CN117500826A - 抗泛素化抗体及其使用方法 - Google Patents

抗泛素化抗体及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本文提供了与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体以及筛选此类抗体的方法。本文还提供了使用此类抗体来检测或富集N末端泛素化多肽的肽的检测和富集方法。

Description

抗泛素化抗体及其使用方法
相关申请的交叉引用
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技术领域
本发明涉及与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体及其使用方法。
背景技术
蛋白质泛素化是调节多种细胞功能(包括蛋白质稳态、DNA损伤反应、先天性和适应性免疫、细胞周期和炎症信号传导)的复杂的翻译后修饰(Komander,D.&Rape,M.AnnulRev Biochem 81,203-229(2012)；Yau,R.&Rape,M.Nat Cell Biol 18,579-586(2016)；Swatek,K.N.&Komander,D.Cell Res 26,399-422(2016)；Dittmar,G.&Winklhofer,K.F.Front Chem 7,915(2020))。泛素(Ub)与蛋白质底物的共价连接是通过三种酶的协同活性发生的：E1 Ub-激活酶、E2 Ub-缀合酶和E3 Ub-连接酶(Deshaies,R.J.&Joazeiro,C.A.P.Annu Rev Biochem 78,399-434(2009)；Schulman,B.A.&Harper,J.W.Nat Rev MolCell Bio 10,319-331(2009)；Ye,Y.&Rape,M.Nat Rev Mol Cell Bio 10,755-764(2009))。Ub本身具有七个赖氨酸残基(K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63)和一个N末端，这些中的所有都适合缀合(Komander,D.&Rape,M.Annu Rev Biochem 81,203-229(2012))。K48和K63-连接的多聚泛素链研究最为深入，传统观点认为K48-连接的Ub链标记蛋白质以供蛋白酶体降解，而K63-连接的Ub链具有蛋白质支架作用(Swatek,K.N.&Komander,D.Cell Res26,399-422(2016)；Hershko,A.&Ciechanover,A.Annu Rev Biochem 67,425-479(1998)；Chen,Z.J.&Sun,L.J.Mol Cell 33,275-286(2009))。此外，研究表明存在混合连接和支化的Ub链，并且可以作为比同型K48-或K-63-连接的Ub链更强效的功能信号(Kirkpatrick,D.S.等人Nat Cell Biol 8,700-710(2006)；Emmerich,C.H.等人Proc National Acad Sci110,15247-15252(2013)；Meyer,H.J.&Rape,M.Cell 157,910-921(2014))。Ub与赖氨酸残基的ε-氨基的缀合是最常见的泛素化的形式。这种类型的缀合形成K-ε-GG基序，其中Ub肽的C末端甘氨酸残基(“GG”)与赖氨酸的ε-氨基(“K-ε”)结合。其它受体残基如Thr、Ser、Cys和底物N末端的α-氨基已被鉴定，并被认为是非典型泛素化靶标(Cadwell,K.&Coscoy,L.Science 309,127-130(2005)；Wang,X.等人J Cell Biology 177,613-624(2007)；Ciechanover,A.&Ben-Saadon,R.Trends Cell Biol 14,103-106(2004))。这些非典型泛素化的生物学意义尚不清楚。
最初发现时，N末端Ub被认为可作为蛋白质降解信号(Breitschopf,K.等人,EmboJ 17,5964-5973(1998)；Bloom,J.等人,Cell 115,71-82(2003)；Coulombe,P.等人,MolCell Biol 24,6140-6150(2004))。这些研究表明，缺乏赖氨酸残基的工程化蛋白或天然存在的低赖氨酸蛋白仍然会受到蛋白酶体降解，这间接暗示N末端Ub为降解信号。随后的工作表明，N末端泛素化蛋白在蛋白酶体抑制时不会显著积累，这表明N末端泛素化除了促进蛋白酶体介导的降解之外可能还具有额外的作用(Akimov,V.等人,Nat Struct Mol Biol25,631-640(2018))，如协助新生多肽的折叠(Finley,D.等人,Nature 338,394-401(1989))。除了由LUBAC形成的线性多聚泛素链外，UBE2W是唯一据报道在Ub的C末端Gly-76与底物蛋白N末端的α-氨基之间形成肽键的E2 Ub-缀合酶或E3连接酶(Scaglione,K.M.等人,J Biol Chem 288,18784-18788(2013)；Kirisako,T.等人Embo J 25,4877-4887(2006))。与泛素连接酶配合，目前的数据表明UBE2W在其N末端严格单泛素化蛋白质底物。这些引发修饰可以通过其它E2/E3复合物加工成N末端连接的多聚泛素链(Tatham,M.H.等人,Biochem J 453,137-145(2013))。有趣的是，UBE2W包含部分无序的C末端，这对于识别具有内在无序的N末端的底物至关重要(Vittal,V.等人,Nat Chem Biol 11,83-89(2015))。尽管对N末端泛素化以及UBE2W的结构和生化特性的了解日益加深，但仅鉴定出一小部分N末端泛素化的UBE2W底物。因此，需要鉴定N末端泛素化蛋白的新策略，以进一步阐明这种修饰的生理后果。
特别地，对与质谱相容的N末端泛素化蛋白进行全局分析的策略将特别有益。质谱(MS)是一种强大的分析工具，用于在氨基酸残基水平上鉴定和阐明底物特异性泛素化(Peng,J.等人Nat Biotechnol 21,921-926(2003)；Kim,W.等人Mol Cell 44,325-340(2011)；Wagner,S.A.等人Mol Cell Proteomics 10,M111.013284(2011))。一种方法是产生特异性地富集酶切割时产生的带有Ub C末端残余物的肽的工具。例如，开发了识别由附着至赖氨酸侧链的异肽连接的双甘氨肽(K-ε-GG)组成的胰蛋白酶Ub残余物的单克隆抗体，可以对泛素化位点进行全局分析(Kim,W.等人Mol Cell 44,325-340(2011)；Xu,G.等人,Nat Biotechnol 28,868-873(2010)；Bustos,D.等人,Mol Cell Proteomics 11,1529-1540(2012))。最近，产生了单克隆抗体以识别延伸的LysC-产生的Ub的残余物，并区分缀合至Ub的底物与其它Ub-样蛋白(如NEDD8和ISG15)(Akimov,V.等人,Nat Struct Mol Biol25,631-640(2018))。还开发了其它基于亲和力的富集或遗传标签系统(Akimov,V.等人,Nat Struct Mol Biol 25,631-640(2018)；Peng,J.等人Nat Biotechnol 21,921-926(2003)；Akimov,V.等人,J Proteome Res 17,296-304(2017)；Kliza,K.等人,Nat Methods14,504-512(2017)；Danielsen,J.M.R.等人Mol Cell Proteomics 10,M110.003590(2011)；Hjerpe,R.等人,.Embo Rep 10,1250-1258(2009)；Akimov,V.等人,Mol Biosyst7,3223-3233(2011))。值得注意的是，这些策略中的一些不仅可以检测典型的K-ε-GG肽，还可以检测与N末端泛素化对应的肽(Akimov,V.等人,Nat Struct Mol Biol 25,631-640(2018)；Akimov,V.等人,J Proteome Res 17,296-304(2017))。先前的定量蛋白质组学数据表明，鉴于典型蛋白质中赖氨酸的频率以及约80％-90％的蛋白质可在其N末端乙酰化，从而排除N末端泛素化的事实，因此N末端Ub连接的相对丰度在基础条件下极低(Akimov,V.等人,Nat Struct Mol Biol 25,631-640(2018)；Arnesen,T.等人Proc National AcadSci 106,8157-8162(2009)；Aksnes,H.等人,Cell Reports 10,1362-1374(2015))。因此，本领域需要能够特异性检测和富集N末端泛素化蛋白特有的肽的抗体。
发明内容
在一方面，本发明提供了一种与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体，其中抗体与肽的N末端处的氨基酸序列GGX结合，其中抗体不与包含支链双甘氨肽的氨基酸序列(K-ε-GG)结合。
在一些实施例中，抗体与包含选自由以下项组成的组的N末端序列的肽结合：GGA、GGE、GGF、GGG、GGH、GGI、GGL、GGM、GGN、GGQ、GGS、GGT、GGV和GGW。
在一些实施例中，抗体与以下结合：包含GGA的N末端序列的肽、包含GGE的N末端序列的肽、包含GGF的N末端序列的肽、包含GGG的N末端序列的肽、包含GGH的N末端序列的肽、包含GGI的N末端序列的肽、包含GGL的N末端序列的肽、包含GGM的N末端序列的肽、包含GGN的N末端序列的肽、包含GGQ的N末端序列的肽、包含GGS的N末端序列的肽、包含GGT的N末端序列的肽、包含GGV的N末端序列的肽，以及包含GGW的N末端序列的肽。
在一些实施例中，抗体为兔、啮齿动物或山羊抗体。
在一些实施例中，抗体为全长抗体或Fab片段。
在一些实施例中，抗体缀合至可检测标记物。
在一些实施例中，标记物选自由以下项组成的组：生物素、地高辛和荧光素。
在一些实施例中，抗体固定在固体支持物上。
在一些实施例中，抗体固定在珠子上。
在一些实施例中，抗体包含在一侧含有根据Kabat编号位置35处的Asn、位置37处的Val、位置93处的Thr、位置101处的Asn和位置103处的Trp的可变重链(VH)，以及含有位置34处的Ala、位置36处的Tyr和位置49处的Tyr的可变轻链(VL)。
在一些实施例中，抗体包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中抗体包含含有氨基酸序列XXXMN(SEQ ID NO:35)的CDRH1；含有氨基酸序列XXXXXGXXYYATWA(SEQ ID NO:36)的CDRH2；以及含有氨基酸序列DDXXXXNX(SEQ ID NO:37)的CDRH3；其中所述抗体包含含有氨基酸序列QSXXSVYXXNXLX(SEQ ID NO:38)的CDRL1；含有氨基酸序列XASTLXS(SEQ ID NO:39)的CDRL2；以及含有氨基酸序列LGXXDCXSXDCXX(SEQ ID NO:40)的CDRL3；其中X为任何氨基酸。
在一些实施例中，VH包含SEQ ID NO:33中所示的氨基酸，并且VL包含SEQ ID NO:34中所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中抗体包含含有SEQID NO:1中所示的氨基酸序列的VH的CDRH1、CDRH2和CDRH3，以及含有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的VL的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
在一些实施例中，该抗体包含SEQ ID NO:3中所示的CDRH1氨基酸序列；SEQ IDNO:4中所示的CDRH2氨基酸序列；SEQ ID NO:5中所示的CDRH3氨基酸序列；SEQ ID NO:6中所示的CDRL1氨基酸序列；SEQ ID NO:7中所示的CDRL2氨基酸序列；以及SEQ ID NO:8中所示CDRL3氨基酸序列。
在一些实施例中，VH包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQID NO:2中所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中该抗体包含含有SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列的VH的CDRH1、CDRH2和CDRH3，以及含有SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列的VL的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
在一些实施例中，该抗体包含SEQ ID NO:11中所示的CDRH1氨基酸序列；SEQ IDNO:12中所示的CDRH2氨基酸序列；SEQ ID NO:13中所示的CDRH3氨基酸序列；SEQ ID NO:14中所示的CDRL1氨基酸序列；SEQ ID NO:15中所示的CDRL2氨基酸序列；以及SEQ ID NO:16中所示的CDRL3氨基酸序列。
在一些实施例中，VH包含SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中该抗体包含含有SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列的VH的CDRH1、CDRH2和CDRH3，以及含有SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列的VL的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
在一些实施例中，该抗体包含SEQ ID NO:19中所示的CDRH1氨基酸序列；SEQ IDNO:20中所示的CDRH2氨基酸序列；SEQ ID NO:21中所示的CDRH3氨基酸序列；SEQ ID NO:22中所示的CDRL1氨基酸序列；SEQ ID NO:23中所示的CDRL2氨基酸序列；以及SEQ ID NO:24中所示的CDRL3氨基酸序列。
在一些实施例中，VH包含SEQ ID NO:17中所示的氨基酸，并且VL包含SEQ ID NO:18中所示的氨基酸。
在一些实施例中，抗体包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中该抗体包含含有SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列的VH的CDRH1、CDRH2和CDRH3，以及含有SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列的VL的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
在一些实施例中，该抗体包含SEQ ID NO:27中所示的CDRH1氨基酸序列；SEQ IDNO:28中所示的CDRH2氨基酸序列；SEQ ID NO:29中所示的CDRH3氨基酸序列；SEQ ID NO:30中所示的CDRL1氨基酸序列；SEQ ID NO:31中所示的CDRL2氨基酸序列；以及SEQ ID NO:32中所示的CDRL3氨基酸序列。
在一些实施例中，VH包含SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ IDNO:26中所示的氨基酸序列。
在另一方面，提供了编码根据段落[0006]至[0029]中任一项所述的抗体的核酸。
在另一方面，提供了一种包含段落[0030]的核酸的宿主细胞。
在另一方面，本发明提供了一种筛选与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体的方法，其中抗体与肽的N末端处的氨基酸序列GGX结合，其中抗体不与包含支链双甘氨肽的氨基酸序列(K-ε-GG)结合，该方法包括
i)提供抗体文库；
ii)正向选择与在N末端处包含氨基酸序列GGX的肽结合的抗体，其中X为任何氨基酸；以及
iii)负向选择与包含氨基酸序列K-ε-GG的肽结合的抗体，从而产生与在N末端处包含氨基酸GGX的肽特异性结合并且不与氨基酸序列K-ε-GG结合的抗体。
在一些实施例中，在步骤ii)中，正向选择与在N末端处包含氨基酸序列GGM的肽结合的抗体。
在一些实施例中，负向选择与包含氨基酸序列K-ε-GG的肽结合的抗体与步骤ii)同时进行。
在一些实施例中，负向选择与包含氨基酸序列K-ε-GG的肽结合的抗体在步骤ii)之前或之后进行。
在一些实施例中，文库为噬菌体文库或酵母文库。
在一些实施例中，文库通过用包含在N末端处含有氨基酸序列GGM的肽的肽文库免疫哺乳动物来产生。
在一些实施例中，哺乳动物为兔或小鼠。
在一些实施例中，步骤ii)至iii)重复两次或更多次。
在另一方面，提供了一种通过根据段落[0032]至[0039]中任一项所述的方法产生的抗体。
在另一方面，本发明提供了一种富集包含肽的混合物的样品中的N末端泛素化肽的方法，该方法包括：
i)使样品与与N末端泛素化蛋白的肽结合的抗体接触；以及
ii)从样品中选择抗体结合的肽，其中抗体与N末端处的氨基酸序列GGX结合，其中抗体不与包含支链双甘氨肽的氨基酸序列(K-ε-GG)结合。
在一些实施例中，样品为细胞裂解物8。
在一些实施例中，方法进一步包括使细胞中的去泛素化酶缺失并裂解细胞以产生细胞裂解物。
在一些实施例中，方法进一步包括在细胞中过表达泛素连接酶并裂解细胞以产生细胞裂解物。
在一些实施例中，将细胞裂解物与胰蛋白酶一起孵育以产生肽。
在一些实施例中，将细胞裂解物与细菌蛋白酶或病毒蛋白酶一起孵育以产生肽。
在一些实施例中，方法进一步包括在裂解物产生并与胰蛋白酶一起孵育之前或者在与细菌蛋白酶或病毒蛋白酶一起孵育之前，用蛋白酶体抑制剂或去泛素化的抑制剂处理细胞。
在一些实施例中，方法进一步包括检测所选择的抗体结合的肽。
在一些实施例中，抗体结合的肽通过质谱来检测。
在一些实施例中，抗体结合的肽通过蛋白质测序来检测。
在一些实施例中，使用与N末端泛素化蛋白的肽结合的抗体结合的第二抗体来检测与抗体结合的肽。
在另一方面，提供了一种通过根据段落[0041]至[0051]中任一项所述的方法产生的N末端泛素化肽的文库。
在另一方面，本发明提供了一种检测包含肽的混合物的样品中的N末端泛素化肽的方法，该方法包括
i)将样品与酶一起孵育以产生肽；
ii)使肽与与N末端泛素化蛋白的肽结合的抗体接触，以及
iii)检测N末端泛素化肽，其中抗体与N末端处的氨基酸序列GGX结合，其中抗体不与包含支链双甘氨肽的氨基酸序列(K-ε-GG)结合。
在一些实施例中，使用与与N末端泛素化蛋白的肽结合的抗体结合的第二抗体来检测N末端泛素化肽。
在一些实施例中，样品为细胞裂解物。
在一些实施例中，方法进一步包括在细胞中过表达泛素连接酶并裂解细胞以产生细胞裂解物。
在一些实施例中，方法进一步包括使细胞中的去泛素化酶缺失并裂解细胞以产生细胞裂解物。
在一些实施例中，将细胞裂解物与细菌蛋白酶或病毒蛋白酶一起孵育以产生肽。
在一些实施例中，方法进一步包括在裂解物产生并与细菌蛋白酶或病毒蛋白酶一起孵育之前用蛋白酶体抑制剂或去泛素化的抑制剂处理细胞。
在另一方面，本发明提供了一种用于检测样品中的N末端泛素化肽的试剂盒，该试剂盒包括与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体和使用说明书，其中与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体，其中抗体与N末端处的氨基酸序列GGX结合，其中抗体不与包含支链双甘氨肽的氨基酸序列(K-ε-GG)结合。
在一些实施例中，与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体缀合至可检测标记物。
在一些实施例中，可检测标记物选自由以下项组成的组：生物素、地高辛和荧光素。
在一些实施例中，抗体固定在固体支持物上。
在一些实施例中，抗体固定在珠子上。
在一些实施例中，试剂盒进一步包括蛋白酶。
附图说明
图1A示出了用于生成抗-GGX单克隆抗体(mAb)的免疫和噬菌体淘选策略的示意图。图1B示出了Gly-Gly-Met(GGM；顶部)和K-ε-GG(底部)肽的化学结构。图1C提供了来自酶联免疫吸附测定(ELISA)的数据，该测定测量了八只兔子中的每只的多克隆抗体(pAb)与GGM和K-ε-GG肽结合的能力，以链霉亲和素作为对照。兔子的身份示出在x轴上，从左到右，每只兔子的单独的条形代表与GGM肽、K-ε-GG肽和链霉亲和素的结合水平。650nm处的光密度示出在y轴上。图1D示出了单克隆抗体1C7、2H2、2E9和2B12的轻链可变区(顶部)和重链可变区(底部)的氨基酸序列比对。轻链可变区比对从顶部到底部包括1C7(SEQ ID NO:2)、2H2(SEQ ID NO:26)、2E9(SEQ ID NO:18)和2B12(SEQ ID NO:10)。重链可变区比对从顶部到底部包括1C7(SEQ ID NO:1)、2H2(SEQ ID NO:25)、2E9(SEQ ID NO:17)和2B12(SEQ ID NO:9)。根据Kabat对氨基酸位置进行编号，并且CDR的位置示出在每个比对上方。图1E提供了来自ELISA的数据，其测量了1C7、2B12、2E9、2H2和抗-K-ε-GG mAb与GGM和K-ε-GG肽结合的能力，以中性亲和素(neutravidin)作为对照。抗体的身份示出在x轴上，从左到右，每种抗体的单个条形代表与GGM肽、K-ε-GG肽和中性亲和素的结合水平。650nm处的光密度示出在y轴上，n＝3，并且误差条示出了标准偏差。图1F提供了来自ELISA的数据，其测量了1C7、2B12、2E9和2H2与GGX肽结合的能力。除了半胱氨酸外，所有二十个氨基酸均在位置“X”处被取代，如y轴所示。抗体的身份示出在x轴上。较深的阴影与更好的结合(即，650nm处的光密度更高，如右侧比例所示)对应，空白行是链霉亲和素对照，并且n＝3。
图2A示出了1C7 Fab与GGM肽结合的表面表示(示出为棒状图)。1C7 CDR的位置被标记。图2B示出了1C7 Fab与GGM肽结合的卡通表示(示出为棒状图)，该肽被包围在电子密度网内，轮廓为1σ。图2C示出了双甘氨肽与1C7 Fab之间相互作用的详细视图，该视图示出了氢键网络以及与轻链和重链的接触。GGM肽示出为被空间填充图包围的棒状图。重链残基示出在GGM肽上方，并且轻链残基示出在GGM肽下方。抗体和GGM肽上的氨基酸残基被标记。图2D示出了位于轻链-重链界面的甲硫氨酸识别口袋的详细视图，该口袋包含疏水性和亲水性残基的混合物。重链残基示出在顶部，并且轻链残基示出在底部。氨基酸残基被标记。图2E示出了模拟到1C7 Fab结构中的Gly-Gly-Pro(GGP)肽(示出为棒状图)，并突出示出了可能阻止与抗体结合的空间冲突。图2F示出了2B12中可结合Trp侧链的口袋的模型，其中指出了HC Thr93Val和LC Leu96Asn残基。
图3A示出了GGX肽用于免疫亲和富集和质谱(MS)分析(GGX-IAP-LC-MS/MS)的工作流程示意图。图3B示出了K48和K63 K-ε-GG多聚泛素链连接肽LIFAGKGGQLEDGR(SEQ ID NO:41；左)和TLSDYNIQKGGESTLHLVLR(SEQ ID NO:42；右)在抗-K-ε-GG抗体、抗-GGX抗体2B12和抗-GGX抗体1C7免疫亲和富集MS实验中的提取离子色谱图(+/-10ppm)。x轴示出了以分钟为单位的时间，并且y轴示出了肽的丰度。图3C示出了K48和K63 K-ε-GG多聚泛素链连接肽LIFAGKGGQLEDGR(SEQ ID NO:41；左)和TLSDYNIQKGGESTLHLVLR(SEQ ID NO:42；右)在抗-K-ε-GG抗体、抗-GGX抗体2E9和抗-GGX抗体2H2免疫亲和富集MS实验中的提取离子色谱图(+/-10ppm)。x轴示出了以分钟为单位的时间，并且y轴示出了肽的丰度。图3D示出了内部GGX肽GGMLTNAR(SEQ ID NO:43；左)和GGMoxALALAVTK(SEQ ID NO:44；右)在抗-K-ε-GG抗体、抗-GGX抗体2B12和抗-GGX抗体1C7免疫亲和富集MS实验中的提取离子色谱图(+/-10ppm)。x轴示出了以分钟为单位的时间，并且y轴示出了肽的丰度。图3E示出了内部GGX肽GGLATFHGPGQLLCHPVLDLR(SEQ ID NO:45；左)和GGMTSTYGR(SEQ ID NO:46；右)在抗-K-ε-GG抗体、抗-GGX 2E9抗体和抗-GGX 2H2抗体免疫亲和富集MS实验中的提取离子色谱图(+/-10ppm)。x轴示出了以分钟为单位的时间，并且y轴示出了肽的丰度。图3F示出了位置X处具有各种氨基酸残基的免疫亲和富集的内部GGX肽的数量。x轴示出了位置X处的氨基酸残基，并且y轴示出了肽的数量。图3G示出了代表由抗-GGX mAb 1C7(左上)、2H2(右上)、2B12(左下)和2E9(右下)富集的内部GGX肽的序列多样性的WebLogo。图3H示出了N末端GGX肽GGMFGSAPQRPVAMTTAQR(SEQ ID NO:47)在抗-K-ε-GG抗体、抗-GGX抗体2B12和抗-GGX抗体1C7免疫亲和富集MS实验中的提取离子色谱图(+/-4ppm)。x轴示出了以分钟为单位的时间，并且y轴示出了肽的丰度。图3I示出了三电荷654.9938m/z N末端GGX修饰肽GGMFGSAPQRPVAMTTAQR(SEQ ID NO:的MS/MS谱图鉴定47)。检测到的b-离子和y-离子被标记。
图4A示出了稳定的多西环素诱导型UBE2W HEK293细胞在多西环素处理后24小时的蛋白质印迹(western blot)。下面示出了微管蛋白的蛋白质印迹作为对照。图4B示出了火山图，该火山图示出了无标记物GGX-MS实验中UBE2W过表达(UBE2Woe)与对照条件的差异N末端蛋白泛素化数据。x轴示出了log2倍数变化，并且y轴示出了-log10(P值)。每个数据点代表一种蛋白质，并示出了一组代表性的蛋白质名称。在log2倍数变化(FC)>1.0和-log10 P值>1.3(P<0.05)处设置的蛋白质水平临界值用虚线标记。图4C示出了稳定的多西环素诱导型UBE2W/RNF4 HEK293细胞在多西环素处理后24小时的蛋白质印迹。图4D示出了散点图，该散点图示出了在串联质量标签(TMT)11-重GGX-IAP-LC-MS/MS实验中，UBE2W过表达与对照(UBE2Woe-ctrl)和组合与RNF4过表达(组合-RNF4oe)对比中具有差异N末端蛋白泛素化的蛋白质。x轴示出了UBE2W过表达与对照的log2倍数变化(FC)，并且y轴示出了组合与RNF4过表达的log2倍数变化(FC)。数据点的大小用P值进行缩放。虚线与两个对比中-log10 P值>1.3(P<0.05)的虚线对应。所有实验均重复进行(对照n＝3，仅UBE2W n＝3，仅RNF4 n＝2，以及组合n＝3)。图4E示出了火山图，该火山图示出了无标记物GGX-MS实验中UBE2W过表达与对照(UBE2Woe-Ctrl；左)、组合与对照(组合-Ctrl；中心)和组合与RNF4过表达(组合-RNF4oe；右)条件的差异N末端蛋白泛素化数据。在每个图中，x轴示出了log2倍数变化(FC)，并且y轴示出了-log10(P值)。每个数据点代表一种蛋白质。在log2倍数变化>1.0和-log10 P值>1.3(P<0.05)处设置的蛋白质水平临界值用虚线标记。图4F示出了散点图，该散点图示出了在无标记物GGX-MS实验中，UBE2W过表达与对照和组合与RNF4过表达对比中具有差异N末端蛋白泛素化的蛋白质。x轴示出了UBE2W过表达与对照(UBE2Woe-ctrl)的log2倍数变化(FC)，并且y轴示出了组合与RNF4过表达(组合-RNF4oe)的log2倍数变化(FC)。数据点的大小用P值进行缩放。虚线与两个对比中-log10 P值>1.3(P<0.05)的虚线对应。图4G示出了面积比例韦恩(Venn)图，该图比较了来自三个MS实验中的每个实验中已鉴定的假定UBE2W底物的数量。第一个无标记物定量(LFQ)实验(LFQ_1)是左上的圆圈，第二个LFQ实验(LFQ_2)是左下的圆圈，并且TMT实验是右边的圆圈。这些数字代表在每个实验中鉴定出的或在多个实验之间共享的底物的数量。韦恩图是使用BioVenn Web应用程序生成的(Hulsen,T.等人,BMC Genomics 9,488(2008))。图4H示出了显示相对N末端泛素化丰度的直方图，其中单个条形示出了与生物学重复对应的单个TMT-11plex通道的值。每个条形代表技术重复的平均值(n＝2)。结果从左到右示出为RS7、MIP18和QKI。在每个图中，x轴代表来自实验的样品，并且y轴示出了相对丰度。图4I示出了用编码假定的UBE2W底物的五种低赖氨酸突变体的构建体转染的野生型、多西环素诱导型UBE2W/RNF4和多西环素诱导型UBE2WW144E/RNF4稳定的HEK293细胞的蛋白质印迹。HA标签融合在每个构建体的C末端，以使用抗-HA标签抗体进行蛋白质检测。箭头表示每种底物的修饰形式。结果代表三项独立实验。每个印迹下面示出了微管蛋白的蛋白质印迹作为对照。图4J示出了免疫亲和富集的UBE2W底物在起始子甲硫氨酸后的第二个位置的分析。x轴示出了起始子甲硫氨酸后X位处的氨基酸残基，并且y轴示出了肽的数量。
图5A示出了UCHL1(左)和UCHL5(右)的N末端胰蛋白酶GGX肽GGMQLKPMEINPEMLNK(SEQ ID NO:48)和GGMTGNAGEWCLMESDPGVFTELIK(SEQ ID NO:49)分别在来自GGX-IAP-LC-MS/MS实验的对照(CTLR；上图)和UBE2W过表达(UBE2Woe；下图)条件下的提取离子色谱图(+/-10ppm)。x轴示出了以分钟为单位的时间，并且y轴示出了肽的丰度。图5B示出了N末端胰蛋白酶GGX修饰肽的GGMQLKPMEINPEMLNK(SEQ ID NO:48)(三电荷，643.9907m/z；左)和GGMTGNAGEWCLMESDPGVFTELIK(SEQ ID NO:49)(三电荷，900.4094m/z；右)的MS/MS谱图鉴定。检测到的b-离子和y-离子被标记。图5C示出了UCHL1(左)和UCHL5(右)的N末端半胰蛋白酶GGX肽GGMQLKPME(SEQ ID NO:50)和GGMTGNAGEWCLME(SEQ ID NO:51)分别在来自GGX-IAP-LC-MS/MS实验的对照(CTLR；上图)和UBE2W过表达(UBE2Woe；下图)条件下的提取离子色谱图(+/-10ppm)。x轴示出了以分钟为单位的时间，并且y轴示出了肽的丰度。图5D示出了N末端半胰蛋白酶GGX修饰肽GGMQLKPME(SEQ ID NO:50)(双电荷，495.7406m/z；左)和GGMTGNAGEWCLME(SEQ ID NO:51)(双电荷，756.7994m/z；右)的MS/MS谱图鉴定。检测到的b-离子和y-离子被标记。图5E示出了对低赖氨酸催化失活的UCHL1(顶部)和UCHL5(底部)进行的体外泛素化测定的结果。在不存在UBE2W(泳道1和2)和存在UBE2W(泳道3至5)的情况下进行两小时反应。所有反应均与E1、E3(RNF4)、ATP/MgCl2以及有(泳道2)或没有(泳道5)泛素一起孵育。结果代表3项独立实验。图5F示出了多西环素诱导型UBE2W/RNF4和UBE2WW144E/RNF4 HEK293细胞在多西环素处理后24小时的蛋白质印迹。用抗-UCHL1抗体分析内源性UCHL1表达。结果代表3项独立实验。图5G示出了多西环素诱导型UBE2W/RNF4 HEK293细胞在多西环素处理后24小时的蛋白质印迹。在细胞收获之前，用硼替佐米(bortezomib)(10μM，5小时)额外处理细胞。图5H示出了多西环素诱导型UBE2W/RNF4 HEK293细胞在多西环素处理后24小时的蛋白质印迹。在细胞收获之前，用环己酰亚胺(cycloheximide)(10μg/ml)额外处理细胞达到指定的时间。
图6A示出了生物层干涉测量(BLI)实验的示意图。使用链霉亲和素(SA)生物传感器上的固定的生物素-泛素(Ub)测量UCHL1和UCHL5相互作用，测量游离UCHL1或UCHL5以及Ub-UCHL1或UCHL5与Ub表面的关联。图6B示出了UCHL1、UbG76V-UCHL1、UbI44A,G76V-UCHL1、UCHL5、UbG76V-UCHL5和UbI44A,G76V-UCHL5的组合稳态结合曲线(从最高反应到最低反应)。x轴示出了分析物的浓度(以nM为单位)，并且y轴示出了每种分析物浓度的Rmax值(以nm为单位)。每个测定以三重复的方式进行。图6C示出了代表性传感图，该传感图示出了Ub与野生型UCHL1(顶部)、N末端泛素化模拟物(UbG76V-UCHL1；中心)或UbI44A,G76V-UCHL1(底部)的结合。图6D示出了代表性传感图，该传感图示出了Ub与野生型UCHL5(顶部)、N末端泛素化模拟物(UbG76V-UCHL5；中心)或UbI44,AG76V-UCHL5(底部)的结合。图6E示出了用泛素-Rho110和UCHL1构建体(左)和UCHL5构建体(右)进行的活性测定的结果。对于UCHL1和UCHL5，样品包括野生型蛋白(示出为圆圈)、催化死亡突变体(C90S或C88S；示出为空心的正方形)、N末端泛素化模拟物(UbG76V；示出为封闭的正方形)或UbI144,AG76V(向上的三角形)。在每张图中，x轴示出了泛素-Rho110的浓度(以μM为单位)，并且y轴示出了反应速率(以μM s-1为单位)。数据报告为最佳拟合值，具有来自非线性回归拟合的标准误差。结果代表两项独立实验。图6F示出了泛素乙烯基砜测定的结果。UCHL1，其N末端泛素化模拟物，UbG67V-UCHL1和UbI44A,G67V-UCHL1(左)以及UCHL5，其N末端泛素化模拟物，UbG67V-UCHL5和UbI44A,G67V-UCHL5(右)在指定的时间点(0、5、15或30分钟)与自杀探针泛素-乙烯基砜(Ub-VS)反应。箭头表示与与HA-Ub-VS反应的N末端泛素化模拟物相关的条带。结果代表三项独立实验。图6G从左到右示出了用空载体、野生型UCHL1、UbG76V-UCHL1、UCHL1C90S(催化失活突变体)、UbG76V-UCHL1C90S或UCHL1D30K(非Ub结合突变体)转染的HEK293细胞在多西环素处理后24小时的蛋白质印迹。单泛素用箭头表示。结果代表两项独立实验。示出了微管蛋白的蛋白质印迹作为对照。
图7A示出了用或未用蛋白酶体抑制剂硼替佐米处理、有或没有UBE2W过表达的样品中的泛素和UBE2W水平的蛋白质印迹。示出了微管蛋白的蛋白质印迹作为对照。图7B示出了火山图，该火山图示出了UBE2W过表达与Ctrl(左)和组合与硼替佐米处理(组合-Btz；左)的差异N末端蛋白泛素化数据。在每个图中，x轴示出了log2倍数变化(FC)，并且y轴示出了-log10(P值)。每个数据点代表一种蛋白质。图7C示出了热图，该热图示出了沿x轴从左到右的两个重复的对照、两个重复的硼替佐米(Btz)处理、两个重复的UBE2W过表达和两个重复的RNF4/UBE2W组合的无标记物峰面积。y轴示出了指定蛋白质的水平。图7D示出了样品相关性表，该样品相关性表示出了两个重复的对照、两个重复的硼替佐米(Btz)处理、两个重复的UBE2W过表达与两个重复的RNF4/UBE2W组合之间的相关性。
具体实施方式
I.定义
如本文所用，“GGX”是指在N末端处包含氨基酸序列(从N末端到C末端)Gly-Gly-X的肽，其中X为任何氨基酸。
如本文所用，“抗-GGX抗体”是指与在N末端处包含GGX肽的多肽结合的抗体。
如本文所用，“K-ε-GG”是指与赖氨酸残基(“K-ε”)的ε-氨基结合的两个甘氨酸残基(“GG”)。K-ε-GG是泛素与赖氨酸残基的ε-氨基缀合的标志，这是最常见的泛素化形式。泛素的三个C末端残基是Arg-Gly-Gly，并且在典型的泛素化中，C末端甘氨酸残基缀合至靶标多肽中的赖氨酸残基。用胰蛋白酶消化后，泛素在精氨酸残基后被切割，在缀合的赖氨酸上产生Gly-Gly二肽残余物。因此，胰蛋白酶消化的多肽中K-ε-GG肽(也称为“K-ε-GG双甘氨肽残余物”或“支链双甘氨肽”)的存在表明泛素先前与多肽中赖氨酸残基的ε-氨基缀合。K-ε-GG的化学结构提供于图1B中。
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段都有单个抗原结合位点和残留的“Fc”片段，其名称反映其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生的F(ab')2片段具有两个抗原结合位点并且仍能与抗原交联。
如本文所使用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量存在)之外，包含所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法生产抗体。例如，待根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，在本文中描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
