CN101365479A - 呈现非天然表面蛋白的嵌合病毒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了嵌合负链RNA病毒，通过使用本发明的单个嵌合病毒，该RNA病毒使得个体例如鸟类对两种传染性物质产生免疫。特别地，本发明提供了经工程改造以表达融合蛋白并将其结合进病毒颗粒的嵌合流感病毒，该融合蛋白包含传染性物质的蛋白的胞外结构域和流感病毒蛋白的跨膜结构域和胞质结构域。这样的嵌合病毒诱导针对流感病毒和传染性物质的免疫应答。本发明还提供了经工程改造以表达融合蛋白并将其结合进病毒颗粒的嵌合新城疫病毒(NDV)，该融合蛋白包含传染性物质的蛋白的胞外结构域和NDV蛋白的跨膜结构域和胞质结构域。这样的嵌合病毒诱导针对NDV和传染性物质的免疫应答。

Description

呈现非天然表面蛋白的嵌合病毒及其应用
1.发明领域
本发明提供了嵌合负链RNA病毒，通过使用本发明的单个嵌合病毒，该RNA病毒使得个体例如鸟类对两种传染性物质产生免疫。特别地，本发明提供了经工程改造以表达融合蛋白并将其结合进病毒颗粒的嵌合流感病毒，该融合蛋白包含传染性物质的蛋白胞外结构域和流感病毒蛋白的跨膜结构域和胞质结构域。这样的嵌合病毒诱导针对流感病毒和传染性物质的免疫应答。本发明还提供了经工程改造以表达融合蛋白并将其结合进病毒颗粒的嵌合新城疫病毒(NDV)，该融合蛋白包含传染性物质的蛋白的胞外结构域和NDV蛋白的跨膜结构域和胞质结构域。这样的嵌合病毒诱导针对NDV和传染性物质的免疫应答。
2.发明背景
许多DNA病毒已经经过基因工程改造以引导异源蛋白在宿主细胞系统(如牛痘病毒、杆状病毒等)中的表达。最近，在正链RNA病毒(例如脊髓灰质炎病毒)中也取得了类似进展。这些构建体的表达产物，即异源基因产物或表达异源基因产物的嵌合病毒被认为可潜在地用于疫苗制剂(亚基或整个病毒疫苗)。使用病毒如牛痘构建用于疫苗的重组或嵌合病毒的一个缺点是其主要抗原决定簇缺乏变化。病毒株中这种变化的缺乏导致嵌合牛痘疫苗的重复使用受到严格的局限性，因为多次疫苗接种将对该病毒株产生宿主抗性从而使接种的病毒无法感染宿主。因此，用嵌合牛痘接种抗性个体将无法诱导免疫刺激。
相反，负链RNA病毒是构建用作疫苗的嵌合病毒的有吸引力的候选者。负链RNA病毒例如流感病毒是理想的，因为其广泛的遗传变异性可以允许构建疫苗制剂的庞大目录，这些制剂引起免疫刺激的同时不会有产生耐受性的风险。
2.1 负链RNA病毒
含有负链基因组的包膜单链RNA的病毒家族被分为两组：具有非节段基因组的组(副粘病毒科、弹状病毒科)或具有节段基因组的组(正粘病毒科、本雅病毒科和沙粒病毒科)。下文具体说明副粘病毒科和正粘病毒科家族并将其用在本文的实施例中。副粘病毒科家族包括新城疫病毒(NDV)、副流感病毒、仙台病毒、猿猴病毒5和腮腺炎病毒。正粘病毒科家族包括流感病毒、A、B和C型病毒，还有索戈托(Thogoto)和托里(Dhori)病毒，以及传染性鲑鱼贫血病毒。
2.11 流感病毒
流感病毒颗粒包含内部的核糖蛋白核(螺旋核衣壳)和外部的脂蛋白包膜，该核糖蛋白核包含单链RNA基因组，该脂蛋白包膜内衬基质蛋白(M1)。A型流感病毒的节段基因组由8个线性的、负极性的、单链RNA分子组成(C型流感病毒为7个)，这些RNA编码10个多肽，包括：RNA依赖性RNA聚合酶蛋白(PB2，PB1和PA)以及形成核衣壳的核蛋白(NP)；基质膜蛋白(M1，M2)；两个从含脂包膜中伸出的表面糖蛋白：血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)；非结构蛋白(NS1)和核输出蛋白(NEP)。基因组的转录和复制在核中进行，并通过在质膜上出芽来发生装配。在混合感染中病毒可以重排基因。
流感病毒通过HA与细胞膜糖蛋白和糖脂上的唾液酸寡糖的结合作用吸附在细胞上。在病毒颗粒的内吞后，细胞内体中的HA分子发生构象变化，该变化促进膜融合，由此引发病毒的脱壳。核衣壳转移至核，在这里病毒mRNA进行转录。病毒mRNA遵从独特的机制进行转录，其中病毒核酸内切酶将细胞异源性mRNAs的5’末端帽子结构切断，该结构成为通过病毒转录酶进行的病毒RNA模板转录的引物。转录终止于距离模板末端15到22个碱基位点处，在这里低聚(U)序列作为附加多聚(A)序列的信号。然后，病毒RNA的转录物转移至细胞膜，并与新转录的跨膜病毒蛋白结合。然后NA从膜结合糖蛋白的碳水化合物部分切下唾液酸残基，从而引起后代病毒的包囊作用和细胞释放。在8个如此生成的病毒RNA分子中，有6个是直接被翻译成HA、NA、NP蛋白和病毒多聚酶蛋白PB2、PB1及PA的单顺反子信息。其它2个转录物经历剪切，各自生成2个mRNA，它们在不同的阅读框内被翻译生成M1、M2、NS1和NEP。换句话说，8个病毒RNA片段编码10个蛋白：9个结构蛋白和1个非结构蛋白。一有关于流感病毒的基因以及其蛋白产物的总结如下文表1所示。
表1：流感病毒基因组RNA片段和编码功能 a
Figure A200680052285D00121
Figure A200680052285D00131
 
a 改编自R.A.Lamb和P.W.Choppin(1983)，Annual Review ofBiochemistry，第52卷，467-506
b A/PR/8/34株
c 由生化和遗传方法鉴定
d 由核苷酸序列分析和蛋白测序鉴定
流感病毒的致病性由多个病毒和宿主因子调节。在抗病毒感染的宿主因子中，I型干扰素(IFN α/β)系统代表了强大的抗病毒先天防御机制，此机制在真核生物进化中建立地相对较早(Garcia-Sastre，2002，Microbes Infect 4：647-55)。抗病毒IFN α/β系统包括三个主要步骤：(i)检测病毒感染和分泌IFNα/β，(ii)IFN α/β与其受体结合并且转录诱导受IFN α/β刺激的基因，(iii)合成抗病毒蛋白和酶。然而，大多数病毒已经获得了编码IFN α/β拮抗剂分子的特异性遗传信息，这些分子有效地阻断抗病毒IFN α/β系统的一个或多个步骤。流感A型病毒在感染细胞中表达非结构性蛋白，NS1蛋白(下文中将有详细描述)，其可以阻碍细胞的IFN α/β应答。(Garcia-Sastre等，1998，Virology 252：324-30)
2.1.1.1 高致病性禽流感
近些年来，亚洲和欧洲都已报道了高致病性禽流感(HPAI)的爆发(Kawaoka等，2005，Natl.Rev.Microbiol.3：591-600；Koopmans等，2004，Lancet363：587-593)。涉及流感A，H5N1或H7N7病毒亚型的爆发导致家禽的致死性感染，并引起有限数量的人类死亡病例(Tweed等，2004，Emerg.Infec.Dis.10：2196-2199)。近年来，在中国，目前的H5N1型病毒已经在家禽间传播(Chen等，2005，Nature 436：191-192)，虽然候鸟被认为是这些病毒的原始宿主，但被认为，这些病毒从感染的家禽再传染回候鸟导致了这些病毒地理分布的增加。当前，H5N1型病毒已经在亚洲出现，并传播至欧洲和非洲(Enserink，2006，Science，311：932)。在1997年的香港和2003年的荷兰，大规模捕杀受感染家禽已被证明是消除H5N1病毒爆发的成功策略(Lipatov等，2004，J.Virol.78：8951-8959)。由于最近HPAI爆发所造成的人类受害者曾经与受感染家禽有过密切接触，接下来可能通过屠宰来根除家禽中的AIV，从而预防禽流感病毒(AIV)的种间传播。然而，由于经济和可行性方面的原因，单靠捕杀受感染家禽已不再被认为是控制这种疾病的选择方法。此外，考虑到道德及生态方面的原因，捕杀候鸟野禽被认为是不可接受的行为。最近，OIE(世界动物卫生组织)和FAO(联合国粮农组织)建议应当考虑对家禽接种疫苗来控制AIV。此外，据报道，在实地研究中，给鸡注射灭活H5疫苗可以成功的控制该病毒的传播(Ellis等，2004，Avian Pathol.33：405-412)。最近，中国已将疫苗接种纳入作为其AIV控制计划的一部分。
高致病性H5N1病毒株可以在人之间引起传播的可能性被称为全球性的流行病，WHO不愿意评估一旦H5N1病毒与人类形式重组将引起的全球死亡率。因此，明显需要用于控制H5N1在农畜间感染的方法，通过这些农畜到人类的绝大多数传播被认为已经增加。
2.1.2 新城疫病毒
新城疫病毒是含有线性、单链、非片段负义RNA基因组的包膜病毒。该基因组RNA的基因包含顺序为3’-N-P-M-F-HN-L的基因，将在下文详细阐述。该基因组RNA还包含3’端的前导序列。
病毒颗粒的结构元件包括病毒包膜，其是来自细胞质膜的脂双层。糖蛋白，血凝素-神经氨酸酶(HN)从包膜突出，提供血凝素(如受体结合/融合)和神经氨酸酶活性。融合糖蛋白(F)(也与病毒包膜相互作用)，首先生成无活性的前体，然后进行翻译后剪切产生两个二硫键连接的多肽。活性F蛋白通过协助病毒包膜与宿主细胞质膜的融合参与NDV进入宿主细胞的穿透过程。基质蛋白(M)参与病毒的装配，同时它与病毒膜以及核衣壳蛋白之间有相互作用。
核衣壳的主要蛋白质亚单位是核衣壳蛋白(N)，其赋于衣壳螺旋对称性。与核衣壳相关的是P和L蛋白。受磷酸化作用支配的磷蛋白(P)被认为在转录过程中起调控作用，且可能参与甲基化、磷酸化和多腺苷酸化。L基因编码RNA依赖性RNA聚合酶，在病毒RNA合成中，它和P蛋白都是必需的。L蛋白占据了将近一半的病毒基因组编码容量，它是最大的病毒蛋白，在转录和复制中起重要作用。
包括NDV在内的所有负链RNA病毒的复制由于缺乏复制RNA所需的细胞结构而变得复杂。另外，负链RNA基因组不能被直接翻译成蛋白质，而必须首先被转录成正链(mRNA)拷贝。因此，在进入宿主细胞后，病毒不能合成所需的RNA依赖性RNA聚合酶。L、P和N蛋白必须与基因组一起通过感染进入细胞。
据假设，转录NDV mRNA的大多数或全部的病毒蛋白同样进行其复制。调控蛋白的相同补体的不同作用(即转录或复制)的机制还未被清楚阐明，但是似乎涉及游离形式的一个或多个核衣壳蛋白的丰度，特别是N。在病毒穿透之后，L蛋白以核衣壳中的负义RNA为模板直接启动转录。病毒RNA合成也被调控，由此在转录过程中产生单顺反子mRNA。
转录后，病毒基因组的复制是负链RNA病毒感染的第二个必要步骤。与其它负链RNA病毒一样，新城疫病毒(NDV)的病毒基因组复制也是由病毒特异性蛋白介导的。复制型RNA合成的最初产物是NDV基因组RNA的互补拷贝(即，正-极性)(cRNA)。这些正链的拷贝(反基因组)与正链mRNA转录物的末端结构不同。与mRNA转录物不同，反基因组cRNA的5’末端没有帽子结构且未被甲基化，3’末端没有被截断且未被多(聚)腺苷酸化。cRNA与它们的负链模板具有共同末端，并且以互补形式包含每一个基因组RNA片段中全部的遗传信息。cRNA作为NDV负链病毒基因组(vRNA)合成的模板。
NDV负链基因组(vRNA)和互补基因组(cRNA)均被核衣壳蛋白包裹(encapsidated)；唯一未被包裹的RNA种类是病毒mRNA。对于NDV，胞质是病毒RNA复制的场所，正如它也是转录的场所一样。病毒各组分的装配似乎发生在宿主细胞的质膜，成熟病毒通过出芽方式进行释放。
2.2 免疫原性制剂
重组DNA技术和“反向遗传学”工程技术提供了制备用于免疫原性制剂的重组病毒的独特方法。特别地，本发明提供了构建负链RNA病毒使其不仅表达或显示天然病毒抗原，而且表达或显示任何被设计结合进病毒蛋白包被的抗原的方法。尤其感兴趣的是，来自除流感外的传染性生物体的抗原。以这种方式，单个病毒可被工程改造为可用于激活或引起免疫应答的免疫原性化合物，这将可以提供抗至少两种病原体的保护。必要时可进一步工程改造这样的嵌合病毒来调节它们的毒性，即由此减轻或进一步减轻它们的毒性。减弱的流感病毒是有益的，因为它们可以是免疫原性的并且可以复制，但它们不具有致病性。
