ES2392891T3 - Procedimiento de prevención de la fusión virus célula inhibiendo la función de la región de iniciación de fusión de virus de ARN que tienen proteínas de envoltura fusogénicas de membrana de clase I - Google Patents

Procedimiento de prevención de la fusión virus célula inhibiendo la función de la región de iniciación de fusión de virus de ARN que tienen proteínas de envoltura fusogénicas de membrana de clase I Download PDF

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Abstract

Un péptido inhibidor de la fusión vírica aislado seleccionado entre el grupo compuesto por: a) un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos compuesto por la SEC ID n.º 1, b) un péptido que tiene una secuencia de aminoácido compuesto por 8 o más restos de aminoácidos contiguos de la SEC ID n.º 1, c) un análogo de péptido que tiene una secuencia de aminoácidos compuesto por la SEC ID n.º 1 que incluye una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras y en el que la mayoría de los residuos del análogo son idénticos a los de la secuencia de SEC ID n.º 1, y d) un péptido análogo que tiene una secuencia de aminoácido compuesto por 8 o más restos de aminoácidos contiguos de la SEC ID n.º 1 que incluye una u más sustituciones de aminoácidos conservadoras y en el que la mayoría de los residuos del análogo son idénticos a los de la secuencia de los 8 o más restos de aminoácidos contiguos de la SEC ID n.º 1, para su uso en el tratamiento de una infección por arenavirus.

Description

Procedimiento de prevención de la fusión virus célula inhibiendo la función de la región de iniciación de fusión en virus de ARN que tienen proteínas de envoltura fusogénicas de membrana de clase I
Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de Estados Unidos número 60/517181 presentada el 4 de noviembre de 2003.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a péptidos para su uso en la prevención o inhibición de la infección vírica por un arenavirus de una célula (previniendo de este modo la liberación del genoma vírico dentro del citoplasma celular, etapa requerida para la infección vírica). La presente invención proporciona composiciones y usos de las mismas para prevenir la infección por un arenavirus interfiriendo con su región de iniciación de fusión (FIR, por sus siglas en inglés).
Introducción
Todos los virus deben unirse a sus células diana e invadirlas para replicarse. Para los virus animales con envoltura, incluyendo virus de ARN que tienen proteínas de fusión de membrana de clase I (virus de tipo I), el proceso implica: a) unión del virión a la célula diana, b) fusión de la envoltura del virus con la membrana plasmática o con una membrana celular interna, c) desestabilización de la envoltura vírica y de la membrana celular en el área de fusión para crear un poro de fusión, d) transferencia del ARN vírico a través del poro y e) modificación de la función celular por el ARN vírico.
La fusión de la membrana vírica y de la envuelta celular, etapas b) y c) anteriores, está mediada por la interacción de una glucoproteína transmembrana vírica (proteína de fusión) con las proteínas de superficie y las membranas de la célula diana. Estas interacciones causan cambios conformacionales en la proteína de fusión que dan lugar a la inserción de un péptido de fusión vírico en la membrana de la célula diana. Esta inserción va seguida de cambios conformacionales adicionales dentro de la proteína de fusión que acercan la envoltura vírica y las membranas celulares y dan lugar a la fusión de las dos bicapas de la membrana.
Un virus es incapaz de extenderse y propagarse dentro de su huésped si se interrumpe este proceso de fusión. Puede lograrse la interrupción intencionada de este proceso de fusión dirigiendo péptidos y homólogos que mimetizan a péptidos hacia secuencias de la proteína de fusión, anticuerpos que reconocen la proteína de fusión y otros factores que actúan frente a la proteína de fusión.
Antecedentes de la invención
Similitudes estructurales entre las proteínas de fusión de los virus de ARN de clase I.
La hemaglutinina 2 (HA2) del virus de la gripe, un ortomixovirus, es el prototipo de proteína de fusión de los virus de ARN de clase I y contiene un dominio hidrófobo amino terminal denominado como péptido de fusión, que se expone durante la escisión de la proteína precursora de la hemaglutinina. Las proteínas de fusión de membrana de los virus de ARN de diversas familias, como arenavirus, coronavirus, filovirus, ortomixovirus, paramixovirus y retrovirus, comparten algunas características estructurales comunes con HA2 y se ha denominado proteínas de fusión vírica de clase I. Se ha observado que la proteína de fusión del VIH-1, la glucoproteína de transmembrana y otras proteínas de transmembrana retrovíricas, como las de ortomixovirus y paramixovirus, poseen un dominio de péptido de fusión hidrófobo expuesto durante la escisión de un precursor (gp160) (Gallaher, 1987; Gonzalez-Scarano y col., 1987). En base a estas similitudes y a algoritmos informáticos que predicen la configuración de las proteínas, se ha sugerido (Gallaher y col., 1989) que la porción externa (ectodominio, extremo amino terminal) de la proteína de transmembrana del VIH-1 y las proteínas de transmembrana de otros retrovirus, pueden coincidir todas ellas con el esqueleto de la estructura de HA2 como se determina mediante cristalografía de rayos X (Wilson, Skehal y Wiley, 1981).
En base a estas observaciones, se ha previsto que las proteínas de transmembrana retrovíricas contienen varías características estructurales además del péptido de fusión en común con la estructura conocida de HA2, que incluyen una hélice en el extremo amino terminal extendida (hélice N normalmente una "héptada repetida" o "cremallera de leucina"), una hélice en el extremo carboxilo terminal (hélice C) y un motivo aromático próximo al dominio de transmembrana. La presencia de al menos cuatro de estos cinco dominios define a una proteína de la envoltura vírica como una proteína de fusión de clase I. Este modelo de proteína de transmembrana retrovírica se confirmó mediante determinaciones estructurales y análisis mutacional posteriores (Chan y col., 1997; Kowalski y col., 1991; Weissenhorn y col., 1997). Los motivos estructurales comunes están presentes no solo en las proteínasde fusión de ortomixovirus y retrovirus sino también en las de paramixovirus, filovirus (como el virus del Ébola, EboV) (Gallaher, 1996) y arenavirus (Gallaher, DiSimone y Buchmeier, 2001). El modelo estructural de Gallaher de la proteína de fusión de EboV (GP2) también se ha confirmado mediante procedimientos de cristalografía de rayos X (Malashkevich y col., 1999; Weissenhorn y col., 1998).
En la figura 1 se muestran los cinco dominios descritos previamente de las proteínas de fusión de las seis familias de virus de tipo 1. Las proteínas de fusión se originan en un péptido de fusión hidrófobo, terminan en un péptido de anclaje e incorporan una hélice alfa en el extremo aminoterminal extendida (hélice N, normalmente una “héptada repetida" o una “cremallera de leucina”), una hélice alfa en el extremo carboxilo terminal (hélice C) (Carr y Kim, 1993; Suarez y col., 2000; Wilson, Skehel y Wiley, 1981) y algunas veces un motivo aromático próximo a la envoltura del virión. También se muestra el sexto dominio, la región de iniciación de fusión (FIR), descrita por los presentes inventores.
Inhibición de la fusión en virus de tipo I
Los intentos previos de los presentes inventores (Garry) y otros laboratorios para diseñar péptidos y miméticos de péptido, anticuerpos y otros factores que inhiban la fusión en los virus de tipo I se han centrado en el péptido de fusión, la hélice N y la hélice C de las proteínas de fusión. En el caso de los péptidos de fusión, se ha encontrado que análogos de los dominios de péptidos de fusión de ortomixovirus y paramixovirus (Richardson, Scheid y Choppin, 1980) y VIH-1 (Gallaher y col., 1992; Owens y col., 1990; Silburn y col., 1998) bloquean la infección vírica, presumiblemente formando heteroagregados inactivos. También se ha encontrado que los péptidos correspondientes a las porciones de la hélice N y la hélice C son eficaces inhibiendo la infección vírica tanto in vitro como in vivo. Por ejemplo, un péptido de 17 aminoácidos correspondiente a la porción carboxilo terminal de la hélice N de la proteína de fusión de VIH-1, definida como la región CS3, bloqueaba la infección por VIH (Qureshi y col., 1990). Además, se ha desarrollado otros péptidos inhibidores de la hélice N y la hélice C en base al modelo estructural de la proteína de fusión (Wild, Greenwell y Matthews, 1993; Wild y col., 1992), incluyendo el fármaco peptídico anti-hélice C del VIH-1 DP178 (T-20 o FUZEON®). DP178 se solapa con la hélice C y el dominio proximal aromático de anclaje, e inhibe la fusión virión VIH-1: célula a concentraciones muy bajas (inhibición del 50 % a 1,7 nM) alcanzables in vivo tras la inyección. En un ensayo clínico, 100 mg/día de DP178 producían una reducción de aproximadamente 100 veces de la carga de VIH-1 en el plasma de los individuos infectados (Kilby y col., 1998). Este resultado ha motivado en gran medida la búsqueda de otros péptidos inhibidores de VIH-1 en base a la estructura de la proteína de transmembrana (Pozniak, 2001; Sodroski, 1999). También se ha demostrado que inhibidores peptídicos de paramixovirus inhiben la replicación vírica (Lambert y col., 1996, Young y col., 1999). Los estudios realizados por Watanabe y colaboradores sugieren que una estrategia similar dirigida hacia la hélice N y la hélice C de GP2 de EboV puede también llevar a descubrir inhibidores útiles (Watanabe y col., 2000). También se ha demostrado que los anticuerpos neutralizantes dirigidos frente a dominios de proteínas de fusión inhiben la fusión virión: célula.