“裸抗体”是指不缀合至异源部分(例如，细胞毒性部分)或放射性标记的抗体。裸抗体可存在于医药制剂中。
“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由经二硫键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N末端至C末端，每条重链均具有可变区(VH)，也称为可变重链结构域或重链可变结构域，随后为三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，自N末端至C末端，各轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，继之以恒定轻链(CL)结构域。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以归属于两种类型中的一种，所述两种类型称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。
抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它们中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1，以及IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
“人抗体”是这样的抗体，该抗体具有的氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列，或来源于利用人抗体全套库或其他人抗体编码序列的非人源的抗体的氨基酸序列。人抗体的该定义特别地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，在该抗体中重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同的来源或物种。
“人共有框架”是这样的框架，其表示在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常存在的氨基酸残基。一般而言，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自于可变结构域序列的亚组。一般而言，序列的亚组是如Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第五版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，第1-3卷中所述的亚组。在一个实施例中，对于VL，该亚组是如Kabat等人(出处同上)中的亚组κI。在一个实施例中，对于VH，该亚组是如Kabat等人(出处同上)中的亚组III。
“人源化”抗体是指这样的嵌合抗体，其包含来自非人CDR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在某些方面，人源化抗体将基本上包含所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有CDR对应于非人抗体的CDR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。“人源化形式”的抗体，例如非人抗体，是指已经进行过人源化的抗体。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个互补决定区(CDR)。(参见，例如，Kindt等人KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.,第91页(2007))。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可分别使用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域来进行分离，以筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
示例性CDR(CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2和CDRH3)发生在L1的氨基酸残基24-34、L2的氨基酸残基50-56、L3的氨基酸残基89-97、H1的氨基酸残基31-35B、H2的氨基酸残基50-65，以及H3的氨基酸残基95-102处。(Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版.美国卫生与公众服务部，国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达(1991))。除VH中的CDR1外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”，其是与抗原接触的残基。SDR包含在被称为缩短CDR或a-CDR的CDR区域内。示例性a-CDR(a-CDRL1、a-CDRL2、a-CDRL3、a-CDRH1、a-CDRH2和a-CDRH3)发生在L1的氨基酸残基31-34、L2的氨基酸残基50-55、L3的氨基酸残基89-96、H1的氨基酸残基31-35B、H2的氨基酸残基50-58，以及H3的氨基酸残基95-102处。(参见Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))。除非另外指明，否则可变结构域中的CDR残基和其它残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等人(出处同上)编号。
“Fab”片段含有重链可变结构域和轻链可变结构域且亦含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于Fab'片段在重链CH1结构域的羧基末端添加了一些残基，这些残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中关于其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离硫醇基的Fab'的命名。F(ab')2抗体片段最初是作为在其间具有铰链半胱氨酸的成对Fab'片段而产生的。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
本文的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，该C末端区包含恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在某些实施例中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文另有说明，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat等人所述(Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美国卫生与公众服务部，国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达，1991)。
“框架”或“FR”是指除CDR残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，CDR和FR序列通常在VH(或VL)中以如下序列出现：FR1-CDRH1(L1)-FR2-CDRH2(L2)-FR3-CDRH3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”及“全抗体”在本文中可互换地用于指代具有基本上类似于天然抗体结构的结构或具有含有如本文所定义的Fc区的重链的抗体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指外源核酸已被引入其中的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于所述原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代可能不与亲本细胞的核酸内容物完全一致，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。
“免疫缀合物”为与一种或多种异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)缀合的抗体。
“分离的”抗体为已从其自然环境的组分中分离的抗体。在一些实施例中，通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(isoelectric focusing,IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)测定，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度。关于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman等人,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
“分离的”核酸是指已从其自然环境的组分中分离的核酸分子。经分离的核酸包括这样的核酸分子，其包含在通常含有核酸分子的细胞中，但该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包括的说明书，其含有涉及此类治疗产品的使用的有关适应症、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌和/或警告的信息。
相对于参照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对候选序列与参考多肽序列并引入空位(如果必要的话)以实现最大的序列同一性百分比之后，并且在不考虑将任何保守取代作为序列同一性的组成部分的情况下，候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用可公开获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，为了本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2来生成氨基酸序列同一性％的值。ALIGN-2序列比较计算机程序由基因泰克公司(Genentech,Inc.)编写，并且源代码已经与用户文档一起提交到U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559，在那里以美国版权登记号TXU510087注册。ALIGN-2程序可从基因泰克公司(Genentech,Inc.,South San Francisco,California)公开获得，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应经编译以在UNIX操作系统上使用，该UNIX操作系统包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设置并且不变。
在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(其可以替代性地表达为给定氨基酸序列A具有或包含与给定氨基酸序列B的某一氨基酸序列同一性％)计算如下：
100乘以分数X/Y
其中X为由序列比对程序ALIGN-2在该程序对A和B的比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，而其中Y为B中氨基酸残基的总数。应当理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A与B的氨基酸序列同一性％将不等于B与A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别指明，否则本文所使用的所有氨基酸序列同一性％的值是如前一段中所述使用ALIGN-2计算机程序获得的。
如本文所用，术语“载体”是指能够载运与其相连的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及并入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
除非另外指出，否则如本文所用的单数形式“一(a/an)”及“该/所述”包括复数个参考物。
如本文所用，术语“约”是指为此技术领域中的技术人员容易知晓的相应值的常见误差范围。在本文中提及“约”值或参数包括(且描述)涉及该值或参数本身的实施例。
应当理解，本文所述的发明的方面和实施例包括“包含”、“由以下组成”及“基本上由以下组成”所指的方面和实施例。
II.组合物和方法
在一方面，本公开提供了与N末端泛素化多肽的区域(诸如表位)相互作用或以其它方式结合的抗体。
A.与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体
1.N末端泛素化多肽
本公开部分基于能够特异性检测和富集N末端泛素化多肽的抗体的开发。如实例1中所述，发明人预期潜在的N末端泛素化多肽中的大部分将为具有非乙酰化的完整起始子甲硫氨酸的新生多肽，其在胰蛋白酶消化后将在起始甲硫氨酸残基之前产生具有双甘氨肽修饰的肽。因此，设计了选择来鉴定能够选择性富集在其N末端含有双甘氨肽序列的胰蛋白酶肽的抗体(参见图1A和实例1)。如本文详细描述的，使用兔免疫噬菌体策略来产生新型抗体，该新型抗体选择性地识别带有N末端双甘氨肽基序的肽，但不识别通过胰蛋白酶消化泛素缀合的赖氨酸产生的支链双甘氨肽残余物(K-ε-GG；参见图1A和实例1)。使用生化方法和结构方法的组合，本文示出了这些抗体主要识别N末端双甘氨肽，对第三个氨基酸具有宽松的选择性，使这些mAb能够与广泛的肽序列结合(参见实例2)。
能够产生N末端泛素化多肽的两种酶是本领域已知的。首先，据报道，泛素缀合酶UBE2W具有N末端泛素(Scaglione,K.M.等人,J Biol Chem 288,18784–18788(2013))。其次，据报道，泛素连接酶，线性泛素链组装复合物(“LUBAC”)包含N末端泛素链(Kirisako,T.等人,Embo J 25,4877–4887(2006))。因此，在一些实施例中，N末端泛素化多肽为UBE2W。在一些实施例中，N末端泛素化多肽为LUBAC。
在一方面，本公开的抗体用于鉴定N末端泛素化多肽(参见实例3至4)。在一些实施例中，本公开的抗体从细胞裂解物(例如，HEK293细胞裂解物或具有诱导型UBE2W表达的HEK293细胞的裂解物)中选择性地富集N末端泛素化多肽。在一些实施例中，N末端泛素化多肽在起始子甲硫氨酸或新-N末端处包含双甘氨肽。在一些实施例中，多肽在多肽的N末端处包含氨基酸序列GGX。在一些实施例中，如实例3或实例4中所述计算富集。在一些实施例中，抗体将来自细胞裂解物的多肽富集至大于1log2(倍数变化)(例如，大于1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10log2(倍数变化))的水平。在一些实施例中，抗体将来自细胞裂解物的多肽富集至p<0.05(例如，p<0.05、p<0.04、p<0.03、p<0.02、p<0.01、p<0.005、p<0.001、p<0.0001或p<0.00001)的统计学意义。在一些实施例中，富集是相对于未与与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体接触的细胞裂解物中的多肽的丰度来计算的。在其中多肽从具有诱导型UBE2W表达的HEK293细胞的裂解物中选择性地富集的一些实施例中，多肽在诱导UBE2W表达时富集。在一些实施例中，N末端泛素化多肽为表7或表8中列出的多肽中的任一者。在一些实施例中，N末端泛素化多肽选自由以下项组成的组：人DCTP1、人F13A、人HNRPK、人PUR9、人RFA1、人RPB7、人S11IP和人UCHL5。在一些实施例中，N末端泛素化多肽选自由以下项组成的组：人AAAT、人AES、人AIG1、人ARF1、人ARL5B、人BABA2、人BUB3、人C1TC、人C2AIL、人C9J470、人CD81、人CDC45、人DCTP1、人DHRSX、人DMKN、人E2AK1、人EF1B、人F13A、人FA60A、人FBRL、人FLOT1、人GCYB1、人GOT1B、人GPAA1、人HIKES、人HNRPK、人IMPA3、人LAT3、人LAT4、人LRWD1、人MED25、人MFS12、人MIP18、人MMGT1、人MOONR、人NARR、人NDUB6、人NENF、人NOL6、人NOP10、人NUDC、人P121A、人PIGC、人PLBL2、人PRDX1、人PRDX2、人PUR9、人QKI、人RAD21、人RCAS1、人REEP1、人RFA1、人RPB1、人RPB7、人RS29、人RS7、人S11IP、人SGMR1、人T179B、人TAF1、人TCPG、人TF3C4、人TM127、人TMM97、人TMX2、人TSN13、人TSN3、人TTC27、人UBAC1、人UBAC2、人UCHL1、人UCHL5、人VKOR1、人VRK3、人ZDH12、人ZN253和人ZN672。在一些实施例中，N末端泛素化多肽为人UCHL1。在一些实施例中，N末端泛素化多肽为人UCHL5。在一些实施例中，N末端泛素化多肽选自由以下项组成的组：UniProt登录号Q15758、Q08117、Q9NVV5、P84077、Q96KC2、Q9NXR7、O43684、P11586、Q96HQ2、C9J470、P60033、O75419、Q9H773、Q8N5I4、Q6E0U4-8、Q9BQI3、P24534、P00488、Q9NP50、P22087、O75955、Q02153、Q9Y3E0、O43292、Q53FT3、P61978、Q9NX62、O75387、Q8N370、Q9UFC0、Q71SY5、Q6NUT3、Q9Y3D0、Q8N4V1、Q2KHM9、P0DI83、O95139、Q9UMX5、Q9H6R4、Q9NPE3、Q9Y266、Q96HA1、Q92535、Q8NHP8、Q06830、P32119、P31939、Q96PU8、O60216、O00559、Q9H902、P27694、P24928、P62487、P62273、P62081、Q8N1F8、Q99720、Q7Z7N9、P21675、P49368、Q9UKN8、O75204、Q5BJF2、Q9Y320、O95857、O60637、Q6P3X3、Q9BSL1、Q8NBM4、P09936、Q9Y5K5、Q9BQB6、Q8IV63、Q96GR4、O75346和Q499Z4。在一些实施例中，N末端泛素化多肽包含无序的N末端。
2.与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体
本文提供了与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体。在一些实施例中，抗体与肽的N末端处的氨基酸序列GGX结合，其中抗体不与包含支链双甘氨肽的氨基酸序列(K-ε-GG)结合。在一些实施例中，X为任何氨基酸。
本文提供了与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体，其中抗体与肽的N末端处的氨基酸序列GGX结合，其中抗体不与包含支链双甘氨肽的氨基酸序列(K-ε-GG)结合。在一些实施例中，抗体与肽的N末端处的氨基酸序列GGX结合，如通过酶联免疫吸附测定(ELISA)所确定。在一些实施例中，抗体与肽的N末端处的氨基酸序列GGX结合的程度大于其与包含支链双甘氨肽的氨基酸序列(K-ε-GG)结合的程度，如通过ELISA所确定。在一些实施例中，抗体与肽的N末端处的氨基酸序列GGX结合，其结合的水平是抗体与包含支链双甘氨肽的氨基酸序列(K-ε-GG)结合的水平的2、3、4、5、6、7、8、9或10倍高，包括这些值之间的任何值或范围。在一些实施例中，抗体与肽的N末端处的氨基酸序列GGX结合，其结合的水平是抗体与对照样品(例如，中性亲和素或链霉亲和素)结合的水平的2、3、4、5、6、7、8、9或10倍高，包括这些值之间的任何值或范围。在一些实施例中，肽的N末端处的氨基酸序列GGX为GGM。测量结合的示例性方法提供于实例1(参见“单克隆抗体ELISA”)和图1E中。
在一些实施例中，与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体与肽的N末端处的氨基酸序列GGX结合，其亲和力大于对照抗体与肽结合的亲和力。在一些实施例中，对照抗体为同型对照。在一些实施例中，对照抗体为抗-K-ε-GG抗体(例如，Cell Signaling 泛素残余物基序抗体)。在一些实施例中，抗体在蛋白质印迹中与N末端泛素化多肽的肽特异性结合。在一些实施例中，抗体能够免疫沉淀在肽的N末端处包含氨基酸序列GGX的肽。在一些实施例中，抗体能够与在肽的N末端处包含氨基酸序列GGX的肽共结晶。在一些实施例中，抗体在表面等离子体共振(SPR)测定中与N末端泛素化多肽的肽特异性结合。
在一些实施例中，抗体以小于100、10、1或0.1μM的解离常数(Kd)与N末端泛素化多肽的肽结合。在一些实施例中，抗体以约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75或100μM(包括这些值之间的任何值或范围)的Kd与N末端泛素化多肽的肽结合。在一些实施例中，抗体以小于100、10或1nM的Kd与N末端泛素化多肽的肽结合。在一些实施例中，抗体以约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、250、500、750或1000nM(包括这些值之间的任何值或范围)的Kd与N末端泛素化多肽的肽结合。在一些实施例中，使用表面等离子体共振(SPR)测量Kd。在一些实施例中，Kd是通过测量与GGM肽的结合来测量的。
本文提供不与包含支链双甘氨肽的氨基酸序列(K-ε-GG)结合的抗体。在一些实施例中，抗体不与包含支链双甘氨肽的氨基酸序列(K-ε-GG)结合，其中抗体的结合在背景下是不可检测的或与阴性对照处于同一水平(例如，非特异性结合的水平或结合中性亲和素的水平)。在一些实施例中，抗体与包含支链双甘氨肽的氨基酸序列(K-ε-GG)的结合是不可检测的(例如，不能通过ELISA、SPR测定、蛋白质印迹和/或免疫沉淀检测到)。
在一些实施例中，抗体与包含支链双甘氨肽的氨基酸序列(K-ε-GG)结合，其水平是抗体与N末端泛素化多肽结合的水平的50％、40％、30％、20％、10％(包括这些值之间的任何值或范围)，其中抗体与肽的N末端处的氨基酸序列GGX结合。在一些实施例中，抗体与包含支链双甘氨肽的氨基酸序列(K-ε-GG)结合的程度与抗体结合中性亲和素的程度相同。在一些实施例中，抗体与包含支链双甘氨肽的氨基酸序列(K-ε-GG)结合的程度与抗体结合链霉亲和素的程度相同。在一些实施例中，抗体与包含支链双甘氨肽的氨基酸序列(K-ε-GG)结合的水平是与阴性对照样品结合的水平(例如，与中性亲和素或链霉亲和素结合的水平)的不超过1.1、1.2、1.3、1.4或1.5倍高。在一些实施例中，抗体与包含支链双甘氨肽的氨基酸序列(K-ε-GG)结合的水平与与阴性对照样品结合的水平(例如，与中性亲和素或链霉亲和素结合的水平)在统计学上没有显著差异。
在一些实施例中，与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体与包含选自由以下项组成的组的N末端序列的肽结合：GGA、GGE、GGF、GGG、GGH、GGI、GGL、GGM、GGN、GGQ、GGS、GGT、GGV和GGW。在一些实施例中，抗体与包含N末端GGA序列的肽结合。在一些实施例中，抗体与包含N末端GGE序列的肽结合。在一些实施例中，抗体与包含N末端GGF序列的肽结合。在一些实施例中，抗体与包含N末端GGG序列的肽结合。在一些实施例中，抗体与包含N末端GGH序列的肽结合。在一些实施例中，抗体与包含N末端GGI序列的肽结合。在一些实施例中，抗体与包含N末端GGL序列的肽结合。在一些实施例中，抗体与包含N末端GGM序列的肽结合。在一些实施例中，抗体与包含N末端GGN序列的肽结合。在一些实施例中，抗体与包含N末端GGQ序列的肽结合。在一些实施例中，抗体与包含N末端GGS序列的肽结合。在一些实施例中，抗体与包含N末端GGT序列的肽结合。在一些实施例中，抗体与包含N末端GGV序列的肽结合。在一些实施例中，抗体与包含N末端GGW序列的肽结合。在一些实施例中，抗体与包含以下的N末端序列的肽结合：GGA、GGE、GGF、GGG、GGH、GGI、GGL、GGM、GGN、GGQ、GGS、GGT、GGV和GGW。在一些实施例中，抗体与以下结合：包含GGA的N末端序列的肽、包含GGE的N末端序列的肽、包含GGF的N末端序列的肽、包含GGG的N末端序列的肽、包含GGH的N末端序列的肽、包含GGI的N末端序列的肽、包含GGL的N末端序列的肽、包含GGM的N末端序列的肽、包含GGN的N末端序列的肽、包含GGQ的N末端序列的肽、包含GGS的N末端序列的肽、包含GGT的N末端序列的肽、包含GGV的N末端序列的肽，以及包含GGW的N末端序列的肽。
在一些实施例中，抗体与包含选自由以下项组成的组的N末端序列的一种或多种肽(包括肽的任意组合)结合：GGA、GGE、GGF、GGG、GGH、GGI、GGL、GGM、GGN、GGQ、GGS、GGT、GGV和GGW。在一些实施例中，抗体与以下结合：包含N末端GGA序列的肽、包含N末端GGE序列的肽、包含N末端GGF序列的肽、包含N末端GGG序列的肽、包含N末端GGH序列的肽、包含N末端GGI序列的肽、包含N末端GGL序列的肽、包含N末端GGM序列的肽、包含N末端GGN序列的肽、包含N末端GGQ序列的肽、包含N末端GGS序列的肽、包含N末端GGT序列的肽以及包含N末端GGV序列的肽。在一些实施例中，抗体与以下结合：包含N末端GGA序列的肽、包含N末端GGF序列的肽、包含N末端GGI序列的肽、包含N末端GGL序列的肽、包含N末端GGM序列的肽、包含N末端GGV序列的肽以及包含N末端GGW序列的肽。在一些实施例中，抗体与以下结合：包含N末端GGA序列的肽、包含N末端GGF序列的肽、包含N末端GGI序列的肽、包含N末端GGL序列的肽、包含N末端GGM序列的肽、包含N末端GGN序列的肽、包含N末端GGQ序列的肽、包含N末端GGS序列的肽以及包含N末端GGT序列的肽。在一些实施例中，抗体与以下结合：包含N末端GGA序列的肽、包含N末端GGE序列的肽、包含N末端GGF序列的肽、包含N末端GGG序列的肽、包含N末端GGH序列的肽、包含N末端GGI序列的肽、包含N末端GGL序列的肽、包含N末端GGM序列的肽、包含N末端GGN序列的肽、包含N末端GGQ序列的肽、包含N末端GGS序列的肽、包含N末端GGT序列的肽以及包含N末端GGV序列的肽。在一些实施例中，抗体与以下结合：包含N末端GGA序列的肽、包含N末端GGE序列的肽、包含N末端GGF序列的肽、包含N末端GGG序列的肽、包含N末端GGH序列的肽、包含N末端GGI序列的肽、包含N末端GGL序列的肽、包含N末端GGM序列的肽、包含N末端GGN序列的肽、包含N末端GGQ序列的肽、包含N末端GGS序列的肽、包含N末端GGT序列的肽、包含N末端GGV序列的肽以及包含N末端GGW序列的肽。示例性抗体的特异性提供于图1F中。
在一些实施例中，抗体为兔抗体、啮齿动物抗体或山羊抗体。在一些实施例中，抗体为兔抗体，其具有的氨基酸序列对应于由兔或兔细胞产生的抗体的氨基酸序列，或者来源于利用兔抗体全套库或其他兔抗体编码序列的非兔源的抗体的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体来源于兔。在一些实施例中，抗体来源于新西兰白兔。在一些实施例中，抗体来源于啮齿动物。在一些实施例中，抗体来源于山羊。在一些实施例中，抗体包含来源于兔、山羊或啮齿动物抗体的Fc区。在一些实施例中，抗体包含来源于兔、山羊或啮齿动物抗体的抗体片段。
在本发明的另一方面，根据以上实施例中的任一项的与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体为单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一些实施例中，与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体为抗体片段，例如，Fv、Fab、Fab'、scFv、双体抗体或F(ab')2片段。在另一个实施例中，与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体为全长抗体，例如，完整IgG1抗体或如本文所定义的其它抗体类别或同型。在一些实施例中，抗体为全长抗体、Fab片段或scFv。在一些实施例中，抗体为IgA、IgD、IgE、IgG或IgM类抗体。在一些实施例中，抗体为IgG类抗体。在一些实施例中，抗体为IgG类抗体并且具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。在一些实施例中，抗体为IgA类抗体并且具有IgA1或IgA2同型。
在本发明的另一方面，根据以上实施例中的任一项或本文所述的与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体缀合至异源部分、药剂或标记物。合适的标记物的实例为已知用于免疫测定的许多标记物，包括可直接检测的部分，诸如荧光染料、化学发光和放射性标记物，以及必须反应或衍生化才能检测的部分，诸如酶。此类标记物的实例包括放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I、荧光团，诸如稀土螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明(rhodamine)及其衍生物、丹酰(dansyl)、伞形酮(umbelliferone)、荧光素酶，例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456)、荧光素(luciferin)、2,3-二氢酞嗪二酮、HRP、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶(与利用过氧化氢氧化染料前体的酶诸如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶、生物素偶联(可通过例如亲和素、链霉亲和素、链霉亲和素-HRP和带有MUG的链霉亲和素-β-半乳糖苷酶检测))、自旋标记物、噬菌体标记物、稳定自由基等。在一些实施例中，标记物选自由以下项组成的组：生物素、地高辛和荧光素。在一些实施例中，根据以上实施例中的任一项的与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体缀合至生物素。
在一些实施例中，抗体固定在固体支持物上。在一些实施例中，抗体固定在珠子上。在一些实施例中，固定是通过吸附至水不溶性基质或表面(美国专利号3,720,760)或非共价或共价偶联(例如，使用戊二醛或碳二亚胺交联，先前用或不用例如硝酸和还原剂激活支持物，如美国专利号3,645,852或Rotmans等人；J.Immunol.Methods,57:87-98(1983)中所述)，或之后例如，通过免疫沉淀来使抗体不溶解来完成的。用于固定的固体支持物可以是基本上不溶于水的任何惰性支持物或载体，包括例如，表面、颗粒、多孔基质等形式的支持物。常用的固体支持物的实例包括小片、凝胶、聚氯乙烯、塑料珠以及由聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯等制造的测定板或试管，包括96-孔微量滴定板，以及颗粒材料诸如滤纸、琼脂糖、交联葡聚糖和其它多糖。
在一些实施例中，与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体包含在一侧含有位置35处的Asn、位置37处的Val、位置93处的Thr、位置101处的Asn和位置103处的Trp的可变重链(VH)。在一些实施例中，与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体包含含有根据Kabat编号位置34处的Ala、位置36处的Tyr和位置49处的Tyr的可变轻链(VL)。
在一些实施例中，与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中抗体包含含有氨基酸序列XXXMN(SEQ ID NO:35)的CDRH1；含有氨基酸序列XXXXXGXXYYATWA(SEQ ID NO:36)的CDRH2；以及含有氨基酸序列DDXXXXNX(SEQ ID NO:37)的CDRH3；其中所述抗体包含含有氨基酸序列QSXXSVYXXNXLX(SEQ ID NO:38)的CDRL1；含有氨基酸序列XASTLXS(SEQ ID NO:39)的CDRL2；以及含有氨基酸序列LGXXDCXSXDCXX(SEQ IDNO:40)的CDRL3；其中X为任何氨基酸。在一些实施例中，VH包含SEQ ID NO:33中所示的氨基酸。在一些实施例中，VL包含SEQ ID NO:34中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，VH包含SEQ ID NO:33中所示的氨基酸，并且VL包含SEQ ID NO:34中所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体包含如表2A和表2B中所示的抗体1C7的一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。在一些实施例中，抗体包含如表3中所示的抗体1C7的VH和/或VL。在一些实施例中，抗体包含如表4中所示的抗体1C7的重链和/或轻链。
在一些实施例中，与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施例中，VH序列含有相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但保留与包含SEQ ID NO:1的抗体一样的与N末端泛素化多肽结合的能力。在某些实施例中，在SEQ ID NO:1中，总共有1至13个氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些实施例中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。在一个特定实施例中，VH包含一个、两个或三个选自由以下项组成的组的CDR：(a)CDRH1，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；(b)CDRH2，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；以及(c)CDRH3，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
在另一方面，提供了一种与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体，其中该抗体包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施例中，VL序列含有相对于SEQID NO:2的氨基酸序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但保留与包含SEQ ID NO:2的抗体一样的与N末端泛素化多肽的肽结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:2中，总共有1至11个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在某些实施例中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。在一个特定实施例中，VL包含一个、两个或三个选自由以下项组成的组的CDR：(a)CDRLl，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(b)CDRL2，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及(c)CDRL3，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在一个实施例中，与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VL和含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH。