活疫苗被认为可引起改良的、可交叉反应的、细胞介导的细胞毒性以及体液抗体反应，比灭活的疫苗提供更好的保护(Gorse和Belshe，1990，J.Clin.Microbiol.28：2539-2550；Gorse等，1995，J.Infect.Dis.172：1-10)。第二，对病毒病的保护性免疫可能涉及粘膜的IgA反应，用传统的肌注给药方式注射疫苗时未观察到此类情况(Nelson等，1998，Vaccine 16：1306-1313)。最后，活疫苗还具有可鼻内给药的优势，这可避免灭活佐剂疫苗的肌注给药时有时会出现的肿胀和肌痛。已有报道，这些活疫苗不仅可以引起抗同型流感病毒的体液反应，还可引起可交叉反应的细胞介导细胞毒性。因此，本发明提供了发展新的和更有效的用于诊断、预防、控制或治疗病毒和非病毒性病原体的免疫制剂例如疫苗制剂的可能性。
3.发明综述
本发明提供了经工程改造以表达可结合进病毒颗粒的融合蛋白的嵌合负链RNA病毒，制备这些嵌合病毒的方法和这些病毒例如作为免疫原在免疫原性制剂或体外试验中的应用。本发明嵌合病毒其特征在于在病毒颗粒的表面不仅显示与病毒相关的抗原，还显示融合蛋白。
本发明提供了嵌合流感病毒和嵌合NDV，通过施用嵌合流感病毒或嵌合NDV，这些病毒可使个体，例如鸟或人，对两种传染性物质产生免疫。一方面，用于诱导免疫应答的单个病毒的应用可减少免疫制剂的给药频率。另一方面，用于诱导免疫应答的单个病毒的应用可降低免疫个体的费用。免疫个体更低的费用增加了更多个体能够负担免疫费用的可能性，由此降低了与治疗被感染个体相关的健康费用。
本发明还涉及本发明的嵌合病毒在用于人或动物的组合物(例如免疫原性制剂)中的应用。特别地，本发明的嵌合病毒可作为抗多种病毒和/或抗原的广谱疫苗。由于该嵌合病毒经工程改造可在病毒颗粒中表达外源抗原决定簇，包含本发明嵌合病毒的组合物(例如，疫苗制剂)可被设计用来针对多种变异株、不同病毒或完全不同的传染物或疾病抗原(例如，细菌、寄生虫、真菌或肿瘤特异性抗原)进行免疫。很多方法可以用来将活的减毒病毒制剂引入人类或动物个体中以诱导免疫应答或适当的细胞因子反应。这些方法包括但不限于鼻内、脑脊髓膜内、口服、皮内、肌肉、腹膜内、静脉内和皮下途径。
通过施用嵌合病毒，本发明的嵌合病毒可以使个体(例如鸟)对两种传染性疾病产生免疫。在具体实施方式中，通过施用本发明的嵌合病毒，本发明的嵌合病毒可以使鸟类对禽流感病毒和新城疫病毒产生免疫。通过用嵌合病毒对鸟进行喷雾或以水溶液形式，例如鸟的饮用水来施用嵌合病毒，可以方便地使鸟类获得免疫。
本发明部分基于申请人的发现，即通过工程改造流感病毒以表达融合蛋白并将该融合蛋白结合进其病毒颗粒可以实现对两种传染性物质的有效免疫应答，该融合蛋白包含该病毒的至少一个必需糖蛋白的胞质区和跨膜区以及第二传染性物质的蛋白的胞外结构域，其中该融合蛋白功能性取代必需糖蛋白。一方面，该融合蛋白结合进病毒颗粒导致对第二传染性物质的胞外结构域的免疫应答的增强。将病毒的必需糖蛋白的胞质区和跨膜区工程改造入融合蛋白中可以使融合蛋白结合进病毒颗粒。在具体实施方式中，必需糖蛋白是流感病毒HA蛋白和/或NA蛋白中的一个或两个。在另一实施方式中，必需糖蛋白是NDV的HN蛋白或F蛋白中的一个或两个。病毒的至少一个必需糖蛋白的功能性置换消除了对于病毒基因组容量限制的担忧(例如流感病毒基因组)。在某些实施方式中，用融合蛋白对病毒的至少一个必需糖蛋白的功能性置换减弱了病毒在个体中的复制。
本发明提供了包含融合蛋白的嵌合禽流感病毒，该融合蛋白具有(i)非流感病毒的传染性物质的保护性抗原的胞外结构域，其与(ii)流感病毒的必需基因编码的糖蛋白的跨膜结构域和胞质结构域融合，其中该融合蛋白结合进禽流感病毒中，在该病毒中，必需基因的功能由融合蛋白或禽流感病毒天然糖蛋白来提供。在某些实施方式中，流感病毒的必需基因是血凝素(HA)基因。在其它实施方式中，流感病毒的必需基因是神经氨酸酶(NA)基因。在某些实施方式中，嵌合禽流感病毒被减弱。根据这些实施方式，通过NS1基因的突变，可减弱嵌合禽流感病毒。
本发明提供了包含融合蛋白的嵌合流感病毒，该融合蛋白具有(i)NDV的HN蛋白的胞外结构域，其与(ii)流感病毒NA蛋白的跨膜结构域和胞质结构域融合，其中该融合蛋白结合进禽流感病毒中，在该病毒中，NA蛋白的功能由融合蛋白或禽流感病毒天然糖蛋白来提供。在某些实施方式中，嵌合禽流感病毒被减弱。根据这些实施方式，通过NS1基因的突变，可减弱嵌合禽流感病毒。根据本发明，可使用任何类型、亚型或病毒株的禽流感病毒。
本发明提供了嵌合禽流感病毒，包含编码神经氨酸融合蛋白的被包装的流感病毒NA片段，其中NA开放阅读框被修饰，由此编码NA胞外结构域的核苷酸被编码非流感的传染性物质的通过N末端锚定的神经氨酸酶抗原胞外结构域的核苷酸所替代，由此该神经氨酸酶融合蛋白被表达并且可被结合进嵌合禽流感病毒中。
本发明提供了嵌合禽流感病毒，包含编码血凝素融合蛋白的被包装的流感病毒HA片段，其中HA开放阅读框被修饰，由此编码HA胞外结构域的核苷酸被编码非流感的传染性物质的通过C末端锚定的受体结合/融合抗原胞外结构域的核苷酸所替代，由此血凝素融合蛋白被表达并被结合进嵌合禽流感病毒中。
本发明提供了嵌合禽流感病毒，包含被包装的双顺反子流感病毒HA片段，其包含：(a)编码禽流感病毒血凝素蛋白的第一开放阅读框，和(b)编码血凝素融合蛋白的第二开放阅读框，其中编码血凝素胞外结构域的核苷酸被编码非流感病毒的传染性物质的保护性抗原胞外结构域的核苷酸，或编码由C末端锚定的疾病抗原的核苷酸所代替，由此流感病毒血凝素和融合蛋白都被表达并且被结合进嵌合禽流感病毒中。在某些实施方式中，嵌合禽流感病毒的HA片段的第一开放阅读框被修饰以去除血凝素多元切割位点。
本发明提供了嵌合禽流感病毒，包含被包装的双顺反子流感病毒NA片段，其包含：(a)编码禽流感病毒神经氨酸酶蛋白的第一开放阅读框，和(b)编码神经氨酸酶融合蛋白的第二开放阅读框，其中编码神经氨酸酶胞外结构域的核苷酸被编码非流感病毒的传染性物质的保护性抗原胞外结构域的核苷酸，或编码N末端被锚定的疾病抗原的核苷酸所代替，由此流感病毒神经氨酸酶和融合蛋白都被表达并且被结合进嵌合禽流感病毒中。在某些实施方式中，嵌合禽流感病毒包含HA片段，该片段具有经修饰以去除血凝素多元切割位点的开放阅读框。
本发明提供了嵌合禽流感病毒，包含被包装的编码神经氨酸酶融合蛋白的流感病毒的NA片段，其中该NA开放阅读框被修饰，使得编码NA胞外结构域的核苷酸被编码NDV的HN抗原的胞外结构域的核苷酸所代替，由此该神经氨酸酶融合蛋白被表达并且被结合进嵌合禽流感病毒中。神经氨酸酶融合蛋白为嵌合禽流感病毒提供了神经氨酸酶的活性。
在某些实施方式中，本发明的嵌合禽流感病毒包含被包装的编码经修饰的NS1蛋白的NS1基因片段，该蛋白降低病毒的细胞干扰素拮抗物的活性。在下文5.1.2节中，提供了生成经修饰的NS1蛋白的NS1基因的突变的非限制性例子。
本发明提供了编码本发明的嵌合禽流感病毒的NA片段的重组核酸分子(如重组DNA分子)。本发明还提供了编码本发明的嵌合禽流感病毒的HA片段的重组核酸分子(如重组DNA分子)。本发明进一步提供了编码本发明的嵌合禽流感病毒的NA片段或HA片段的重组核酸分子(如重组RNA分子)。
本发明提供了增殖本发明的嵌合禽流感病毒的方法，包括在易受禽流感病毒感染的胚蛋或细胞系中培养嵌合禽流感病毒。本发明还提供了制备免疫原性制剂的方法，该方法包括：(a)在胚蛋或易受禽流感病毒感染的细胞系中，培养该嵌合流感病毒；和(b)收集增殖的病毒，其中病毒生长到足够的量，并且在足以使病毒免受污染的条件下生长，这样，增殖的病毒就可以用于免疫原性制剂，例如，疫苗制剂。
本发明提供了包含融合蛋白的减毒嵌合流感病毒，该融合蛋白具有(i)非流感病毒的传染性物质的保护性抗原的胞外结构域，其与(ii)由流感病毒的必需基因编码的糖蛋白的跨膜结构域和胞质结构域融合，其中该融和蛋白结合到减毒流感病毒中，在该病毒中，必需基因的功能由融和蛋白或该减毒流感病毒的天然糖蛋白来提供。在某些实施方式中，流感病毒的必需基因是血凝素(HA)基因。在其它实施方式中，流感病毒的必需基因是神经氨酸酶(NA)基因。该减毒嵌合流感病毒可能是任何型、亚型或流感病毒株。例如，该减毒嵌合流感病毒可以是流感A病毒、流感B病毒或流感C病毒。
本发明提供了减毒嵌合流感病毒，包含被包装的编码神经氨酸酶融合蛋白的流感病毒NA片段，其中该NA开放阅读框被修饰从而编码NA胞外结构域的核苷酸被编码非流感的传染性物质的由N末端锚定的神经氨酸酶抗原胞外结构域的核苷酸所替代，从而神经氨酸酶融合蛋白被表达并结合进减毒嵌合禽流感病毒中。在某些实施方式中，本发明的减毒嵌合流感病毒包含HA片段，该片段具有经修饰以去除血凝素多元切割位点的开放阅读框。
本发明提供了减毒嵌合流感病毒，包含被包装的编码血凝素融合蛋白的流感病毒HA片段，其中该HA开放阅读框被修饰从而编码HA胞外结构域的核苷酸被编码非流感的传染性物质的由C末端锚定的血凝素抗原胞外结构域的核苷酸所替代，从而血凝素融合蛋白被表达并结合进减毒嵌合禽流感病毒中。
本发明提供了减毒嵌合流感病毒，包含被包装的双顺反子流感病毒HA片段，包含：(a)编码流感血凝素蛋白的第一开放阅读框，和(b)编码血凝素融合蛋白的第二开放阅读框，其中编码血凝素胞外结构域的核苷酸被编码非流感的传染性物质的保护性抗原胞外结构域的核苷酸，或编码由C末端锚定的疾病抗原的核苷酸所代替，因此该流感病毒血凝素和该融合蛋白都被表达并结合到减毒嵌合流感病毒中。在某些实施方式中，该减毒嵌合流感病毒的HA片段的第一开放阅读框被修饰以去除血凝素多元切割位点。
本发明提供了减毒嵌合流感病毒，包含被包装的双顺反子流感病毒NA片段，包括：(a)编码流感神经氨酸酶蛋白的第一开放阅读框，和(b)编码神经氨酸酶融合蛋白的第二开放阅读框，其中编码神经氨酸酶胞外结构域的核苷酸被编码非流感的传染性物质的保护性抗原的胞外结构域的核苷酸或编码由N末端锚定的疾病抗原的核苷酸替代，由此流感神经氨酸酶和融合蛋白被表达并结合进减毒嵌合流感病毒中。在某些实施方式中，本发明的减毒嵌合流感病毒包含HA片段，该片段具有经修饰以去除血凝素多元切割位点的开放阅读框。
在某些实施方式中，本发明的减毒嵌合流感病毒包含经包装的编码被修饰的NS1蛋白的NS1基因片段，该蛋白降低病毒的细胞干扰素拮抗剂活性。
本发明提供了编码本发明的减毒嵌合流感病毒NA片段的重组核酸分子(例如，重组DNA分子)。本发明还提供了编码本发明的减毒嵌合流感病毒HA片段的重组核酸分子(例如，重组DNA分子)。本发明进一步提供了编码本发明的减毒嵌合流感病毒的NA片段或HA片段的重组核酸分子(例如，重组RNA分子)。
本发明提供了本发明的减毒嵌合流感病毒的增殖方法，包括在对流感病毒易感的胚蛋中或细胞系中培养该减毒嵌合流感病毒。本发明还提供了制备免疫原性制剂的方法，该方法包含：(a)在对减毒流感病毒易感的胚蛋中或细胞系中增殖本发明的减毒嵌合流感病毒；和(b)收集后代病毒，其中病毒生长到足够的量，并且在足以使病毒免受污染的条件下生长，由此后代病毒适用于免疫原性制剂，例如疫苗制剂。
本发明还提供了嵌合NDV病毒。特别地，本发明提供了包含融合蛋白的嵌合NDV，该融合蛋白具有(i)非NDV的传染性物质的保护性抗原的胞外结构域，其与(ii)由NDV的必需基因编码的糖蛋白的跨膜结构域和胞质结构域融合，其中该融合蛋白结合进NDV中，在该NDV中，必需基因的功能由融合蛋白或NDV天然糖蛋白提供。在某些实施方式中，NDV的NDV必需基因是编码F蛋白的基因。在其它实施方式中，NDV的NDV必需基因是编码HN蛋白的基因。根据本发明，可以使用任何类型、亚型或病毒株的NDV。
本发明提供了嵌合NDV，包含被包装的基因组，该基因组包含编码F蛋白-融合蛋白的核苷酸序列，该蛋白具有F蛋白跨膜结构域和胞质结构域以及非NDV的传染性物质的抗原的胞外结构域或由C末端锚定的疾病抗原，因此F蛋白-融合蛋白被表达并被结合进嵌合NDV中。在某些实施方式中，嵌合NDV的基因组包含编码F蛋白的核苷酸序列，由此除了NDV F蛋白-融合蛋白外，F蛋白被表达并被结合进嵌合NDV中。在其它实施方式中，编码NDV F蛋白-融合蛋白的核苷酸序列代替了编码NDV F蛋白的核苷酸序列，并且F蛋白-融合蛋白为嵌合NDV提供了F蛋白的功能。
本发明提供了嵌合NDV，包含被包装的基因组，该基因组包含编码HN融合蛋白的核苷酸序列，该蛋白具有HN蛋白的跨膜结构域和胞质结构域和由N末端锚定的非NDV的传染性物质的抗原或疾病抗原的胞外结构域，因此该HN融合蛋白被表达并被插入到嵌合NDV中。在某些实施方式中，嵌合NDV的基因组包含编码HN蛋白的核苷酸序列，因此，除形成NDV HN融合蛋白外，该HN融合蛋白被表达并被插入到嵌合NDV中。在其它实施方式中，编码HN融合蛋白的核苷酸序列代替了编码NDV HN蛋白的核苷酸序列，并且HN融合蛋白为嵌合NDV提供了HN蛋白的功能。本发明提供了编码和/或被编码NDV HN蛋白或F蛋白的重组核酸分子。