Observaciones realizadas en VIH-1
Una gran parte del estudio se ha dedicado a la inhibición de la fusión en el virus de la inmunodeficiencia humana VIH-1, uno de los virus de ARN de tipo I. Bolognesi y col. (documento 5.464.933) y los actuales inventores (Garry, documento USPN 5.567.805) nos muestran cómo puede inhibirse la muerte celular mediada por VIH introduciendo péptidos que se unen a porciones de la proteína de fusión de transmembrana del virión de VIH-1. La región de unión de DP178 de Bolognesi, marcado como FUZEON® en la figura 7, está principalmente dentro de la hélice C y está fuera de lo que en la presente solicitud se describe como la región de iniciación de fusión (FIR). Bolognesi demuestra la inhibición pero no presenta ningún procedimiento de inhibición. Los actuales inventores (Garry) mostraron previamente la inhibición en la región CS3 de TM del VIH-1, marcado como CS3 en la figura 7, pero no identificaron procedimiento de inhibición, lo que sugiere que sólo se inhibe la interacción CS3: receptor de CS3. El descubrimiento inesperado de la región FIR por los actuales inventores (como se describe actualmente en este documento) y el hecho de que las secuencias CS3 estén dentro de FIR indica que la unión CS3: receptor de CS3 descrita en el documento USPN 5.567.805 es de hecho una unión que se produce entre la porción CS3 de la FIR y porciones de la membrana celular por las cuales tiene afinidad la porción CS3 de FIR. Además, aunque Melikyan, Watanabe, Bewley y otros autores han descrito inhibición de la fusión con los péptidos introducidos, no han explicado los mecanismos mediante los cuales se produce la inhibición. Por consiguiente, la localización del péptido FUZEON® está alejado de la región FIR, lo que sugiere con fuerza que funcionan otros elementos del proceso de fusión en la región FUZEON®.
En referencia a lo anterior, está claro que existe la necesidad en la técnica de un medio más eficaz para identificar aquellas regiones de los virus que están implicadas en el proceso de infección y de composiciones eficaces para prevenir o inhibir la infección vírica. La invención descrita y divulgada en este documento proporciona una solución eficaz para estas necesidades.
Sumario de la invención
Según un primer aspecto de la invención, se proporciona un péptido inhibidor de la fusión vírica aislado seleccionado entre el grupo compuesto por:
a) un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos compuesta por la SEC ID n.º 1, b) un péptido que tiene una secuencia de aminoácido compuesta por 8 o más restos de aminoácidos contiguos de la SEC ID n.º 1,
c) un análogo de péptido que tiene una secuencia de aminoácidos compuesta por la SEC ID n.º 1 que incluye una u más sustituciones de aminoácidos conservadoras y en el que la mayoría de los residuos del análogo son idénticos a los de la secuencia de SEC ID n.º 1, y
d) un análogo de péptido que tiene una secuencia de aminoácidos compuesta por 8 o más restos de aminoácidos contiguos de la SEC ID n.º 1 que incluye una u más sustituciones de aminoácidos conservadoras y en el que la mayoría de los residuos del análogo son idénticos a los de la secuencia de los 8 o más restos de aminoácidos contiguos de la SEC ID n.º 1,
para su uso en el tratamiento de una infección por arenavirus.
El péptido puede ser un péptido análogo que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID n.º 30. Estos péptidos pueden incluir un grupo acetilo, un grupo carbobenzoxilo, un grupo dansilo, un grupo t-butiloxicarbonilo, un grupo hidrófobo o un grupo macromolecular en el extremo amino terminal del péptido. Adicionalmente, estos péptidos pueden incluir un grupo amido, un grupo hidrófobo o un grupo macromolecular en el extremo carboxilo terminal del péptido. La infección por arenavirus puede ser una infección por el virus de Lassa.
Según un segundo aspecto de la invención, se proporciona el uso de un péptido como se define en el primer aspecto de la invención para la preparación de un medicamento para tratar una infección por arenavirus en un paciente. La infección por arenavirus puede ser una infección por el virus de Lassa.
Según un tercer aspecto de la invención, se proporciona una molécula de ADN recombinante que permite, o estimula, la producción en un paciente del péptido definido en el primer aspecto anterior para el tratamiento de una infección por arenavirus en un paciente. Este aspecto incluye el uso de una molécula de ADN recombinante que permite, o estimula, la producción en un paciente del péptido definido en el primer aspecto anterior para la preparación de un medicamento para tratar una infección por arenavirus en un paciente.
Según un cuarto aspecto de la invención, se proporciona un agente que inhibe la fusión vírica que comprende un péptido con una secuencia de aminoácidos compuesta por 8 a 50 restos de aminoácidos para su uso en el tratamiento de una infección por arenavirus en el que el péptido comprende una secuencia de aminoácidos de un péptido del primer aspecto anterior. El agente inhibidor de la fusión vírica puede incluir un grupo acetilo, un grupo carbobenzoxilo, un grupo dansilo, un grupo t-butiloxicarbonilo, un grupo hidrófobo o un grupo macromolecular en el extremo amino terminal del mismo. Adicionalmente, el agente inhibidor de la fusión vírica puede incluir un grupo amido, un grupo hidrófobo o un grupo macromolecular en el extremo carboxilo terminal del mismo. Este aspecto incluye el uso de un agente inhibidor de la fusión vírica de este aspecto para la preparación de un medicamento para tratar una infección por arenavirus en un paciente.
Realizaciones ilustrativas de la invención
El sexto dominio de los virus de ARN que tienen proteínas de fusión de membrana de clase I
Los arenavirus, coronavirus, filovirus, ortomixovirus, paramixovirus y retrovirus son las seis familias de virus de ARN actualmente identificados que tienen proteínas de la envoltura de fusión de membrana de clase I. Los actuales inventores (Garry) así como otros investigadores han mostrado previamente que las proteínas de fusión de estos virus de tipo I incorporan cinco motivos conservados o dominios (Carr y Kim, 1993; Gallaher y col., 1989; Suarez y col., 2000; Wilson, Skehel y Wiley, 1981). Estos dominios comprenden un péptido de fusión, una hélice H, una hélice C y un motivo aromático, todos ellos ectodominios, y un péptido de anclaje que es un endodominio.
Usando análisis por ordenador, modelos de estructura secundaria, cálculos de hidrofobicidad interfacial y otras técnicas, los actuales inventores han hecho el sorprendente descubrimiento de un sexto dominio muy conservado que está presente en las proteínas de fusión de una amplia variedad de virus (en este documento se describe este sexto dominio). Los virus que poseen este dominio están incluidos en la lista anterior, aunque no necesariamente se limita a estas seis clases de virus de ARN. Para resaltar la función crítica de este dominio recientemente identificado, que es un ectodominio, el dominio se denomina en este documento como la región de iniciación de la fusión (FIR) de los virus.
Según se usa en este documento, el termino hélice alfa “extendida” se refiere a una hélice alfa que tiene más de cuatro "vueltas de hélice alfa" (especialmente, más de 14 aminoácidos).
En otras realizaciones se proporcionan “factores” que los inventores han encontrado de forma inesperado son eficaces en la prevención e inhibición de la infección vírica y/o de la fusión virus: célula.
Según se usa en este documento, el término “factores" incluye, pero sin limitaciones, péptidos aislados o segmentos peptídicos funcionales (o péptidos análogos de los mismos) de los dominios de la región de iniciación de fusión (FIR) descritos recientemente, péptidos miméticos (“péptido mimético” se refiere a cualquier compuesto o sustancia que podría servir como sustituto de un péptido que interacciona con la FIR, que es cualquier compuesto que mimetiza las propiedades de un segmento funcional de la FIR), anticuerpos específicos para los dominios de FIR funcionales (es decir, anticuerpos idiotipo y antiidiotipo) y otros compuestos moleculares que interfieren con la unión y/o fusión virus: célula.
Según se usa en este documento el término “segmento funcional” o “fragmento funcional” de una región de iniciación de fusión (FIR) se refiere a un fragmento capaz de inhibir la fusión virus: célula, inhibiendo la infectividad vírica, capaz de inducir un anticuerpo capaz de reconoce y unirse específicamente a la FIR y/o interferir con la infección celular mediada por FIR.