在另一方面，提供了一种与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体，其中该抗体包含：VH，其包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDRH1、含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDRH2和含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDRH3；以及VL，其包含含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDRLl、含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDRL2和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDRL3。
在另一方面，提供了一种与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体，其中该抗体包含：VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，其分别含有具有SEQ ID NO:1中所示的序列的VH的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；以及VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其分别含有具有SEQ ID NO:2中所示的序列的VL的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体包含与SEQ ID NO:52的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链。在某些实施例中，重链序列含有相对于SEQ ID NO:52的氨基酸序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但保留与包含SEQ ID NO:52的抗体一样的与N末端泛素化多肽结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:52中，总共有1至20个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在一些实施例中，抗体包含含有SEQ ID NO:52中所示的氨基酸序列的重链。
在一些实施例中，抗体包含与SEQ ID NO:53的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链。在某些实施例中，轻链序列含有相对于SEQ ID NO:53的氨基酸序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但保留与包含SEQ ID NO:53的抗体一样的与N末端泛素化多肽结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:53中，总共有1至20个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在一些实施例中，抗体包含含有SEQ ID NO:53中所示的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体包含如表2A和表2B中所示的抗体2B12的一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。在一些实施例中，抗体包含如表3中所示的抗体2B12的VH和/或VL。在一些实施例中，抗体包含如表4中所示的抗体2B12的重链和/或轻链。
在一些实施例中，与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施例中，VH序列含有相对于SEQ ID NO:9的氨基酸序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但保留与包含SEQ ID NO:9的抗体一样的与N末端泛素化多肽的肽结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:9中，总共有1至13个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在某些实施例中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。在一个特定实施例中，VH包含一个、两个或三个选自由以下项组成的组的CDR：(a)CDRH1，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；(b)CDRH2，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；以及(c)CDRH3，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
在另一方面，提供了一种与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体，其中该抗体包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施例中，VL序列含有相对于SEQID NO:10的氨基酸序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但保留与包含SEQ ID NO:10的抗体一样的与N末端泛素化多肽的肽结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:10中，总共有1至11个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在某些实施例中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。在一个特定实施例中，VL包含一个、两个或三个选自由以下项组成的组的CDR：(a)CDRLl，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；(b)CDRL2，其包含SEQ IDNO:15的氨基酸序列；以及(c)CDRL3，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
在一个实施例中，与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL和含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VH。
在另一方面，提供了一种与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体，其中该抗体包含：VH，其包含含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDRH1、含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDRH2和含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDRH3；以及VL，其包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDRLl、含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDRL2和含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDRL3。
在另一方面，提供了一种与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体，其中该抗体包含：VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，其分别含有具有SEQ ID NO:9中所示的序列的VH的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；以及VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其分别含有具有SEQ ID NO:10中所示的序列的VL的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体包含与SEQ ID NO:54的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链。在某些实施例中，重链序列含有相对于SEQ ID NO:54的氨基酸序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但保留与包含SEQ ID NO:54的抗体一样的与N末端泛素化多肽结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:52中，总共有1至20个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在一些实施例中，抗体包含含有SEQ ID NO:54中所示的氨基酸序列的重链。
在一些实施例中，抗体包含与SEQ ID NO:55的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链。在某些实施例中，轻链序列含有相对于SEQ ID NO:55的氨基酸序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但保留与包含SEQ ID NO:55的抗体一样的与N末端泛素化多肽结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:55中，总共有1至20个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在一些实施例中，抗体包含含有SEQ ID NO:55中所示的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体包含如表2A和表2B中所示的抗体2E9的一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。在一些实施例中，抗体包含如表3中所示的抗体2E9的VH和/或VL。在一些实施例中，抗体包含如表4中所示的抗体2E9的重链和/或轻链。
在一些实施例中，与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体包含与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施例中，VH序列含有相对于SEQ ID NO:17的氨基酸序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但保留与包含SEQ ID NO:17的抗体一样的与N末端泛素化多肽的肽结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:17中，总共有1至13个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在某些实施例中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。在一个特定实施例中，VH包含一个、两个或三个选自由以下项组成的组的CDR：(a)CDRH1，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；(b)CDRH2，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；以及(c)CDRH3，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
在另一方面，提供了一种与N末端泛素化多肽的肽的肽结合的抗体，其中该抗体包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施例中，VL序列含有相对于SEQ ID NO:18的氨基酸序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但保留与包含SEQ IDNO:18的抗体一样的与N末端泛素化多肽结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:18中，总共有1至11个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在某些实施例中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。在一个特定实施例中，VL包含一个、两个或三个选自由以下项组成的组的CDR：(a)CDRLl，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；(b)CDRL2，其包含SEQ IDNO:23的氨基酸序列；以及(c)CDRL3，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
在一个实施例中，与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体包含含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL和含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VH。
在另一方面，提供了一种与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体，其中该抗体包含：VH，其包含含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDRH1、含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDRH2和含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDRH3；以及VL，其包含含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDRLl、含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDRL2和含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDRL3。
在另一方面，提供了一种与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体，其中该抗体包含：VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，其分别含有具有SEQ ID NO:17中所示的序列的VH的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；以及VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其分别含有具有SEQ ID NO:18中所示的序列的VL的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体包含与SEQ ID NO:56的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链。在某些实施例中，重链序列含有相对于SEQ ID NO:56的氨基酸序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但保留与包含SEQ ID NO:56的抗体一样的与N末端泛素化多肽结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:56中，总共有1至20个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在一些实施例中，抗体包含含有SEQ ID NO:56中所示的氨基酸序列的重链。
在一些实施例中，抗体包含与SEQ ID NO:57的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链。在某些实施例中，轻链序列含有相对于SEQ ID NO:57的氨基酸序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但保留与包含SEQ ID NO:57的抗体一样的与N末端泛素化多肽结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:53中，总共有1至20个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在一些实施例中，抗体包含含有SEQ ID NO:57中所示的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体包含如表2A和表2B中所示的抗体2H2的一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。在一些实施例中，抗体包含如表3中所示的抗体2H2的VH和/或VL。在一些实施例中，抗体包含如表4中所示的抗体2H2的重链和/或轻链。
在一些实施例中，与N末端泛素化多肽的肽的肽结合的抗体包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施例中，VH序列含有相对于SEQ ID NO:25的氨基酸序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但保留与包含SEQ ID NO:25的抗体一样的与N末端泛素化多肽的肽结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:25中，总共有1至13个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在某些实施例中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。在一个特定实施例中，VH包含一个、两个或三个选自由以下项组成的组的CDR：(a)CDRH1，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；(b)CDRH2，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；以及(c)CDRH3，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
在另一方面，提供了一种与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体，其中该抗体包含与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施例中，VL序列含有相对于SEQID NO:26的氨基酸序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但保留与包含SEQ IDNO:26的抗体一样的与N末端泛素化多肽的肽结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:26中，总共有1至11个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在某些实施例中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。在一个特定实施例中，VL包含一个、两个或三个选自由以下项组成的组的CDR：(a)CDRLl，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；(b)CDRL2，其包含SEQ IDNO:31的氨基酸序列；以及(c)CDRL3，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。
在一个实施例中，与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体包含含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL和含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VH。
在另一方面，提供了一种与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体，其中该抗体包含：VH，其包含含有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDRH1、含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDRH2和含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDRH3；以及VL，其包含含有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDRLl、含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDRL2和含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDRL3。
在另一方面，提供了一种与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体，其中该抗体包含：VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，其分别含有具有SEQ ID NO:25中所示的序列的VH的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；以及VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其分别含有具有SEQ ID NO:26中所示的序列的VL的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体包含与SEQ ID NO:58的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链。在某些实施例中，重链序列含有相对于SEQ ID NO:58的氨基酸序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但保留与包含SEQ ID NO:58的抗体一样的与N末端泛素化多肽结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:58中，总共有1至20个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在一些实施例中，抗体包含含有SEQ ID NO:58中所示的氨基酸序列的重链。
在一些实施例中，抗体包含与SEQ ID NO:59的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链。在某些实施例中，轻链序列含有相对于SEQ ID NO:59的氨基酸序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但保留与包含SEQ ID NO:59的抗体一样的与N末端泛素化多肽结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:59中，总共有1至20个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在一些实施例中，抗体包含含有SEQ ID NO:59中所示的氨基酸序列的轻链。
在另一方面，提供了一种与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体，其中该抗体包含如在上文提供的实施例中的任一项的VH以及如在上文提供的实施例中的任一项的VL。
在另一方面，本文提供了一种组合物，该组合物包含根据以上实施例中的任一项或本文所述的与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体中的一种或多种。在一些实施例中，含有抗体的一种多种的组合物包含药学上可接受的载体。
本文还提供了产生与如本文所述的N末端泛素化多肽的肽结合的抗体的方法。
3.抗体变体
在某些实施例中，考虑了与本文提供的N末端泛素化多肽的肽结合的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能期望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物特性。抗体的氨基酸序列变体可以通过向编码抗体的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内残基的缺失、和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以实现最终构建体，前提条件是最终构建体具有期望特征，例如，与N末端泛素化多肽的肽结合。
在某些实施例中，提供了具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。用于取代诱变的目标位点包括CDR和FR。优选的，保守取代在表1中的“优选的取代”标题下示出。更多实质性变化提供于表1中的“示例性取代”标题下，并且在下文中关于氨基酸侧链类别予以进一步描述。可以将氨基酸取代引入目标抗体中，并且针对所需活性(例如，保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC)对产物进行筛选。
表1.
原始残基 示例性取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp、Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
可根据共同的侧链特性将氨基酸分组：
-疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
-中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
-酸性：Asp、Glu；
-碱性：His、Lys、Arg；
-影响链取向的残基：Gly，Pro；
-芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代将需要用这些类别中的一个的成员交换另一类别。
一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如人源化抗体或人抗体)的一个或多个高可变区残基或CDR残基。通常，为进一步研究而选择的一种或多种所得变体相对于亲本抗体将在某些生物特性(例如，提高的亲和力、降低的免疫原性)上具有修饰(例如，改善)和/或将基本上保留亲本抗体的某些生物特性。示例性取代变体是亲和力成熟抗体，其可例如使用诸如本文所述的那些基于噬菌体展示的亲和力成熟技术方便地生成。简而言之，将一个或多个CDR残基突变并且将变体抗体展示在噬菌体上并针对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。
例如，可在CDR中作出改变(例如，取代)，以改善抗体亲和力。此类改变可以在CDR“热点”中进行，即由在体细胞成熟过程期间经历高频突变的密码子编码的残基(参见例如，Chowdhury,Methods Afol.Biol.207:179-196(2008))，和/或SDR(a-CDR)，测试所得变体VH或VL的结合亲和力。通过构建并自二级文库重新选择而实现的亲和力成熟已被例如，Hoogenboom等人在Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等人编辑，HumanPress,Totowa,NJ,(2001))中进行描述。在亲和力成熟的一些实施例中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向突变)中的任一者将多样性引入出于成熟目的而挑选的可变基因中。然后创建一个二级文库。随后对该文库进行筛选以鉴别具有所需亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及CDR定向方法，其中将若干CDR残基(例如，每次4至6个残基)随机化。参与抗原结合的CDR残基可例如使用丙氨酸扫描突变或建模来特异性地鉴定。具体而言，常常靶向CDRH3和CDRL3。
在某些实施例中，取代、插入或缺失可发生在一个或多个CDR内，只要此类改变不基本上降低抗体的抗原结合能力即可。例如，可在CDR中进行基本上不降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文提供的保守性取代)。此类改变可在CDR“热点”或SDR之外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施例中，每个CDR保持不变，或包含不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
可用于鉴别可被靶向诱变的抗体残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science，244:1081-1085所述。在此方法中，鉴定残基或一组靶残基(例如，带电残基，诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并用中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替换以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可在对初始取代展示功能敏感性的氨基酸位置引入其他取代。
可替代地或另外地，利用抗原-抗体复合物的晶体结构鉴别抗体与抗原之间的接触点。可靶向或消除作为取代的候选的此类接触残基和相邻残基。可筛选变体以确定它们是否具备期望的特性。
氨基酸序列插入包括长度范围为一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及一个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括与增加抗体的血清半衰期的酶(例如对于ADEPT)或多肽的抗体的N末端或C末端的融合。
B.核酸、载体、宿主细胞
本文还提供了编码与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体的核酸。在一些实施例中，核酸编码本文所述的任何抗体。
在一些实施例中，核酸编码与包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)的N末端泛素化多肽的肽结合的抗体，其中该抗体包含含有氨基酸序列XXXMN(SEQ ID NO:35)的CDRH1；含有氨基酸序列XXXXXGXXYYATWA(SEQ ID NO:36)的CDRH2；以及含有氨基酸序列DDXXXXNX(SEQ ID NO:37)的CDRH3；其中该抗体包含SEQ ID NO:QSXXSVYXXNXLX(SEQ ID NO:38)中所示的CDRL1序列；含有氨基酸序列XASTLXS(SEQ ID NO:39)的CDRL2；以及含有氨基酸序列LGXXDCXSXDCXX(SEQ ID NO:40)的CDRL3；其中X为任何氨基酸。在一些实施例中，核酸编码包含含有SEQ ID NO:33中所示的氨基酸的VH的抗体。在一些实施例中，核酸编码包含含有SEQ ID NO:34中所示的氨基酸序列的VL的抗体。在一些实施例中，核酸编码包含含有SEQID NO:33中所示的氨基酸的VH的抗体并且VL包含SEQ ID NO:34中所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，核酸编码与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体，其中该抗体包含如表2A和表2B中所示的抗体1C7的一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。在一些实施例中，核酸编码包含如表3中所示的抗体1C7的VH和/或VL的抗体。在一些实施例中，核酸编码包含如表4中所示的抗体1C7的重链和/或轻链的抗体。
在一些实施例中，核酸编码与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体，其中该抗体包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施例中，核酸编码VH序列，该VH序列含有相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但保留与包含SEQ ID NO:1的抗体一样的与N末端泛素化多肽结合的能力。在某些实施例中，在SEQ ID NO:1中，总共有1至13个氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些实施例中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。在一个特定实施例中，核酸编码包含VH的抗体，该VH包含一个、两个或三个选自由以下项组成的组的CDR：(a)CDRH1，其包含SEQID NO:3的氨基酸序列；(b)CDRH2，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；以及(c)CDRH3，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
在另一方面，提供了编码与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体的核酸，其中该抗体包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施例中，核酸编码包含VL序列的抗体，该VL序列含有相对于SEQ ID NO:2的氨基酸序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但保留与包含SEQ ID NO:2的抗体一样的与N末端泛素化多肽结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:2中，总共有1至11个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在某些实施例中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。在一个特定实施例中，核酸编码包含VL抗体，该VL包含一个、两个或三个选自由以下项组成的组的CDR：(a)CDRLl，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(b)CDRL2，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及(c)CDRL3，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在一个实施例中，核酸编码与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体，其中该抗体包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VL和含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH。
在另一方面，提供了一种编码与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体的核酸，其中该抗体包含：VH，其包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDRH1、含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDRH2和含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDRH3；以及VL，其包含含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDRLl、含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDRL2和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDRL3。