本发明提供了本发明的嵌合NDV的增殖方法，包括在对NDV易感的胚蛋或细胞系中培养嵌合NDV。本发明还提供制备免疫原性制剂的方法，该方法包含：(a)在对NDV易感的胚蛋或细胞系中增殖本发明的嵌合NDV；和(b)收集后代病毒，其中该病毒生长到足够的量，并且足以使病毒免受污染的条件下生长，由此，后代病毒适用于免疫原性制剂，例如疫苗制剂。
本发明提供了包含本发明的嵌合病毒的胚蛋。本发明还提供了包含本发明的嵌合病毒的细胞系。本发明进一步提供了包含本发明的嵌合病毒的免疫原性制剂。
本发明提供了在个体中诱导对一种、两种或更多种传染性物质的免疫应答的方法，该方法包含施用有效量的本发明的嵌合流感病毒。在某些实施方式中，个体是人类个体。在其它实施方式中，个体是非人类哺乳动物(例如，猪、马、狗或猫)。在其它实施方式中，个体是鸟类个体。在具体实施方式中，本发明提供了在鸟体内诱导对一种、两种或更多种传染性物质的免疫应答的方法，该方法包含施用有效量的本发明的嵌合禽流感病毒。
本发明提供了在个体中诱导对一种、两种或更多种传染性物质的免疫应答的方法，该方法包含施用有效量的本发明的嵌合NDV。在某些实施方式中，个体是人类个体。在其它实施方式中，个体是非人类哺乳动物(例如，猪、马、狗或猫)。在其它实施方式中，个体是鸟类个体。在具体实施方式中，本发明提供了在鸟体内诱导对一种、两种或更多种传染性物质的免疫应答的方法，该方法包含施用有效量的本发明的嵌合NDV。
本发明提供了在个体中诱导对一种、两种或更多种传染性物质的免疫应答的方法，该方法包含施用有效量的本发明的减毒嵌合流感病毒。在某些实施方式中，个体是人类个体。在其它实施方式中，个体是非人类哺乳动物(例如，猪、马、狗或猫)。在其它实施方式中，个体是鸟类个体。在具体实施方式中，本发明提供了在鸟体内诱导对一种、两种或更多种传染性物质的免疫应答的方法，该方法包含对有此需要的人施用有效量的本发明的嵌合病毒。
本发明提供了诱导对疾病抗原的免疫应答的方法，该方法包含对个体施用有效量的本发明的嵌合病毒。在某些实施方式中，个体是人类。在其它实施方式中，个体是鸟。
3.1 术语
本文所用的术语“动物”包括但不限于伴侣动物(如狗和猫)、动物园动物、农场动物(如反刍动物、非反刍动物、家畜和家禽)、野生动物、还有实验室动物(如啮齿类，例如大鼠、小鼠、豚鼠以及兔子)，以及被克隆或者经过遗传学或其它手段改造的动物(如转基因动物)。
本文中，当术语“大约”或“近似地”与数字连用时，指所指数字的1％、5％或10％之内的任何数字。
本文中，NS1的“氨基末端”指流感病毒NS1蛋白的氨基末端氨基酸残基(氨基酸残基1)到氨基酸残基115、氨基酸残基1到100、氨基酸残基1到75、氨基酸残基1到50、氨基酸残基1到25、或氨基酸残基1到10的氨基酸。氨基末端的缺失包括由NS1的氨基末端的5个氨基酸残基，优选地10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、73、75、80、85、90、95、99、100、105、110、115、120、125、126、130、135、140、145、150、155、160、165、170或175个氨基酸残基组成的缺失。
本文中，NS1的“羧基末端”指马流感病毒NS1蛋白的氨基酸残基116到羧基末端氨基酸残基，氨基酸残基101到羧基末端氨基酸残基，氨基酸残基76到羧基末端氨基酸残基，氨基酸残基51到羧基末端氨基酸残基，或氨基酸残基26到羧基末端氨基酸残基，当NS1的氨基末端分别是流感病毒NS1蛋白的氨基酸残基1到115，氨基酸残基1到100，氨基酸残基1到75，氨基酸残基1到50，或氨基酸残基1到25时。羧基末端的缺失可包括由NS1的羧基末端的5个氨基酸残基，优选地10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、73、75、80、85、90、95、99、100、105、110、115、120、125、126、130、135、140、145、150、155、160、165、170或175个氨基酸残基组成的缺失。
本文中，术语“疾病”和“紊乱”可互换地用于指个体的病症，且包括但不限于增殖紊乱(例如，白血病、纤维症、肿瘤(包括恶性肿瘤、非恶性肿瘤、转移性肿瘤和非转移性肿瘤)、和淋巴瘤)，以及传染性物质引起的感染(例如，病毒、细菌、寄生虫)，或与其相关的病症或症状。
本文中，术语“抗原决定簇”指个体中就有抗原活性或免疫原活性的分子(例如，多肽或蛋白质)的位点、片段或区域。具有免疫原活性的抗原决定簇是激发个体内抗体应答的分子(例如，多肽或蛋白)的位点、片段或区域。具有抗原活性的抗原决定簇是通过任何本领域技术人员熟知的方法例如免疫分析法确定的抗体能与之特异性结合的分子位点、片段或区域。
本文中，蛋白物质的“片段”指肽或多肽，其包含肽、多肽或蛋白的氨基酸序列的至少2个连续的氨基酸残基、至少5个连续的氨基酸残基、至少10个连续的氨基酸残基、至少15个连续的氨基酸残基、至少20个连续的氨基酸残基、至少25个连续的氨基酸残基、至少40个连续的氨基酸残基、至少50个连续的氨基酸残基、至少60个连续的氨基酸残基、至少70个连续的氨基酸残基、至少80个连续的氨基酸残基、至少90个连续的氨基酸残基、至少100个连续的氨基酸残基、至少125个连续的氨基酸残基、至少150个连续的氨基酸残基、至少175个连续的氨基酸残基、至少200个连续的氨基酸残基、或至少250个连续的氨基酸残基的氨基酸序列。在一实施方式中，全长蛋白的片段保留全长蛋白的活性。在另一实施方式中，全长蛋白的片段不保留全长蛋白的活性。
本文中，编码多肽或蛋白的核酸的“片段”指核酸，其包含编码肽、多肽或蛋白的核酸序列的至少2个连续核苷酸、至少5个连续核苷酸、至少10个连续核苷酸、至少15个连续核苷酸、至少20个连续核苷酸、至少25个连续核苷酸、至少30个连续核苷酸、至少35个连续核苷酸、至少40个连续核苷酸、至少50个连续核苷酸、至少60个连续核苷酸、至少70个连续核苷酸、至少80个连续核苷酸、至少90个连续核苷酸、至少100个连续核苷酸、至少125个连续核苷酸、至少150个连续核苷酸、至少175个连续核苷酸、至少200个连续核苷酸、至少250个连续核苷酸、至少300个连续核苷酸、至少350个连续核苷酸、或至少380个连续核苷酸的核酸序列。在优选实施方式中，核酸片段编码保留全长蛋白活性的肽或多肽。在另一实施方式中，全长蛋白的片段不保留全长蛋白的活性。
本文中，蛋白物质的“异源序列”指在自然界中未发现与嵌合病毒骨架或特别是嵌合病毒糖蛋白相关联的分子。核酸序列或核酸分子的“异源序列”指在自然界中未发现与嵌合病毒骨架基因组相关联的分子。
本文中，术语“免疫特异性结合抗原”以及类似术语，指特异性结合抗原而不会特异性结合另一个分子的分子(例如，抗原特异性抗体包括被修饰的抗体(即含有被修饰的IgG(例如IgG1)的恒定结构域，或其FcRn-结合片段(例如Fc结构域或铰链-Fc结构域))和未被修饰的抗体(即不包括被修饰的IgG(例如IgG1)的恒定结构域，或其FcRn-结合片段(例如Fc结构域或铰链-Fc结构域))。特异性的结合一种抗原的分子可与相关抗原交叉反应。优选地，特异性结合一种抗原的分子不与其它抗原发生交叉反应。可通过免疫分析、BIAcore、或本领域技术人员已知的其它技术识别特异性结合抗原的分子。当通过实验技术(例如放射免疫分析法(RIA)和酶联免疫吸附测定(ELISA))确定分子与所述抗原比与其它交叉反应抗原以更高的亲和力结合时，该分子特异性地结合抗原。关于抗体特异性的讨论，参见例如，Paul编，1989，Fundamental Immunology第2版，Raven Press，New York第332-336页。
本文中，在对个体施用治疗的上下文中，术语“联合”指多于一种治疗的使用(例如，多于一种的预防剂和/或治疗剂)。使用术语“联合”并不限制对个体(例如，被流感病毒感染或NDV感染或具有与其相关的病症或症状的个体，或具有其它感染(例如另一种病毒感染)的个体)施用治疗(例如，预防剂和/或治疗剂)的顺序。可在对个体(例如，被流感病毒感染或NDV感染或具有与其相关的病症或症状的个体，或具有其它感染(例如另一种病毒感染)的个体)施用第二治疗(例如第二预防剂和/或治疗剂)之前(例如之前5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)、同时或之后(例如之后5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周。5周、6周、8周或12周)施用第一治疗(例如第一预防剂和/或治疗剂)。
本文中，蛋白试剂的“干扰素拮抗剂活性”指降低或抑制细胞干扰素免疫应答的蛋白质或多肽，或其片段、衍生物或类似物。尤其是，具有干扰素拮抗剂活性的蛋白质或多肽，或其片段、衍生物或类似物(例如流感病毒NS1)降低或抑制干扰素的表达和/或活性。在具体实施方式中，短语“干扰素拮抗剂活性”指降低或抑制细胞干扰素免疫应答的病毒蛋白或多肽，或其片段、衍生物或类似物(例如流感病毒蛋白)。具有干扰素拮抗剂活性的病毒蛋白或多肽可优先影响一种或两种干扰素(IFN)的表达和/或活性。在一个实施方式中，IFN-α的表达和/或活性受到影响。在另一实施方式中，IFN-β的表达和/或活性受到影响。在另一具体实施方式中，IFN-γ的表达和/或活性受到影响。在某些实施方式中，如本文所述的或本领域技术人员已知的技术所测量的，相比于没有表达或接触这种蛋白试剂的对照胚蛋或细胞中IFN-α、IFN-β和/或IFN-γ的表达和/或活性，胚蛋或细胞中的IFN-α、IFN-β和/或IFN-γ的表达和/或活性被具有干扰素拮抗剂活性的蛋白试剂降低大约1到100倍、大约5到80倍、大约20到80倍、大约1到10倍、大约1到5倍、大约40到80倍，或1、2、3、4、5、7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍。
本文中，短语“IFN缺陷系统”或“IFN缺陷底物”指系统，例如细胞、细胞系和动物如小鼠、鸡、火鸡、兔、大鼠、马等，它们不能生成一种、两种或更多种类型的IFN，或不能生成任何类型的IFN，或生成低水平的一种、两种或更多类型的IFN，或生成低水平的任何IFN(例如，与相同情况下的IFN完全系统相比，任何IFN表达降低5-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％或更多)，对一种、两种、或更多种类型的IFN无应答或不能有效应答，或对任何类型IFN不应答，和/或在由一种、两种、或更多类型的IFN或任何类型的IFN引起的抗病毒基因的活性上存在缺陷。
本文中，术语“感染”、“流感感染”、“禽流感感染”和“NDV感染”指流感病毒、禽流感病毒、NDV、或另一种传染性物质(例如，另一种病毒或细菌感染)在个体内的生命周期的所有阶段(包括但不限于流感病毒、禽流感病毒、NDV或其它传染性物质侵入细胞或个体组织并在其中复制)，以及流感病毒、禽流感病毒、NDV或其它传染性物质侵入并复制而引起的病理状态。流感病毒、禽流感病毒、NDV或其它传染性物质的侵入和复制，包括但不限于以下步骤：病毒(例如流感病毒、禽流感病毒或NDV颗粒)到细胞的对接；病毒与细胞膜的融合；病毒基因信息向细胞的导入；病毒蛋白的表达(例如流感病毒、禽流感病毒或NDV蛋白)；新的病毒颗粒的产生(例如，流感病毒、禽流感病毒、或NDV颗粒)和病毒(例如，流感病毒、禽流感病毒、或NDV颗粒)从细胞的释放。呼吸道感染(例如，流感病毒或NDV感染)可能是上呼吸道感染(URI)、下呼吸道感染(LRI)，或其组合。在具体实施方式中，感染是继发于原发感染(例如病毒性肺炎)的继发感染(例如继发性肺炎)。继发感染是由于使感染个体易于产生继发感染的原发感染或者与其相关联的症状或者病症而引起的。在具体实施方式中，流感病毒、禽流感病毒或NDV的侵入和复制引发的病理状态为急性流感病毒、禽流感病毒或NDV病。呼吸道感染的急性期表现为肺炎和/或支气管炎，其症状可包括：缺氧、呼吸暂停、呼吸窘迫、呼吸急促、哮喘、紫绀等。呼吸道感染的急性期(例如，流感病毒和NDV感染)要求受影响的个体接受医疗干预，例如入院治疗、输氧、插管和/或通气。