Según se usa en este documento, un “análogo de péptido” o “péptido modificado” se define preferiblemente como un péptido de FIR modificado para contener un grupo amino, un grupo acetilo, un grupo hidrófobo (por ejemplo, carbobenzoxilo, dansilo o t-butiloxicarbonilo) y un grupo portador macromolecular (por ejemplo, conjugado lípido, polietilenglicol, un hidrato de carbono o una proteína) en el extremo amino terminal. Una clase adicional de análogos de péptidos de FIR contiene un grupo carboxilo, un grupo amido, un grupo hidrófobo o un grupo portador macromolecular en el extremo carboxilo terminal. Otros análogos de péptidos se definen como péptidos de FIR en los que al menos un enlace que se une a restos aminoacídicos adyacentes es un enlace no peptídico (por ejemplo, un enlace imido, éster, hidrazina, semicarbazoido o azo), un péptido en el que al menos un resto de aminoácido está en configuración de isómero D o un péptido en el que se ha invertido el orden de los aminoácidos. Análogos de péptidos adicionales son péptidos de FIR que comprenden al menos una sustitución de aminoácido en el que un primer resto aminoacídico se sustituye por un segundo resto aminoacídico diferente (la sustitución de aminoácidos puede ser una sustitución conservada o una sustitución no conservada). Según se usa en este documento, dichos análogos de péptido puede comprender secuencias de aminoácidos análogas en las que las secuencias análogas contienen una mayoría de aminoácidos idénticos o químicamente similares en el mismo orden que las secuencias principales.
Según se usa en este documento, el término “región de iniciación de fusión” (FIR) generalmente se refiere a una región de una proteína de fusión vírica implicada en la etapa o etapas iniciales de la infección vírica y/o fusión con una célula huésped.
Según se usa en este documento, el término "péptido mimético" incluye, pero sin limitaciones, compuestos orgánicos u otros compuestos químicos que mimetizan la estructura o función del péptido de FIR. Entre los ejemplos de péptidos miméticos se incluyen, pero sin limitaciones, compuestos orgánicos que comprenden los grupos laterales funcionales de un aminoácido o péptido pero carecen de la estructura carbono/nitrógeno o de enlaces peptídicos. Péptido mimético también se refiere a compuestos que mimetizan la acción de estos grupos laterales funcionales con otros restos.
Otras moléculas, como anticuerpos idiotipo o antiidiotipo o proteínas seleccionadas mediante procedimientos de despliegue de fagos, que es unen a los péptidos, análogos de péptidos o miméticos de péptidos descritos en la presente solicitud también pueden funcionar con inhibidores de la infección vírica y/o fusión virus: célula. La presente invención también contempla plásmidos, o virus recombinantes, u otras moléculas o compuestos que permiten o estimulan al paciente a producir un análogo de los compuestos inhibidores. Por ejemplo, una proteína recombinante, producido en una bacteria, hongo o célula de mamífero genéticamente modificada puede usarse para producir un análogo inmunogénico de la FIR de una proteína de fusión vírica. De forma similar, podría inducirse una respuesta antiidiotipo en el individuo usando una proteína genéticamente modificada que comprende una secuencia que se corresponde con el sitio de unión de un anticuerpo específico de FIR.
Según se usa en este documento, el término “péptido de fusión” preferiblemente se refiere a una secuencia hidrófoba en el extremo amino terminal, o próximo, de una proteína de fusión vírica de clase I (véase, Gallaher y col., 1987; 1992).
Según se usa en este documento el término péptido o análogo de péptido "sustancialmente purificado" se refiere preferiblemente a un péptido o análogo de péptido que está puro a más del 80 %. Más preferiblemente, “sustancialmente purificado” se refiere a un péptido o análogo de péptido que está puro a más de aproximadamente el 90 % o puro a más del 95 %. Más preferiblemente, se refiere a un péptido o análogo de péptido que está puro a más del 96 %, 97 %, 98 % o 99 %. Funcionalmente, “sustancialmente purificado” significa que está libre de contaminantes a un nivel que lo hace adecuado para los fines proporcionados en este documento. Los procedimientos para evaluar la pureza son bien conocidos por los expertos en la materia. Entre los procedimientos adecuados se incluyen, pero sin limitaciones, cromatografía de gas (CG) unida a espectrofotometría de masas, análisis por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y ensayos funcionales en sistemas de cultivo celular en los que, entre otros, se evalúa la citotoxicidad.
Según se usa en este documento el término "análogo estable" se refiere a un péptido que tiene una semivida farmacológicamente activa en sistemas biológicos. Se contemplan semividas biológicas superiores a los 60 minutos.
Según se usa en este documento, el término "derivado peptídico" se refiere a un péptido que tiene aminoácidos 5 sustituidos diferentes a los de la secuencia FIR de una proteína de fusión vírica. En el que las sustituciones no hacen que el péptido sea inútil para la presente invención.
Según diversos aspectos de la presente realización de la invención los péptidos, las secuencias de ácido nucleico aisladas o los anticuerpos pueden producirse por cualquier sistema conocido en la materia, pero sin limitaciones, de
10 síntesis química, procedimientos de ADN recombinante y combinaciones de los mismos.
Según se define en este documento, la presente invención proporciona composiciones y usos para tratar o prevenir la infección por un arenavirus. Un posible mecanismo por el cual la presente invención puede prevenir y/o inhibir la infección es mediante la interferencia con la fusión virus: célula mediada por FIR.
Breve descripción de las figuras
En la figura 1 se muestran los dominios de las proteínas de fusión de un miembro de cada una de estas seis familias víricas (en concreto, arenavirus, coronavirus, filovirus, ortomixovirus, paramixovirus y retrovirus). Los círculos en la
20 figura 1 muestran la localización aproximada de la FIR en cada virus mostrado.
En las figuras 2 a 7 se muestran las secuencias de aminoácidos de estas proteínas de fusión (correspondientes a las SEC ID n.º 16 – 21, respectivamente) y una representación esquemática de su estructura ectópica. Específicamente, se muestran los cinco dominios descritos previamente que constituyen el péptido de fusión, es
25 decir la hélice N, la hélice C, el motivo aromático (si está presente) y el péptido de anclaje. También se identifica el sexto dominio recién descubierto, la región de iniciación de fusión o FIR. Cada FIR se incida con un polígono en las figuras 2 a 7.
El área rodeada con un círculo detrás de las proteínas de fusión en cada una de las figuras 2 – 7 representa la
30 proteína de unión virus: célula (PUVC) principal del virus. La PUVC normalmente interacciona con la porción de la proteína de fusión que está más alejada de la membrana del virus y, por tanto, se muestra en esta posición en las figuras. A diferencia de la proteína de fusión altamente conservada, la PUVC de cada familia de virus es más divergente. Normalmente es la PUVC la que dicta la gama de huéspedes del virus y determina qué tipos de células del huésped son objetivo para la infección. La PUVC actúa en su capacidad para reconocer y unirse con proteínas
35 específicas de la superficie celular. La unión de la PUVC a las proteínas celulares objetivo se produce antes y típicamente es un requisito previo para la fusión virus: célula.
Figura 8: inhibición de la infectividad de los coronavirus mediante péptidos de la región de iniciación de fusión. Entre 50 y 100 UFP de la cepa A59 del virus de la hepatitis de ratón o de la cepa Urbani del coronavirus del SARS se
40 incubaron previamente con o sin el péptido indicado (~ 100 !M) en DMEM sin suero durante 1 h. A continuación, las células se expusieron al inóculo tratado con el péptido o a un control del vehículo (no peptídico). Tras 1 h de adsorción, se retiró el inóculo, las células se lavaron dos veces con tampón fosfato salino 1x y éstas se recubrieron con DMEM que contenía SFT al 10 % y agarosa al 0,5 %. A las 48 horas de la infección, las monocapas infectadas se fijaron y tiñeron con cristal violeta para determinar el número de placas.
45 Figura 9: inhibición de la infectividad del virus de Lassa mediante péptidos de la región de iniciación de fusión. Se incubaron previamente entre 50 y 100 UFC del virus de Lassa con o sin los péptidos indicados (~ 100 !M) en BME sin suero durante 1 h. A continuación, las células se expusieron al inóculo tratado con el péptido o el control del vehículo (sin péptido). Tras 1 h de adsorción, se retiró el inóculo, las células se lavaron dos veces con tampón
50 fosfato salino 1x y éstas se recubrieron con BME que contenía SFT al 5 %, HEPES 10 Mm y agarosa al 0,5 %. Cuatro días después de la infección, se aplicó un segundo recubrimiento que contenía rojo neutro al 5 % y las placas se contaron 24 horas después.