在另一方面，提供了一种编码与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体的核酸，其中该抗体包含：VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，其分别含有具有SEQ ID NO:1中所示的序列的VH的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；以及VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其分别含有具有SEQ IDNO:2中所示的序列的VL的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施例中，核酸编码包含重链的抗体，该重链与SEQ ID NO:52的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在某些实施例中，重链序列含有相对于SEQ ID NO:52的氨基酸序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但保留与包含SEQ ID NO:52的抗体一样的与N末端泛素化多肽结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:52中，总共有1至20个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在一些实施例中，抗体包含含有SEQ ID NO:52中所示的氨基酸序列的重链。
在一些实施例中，核酸编码包含轻链的抗体，该轻链与SEQ ID NO:53的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在某些实施例中，轻链序列含有相对于SEQ ID NO:53的氨基酸序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但保留与包含SEQ ID NO:53的抗体一样的与N末端泛素化多肽结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:53中，总共有1至20个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在一些实施例中，抗体包含含有SEQ ID NO:53中所示的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，核酸编码与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体，其中该抗体包含如表2A和表2B中所示的抗体2B12的一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。在一些实施例中，核酸编码包含如表3中所示的抗体2B12的VH和/或VL的抗体。在一些实施例中，核酸编码包含如表4中所示的抗体2B12的重链和/或轻链的抗体。
在一些实施例中，核酸编码与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体，其中该抗体包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施例中，核酸编码包含VH序列的抗体，该VH序列含有相对于SEQ ID NO:9的氨基酸序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但保留与包含SEQ ID NO:9的抗体一样的与N末端泛素化多肽的肽结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:9中，总共有1至13个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在某些实施例中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。在一个特定实施例中，核酸编码包含VH的抗体，该VH包含一个、两个或三个选自由以下项组成的组的CDR：(a)CDRH1，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；(b)CDRH2，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；以及(c)CDRH3，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
在另一方面，提供了一种编码与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体的核酸，其中该抗体包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施例中，核酸编码包含VL序列的抗体，该VL序列含有相对于SEQ ID NO:10的氨基酸序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但保留与包含SEQ ID NO:10的抗体一样的与N末端泛素化多肽的肽结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:10中，总共有1至11个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在某些实施例中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。在一个特定实施例中，核酸编码包含VL抗体，该VL包含一个、两个或三个选自由以下项组成的组的CDR：(a)CDRLl，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；(b)CDRL2，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；以及(c)CDRL3，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
在一个实施例中，核酸编码与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体，其中该抗体包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL和含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VH。
在另一方面，提供了一种编码与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体的核酸，其中该抗体包含：VH，其包含含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDRH1、含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDRH2和含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDRH3；以及VL，其包含含有SEQ IDNO:14的氨基酸序列的CDRLl、含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDRL2和含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDRL3。
在另一方面，提供了一种编码与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体的核酸，其中该抗体包含：VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，其分别含有具有SEQ ID NO:9中所示的序列的VH的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；以及VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其分别含有具有SEQ IDNO:10中所示的序列的VL的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施例中，核酸编码包含重链的抗体，该重链与SEQ ID NO:54的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在某些实施例中，重链序列含有相对于SEQ ID NO:54的氨基酸序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但保留与包含SEQ ID NO:54的抗体一样的与N末端泛素化多肽结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:54中，总共有1至20个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在一些实施例中，抗体包含含有SEQ ID NO:54中所示的氨基酸序列的重链。
在一些实施例中，核酸编码包含轻链的抗体，该轻链与SEQ ID NO:55的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在某些实施例中，轻链序列含有相对于SEQ ID NO:55的氨基酸序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但保留与包含SEQ ID NO:55的抗体一样的与N末端泛素化多肽结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:55中，总共有1至20个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在一些实施例中，抗体包含含有SEQ ID NO:55中所示的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，核酸编码与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体，其中该抗体包含如表2A和表2B中所示的抗体2E9的一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。在一些实施例中，核酸编码包含如表3中所示的抗体2E9的VH和/或VL的抗体。在一些实施例中，核酸编码包含如表4中所示的抗体2E9的重链和/或轻链的抗体。
在一些实施例中，核酸编码与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体，其中该抗体包含与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施例中，核酸编码包含VH序列的抗体，该VH序列含有相对于SEQ ID NO:17的氨基酸序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但保留与包含SEQ ID NO:17的抗体一样的与N末端泛素化多肽的肽结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:17中，总共有1至13个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在某些实施例中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。在一个特定实施例中，核酸编码包含VH的抗体，该VH包含一个、两个或三个选自由以下项组成的组的CDR：(a)CDRH1，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；(b)CDRH2，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；以及(c)CDRH3，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
在另一方面，提供了一种编码与N末端泛素化多肽的肽的肽结合的抗体的核酸，其中该抗体包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施例中，核酸编码包含VL序列的抗体，该VL序列含有相对于SEQ ID NO:18的氨基酸序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但保留与包含SEQ ID NO:18的抗体一样的与N末端泛素化多肽结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:18中，总共有1至11个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在某些实施例中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。在一个特定实施例中，核酸编码包含VL抗体，该VL包含一个、两个或三个选自由以下项组成的组的CDR：(a)CDRLl，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；(b)CDRL2，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；以及(c)CDRL3，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
在一个实施例中，核酸编码与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体，其中该抗体包含含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL和含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VH。
在另一方面，提供了一种编码与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体的核酸，其中该抗体包含：VH，其包含含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDRH1、含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDRH2和含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDRH3；以及VL，其包含含有SEQ IDNO:22的氨基酸序列的CDRLl、含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDRL2和含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDRL3。
在另一方面，提供了一种编码与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体的核酸，其中该抗体包含：VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，其分别含有具有SEQ ID NO:17中所示的序列的VH的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；以及VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其分别含有具有SEQID NO:18中所示的序列的VL的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施例中，核酸编码包含重链的抗体，该重链与SEQ ID NO:56的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在某些实施例中，重链序列含有相对于SEQ ID NO:56的氨基酸序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但保留与包含SEQ ID NO:52的抗体一样的与N末端泛素化多肽结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:56中，总共有1至20个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在一些实施例中，抗体包含含有SEQ ID NO:56中所示的氨基酸序列的重链。
在一些实施例中，核酸编码包含轻链的抗体，该轻链与SEQ ID NO:57的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在某些实施例中，轻链序列含有相对于SEQ ID NO:57的氨基酸序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但保留与包含SEQ ID NO:57的抗体一样的与N末端泛素化多肽结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:57中，总共有1至20个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在一些实施例中，抗体包含含有SEQ ID NO:57中所示的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，核酸编码与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体，其中该抗体包含如表2A和表2B中所示的抗体2H2的一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。在一些实施例中，核酸编码包含如表3中所示的抗体2H2的VH和/或VL的抗体。在一些实施例中，核酸编码包含如表4中所示的抗体2H2的重链和/或轻链的抗体。
在一些实施例中，核酸编码与N末端泛素化多肽的肽的肽结合的抗体，该抗体包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施例中，核酸编码包含VH序列的抗体，该VH序列含有相对于SEQ ID NO:25的氨基酸序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但保留与包含SEQ ID NO:25的抗体一样的与N末端泛素化多肽的肽结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:25中，总共有1至13个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在某些实施例中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。在一个特定实施例中，核酸编码包含VH的抗体，该VH包含一个、两个或三个选自由以下项组成的组的CDR：(a)CDRH1，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；(b)CDRH2，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；以及(c)CDRH3，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
在另一方面，提供了一种编码与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体的核酸，其中该抗体包含与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施例中，核酸编码包含VL序列的抗体，该VL序列含有相对于SEQ ID NO:26的氨基酸序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但保留与包含SEQ ID NO:26的抗体一样的与N末端泛素化多肽的肽结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:26中，总共有1至11个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在某些实施例中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。在一个特定实施例中，核酸编码包含VL抗体，该VL包含一个、两个或三个选自由以下项组成的组的CDR：(a)CDRLl，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；(b)CDRL2，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；以及(c)CDRL3，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。
在一个实施例中，核酸编码与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体，其中该抗体包含含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL和含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VH。
在另一方面，提供了一种编码与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体的核酸，其中该抗体包含：VH，其包含含有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDRH1、含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDRH2和含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDRH3；以及VL，其包含含有SEQ IDNO:30的氨基酸序列的CDRLl、含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDRL2和含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDRL3。
在另一方面，提供了一种编码与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体的核酸，其中该抗体包含：VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，其分别含有具有SEQ ID NO:25中所示的序列的VH的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；以及VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其分别含有具有SEQID NO:26中所示的序列的VL的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施例中，核酸编码包含重链的抗体，该重链与SEQ ID NO:58的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在某些实施例中，重链序列含有相对于SEQ ID NO:58的氨基酸序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但保留与包含SEQ ID NO:58的抗体一样的与N末端泛素化多肽结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:58中，总共有1至20个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在一些实施例中，抗体包含含有SEQ ID NO:58中所示的氨基酸序列的重链。
在一些实施例中，核酸编码包含轻链的抗体，该轻链与SEQ ID NO:59的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在某些实施例中，轻链序列含有相对于SEQ ID NO:59的氨基酸序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但保留与包含SEQ ID NO:59的抗体一样的与N末端泛素化多肽结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:59中，总共有1至20个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在一些实施例中，抗体包含含有SEQ ID NO:59中所示的氨基酸序列的轻链。
在另一方面，提供了一种编码与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体的核酸，其中该抗体包含如在上文提供的实施例中的任一项的VH以及如在本文提供的实施例中的任一项的VL。
本文还提供了一种包含本文所述的核酸中的任一者的载体。本文还提供了一种包含本文所述的载体和/或核酸中的任一者的宿主细胞。在一些实施例中，宿主细胞经过分离或纯化。在一些实施例中，宿主细胞在细胞培养基中。
对于抗体生产，可将包含本文描述的核酸的载体引入本领域已知的适当生产细胞系(诸如，例如，NS0细胞)中。表达载体的引入可通过经由电穿孔的共转染或本领域可用的任何其他合适的转化技术来完成。然后可选择并且扩增抗体生产细胞系，并且对人源化抗体进行纯化。然后可通过标准技术诸如SDS-PAGE分析纯化的抗体。
本文还提供了一种包含编码与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体的核酸的宿主细胞。在一些实施例中，宿主细胞包含编码本文所述的抗体中的任一者的核酸。用于克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。关于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。(也参见Charlton,Methods inMolecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo,B.K.C.主编，Humana Press，Totowa，NJ(2003)，第245-254页，描述抗体片段在大肠杆菌中的表达。)抗体可在表达后在可溶性级分中从细菌细胞糊中分离，并且可以进一步纯化。
除了原核生物外，诸如丝状真菌或酵母等真核微生物也是用于编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主，所述真核微生物包括这样的真菌和酵母菌株，其糖基化途径已经“人源化”，从而导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)和Li等人,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞也来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定出了许多可以与昆虫细胞一起使用的杆状病毒株，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它实例为由SV40(COS-7)转化的猴肾CVl系；人胚胎肾系(例如Graham等人,J.Gen Virol.36:59(1977)中所述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述的TM4细胞)；猴肾细胞(CVl)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562)；TRI细胞(例如Mather等人,Annals N Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述)；MRC5细胞；以及FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，诸如Y0、NS0和Sp2/0。关于适用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo主编，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。
单克隆抗体(包括与肽的N末端处的氨基酸序列GGX结合的抗体，其中该抗体不与包含支链双甘氨肽的氨基酸序列(K-ε-GG)结合，如本文所述)可以使用Kohler等人.,Nature,256:495(1975)首次描述的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法来制备(美国专利号4,816,567)。
在杂交瘤方法中，如上文所述对小鼠或其它适当的宿主动物(诸如仓鼠或猕猴)进行免疫以引发产生或能够产生抗体的淋巴细胞，这些抗体将与多肽特异性结合以用于免疫。可替代地，可以体外免疫淋巴细胞。接着使用合适的融合剂(诸如聚乙二醇)融合淋巴细胞与瘤细胞以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles andPractice，第59-103页(Academic Press,1986))。将由此制备的杂交瘤细胞接种在合适的培养基中并使其生长，该培养基优选地含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞的生长或生存的物质。例如，若亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨喋呤及胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止缺乏HGPRT的细胞的生长。
优选的骨髓瘤细胞是有效融合的那些，支持选定抗体产生细胞稳定高水平地产生抗体，并对培养基(诸如HAT培养基)敏感。其中，优选的骨髓瘤细胞系为鼠骨髓瘤系，诸如来源于可从Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,California USA获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤，和来源于可从American Type Culture Collection,Rockville,Maryland USA获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞。还已经描述了人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系用于人单克隆抗体的产生(Kozbor,J.lmmunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
关于针对抗原的单克隆抗体的产生而分析其中生长杂交瘤细胞的培养基。优选地，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合测定诸如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定。
鉴别出产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞之后，便可通过有限稀释法对该克隆进行亚克隆并通过标准方法使其生长(Goding,MonoclonalAntibodies:Principles and Practice，第59-103页(Academic Press,1986))。用于此目的的合适培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以作为动物的腹水瘤在体内生长。
通过常规免疫球蛋白纯化方法(诸如，例如蛋白A-琼脂糖凝胶、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析)，适当地将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清分离。
编码抗体的DNA易于使用常规程序(例如，通过使用能够与编码单克隆抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)进行分离并测序。杂交瘤细胞充当此类DNA的优选的来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染至不另外产生免疫球蛋白蛋白的宿主细胞诸如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中，以在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。
DNA还可以被修饰，例如，通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列取代同源鼠类序列(美国专利号4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA,81:6851(1984))，或通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接至免疫球蛋白编码序列。
典型地，这种非免疫球蛋白多肽取代抗体的恒定结构域，或者它们取代抗体的一个抗原结合位点的可变结构域，以产生嵌合二价抗体，该抗体包含一个对抗原具有特异性的抗原结合位点和另一个对不同抗原具有特异性的抗原结合位点。
C.筛选方法
本文还提供了一种筛选与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体的方法，其中抗体与肽的N末端处的氨基酸序列GGX结合，其中抗体不与包含支链双甘氨肽的氨基酸序列(K-ε-GG)结合。在一些实施例中，X为任何氨基酸。
在一些实施例中，方法包括i)提供抗体文库；ii)正向选择与在N末端处包含氨基酸序列GGX的肽结合的抗体，其中X为任何氨基酸；以及iii)负向选择与包含氨基酸序列K-ε-GG的肽结合的抗体，从而产生与在N末端处包含氨基酸序列GGX的肽特异性结合并且不与氨基酸序列K-ε-GG结合的抗体。在一些实施例中，在步骤ii)中，正向选择与在N末端处包含氨基酸序列GGM的肽结合的抗体。在一些实施例中，在步骤ii)中，正向选择与在N末端处包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列的肽结合的抗体：GGA、GGE、GGF、GGG、GGH、GGI、GGL、GGM、GGN、GGQ、GGS、GGT、GGV和GGW。
在一些实施例中，方法包括提供抗体文库以及正向选择与在N末端泛素化多肽的肽的N末端处的氨基酸序列GGX结合的抗体。在一些实施例中，提供了噬菌体展示文库。在一些实施例中，提供了酵母展示文库。在一些实施例中，提供了细菌展示文库。
本文提供的抗体文库可包含来自各种来源的抗体。例如，在一些实施例中，提供了合成抗体的文库。在一些实施例中，提供了人初始抗体的文库。在一些实施例中，提供了骆驼抗体的文库。在一些实施例中，提供了鼠抗体文库。在一些实施例中，提供了兔抗体的文库。在一些实施例中，提供了人源化抗体的文库。
在一些实施例中，文库通过用包含在N末端处含有氨基酸序列GGM的肽的肽文库免疫哺乳动物来产生。在一些实施例中，文库通过克隆来自经免疫的哺乳动物的抗体来产生。在一些实施例中，经免疫的哺乳动物为啮齿动物(例如，小鼠)或兔。在一些实施例中，将哺乳动物用肽文库免疫。在一些实施例中，将哺乳动物用N末端泛素化多肽的文库免疫。在一些实施例中，将哺乳动物用包含肽的N末端泛素化多肽免疫，该肽在肽的N末端处包含氨基酸序列GGX。在一些实施例中，将哺乳动物用包含肽的N末端泛素化多肽免疫，该肽在肽的N末端处包含氨基酸序列GGM
本文还提供了一种肽文库，其可用于产生和/或筛选与N末端泛素化多肽的肽的N末端处的氨基酸序列GGX结合的抗体。在一些实施例中，X为任何氨基酸。
在一些实施例中，在抗体文库中正向选择与在N末端处包含氨基酸序列GGM的肽结合的抗体。在一些实施例中，通过噬菌体淘选在抗体文库中正向选择。在一些实施例中，将抗体文库与一种或多种与固体支持物结合的在N末端处包含氨基酸序列GGM的肽一起孵育。在一些实施例中，将未结合抗体通过洗涤去除，并且将结合抗体用HCl洗脱。在一些实施例中，在文库中正向选择至少两次、至少三次、至少四次或多于五次。在一些实施例中，根据如实例1中描述的方法正向选择抗体文库(参见例如实例1，材料和方法、噬菌体文库产生和选择)。
在一些实施例中，通过与一种或多种N末端泛素化多肽一起孵育，在抗体文库中进行正向选择。在一些实施例中，通过与一种或多种在N末端处包含氨基酸序列GGM的肽一起孵育，在抗体文库中进行正向选择。
在一些实施例中，进行多轮正向选择，其中每轮使用不同的肽。在一些实施例中，进行多轮正向选择，其中每轮使用相同的肽。