本文中，关于病毒的术语“分离的”指获自单亲本病毒的病毒。可以使用本领域技术人员已知的常规方法分离病毒，包括但不限于基于噬斑纯化和有限稀释的方法。
本文中，关于核酸分子的术语“分离的”指从存在于核酸分子的天然来源中的其它核酸分子中分离出的核酸分子。此外，“分离的”核酸分子如cDNA分子，可基本不含其它细胞材料，或当它通过重组技术制备时，基本不含培养基，或当它由化学方法合成时，基本不含化学前体或其它化学物质。在优选实施方式中，编码病毒蛋白的核酸分子是分离的。
本文中，术语“控制”指个体从治疗(例如预防剂或治疗剂)中得到的有益效果，该效果不导致疾病(例如感染)的治愈。在某些实施方式中，对个体施用一种或更多种治疗(例如，预防剂或治疗剂，如本发明的抗体)来“控制”流感病毒感染、禽流感病毒或NDV感染、或其它传染性物质的感染，或其一种或多种症状，或与流感病毒感染、禽流感病毒、NDV感染或其它传染性物质的感染相关联的、因其严重化的病症、或使流感病毒感染、禽流感病毒、NDV感染或其它传染性物质的感染严重化的病症，由此防止感染的进展或恶化。
本文中，短语“感染复数”或“MOI”指每个受感染细胞的病毒平均数。MOI由加入的病毒数(加入的ml数×Pfu)除以加入的细胞数(加入的ml数×细胞/ml)确定。
本文中，短语“NS1基因”指编码流感非结构蛋白(NS1)的基因。NS1是由流感病毒A和其它病毒的节段基因组编码的八个分子中的一个。“NS1基因产物”指NS1基因编码的基因产物(例如，RNA或蛋白)。关于蛋白，NS1基因产物是全长产物并有野生型NS1活性(例如，来自毒株A/WSN/33)。
本文中，术语“核酸”、“核苷酸序列”和“核酸分子”包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如，mRNA)、DNA和RNA分子的组合或杂交DNA/RNA分子，和DNA或RNA分子的类似物。这样的类似物可通过使用例如核苷酸类似物制备，包括但不限于肌苷或三苯甲基化碱基(tritylated base)。这样的类似物还可以包含DNA或RNA分子，这些分子包含被修饰的骨架，其赋予分子有益的性质，例如核酸酶抗性或穿越细胞膜的提高的能力。核酸或核苷酸序列可以是单链的、双链的，可以既包含单链部分又包含双链部分，并且可以包含三链部分，但优选双链DNA。
本文中，术语“预防”指通过施用治疗(例如，预防剂或治疗剂)对个体疾病(例如，病毒感染或其它传染性疾病)一或多种症状的复发或发作的预防或减轻。例如，就因为感染对个体施用治疗而言，“预防”指由于治疗(例如，预防剂或治疗剂)的施用、或治疗的联合施用(例如预防剂或治疗剂的联合施用)，对个体的感染(例如，流感病毒感染、NDV感染或与其相关的病症，或流感病毒或NDV感染以外的其它感染或与其相关的病症)的发展或发作的抑制或降低，或对感染(例如，禽流感病毒感染、NDV感染或与其相关的病症，或除流感病毒、NDV感染以外的其它感染或与其相关的病症)的一种或多种症状的复发、发作或发展的预防。
本文中，就传染性物质而言的术语“保护性抗原”包括在施用于个体时能够引起保护性免疫应答的任何分子，这种免疫应答是针对该传染性病原体。
本文中，术语“预防剂”指可用于疾病(例如感染)或其症状(例如流感病毒感染、NDV感染或与其相关的病症或症状，或流感病毒、或NDV病毒以外的感染或与其相关的病症或症状)的预防的任何试剂。优选地，预防剂是已知可用于、已被用于、或正在被用于预防或防止疾病或其症状(例如，感染或其相关的病症或症状)的发作、发展、进展和/或严重化的试剂。
本文中，关于病毒的短语“纯化的”指基本不含从其中获取病毒的细胞或组织来源的细胞材料和培养基的病毒。“基本不含细胞材料”包括病毒制剂，其中病毒由从其中分离或重组制备该病毒的细胞的细胞组分中分离。这样，基本不含细胞材料的病毒包括具有少于约30％、20％、10％或5％(干重)细胞蛋白(本文中也称为“污染蛋白”)的蛋白制剂。病毒也基本不含培养基，即，培养基少于病毒制剂体积的大约20％、10％或5％。可使用本领域技术人员已知的常规方法纯化病毒，包括但不限于层析和离心。
本文中，术语“个体”或“患者”可互换使用。本文中，术语“个体”指动物(例如，鸟类、爬行动物和哺乳动物)。在某些实施方式中，个体是包括非灵长类(例如，骆驼、驴、斑马、母牛、马、猫、狗、大鼠和小鼠)和灵长类(例如，猴、黑猩猩、人)的哺乳动物。在某些实施方式中，个体是非人类哺乳动物。在其它实施方式中，个体是人。在某些实施方式中，哺乳动物(例如人)为0到6个月大、6到12个月大、1到5岁大、5到10岁大、10到15岁大、15到20岁大、20到25岁大、25到30岁大、30到35岁大、35到40岁大、40到45岁大、45到50岁大、50到55岁大、55到60岁大、60到65岁大、65到70岁大、70到75岁大、75到80岁大、80到85岁大、85到90岁大、90到95岁大或95到100岁大。在具体实施方式中，个体或患者是鸟。在某些实施方式中，鸟为0到3个月大、3到6个月大、6到9个月大、9到12个月大、12到15个月大、15到18个月大、或18到24个月大。
本文中，关于治疗的施用或结果的术语“协同的”指比任何两种或更多种单独治疗(例如，一种或更多种预防剂或治疗剂)的加成效果更有效的治疗(例如，预防剂或治疗剂)的联合。联合治疗(例如，预防剂和治疗剂的联合)的协同效应可以对患有疾病(例如，流感病毒感染、NDV感染或与其相关的病症，或流感病毒或NDV感染以外的其它感染或与其相关的病症)的个体使用更低剂量的一种或多种治疗(例如，一种或多种预防剂或治疗剂)和/或以更低的频率施用所述治疗。使用更低剂量的治疗(例如，预防剂或治疗剂)和/或以更低频率使用所述治疗的能力降低了与对个体施用所述治疗相关联的毒性而不降低所述治疗在疾病(例如，流感病毒感染、NDV感染或与其相关的病症，或流感病毒或NDV感染以外的其它感染或与其相关的病症)的预防或治疗中的功效。此外，协同效应可在疾病(例如，流感病毒感染、NDV感染或与其相关的病症，或流感病毒或NDV感染以外的其它感染或与其相关的病症)的预防、控制或治疗中带来改进的治疗(例如，预防剂或治疗剂)功效。最后，联合治疗(例如，预防剂或治疗剂)的协同效应可避免或降低与任何单个治疗的使用相关联的不良副作用或有害副作用。
本文中，术语“治疗”可指能够用于疾病(例如，癌症，流感病毒感染、NDV感染或与其相关的病症，或流感病毒或NDV感染以外的其它感染或与其相关的病症)的预防、治疗、控制、或改善的任何方案、方法、和/或试剂。在某些实施方式中，术语“治疗”指本领域技术人员已知的可用于疾病、感染或与其相关的病症或症状的治疗、控制、预防或改善的生物治疗、支持治疗和/或其它治疗。
本文中，术语“治疗剂”指可用于疾病(例如，感染或其相关症状(例如，流感病毒感染、NDV感染或与其相关的病症，或流感病毒或NDV感染以外的其它感染或与其相关的病症))的预防、治疗、控制或改善的任何试剂。优选地，治疗剂是已知可用于、已被用于、或正在被用于预防、治疗、控制、或改善疾病或与其相关症状(例如，流感病毒感染、NDV感染或与其相关的病症，或流感病毒或NDV感染以外的其它感染或与其相关的病症)的试剂。
本文中，就为了疾病对个体施用治疗而言，术语“治疗”指根除、减少或改善所述疾病的症状。关于感染(例如，流感病毒或NDV病毒)，治疗指根除或控制传染性物质(例如病毒)的复制，减少传染性物质(例如降低病毒滴度)的数量，降低或改善感染(例如，流感病毒感染、NDV感染或与其相关的病症，或流感病毒或NDV感染以外的其它感染或与其相关的病症)的进展、严重度和/或持续时间，或施用一种或多种治疗(包括但不限于一种或多种预防剂或治疗剂的施用)产生的一种或多种症状的改善。关于癌症，治疗指由于施用本发明的一种或多种治疗剂对原发性、区域性、或转移性癌组织的根除、去除、改造、或控制。在某些实施方式中，该术语指对患有该病的个体施用本发明的一种或多种治疗剂来最小化或延迟癌症的扩散。在其它实施方式中，该术语指清除可引起疾病的细胞。
4.附图说明
图1.杂交NAf-HN构建物的图示
该构建物编码WSN NA vRNA的3’非编码区的核苷酸，对应于NA蛋白的胞质尾区和跨膜区加上NA胞外结构域的第一个氨基酸的NA编码区，NDV B1 HN蛋白的编码区(只有胞外结构域)，两个连续终止密码子，WSNNA阅读框的不翻译的核苷酸和WSN vRNA的5’非编码区。
图2.HA的多元氨基酸序列中的变化的图示
鉴定为H5N1HA的核苷酸序列代表流感A/越南/1203/04(H5N1)的HA表面糖蛋白的开放阅读框的核苷酸1013-1045(SEQ ID NO：13；氨基酸序列SEQ ID NO：14)。通过切除PCR和定点突变使用单核苷酸胞嘧啶代替核苷酸1026-1038，产生无毒性HA核苷酸序列(SEQ ID NO：15；氨基酸序列SEQID NO：16)。该序列变化对应于用单个氨基酸苏氨酸替代5个氨基酸的多元序列。
图3.HA核酸序列的改变的图示
鉴定为无毒HA的序列代表基于与无毒性流感A/越南/1203/04(H5N1)(SEQ ID NO：15；氨基酸序列SEQ ID NO：16)的HA蛋白一致的序列的HA表面糖蛋白的开放阅读框的核苷酸1013-1033。加下划线的腺苷残基被代替，由此突变为同义的，生成核苷酸序列SEQ ID NO：17和氨基酸序列SEQ ID NO：16。
图4A-D.pPol1VN1203 NS截断突变体的图示
A.H5N1的NS基因片段的编码区为833个核苷酸。B.pPol1VN1203NS1-126构建体在NS基因中具有从编码区核苷酸379-456的缺失，3个终止密码子和BglII限制性位点的插入。C.pPol1VN1203 NS1-99构建体在NS基因中具有从编码区核苷酸298-456的缺失，4个终止密码子、BglII限制性位点和PacI限制性位点的插入。D.pPol1VN1203 NS1-73构建体在NS基因中具有从编码区核苷酸219-456的缺失、4个终止密码子、BglII限制性位点和PacI限制性位点的插入。
图5.pNDV/B1的图示
图示的序列3’端侧翼为T7启动子，5’端侧翼为HDV核酶和T7终止子。在P和M基因之间的插入位点包含特有的XbaI限制性位点。
图6.嵌合rNDV病毒的KGFR表达的Western印迹分析
将嵌合病毒rNDV(泳道1)、rNDV-KGFR(泳道2)和rNDV-KGFR/F-CT(泳道3)在10天大的胚鸡蛋中培育。分别使用鼠抗-KGFR和抗-鼠HRPO作为一抗和二抗，对纯化的病毒进行Western印迹分析。
图7.嵌合rNDV病毒中H7HA表达的Western印迹分析
将嵌合病毒rNDV(泳道1)、rNDV-KGFR(泳道2)和rNDV-KGFR/F-CT(泳道3)在10天大的胚鸡蛋中培育。分别使用鼠抗-KGFR和抗-鼠HRPO作为一抗和二抗，对纯化的病毒进行Western印迹分析。
图8.rNDV的F蛋白切割位点的修饰
(A)rNDV/B1基因组的图示，该基因组在F蛋白的切割位点具有两或三个氨基酸的改变。F蛋白中被切割的肽键用斜杠标示。(B)被带有修饰的F蛋白的rNDV感染的CEF细胞中的合胞体形成。CEF细胞被rNDV/B1、rNDV/F2aa和rNDV/F3aa病毒感染的感染复数为0.001。通过免疫荧光分析每24小时监视病毒的扩散。
图9.表达HPAI H7 HA蛋白的融合rNVD载体的构建和特征
(A)带有GE/GS、Kozak和部分H7HA序列(SEQ ID NO：36)的rNDV/F3aa嵌合H7cDNA构建体的图示。(B)病毒生长动力学比较，LogTCID vs接种后时间(小时)。正方形，rNDV/B1；三角形，rNDV/F3aa；粗体星号，rNDV/B1-H7；星号，rNDV/F3aa-嵌合H7。(C)在被rNDV感染的细胞中WTH7HA蛋白或嵌合H7HA蛋白的表达。泳道1，假感染；泳道2，rNDV/F3aa；泳道3，rNDV/B1-H7；泳道4，rNDV/F3aa-嵌合H7。第1排α-鸟类H7；第2排，α-NDV。(D)与WT H7HA蛋白相比，嵌合H7HA蛋白在rNDV病毒颗粒中的结合被增强。泳道1，rNDV/B1-H7；rNDV/F3aa-嵌合H7。第1排，α-鸟类H7；第2排，α-NDV。