Las seis familias de virus de ARN en las que hoy en día se sabe que tienen proteínas de fusión de membrana de 55 clase I (virus de tipo I) y los miembros representativos de cada familia son los siguientes:
Virus de ARN representativos que tienen proteínas de fusión de membrana de clase I (virus de tipo I)
Familia Virus representativo Mostrado en las figuras
Arenavirus Virus de Lassa Sí Virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) No Virus de Junín No Virus de Machupo No
6 Virus de Guanarito No Virus de Sabia No
Coronavirus Virus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS) Sí Virus de la hepatitis murina (VHM) No Coronavirus bovino No Coronavirus canino No Virus de la peritonitis infecciosa felina No
Filovirus Virus del Ébola Sí Virus de Marburgo No
Ortomixovirus Virus de la gripe A Sí Virus de la gripe B No Virus de la gripe C No
Paramixovirus Virus del sarampión Sí Virus de las paperas No Virus del moquillo No Virus de la enfermedad de Newcastle No
Retrovirus Virus de la inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) Sí Virus de la inmunodeficiencia humana 2 (VIH-2) No Virus linfotrófico de células T humanas 1 (HTLV-1) No Virus linfotrófico de células T humanas 2 (HTLV-2) No Partícula de tipo A intracisternal humana 1 (HIAP-1) No Partícula de tipo A intracisternal humana 2 (HIAP-2) No
Los virus mostrados en las figuras son los siguientes:
Ejemplos de virus de ARN que tienen proteínas de fusión de membrana de clase I (virus de tipo I)
Figura Familia Virus mostrado Proteína mostrada
Figura 2 Arenavirus Virus de Lassa GP2 Figura 3 Coronavirus Virus del SARS S Figura 4 Filovirus Virus del Ébola GP2 Figura 5 Ortomixovirus Virus de la gripe A HA2 Figura 6 Paramixovirus Virus del sarampión F1 Figura 7 Retrovirus VIH-1 TM
Listado de secuencias de los ejemplos de proteínas de fusión de membrana de clase I (virus de tipo I)
GP2 de LASSA (Número de acceso a Genbank: A43492, aminoácidos 257 – 490)
S del SARS (Número de acceso a Genbank: AAQ9406, aminoácidos 864 – 1256) GP2 del ÉBOLA (Número de acceso a Genbank: AAM76034, aminoácidos 502 – 676)
HA2 de la GRIPE (Número de acceso a Genbank: P03437, aminoácidos 346 – 566)
F1 del SARAMPIÓN (Número de acceso a Genbank: VGNZMV, aminoácidos 116 – 553),
15 TM del VIH (Número de acceso a Genbank: AAB50262, aminoácidos 512 – 710)
Procedimiento de identificación de la región FIR
20 Con fines de referencia, se describe el siguiente procedimiento para identificar dentro de las proteínas de fusión de virus un motivo conservado. Un motivo conservado de las regiones FIR de diferentes virus tendrá una estructura y función similares. Adicionalmente, las regiones FIR de los virus relacionados pueden tener, aunque no necesariamente, secuencias primarias de aminoácidos muy similares.
25 Como se describe anteriormente, la presente invención proporciona composiciones útiles para prevenir o inhibir la infección vírica por arenavirus usando péptidos, anticuerpos y ácidos nucleicos aislados dirigidos frente a la FIR específica de arenavirus y que interfieren con la función de dicha FIR.
La FIR de una proteína de función vírica puede identificarse mediante un procedimiento como el siguiente que comprende las siguientes etapas:
1) La secuencia de la proteína de fusión se hace coincidir primero con la estructura de la proteína de fusión de transmembrana de VIH, que comprende la hélice N, la hélice C y otros dominios previamente descritos, para identificar la hélice N y la hélice C en la proteína de fusión en cuestión. Este proceso de coincidencia se facilita mediante la búsqueda de la secuencia primaria de aminoácidos de la proteína para dos o más cisteínas que sean propensas a formar al menos un lazo unido covalentemente, que estará presente en la mayoría de estas secuencias, pero no en todas. A continuación la hélice N puede identificarse en la región que precede a este lazo de cisteína examinado en dicha región la presencia de aminoácidos cargados y de otros aminoácidos que tienen la propensión a formar una hélice alfa (por ejemplo, glutamina (Q), alanina (A), triptófano (W), lisina (K) y leucina (L)).
2) A continuación, se identifica el extremo amino terminal de la FIR en la hélice N. Este extremo normalmente estará dentro de los 10 a 20 aminoácidos finales de la hélice N y tendrá un núcleo compuesto típicamente por tres o cuatro aminoácidos hidrófobos (como leucina (L) o alanina (A)), un aminoácido cargado positivamente (como lisina (K) o arginina (R)), un aminoácido cargado negativamente (como glutamato (E)) y un aminoácido aromático (como tirosina (Y)).
3) A continuación se identifica el extremo carboxilo terminal de la FIR. En el caso de todas las familias, excepto los coronavirus y los paramixovirus, este extremo terminal es el extremo carboxilo terminal de la primera secuencia peptídica con hidrofobicidad interfacial positiva que se encuentra más allá de la hélice N. Este extremo terminal se localiza normalmente más allá del lazo de cisteína, si este último está presente y, en ocasiones, solapa con la hélice C o está colocado en la hélice C. Las secuencias de hidrofobicidad interfacial positiva tienen un alto porcentaje de aminoácidos aromáticos (como triptófano (W), fenilalanina (F) y tirosina (Y)) y de aminoácidos hidrófobos pequeños (como glicina (G)). El grado de hidrofobicidad interfacial de estas secuencias puede determinarse usando la escala de hidrofobicidad interfacial de Wimley-White, preferiblemente con un programa de ordenador como el programa MPEX que incorpora esta escala (la “hidrofobicidad interfacial” es una medida de la capacidad del péptido para transferirse de una solución acuosa a la interfaz de la bicapa de la membrana y se basa en la escala hidrofobicidad del residuo completo de Wimley-White determinada experimentalmente (Jaysinghe, Hristova y White, 2000)). Los programas de ordenador que usan esta escala pueden identificar una secuencia peptídica de una cadena peptídica que tiene puntuaciones de hidrofobicidad interfacial positivas y, por tanto, el que se asocia con mayor probabilidad a la superficie de las membranas). Véase el ejemplo 1 como ejemplo de la aplicación de este procedimiento a laidentificación de la FIR en el virus del Ébola.
En el caso de los coronavirus, que tienen hélices alfa más largas y una escala generalmente mayor y de los paramixovirus en los que la FIR es discontinua debido a una inserción de secuencia no FIR, el extremo carboxilo terminal de la FIR es el extremo carboxilo terminal de la segunda secuencia peptídica con hidrofobicidad interfacial positiva que se encuentra más allá de la hélice N. La secuencia entre la hélice N y la hélice C en la proteína F1 de los paramixovirus es más larga que las secuencias interhelicoidales de otros virus con proteínas de fusión vírica de clase I. La proteína F2 de los paramixovirus, que cumple una función de unión al receptor es, por consiguiente, más corta. Tras la inspección de modelos de ordenador, es obvio para los expertos en la materia que la proteína F1 contiene una secuencia insertada entre la hélice N y la hélice C. Por consiguiente, la FIR de paramixovirus contiene dos lazos de cisteína y dos secuencias de alta hidrofobicidad interfacial, y es discontinua debido a aminoácidos adicionales que son característicos sólo de los paramixovirus y aparecen entre la hélice N y la primera secuencia de hidrofobicidad interfacial alta está excluida de la región FIR.
SECUENCIAS FIR
La secuencia de la proteína de fusión y de FIR para cada uno de los seis virus representativos mostrados en las figuras 2 a 7 se recoge en la figura respectiva y en el listado de secuencias proporcionado a continuación (Las SEC ID n.º 16 a SEC ID n.º 21 proporcionan las respectivas proteínas de fusión y las SEC ID n.º 1 a SEC ID n.º 7 proporcionan las respectivas FIR). Aunque existen algunas variaciones de secuencia menores entre los virus hermanos dentro de cada una de estas seis familias, la FIR de cualquier virus de tipo I puede identificarse fácilmente usando la secuencia representativa proporcionada en la figura apropiada.
Procedimientos de inhibición de la fusión en estos virus
La presente invención proporciona composiciones según se define en las reivindicaciones que inhiben la fusión virus: célula interfiriendo en la función de la FIR. Diversos aspectos de estas realizaciones incluyen dirigirse hacia las regiones FIR con péptidos, anticuerpos y secuencias de ácido nucleico aisladas según se define en este documento para interferir en la fusión virus: célula. En la presente invención los péptidos y los análogos de péptido constan de una secuencia SEC ID n.º 1 u 8 aminoácidos contiguos a estos, y son de esta longitud ya que es necesario proporcionan una inhibición eficaz de la infección vírica por arenavirus. Según se usa en este documento, el término "de una longitud necesaria para proporcionar una inhibición eficaz" del virus se refiere preferiblemente a una longitud suficiente para proporcionar una reducción de 5 veces o superior en la infectividad vírica cuando se usa según la presente invención. Los procedimientos para cuantificar la reducción de la infectividad vírica son bien conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, las reducciones de la actividad vírica pueden determinarse mediante reducción de placa, inhibición de la unión, ensayos de reducción del valor o mediante estudios de estimulación en animales.
5 Los péptidos de FIR de la SEC ID n.º 1, péptidos de secuencias análogas de la SEC ID n.º 1 o fragmentos de la misma, contempladas como parte de la presente invención son como se define en las reivindicaciones. Las secuencias siguientes se muestras a fines de comparación con la SEC ID n.º 1.