在一些实施例中，在抗体文库中负向选择与包含氨基酸序列K-ε-GG的肽结合的抗体。在一些实施例中，负向选择包括将抗体文库与包含氨基酸序列K-ε-GG的肽一起孵育。在一些实施例中，负向选择包括将抗体文库与与固体底物结合的包含氨基酸序列K-ε-GG的肽一起孵育，以及保留上清液并且弃去结合抗体。在一些实施例中，负向选择包括将抗体文库与包含氨基酸序列K-ε-GG的游离肽一起孵育。在一些实施例中，根据如实例1中描述的方法进行负向选择(参见，例如，实例1，材料和方法、噬菌体文库产生和选择)。
在一些实施例中，正向选择和负向选择同时进行。在一些实施例中，将抗体文库与一种或多种与固体支持物结合的在N末端处包含氨基酸序列GGM的肽一起孵育，并与一种或多种包含氨基酸序列K-ε-GG的未结合的肽一起孵育。在一些实施例中，选择与固体底物结合的抗体。
在一些实施例中，正向选择和负向选择同时进行。在一些实施例中，将抗体文库与一种或多种在N末端处包含氨基酸序列GGM的未结合的肽一起孵育，并与一种或多种与固体支持物结合的包含氨基酸序列K-ε-GG的肽一起孵育。在一些实施例中，选择不与固体底物结合的抗体。
在一些实施例中，正向选择和负向选择依次进行。例如，在一些实施例中，在抗体文库中首先正向选择与在N末端处包含氨基酸序列GGM的肽结合的抗体，并且然后负向选择与包含氨基酸序列K-ε-GG的肽结合的抗体。在一些实施例中，在抗体文库中首先负向选择与包含氨基酸序列K-ε-GG的肽结合的抗体，并且然后正向选择与在N末端处包含氨基酸序列GGM的肽结合的抗体。
在一些实施例中，正向选择和负向选择的步骤重复两次或更多次。例如，在一些实施例中，正向选择和负向选择重复至少两次、至少三次、至少四次或至少五次。
在一些实施例中，测定所选择的抗体以确认它们与在肽的N末端处包含氨基酸序列GGX的肽结合，但不与包含K-ε-GG的氨基酸序列结合。在一些实施例中，使用ELISA或SPR测定抗体。在一些实施例中，根据如实例1中描述的方法测定抗体(参见例如，实例1，材料和方法、pAb ELISA和单克隆抗体ELISA)。在一些实施例中，在泛素化测定中测定抗体。实例5中描述了示例性泛素化测定方法。
本文还提供了一种通过如本文所述的筛选方法产生的抗体。
D.富集样品中的N末端泛素化肽的方法
本文还提供了富集包含肽的混合物的样品中的N末端泛素化肽的方法。此外，提供了N末端泛素化肽的文库。
1.富集的方法
本文提供了富集包含肽的混合物的样品中的N末端泛素化肽的方法。在一些实施例中，方法包括i)使样品与与N末端泛素化蛋白的肽结合的抗体接触；以及ii)从样品中选择抗体结合的肽，其中该抗体与N末端处的氨基酸序列GGX结合，其中该抗体不与包含支链双甘氨肽的氨基酸序列(K-ε-GG)结合。在一些实施例中，X为任何氨基酸。在一些实施例中，抗体为与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体中的任一者，如本文所述。在一些实施例中，使用一种或多种抗体，例如，抗体的等摩尔混合物。在一些实施例中，使用1C7、2B12、2E9和2H2的等摩尔混合物。
在一些实施例中，样品为细胞裂解物。在一些实施例中，样品为人细胞裂解物。在一些实施例中，样品为HEK293细胞裂解物。在一些实施例中，样品为来源于具有诱导型泛素缀合酶E2(UBE2W)表达的HEK293细胞的细胞裂解物。在一些实施例中，样品为来源于具有诱导型UBE2W表达和诱导型RNF4表达的HEK293细胞的细胞裂解物。
在一些实施例中，方法进一步包括使细胞中的去泛素化酶缺失并裂解细胞以产生细胞裂解物(例如，通过敲除编码去泛素化酶的基因)。在一些实施例中，方法进一步包括下调细胞中的去泛素化酶并裂解细胞以产生细胞裂解物。在一些实施例中，去泛素化酶为UCHL1或UCHL5。在不希望受理论束缚的情况下，据信缺失或下调去泛素化酶会增加N末端Ub位点的数量。
在一些实施例中，方法进一步包括在细胞中过表达泛素连接酶并裂解细胞以产生细胞裂解物。在一些实施例中，泛素连接酶为N末端泛素连接酶。在一些实施例中，泛素连接酶为泛素缀合酶E2(UBE2W)。在一些实施例中，使用多西环素(Dox)诱导型表达系统实现细胞中的泛素连接酶的过表达。在一些实施例中，根据如实例4中描述的方法实现细胞中的泛素连接酶的过表达(参见，例如，实例4，材料和方法)。
在一些实施例中，将细胞裂解物与蛋白酶一起孵育以产生肽。在一些实施例中，蛋白酶为胰蛋白酶。胰蛋白酶为丝氨酸蛋白酶，其可在赖氨酸或精氨酸氨基酸残基的羧基侧切割多肽链，除非任一残基后面有脯氨酸残基。胰蛋白酶消化产生的肽的平均大小适合用于质谱检测(约700至1500道尔顿)，并且由于赖氨酸或精氨酸残基的存在而带电(参见例如，Lackay,U.A.等人,J Proteome Res.2013年12月6日；12(12):5558-69)。因此，胰蛋白酶消化通常在基于质谱的蛋白质组学实验之前进行。在其中将细胞裂解物与胰蛋白酶一起孵育以产生肽的一些实施例中，使用质谱检测所选择的抗体结合的肽。
在一些实施例中，将细胞裂解物与细菌蛋白酶或病毒蛋白酶一起孵育以产生肽。在一些实施例中，将细胞裂解物与病毒蛋白酶一起孵育以产生肽。在一些实施例中，病毒蛋白酶为口蹄疫病毒前导蛋白酶。在一些实施例中，病毒蛋白酶为Lbpro。Lbpro为口蹄疫病毒前导蛋白酶。例如，用于研究泛素化的Lbpro的用途已描述于例如，Swatek,K.N.等人.,Nature2019年8月1日；572(7770):533-537和Swatek,K.N.等人.,Protocol Exchange 2019年8月22日；10.21203/rs.2.10850/v1中，两者中的全部内容均特此通过引用整体并入。Lbpro特异性切割Gly-Gly基序之前的肽键，诸如附着的泛素的C末端甘氨酸残基。因此，用Lbpro消化不能完全从底物中去除泛素，使标志性C末端Gly-Gly二肽附着至底物的泛素化残基。在一些实施例中，病毒蛋白酶为工程化病毒蛋白酶，例如，工程化口蹄疫病毒前导蛋白酶。在一些实施例中，工程化病毒蛋白酶为Lbpro*。如Swatek,K.N.等人,Nature 2019年8月1日；572(7770):533-537中所述，Lbpro*是具有L102W氨基酸取代的Lbpro的变体，表现出增强的泛素切割活性。使用Lbpro/Lbpro*产生具有指示泛素化位点的Gly-Gly基序的多肽已被称为“Ub-剪切”。在一些实施例中，通过蛋白酶切割(例如，使用Lbpro/Lbpro*)产生的肽包含Gly-Gly残基。
在一些实施例中，将细胞裂解物与蛋白酶一起孵育以产生肽，其中蛋白酶特异性切割泛素化多肽。在一些实施例中，将细胞裂解物与蛋白酶一起孵育以产生肽，其中蛋白酶在Gly-Gly基序之前的肽键处切割多肽。在一些实施例中，蛋白酶为Lbpro或Lbpro*。与主要在赖氨酸或精氨酸氨基酸残基的羧基侧切割肽链的胰蛋白酶相比，Lbpro和Lbpro*选择性切割具有更高程度的序列特异性的蛋白质。因此，预期相对于与特异性较低的蛋白酶(诸如胰蛋白酶)一起孵育，这种蛋白酶与细胞裂解物的孵育会产生富集来自泛素化底物的肽的肽池。在一些实施例中，与特异性切割泛素化多肽的蛋白酶一起孵育提高了N末端泛素化肽的富集水平。
在一些实施例中，方法进一步包括在裂解物产生并与蛋白酶(例如，胰蛋白酶、Lbpro或Lbpro*)一起孵育之前，用蛋白酶体抑制剂或去泛素化的抑制剂处理细胞。在一些实施例中，蛋白酶体抑制剂选自由以下项组成的组：乳胞素(lactacystin)、双硫仑(disulfiram)、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、马里佐米(Marizomib，盐孢菌胺A)、奥普佐米(Oprozomib，ONX-0912)、地兰佐米(delanzomib，CEP-18770)、环氧酶素(epoxomicin)、MG132、β-羟基β-甲基丁酸酯和硼替佐米。在一些实施例中，蛋白酶体抑制剂为硼替佐米。
在一些实施例中，方法进一步包括检测所选择的抗体结合的肽。在一些实施例中，抗体结合的肽通过质谱来检测。用于质谱分析的样品的制备通常可以根据已知技术进行(参见，例如，“Modem Protein Chemistry:Practical Aspects”,Howard,G.C.和Brown,W.E.编辑.(2002)CRC Press,Boca Raton,Florida)。具有高质量准确度、高灵敏度和高分辨率的多种质谱系统是本领域已知的并且可以在本发明的方法中采用。此类质谱仪的质量分析器包括但不限于四极杆(Q)、飞行时间(TOF)、离子阱、磁扇或FT-ICR或其组合。质谱仪的离子源应主要产生样品分子离子或伪分子离子以及某些可表征的片段离子。此类离子源的实例包括大气压电离源，例如电喷雾电离(ESI)和大气压化学电离(APCI)以及基质辅助激光解吸电离(MALDI)。ESI和MALDI是用于质谱分析的两种最常用的电离蛋白质方法。ESI和APCI是通过LC/MS来分析小分子最常用的离子源技术(Lee,M.“LC/MS Applications inDrug Development”(2002)J.Wiley&Sons,New York)。在一些实施例中，通过液相色谱和串联质谱(LC-MS/MS)来检测抗体结合的肽。实例3中描述了用于进行LC-MS/MS的示例性方法。在一些实施例中，使用nanoAcquity UPLC(Waters)通过液相色谱来分离抗体结合的肽。在一些实施例中，在液相色谱之后，通过电喷雾电离将分离的肽引入Orbitrap EliteTM或QExactiveTMHF质谱仪(ThermoFisher)。在一些实施例中，通过无标记物定量(LFQ)质谱来检测抗体结合的肽。在一些实施例中，通过串联质量标签(TMT)质谱来检测抗体结合的肽。在一些实施例中，抗体结合的肽通过蛋白质测序来检测。
在一些实施例中，使用与N末端泛素化蛋白的肽结合的抗体结合的第二抗体来检测与抗体结合的肽。在一些实施例中，第二抗体为抗兔、抗啮齿动物或抗山羊第二抗体。在一些实施例中，第二抗体缀合至可检测标记物。
2.N末端泛素化肽的文库
本文提供了N末端泛素化肽的文库。在一些实施例中，文库通过上文描述的富集方法中的任一者产生。在一些实施例中，文库包含表7或表8中列出的多肽中的一种或多种。在一些实施例中，文库包含来源于由以下组成的多肽的组的一种或多种肽：人AAAT、人AES、人AIG1、人ARF1、人ARL5B、人BABA2、人BUB3、人C1TC、人C2AIL、人C9J470、人CD81、人CDC45、人DCTP1、人DHRSX、人DMKN、人E2AK1、人EF1B、人F13A、人FA60A、人FBRL、人FLOT1、人GCYB1、人GOT1B、人GPAA1、人HIKES、人HNRPK、人IMPA3、人LAT3、人LAT4、人LRWD1、人MED25、人MFS12、人MIP18、人MMGT1、人MOONR、人NARR、人NDUB6、人NENF、人NOL6、人NOP10、人NUDC、人P121A、人PIGC、人PLBL2、人PRDX1、人PRDX2、人PUR9、人QKI、人RAD21、人RCAS1、人REEP1、人RFA1、人RPB1、人RPB7、人RS29、人RS7、人S11IP、人SGMR1、人T179B、人TAF1、人TCPG、人TF3C4、人TM127、人TMM97、人TMX2、人TSN13、人TSN3、人TTC27、人UBAC1、人UBAC2、人UCHL1、人UCHL5、人VKOR1、人VRK3、人ZDH12、人ZN253和人ZN672。在一些实施例中，文库包含人DCTP1、人F13A、人HNRPK、人PUR9、人RFA1、人RPB7、人S11IP和人UCHL5。在一些实施例中，文库包含来源于人UCHL1的肽。在一些实施例中，文库包含来源于人UCHL5的肽。在一些实施例中，文库包含来源于由以下UniProt登录号组成的多肽的组的一种或多种肽：Q15758、Q08117、Q9NVV5、P84077、Q96KC2、Q9NXR7、O43684、P11586、Q96HQ2、C9J470、P60033、O75419、Q9H773、Q8N5I4、Q6E0U4-8、Q9BQI3、P24534、P00488、Q9NP50、P22087、O75955、Q02153、Q9Y3E0、O43292、Q53FT3、P61978、Q9NX62、O75387、Q8N370、Q9UFC0、Q71SY5、Q6NUT3、Q9Y3D0、Q8N4V1、Q2KHM9、P0DI83、O95139、Q9UMX5、Q9H6R4、Q9NPE3、Q9Y266、Q96HA1、Q92535、Q8NHP8、Q06830、P32119、P31939、Q96PU8、O60216、O00559、Q9H902、P27694、P24928、P62487、P62273、P62081、Q8N1F8、Q99720、Q7Z7N9、P21675、P49368、Q9UKN8、O75204、Q5BJF2、Q9Y320、O95857、O60637、Q6P3X3、Q9BSL1、Q8NBM4、P09936、Q9Y5K5、Q9BQB6、Q8IV63、Q96GR4、O75346和Q499Z4。
E.检测样品中的N末端泛素化肽的方法
本文还提供了一种检测包含肽的混合物的样品中的N末端泛素化肽的方法。在一些实施例中，方法包括i)将样品与酶一起孵育以产生肽；ii)使肽与与N末端泛素化蛋白的肽结合的抗体接触，以及iii)检测N末端泛素化肽，其中该抗体与N末端处的氨基酸序列GGX结合，其中该抗体不与包含支链双甘氨肽的氨基酸序列(K-ε-GG)结合。在一些实施例中，X为任何氨基酸。在一些实施例中，抗体为与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体中的任一者，如本文所述。
在一些实施例中，在血液样品、血浆样品、血清样品、尿液样品、唾液样品、痰样品、肺积液样品或组织样品中检测到N末端泛素化肽。在一些实施例中，样品为人样品。在一些实施例中，样品为细胞裂解物。在一些实施例中，样品为HEK293细胞裂解物。在一些实施例中，样品为来源于具有诱导型泛素缀合酶E2(UBE2W)表达的HEK293细胞的细胞裂解物。在一些实施例中，样品为来源于具有诱导型UBE2W表达和诱导型RNF4表达的HEK293细胞的细胞裂解物。
在一些实施例中，使用与与N末端泛素化蛋白的肽结合的抗体结合的第二抗体来检测N末端泛素化肽。在一些实施例中，第二抗体为抗兔、抗啮齿动物或抗山羊第二抗体。在一些实施例中，第二抗体缀合至可检测标记物。
在一些实施例中，在细胞裂解物中检测到N末端泛素化肽。在一些实施例中，方法进一步包括在细胞中过表达泛素连接酶并裂解细胞以产生细胞裂解物。在一些实施例中，泛素连接酶为泛素缀合酶E2(UBE2W)。在一些实施例中，使用多西环素(Dox)诱导型表达系统实现细胞中的泛素连接酶的过表达。在一些实施例中，根据如实例4中描述的方法实现细胞中的泛素连接酶的过表达(参见，例如，实例4，材料和方法)。在一些实施例中，方法进一步包括使细胞中的去泛素化酶缺失并裂解细胞以产生细胞裂解物(例如，通过敲除编码去泛素化酶的基因)。在一些实施例中，方法进一步包括下调细胞中的去泛素化酶并裂解细胞以产生细胞裂解物。在一些实施例中，去泛素化酶为UCHL1或UCHL5。在不希望受理论束缚的情况下，据信缺失或下调去泛素化酶会增加N末端Ub位点的数量。
在一些实施例中，将细胞裂解物与病毒蛋白酶一起孵育以产生肽。在一些实施例中，病毒蛋白酶为口蹄疫病毒前导蛋白酶。在一些实施例中，病毒蛋白酶为Lbpro。在一些实施例中，病毒蛋白酶为工程化病毒蛋白酶，例如，工程化口蹄疫病毒前导蛋白酶。在一些实施例中，工程化病毒蛋白酶为Lbpro*。在一些实施例中，病毒蛋白酶在Gly-Gly基序之前的肽键处切割多肽。在一些实施例中，通过蛋白酶切割(例如，使用Lbpro/Lbpro*)产生的肽包含Gly-Gly残基。
在一些实施例中，方法进一步包括在裂解物产生并与病毒蛋白酶(例如，Lbpro或Lbpro*)一起孵育之前，用蛋白酶体抑制剂或去泛素化的抑制剂处理细胞。在一些实施例中，蛋白酶体抑制剂选自由以下项组成的组：乳胞素(lactacystin)、双硫仑(disulfiram)、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、马里佐米(Marizomib，盐孢菌胺A)、奥普佐米(Oprozomib，ONX-0912)、地兰佐米(delanzomib，CEP-18770)、环氧酶素(epoxomicin)、MG132、β-羟基β-甲基丁酸酯和硼替佐米。在一些实施例中，蛋白酶体抑制剂为硼替佐米。
检测可通过任何合适的方法进行，例如，那些基于质谱、免疫荧光显微术、流式细胞术、光纤扫描细胞术或激光扫描细胞术的方法。在一些实施例中，检测为免疫测定。在一些实施例中，检测为酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定。在一些实施例中，免疫测定包含免疫印迹分析、免疫扩散、免疫电泳或免疫沉淀。在一些实施例中，通过用与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体进行印迹来检测N末端泛素化多肽。
F.试剂盒
本发明的筛选、富集和检测方法可以以试剂盒形式提供。在一些实施例中，这种用于筛选、富集或检测的试剂盒包括与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体或含有如本文所述的与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体的组合物。抗体可以为与如本文所述的与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体中的任一者。在一些实施例中，抗体包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中该抗体包含含有氨基酸序列XXXMN(SEQ ID NO:35)的CDRH1；含有氨基酸序列XXXXXGXXYYATWA(SEQ ID NO:36)的CDRH2；以及含有氨基酸序列DDXXXXNX(SEQ ID NO:37)的CDRH3；其中所述抗体包含含有氨基酸序列QSXXSVYXXNXLX(SEQ ID NO:38)的CDRL1；含有氨基酸序列XASTLXS(SEQ ID NO:39)的CDRL2；以及含有氨基酸序列LGXXDCXSXDCXX(SEQ IDNO:40)的CDRL3；其中X为任何氨基酸。在一些实施例中，抗体包含含有SEQ ID NO:33中所示的氨基酸的VH。在一些实施例中，抗体包含含有SEQ ID NO:34中所示的氨基酸序列的VL。在一些实施例中，抗体包含含有SEQ ID NO:33中所示的氨基酸的VH并且VL包含SEQ ID NO:34中所示的氨基酸序列。在各种实施例中，与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体为本文所述的一种或多种抗体(例如，1C7、2B12、2E9或2H2)。
在一些实施例中，提供了一种用于在筛选与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体的方法中使用的试剂盒，其中该抗体与肽的N末端处的氨基酸序列GGX结合，其中该抗体不与包含支链双甘氨肽的氨基酸序列(K-ε-GG)结合，如本文所述。在一些实施例中，X为任何氨基酸。在一些实施例中，用于在筛选与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体的方法中使用的试剂盒包括与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体中的任一者，如本文所述(例如，1C7、2B12、2E9或2H2)。在一些实施例中，用于在筛选与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体的方法中使用的试剂盒提供用于进行正向选择(例如，用于结合N末端泛素化多肽的选择)或负向选择(例如，用于不与氨基酸序列K-ε-GG结合的选择)的说明书，如本文所述。在一些实施例中，用于在筛选与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体的方法中使用的试剂盒包括肽文库，该肽文库可用于产生和/或筛选与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体。在一些实施例中，肽文库包含在N末端处含有氨基酸序列GGX(例如，在N末端处的氨基酸序列GGM)的肽。在一些实施例中，用于在筛选与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体的方法中使用的试剂盒包括可用于负向选择的肽文库。在一些实施例中，用于负向选择的肽文库包含含有氨基酸序列K-ε-GG的肽。在一些实施例中，用于在筛选与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体的方法中使用的试剂盒提供了一种用于检测抗体与N末端泛素化多肽的结合的试剂。在一些实施例中，用于在筛选与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体的方法中使用的试剂盒提供了一种用于检测抗体与肽文库(例如，在N末端处包含氨基酸序列GGX的肽)的结合的试剂。在一些实施例中，用于在筛选与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体的方法中使用的试剂盒提供了一种用于检测抗体与用于负向选择的肽文库的结合的试剂。在一些实施例中，抗体与肽文库的结合或用于负向选择的肽文库通过ELISA进行检测。在一些实施例中，试剂盒提供了用于ELISA的说明书或试剂。在一些实施例中，用于在筛选与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体的方法中使用的试剂盒包括作为标准的N末端泛素化肽(例如，UBE2W和/或LUBAC)。
在一些实施例中，提供了一种用于在富集N末端泛素化肽的方法中使用的试剂盒，如本文所述。在一些实施例中，用于在富集N末端泛素化肽的方法中使用的试剂盒包括与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体中的任一者，如本文所述(例如，1C7、2B12、2E9或2H2)。在一些实施例中，用于在富集N末端泛素化肽的方法中使用的试剂盒包括用于使样品与抗体接触的试剂。在一些实施例中，用于使样品与抗体接触的试剂为合适的缓冲液。在一些实施例中，用于在富集N末端泛素化肽的方法中使用的试剂盒包括用于从样品中选择抗体结合的肽的试剂。在一些实施例中，用于从样品中选择抗体结合的肽的试剂为捕获试剂，如上所述。在一些实施例中，用于在富集N末端泛素化肽的方法中使用的试剂盒提供了用于检测所选择的抗体结合的肽的说明书。在一些实施例中，用于在富集N末端泛素化肽的方法中使用的试剂盒提供了用于检测所选择的抗体结合的肽的试剂。在一些实施例中，抗体结合的肽通过蛋白质测序来检测。在一些实施例中，用于在富集N末端泛素化肽的方法中使用的试剂盒提供了用于蛋白质测序的说明书。在一些实施例中，用于在富集N末端泛素化肽的方法中使用的试剂盒包括作为标准品的N末端泛素化肽(例如，UBE2W和/或LUBAC)。
在一些实施例中，用于在富集N末端泛素化肽的方法中使用的试剂盒进一步包括蛋白酶(例如，胰蛋白酶、细菌蛋白酶或病毒蛋白酶)。在一些实施例中，蛋白酶为Lbpro或Lbpro*。在一些实施例中，蛋白酶在Gly-Gly基序之前的肽键处切割多肽。在一些实施例中，用于在富集N末端泛素化肽的方法中使用的试剂盒提供了用于将蛋白酶与细胞裂解物一起孵育的试剂和说明书，例如，如Swatek,K.N.等人.,Protocol Exchange 2019年8月22日；10.21203/rs.2.10850/v1中所述。在一些实施例中，用于在富集N末端泛素化肽的方法中使用的试剂盒提供了用于“Ub-剪切”细胞裂解物的试剂和说明书。在一些实施例中，用于在富集N末端泛素化肽的方法中使用的试剂盒进一步包括用于检测N末端泛素化肽的试剂和说明书，例如，根据下文描述检测试剂盒。在一个特定实施例中，使用蛋白质印迹检测富集的N末端泛素化肽。在一些实施例中，试剂盒包括第二抗体。
在一方面，提供了一种用于检测样品中的N末端泛素化肽的试剂盒。在一些实施例中，用于检测的试剂盒包括与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体以及使用说明书，其中与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体，其中抗体与N末端处的氨基酸序列GGX结合，其中抗体不与包含支链双甘氨肽的氨基酸序列(K-ε-GG)结合。在一些实施例中，X为任何氨基酸。在一些实施例中，用于检测N末端泛素化肽的试剂盒提供了用于使用抗体检测N末端泛素化多肽的说明书。在一些实施例中，用于检测N末端泛素化肽的试剂盒提供了一种与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体以及一种用于检测该抗体的方法。例如，在一些实施例中，用于检测N末端泛素化肽的试剂盒提供了一种与缀合至标记物的N末端泛素化多肽的肽结合的抗体。在一些实施例中，将抗体用生物素、地高辛或荧光素标记。在一些实施例中，用于检测NSEC泛素化肽的试剂盒提供了用于使用抗体检测N-末端泛素化多肽的试剂。在一些实施例中，用于检测N-末端泛素化肽的试剂盒提供了用于ELISA的试剂，以使用抗体检测N-末端泛素化多肽。在一些实施例中，用于检测N-末端泛素化肽的试剂盒提供了用于在蛋白质印迹中使用抗体检测N-末端泛素化多肽的试剂。在一些实施例中，用于检测N-末端泛素化肽的试剂盒提供了用于SPR测定的试剂，以使用抗体检测N-末端泛素化多肽。在一些实施例中，用于检测N-末端泛素化肽的试剂盒在免疫沉淀中使用抗体为N-末端泛素化多肽提供了试剂。在一些实施例中，这种用于检测N-末端泛素化肽的试剂盒为包装组合，该包装组合包括以下基本要素：由与N-末端泛素化多肽的肽结合的抗体组成的捕获试剂；与如本文所述的N-末端泛素化多肽的肽结合的可检测(带标记物或不带标记物的)抗体；以及关于如何使用这些试剂进行测定方法的说明书。在上文中定义了这些基本要素。用于检测N-末端泛素化肽的试剂盒可进一步包括用于捕获试剂的固体支持物，该固体支持物可作为单独要素提供或者捕获试剂已固定于其上。因此，试剂盒中的捕获抗体可以固定在固体支持物上，或者它们可以固定在试剂盒随附或与试剂盒分开提供的此类支持物上。在一些实施例中，将捕获试剂包被在固体材料(例如，微量滴定板、珠粒或梳子)上或连接至该固体材料。可检测抗体可以为直接检测的带标记抗体，或者通过针对在不同物种中产生的无标记抗体的带标记抗体进行检测的无标记抗体。其中标记物为酶，试剂盒通常包括酶所需的底物和辅因子；其中标记物为荧光团，提供可检测发色团的染料前体；并且其中标记物为生物素、抗生物素蛋白诸如抗生物素蛋白、链霉亲和素或缀合至HRP或包含MUG的β-半乳糖苷酶的链霉亲和素。用于检测N-末端泛素化肽的试剂盒通常还含有N-末端泛素化肽(例如，UBE2W和/或LUBAC)作为标准品以及其它添加剂(诸如稳定剂、洗涤和孵育缓冲液)等。
在一些实施例中，与N-末端泛素化多肽的肽结合的抗体缀合至可检测标记物。在一些实施例中，可检测标记物选自由以下项组成的组：生物素、地高辛和荧光素。在一些实施例中，抗体固定在固体支持物上。在一些实施例中，抗体固定在珠子上。在一些实施例中，用于检测N-末端泛素化肽的试剂盒进一步包括蛋白酶(例如，胰蛋白酶、细菌蛋白酶或病毒蛋白酶)。在一些实施例中，蛋白酶为Lbpro或Lbpro*。在一些实施例中，蛋白酶在Gly-Gly基序之前的肽键处切割多肽。在一些实施例中，用于检测N-末端泛素化肽的试剂盒包括用于使用蛋白酶(例如，用于在使用与N-末端泛素化多肽的肽结合的抗体进行检测之前消化样品)的说明书。
实施例
1.一种与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体，其中所述抗体与所述肽的N末端处的氨基酸序列GGX结合，其中所述抗体不与包含支链双甘氨肽的氨基酸序列(K-ε-GG)结合。
2.根据实施例1所述的抗体，其中所述抗体与包含选自由以下项组成的组的N-末端序列的肽结合：GGA、GGE、GGF、GGG、GGH、GGI、GGL、GGM、GGN、GGQ、GGS、GGT、GGV和GGW。
3.根据实施例1或实施例2所述的抗体，其中所述抗体与以下结合：包含GGA的N-末端序列的肽、包含GGE的N-末端序列的肽、包含GGF的N-末端序列的肽、包含GGG的N-末端序列的肽、包含GGH的N-末端序列的肽、包含GGI的N-末端序列的肽、包含GGL的N-末端序列的肽、包含GGM的N-末端序列的肽、包含GGN的N-末端序列的肽、包含GGQ的N-末端序列的肽、包含GGS的N-末端序列的肽、包含GGT的N-末端序列的肽、包含GGV的N-末端序列的肽，以及包含GGW的N-末端序列的肽。
4.根据实施例1至3中任一项所述的抗体，其中所述抗体为兔、啮齿动物或山羊抗体。
5.根据实施例1至4中任一项所述的抗体，其中所述抗体为全长抗体或Fab片段。
6.根据实施例1至5中任一项所述的抗体，其中所述抗体缀合至可检测标记物。
7.根据实施例6所述的抗体，其中所述标记物选自由以下项组成的组：生物素、地高辛和荧光素。
8.根据实施例1至7中任一项所述的抗体，其中所述抗体固定在固体支持物上。
9.根据实施例8所述的抗体，其中所述抗体固定在珠子上。
10.根据实施例1至9中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含在一侧含有根据Kabat编号位置35处的Asn、位置37处的Val、位置93处的Thr、位置101处的Asn和位置103处的Trp的可变重链(VH)，以及含有位置34处的Ala、位置36处的Tyr和位置49处的Tyr的可变轻链(VL)。
11.根据实施例1至9中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中所述抗体包含含有氨基酸序列XXXMN(SEQ ID NO:35)的CDRH1；含有氨基酸序列XXXXXGXXYYATWA(SEQ ID NO:36)的CDRH2；以及含有氨基酸序列DDXXXXNX(SEQ IDNO:37)的CDRH3；其中所述抗体包含含有氨基酸序列QSXXSVYXXNXLX(SEQ ID NO:38)的CDRL1；含有氨基酸序列XASTLXS(SEQ ID NO:39)的CDRL2；以及含有氨基酸序列LGXXDCXSXDCXX(SEQ ID NO:40)的CDRL3；其中X为任何氨基酸。
12.根据实施例11所述的抗体，其中所述VH包含SEQ ID NO:33中所示的氨基酸，并且VL包含SEQ ID NO:34中所示的氨基酸序列。
13.根据实施例1至9中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的VH的CDRH1、CDRH2和CDRH3，以及含有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的VL的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
14.根据实施例13所述的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:3中所示的CDRH1氨基酸序列；SEQ ID NO:4中所示的CDRH2氨基酸序列；SEQ ID NO:5中所示的CDRH3氨基酸序列；SEQ ID NO:6中所示的CDRL1氨基酸序列；SEQ ID NO:7中所示的CDRL2氨基酸序列；以及SEQ ID NO:8中所示的CDRL3氨基酸序列。
15.根据实施例13所述的抗体，其中所述VH包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。
16.根据实施例13至15中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含SEQ ID NO:52中所示的氨基酸序列，并且所述轻链包含SEQ ID NO:53中所示的氨基酸。
17.根据实施例1至9中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列的VH的CDRH1、CDRH2和CDRH3，以及含有SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列的VL的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
18.根据实施例17所述的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:11中所示的CDRH1氨基酸序列；SEQ ID NO:12中所示的CDRH2氨基酸序列；SEQ ID NO:13中所示的CDRH3氨基酸序列；SEQ ID NO:14中所示的CDRL1氨基酸序列；SEQ ID NO:15中所示的CDRL2氨基酸序列；以及SEQ ID NO:16中所示的CDRL3氨基酸序列。
19.根据实施例18所述的抗体，其中所述VH包含SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列。
20.根据实施例17至19中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含SEQ ID NO:54中所示的氨基酸序列，并且所述轻链包含SEQ ID NO:55中所示的氨基酸。
21.根据实施例1至9中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列的VH的CDRH1、CDRH2和CDRH3，以及含有SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列的VL的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
22.根据实施例21所述的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:19中所示的CDRH1氨基酸序列；SEQ ID NO:20中所示的CDRH2氨基酸序列；SEQ ID NO:21中所示的CDRH3氨基酸序列；SEQ ID NO:22中所示的CDRL1氨基酸序列；SEQ ID NO:23中所示的CDRL2氨基酸序列；以及SEQ ID NO:24中所示的CDRL3氨基酸序列。
23.根据实施例22所述的抗体，其中所述VH包含SEQ ID NO:17中所示的氨基酸，并且VL包含SEQ ID NO:18中所示的氨基酸。
24.根据实施例21至23中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含SEQ ID NO:56中所示的氨基酸序列，并且所述轻链包含SEQ ID NO:57中所示的氨基酸。
25.根据实施例1至9中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列的VH的CDRH1、CDRH2和CDRH3，以及含有SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列的VL的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
26.根据实施例25所述的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:27中所示的CDRH1氨基酸序列；SEQ ID NO:28中所示的CDRH2氨基酸序列；SEQ ID NO:29中所示的CDRH3氨基酸序列；SEQ ID NO:30中所示的CDRL1氨基酸序列；SEQ ID NO:31中所示的CDRL2氨基酸序列；以及SEQ ID NO:32中所示的CDRL3氨基酸序列。
27.根据实施例26所述的抗体，其中所述VH包含SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO:26中所示的氨基酸。
28.根据实施例25至27中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含SEQ ID NO:58中所示的氨基酸序列，并且所述轻链包含SEQ ID NO:59中所示的氨基酸。
29.编码根据实施例1至28中任一项所述的抗体的核酸。
30.一种宿主细胞，其包含根据实施例29所述的核酸。
31.一种筛选与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体的方法，其中所述抗体与所述肽的N末端处的氨基酸序列GGX结合，其中所述抗体不与包含支链双甘氨肽的氨基酸序列(K-ε-GG)结合，所述方法包括
i)提供抗体文库；
ii)正向选择与在N末端处包含氨基酸序列GGX的肽结合的抗体，其中X为任何氨基酸；以及
iii)负向选择与包含氨基酸序列K-ε-GG的肽结合的抗体，
从而产生与在N末端处包含氨基酸GGX的肽特异性结合并且不与氨基酸序列K-ε-GG结合的抗体。
32.根据实施例31所述的方法，其中在步骤ii)中，正向选择与在N末端处包含氨基酸序列GGM的肽结合的抗体。
33.根据权利要求31或32所述的方法，其中负向选择与包含氨基酸序列K-ε-GG的肽结合的抗体是与步骤ii)同时进行的。
34.根据实施例31或32所述的方法，其中负向选择与包含氨基酸序列K-ε-GG的肽结合的抗体在步骤ii)之前或之后进行。