5.本发明的详细说明
本发明提供了经工程改造以表达结合进病毒颗粒的融合蛋白的嵌合负链RNA病毒，制备这些嵌合病毒的方法和这些病毒的应用，例如作为免疫原、在免疫原性制剂、或在体外分析中的应用。本发明的嵌合病毒的特征为其病毒颗粒表面不仅显示病毒相关抗原还显示融合蛋白。
按照本发明的方法被工程改造的病毒可以是任何包膜病毒。在具体实施方式中，可按照本发明的方法被工程改造的病毒具有片段或非节段基因组，单链或双链基因组，且表达至少一种结合进病毒包膜的必需糖蛋白(例如NA、HA、HN或F)。用于本发明的方法的病毒可选自天然存在的病毒株、变体或突变体；经诱变的病毒(例如，通过暴露于紫外线辐射、诱变剂和/或传代)；重组病毒(对于带有节段基因组的病毒)；和/或基因工程改造病毒。例如，突变病毒可通过自然变异、暴露在紫外线辐射中、暴露在化学诱变剂中、通过在非许可性宿主中传代、通过重新组合(即通过减毒片段性病毒与另一具有所需抗原的病毒株的同时感染)、和/或通过基因工程(例如，使用“反向遗传学”)来产生。用于本发明的方法中的具有节段基因组的病毒的非限制性例子包括来自正粘病毒科(例如，流感病毒)、本扬病毒科(例如，布尼奥罗病毒)、呼肠孤病毒科和沙粒病毒科(例如，拉沙热)家族的病毒。用于本发明的方法的具有非节段基因组的病毒的非限制性例子包括冠状病毒科(例如，人类冠状病毒(SARS))、肝脱氧核糖核酸病毒科(例如，A、B、C型肝炎病毒)、疱疹病毒科(例如，单纯性疱疹病毒)、痘病毒科(例如，天花)、弹状病毒科(例如，水泡口腔炎病毒(VSV)、仙台病毒和狂犬病)、副粘病毒科(例如，麻疹和呼吸道合胞病毒)以及纤丝病毒科(马尔堡病毒和依波拉病毒)。在某些实施方式中，片段性病毒是流感病毒。在其它实施方式中，非片段性病毒是NDV。
在某些实施方式中，选择用于本发明的病毒是被减毒的和/或具有缺陷性IFN拮抗活性的；即，它们具有感染性并且可在体内复制，但只具有低滴度，导致非致病性的亚临床水平感染。病毒可通过本领域已知的和/或在此例举的任何方法被减毒，例如，通过工程改造病毒以在NS1基因中包含突变或在HA蛋白的切割位点之前的多元氨基酸序列中包含修饰。因此，根据本发明工程改造的这种减毒病毒是免疫原性制剂的理想候选物，例如，活病毒疫苗。当对个体给药时，本发明的减毒、嵌合病毒能够产生免疫应答并引起对病毒和非天然或融合蛋白的免疫性。在某些实施方式中，非天然蛋白来自病原体。展开地说，对个体施用这样的嵌合病毒产生对病毒以及所述病原体的免疫应答和/或免疫性。
本发明还涉及本发明中的嵌合病毒在用于人类或动物(例如鸟类)的组合物(例如，免疫原性制剂)中的应用。尤其是，减毒嵌合病毒可被用作广谱抗病毒和/或疾病的疫苗。因为嵌合病毒被工程改造以表达作为病毒颗粒外源抗原决定簇的异源性基因序列，可设计包含本发明的嵌合病毒的组合物(例如疫苗制剂)来对从中获得异源性基因序列的多种变体株、不同病毒、或完全不同的传染性物质或疾病抗原(例如，细菌、寄生虫、真菌或肿瘤特异性抗原)产生免疫。可通过很多种方法将活减毒病毒制剂引入人类或动物个体以诱导免疫应答或恰当的细胞因子应答。这些方法包括但不限于鼻内、气管内、口服、皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内和皮下途径。
5.1 嵌合流感病毒
5.1.1 包含结合进病毒颗粒的融合蛋白的嵌合禽流感病毒
本发明包括对禽流感病毒的工程改造，由此融合蛋白被基因组编码且当被表达时结合进病毒颗粒。可被工程改造以表达融合蛋白并将其结合进禽流感病毒颗粒的任何类型、亚型或病毒株的禽流感病毒可被选择并用于本发明，包括但不局限于天然存在的病毒株、变异株或突变体、经诱变的病毒、重组和/或基因工程改造病毒。在特定实施方式中，本发明的禽流感病毒不是天然发生的病毒。在另一实施方式中，本发明的禽流感病毒是基因工程改造病毒。禽流感病毒的非限制性例子包括流感A亚型H5N1、H6N2、H7N3、H9N2和H10N7。
流感病毒的基因操作需要将组成病毒基因组的8个病毒RNA片段的至少1个工程改造。基因组诱变可通过“反向工程”技术实现(参照5.4节)。然而，流感基因组的可塑性在可被稳定整合进病毒的片段数量和片段长度方面都是有限的。长插入片段的整体稳定性是未知的，且包含这些插入片段的片段或其部分可能在几次传代后由于病毒重组而丢失。因此，在本发明的优选实施方式中，禽流感病毒被工程改造，由此两个主要表面蛋白中的一个被融合蛋白代替。
相应地，本发明提供了包含至少一个融合蛋白的嵌合禽流感病毒，该蛋白包含非流感病毒的传染性物质的蛋白胞外结构域(ED)和至少一个必需流感病毒糖蛋白的胞质结构域(CT)和跨膜结构域(TM)或跨膜结构域(TM)，其中至少一个融合蛋白功能性代替至少一个必需禽流感病毒糖蛋白。换句话说，禽流感病毒作为“骨架”，该骨架被工程改造以表达代替禽流感病毒必需糖蛋白的融合蛋白并将其结合进其病毒颗粒。包含对应于被融合蛋白功能性替代的禽流感病毒必需糖蛋白的流感病毒糖蛋白的TM和CT域或TM域使得融合蛋白能够结合进禽流感病毒的病毒颗粒。融合蛋白的TM和CT域或TM域可对应于或来自于允许融合蛋白结合到禽流感病毒骨架的病毒颗粒的任何流感病毒。
在某些实施方式中，融合蛋白的TM和CT域或TM域对应于与骨架禽流感病毒不同的禽流感病毒的类型、亚型或病毒株的TM和CT域或TM域。在其它实施方式中，融合蛋白的TM和CT域或TM域对应于非禽流感病毒的流感病毒的TM和CT域或TM域。在其它实施方式中，融合蛋白的TM和CT域或TM域对应于禽流感病毒骨架的TM和CT域或TM域。
禽流感病毒颗粒包含两个主要表面糖蛋白，血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)，它们都包含胞质结构域、跨膜结构域和胞外结构域。因此，在某些实施方式中，融合蛋白的TM和CT域对应于流感病毒的HA蛋白或NA蛋白的TM和CT域。由于HA或NA的CT域对融合蛋白结合到禽流感病毒颗粒来说不是必需的，在一些实施方式中，融合蛋白经工程改造只包含HA或NA的TM域。例如，已显示NA的CT域对这种蛋白适当包装进入流感A病毒包膜来说不是必需的(Garcia-Sastre等，1995，Virus Res.37：37-47，该文献完整引入本文作为参考)。因此，当对应于NA蛋白的结构性区域被用于构建融合蛋白时，本发明包含工程改造融合蛋白以只包含对应于流感病毒NA蛋白的TM域。相应地，在本发明的一个实施方式中，工程改造融合蛋白从而只包含TM域，该TM域对应于流感病毒NA蛋白的TM域。
流感病毒HA和NA蛋白的TM和CT域结构上的区别在于这些结构域位于HA蛋白的C末端和NA蛋白的N末端。除了两个结构域在各类表面糖蛋白中的定向不同外，依据它们在多肽链中的相对位置，HA和CT结构性区域可能包含未知的功能差异。因此，当设计将被工程改造进禽流感病毒的融合蛋白时，将被融合进流感病毒糖蛋白的TM和CT域或TM域的传染性物质的胞外结构域的方向将指导TM和CT域或TM域的选择。例如，当传染性物质的胞外结构域被N末端锚定时，可用流感病毒NA蛋白的TM和CT域。
就细胞融合和释放而言，HA和NA显示了对病毒的传染和繁殖所必需的彼此相当的活性。HA结合到细胞表面的N-乙酰神经氨酸(NeuNAc；唾液酸)，导致宿主细胞对病毒的摄取，而NA将唾液酸部分从细胞表面切割，使后代病毒从被感染的细胞释放。这些活动中无论哪一个被破坏都会导致形成无功能病毒。因此，为维持病毒的完整性，在表面糖蛋白被代替时，它在嵌合病毒中的功能必须由融合蛋白提供。在本发明的一个实施方式中，嵌合禽流感病毒包含表现出神经氨酸酶活性的融合蛋白。在本发明的另一实施方式中，嵌合禽流感病毒包含表现出受体结合活性的融合蛋白。在本发明的另一实施方式中，嵌合禽流感病毒包含两个融合蛋白，其中一个表现出神经氨酸酶活性，另一个表现出受体结合活性。在本发明的其它实施方式中，嵌合禽流感病毒包含融合蛋白，该融合蛋白包含异源性传染性物质的抗原决定簇，该融合蛋白表现出神经氨酸酶活性或受体结合活性。在本发明的另一实施方式中，嵌合禽流感病毒包含表现出受体结合活性的融合蛋白。在具体实施方式中，嵌合禽流感病毒包含表面蛋白，其包含新城疫病毒(NDV)的HN蛋白的胞外结构域，和流感A/WSN/33的NA蛋白的TM和CT域，该HN胞外结构域表现出神经氨酸酶活性。在其它实施方式中，嵌合禽流感病毒包含表面蛋白，该表面蛋白包含异源流感病毒的HA蛋白的胞外结构域(例如，H7HA蛋白或H9HA蛋白)。HA和NA被病毒基因组的分开的片段编码，且天然蛋白的整个编码区的替代消除了对编码被引入蛋白的序列的绝大部分长度限制。
在某些实施方式中，融合蛋白包含跨膜结构域外加1到15、1到10、1到5、1到3、2或者1个直接相邻的流感病毒必需糖蛋白的胞外结构域残基。例如，在具体实施方式中，融合蛋白包含流感病毒NA蛋白的跨膜结构域，1到15、1到10、1到5、1到3、2或1个直接相邻的流感病毒NA蛋白的胞外结构域残基，和非流感病毒的传染性物质的胞外结构域或其片段，由此融合蛋白可以功能性替代NA蛋白的功能。在另一具体实施方式中，融合蛋白包含流感病毒NA蛋白的胞质结构域和跨膜结构域，与流感病毒NA蛋白的跨膜结构域直接相邻的1到15、1到10、1到5、1到3、2或1个流感病毒NA蛋白的胞外结构域的残基，以及非流感病毒的传染性物质的胞外结构域或其片段，由此融合蛋白可以功能性替代NA蛋白。在另一实施方式中，融合蛋白包含NA蛋白的跨膜结构域或胞质结构域和跨膜结构域，位于球状头部之前的NA蛋白的完整的主干结构域或其片段，和非流感病毒传染性物质的胞外结构域或其片段，由此融合蛋白能够功能性替代NA蛋白的功能。在另一实施方式中，融合蛋白包含流感病毒HA蛋白的跨膜结构域，1到15、1到10、1到5、1到3、2或1个直接相邻的流感病毒HA蛋白胞外结构域的残基，和非流感病毒传染性物质的胞外结构域或者其片段，由此融合蛋白能够功能性替代HA蛋白的功能。在另一具体实施方式中，融合蛋白包含流感病毒HA蛋白的胞质结构域和跨膜结构域，与流感病毒HA蛋白的跨膜结构域直接相邻的1到15、1到10、1到5、1到3、2或1个流感病毒HA蛋白胞外结构域的残基，和非流感病毒传染性物质的胞外结构域或其片段，由此融合蛋白可以功能性替代HA蛋白。
在某些实施方式中，本发明的嵌合流感病毒的至少一个融合蛋白不包含异源蛋白的完整胞外结构域(例如，包含异源传染性物质的蛋白的胞外结构域的抗原片段)，而且可能或者可能不进一步包含天然必需糖蛋白的一个或者几个胞外结构域的片段。相应地，在某些实施方式中，融合蛋白的胞外结构域可包含异源传染性物质的蛋白的胞外结构域的片段。在其它实施方式中，融合蛋白的胞外结构域可同时包含天然必需糖蛋白片段和异源传染性物质蛋白片段。在融合蛋白取代必需表面糖蛋白的实施方式中，表面糖蛋白的功能必须由融合蛋白提供，即融合蛋白必须展现出它替代的表面糖蛋白的功能。
本发明包含编码本章节5.11所描述的融合蛋白的核苷酸序列(即重组片段)。在优选实施方式中，含有编码5.11章节描述的融合蛋白的核酸的重组片段包含3’和5’结合信号，这些信号是vRNA正确复制、转录和包装所需要的(Fujii等，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：2002-2007；Zheng等，1996，Virology 217：242-251，两者内容均完整引入本文作为参考)。在优选实施方式中，本发明的重组片段因此使用与骨架禽流感病毒相同类型或者病毒株的病毒片段的3’和5’非编码和/或非翻译序列。在具体实施方式中，重组片段包含本章(5.1.1)描述的融合蛋白的编码核酸，该核酸包含流感病毒NAvRNA的3’非编码区，对应于NA蛋白的CT和TM域的NA编码区，与流感病毒NA蛋白的跨膜结构域直接相邻的流感病毒NA蛋白的胞外结构域的1到15、1到10、1到5、1到3、2或者1个残基，NA vRNA的NA蛋白阅读框的非翻译区和5’非编码区。