LASSA
X-LIMKNHLRDIMGIPYCNYSRYWYLNHTSTGKTLPRCWLI-Z (SEC ID n.º 1)
SARS 15
ÉBOLA X-LRTFSILNRKAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCI-Z (SEC ID n.º 3) GRIPE X-IQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLF-Z (SEC ID n.º 4) SARAMPIÓN
(“---“ indica que la FIR del virus del sarampión es discontinua). VIH
35 En cada una de las secuencias anteriores la "X" y la "Z" designan respectivamente los extremos amino o carboxilo terminales del péptido o un resto adicional, como se describe a continuación.
Los péptidos de la SEC ID n.º 1 proporcionados por la presente invención tienen la secuencia de una región FIR. La región FIR es de un virus que pertenece a la familia vírica de los arenavirus en la que se incluyen el virus de Lassa, el virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), el virus de Junín, el virus de Machupo, el virus de Guanarito y el virus de Sabia.
Otros aspectos de esta realización de la invención es proporcionar la secuencia SEC ID n.º 30 que comprende un
45 fragmento funcional de una secuencia FIR o secuencias análogas a la misma en un virus que pertenece a la familia vírica de los arenavirus en la que se incluyen el virus de Lassa, el virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), el virus de Junín, el virus de Machupo, el virus de Guanarito y el virus de Sabia.
Los péptidos derivados pueden comprender secuencias alteradas en las que restos de aminoácidos funcionalmente equivalentes se sustituyen por restos dentro de la secuencia lo que tiene como resultado un cambio sinónimo. Por ejemplo, pueden sustituirse en la secuencia uno o más restos de aminoácidos por cualquier otro aminoácido de polaridad similar, que actúan como equivalente funcional, dando lugar a una alteración sinónima (por ejemplo sustitución de leucina por isoleucina). Los sustitutos para un aminoácido de la secuencia pueden seleccionarse entre otros miembros de la clase de aminoácidos a la que pertenece. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) son alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Entre los aminoácidos polares neutros se incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparragina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) son arginina, lisina e histidina. Entre los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) se incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. A modo de ejemplo adicional, y no como limitación, estos péptidos pueden también comprender aminoácidos D y/o pueden comprender una proteína portadora no eficaz o ninguna clase de proteína portadora.
Los péptidos FIR pueden comprender péptidos en los que “X” comprende un grupo amino, un grupo acetilo, un grupo hidrófobo o un grupo portador macromolecular y/o “Z” comprende un grupo carboxilo, un grupo amido, un grupo hidrófobo un grupo portador macromolecular. El resto "X" también puede seleccionarse entre el grupo compuesto por un resto hidrófobo, un resto carbobenzoxilo, un resto dansilo y un resto t-butiloxicarbonilo. El resto "Z" puede seleccionarse entre el grupo compuestos por un resto hidrófobo y un resto t-butiloxicarbonilo.
El resto “X” puede comprender un grupo portador macromolecular. Este grupo portador macromolecular puede seleccionarse entre el grupo compuesto, pero sin limitaciones, por un conjugado lipídico, un resto de polietilenglicol o un resto de hidrato de carbono. De forma similar, la “Z” también puede comprender un grupo transportador macromolecular, donde dicho transportador macromolecular se selecciona entre el grupo compuesto por, pero sin limitaciones, un conjugado lipídico, un resto de polietilenglicol o un resto de hidrato de carbono.
Uno o más de los enlaces moleculares que unen restos de aminoácidos adyacentes pueden ser enlaces no peptídicos. Estos enlaces no peptídicos incluyen, pero sin limitaciones, enlaces imido, éster, hidrazina, semicarbazoido y azo.
El péptido puede comprender uno o más restos de aminoácidos que estén en un aminoácido isómero D.
Los péptidos pueden comprender una o más sustituciones de aminoácidos en las que un primer resto de aminoácido se sustituye por un segundo resto de aminoácido diferente en las secuencias proporcionadas anteriormente (o un segmento funcional de las mismas). En diversos aspectos de esta realización, la sustitución de aminoácido es una sustitución conservadora. En otros aspectos de esta realización, la sustitución de aminoácido es una sustitución no conservadora. Aún en otros aspectos de este realización de la invención se proporcionan péptidos como se describe anteriormente excepto porque se han eliminado uno o más restos de aminoácidos.
En diversos aspectos preferidos de las actuales realizaciones, los péptidos FIR de la invención comprenden al menos 8 restos contiguos de una FIR. Según se usa en este documento, el término “péptidos inhibidores de FIR" se refiere preferiblemente a un péptido o péptidos que tienen la secuencia de una FIR (o segmento funcional de la misma) y a dichos péptidos FIR o segmentos funcionales en los que uno o más aminoácidos están sustituidos por aminoácidos funcionalmente equivalentes o químicamente similares (véase a continuación). También se refiere a derivados de estos péptidos incluyendo pero sin limitaciones, derivados benzilados, derivados glucosilados y péptidos que incluyen enantiómeros de aminoácidos naturales. En un aspecto preferido de esta realización, los péptidos tienen la secuencia de SEC ID n.º 30.
Aún en otros aspectos de esta realización de la invención, los péptidos FIR pueden estar unidos a una molécula transportadora como una proteína incluyendo, pero sin limitaciones, albúmina de suero humano (HSA).
Además, la presente invención contempla moléculas que comprenden cualquier combinación de los restos X y Z y/o las modificaciones de otros péptidos descritas anteriormente.
Los péptidos según la presente invención pueden producirse a partir de proteínas víricas naturales o recombinantes. También pueden producirse usando técnicas convencionales de ADN recombinante (por ejemplo, la expresión del péptido mediante un microorganismo que contiene la molécula de ácido nucleico recombinante que codifica el péptido deseado, expresada bajo el control de un promotor transcripcional adecuado y la recogida del péptido deseado a partir de dicho microorganismo). En un aspecto preferido de la invención, puede prepararse cualquiera de los péptidos de la invención usando cualquier metodología de síntesis química conocida en la materia incluyendo, pero sin limitaciones, la síntesis en fase sólida de Merrifield (Clark-Lewis y col., 1986, Science 231: 134 – 139).
Las realizaciones de la presente invención también proporcionan anticuerpos útiles para tratar o prevenir la infección de una célula por un virus. Los anticuerpos incluyen fragmentos activos de los mismos, lo que significa porciones de anticuerpos capaces de reconocer específicamente una región FIR o un segmento funcional de la misma. Los anticuerpos reconocen específicamente una FIR, o fragmento antigénico de la misma, para prevenir o reducir la infección de la célula por el virus. Los anticuerpos según estas realizaciones de la invención pueden ser monoclonales o policlonales.
Los procedimientos generales para producir anticuerpos son bien conocidos por los expertos en la materia. Los procedimientos para producir anticuerpos según la presente invención comprenden las etapas de (i) proporcionar un antígeno que comprende una FIR o un fragmento antigénico de la misma (este antígeno puede ser un péptido no modificado, un péptido análogo o un derivado de péptido); (ii) exponer el sistema inmunitario de un animal al antígeno de modo que se induzca una respuesta inmunitaria, (iii) recoger los anticuerpos del animal e identificar aquellos anticuerpos que reconocen específicamente una FIR (o fragmento funcional de la misma) y/o son capaces de inhibir o reducir la infección virus: célula en forma de respuesta a dosis en ensayos en los que se mide la infectividad vírica.
Según diversos aspectos de la presente invención, los péptidos y/o anticuerpos de la presente invención útiles para tratar o prevenir la infección vírica de una célula pueden estar dirigidos frente a los aminoácidos de alrededor o del interior del lazo de cisteínas de FIR, la porción distal de la hélice N de FIR, cualquiera de las regiones de hidrofobicidad interfacial de la FIR, otras áreas de la FIR o cualquier combinación de las mismas. Estos anticuerpos, péptidos o análogos de péptidos (colectivamente compuestos) pueden usarse individualmente; de forma alternativa pueden usarse combinaciones de dos o más para prevenir o inhibir la infección de la célula por el virus. Entre los procedimientos para prevenir o inhibir la infección vírica de la célula interfiriendo con la función de las FIR proporcionada en la presente invención también se incluye el uso de anticuerpos neutralizantes, producidos exógena
o endógenamente, frente a toda o partes de la región FIR. El objetivo de este uso es interferir con la función de la FIR, inhibiendo así la infección vírica de la célula y/o la fusión virus: membrana celular.
Otras realizaciones de la presente invención proporcionan composiciones, incluyendo composiciones farmacéuticas que comprenden alguno y todos los péptidos (incluyendo análogos o anticuerpos). Esto incluye, pero sin limitaciones, composiciones que contienen cualquier molécula que comprende, esencialmente consta o consta de una FIR de SEC ID n.º 1 o un segmento funcional de una FIR. Esto incluye además, pero sin limitaciones, composiciones que comprenden cualquier compuesto que específicamente reconoce, se une o interfiere con la función de una FIR vírica. Según se usa en este documento, la frase “que interfiere con la función de la FIR” significa que un compuesto interacciona con la FIR o con la proteína celular que sirve como el receptor que reconoce la FIR, de modo que previene o reduce la infección de la célula por el virus. Adicionalmente, se contempla que las composiciones puedan comprender cualquiera de las moléculas descritas o mezclas de una o más de estas moléculas.