35.根据实施例31至34中任一项所述的方法，其中所述文库为噬菌体文库或酵母文库。
36.根据实施例31至35中任一项所述的方法，其中所述文库通过用包含在N末端处含有氨基酸序列GGM的肽的肽文库免疫哺乳动物来产生。
37.根据实施例36所述的方法，其中所述哺乳动物为兔或小鼠。
38.根据实施例31至37中任一项所述的方法，其中步骤ii)至iii)重复两次或更多次。
39.一种通过根据实施例31至38中任一项所述的方法产生的抗体。
40.一种富集包含肽的混合物的样品中的N-末端泛素化肽的方法，所述方法包括：
i)使所述样品与抗体接触，该抗体与N-末端泛素化蛋白的肽结合；以及
ii)从所述样品中选择抗体结合的肽，其中所述抗体与N末端处的氨基酸序列GGX结合，其中所述抗体不与包含支链双甘氨肽的氨基酸序列(K-ε-GG)结合。
41.根据实施例40所述的方法，其中所述样品为细胞裂解物。
42.根据实施例41所述的方法，所述方法进一步包括使细胞中的去泛素化酶缺失并裂解所述细胞以产生所述细胞裂解物。
43.根据实施例41所述的方法，所述方法进一步包括在细胞中过表达泛素连接酶并裂解所述细胞以产生所述细胞裂解物。
44.根据实施例41至43中任一项所述的方法，其中将所述细胞裂解物与胰蛋白酶一起孵育以产生所述肽。
45.根据实施例41至43中任一项所述的方法，其中将所述细胞裂解物与细菌蛋白酶或病毒蛋白酶一起孵育以产生所述肽。
46.根据实施例42至45中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在裂解物产生并与胰蛋白酶一起孵育之前或者在与所述细菌蛋白酶或病毒蛋白酶一起孵育之前，用蛋白酶体抑制剂或去泛素化的抑制剂处理所述细胞。
47.根据实施例40至46中任一项所述的方法，所述方法进一步包括检测所选择的抗体结合的肽。
48.根据实施例47所述的方法，其中所述抗体结合的肽通过质谱来检测。
49.根据实施例47所述的方法，其中所述抗体结合的肽通过蛋白质测序来检测。
50.根据实施例47所述的方法，其中使用与N-末端泛素化蛋白的肽结合的抗体结合的第二抗体来检测所述与抗体结合的肽。
51.一种通过根据实施例40至50中任一项所述的方法产生的N-末端泛素化肽的文库。
52.一种检测包含肽的混合物的样品中的N-末端泛素化肽的方法，所述方法包括
i)将所述样品与酶一起孵育以产生肽；
ii)使所述肽与抗体接触，该抗体与N末端泛素化蛋白的肽结合，以及
iii)检测所述N末端泛素化肽，其中所述抗体与N末端处的氨基酸序列GGX结合，其中所述抗体不与包含支链双甘氨肽的氨基酸序列(K-ε-GG)结合。
53.根据实施例52所述的方法，其中使用与与N-末端泛素化蛋白的肽结合的抗体结合的第二抗体来检测所述N-末端泛素化肽。
54.根据实施例52或53所述的方法，其中所述样品为细胞裂解物。
55.根据实施例54所述的方法，所述方法进一步包括使细胞中的去泛素化酶缺失并裂解所述细胞以产生所述细胞裂解物。
56.根据实施例54所述的方法，所述方法进一步包括在细胞中过表达泛素连接酶并裂解所述细胞以产生所述细胞裂解物。
57.根据实施例54至56中任一项所述的方法，其中将所述细胞裂解物与细菌蛋白酶或病毒蛋白酶一起孵育以产生所述肽。
58.根据实施例55至57中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在裂解物产生并与所述细菌蛋白酶或病毒蛋白酶一起孵育之前用蛋白酶体抑制剂或去泛素化的抑制剂处理所述细胞。
59.一种用于检测样品中的N末端泛素化肽的试剂盒，所述试剂盒包括与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体和使用说明书，其中与N末端泛素化多肽的肽结合的所述抗体，其中所述抗体与N末端处的氨基酸序列GGX结合，其中所述抗体不与包含支链双甘氨肽的氨基酸序列(K-ε-GG)结合。
60.根据实施例59所述的试剂盒，其中所述抗体缀合至可检测标记物。
61.根据实施例60所述的试剂盒，其中所述可检测标记物选自由以下项组成的组：生物素、地高辛和荧光素。
62.根据实施例59至61中任一项所述的试剂盒，其中所述抗体固定在固体支持物上。
63.根据实施例62所述的试剂盒，其中所述抗体固定在珠子上。
64.根据实施例59至63中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包括蛋白酶。
实例
本公开在以下实例中进行更详细的描述，这些实例不以任何方式限制所要求保护的本公开的范围。附图旨在被视为本公开的说明书和描述的组成部分。提供以下实例以说明但不限制要求保护的公开。
实例1：新型抗-GGX单克隆抗体的产生
以下实例描述了能够选择性富集在其N-末端处含有双甘氨肽序列的胰蛋白酶肽的抗体的产生。
材料和方法
抗体选择的设计
设计选择来鉴定能够选择性富集在其N末端处含有双甘氨肽序列的胰蛋白酶肽的抗体(参见图1A)。在不希望受理论束缚的情况下，假设相当大的潜在底物池将为具有非乙酰化的完整起始子甲硫氨酸的新生多肽，该新生多肽在胰蛋白酶消化后，在起始甲硫氨酸之前产生具有双甘氨肽修饰的肽(Waller,J.-P.J Mol Biol 7,483-IN1(1963))。因此，Gly-Gly-Met(GGM)肽被用作兔免疫的抗原，因为已知兔会产生针对肽和小半抗原的高亲和力抗体(Weber,J.等人,Exp Mol Medicine 49,e305-e305(2017))(参见下面的兔免疫方法)。重要的是，在纯化多克隆抗体(pAb)血清后，进行了选择以鉴定与常规和更丰富的K-ε-GG肽具有最小交叉反应性的单克隆抗体(mAb)，即使它们共享相同的双甘氨肽序列特征(参见下面的噬菌体文库产生和选择方法；参见图1B中的GGM和K-ε-GG肽结构)。
兔免疫
使用缀合至匙孔血蓝蛋白(KLH)或卵清蛋白(OVA)载体蛋白的Gly-Gly-Met肽对八只新西兰白兔进行免疫，以引发动物中的免疫反应。用500μg与CFA佐剂混合的KLH连接肽对兔进行引发，并且随后皮内注射。每两周用250μg在IFA佐剂中的肽抗原进行四次加强。为了确保B细胞反应针对肽而不是载体蛋白，每次加强时都会交替载体。最后一次加强后，从每只兔中抽取5至10mL血液，并产生蛋白A纯化的pAb血清，以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来监测免疫反应。对滴度最高的四只兔实施安乐死，并且收获脾脏和肠道相关淋巴组织(GALT)。
噬菌体文库产生和选择
将从兔脾脏和肠道相关淋巴组织中提取的总RNA分别用于扩增可变重(VH)和可变轻(VL)谱。使用标准Gibson克隆方法，将VH和VL谱组装成单链Fv(scFv)形式，并且克隆到噬菌体展示载体中。用于选择的肽抗原为BSA缀合的或C末端生物素化的GGM肽和用于反选择的生物素化的K-ε-GG肽(AAA{K-ε-GG}AAA)。进行三轮基于板的选择，其中将结合的噬菌体用100mM HCl洗脱，中和，并且在大肠杆菌XL1-blue(Stratagene)中通过加入M13-KO7辅助噬菌体(New England Biolabs)进行扩增。选择后，在羧苄青霉素和M13-KO7存在下，在具有2xYT生长培养基的96孔深孔块中挑选并且生长单个噬菌体克隆。沉淀后，将培养物上清液用于噬菌体ELISA中以筛选特异性。
pAb ELISA
将PBS中的生物素化的GGM或K-ε-GG肽以10μg/mL涂布在中性亲和素ELISA板(Thermo Scientific)上，一式三份，在4℃过夜。使用前用具有20的PBS(PBST)溶液洗涤板。将从100μg/mL开始的蛋白A-纯化的pAb的连续稀释液在25℃孵育1至2小时。用PBST洗涤板。洗涤后，加入抗兔Fc特异性HRP 2°抗体(供应商)，在25℃持续1小时。洗涤板，用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物显影5分钟，并在650nm处进行检测(参见图1C)。
单克隆抗体ELISA
将PBS中的生物素化的肽(GGM和K-ε-GG)以1μg/mL涂布在中性亲和素ELISA板(Thermo Scientific)上，一式三份，在4℃过夜。使用前用PBST洗涤板。加入1μg/mL的GGXmAb或K-ε-GG mAb(Cell Signaling Technology)的连续稀释液，在25℃持续1至2小时。如上所述洗涤板并进一步显影(参见图1E)。
合成生物素化的GGX肽，并以PBS中的1μg/mL涂布在中性亲和素ELISA板(ThermoScientific)上，一式三份，在4℃过夜。洗涤板并加入从1μg/mL开始的GGX mAb的连续稀释液，在25℃持续1至2小时。用PBST洗涤ELISA板并如上所述进行显影(参见图1F)。
Fab和IgG产生
通过基因合成生成用于Fab的细菌表达的构建体。随后如前所述表达和纯化Fab(Simmons,L.C.等人,J Immunol Methods 263,133-147(2002)；Lombana,T.N.等人,SciRep(2015)doi:https://doi.org/10.1038/srep17488)。通过基因合成生成用于兔IgG的哺乳动物表达的构建体。将编码LC和HC的质粒共转染到293个细胞中，并且使用标准，通过亲和色谱以及之后的SEC进行纯化(MabSelect SuReTM；GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)。
DNA构建体
所有的DNA构建体均通过定制基因合成(GeneScript)获得，并使用NcoI和XhoI位点亚克隆到多西环素诱导型PiggyBac转座子质粒(BH1.2,Genentech)中。
单克隆抗体测序
抗体1C7、2B12、2E9和2H2的氨基酸序列使用本领域中的标准技术进行确定(参见图1D和表2至4)。
结果
使用纯化的多克隆抗体(pAb)的ELISA证实了针对GGM肽的强大免疫反应，与带有K-ε-GG的肽的交叉反应性令人惊讶地最小(图1C)。基于强pAb信号，进行噬菌体展示以直接选择具有所需特异性的mAb。从个体兔中构建了若干种单链Fv(scFv)-展示文库，并针对GGM肽进行三轮基于板的生物淘选，并针对K-ε-GG肽进行反选择(图1A)。通过噬菌体ELISA进行初步筛选后，对hits进行测序，并将独特的克隆重新格式化为IgG。四种独特的抗体克隆(称为1C7、2B12、2E9和2H2)已被鉴定。这四种克隆具有高度序列相似性，但在多个互补决定区(CDR)中存在多样性(参见图1D，该图示出了在X位置处的简并识别)。通过针对GGM和K-ε-GG肽的ELISA来表征mAb，并且发现所有四种克隆都选择性与GGM而不是K-ε-GG肽结合(图1E)。
虽然最大的潜在mAb靶标池为真核生物中主要以甲硫氨酸起始的新生多肽，但也存在若干种其它游离N末端来源。这些来源是经由氨肽酶进行Met-剪切、信号肽去除和内部蛋白水解产生的。在通过Met氨肽酶(MetAP)进行剪切的情况下，切割通常发生在Ala、Cys、Gly、Pro、Ser、Thr或Val残基之前(Sherman,F.等人,Bioessays 3,27-31(1985))。为了探究mAb是否也能识别来自N末端泛素化的这些潜在位点的胰蛋白酶肽，对除半胱氨酸之外的二十种氨基酸中的每一者中含有双甘氨肽的肽进行评估。在本文中，这些肽被称为“GGX”肽，其中X代表含有从N末端延伸的GG序列添加的多肽序列中的起始氨基酸。值得注意的是，mAb1C7和2H2识别一组相似的GGX肽，而2E9和2B12则表现出不同的特异性。总的来说，这四种mAb结合了19种GGX肽中的14种，显示出对易受MetAP剪切影响的若干种氨基酸(Sherman,F.等人,Bioessays 3,27-31(1985))、GGG、GGA、GGS、GGT和GGV的强烈偏好(图1F)。
1C7、2B12、2E9和2H2的CDR、重链和轻链可变区以及全长重链和轻链的氨基酸序列以及共有序列提供于下面的图1D和表2A、2B、3和4中。对于表2A、2B和3中示出的共有序列，X代表任何氨基酸。
表2A.1C7、2B12、2E9和2H2重链可变区CDR氨基酸序列
表2B.1C7、2B12、2E9和2H2轻链可变区CDR氨基酸序列
表3.1C7、2B12、2E9和2H2 VH和VL氨基酸序列
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表4.1C7、2B12、2E9和2H2轻链和重链氨基酸序列
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总体而言，这些数据表明，产生了四种新型抗-GGX mAb，它们选择性识别在第三个位置处具有广泛特异性的含有胰蛋白酶双甘氨肽的线性肽(GGX)，并且缺乏与含有异肽连接的双甘氨肽修饰的赖氨酸的肽(对应于典型的泛素化位点)的交叉反应性。
实例2：用于GGX肽识别的结构基础
以下实例描述了与GGM肽结合的1C7抗-GGX Fab的x射线晶体结构的测定。
材料和方法
结晶条件和结构测定
使用悬滴法筛选1C7 Fab-GGM复合物的结晶，蛋白质:孔溶液比率为1:1。在多种条件下观察晶体，最佳条件为2M硫酸铵和0.1M TRIS pH 7.5。优化后，单晶在2M硫酸铵和0.1MMES pH 6.5中生长至约200mm。晶体成熟超过2周，并用20％(v/v)乙二醇在2M硫酸铵和0.1MMES pH 6.5中快速冷冻。衍射数据是在100K温度在先进光源(ALS)光束线5.0.2处收集的。使用HKL2000将数据处理至分辨率(Otwinowski,Z.&Minor,W.Methods inEnzymology 276,(1997))，并用PHENIX通过用模型兔Fab进行分子置换来获得相(PDB:4ZTP)。该结构使用COOT构建(Emsley,P.&Cowtan,K.Acta Crystallogr Sect DBiological Crystallogr 60,2126-2132(2004))，并使用PHENIX进行细化(Adams,P.D.等人,Acta Crystallogr Sect D Biological Crystallogr 66,213-221(2010))。加入GGM肽、水分子和缓冲分子后产生最终模型(参见图2A至2E和表5)。
结果
为了深入了解抗-GGX mAb对含有线性双甘氨肽的肽的选择性，以分辨率测定了与GGM肽结合的1C7 Fab的x射线晶体结构。下面的表5提供了1C7 Fab GGM肽共晶结构的数据收集和细化统计，括号中的值为最高分辨率壳的值。
表5.1C7 Fab GGM肽共晶结构的数据收集和细化统计。
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不对称单元中有两个Fab-GGM复合物，结合在重链(HC)和轻链(LC)CDR界面处的口袋中的GGM肽具有明确的电子密度(图2A、图2B)。GGM肽和Fab的相互作用具有的埋藏表面积。有趣的是，LC-HC界面处的这个口袋通常被抗体用来识别半抗原(Finlay,W.J.J.&Almagro,J.C.Front Immunol 3,342(2012))。对Fab-肽复合物的仔细检查发现了一系列氢键，该氢键有助于识别肽的双甘氨肽部分。HC Asp95和LC Glu46的侧链与双甘氨肽的主链形成五个氢键，包括氨基末端和两个酰胺(图2C)。两种羧酸盐的负电荷似乎中和了氨基末端的正电荷，氨基末端被Fab残基包围并被排除在溶剂之外。另外，针对LC Ala34、LC Tyr36和LC Tyr49的双甘氨肽的紧密堆积可能在空间上阻断了对肽中的前两个位置中的任何一个位置处的非-Gly残基的识别。这种结合模式通过HC Asp95侧链与Met的主链胺之间的氢键来进一步稳定(图2C)。
对Met-结合口袋的检查揭示了此位置所需简并氨基酸特异性的结构基础。此口袋在一侧排列有HC残基Asn35、Val37、Thr93、Asn101和Trp103，并且在另一侧排列有LC残基Tyr36、Leu89、Leu96和Phe98(图2D)。与甲硫氨酸侧链最紧密的接触是硫原子与HC Thr93之间的氢键(图2C)。此分析表明松散堆积的口袋具有疏水性和亲水性特征，在不希望受理论束缚的情况下，其被认为能够识别广泛的氨基酸。缺乏对Trp、Lys、Tyr和Arg的识别很容易通过与排列在此口袋中的多个侧链的空间冲突来解释。就Pro而言，抗体中的HC Asp95和LC Tyr35侧链与肽中的Pro侧链之间会发生多重冲突(图2E)。
此抗体的关键特征是缺乏对高度相似的K-ε-GG肽的识别。因此，假设GG识别的模式与GGM肽相同，则分析了K-ε-GG肽如何与Fab相互作用。据假设，赖氨酸侧链可遵循与GGM主链相似的轨迹，然而，在Lys Cα位置处的分支(即，肽中Lys之前和之后的残基)会与CDRH3和HC Tyr33在空间上发生冲突，从而阻止与mAb结合。
由于2E9和2B12 mAb均与1C7具有序列相似性，但表现出改变的识别特征，因此检查了此结果的潜在结构基础。在GGM-结合口袋内，2E9有两个差异(LC Thr91Glu和Leu96Phe)，这会压缩Met口袋，并且在不希望受理论束缚的情况下，可能阻止对广泛残基的识别(图2D)。2B12中的六个残基差异将更明显地重塑Met口袋。例如，LC Thr91Leu和HCThr93Val增加了口袋的疏水性，这可以解释与其它mAb相比结合GGW的独特能力(图2D)。2B12中可以结合Trp侧链的口袋模型提供于图2F中，其中指出了HC Thr93Val和LCLeu96Asn残基。
总的来说，本文描述的结构研究阐明了这些抗体如何实现对GGX的简并识别，同时避免对高度相似的K-ε-GG的识别。
实例3：抗-GGX mAb从细胞裂解物中选择性富集GGX肽
以下实例描述了研究通过抗-GGX单克隆抗体对来自复杂细胞裂解物的肽进行免疫亲和富集的实验。具体来说，进行免疫亲和富集，然后进行质谱，以鉴定HEK293细胞裂解物中的抗-GGX抗体结合的蛋白质。
材料和方法
证明试剂选择性的试点质谱实验
从汇合的HEK293 T细胞中制备40mg蛋白质裂解物，并用胰蛋白酶(Promega)消化。将IAP缓冲液(Cell Signaling Technologies)中的胰蛋白酶肽与80μg抗-GGX或抗-K-ε-GG mAb(Cell Signaling/>)在4℃一起孵育30分钟(参见图3A)。随后，将80μL蛋白G琼脂糖浆液加入到抗体-肽混合物中，在4℃再持续30分钟。对于将四种GGX mAb合并用于肽免疫亲和富集的MS实验，将50μg每种mAb混合在一起，然后与胰蛋白酶消化和脱盐的肽接触。
质谱
重悬的样品通过LC-MS/MS以120分钟总运行时间方法来进行分析。在nanoAcquityUPLC(Waters)上分离肽，并通过电喷雾电离来引入Orbitrap EliteTM或Q ExactiveTMHF质谱仪(ThermoFisher)。将每种样品的30％至40％上样到100μm×100mm Waters 1.7-μmBEH-130C18柱上，并通过低pH反相色谱(溶剂A：0.1％FA/98％水/2％ACN，溶剂B：0.1％FA/98％ACN/2％水)以1μl/分钟的流速来进行分离，使用两阶段线性梯度，施加90分钟。在第一阶段中，溶剂B在85分钟内从2％增加到25％，然后在第二阶段中，溶剂B在5分钟内从25％增加到40％。Orbitrap EliteTM和Q ExactiveTMHF质谱仪均在数据依赖模式下运行，分别选择前15个和前10个丰度最高的离子进行MS2碎裂。用于分析的质谱仪特定设置(针对每种仪器进行了优化)如下。
Orbitrap EliteTM傅里叶变换质谱(FTMS1)扫描以60,000分辨率、1x106的自动增益控制(AGC)靶标和200ms的最大注入时间收集。使用设置为35％归一化碰撞能量的碰撞-诱导解离(CID)、1x103的自动增益控制(AGC)靶标和100ms的最大注入时间进行离子阱质谱(ITMS2)。
Q ExactiveTMHF FTMS1扫描以60,000分辨率、3x106的AGC靶标和60ms的最大注入时间收集。使用设置为30％归一化碰撞能量的高能碰撞解离(HCD)，以15,000分辨率、1x105的AGC靶标和75ms的最大注入时间收集来进行FTMS2。
数据分析
使用Mascot(Matrix Science)针对含有Uniprot人(2017年8月下载)和常见污染物序列的靶标诱饵数据库搜索数据文件。采用25ppm的前体离子质量容差、0.8Da(ITMS2)或0.02Da(FTMS2)的碎片离子容差以及半胰蛋白酶的酶特异性。将氨基甲酰甲基化半胱氨酸(+57.0215Da)设置为固定修饰，并且甲硫氨酸氧化(+15.9949Da)、K-ε-GG(+114.0429)和N末端GG(+114.0429)被认为是可变修饰。使用线性判别分析在肽水平上过滤肽谱匹配，错误发现率为5％，随后基于与所询问的生物学相关的序列特征进行过滤。
结果
用胰蛋白酶消化来自未刺激的HEK293细胞的裂解物，并分别使用四种抗-GGX mAb中的每一种对GGX肽进行免疫亲和富集。通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)来分析所得肽池(图3A)。同时，使用抗-K-ε-GG mAb作为对照进行免疫亲和富集。鉴于这些裂解物中存在高丰度的K48和K63-连接的Ub链，这些靶标肽用于确认新型mAb免疫亲和富集GGX肽而非丰富的K-ε-GG肽的选择性。由抗-GGX和抗-K-ε-GG富集样品的LC-MS数据制备对应于K48和K63-连接的Ub链的代表性肽离子的提取离子色谱图(XIC)，以比较它们的水平。与显示出对异肽连接的K48和K63 Ub肽的强富集的抗-K-ε-GG mAb相比，当使用四种抗-GGX mAb中的任何一种进行富集时，未检测到信号(图3B、图3C)。
接下来，研究了抗-GGX mAb富集的肽序列。鉴于蛋白质组中的甘氨酸、赖氨酸和精氨酸残基的频率，源自含有天然存在的内部GGX序列基序的蛋白质的许多GGX肽被编码在蛋白质组中，该基序前面有胰蛋白酶切割位点(R/KGGXXXX)。正如预测的那样，在此实验中检测到许多此类肽。值得注意的是，应用于每个富集样品的代表性内部GGX序列的提取离子色谱图证明在抗-GGX mAb富集样品中有特异性信号，但在使用抗-K-ε-GG mAb进行免疫亲和富集后没有特异性信号。结合ELISA数据，这些结果证明了抗-GGX mAb对靶向序列的选择性(图3D、图3E)。
与N末端泛素化蛋白一样，内部GGX肽仅在胰蛋白酶切割后才会暴露，并为每种mAb的序列偏好提供有价值的见解。使用这些内部肽，确定了在第三个位置处的氨基酸偏好。与淘选策略、ELISA和结构数据一致，观察到对在第三个位置处的甲硫氨酸和亮氨酸的强烈偏好，其次最普遍的氨基酸为苯丙氨酸和谷氨酰胺(图3F)。为了进一步分析序列特异性，为每种抗-GGX mAb生成序列标识(图3G)(Schneider,T.D.&Stephens,R.M.Nucleic Acids Res18,6097-6100(1990))。同样，序列标识显示出对在第三个位置处的甲硫氨酸和亮氨酸的总体偏好，但重要的是，在位置3至6处显示了其它氨基酸的多样性(图3G)。这些数据再次证实了ELISA结果，该结果表明每种mAb都富集了一组独特的肽，其中单个mAb之间存在部分重叠，特别是在考虑位置4至6中的差异时(表6)。基于这些数据，使用四种抗-GGX mAb的等摩尔混合物建立了方案用于随后的MS实验，以确保潜在肽的最广泛覆盖(参见实例4)。
表6.来自抗-GGX mAb的独特的和共享的内部GGX序列
抗体 独特的序列 共享的序列
1C7 26 16
2E9 41 14
2H2 47 20
2B12 8 8
重点关注N末端泛素化位点，对数据进行手动检查并过滤肽谱匹配(PSM)，以查找在起始子甲硫氨酸或新-N末端处带有双甘氨肽残余物的肽。鉴定出带有114.0429Da质量加成(对应于双甘氨肽的质量)的肽，并且然后确认基因组编码的多肽序列不含有紧接在胰蛋白酶敏感的R/K残基之前的双甘氨肽序列。严格过滤后，鉴定出六种以上具有假定N末端泛素化位点的蛋白质(表7)。一个实例为在丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶11-相互作用蛋白(STK11IP)上观察到的假定N末端泛素化位点(图3H、图3I)，此外还有先前描述的若干个位点(Akimov,V.等人,Nat Struct Mol Biol 25,631-640(2018))。
表7.在试点免疫亲和富集和MS实验中鉴定出具有假定N末端泛素化位点的蛋白质
总体而言，这项研究证明了这些抗-GGX mAb的选择性能力，可以富集通过胰蛋白酶消化暴露的内部基因组编码的GGX肽序列和源自N末端泛素化的GGX肽。此试点MS试验验证了抗-GGX mAb的效用，但从内源性HEK293细胞中产生了不到十几种假定的N末端泛素化底物。此结果与现有文献一致，证实了N末端泛素修饰的基础水平较低(Akimov,V.等人,NatStruct Mol Biol 25,631-640(2018))。
实例4：假定的UBE2W底物的蛋白质组学鉴定
以下实例描述了具有多西环素(Dox)诱导型UBE2W(编码泛素缀合酶E2的基因)表达的HEK293细胞系的生成。此外，Dox-诱导型UBE2WHEK293细胞系用于在免疫亲和富集MS实验中鉴定抗-GGX mAb结合的肽。
材料和方法
对来自UBE2W表达细胞的GGX和K-ε-GG肽进行免疫亲和富集，用于通过质谱来进行无标记物定量(LFQ)分析
诱导表达泛素缀合酶E2(UBE2W)的HEK293细胞和匹配对照(即，表达E3泛素-蛋白连接酶RNF4或UBE2W和RNF4两者的细胞)在完全变性条件下(8M尿素、20mM HEPES pH 8.0、1mM原钒酸钠、2.5mM焦磷酸钠、1mMβ-甘油磷酸盐)被裂解。将裂解物在冰上进行微尖端超声处理(2x30秒)，并通过高速超速离心(18,000x g，15分钟)进行澄清。每种裂解物取40mg进行还原(4.1mM二硫苏糖醇，37℃60分钟)、烷基化(9.1mM碘乙酰胺，室温15分钟)、4倍稀释，并且然后用赖氨酰内肽酶(Wako)和测序级胰蛋白酶(Promega)的组合以1:100的酶与蛋白质的比率进行过夜消化，后者在与前者一起孵育4小时后加入。将消化的肽用TFA酸化至最终浓度为1％，通过离心(18,000x g，15分钟)澄清，通过C18重力流固相萃取(Waters)脱盐，并冻干48小时。将干肽在1mL 1X IAP缓冲液(Cell Signaling Technology)中复溶，并经由高速离心(18,000x g，10分钟)进行澄清，用于随后的免疫亲和富集。
对肽进行两轮连续的免疫亲和富集，均在4℃在PhyNexus MEA2自动纯化系统上进行，该系统使用填充有20μL ProPlus树脂的1mL Phytips(Phynexus)，该树脂与200μg抗-GGX抗体混合物(即，1C7、2B12、2E9和2H2的等摩尔混合物)或200μg抗-K-ε-GG(CellSignaling Technology)抗体偶联。按以下顺序进行富集：针对含有双甘氨肽修饰的N末端(GGX)的肽进行抗-GGX IP，以及针对含有双甘氨肽修饰的赖氨酸残基(K-ε-GG)的肽进行抗-K-ε-GG IP。
如前所述对PhyNexus MEA2进行免疫亲和富集(Phu,L.等人,Mol Cell 77,1107-1123.e10(2020))。简而言之，在与肽接触之前，将Phytip柱用1mL 1X IAP缓冲液平衡2次循环(1次循环＝吸取和分配，0.9mL，0.5mL/分钟)，与肽一起孵育16次捕获循环，并洗涤6次循环(用1mL 1X IAP缓冲液进行2次，然后用1mL水进行4次)。将捕获的肽在8次循环中用60μL0.15％TFA洗脱，其中吸取/分配的体积调整为0.06mL。随后使用C18 stage-tips(Rappsilber,J.等人,Nat Protoc 2,1896-1906(2007))对洗脱的肽进行脱盐，并干燥Speed-Vac(ThermoFisher)至完成。
将富集的GGX肽在2％乙腈(ACN)/0.1％甲酸(FA)中复溶，并在OrbitrapFusionTMLumosTM质谱仪(ThermoFisher)上通过LC-MS/MS进行一式两份(每次注入40％)分析，该质谱仪与采用填充有1.7-μm BEH-130 C18树脂(Waters)的100μm×250mm PicoFrit(New Objective)柱的Dionex UltiMate 3000RSLC(ThermoFisher)偶联。低pH反相分离(溶剂A：0.1％FA/98％水/2％ACN，溶剂B：0.1％FA/98％ACN/2％水)在96分钟的两步线性梯度上以450nL/分钟进行，其中溶剂B在102分钟内从2％增加到35％，并且然后在2分钟内从35％增加到50％，总运行时间为120分钟。Orbitrap FusionTMLumosTM在数据依赖模式下运行，其中以240,000分辨率与1x106的AGC靶标以及50ms的最大注入时间收集FTMS1扫描。在离子阱中收集电荷态为2至4的前15个最强烈前体上的MS2扫描，其中以30％的归一化碰撞能量、2.0x104的AGC靶标和11ms的最大注入时间进行HCD碎裂。
对于重复注入，在Orbitrap而不是离子阱中分析MS2谱。OTMS2 AGC靶标设置为2.0x105，最大注入时间为54ms。
对来自UBE2W和/或RNF4表达细胞的GGX和K-ε-GG肽进行免疫亲和富集，用于LC-MS分析
对来自未诱导型(N＝3)或诱导表达E3泛素-蛋白连接酶RNF4(N＝2)、UBE2W(N＝3)或组合(N＝3)的40mg HEK293细胞中的每一者的GGX和K-ε-GG肽进行免疫亲和富集，如上面详细描述，并进行以下修改。
对肽进行三轮连续的免疫亲和富集，所有这些均如上描述在使用200μg抗-GGX抗体混合物或200μg抗-K-ε-GG(Cell Signaling Technology)抗体的MEA2自动纯化系统(Phynexus)上进行。按以下顺序进行富集：针对含有双甘氨肽修饰的N末端(GGX)的肽进行抗-GGX IP，针对含有双甘氨肽修饰的赖氨酸残基(K-ε-GG)的肽进行抗-K-ε-GG IP，然后再次针对GGX进行抗-GGX IP。
随后制备来自第一轮(GGX)和第二轮(K-ε-GG)免疫沉淀的富集肽用于串联质量标签(TMT-11)多重定量分析，如前所述(Rose,C.M.等人,Cell Syst 3,395-403.e4(2016)；Phu,L.等人,Mol Cell 77,1107-1123.e10(2020))，而制备来自第三轮的富集GGX肽用于无标记物定量质谱分析。
TMT-11多重样品制备
使用C18 stage-tips对含有富集GGX或K-ε-GG肽的洗脱液进行脱盐，将SpeedVac干燥至完全，并在25μL 200mM HEPES pH 8.0中复溶，以便随后使用11-重串联质量标签(TMT)试剂(ThermoFisher)进行同量异位标记。将每瓶TMT试剂在室温解冻5分钟，使用台式离心机减速旋转，并重悬于41μL无水乙腈(ACN)中。向每种洗脱液中加入8μL TMT试剂和2μLACN，以达到最佳标记物反应最终ACN浓度29％。在室温孵育1小时后，加入4μL 5％羟胺15分钟使反应猝灭。将标记的肽合并并通过真空离心干燥。
将TMT标记的GGX肽重悬于溶剂A(2％乙腈(ACN)/0.1％甲酸(Fa))中，并分成40％和60％两部分，前者无需进一步操作即可用于LC-MS/MS分析，并且后者使用AssayMap(Agilent)上的RPS柱体进行额外的离线高pH反相分级，该柱体采用基于0.1％三乙胺/乙腈的洗脱缓冲液。收集了六种级分(F1：12％ACN，F2：17％％ACN，F3：22％ACN，F4：27％ACN，F5：32％ACN，F6：80％ACN)。随后将分级的GGX肽冻干并重悬于溶剂A中用于LC-MS/MS分析。
对于TMT标记的K-ε-GG肽，使用可商购获得的试剂盒(ThermoFisher)进行高pH反相分级。在0.15％TFA中重新溶解后，根据制造商的方案使用改进的洗脱方案进行分级，其中收集了11种级分(F1：13.5％ACN，F2：15％ACN，F3：16.25％ACN，F4：17.5ACN，F5：20％ACN，F6：21.5％ACN，F7：22.5％ACN，F8：23.75％ACN，F9：25％ACN，F10：27.5％ACN和F11：30％ACN)，并且然后合并成6种级分(F1+F6、F2+F7、F8、F3+F9、F4+F10、F5+F11)。将肽冻干并重悬于10μL溶剂A中用于LC-MS/MS分析。
在FusionTMLumosTM质谱仪(ThermoFisher)上对未分级的GGX样品进行LC-MS/MS分析，该质谱仪与UPLC(Waters)系统偶联，该系统配有填充有1.7uM BEH-130C18(Waters)的100μm×250mm/>柱(New Objective)。低pH反相分离(溶剂A：0.1％FA/98％水/2％ACN，溶剂B：0.1％FA/98％ACN/2％水)在163分钟的两步线性梯度上以500nL/分钟进行，其中溶剂B在158分钟内从2％升到30％，并且然后在5分钟内从30％升到75％，总运行时间为180分钟。FusionTMLumosTM以120,000分辨率与1x106的AGC靶标以及50ms的最大注入时间收集FTMS1扫描。以15,000分辨率收集电荷态为2至6的前体上的FTMS2扫描，其中以35％的归一化碰撞能量、5.0x104的AGC靶标和200ms的最大注入时间进行CID碎裂。在Orbitrap中以50,000分辨率对同步前体选择(SPS)MS3扫描进行分析，其中MS2谱中的前8个最强烈离子以55％的归一化碰撞能量、1.5x105的AGC靶标和400ms的最大注入时间进行HCD碎裂。
如上描述对分级的GGX肽进行LC-MS/MS分析，但以下情况除外。使用DionexUltimate 3000RSLC(ThermoFisher)在Aurora系列25cm x 75μm I.D.柱(IonOpticks)上进行液相色谱，该柱以300nL/分钟的降低流速和改进的梯度运行，其中溶剂B在135分钟内从2％升到30％，并在15分钟内从30％升到50％。
对分级的K-ε-GG肽进行LC-MS/MS分析完全如未分级的GGX样品所述进行，但对MS方法进行了修改，将选择用于碎裂的前体离子限制为电荷态3至6的离子。
在TMT分析中，在MS1数据中观察到一系列大型且未预料到的特征，该特征似乎影响了数据依赖方法的性能。这些特征包括一系列在色谱图中洗脱的强烈峰，该峰被鉴定为11种样品中的每种样品中存在的丰富的内部GGX肽的复合信号。据推测，此信号掩盖了来自目标N末端泛素化GGX肽的较低强度信号，该肽预计仅存在于11种样品的子集中(仅UBE2W，组合)。为了尽量减少高丰度内部GGX肽对信号的竞争并恢复可能被掩盖的其它鉴定，使用来自TMT标记实验的流通肽进行免疫亲和富集，并将这些富集的肽进行LC-MS用于无标记物定量(LFQ)分析，如上。对于TMT多重数据，使用Mascot针对UniProt人靶标诱饵数据库(2017年8月下载)搜索原始MS数据，该数据库含有常见污染物序列，具有25ppm的ppm前体离子质量容差、0.02Da的碎片离子容差和半胰蛋白酶特异性。将氨基甲基化半胱氨酸残基(+57.0215Da)和TMT标记的N末端(+229.1629)设置为固定修饰，甲硫氨酸氧化(+15.9949Da)、K-ε-GG(+114.0429)和N末端GG(+114.0429)被认为是可变修饰。每次运行的肽谱匹配均使用LDA过滤至3％的FDR，并且理论前体m/z的ppm质量容差在-5与4之间。使用Mojave进行TMT-MS3定量(Zhuang,G.等人,Sci Signal 6,ra25-ra25(2013))。使用开源R/Bioconductor软件包MSstatsTMT v1.6.3对TMT蛋白质组学数据进行定量和统计测试(Huang,T.等人,Mol Cell Proteomics 19,mcp.RA120.002105(2020))。在MSstatsTMT分析之前，如果PSM属于以下情况，则将其从进一步分析中过滤掉：(1)来自诱饵蛋白；(2)来自长度小于7的肽；(3)分离特异性小于50％；(4)报告离子强度小于256；或(5)报告离子强度总和(所有十一个通道)低于30,000。冗余PSM(即，在一次MS运行中映射到同一肽的多个PSM)通过首先获取每个肽和通道的最大报告离子强度，并且然后选择每个PSM具有最大报告离子强度的级分来总结。接下来，MSstatsTMT使用Tukey中值抛光总结(TMP)将肽总结到蛋白质修饰位点水平。条件之间的差异丰度分析是通过MSstatsTMT基于每种蛋白质的线性混合效应模型来计算的。通过应用经验贝叶斯收缩来调整推理过程，并通过本杰明-霍克伯格(Benjamini-Hochberg)程序针对多重假设检验调整所得p值。
在合并的TMT样品中，观察到内部GGX肽相对于N末端泛素化的GGX残余物展示出不成比例的高信号。为了克服这种影响并捕获额外的UBE2W底物，对对照(无dox)、仅UBE2W、仅RNF4和RNF4/UBE2W(组合)样品进行额外的免疫亲和富集实验和无标记物MS分析。
LC-MS/MS的进行类似于两种条件LFQ实验，但对液相色谱和数据采集进行了以下细微修改。在Aurora系列25cm x 75μm I.D柱(IonOpticks)上以450nL/分钟的流速进行低pH反相分离。双阶段梯度被修改为溶剂B在91分钟内从2％升到35％，并在5分钟内从35％升到75％。对于所有注入，均在离子阱中分析MS2谱。