作为替代禽流感病毒的NA或者HA蛋白的一种选择，“反向遗传学”和双顺反子技术可被用来制备嵌合流感病毒，该病毒包括非流感病毒传染性物质的胞外结构域或其片段和流感病毒的TM和/或CT域。参见如美国专利号6,887,699、美国专利号6,001,634、美国专利号5,854,037和美国专利号5,820,871，各专利内容均完整引入本文作为参考。双顺反子法将融合蛋白的编码区插入到病毒的必需蛋白的开放阅读框和其终止密码子中。插入序列的两侧为IRES和必需蛋白的任何非翻译信号序列，在该蛋白中，插入不破坏必需病毒蛋白的开放阅读框、包装信号、多聚腺苷酸化或者转录启动子。任何本领域已知的或在本文中描述的IRES可被用于本发明(例如，BiP基因的IRES，GenBank数据库录入条HU MGRP78的372到592核苷酸；或者脑心肌炎病毒(EMCV)的IRES，GenBank数据库录入条CQ867238的1430-2115核苷酸)。由于在使用双顺反子法时，HA或NA的功能不被取代，融合蛋白的胞外结构域部分不限于提供被替代的HA或者NA蛋白的功能的蛋白。这样的融合蛋白的胞外结构域可以对应于任何异源分子，或者包含任意异源分子的片段，包括但不限于抗原、疾病抗原和来自传染性物质的任何蛋白的抗原(例如，与病毒、细菌或者寄生虫性传染性物质相关的任何保护性抗原)。从用于本发明的方法的传染性物质获得的或与之相关联的抗原的非限制性例子在下文5.3章节提供。
替代骨架病毒的必需表面蛋白或者在病毒基因组引入重组片段可能会减弱生成的嵌合病毒，即相比野生型，嵌合病毒会展现出受损的复制能力。在本发明的某些实施方式中，嵌合病毒的减毒是需要的，由此嵌合病毒至少部分保留了感染性并且可以在体内复制，但是只产生低滴度，导致非致病性的亚临床水平感染。这样的减毒嵌合病毒特别适用于本发明的实施方式，其中病毒作为免疫原如活体疫苗施用于个体。可以通过本领域已知的和/或在此例举的任何方法将病毒减毒，如，将病毒工程改造以在NS1基因中包含突变或在HA蛋白的切割位点前的多元氨基酸序列中包含改变。(参见美国专利号6,468,544；美国专利号6,669,943；Li等，1999，J.Infect.Dis 179：1132-1138，各文献内容均完整引入本文作为参考)。
在一实施方式中，本发明的减毒嵌合禽流感病毒包含基因组，其包含在禽流感骨架病毒的NS1基因中的突变，已知该突变在其它流感病毒中降低NS1基因产物拮抗细胞干扰素应答的能力。在另一实施方式中，本发明的减毒嵌合禽流感病毒包含基因组，其包含在禽流感骨架病毒的HA基因中的突变，已知该突变在其它流感病毒中降低或者消除细胞蛋白酶将蛋白剪切成活性形式的能力，从而减毒或者消除HA诱导的融合或者感染。在另一实施方式中，本发明的减毒嵌合禽流感病毒包含基因组，其同时包含在禽流感骨架病毒的HA基因和NS1基因中的突变，已知这些突变在其它流感病毒中分别地或联合地诱导或者减弱病毒活性。使用本领域已知的或本文所述的任何技术可确定减毒的嵌合和野生型禽流感病毒的滴度(例如，血凝素分析、空斑分析、鸡胚半数感染量(EID50)、半数细胞培养感染量(TCID50)等)，病毒可以在本文所述的或本领域已知的条件下培养(如在CEF细胞、MDCK细胞(如在MEM，10％v/v胎牛血清，1％青霉素/链霉素在37℃，5％二氧化碳的湿润培养箱中)或胚鸡卵中(例如恒温培养箱中，37℃，55％相对湿度)。或者，病毒可以在生长在无血清或者低血清(如，TPCK胰蛋白酶)培养基的细胞中(如，CEF细胞、MDCK细胞等)增殖。
5.1.2 包含结合进其病毒颗粒的融合蛋白的嵌合减毒流感病毒
本发明包含对减毒流感病毒工程改造，由此融合蛋白被基因组编码且在被表达时结合进病毒颗粒。换句话说，本发明包含减毒流感病毒(亲本病毒)作为“骨架”的应用，该骨架经工程改造以表达融合蛋白并将其结合入病毒颗粒中。任何减毒流感病毒类型或者病毒株(包括但不仅限于天然存在的毒株、变异体或者突变株、经诱变的病毒、重组和/或遗传改造病毒)可被用作经工程改造以表达融合蛋白并将其结合入病毒颗粒的的骨架。在具体实施方式中，用于本发明的亲本流感病毒不是天然存在的病毒。在另一具体实施方式中，用于本发明的亲本病毒是经遗传工程改造的病毒。
用作本发明的骨架病毒的流感病毒可天然具有减毒的表型或者可被工程改造而包含与减毒表型相关的突变，该突变是本领域已知的或在本文中说明(如，位于病毒NS1蛋白或者病毒HA蛋白的突变)。在其它实施方式中，减毒病毒是流感A。在其它实施方式中，减毒病毒是流感B。在其它实施方式中，减毒病毒是流感C。根据本发明可以被工程改造的流感病毒的非限定性例子包括流感A 亚型 H10N4、亚型 H10N5、亚型 H10N7、亚型 H10N8、亚型 H10N9、亚型 H11N1、亚型 H11N13、亚型 H11N2、亚型 H11N4、亚型H11N6、亚型 H11N8、亚型 H11N9、亚型 H12N1、亚型 H12N4、亚型H12N5、亚型 H12N8、亚型 H13N2、亚型 H13N3、亚型 H13N6、亚型H13N7、亚型 H14N5、亚型 H14N6、亚型 H15N8、亚型 H15N9、亚型H16N3、亚型 H1N1、亚型 H1N2、亚型 H1N3、亚型 H1N6、亚型 H1N9、亚型 H2N1、亚型 H2N2、亚型 H2N3、亚型 H2N5、亚型 H2N7、亚型H2N8、亚型 H2N9、亚型 H3N1、亚型 H3N2、亚型 H3N3、亚型 H3N4、亚型 H3N5、亚型 H3N6、亚型 H3N8、亚型 H3N9、亚型 H4N6、亚型 H4N8、亚型 H4N9、亚型 H5N1、亚型 H5N2、亚型 H5N3、亚型 H5N4、亚型H5N6、亚型 H5N7、亚型 H5N8、亚型 H5N9、亚型 H6N1、亚型 H6N2、亚型 H6N3、亚型 H6N4、亚型 H6N5、亚型 H6N6、亚型 H6N7、亚型 H6N8、亚型 H6N9、亚型 H7N1、亚型 H7N2、亚型 H7N3、亚型 H7N4、亚型H7N5、亚型 H7N7、亚型 H7N8、亚型 H7N9、亚型 H8N4、亚型 H8N5、亚型 H9N1、亚型 H9N2、亚型 H9N3、亚型 H9N5、亚型 H9N6、亚型 H9N7、亚型 H9N8、或亚型 H9N9；流感 B 爱知株/5/88、秋田株/27/2001、秋田株/5/2001、阿拉斯加株/16/2000、阿拉斯加株/1777/2005、阿根廷株/69/2001、亚利桑那株/146/2005、亚利桑那株/148/2005、曼谷株/163/90、曼谷株/34/99、曼谷株/460/03、曼谷株/54/99、巴塞罗那株/215/03、北京株/15/84、北京株/184/93、北京株/243/97、北京株/43/75、北京株/5/76、北京株/76/98、比利时株/WV106/2002、比利时株/WV107/2002、比利时株/WV109/2002、比利时株/WV114/2002、比利时株/WV122/2002、波恩株/43、巴西株/952/2001、布加勒斯特株/795/03、布宜诺斯艾利斯株/161/00、布宜诺斯艾利斯株/9/95、布宜诺斯艾利斯株/SW16/97、布宜诺斯艾利斯株/VL518/99、加拿大株/464/2001、加拿大株/464/2002、查科株/366/00、查科株/R113/00、济州株/303/03、千叶株/447/98、重庆/3/2000株、泰国临床分离株SA1/2002、泰国临床分离株SA10/2002、菲律宾临床分离株SA100/2002、菲律宾临床分离株SA110/2002、菲律宾临床分离株SA112/2002、菲律宾临床分离株SA113/2002、菲律宾临床分离株SA114/2002、泰国临床分离株SA2/2002、泰国临床分离株SA20/2002、菲律宾临床分离株SA38/2002、泰国临床分离株SA39/2002、菲律宾临床分离株SA99/2002、CNIC株/27/2001、科罗拉多株/2597/2004、科多巴株/VA418/99，捷克斯洛伐克株/16/89、捷克斯洛伐克株/69/90、大邱株/10/97、大邱株/45/97、大邱株/9/97、B株/Du/4/78、B株/德班/39/98、德班株/43/98、德班株/44/98、B株/德班/52/98、德班株/55/98、德班株/55/98、德班株/56/98、英格兰株/1716/2005、英格兰株/2054/2005、英格兰株/23/04、芬兰株/154/2002、芬兰株/159/2002、芬兰株/160/2002、芬兰株/154/2002、芬兰株/159/2002、芬兰株/160/2002、芬兰株/161/2002、芬兰株/162/03、芬兰株/162/2002、芬兰株/162/91、芬兰株/164/2003、芬兰株/172/91、芬兰株/173/2003、芬兰株/176/2003、芬兰株/184/91、芬兰株/188/2003、芬兰株/190/2003、芬兰株/220/2003、芬兰株/WV5/2002、富士株/36/82、日内瓦株/5079/03、热那亚株/11/02、热那亚株/2/02、热那亚株/21/02、热那亚株/54/02、热那亚株/55/02、广东株/05/94、广东株/08/93、广东株/5/94、广东株/55/89、广东株/8/93、广州株/7/97、广州株/86/92、广州株/87/92、京畿道株/592/2005、汉诺威株/2/90/、哈尔滨株/07/94、夏威夷株/10/2001、夏威夷株1990/2004、夏威夷株/38/2001、夏威夷株/9/2001、河北株/19/94、河北株/3/94、河南株/22/97、广岛株/23/2001、香港株/110/99、香港株/1115/2002、香港株112/2001、香港株/123/2001、香港株/1351/2002、香港株/1434/2002、香港株/147/99、香港株/156/99、香港株/157/99、香港株/22/2001、香港株/22/89、香港株/336/2001、香港株/666/2001、香港株/9/89、休斯顿株/1/91、休斯顿株/1/96，休斯顿株/2/96，湖南株/4/72、茨城株/2/85、仁川/297/2005、印度株/3/89、印度株/77276/2001、以色列株/95/03、以色列株/WV187/2002，日本株/1224/2005、江苏株/10/03、约翰内斯堡株/1/99、约翰内斯堡株/96/01、卡杜纳株/1076/99、卡杜纳株/122/99、鹿儿岛株/15/94、堪萨斯株/22992/99、哈尔科夫株/224/91、神户株/1/2002、小内株/193/99、拉齐奥株/1/02、李株/40、列宁格勒株/129/91、里斯本株/2/90、洛杉矶株/1/02、卢萨卡株/270/99、里昂株/1271/96、马来群岛株/83077/2002、马普托株/1/99、马德普拉塔株/595/99、马里兰株/1/01、孟菲斯株/1/01、孟菲斯株/12/97-MA、密歇根株/22572/99、三重株/1/93、米兰株/1/01、明斯克株/318/90、莫斯科株/3/03、名古屋株/20/99、南昌株/1/100、那什维尔株/107/93、那什维尔株/45/91、内布拉斯加株/2/01、荷兰株/801/90、荷兰株/429/98、纽约株/1/2002、NIB株/48/90、宁夏株/45/83、挪威株/1/84、阿曼株/16299/2001、大阪株/1059/97、大阪株/983/97-V2、奥斯陆株/1329/2002、奥斯陆株/1846/2002、巴拿马株/45/90、巴黎株/329/90、帕尔马株/23/02、佩思株/211/2001、秘鲁株/1364/2004、菲律宾株/5072/2001、釜山株/270/99、魁北克株/173/98、魁北克株/465/98、魁北克株/7/01、罗马株/1/03、萨迦株/S172/99、首尔株/13/95、首尔株/37/91、山东株/7/97、上海株/361/2002、志贺株/T30/98、四川株/379/99、新加坡株/222/79、西班牙株/WV27/2002、斯德哥尔摩株/10/90、瑞士株/5441/90、台湾株/0409/00、台湾株/0722/02、台湾株/97271/2001、德黑兰株/80/02、东京株/6/98、的里雅斯特株/28/02、乌兰巴托株/4/02、不列颠株/34304/99、USSR株/100/83、维多利亚株/103/89、维也纳株/1/99、武汉株/356/2000、WV194株/2002、宣武株/23/82、山形株/1311/2003、山形株/K500/2001、阿拉斯加株/12/96、GA株/86、NAGASAKI株/1/87、东京株/942/96、或者罗彻斯特株/02/2001；流感C爱知株/1/81、安阿伯株/1/50、青森株/74、加利福尼亚株/78、英格兰株/83、希腊株/79、广岛株/246/2000、广岛株/252/2000、兵库株/1/83、约翰内斯堡株/66、神奈川株/1/76、京都株/1/79、密西西比株/80、宫崎株/1/97、宫崎株/5/2000、宫崎株/9/96、奈良株/2/85、新泽西株/76、猪株/北京/115/81、扎晃株/3/2000、静冈株/79、山形株/2/98、山形株/6/2000、山形株/9/96、柏林株/1/85、英格兰株/892/8、五大湖株/1167/54、JJ株/50、猪株/北京/10/81、猪株/北京/439/82、泰勒株/1233/47、或者C株/山形/10/81。