Realizaciones adicionales de la presente invención proporcionan usos de compuestos de la invención para tratar o prevenir la infección de una célula por un arenavirus. Diversos aspectos de esta realización de la invención proporcionan una cantidad eficaz de cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en este documento para su uso en la administración a un paciente que se sospecha ha estado expuesto a un arenavirus (o que tiene la posibilidad de verse expuesto a un arenavirus). En diversos aspectos de la invención, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo que reconoce específicamente y se une a un péptido de FIR de SEC ID n.º 1 (o un segmento funcional de una FIR) o un fragmento de dicho anticuerpo que reconoce específicamente y se une a una FIR, o a un segmento funcional de una FIR.
Aún otros aspectos de esta realización de la invención como se define en las reivindicaciones proporcionan una cantidad eficaz de una composiciones que comprende al menos una molécula de ADN recombinantes, en la que el ADN codifica una FIR de SEC ID n.º 1 (o un segmento funcional de la misma) de modo que se previene o reduce la infección por un arenavirus. En un aspecto preferido de esta realización la molécula de ADN recombinante y/o la composición farmacéutica demás comprenden los elementos necesarios para que la proteína codificado por la molécula de ADN se exprese en una célula humana. A modo de ejemplo no exclusivo, en determinados aspectos de esta realización de la invención, la molécula de ADN es parte de un plásmido recombinante o de un virus recombinante.
Ejemplos
Ejemplo 1: Identificación de la FIR en el virus del Ébola
El procedimiento para identificar la FIR de las proteínas de fusión vírica de clase I puede ilustrarse mediante dos ejemplos. El primer ejemplo es la identificación de la FIR en la proteína de fusión de clase I mínima glucoproteína 2(GP2) del virus del Ébola, un filovirus. Los límites de la hélice N y de la hélice C de la GP2 del virus del Ébola se han determinado mediante procedimientos de cristalografía de rayos X (Malashkevich y col., 1999). Los aminoácidos terminales de la hélice N contienen la secuencia ILNRKAIDF (SEC ID n.º 8) que coincide con la secuencia consenso de un núcleo que comprende tres o cuatro aminoácidos hidrófobos, un aminoácido cargado positivamente, un aminoácido cargado negativamente y un aminoácido aromático. Entre estas dos hélices hay dos cisteínas en lasecuencia CHILGPDC (SEC ID n.º 9). Definiendo los extremos de la FIR de la GP2 del virus del Ébola está la secuencia FLLQRWGGTCHILGPDCCI (SEC ID n.º 10), que tiene una puntuación de hidrofobicidad interfacial de Wimley-White de 2,59 según se determina por el programa MPEX (Jaysinghe y col., 2002). Por tanto, la FIR de laGP2 del virus del Ébola abarca los aminoácidos 579 a 610.
Ejemplo 2: Identificación de la FIR en el virus del sarampión
El ejemplo segundo es una proteína de fusión de clase I compleja, la proteína F1 del virus del sarampión, un paramixovirus. Las hélices N y C de F1 del virus del sarampión pueden identificarse examinando la secuencia primaria en busca de aminoácidos con propensión a formar hélices. El alineamiento de la secuencia principal de F1 del virus del sarampión con la secuencia primaria de aminoácidos de la proteína F1 de otro paramixovirus, F1 del virus de la enfermedad de Newcastle, también puede ayudar a la identificación de los límites de la hélice. La estructura de la proteína F1 del virus de la enfermedad de Newcastle se ha determinado mediante procedimientos de cristalografía de rayos X (Chen y col., 2001). Por tanto, puede predecirse que límites de las hélices H y C son losaminoácidos 131 – 217 y 455 – 491, respectivamente. Al contrario que la GP2 del virus del Ébola y la mayoría de las proteínas de fusión víricas de clase I, la secuencia primaria entre las hélices N y C en el virus del sarampión es mayor de 100 aminoácidos. La región FIR de la F1 del virus del sarampión contiene una inserción que, tras la inspección de modelos de ordenador, es obvia para los expertos en la materia y, por tanto, la estructura de la región FIR está formada por un ordenamiento secundario que une dos partes de la secuencia primaria. La secuencia insertada forma un lazo externo a la FIR. Los aminoácidos terminales de la hélice N contienen la secuencia LKLLRYYTE (SEC ID n.º 11) que coincide con la secuencia consenso de un núcleo que comprende tres o cuatro aminoácidos hidrófobos, un aminoácido cargado positivamente, un aminoácido cargado negativamente y un aminoácido aromático. En la F1 del virus del sarampión hay ocho restos de cisteína entre las hélices N y C. En base al alineamiento con F1 del virus de la enfermedad de Newcastle, puede determinarse que las primeras dos cisteínas y las dos siguientes forman lazos unidos mediante puentes disulfuro. El primer par de cisteínas en la secuencia, CTFNIPEGTVC (SEC ID n.º 12), es parte de la FIR ya que está unido mediante una secuencia WYTTVPKYVATQGYLISNF (SEC ID n.º 13) con una puntación de hidrofobicidad interfacial de Wimley-White de 3,36 según se determina mediante el programa MPEX. El segundo par de cisteínas en la secuencia, CLRGSTKSC (SEC ID n.º 14), también es parte de la FIR ya que es adyacente a la secuencia TLVSGSFGNRFILSQGNLIANCASILCKCYTTGTII (SEC ID n.º 15) con una puntación de hidrofobicidad interfacial de Wimley-White de 2,54 según se determina mediante el programa MPEX. Por tanto, la FIR de la F1 del virus del sarampión abarca de los aminoácidos 205 a 407, representando los aminoácidos 221 a 314 una inserción de no participa en la función de FIR.
Ejemplo 3: Identificación de péptidos inhibidores de la fusión del coronavirus.
Antecedentes
El síndrome respiratorio agudo severo (SARS) es una enfermedad recién reconocida que se extendió desde el sur de China entre finales de 2002 y principio de 2003 a varios países de Asia, Europa y Norteamérica (Guan y col., 2004), el SARS normalmente empieza con fiebre superior a 38 ºC. Entre los síntomas iniciales también pueden incluirse cefalea, malestar general y síntomas respiratorios leves. Entre dos días y una semana, los pacientes con SARS pueden desarrollar tos seca y tener problemas para respirar. Los pacientes en estadios más avanzados del SARS desarrollan neumonía o síndrome de dificultad respiratoria. En el brote inicial se detectaron 8098 casos en todo el mundo, con una mortalidad global del 9,6 %. Se ha demostrado que un coronavirus no identificado previamente (CoV) es la causa de la nueva enfermedad (Poutanen y col., 2003; Peiris y col., 2003; Drosten y col., 2003; Rota y col., 2003; Mara y col., 2003). Las intervenciones en salud pública, como vigilancia, restricciones en los viajes y cuarentenas, contuvieron la propagación original del CoV del SARS en 2003, y de nuevo se detuvo la propagación del SARS tras la aparición de algunos casos nuevos en 2004. Sin embargo, se desconoce si estas medidas draconianas de contención pueden mantenerme en cada aparición del CoV del SARS en humanos. Adicionalmente, es obvio el potencial de este nuevo y, en ocasiones, letal CoV como amenaza bioterrorista.
Los coronavirus son virus de ARN de cadena positiva larga típicamente con una amplia gama de huéspedes. Al igual que otros virus con envuelta, CoV entra en las células diana mediante fusión entre las membranas del virus y las celulares, proceso mediado por la proteína vírica espicular (S). Las proteínas S de CoV, caracterizadas hasta la fecha parecen constar de dos subunidades asociada no covalentemente, S1 y S2. Usando análisis por ordenador, Garry y Gallaher (2003) propusieron por primera vez que la porción de la proteína S de SARS-CoV que se corresponde con la subunidad S2 coincide con el modelo prototípico de una proteína de fusión vírica de clase I en base a la presencia de dos regiones de hélice alfa predichas en las regiones N y C terminales de S2 (hélice N y hélice C) y una región rica en aminoácidos aromáticos justo antes del dominio de anclaje transmembrana.