使用Mascot(Matrix Science)针对含有UniProt人和常见污染物序列的靶标诱饵数据库(2017年8月下载)搜索这些MS数据，该数据库使用25ppm的ppm前体离子质量容差、0.8Da的碎片离子容差和半胰蛋白酶特异性。将氨基甲酰甲基化半胱氨酸(+57.0215Da)设置为固定修饰，并且甲硫氨酸氧化(+15.9949Da)、K-ε-GG(+114.0429)和N末端GG(+114.0429)被认为是可变修饰。使用线性判别分析在肽水平上过滤肽谱匹配，错误发现率为3％。使用XQuant(由直接PSM引导的算法，利用准确的前体离子质量和保留时间来定量运行中的肽)对所有数据文件中的N末端GG肽进行无标记物定量(Kirkpatrick,D.S.等人ProcNational Acad Sci 110,19426-19431(2013))。使用开源R/Bioconductor软件包MSstatsv3.20.0对无标记物蛋白质组学数据进行定量和统计测试(Choi,M.等人,Bioinformatics30,2524-2526(2014))。在MSstats分析之前，如果PSM属于以下情况，则将其从进一步分析中去除：(1)来自诱饵蛋白；(2)来自长度小于7的肽；(3)拥有的VistaQuant置信度分数低于71；或(4)峰面积小于256。冗余PSM(即，在一次MS运行中映射到同一肽的多个PSM)通过获取每次运行的最大强度来总结。接下来，MSstats使用Tukey中值抛光总结(TMP)将肽总结到蛋白质修饰位点水平。条件之间的差异丰度分析是通过MSstats基于每种蛋白质的线性混合效应模型来计算的。通过使用本杰明-霍克伯格程序针对多重假设检验来调整来自线性混合效应模型的P-值。
细胞培养
HEK293细胞系获自Genentech的细胞系核心设施gCell。将细胞维持在补充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和50U/ml青霉素-链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco'smodified Eagle's medium，DMEM)中。所有细胞系均在37℃/5％CO2的湿润培养箱中培养，并且每隔一天更换一次培养基。在适用的情况下，用媒剂DMSO(目录号D2650，Sigma-Aldrich)和1μg/ml多西环素(目录号D9891，Sigma-Aldrich)处理细胞达到指定的时间。
DNA构建体、转染和蛋白质印迹
所有的DNA构建体均通过定制基因合成(GeneScript)获得，并使用NcoI和XhoI位点亚克隆到多西环素诱导型PiggyBac转座子质粒(BH1.2,Genentech)中。为了瞬时表达，将HEK293细胞接种到6-孔板中，并在DMEM培养基中生长至约50％汇合。然后根据制造商的说明书，使用10μl Fugene(Promega)用1μg piggyBac转座子质粒转染细胞。为了生成稳定的细胞系，使用10μl Fugene(Promega)将细胞与250ng piggyBac转座酶质粒(pBO，Transposagen)和750ng piggyBac转座子质粒共转染。转染三天后，将细胞分入含有1μg/mL嘌呤霉素的选择培养基中，并选择10天。然后通过蛋白质印迹分析来测定稳定或瞬时转染的细胞的蛋白质表达(参见，例如，图4A、图4C、图4I)。用1μg/mL Dox处理两天后，用变性裂解缓冲液(9M尿素、RIPA缓冲液)裂解细胞，超声处理，并在4℃以13,000rpm离心10分钟。在1×SDS上样缓冲液(ThermoFisher)和1×还原剂(ThermoFisher)中制备15至50μg蛋白质，加热至90℃5分钟，并在12％Tris-甘氨酸凝胶(Bio-Rad)中电泳。使用Trans-Blot Turbo系统(Bio-Rad)在23V将凝胶转移至硝酸纤维素膜7分钟。用5％脱脂牛奶(在含0.1％20的PBS(PBS-T)中稀释)封闭膜30分钟，并用PBS-T短暂冲洗三次，并在4C与含5％BSA的PBS-T中的第一抗体一起孵育过夜。将印迹在PBS-T中洗涤三次，每次5分钟，并且然后在室温与含5％BSA的PBS-T中的第二抗体一起孵育1小时。如前所述洗涤印迹，并用SupersignalFemto(Pierce)进行检测。抗体为1:5000兔抗-β微管蛋白(目录号ab6046；Abcam)、1:1000兔抗-UBE2W(目录号PA5-67547；Thermo Fisher)、1:2,000兔抗-UCHL1(目录号HPA005993；Thermo Fisher)、1:500小鼠抗泛素(目录号VU-1；LifeSensors)和1:10,000山羊抗小鼠和兔IgG HRP(目录号31460和31430，Thermo Fisher)。
结果
由于泛素缀合酶E2(UBE2W)是已知介导N末端泛素化的唯一的E2Ub-缀合酶，并且由于UBE2W表达水平在HEK293细胞中较低，在不希望受理论束缚的情况下，因此据推测，UBE2W的外源表达可能会刺激内源性底物的N末端泛素化。因此，生成了多西环素(Dox)诱导型UBE2WHEK293细胞系，并用于进行与试点MS实验中相似的免疫亲和富集和MS工作流程，如实例3中所述。
MS1峰强度的无标记物定量(LFQ)用于比较DOX+UBE2W表达与对照DOX-条件，目的是将UBE2W底物鉴定为在UBE2W表达时GGX肽在其N末端丰度增加的蛋白质(图4A)。应用与实例3中描述的相似方法，过滤肽谱匹配(PSM)以寻找与起始子甲硫氨酸或新-N末端处的双甘氨肽附着相对应的蛋白质N末端序列。总共鉴定出来源于109种蛋白质的152个独特的GGXPSM，肽和蛋白质错误发现率分别为0.80％和3.67％。对于PSM，使用log2-倍数变化(log2FC)>1且p<0.05的标准，此实验鉴定了33种UBE2W底物(图4B、表8)。
大多数E2 Ub-缀合酶与E3连接酶(例如，RNF4)协同工作，并且先前的工作报道了UBE2W表现出一些底物的RNF4-依赖性泛素化(Tatham,M.H.等人,Biochem J 453,137-145(2013))。因此，生成了Dox-诱导型RNF4和双顺反子(RNF4/UBE2W，“组合”)表达载体并用于制备稳定的HEK293细胞系(图4C)。除了上面采用的LFQ方法之外，还进行了抗-GGX mAb免疫亲和富集，这次与经由串联质量标签(TMT)进行的同量异位多重分析相结合，如针对抗-K-ε-GG mAb所描述的那样(Rose,C.M.等人,Cell Syst 3,395-403.e4(2016))。在TMT分析中，可在单个多重实验中比较每种条件的若干个重复：对照(无dox)、仅UBE2W、仅RNF4和RNF4/UBE2W(组合)。这组样品使得评估UBE2W和RNF4在底物的N末端泛素化中潜在的E2/E3协同作用成为可能。在此范例中，UBE2W底物以两种对比表示：UBE2W-对照和组合-RNF4。对比是指在已鉴定和定量的特征的列表中比较一对条件。在TMT分析中，鉴定出来源于99种蛋白质的141个独特的N末端泛素化GGX PSM，肽和蛋白质错误发现率分别为0.80％和2.02％。对数据的粗略检查表明，RNF4过表达不会显著影响N末端泛素化水平，无论是在仅RNF4样品中，还是协同地与UBE2W共表达时(即在组合样品中)。这些条件中的每一者都分别产生与对照和仅UBE2W条件相似的定量数据。为了寻找多种条件下出现的hits，将组合-RNF4对比的log2FC与UBE2W-对照的进行比较，在多种条件下产生一组具有log2FC>1且p<0.05高置信度的60种UBE2W底物。(图4D、表8)。
在对应的LFQ分析中，鉴定出来源于120种蛋白质的186个独特的N末端泛素化GGXPSM，肽错误发现率为1.38％。由于肽水平上的重复鉴定频率，此数据集的蛋白质错误发现率异常高，达到13.33％。重点关注在仅UBE2W与对照、组合与仅RNF4以及组合与对照中N末端泛素化水平增加的蛋白质(log2FC>1且p<0.05)，此数据产生了与TMT分析部分重叠的38种UBE2W底物(图4E)。通过在UBE2W-对照和组合-仅RNF4对比中要求log2FC>1且p<0.05来过滤最高置信度hits，产生28个高置信度UBE2W底物蛋白hits(图4F)。
整合本文描述的所有MS实验数据揭示了已鉴定底物的显著重叠，其中单独实验中的每一者中都鉴定出独特底物的子集(图4G)。进一步检查显示，大多数(约53％)在单独的UBE2W与UBE2W/RNF4组合条件之间共享，证实RNF4的外源表达确实不增强体内UBE2W的活性(图4E、表8)。
三项定量免疫亲和富集实验的总和：询问UBE2W过表达与对照的LFQ，比较单独地UBE2W和RNF4过表达以及组合与对照的TMT分析，以及后续的LFQ实验，74种UBE2W底物被报告为达到统计学意义(参见下面表8中的总结)。与对照相比，TMT实验产生的定量数据始终为表达UBE2W的样品中若干种蛋白质产生增加的信号，从而表明这些确实是UBE2W的底物(参见图4H中的RS7、MIP18和QKI的结果)。
接下来，通过在细胞中异位表达具有UBE2W或UBE2WW144E(减少泛素结合的突变体)的低赖氨酸C末端HA-标记蛋白来验证新鉴定的底物(Vittal,V.等人,Nat Chem Biol 11,83-89(2015))。考虑到先前的观察结果(即N末端HA-标签代表可被UBE2W识别和修饰的内在无序的序列)，因此使用C末端标记的底物至关重要(Vittal,V.等人,Nat Chem Biol 11,83-89(2015))。大多数已鉴定的UBE2W底物表现出单泛素化形式的富集；然而，在一些情况下，可以检测到与多泛素化一致的高分子量条带，在不希望受理论束缚的情况下，假定多泛素化是在N末端泛素化之后通过其它酶的作用发生的(图4I)。重要的是，这些底物的单泛素化种类并未在表达突变体UBE2WW144E的细胞中积累，证实这些底物依赖于UBE2W泛素结合并随后转移至靶蛋白氨基末端(图4I)。对实验中已鉴定底物的检查表明，N末端泛素化仅发生在翻译起始甲硫氨酸上。这是令人惊讶的，因为许多这些相同的蛋白质在第二个位置展示小的疏水性氨基酸，这往往会触发MetAP39去除N末端Met(参见图4J，其中对免疫亲和富集的UBE2W底物的第二个位置的分析表明优先富集在起始子甲硫氨酸之后含有甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸或苯丙氨酸的肽)。由于已知UBE2W优先泛素化具有无序N末端的蛋白质(Vittal,V.等人,Nat Chem Biol 11,83-89(2015))，因此使用蛋白质预测软件来评估这些假定的底物是否确实具有无序的N末端。使用蛋白质无序预测系统(PrDOS)(Ishida,T.&Kinoshita,K.Nucleic Acids Res 35,W460-W464(2007))，发现这些蛋白质中的62种具有预测的无序的N末端(表8，右列)。
总共鉴定出74种UBE2W细胞底物。UBE2W底物以及如在实例3中描述的试点免疫亲和富集和MS实验中鉴定的具有假定的N末端泛素化位点的蛋白质的总结提供于下面的表8中。在表8中，“X”表示蛋白质在对应的MS实验中被鉴定，或被预测具有无序的N末端。
表8.免疫亲和富集和MS实验中鉴定的蛋白质的总结
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实例5：UCHL1和UCHL5为UBE2W的底物，并且N末端泛素化调节UCHL1和UCHL5去泛素化酶活性
以下实例描述了表征UBE2W底物UCHL1和UCHL5(泛素C末端水解酶(UCH)去泛素化酶家族的两个成员)的实验。具体来说，据证明在体外泛素化测定中，UCHL1和UCHL5被UBE2W在N末端泛素化。此外，N末端泛素化被证明可调节UCHL1和UCHL5的去泛素化酶活性。
材料和方法
细胞培养
HEK293和COS-7细胞系获自Genentech的细胞系核心设施gCell。将细胞维持在补充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和50U/ml青霉素-链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)中。所有细胞系均在37℃/5％CO2的湿润培养箱中培养，并且每隔一天更换一次培养基。在适用的情况下，用媒剂DMSO(目录号D2650，Sigma-Aldrich)、1μg/ml多西环素(目录号D9891，Sigma-Aldrich)、1μM硼替佐米(目录号2204，CST)和10μg/ml环己酰亚胺(目录号2112，CST)处理细胞达到指定的时间。
泛素化测定
对于泛素化测定，使用100nM E1(目录号E-305，Boston Biochem)、4μM UBE2W(目录号E2-740，Boston Biochem)、1μMUCHL1-K0和UCHL5-K0(内部制造)、1μM RNF4(目录号E3-210，Boston Biochem)和250μM Ub(目录号U-100H，Boston Biochem)的混合物。所有反应均在40μl泛素化缓冲液(50mM tris pH 7.5、5mM MgCl2、50mM KCL和0.2mM DTT)中在37℃进行2小时。反应从3mM ATP开始，并通过加入Laemmli缓冲液终止，并加热至90℃，然后通过SDS-PAGE分离蛋白质，并通过使用适当抗体的免疫印迹进行可视化。
生物层干涉测量测定
BLI测定在Octet Red384(Forte Bio)平台上使用384倾斜孔板进行。所有实验均在25℃、1000RPM振荡、60μL孔体积下进行，并使用含有以下的缓冲液：150mM NaCl、20mMTris 7.5、1mg/mL BSA、0.01％-20和1mM TCEP。在空白缓冲液中的每个上样、缔合或解离步骤之前进行60秒基线或洗涤步骤。将生物素化泛素(目录号UB-570，BostonBiochem)在链霉亲和素生物传感器(目录号18-5019，Forte Bio)上的固定优化至18nM(0.156μg/μL)，在300秒的上样步骤中响应为1nM。野生型或泛素融合蛋白的缔合是从5μM开始对蛋白进行4倍稀释。缔合步骤测量180秒，并且解离步骤测量300秒。使用未上样生物素-泛素的链霉亲和素吸头来测量每种蛋白质稀释液与吸头表面的非特异性结合，并在曲线拟合之前从原始数据测量中减去该数据。使用棱镜中的1:1结合模型拟合缔合和解离曲线，其中KD由动力学常数以及稳态测量确定(参见图6A、图6B、图6C和图6D)。
Ub-罗丹明110酶测定
将Ub-罗丹明110(目录号U-555，Boston Biochem)溶解在DMSO中，并使用10μl反应缓冲液(50mM HEPES pH 7.5、50mM KCl、5％甘油、5mM MgCl2、5mM DTT、0.1mg/ml BSA和0.005％Tween-20)中的1nM纯化酶和0.5μM底物(Ub-Rho110)确定活性测定。在37℃在黑色384-孔非结合表面低凸缘板(Corning)中进行实验，并在2105多模式读板仪(PerkinElmer)中分别使用350nm和450nm激发和发射波长进行监测。每60秒进行一次测量，持续120分钟(参见图6E)。
泛素乙烯基砜测定
纯化的蛋白质(50nM)与1μM Ub乙烯基砜HA-标记探针(Ub-VS-HA)(目录号U-212，Boston Biochem)进行酶促反应。所有反应均在40μl去泛素化酶(DUB)缓冲液(50mM HEPESpH 7.5、50mM KCl、5％甘油、5mM MgCl2、5mM DTT、0.1mg/ml BSA和0.005％-20)中在37℃进行30分钟。通过使用适当的抗体进行免疫印迹来检测定点HA-Ub-VS探针对酶的修饰(参见图6F)。
蛋白质表达和纯化
所有的全长野生型和突变蛋白以及N末端融合Ub均通过定制基因合成(GeneScript)来获得，并亚克隆到单个蛋白表达载体中用于在大肠杆菌中表达。所有序列均用6-His标签在其C末端进行标记。在18℃蛋白质在BL21-Gold(DE3)细胞中表达18小时，然后在含有500mM NaCl、50mM Tris 7.5、5％甘油和1mM TCEP的裂解缓冲液中通过离心来收获。通过亲和层析(Ni-NTA琼脂糖，Thermofisher)，然后通过尺寸排阻层析(16/600Superdex200,GE Healthcare)来纯化蛋白质。将蛋白质样品浓缩并冷冻在GF缓冲液(150mM NaCl、20mM Tris 7.5、1mM TCEP)中。
结果
UCHL1和UCHL5为UBE2W的底物
UBE2W底物列表中值得注意的是泛素C末端水解酶(UCH)去泛素化酶家族的两个成员UCHL1和UCHL5(图5A、图5B、图5C、图5D、表8)。UCHL1在三项LC-MS实验之一中被鉴定为假定底物，而UCHL5在所有三项实验中均被鉴定。由于数据依赖鸟枪法测序的特殊性，这些实验没有产生数据来证明TMT样品中UCHL1的N末端泛素化。鉴定出两种不同形式的N末端泛素化UCHL1和UCHL5肽，各自代表每种肽的半胰蛋白酶和完全胰蛋白酶形式，进一步增加了对其各自鉴定的置信度。先前，有人认为UCHL1是N末端泛素化的，然而负责这种修饰的酶尚不清楚(Meray,R.K.&Lansbury,P.T.J Biol Chem 282,10567-10575(2007))。为了验证这两种去泛素化酶确实是N末端泛素化的，使用纯化的蛋白质进行体外泛素化测定，并且观察到UBE2W可以单泛素化UCHL1和UCHL5的低赖氨酸版本(图5E)。支持这些数据的是，内源UCHL1在细胞中表达UBE2W时被单泛素化(图5F)。重要的是，UBE2WW144E表达不支持Ub-UCHL1的形成(图5F)。不幸的是，在蛋白质印迹实验中没有检测到UCHL5的修饰(数据未显示)。
N末端泛素化已被认为是蛋白质降解的信号(Ciechanover,A.&Ben-Saadon,R.Trends Cell Biol 14,103-106(2004)；Breitschopf,K.等人,Embo J 17,5964-5973(1998)；Bloom,J.等人,Cell 115,71-82(2003)；Coulombe,P.等人,Mol Cell Biol 24,6140-6150(2004))。然而，最近的研究表明，在蛋白酶体抑制剂存在的情况下，N末端泛素化蛋白质仅适度积累，这表明N末端泛素化可能具有除蛋白质降解之外的作用(Akimov,V.等人,Nat Struct Mol Biol 25,631-640(2018))。因此，在细胞测定中评估了N末端泛素化是否促进UCHL1的降解。为了测试这一点，表达了UBE2W，并用蛋白酶体抑制剂硼替佐米处理HEK293细胞。尽管高分子量泛素化蛋白在硼替佐米处理的细胞中积累，但未观察到Ub-UCHL1的积累(图5G)。为了再次确认UCHL1的N末端单泛素化不会触发其降解，进行了环己酰亚胺追逐实验。虽然不稳定的蛋白p21在表达UBE2W并用环己酰亚胺处理的细胞中迅速降解，但Ub-UCHL1保持稳定。仅在稍后的时间点(5小时)，UCHL1蛋白水平才开始下降(图5H)。总之，这些结果表明UBE2W在细胞中的N末端单泛素化不会触发UCHL1的降解。
N末端泛素化调节UCHL1和UCHL5去泛素化酶活性
由于在基于细胞的测定中，N末端泛素化不会促进UCHL1降解，因此接下来评估N末端泛素化是否调节UCHL1和UCHL5去泛素化酶功能。为了评估这一点，生成了许多UCHL1和UCHL5变体，包括野生型(UCHL1WT和UCHL5WT)、催化失活突变体(UCHL1C90S和UCHL5C88S)、N末端泛素化模拟物(UbG76V-UCHL1和UbG76V-UCHL5)和泛素突变体(UbI44A,G76V-UCHL1和UbI44A,G76V-UCHL5)。对于模拟物，泛素的C末端与去泛素化酶的起始甲硫氨酸融合，并且泛素中的最后一个甘氨酸突变为缬氨酸，以防止经由UCH自催化活性去除泛素。
先前的结构工作表明，Ub结合导致UCHL1活性位点残基重排成具有催化能力的构型(Boudreaux,D.A.等人,Proc National Acad Sci 107,9117-9122(2010))。然而，UCHL1活性位点附近的内部赖氨酸的单泛素化已被证明可阻断其底物的结合(Meray,R.K.&Lansbury,P.T.J Biol Chem 282,10567-10575(2007))。此外，UCHL5的活性在底物亲和力水平上进行调节(Yao,T.等人,Nat Cell Biol 8,994-1002(2006))。因此，测试了N末端泛素化是否会调节UCHL1和UCHL5的泛素结合亲和力。使用生物层干涉测量(BLI)，检查了UCHL1WT、UCHL5WT、UbG76V-UCHL1、UbG76V-UCHL5、UbI44A,G76V-UCHL1和UbI44A,G76V-UCHL5的单泛素结合能力(图6A)。与先前的报道一致(Larsen,C.N.等人,Biochemistry-us 37,3358-3368(1998)；Osaka,H.等人,Hum Mol Genet 12,1945-1958(2003))，观察到单泛素与UCHL1WT之间存在强烈的相互作用。然而，仅在高单泛素浓度(5μM)下观察到单泛素与UbG76V-UCHL1之间的结合(图6B、图6C)。UCHL5也出现了相似的趋势，然而，与UCHL1相比，对单泛素的亲和力大大降低(图6B、图6D)。有趣的是，与UbG76V-UCHL1相比，UbI44A,G76V-UCHL1的结合增加约3倍，表明UCHL1能够与其N末端Ub修饰在顺式中相互作用。相反，加入I44A对UbG76V-UCHL1的Ub结合没有影响。因此，得出结论，N末端泛素化阻止UCHL1和UCHL5结合单泛素。
接下来，通过使用泛素-罗丹明110(Ub-Rho110)进行去泛素化酶活性测定，来检查UCHL1和UCHL5的去泛素化酶活性是否在N末端泛素化后发生改变。UCHL1WT和UCHL5WT的动力学与先前的报道一致(Boudreaux,D.A.等人,Proc National Acad Sci 107,9117-9122(2010)；Yao,T.等人,Nat Cell Biol 8,994-1002(2006))，并且正如预期的那样，从催化死亡的UCHL1C90S和UCHL5C88S中未检测到活性(图6E和表9)。引人注目的是，UCHL1和UCHL5的N末端泛素化对其各自的去泛素化酶活性产生相反的影响。与UCHL1WT相比，UbG76V-UCHL1和UbI44A,G76V-UCHL1显示出显著降低的活性，而与UCHL5WT相比，UbG76V-UCHL5和UbI44A,G76V-UCHL5的活性显著增强(图6E和表9)。为了证实Ub-Rho110测定，使用了自杀探针泛素-乙烯基砜(Ub-VS)(Borodovsky,A.等人,Embo J 20,5187-5196(2001))。UCHL1WT很容易与Ub-VS反应，30分钟后接近完成，而UbG76V-UCHL1基本上保持未修饰(图6F)。相反，UCHL5WT仅在30分钟时部分修饰，而UbG76V-UCHL5快速与Ub-VS反应(图6F)。总之，这些数据表明N末端泛素化调节UCHL1和UCHL5的去泛素化酶活性，但方向相反。
表9.Ub Rho-110-单泛素实验的UCHL1和UCHL5动力学表(“ND”表示无数据)
最后，先前的报道已表明UCHL1去泛素化酶活性调节细胞中的游离单泛素池(Osaka,H.等人,Hum Mol Genet 12,1945-1958(2003))。由于N末端泛素化在体外负调节UCHL1活性，因此探讨了这种修饰在细胞中的生理后果。与先前在COS-7细胞中的工作一致(Meray,R.K.&Lansbury,P.T.J Biol Chem 282,10567-10575(2007))，UCHL1WT的外源性表达显著增加了游离单泛素的水平(图6G，与泳道1相比的泳道2)。然而，UbG76V-UCHL1的表达将游离单泛素的积累降低至背景水平(图6G、泳道3)。此结果支持体外生化观察结果，表明UbG76V-UCHL1不能与单泛素结合(图6B、图6C)。类似于UCHL1WT，UCHL1C90S表达触发游离单泛素的积累(图6G，比较泳道4和泳道2)。然而，表达UbG76V-UCHL1C90S和非-Ub结合UCHL1突变体(UCHL1D30K)的细胞显示游离单泛素的基础水平(图6G，泳道5和6)。
总的来说，本文提供的数据表明Ub-结合活性而不是UCHL1的催化活性调节细胞中的游离单泛素池。此外，这些结果表明UCHL1的N末端泛素化阻断了Ub结合并抑制其细胞功能。
结论
总之，本文描述的工作建立了新的抗体工具包，该工具包用于全局分析N末端泛素化多肽，并鉴定了这种非典型形式的泛素化的新作用。负责合成这种翻译后修饰的关键酶已被表征，并且提供了关于底物如何在其N末端修饰的见解。
实例6：证明N末端泛素化功能独立于蛋白酶体降解
以下实例描述了测试N末端泛素化是否导致大量底物被蛋白酶体降解的实验。尽管数据表明UCHL1不是N末端泛素化后蛋白酶体降解的靶标，但现有数据并没有排除N末端泛素化和蛋白酶体降解之间更广泛的联系。为了系统地评估这种联系，使用了UBE2W Dox-诱导型过表达模型，这次是在存在和不存在蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Btz)的情况下进行。
材料和方法
使用无标记物定量如实例4中所述进行实验。在收获细胞之前，另外用10μM蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Btz)处理细胞2小时。
结果
在生物学重复中生成四种单独的样品：对照(Dox(-)/Btz(-))、单独的Btz蛋白酶体抑制(Dox(-)/Btz(+))、单独的UBE2W过表达(Dox(+)/Btz(-))和组合(Dox(+)/Btz(+))(图7A)。使用与先前的MS实验相同的过滤和截止值，对富含GGX的肽的无标记物定量数据进行询问，以询问N末端泛素化是否在蛋白酶体抑制后增加。与早期的RNF4实验一样，在不存在和存在Btz处理的情况下均鉴定出UBE2W-依赖性底物，如UBE2W-Ctrl(左，图7B)和组合-Btz(右，图7B)对比所示。有趣的是，GGX富集的肽丰度在多种底物中并未因蛋白酶体抑制而系统性地改变(图7C)，证实了蛋白酶体降解不是N末端泛素化的主要结果的假设。与这一观察结果一致，UBE2W过表达条件(即，UBE2W和组合)之间存在很强的相关性，而Btz-处理的样品与对照密切相关(图7D)。然而，236个GGX肽中有12个(约5％)显示，相对于单独Btz处理或UBE2W过表达，组合样品中丰度的协调增加，如组合-UBE2W和组合-Btz对比中的Log2FC>2中所示。综上所述，本文描述的无标记物蛋白质组学分析证实，UBE2W的N末端泛素化不足以触发绝大多数底物的蛋白酶体降解。
实例7：使用抗-GGX抗体检测泛素化多肽
以下实例描述了使用蛋白酶Lbpro*消化细胞裂解物，以及使用抗-GGX抗体检测消化的细胞裂解物中具有Gly-Gly基序的肽。Lbpro*切割Gly-Gly氨基酸残基之前的肽键。因此，与主要在赖氨酸或精氨酸氨基酸残基的羧基侧切割肽链的胰蛋白酶相比，Lbpro*以更高程度的序列特异性选择性切割蛋白质。因为缺少Gly-Gly基序的蛋白质不会被Lbpro*切割，因此据信使用Lbpro*消化细胞裂解物将产生大量消化的肽或修饰的蛋白质，该蛋白质富集泛素化底物中的肽。
Lbpro*的制备和Ub-剪切
Lbpro*根据Swatek,K.N.等人.,Protocol Exchange 2019年8月22日；10.21203/rs.2.10850/v1中描述的方案进行表达和纯化。此外，使用全细胞裂解物进行“Ub-剪切”(同上)。具体来说，将细胞裂解物与Lbpro一起孵育，以产生在泛素化位点含有GG加成的修饰蛋白。
泛素化多肽的检测。
然后使用本文提供的抗-GGX抗体通过蛋白质印迹来检测细胞裂解物中的泛素化多肽。具体来说，将已用Lbpro*消化的全细胞裂解物上样并在SDS-PAGE凝胶上分离，并使用本领域标准技术转移到膜上。替代性地，在上样到SDS-PAGE凝胶上之前，可以使用抗-GGX抗体对已用Lbpro*消化的全细胞裂解物进行免疫沉淀。将膜与一种或多种抗-GGX抗体一起孵育。GGX抗体可以使用第二抗体(例如抗兔抗体)进行标记或检测。
序列表
<110> 基因泰克公司
<120> 抗泛素化抗体及其使用方法
<130> 14639-20523.40
<140> 尚未分配
<141> 同时附上
<150> US 63/212,075
<151> 2021-06-17
<160> 60
<170> 用于 Windows 的 FastSEQ，4.0 版
<210> 1
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<213> 人工序列
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<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 8, 10, 16, 17, 23, 24, 30, 31, 32, 33, 50,
51, 52, 53, 54, 56, 57, 68, 73, 81, 86, 94, 95, 98, 99,
100, 101, 103
<223> Xaa = 任何氨基酸
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 2, 3, 8, 10, 20, 26, 27, 31, 32, 34, 36, 46, 48, 49, 51,
52, 57, 61, 65, 74, 93, 94, 97, 99, 102, 103, 109, 110,
111, 112
<223> Xaa = 任何氨基酸
<400> 34
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1, 2, 3
<223> Xaa = 任何氨基酸
<400> 35
Xaa Xaa Xaa Met Asn
1 5
<210> 36
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8
<223> Xaa = 任何氨基酸
<400> 36
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala
1 5 10
<210> 37
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 3, 4, 5, 6, 8
<223> Xaa = 任何氨基酸
<400> 37
Asp Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Xaa
1 5
<210> 38
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 3, 4, 8, 9, 11, 13
<223> Xaa = 任何氨基酸
<400> 38
Gln Ser Xaa Xaa Ser Val Tyr Xaa Xaa Asn Xaa Leu Xaa
1 5 10
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1, 6
<223> Xaa = 任何氨基酸
<400> 39
Xaa Ala Ser Thr Leu Xaa Ser
1 5
<210> 40
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 3, 4, 7, 9, 12, 13
<223> Xaa = 任何氨基酸
<400> 40
Leu Gly Xaa Xaa Asp Cys Xaa Ser Xaa Asp Cys Xaa Xaa
1 5 10
<210> 41
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 41
Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gly Gly Gln Leu Glu Asp Gly Arg
1 5 10
<210> 42
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 42
Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Gly Gly Glu Ser Thr Leu His
1 5 10 15
Leu Val Leu Arg
20
<210> 43
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 43
Gly Gly Met Leu Thr Asn Ala Arg
1 5
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
Gly Gly Met Ala Leu Ala Leu Ala Val Thr Lys
1 5 10
<210> 45
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 45
Gly Gly Leu Ala Thr Phe His Gly Pro Gly Gln Leu Leu Cys His Pro
1 5 10 15
Val Leu Asp Leu Arg
20
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 46
Gly Gly Met Thr Ser Thr Tyr Gly Arg
1 5
<210> 47
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 47
Gly Gly Met Phe Gly Ser Ala Pro Gln Arg Pro Val Ala Met Thr Thr
1 5 10 15
Ala Gln Arg
<210> 48
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 48
Gly Gly Met Gln Leu Lys Pro Met Glu Ile Asn Pro Glu Met Leu Asn
1 5 10 15
Lys
<210> 49
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 49
Gly Gly Met Thr Gly Asn Ala Gly Glu Trp Cys Leu Met Glu Ser Asp
1 5 10 15
Pro Gly Val Phe Thr Glu Leu Ile Lys
20 25
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 50
Gly Gly Met Gln Leu Lys Pro Met Glu
1 5
<210> 51
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 51
Gly Gly Met Thr Gly Asn Ala Gly Glu Trp Cys Leu Met Glu
1 5 10
<210> 52
<211> 436
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 52
Gln Ser Val Lys Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Lys Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Tyr
20 25 30
Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ile Met Phe Pro Asn Gly Lys Ile Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Thr Gly Asp Asp
85 90 95
Ser Gly Asp Val Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys
115 120 125
Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly
130 135 140
Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr
145 150 155 160
Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr
180 185 190
Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val
195 200 205
Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu
210 215 220
Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
225 230 235 240
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
245 250 255
Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln
260 265 270
Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr
275 280 285
Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg
290 295 300
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
305 310 315 320
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys
325 330 335
Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val
340 345 350
Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val
355 360 365
Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
370 375 380
Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser
385 390 395 400
Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val
405 410 415
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg
420 425 430
Ser Pro Gly Lys
435
<210> 53
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 53
Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Ala Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Thr Asn
20 25 30
Asn Arg Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Ala Lys Glu
35 40 45
Met Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Pro Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ala Leu Thr Ile Ser Asp Val
65 70 75 80
Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Thr Tyr Asp Cys
85 90 95
Leu Ser Ala Asp Cys Leu Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro Ala Ala
115 120 125
Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys
130 135 140
Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr Thr Gln
145 150 155 160
Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser Ala Asp Cys
165 170 175
Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr Gln Tyr Asn
180 185 190
Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr Thr Ser Val
195 200 205
Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
210 215
<210> 54
<211> 435
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 54
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Thr Pro Gly Gly Ala
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Asn Arg His Trp
20 25 30
Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ala Ile Asn Glu Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Phe Ile Ser Lys Thr Thr Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Asp Asp
85 90 95
Asp Val Ser Asn Phe Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly
115 120 125
Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
130 135 140
Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn
145 150 155 160
Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys
180 185 190
Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala
195 200 205
Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly
210 215 220
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
225 230 235 240
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
245 250 255
Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val
260 265 270
Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile
275 280 285
Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly
290 295 300
Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
305 310 315 320
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val
325 330 335
Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser
340 345 350
Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu
355 360 365
Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala
370 375 380
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val
385 390 395 400
Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met
405 410 415
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser
420 425 430
Pro Gly Lys
435
<210> 55
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 55
Asp Pro Met Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Ser Ile Asn Cys Gln Ser Thr Lys Ser Val Tyr Lys Tyr
20 25 30
Asn His Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Gln
35 40 45
Leu Ile Phe Pro Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val
65 70 75 80
Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Leu Tyr Asp Cys
85 90 95
Arg Ser Gly Asp Cys Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro Ala Ala
115 120 125
Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys
130 135 140
Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr Thr Gln
145 150 155 160
Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser Ala Asp Cys
165 170 175
Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr Gln Tyr Asn
180 185 190
Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr Thr Ser Val
195 200 205
Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
210 215
<210> 56
<211> 437
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 56
Gln Lys Gln Leu Met Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr
1 5 10 15
Pro Leu Thr Leu Thr Cys Lys Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Met Phe Pro Asn Gly Lys Ile Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Thr Gly Asp
85 90 95
Asp Ser Gly Asp Val Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys
115 120 125
Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys
130 135 140
Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu
145 150 155 160
Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val
180 185 190
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr
195 200 205
Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu
210 215 220
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
225 230 235 240
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
245 250 255
Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu
260 265 270
Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser
275 280 285
Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu
290 295 300
Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala
305 310 315 320
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro
325 330 335
Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser
340 345 350
Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser
355 360 365
Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr
370 375 380
Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
385 390 395 400
Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser
405 410 415
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser
420 425 430
Arg Ser Pro Gly Lys
435
<210> 57
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 57
Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Ala Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Thr Asn
20 25 30
Asn Arg Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Ala Lys Glu
35 40 45
Met Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Pro Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ala Leu Thr Ile Ser Asp Val
65 70 75 80
Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Glu Phe Asp Cys
85 90 95
Thr Ser Ala Asp Cys Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val
100 105 110
Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro Ala Ala
115 120 125
Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys
130 135 140
Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr Thr Gln
145 150 155 160
Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser Ala Asp Cys
165 170 175
Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr Gln Tyr Asn
180 185 190
Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr Thr Ser Val
195 200 205
Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
210 215
<210> 58
<211> 436
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 58
Gln Ser Val Glu Glu Ser Arg Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Lys Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Tyr
20 25 30
Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ile Met Phe Pro Asn Gly Lys Ile Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Thr Gly Asp Asp
85 90 95
Ser Gly Asp Val Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys
115 120 125
Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly
130 135 140
Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr
145 150 155 160
Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr
180 185 190
Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val
195 200 205
Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu
210 215 220
Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
225 230 235 240
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
245 250 255
Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln
260 265 270
Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr
275 280 285
Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg
290 295 300
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
305 310 315 320
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys
325 330 335
Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val
340 345 350
Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val
355 360 365
Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
370 375 380
Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser
385 390 395 400
Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val
405 410 415
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg
420 425 430
Ser Pro Gly Lys
435
<210> 59
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 59
Asp Pro Met Leu Thr Gln Thr Ala Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Ser Asn
20 25 30
Asn Arg Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Glu
35 40 45
Met Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Pro Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val
65 70 75 80
Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Thr Tyr Asp Cys
85 90 95
Leu Ser Ala Asp Cys Leu Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val
100 105 110
Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro Ala Ala
115 120 125
Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys
130 135 140
Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr Thr Gln
145 150 155 160
Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser Ala Asp Cys
165 170 175
Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr Gln Tyr Asn
180 185 190
Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr Thr Ser Val
195 200 205
Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
210 215
<210> 60
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = R 或 K
<220>
<221> 变体
<222> 4, 5, 6, 7
<223> Xaa = 任何氨基酸
<400> 60
Xaa Gly Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5

Claims (64)

1.一种与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体，其中所述抗体与所述肽的N末端处的氨基酸序列GGX结合，其中所述抗体不与包含支链双甘氨肽的氨基酸序列(K-ε-GG)结合。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体与包含选自由以下项组成的组的N末端序列的肽结合：GGA、GGE、GGF、GGG、GGH、GGI、GGL、GGM、GGN、GGQ、GGS、GGT、GGV和GGW。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的抗体，其中所述抗体与以下结合：包含GGA的N末端序列的肽、包含GGE的N末端序列的肽、包含GGF的N末端序列的肽、包含GGG的N末端序列的肽、包含GGH的N末端序列的肽、包含GGI的N末端序列的肽、包含GGL的N末端序列的肽、包含GGM的N末端序列的肽、包含GGN的N末端序列的肽、包含GGQ的N末端序列的肽、包含GGS的N末端序列的肽、包含GGT的N末端序列的肽、包含GGV的N末端序列的肽，以及包含GGW的N末端序列的肽。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体，其中所述抗体为兔、啮齿动物或山羊抗体。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中所述抗体为全长抗体或Fab片段。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体，其中所述抗体缀合至可检测标记物。
7.根据权利要求6所述的抗体，其中所述标记物选自由以下项组成的组：生物素、地高辛和荧光素。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的抗体，其中所述抗体固定在固体支持物上。
9.根据权利要求8所述的抗体，其中所述抗体固定在珠粒上。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含根据Kabat编号含有在一侧的位置35处的Asn、位置37处的Val、位置93处的Thr、位置101处的Asn和位置103处的Trp的可变重链(VH)，以及含有位置34处的Ala、位置36处的Tyr和位置49处的Tyr的可变轻链(VL)。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中所述抗体包含含有氨基酸序列XXXMN(SEQ ID NO:35)的CDRH1；含有氨基酸序列XXXXXGXXYYATWA(SEQ ID NO:36)的CDRH2；以及含有氨基酸序列DDXXXXNX(SEQ ID NO:37)的CDRH3；其中所述抗体包含含有氨基酸序列QSXXSVYXXNXLX(SEQ ID NO:38)的CDRL1；含有氨基酸序列XASTLXS(SEQ ID NO:39)的CDRL2；以及含有氨基酸序列LGXXDCXSXDCXX(SEQ ID NO:40)的CDRL3；其中X为任何氨基酸。
12.根据权利要求11所述的抗体，其中所述VH包含SEQ ID NO:33中所示的氨基酸，并且所述VL包含SEQ ID NO:34中所示的氨基酸序列。
13.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的VH的CDRH1、CDRH2和CDRH3，以及含有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的VL的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
14.根据权利要求13所述的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:3中所示的CDRH1氨基酸序列；SEQ ID NO:4中所示的CDRH2氨基酸序列；SEQ ID NO:5中所示的CDRH3氨基酸序列；SEQ ID NO:6中所示的CDRL1氨基酸序列；SEQ ID NO:7中所示的CDRL2氨基酸序列；以及SEQID NO:8中所示的CDRL3氨基酸序列。
15.根据权利要求13所述的抗体，其中所述VH包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含SEQ ID NO:52中所示的氨基酸序列，并且所述轻链包含SEQ ID NO:53中所示的氨基酸。
17.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列的VH的CDRH1、CDRH2和CDRH3，以及含有SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列的VL的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
18.根据权利要求17所述的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:11中所示的CDRH1氨基酸序列；SEQ ID NO:12中所示的CDRH2氨基酸序列；SEQ ID NO:13中所示的CDRH3氨基酸序列；SEQ ID NO:14中所示的CDRL1氨基酸序列；SEQ ID NO:15中所示的CDRL2氨基酸序列；以及SEQ ID NO:16中所示的CDRL3氨基酸序列。
19.根据权利要求18所述的抗体，其中所述VH包含SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含SEQ ID NO:54中所示的氨基酸序列，并且所述轻链包含SEQ ID NO:55中所示的氨基酸。
21.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列的VH的CDRH1、CDRH2和CDRH3，以及含有SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列的VL的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
22.根据权利要求21所述的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:19中所示的CDRH1氨基酸序列；SEQ ID NO:20中所示的CDRH2氨基酸序列；SEQ ID NO:21中所示的CDRH3氨基酸序列；SEQ ID NO:22中所示的CDRL1氨基酸序列；SEQ ID NO:23中所示的CDRL2氨基酸序列；以及SEQ ID NO:24中所示的CDRL3氨基酸序列。
23.根据权利要求22所述的抗体，其中所述VH包含SEQ ID NO:17中所示的氨基酸，并且所述VL包含SEQ ID NO:18中所示的氨基酸。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含SEQ ID NO:56中所示的氨基酸序列，并且所述轻链包含SEQ ID NO:57中所示的氨基酸。
25.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列的VH的CDRH1、CDRH2和CDRH3，以及含有SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列的VL的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
26.根据权利要求25所述的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:27中所示的CDRH1氨基酸序列；SEQ ID NO:28中所示的CDRH2氨基酸序列；SEQ ID NO:29中所示的CDRH3氨基酸序列；SEQ ID NO:30中所示的CDRL1氨基酸序列；SEQ ID NO:31中所示的CDRL2氨基酸序列；以及SEQ ID NO:32中所示的CDRL3氨基酸序列。
27.根据权利要求26所述的抗体，其中所述VH包含SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含SEQ ID NO:58中所示的氨基酸序列，并且所述轻链包含SEQ ID NO:59中所示的氨基酸。
29.一种核酸，其编码根据权利要求1至28中任一项所述的抗体。
30.一种宿主细胞，其包含根据权利要求29所述的核酸。
31.一种筛选与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体的方法，其中所述抗体与所述肽的N末端处的氨基酸序列GGX结合，其中所述抗体不与包含支链双甘氨肽的氨基酸序列(K-ε-GG)结合，所述方法包括
i)提供抗体文库；
ii)正向选择与在N末端处包含氨基酸序列GGX的肽结合的抗体，其中X为任何氨基酸；以及
iii)负向选择与包含氨基酸序列K-ε-GG的肽结合的抗体，从而产生与在N末端处包含氨基酸GGX的肽特异性结合并且不与氨基酸序列K-ε-GG结合的抗体。
32.根据权利要求31所述的方法，其中在步骤ii)中，正向选择与在N末端处包含氨基酸序列GGM的肽结合的抗体。
33.根据权利要求31或32所述的方法，其中负向选择与包含氨基酸序列K-ε-GG的肽结合的抗体是与步骤ii)同时进行的。
34.根据权利要求31或32所述的方法，其中负向选择与包含氨基酸序列K-ε-GG的肽结合的抗体是在步骤ii)之前或之后。
35.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述文库为噬菌体文库或酵母文库。
36.根据权利要求31至35中任一项所述的方法，其中所述文库通过用肽文库使哺乳动物免疫来产生，所述肽文库包含在N末端处含有氨基酸序列GGM的肽。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述哺乳动物为兔或小鼠。
38.根据权利要求31至37中任一项所述的方法，其中步骤ii)至iii)重复两次或更多次。
39.一种抗体，其通过根据权利要求31至38中任一项所述的方法产生。
40.一种富集包含肽的混合物的样品中的N末端泛素化蛋白的肽的方法，所述方法包括：
i)使所述样品与抗体接触，所述抗体与N末端泛素化蛋白的肽结合；以及
ii)从所述样品中选择抗体结合的肽，其中所述抗体与N末端处的氨基酸序列GGX结合，其中所述抗体不与包含支链双甘氨肽的氨基酸序列(K-ε-GG)结合。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述样品为细胞裂解物。
42.根据权利要求41所述的方法，其进一步包括使细胞中的去泛素化酶缺失并裂解所述细胞以产生所述细胞裂解物。
43.根据权利要求41所述的方法，其进一步包括在细胞中过表达泛素连接酶并裂解所述细胞以产生所述细胞裂解物。
44.根据权利要求41至43中任一项所述的方法，其中将所述细胞裂解物与胰蛋白酶一起孵育以产生所述肽。
45.根据权利要求41至43中任一项所述的方法，其中将所述细胞裂解物与细菌或病毒蛋白酶一起孵育以产生所述肽。
46.根据权利要求42至45中任一项所述的方法，其进一步包括在裂解物产生并与胰蛋白酶一起孵育之前或者在与细菌或病毒蛋白酶一起孵育之前，用蛋白酶体抑制剂或去泛素化的抑制剂处理所述细胞。
47.根据权利要求40至46中任一项所述的方法，其进一步包括检测所选择的抗体结合的肽。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述抗体结合的肽通过质谱法来检测。
49.根据权利要求47所述的方法，其中所述抗体结合的肽通过蛋白质测序来检测。
50.根据权利要求47所述的方法，其中使用与所述抗体结合的二抗检测所述抗体结合的肽，所述抗体与N末端泛素化蛋白的肽结合。
51.一种通过根据权利要求40至50中任一项所述的方法产生的N末端泛素化蛋白的肽的文库。
52.一种检测包含肽的混合物的样品中的N末端泛素化蛋白的肽的方法，所述方法包括
i)将所述样品与酶一起孵育以产生肽；
ii)使所述肽与抗体接触，所述抗体与N末端泛素化蛋白的肽结合，以及
iii)检测所述肽，其中所述抗体与N末端处的氨基酸序列GGX结合，其中所述抗体不与包含支链双甘氨肽的氨基酸序列(K-ε-GG)结合。
53.根据权利要求52所述的方法，其中使用与所述抗体结合的二抗检测所述肽，所述抗体与N末端泛素化蛋白的肽结合。
54.根据权利要求52或53所述的方法，其中所述样品为细胞裂解物。
55.根据权利要求54所述的方法，其进一步包括使细胞中的去泛素化酶缺失并裂解所述细胞以产生所述细胞裂解物。
56.根据54所述的方法，其进一步包括在细胞中过表达泛素连接酶并裂解所述细胞以产生所述细胞裂解物。
57.根据权利要求54至56中任一项所述的方法，其中将所述细胞裂解物与细菌或病毒蛋白酶一起孵育以产生所述肽。
58.根据权利要求55至57中任一项所述的方法，其进一步包括在裂解物产生并与细菌或病毒蛋白酶一起孵育之前，用蛋白酶体抑制剂或去泛素化的抑制剂处理所述细胞。
59.一种用于检测样品中的N末端泛素化蛋白的肽的试剂盒，所述试剂盒包含与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体以及使用说明书，其中与N末端泛素化多肽的肽结合的所述抗体，其中所述抗体与N末端处的氨基酸序列GGX结合，其中所述抗体不与包含支链双甘氨肽的氨基酸序列(K-ε-GG)结合。
60.根据权利要求59所述的试剂盒，其中所述抗体缀合至可检测标记物。
61.根据权利要求60所述的试剂盒，其中所述可检测标记物选自由以下项组成的组：生物素、地高辛和荧光素。
62.根据权利要求59至61中任一项所述的试剂盒，其中所述抗体固定在固体支持物上。
63.根据权利要求62所述的试剂盒，其中所述抗体固定在珠粒上。
64.根据权利要求59至63中任一项所述的试剂盒，其进一步包括蛋白酶。
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