在一个实施方式中，用于本发明的减毒流感病毒具有受损的拮抗细胞干扰素(IFN)的能力。在具体实施方式中，用于本发明的减毒流感病毒(亲本病毒)是在NS1基因中包含突变的流感病毒型或者毒株，该突变导致病毒拮抗细胞干扰素应答能力受损。可被引入流感病毒NS1基因中的突变类型的例子包括删除、替换、插入和它们的组合。一个或者多个突变可以引入到NS1基因的任何位置(例如，N末端、C末端或者两者之间的某个地方)和/或NS1基因的调控元件中。在具体实施方式中，用于本发明的减毒流感病毒(亲本病毒)包含基因组，该基因组在流感病毒NS1基因的N末端具有突变。在另一实施方式中，减毒流感病毒(亲本病毒)包含基因组，该基因组在流感病毒NS1基因的C末端具有突变。在另一实施方式中，用于本发明的减毒流感病毒(亲本病毒)包含在流感病毒NS1基因中具有突变的基因组，该突变会导致由自NS1基因C末端的5个，优选地10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、75个、80个、85个、90个、95个、99个、100个、105个、110个、115个、120个、125个、126个、130个、135个、140个、145个、150个、155个、160个、165个、170个或者175个氨基酸组成的缺失，或者自C末端的5-170个、25-170个、50-170个、100-170个、100-160个或者105-160氨基酸残基之间的缺失。在另一实施方式中，用于本发明的减毒流感病毒(亲本病毒)包含在流感病毒NS1基因中具有突变的基因组，导致除1-126氨基酸残基、1-120氨基酸残基、1-115氨基酸残基、1-110氨基酸残基、1-100氨基酸残基、1-99氨基酸残基、1-95氨基酸残基、1-85氨基酸残基、1-80氨基酸残基、1-75氨基酸残基、1-73氨基酸残基、1-70氨基酸残基、1-65氨基酸残基、1-60氨基酸残基之外的所有氨基酸残基的缺失，其中N末端氨基酸为编号1。
在一实施方式中，本发明的减毒流感病毒包含在流感病毒骨架的NS1基因中具有突变的基因组，该突变减弱了NS1基因产物拮抗细胞干扰素应答的能力，并且使减毒病毒在介于0.0005和0.001、0.001和0.01、0.01和0.1、或者0.1和1之间的感染复数(MOI)，或者在0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0的MOI下生长至细胞(如，人类、小鼠、大鼠、猪、狗、马、或者禽类的细胞(例如，Hep-2、A549、293T、Madin-Darby狗肾细胞(MDCK)或者鸡胚成纤维细胞(CEF))内的滴度低于野生型流感病毒约1到约100倍、约5到约80倍、约20到约80倍、或者约40到约80倍、约1到约10倍、约1到约5倍、约1到约4倍、约1到约3倍、约1到约2倍、或者约1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，这是通过在相同的环境下增殖时感染后约2到10天、3到7天、3到5天、或者2、3、4、5、6、7、8、9、10天测定的。减毒和野生型流感病毒可以通过任何本领域熟知的或者此处描述的技术来测定(例如，血凝素测试、空斑测试、鸡胚半数感染量(EID50)、半数细胞培养感染量(TCID50)等)，病毒可以在此处描述或者本领域熟知的环境下增殖(如在CEF细胞、MDCK细胞(如在MEM，10％v/v胎牛血清，1％青霉素/链霉素在37℃，5％二氧化碳的湿润培养箱中)或胚鸡卵中(例如恒温培养箱中，37℃，55％相对湿度)。或者，病毒可以在生长在无血清或者低血清(如，TPCK胰蛋白酶)培养基的细胞(如，CEF细胞、MDCK细胞)中增殖。
在另一实施方式中，用于本发明的减毒流感病毒(亲本病毒)包含在流感骨架病毒的HA基因中具有突变的基因组，该突变减弱或者消除了细胞蛋白酶剪切蛋白成为其活性形式的能力。可被引入流感病毒HA基因的突变类型的例子包括删除、替换、插入和它们的组合。一个或者多个突变被优选地引入到HA的切割位点(例如，GenBank登陆号为AY818135的核苷酸1013-1039)。一般情况下，在CEF中被标准方法测定为可以减弱HA蛋白裂解性的突变与体内测试中毒性的降低相关(Horimoto和Kawaoka，1994，68：3120-3128；全文引入本文作为参考)。在具体实施方式中，用于本发明的减毒流感病毒(亲本病毒)包含在流感病毒的HA基因具有突变的基因组，该突变导致1026-1038位点的核苷酸被胸腺嘧啶替代。在另一实施方式中，本发明的减毒流感病毒包含在流感骨架病毒的HA基因具有突变的基因组，该突变减弱或者消除细胞蛋白酶剪切蛋白成为其活性形式的能力，并且使减毒病毒在介于0.0005和0.001、0.001和0.01、0.01和0.1、或者0.1和1之间的感染复数(MOI)，或者在0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0的MOI下生长至细胞(如，人类、小鼠、大鼠、猪、狗、马、或者禽类的细胞(例如，Hep-2、A549、293T、Madin-Darby狗肾细胞(MDCK)或者鸡胚成纤维细胞(CEF))内的滴度低于野生型流感病毒约1到约100倍、约5到约80倍、约20到约80倍、或者约40到约80倍、约1到约10倍、约1到约5倍、约1到约4倍、约1到约3倍、约1到约2倍、或者约1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，这是通过在相同的环境下增殖时感染后约2到10天、3到7天、3到5天、或者2、3、4、5、6、7、8、9、10天测定的。包含这样的突变的HA蛋白并不是抗原性地区别于野生型亲本HA蛋白，即所有针对野生型HA蛋白产生的抗体会与突变的HA蛋白相互作用且所有针对突变HA蛋白产生的抗体会与野生型HA蛋白相互作用。减毒的和野生型流感病毒的滴度可以利用本领域熟知的或者此处描述的任何技术测定(例如，血凝素分析、空斑分析、鸡胚半数感染量(EID50)等)，并且病毒可以在此处提到的或者本领域熟知的条件下增殖(如在CEF细胞、MDCK细胞(如在MEM，10％v/v胎牛血清，1％青霉素/链霉素在37℃，5％二氧化碳的湿润培养箱中)或胚鸡卵中(例如恒温培养箱中，37℃，55％相对湿度)。或者，病毒可以在生长在无血清或者低血清(如，TPCK胰蛋白酶)培养基的细胞(如，CEF细胞、MDCK细胞)中增殖。
在另一实施方式中，用于本发明的减毒流感病毒(亲本病毒)包含基因组，其包含：(i)位于流感骨架病毒的HA基因中的突变，该突变可以减弱或者消除细胞蛋白酶剪切蛋白成为其活性形式的能力，和(ii)位于NS1基因中的突变，该突变导致病毒拮抗细胞干扰素能力受损。在另一实施方式中，本发明的减毒流感病毒包含在流感骨架病毒的HA基因和NS1基因中均有突变的基因组，使减毒病毒在介于0.0005和0.001、0.001和0.01、0.01和0.1、或者0.1和1之间的感染复数(MOI)，或者在0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0的MOI下生长至细胞(如，人类、小鼠、大鼠、猪、狗、马、或者禽类的细胞(例如，Hep-2、A549、293T、Madin-Darby狗肾细胞(MDCK)或者鸡胚成纤维细胞(CEF))内的滴度低于野生型流感病毒约1到约100倍、约5到约80倍、约20到约80倍、或者约40到约80倍、约1到约10倍、约1到约5倍、约1到约4倍、约1到约3倍、约1到约2倍、或者约1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，这是通过在相同的环境下增殖时感染后约2到10天、3到7天、3到5天、或者2、3、4、5、6、7、8、9、10天测定的。
本发明提供了包含至少一个融合蛋白的嵌合减毒流感病毒，该蛋白具有非流感病毒传染性物质的胞外结构域(ED)或其片段以及流感病毒必需糖蛋白的胞质(CT)和跨膜(TM)域或者跨膜(TM)域，其中至少一个融合蛋白功能性替代至少一个流感病毒必需糖蛋白。换句话说，减毒流感病毒作为“骨架”，该骨架被工程改造以表达代替流感病毒必需糖蛋白的至少一个融合蛋白并将其结合进其病毒颗粒。包含对应于被融合蛋白功能性替代的流感病毒必需糖蛋白的流感病毒糖蛋白的TM和CT域或TM域使得融合蛋白能够结合进减毒流感病毒的病毒颗粒。融合蛋白的TM和CT域或TM域可对应于或来自于允许融合蛋白结合到减毒流感病毒骨架的病毒颗粒的任何流感病毒。
在某些实施方式中，融合蛋白的TM和CT域或TM域对应于与骨架减毒流感病毒不同的流感病毒的类型、亚型或病毒株的TM和CT域或TM域。在其它实施方式中，融合蛋白的TM和CT域或TM域对应于非骨架减毒流感病毒的流感病毒种的TM和CT域或TM域。在优选实施方式中，融合蛋白的TM和CT域或TM域对应于减毒流感病毒骨架的TM和CT域或TM域。
在某些实施方式中，融合蛋白的TM和CT域对应于流感病毒的HA或者NA蛋白的TM和CT域。由于HA或者NA的CT域对于融合蛋白结合入流感病毒病毒粒并不是必需的，在某些实施方式中，融合蛋白经工程改造以仅包含HA或者NA的TM域。
流感病毒HA和NA蛋白的TM和CT域结构上的区别在于这些结构域位于HA蛋白的C末端和NA蛋白的N末端。除了两个结构域在各类表面糖蛋白中的定向不同外，依据它们在多肽链中的相对位置，HA和CT结构性区域可能包含未知的功能差异。因此，当设计将被工程改造进减毒流感病毒的融合蛋白时，将被融合进流感病毒糖蛋白的TM和CT域或TM域的传染性物质的胞外结构域或其片段的方向将指导TM和CT域或TM域的选择。
为维持病毒的完整性，在表面糖蛋白被代替时，它在嵌合病毒中的功能必须由融合蛋白提供。在本发明的一个实施方式中，嵌合减毒流感病毒包含表现出神经氨酸酶活性的融合蛋白。在本发明的另一实施方式中，嵌合减毒流感病毒包含表现出受体结合活性的融合蛋白。在本发明的另一实施方式中，嵌合减毒流感病毒包含两个融合蛋白，其中一个表现出神经氨酸酶活性，另一个表现出受体结合活性。在本发明的其它实施方式中，嵌合减毒流感病毒包含融合蛋白，该融合蛋白包含异源传染性物质的抗原决定簇，该融合蛋白表现出神经氨酸酶活性或受体结合活性。在具体实施方式中，嵌合减毒流感病毒包含表面蛋白，其包含新城疫病毒(NDV)的HN蛋白的胞外结构域，和流感A/WSN/33的NA蛋白的TM和CT域，该HN胞外结构域表现出神经氨酸酶活性。在其它实施方式中，嵌合减毒流感病毒包含表面蛋白，该表面蛋白包含异源流感病毒亚型或毒株的HA蛋白的胞外结构域(例如，H7HA蛋白或H9HA蛋白的胞外结构域)。
在某些实施方式中，本发明的嵌合减毒流感病毒的至少一个融合蛋白不包含异源蛋白的完整胞外结构域(例如，包含异源传染性物质的蛋白的胞外结构域的抗原性或保护性片段)，而且可能或者可能不进一步包含天然必需糖蛋白的一个或者几个胞外结构域的片段。相应地，在某些实施方式中，融合蛋白的胞外结构域可包含异源传染性物质的蛋白的胞外结构域的片段。在其它实施方式中，融合蛋白的胞外结构域可同时包含天然必需糖蛋白片段和异源传染性物质蛋白片段。在融合蛋白取代必需表面糖蛋白的实施方式中，表面糖蛋白的功能必须由融合蛋白提供，即融合蛋白必须展现出它替代的表面糖蛋白的功能。
本章5.1.2描述的融合蛋白的胞外结构域可对应于或者源自传染性物质(包括，病毒、细菌和寄生虫传染性物质)的任何糖蛋白或者其片段。传染性物质糖蛋白的非限定性例子将在下文5.3章提供。