Materiales y procedimientos
Las células L2 o las células Vero E6 se mantuvieron como monocapas en medio completo de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía HCO3-al 0,15 % suplementado con suero fetal de ternera (SFT) al 10 %, penicilina G (100 U/ml), estreptomicina (100 mg/ml) y L-glutamina 2 mM a 37 ºC en un incubador de CO2 al 5 %. La cepa A59 del virus de la hepatitis murina (VHM), la cepa Urbani o HK del CoV del SARS o HK se propagaron en células L2. Para los ensayos de placa, las células L2 o las células Vero E6 se sembraron a una densidad de 1x106 células en cada pocillo de una placa de 6 pocillos. De 50 a 100 unidades formadora de placa (ufp) de VHM o CoV del SARS se incubaron previamente con o sin 100 µg/ml aproximadamente de péptidos en DMEM sin suero durante 1 h. A continuación, las células se infectaron con inóculo tratado con el péptido o inóculo control del vehículo. Tras 1 h de adsorción, se retiró el inóculo, las células se lavaron dos veces con tampón fosfato salino 1x y se recubrieron con DMEM/SFT al 10 % que contenía agarosa SEAPLAQUE® al 0,5 % (Cambrex Bio Science Rockland, Inc., Rockland, ME). Las monocapas se fijaron con formalina al 3,7 % y se tiñeron con violeta cristal 1X 2 días después de la infección y se determinó el número de placas mediante microscopia óptica.
Resultados y discusión
Los péptidos sintéticos correspondientes a los dominios FIR de la proteína S del VHM o del CoV del SARS se analizaron para comprobar su capacidad para inhibir la infección por estos coronavirus. La capacidad para inhibir la formación de placas en las monocapas de células es la prueba más estricta in vivo de un fármaco inhibidor de la posible infección. Dos péptidos (GNHILSLVQNAPYGLYFIHFSW, SEC ID n.º 22 y GYFVQDDGEWKFTGSSYYY, SEC ID n.º 23) de la FIR del VHM pueden inhibir la formación de placas por VHM, aunque el primer péptido FIR de VHM es más eficaz (véase la figura 8A). Dos péptidos de la FIR del CoV del SARS (GYHLMSFPQAAPHGVVFLHVTY, SEC ID n.º 24 y GVFVFNGTSWFITQRNFFS, SEC ID n.º 25) inhibían la formación de placa por este coronavirus (véase la figura 8B). También se observó una reducción significativa (~ 50 %) en el diámetro medio de las placas residuales. Estos resultados sugieren que esté péptido inhibe tanto la entrada como la propagación del VHM. Se obtuvieron resultados similares con estos péptidos inhibidores en experimentos independientes, con una inhibición de placa del 50 % observada a concentraciones de < 5 µM. Es poco probable que estos resultados se expliquen por los efectos citotóxicos no específicos de los péptidos. Excepto por las placas, las células en las monocapas estaban intactas y eran viables. El número bajo de placas crecidas era similar en tamaño a las placas control. Los péptidos de otras regiones también inhibían la infección por estos virus aunque en menor grado que los péptidos FIR más activos (figura 8). Por ejemplo, los péptidos de la región del péptido de fusión y de la hélice carboxilo terminal (hélice C) de la S de VHM y de la S del CoV del SARS proporcionaban cierta inhibición (péptido de fusión S del VHM = MFPPWSAAAGVPFSLSVQY, SEC ID n.º 26; hélice C de S del VHM = QDAIKKLNESYINLKEVGTYEMYVKW, SEC ID n.º 27; péptido de fusión del CoV del SARS = MYKTPTLKYFGGFNFSQIL, SEC ID n.º 28; hélice C de S del CoV del SARS = AACEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKW, SEC ID n.º 29. Actividades inhibidores en la gama de µM se han notficado recientemente con péptidos de hélice C de coronavirus por Bosch y col., (2003) y otros (Bosch y col., 2004; Lui y col., 2004; Yuan y col., 2004; Zhu y col., 2004)). Sin embargo, no se han notificado péptidos inhibidores de la región FIR de coronavirus. No obstante, a la vista de la presente invención, las referencias actuales de forma colectiva proporcionan apoyo para las enormes ventajas de las invenciones actualmente descritas y reivindicadas. Es decir, estas referencias coinciden con la afirmación de los inventores de que los procedimientos de la presente invención pueden usarse con ventaja para identificar péptidos sintéticos que inhiben la fusión/infectividad por miembros de la familia Coronaviridae.
Ejemplo 4: Identificación de péptidos inhibidores de la fusión de arenavirus.
Antecedentes
La fiebre de Lassa es una enfermedad hemorrágica a menudo mortal denominada así por el pueblo del valle del río Yedseram de Nigeria en el que se describieron los primeros casos ocurridos en 1969 (Buckley y Casals, 1970). Zonas de Guinea, Sierra Leona, Nigeria y Liberia son endémicas para el agente etiológico, el virus de Lassa (LasV). El impacto sobre la salud pública de LasV en las áreas endémicas es inmenso. Los centros para el control y prevención de enfermedades (CDC) han estimado que se producen 100.000 – 300.000 casos de Lassa al año en eloeste de África y 5.000 muertes. En algunas zonas de Sierra Leona, del 10 % – 15 % de todos los pacientes admitidos en los hospitales tienen fiebre de Lassa. Las tasas de letalidad de la fiebre de Lassa típicamente son del 15 % al 20 %, aunque en casos de epidemia la mortalidad total puede ser de hasta el 45 %. La tasa de mortalidad en mujeres durante el último mes de embarazo es siempre alto, ~ 90 %, y la infección por LasV causa tasas altas de muerte fetal en todas las etapas de la gestación. Las tasas de mortalidad por Lassa son más altas en no africanos, lo cual es preocupante ya que Lassa es la fiebre hemorrágica que se exporta con más frecuencia. Debido a la alta tasa de letalidad y a la capacidad para propagarse fácilmente mediante contacto entre humanos, el virus LasV se clasifica como nivel 4 de seguridad biológica y agente de categoría A de bioseguridad NIAID.
LasV es miembro de la familia Arenaviridae. El genoma de los arenavirus consta de dos segmentos de ARN ambisentido de cadena sencilla. Cuando se observan al microscopio electrónico de transmisión, los viriones esféricos con envoltura (diámetro: 110 nm – 130 nm) muestran partículas granulosas que son ribosomas adquiridos de las células huésped (Murphy y Whitfield, 1975). De aquí el uso de la palabra latina "arena" para el nombre de la familia. Además de LasV, otros arenavirus que causan enfermedades en humanos son el virus de Junín (fiebre hemorrágica argentina), virus de Machupo (fiebre hemorrágica boliviana), virus de Guanarito (fiebre hemorrágica venezolana) y virus de Sabia (fiebre hemorrágica brasileña). Los arenavirus son zoonóticos; cada virus se asocia con una especie específica de roedor (Bowen, Peters y Nichol, 1997). El reservorio de LasV es la “rata de múltiples mamas” del género Mastomys (Monath y col., 1974). La amplia distribución de Mastomys en África hace que la erradicación de este reservorio de roedores sea poco práctica y ecológicamente no deseable.
Los signos y síntomas de la fiebre de Lassa, que aparecen 1 – 3 semanas después de la exposición al virus, son altamente variables aunque pueden incluir fiebre, dolor retroesternal, de espalda o abdominal, dolor de garganta, tos, vómitos, diarrea, hiperemia conjuntival e hinchazón facial. LasV infecta a células endoteliales, lo que da lugar a un aumento de la permeabilidad capilar, disminución del volumen circulante eficaz, shock y fallo multiorgánico. La hemorragia externa, normalmente de la mucosa (encías, etc.) tiene lugar en menos de un tercio de los casos, pero confiere un mal diagnóstico. También se han descrito problemas neurológicos, como pérdida de audición, temblores y encefalitis. Los pacientes que sobreviven empiezan la defervescencia 2 – 3 semanas después del inicio de la enfermedad. La complicación más frecuente de la fiebre de Lassa es la sordera. La sordera unilateral o bilateral temporal o permanente se producen en ~ 30 % de los pacientes con fiebre de Lassa durante la convalescencia y no se asocia con la intensidad de la enfermedad aguda. El fármaco antiviral ribavirina es eficaz en el tratamiento de la fiebre de Lassa, aunque sólo si se administra al inicio (antes de 6 días) del transcurso de la enfermedad (Johnson y col., 1987; McCormick y col., 1986). No se sabe si la ribavirina es eficaz frente a otros arenavirus, como los virus de Junín, Machupo, Guanarito o Sabia. Actualmente no ha disponible vacuna para el LasV.
Materiales y procedimientos
Las células Vero se mantuvieron como monocapas en medio basal de Eagle (BME) que contenía HEPES 10mM y SFT al 5 %. El virus de Lassa (cepa Josiah) se propagó en células Vero. Para los ensayos de placa, las células Vero se sembraron a una densidad de 1x106 células en cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Se incubaron previamente de 50 a 100 ufp de LasV con o sin péptido en BME sin suero durante 1 h. A continuación, las células se infectaron con inóculo tratado con el péptido o con inóculo control del vehículo. Tras 1 h de adsorción, se retiró el inóculo, las células se lavaron dos veces con tampón fosfato salino 1x y se recubrieron con 2 ml de agarosa al 0,5 % en BME que contenía HEPES 10 Mm y SFT al 5 %, y se incubaron durante 4 días. Se aplicó un segundo recubrimiento que contenía rojo neutro al 5 % y las placas se contaron 24 h después.
Resultados y discusión
Se comprobó la capacidad de los péptidos sintéticos correspondientes a los dominios FIR de la glucoproteína 2 (GP2) de LasV para inhibir la infección por este arenavirus. Un péptido (NYSKYWYLNHTTTGR, SEC ID n.º 30) análogo a la secuencia NYSRYWYLNHTSTGK de la SEC ID n.º 1 (FIR de LASSA) puede inhibir la formación de placa por LasV (figura 9). Un péptido análogo a otra región de GP2, el péptido de fusión (GTFTWTLSDSEGKDTPGGY, SEC ID n.º 31) también inhibía la infección por LasV, aunque en menor grado (figura 9). No se han notificado péptidos inhibidores de arenavirus. De forma colectiva, estos resultados sugieren que nuestras técnicas pueden identificar péptidos sintéticos que inhiben la fusión/infectividad por miembros de la familia Arenaviridae. Estos resultados, junto con nuestros resultados con péptidos inhibidores de la FIR de coronavirus, establecen la prueba del principio de que los péptidos de las regiones FIR pueden funcionar como inhibidores víricos.
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10 LISTADO DE SECUENCIAS
< 110 > Garry, Jr., Robert F. Wilson, Russell B.
15 < 120 > PROCEDIMIENTO DE PREVENCIÓN DE LA FUSIÓN VIRUS: CÉLULA INHIBIENDO LA FUNCIÓN DE LA REGIÓN DE INICIACIÓN DE FUSIÓN EN VIRUS DE ARN QUE TIENEN PROTEÍNAS DE ENVOLTURA FUSOGÉNICAS DE MEMBRANA DE CLASE I
<
130 > 12920.0013.00PC00 20
< 150 > US 60/517.181
<
151 > 25 <160>31
< 170 > PatentIn versión 3.3
<
210 > 1 30
< 211 > 39
<
212 > PROT 35 < 213 > Secuencia artificial
< 220 >
<
223 > Péptido sintético 40
45 <210>2
<
211 > 100
<
212 > PROT
<
213 > Secuencia artificial
< 220 > 55 < 223 > Péptido sintético
< 400 > 2 20 <210>4
5
< 210 > 3 < 211 > 32
< 212 > PROT
10
< 213 > Secuencia artificial
< 220 >
15
< 223 > Péptido sintético < 400 > 3
<
211 > 43
<
212 > PROT
<
213 > Secuencia artificial
< 220 > 30 < 223 > Péptido sintético
<
400 > 4
<
212 > PROT
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
20
< 210 > 6 < 211 > 94
< 212 > PROT
25
< 213 > Secuencia artificial
< 220 >
30
< 223 > Péptido sintético < 400 > 6
35 <210>7
<
211 > 57
<
212 > PROT
<
213 > Secuencia artificial
<
220 > 10 < 223 > Péptido sintético
15
< 210 > 8
< 211 > 9
20
< 212 > PROT
< 213 > Secuencia artificial
25
< 220 > < 223 > Péptido sintético
< 400 > 8
< 210 > 9
35
< 211 > 8 < 212 > PROT
< 213 > Secuencia artificial
40
< 220 >
< 223 > Péptido sintético
45
< 400 > 9
<
210 > 10 50 <211>19
<
212 > PROT
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Péptido sintético
<
212 > PROT
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Péptido sintético 25 <400>11
<
210 > 12
<
211 > 10
<
212 > PROT 35 < 213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Péptido sintético
<
400 > 12
<
210 > 11 15 <211>9
45 <210>13
<
211 > 19
<
212 > PROT
<
213 > Secuencia artificial
<
220 > 55 < 223 > Péptido sintético
<
400 > 13
<
212 > PROT
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Péptido sintético 15 <400>14
20
< 210 > 15 < 211 > 36
< 212 > PROT
25
< 213 > Secuencia artificial
< 220 >
30
< 223 > Péptido sintético < 400 > 15
35 <210>16
<
211 > 234
<
212 > PROT
<
213 > VIRUS DE LASSA
<
400 > 16
<
212 > PROT
<
213 > VIRUS DEL SARS
<
400 > 17
<
212 > PROT
<
213 > VIRUS DEL ÉBOLA
<
400 > 18
<
212 > PROT
<
213 > VIRUS DE LA GRIPE
<
400 > 19
<
212 > PROT
<
213 > VIRUS DEL SARAMPIÓN
<
400 > 20
<
212 > PROT
<
213 > VIH
< 400 > 21
<
212 > PROT
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Péptido sintético 15 <400>22
< 210 > 23
5
< 211 > 19 < 212 > PROT
< 213 > Secuencia artificial
< 220 >
< 223 > Péptido sintético
15
< 400 > 23
<
211 > 22
<
212 > PROT
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Péptido sintético
<
211 > 19
<
212 > PROT
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Péptido sintético
<
211 > 19
<
212 > PROT
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Péptido sintético
<
211 > 28
<
212 > PROT
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Péptido sintético
35
< 210 > 25 < 211 > 19
< 212 > PROT
< 213 > Secuencia artificial
< 220 >
45
< 223 > Péptido sintético < 400 > 25
15
< 210 > 27 < 211 > 26
< 212 > PROT
< 213 > Secuencia artificial
< 220 >
25
< 223 > Péptido sintético < 400 > 27
<
210 > 29
10
< 210 > 30 < 211 > 15
< 212 > PROT
15
< 213 > Secuencia artificial
< 220 >
20
< 223 > Péptido sintético < 400 > 30
25 <210>31
<
211 > 19
<
212 > PROT
<
213 > Secuencia artificial
< 220 > 35 < 223 > Péptido sintético

Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un péptido inhibidor de la fusión vírica aislado seleccionado entre el grupo compuesto por:
    a) un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos compuesto por la SEC ID n.º 1,
    b) un péptido que tiene una secuencia de aminoácido compuesto por 8 o más restos de aminoácidos contiguos de la SEC ID n.º 1,
    c) un análogo de péptido que tiene una secuencia de aminoácidos compuesto por la SEC ID n.º 1 que incluye una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras y en el que la mayoría de los residuos del análogo son idénticos a los de la secuencia de SEC ID n.º 1, y
    d) un péptido análogo que tiene una secuencia de aminoácido compuesto por 8 o más restos de aminoácidos contiguos de la SEC ID n.º 1 que incluye una u más sustituciones de aminoácidos conservadoras y en el que la mayoría de los residuos del análogo son idénticos a los de la secuencia de los 8 o más restos de aminoácidos contiguos de la SEC ID n.º 1,
    para su uso en el tratamiento de una infección por arenavirus.
  2. 2.
    El péptido de la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento de una infección por arenavirus en el que el péptido es un análogo de péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID n.º 30.
  3. 3.
    Un péptido según se define en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2 para su uso en el tratamiento de una infección por arenavirus que incluye un grupo acetilo, un grupo carbobenzoxilo, un grupo dansilo, un grupo tbutiloxicarbonilo, un grupo hidrófobo o un grupo macromolecular en el extremo amino terminal del péptido.
  4. 4.
    Un péptido según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso en el tratamiento de una infección por arenavirus que incluye un grupo amido, un grupo hidrófobo o un grupo macromolecular en el extremo carboxilo terminal del péptido.
  5. 5.
    El péptido de la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento de una infección por arenavirus en el que la infección por arenavirus es una infección por el virus de Lassa.
  6. 6.
    Uso de un péptido según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la preparación de un medicamento para tratar una infección por arenavirus en un paciente.
  7. 7.
    El uso de la reivindicación 6 en el que la infección por arenavirus es una infección por el virus de Lassa.
  8. 8.
    Una molécula de ADN recombinante que permite o estimula a un paciente a producir el péptido definido en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2 para su uso en el tratamiento de una infección por arenavirus en un paciente.
  9. 9.
    Uso de una molécula de ADN recombinante que permite o estimula a un paciente a producir el péptido definido en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2 para la preparación de un medicamento para tratar una infección por arenavirus en un paciente.
  10. 10.
    Un agente que inhibe la fusión vírica que comprende un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos compuesta por 8 a 50 restos de aminoácidos para su uso en el tratamiento de una infección por arenavirus, en el que el péptido comprende una secuencia de aminoácidos de un péptido de la reivindicación 1 o la reivindicación 2.
  11. 11.
    El agente inhibidor de la fusión vírica según se define en la reivindicación 10 para su uso en el tratamiento de una infección por arenavirus que incluye un grupo acetilo, un grupo carbobenzoxilo, un grupo dansilo, un grupo tbutiloxicarbonilo, un grupo hidrófobo o un grupo macromolecular en el extremo amino terminal del mismo.
  12. 12.
    El agente inhibidor de la fusión vírica según se define en la reivindicación 10 para su uso en el tratamiento de una infección por arenavirus que incluye un grupo amido, un grupo hidrófobo o un grupo macromolecular en el extremo carboxilo terminal del mismo.
  13. 13.
    Uso de un agente inhibidor de la fusión vírica de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 para la preparación de un medicamento para tratar una infección por arenavirus en un paciente.
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