在某些实施方式中，融合蛋白包含跨膜结构域外加1到15、1到10、1到5、1到3、2或者1个直接相邻的流感病毒必需糖蛋白的胞外结构域残基。在具体实施方式中，融合蛋白包含流感病毒NA蛋白的跨膜结构域，1到15、1到10、1到5、1到3、2或1个直接相邻的流感病毒NA蛋白的胞外结构域残基，和非流感病毒的传染性物质的胞外结构域或其片段，由此融合蛋白可以功能性替代NA蛋白的功能。在另一具体实施方式中，融合蛋白包含流感病毒NA蛋白的胞质结构域和跨膜结构域，与流感病毒NA蛋白的跨膜结构域直接相邻的1到15、1到10、1到5、1到3、2或1个流感病毒NA蛋白的胞外结构域的残基，以及非流感病毒的传染性物质的胞外结构域或其片段，由此融合蛋白可以功能性替代NA蛋白。在另一实施方式中，融合蛋白包含NA蛋白的跨膜结构域或胞质结构域和跨膜结构域，位于球状头部之前的NA蛋白的完整的主干结构域或其片段，和非流感病毒传染性物质的胞外结构域或其片段，由此融合蛋白能够功能性替代NA蛋白的功能。在另一实施方式中，融合蛋白包含流感病毒HA蛋白的跨膜结构域，1到15、1到10、1到5、1到3、2或1个直接相邻的流感病毒HA蛋白胞外结构域的残基，和非流感病毒传染性物质的胞外结构域或者其片段，由此融合蛋白能够功能性替代HA蛋白的功能。在另一具体实施方式中，融合蛋白包含流感病毒HA蛋白的胞质结构域和跨膜结构域，与流感病毒HA蛋白的跨膜结构域直接相邻的1到15、1到10、1到5、1到3、2或1个流感病毒HA蛋白胞外结构域的残基，和非流感病毒传染性物质的胞外结构域或其片段，由此融合蛋白可以功能性替代HA蛋白。
本发明包含编码本章节5.1.2所描述的融合蛋白的核苷酸序列(即重组片段)。在优选实施方式中，含有编码5.1.2章节描述的融合蛋白的核酸的重组片段包含3’和5’结合信号，这些信号是vRNA正确复制、转录和包装所需要的(Fujii等，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：2002-2007；Zheng等，1996，Virology 217：242-251，两者内容均完整引入本文作为参考)。在优选实施方式中，本发明的重组片段因此使用与骨架减毒流感病毒相同类型或者病毒株的病毒片段的3’和5’非编码和/或非翻译序列。在具体实施方式中，重组片段包含5.1.2章描述的融合蛋白的编码核酸，该核酸包含流感病毒NAvRNA的3’非编码区，对应于NA蛋白的CT和TM域的NA编码区，与流感病毒NA蛋白的跨膜结构域直接相邻的流感病毒NA蛋白的胞外结构域的1到15、1到10、1到5、1到3、2或者1个残基，NA vRNA的NA蛋白阅读框的非翻译区和5’非编码区。在某些实施方式中，重组片段包含5.1.2章描述的融合蛋白编码核酸，该融合蛋白包含球状头部之前的NA蛋白完整的主干结构域或者其片段。
作为替代减毒流感病毒的NA或者HA蛋白的一种选择，“反向遗传学”和双顺反子技术可被用来制备嵌合流感病毒，该病毒包括非流感病毒传染性物质的胞外结构域或疾病抗原和流感病毒的TM和/或CT域。参见如美国专利号6,887,699、美国专利号6,001,634、美国专利号5,854,037和美国专利号5,820,871，各专利内容均完整引入本文作为参考。可用于本发明的方法的异源分子例如疾病抗原和获自传染性物质的抗原的非限制性例子(例如与疾病或病毒蛋白相关的抗原)在下文5.3章节提供。
5.1.3 包含新城疫病毒HN蛋白的胞外结构域的嵌合禽流感病毒
本发明包括禽流感病毒的工程改造，由此包含新城疫病毒HN蛋白胞外结构域的融合蛋白被基因组编码且当被表达时结合进病毒颗粒。可被工程改造以表达融合蛋白并将其结合进禽流感病毒颗粒的任何类型、亚型或病毒株的禽流感病毒可被选择并用于本发明，包括但不局限于天然存在的病毒株、变异株或突变体、经诱变的病毒、重组和/或基因工程改造病毒。禽流感病毒的非限制性例子包括流感A亚型H5N1、H6N2、H7N3、H9N2和H10N7。
本发明提供了包含融合蛋白的嵌合禽流感病毒，该蛋白具有新城疫病毒(NDV)HN蛋白的胞外结构域(ED)和流感病毒NA蛋白的胞质结构域(CT)和跨膜结构域(TM)或跨膜结构域(TM)，其中融合蛋白功能性代替至少禽流感病毒NA蛋白。换句话说，禽流感病毒作为“骨架”，该骨架被工程改造以表达代替禽流感病毒NA蛋白的融合蛋白并将其结合进其病毒颗粒。在融合蛋白中包含流感病毒NA蛋白的TM和CT域或TM域使得融合蛋白能够结合进禽流感病毒的病毒颗粒。融合蛋白的TM和CT域或TM域可对应于或来自于允许融合蛋白结合到禽流感病毒骨架的病毒颗粒的任何流感病毒。
可用于本发明的TM和CT域的编码序列可获自或者源自任何流感病毒株或者亚型的任何NA蛋白的已公开的序列(例如，GenBank登录号AY651447，来自A/越南/1203/2004(H5N1)株；GenBank登录号AY96877，来自A/火鸡/加拿大/63(H6N2)株；GenBank登录号AY706954，来自A/鸭/海南/4/2004(H6N2)株；GenBank登录号DQ646080，来自A/鸡/英属哥伦比亚/GSC_人_B/04(H7N3)株；GenBank登录号DQ064434，来自A/鸡/北京/8/98(H9N2)株)。在某些具体李子中，融合蛋白的TM和CT域或者TM域对应于不同于骨架禽流感病毒的禽流感病毒类型或毒株的TM和CT域或者TM域。在其它实施方式中，融合蛋白的TM和CT域或者TM域对应于非禽流感病毒的流感病毒的TM和CT域或者TM域。在优选实施方式中，融合蛋白的TM和CT域或者TM域对应于禽流感病毒骨架的TM和CT域或者TM域。在具体实施方式中，融合蛋白的TM和CT域对应于流感病毒A/WSN/33的NA蛋白的TM和CT结构域。
在某些实施方式中，融合蛋白包含流感病毒NA蛋白的跨膜结构域，1到15、1到10、1到5、1到3、2或1个直接相邻的流感病毒NA蛋白的胞外结构域残基，和NDV HN蛋白的胞外结构域。在另一具体实施方式中，融合蛋白包含流感病毒NA蛋白的胞质结构域和跨膜结构域，与流感病毒NA蛋白的跨膜结构域直接相邻的1到15、1到10、1到5、1到3、2或1个流感病毒NA蛋白的胞外结构域的残基，以及NDV HN蛋白的胞外结构域。在另一具体实施方式中，融合蛋白包含位于球状头部之前的NA蛋白的完整的主干结构域或其片段，和NDV HN蛋白的胞外结构域。在另一实施方式中，融合蛋白包含NA蛋白的跨膜结构域或胞质结构域和跨膜结构域，且进一步包含位于球状头部之前的NA蛋白的完整的主干结构域或其片段，和NDVHN蛋白的胞外结构域。
作为替代禽流感病毒的NA蛋白的一种选择，“反向遗传学”和双顺反子技术可被用来制备嵌合禽流感病毒，该病毒包括NDV HN蛋白的胞外结构域和流感病毒的TM和/或CT域。参见如美国专利号6,887,699、美国专利号6,001,634、美国专利号5,854,037和美国专利号5,820,871，各专利内容均完整引入本文作为参考。
本发明包含编码本章节5.1.3所描述的融合蛋白的核苷酸序列(即重组片段)。在优选实施方式中，含有编码5.1.3章节描述的融合蛋白的核酸的重组片段包含3’和5’结合信号，这些信号是vRNA正确复制、转录和包装所需要的(Fujii等，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：2002-2007；Zheng等，1996，Virology 217：242-251，两者内容均完整引入本文作为参考)。在优选实施方式中，本发明的重组片段因此使用与骨架禽流感病毒相同类型或者病毒株的病毒片段的3’和5’非编码和/或非翻译序列。在具体实施方式中，重组片段包含5.1.3章描述的融合蛋白的编码核酸，该核酸包含流感病毒NAvRNA的3’非编码区，对应于NA蛋白的CT和TM域的NA编码区，与流感病毒NA蛋白的跨膜结构域直接相邻的流感病毒NA蛋白的胞外结构域的1到15、1到10、1到5、1到3、2或者1个残基，NA vRNA的NA蛋白阅读框的非翻译区和5’非编码区。在另一具体实施方式中，重组片段以3’到5’的顺序包含WSN NA vRNA的3’非编码区(19个核苷酸)、编码NA编码区的氨基酸残基1-36的核苷酸(108个核苷酸)、编码NDV B1 HN蛋白的氨基酸残基51-568的核苷酸、2个连续的终止密码子、WSN NA非翻译阅读框的157个核苷酸、WSN vRNA的5’非编码区(28个核苷酸)。见图1。
替代骨架流感病毒的NA蛋白或者在病毒基因组引入重组片段可能减弱生成的嵌合病毒，即相比野生型，嵌合病毒会展现出受损的复制能力。在本发明的某些实施方式中，嵌合病毒的减弱是需要的，由此嵌合病毒至少部分保留了感染性并且可以在体内复制，但是只产生低滴度，导致非致病性的亚临床水平感染。这样的减毒嵌合病毒特别适用于本发明的实施方式，其中病毒作为免疫原如活体疫苗施用于个体。可以通过本领域已知的和/或在此例举的任何方法将病毒减弱，如，将病毒工程改造以在NS1基因中包含突变或在HA蛋白的切割位点前的多元氨基酸序列中包含改变。(参见美国专利号6,468,544；美国专利号6,669,943；Li等，1999，J.Infect.Dis 179：1132-1138，各文献内容均完整引入本文作为参考)。
在一实施方式中，本发明的减毒嵌合禽流感病毒包含基因组，其包含在禽流感骨架病毒的NS1基因中的突变，已知该突变在其它流感病毒中降低NS1基因产物拮抗细胞干扰素应答的能力。在另一实施方式中，本发明的减毒嵌合禽流感病毒包含基因组，其包含在禽流感骨架病毒的HA基因中的突变，已知该突变在其它流感病毒中降低或者消除细胞蛋白酶将蛋白剪切成其活性形式的能力，从而减弱或者消除HA诱导的融合和感染。在另一实施方式中，本发明的减毒嵌合禽流感病毒包含基因组，其同时包含在禽流感骨架病毒的HA基因和NS1基因中的突变，已知这些突变在其它流感病毒中分别地或联合地诱导或者减弱病毒活性。使用本领域已知的或本文所述的任何技术可确定减毒的嵌合和野生型禽流感病毒的滴度(例如，血凝素分析、空斑分析、鸡胚半数感染量(EID50)、半数细胞培养感染量(TCID50)等)，病毒可以在本文所述的或本领域已知的条件下培养(如在CEF细胞、MDCK细胞(如在MEM，10％v/v胎牛血清，1％青霉素/链霉素在37℃，5％二氧化碳的湿润培养箱中)或胚鸡卵中(例如恒温培养箱中，37℃，55％相对湿度)。或者，病毒可以在生长在无血清或者低血清(如，TPCK胰蛋白酶)培养基的细胞中(如，CEF细胞、MDCK细胞等)增殖。
5.2 嵌合新城疫病毒
本发明包含新城疫病毒(“NSV”)的工程改造，由此至少一个融合蛋白被基因组编码并在被表达时结合进入病毒颗粒。可被工程改造以表达至少一个融合蛋白并将其结合进NDV病毒颗粒的任何NDV类型或病毒株可被选择并用于本发明，包括但不局限于天然存在的病毒株、变异株或突变体、经诱变的病毒、重组和/或基因工程改造病毒。在具体实施方式中，NDV是天然存在的病毒。在另一具体实施方式中，NDV是经遗传工程改造的病毒。例如，如本文所述，重组NDV、rNDV/F2aa和rNDV/F3aa的变异株可用于本发明的方法，在这些突变株中，F蛋白的切割位点被包含一个或两个额外精氨酸残基的切割位点替代，从而使突变体切割位点被普遍表达的弗林家族蛋白酶激活。可以用于本发明的方法的NDV的非限定性例子包括B1、LaSota、YG97、MET95和F48E9。在具体实施方式中，本发明的嵌合NDV或者rNDV包含含有流感病毒HA蛋白的胞外结构域的融合蛋白；在根据该实施方式的具体实施方式中，流感HA蛋白是来自流感H7的HA蛋白。
本发明提供了包含至少一个融合蛋白的嵌合NDV，该蛋白具有非NDV蛋白的传染性物质的蛋白的胞外结构域(ED)或其片段以及NDV必需糖蛋白的胞质(CT)和/或跨膜(TM)域。本发明也提供了包含至少一个融合蛋白的嵌合NDV，该蛋白具有非NDV糖蛋白的传染性物质的蛋白的ED或其片段以及TM域，和NDV必需糖蛋白的CT域。换句话说，NDV病毒作为“骨架”，该骨架被工程改造以表达融合蛋白并将其结合进其病毒颗粒。在融合蛋白中包含NDV必需糖蛋白的TM和/或CT域使得融合蛋白能够结合进NDV的病毒颗粒。融合蛋白的TM和/或CT域可对应于或来自于允许融合蛋白结合到NDV骨架的病毒颗粒的任何NDV。
在某些实施方式中，融合蛋白的TM和/或CT域对应于不同于骨架NDV的NDV类型或者毒株的TM和/或CT域。在优选实施方式中，融合蛋白的TM和/或CT域对应于NDV骨架的TM和/或CT域。
NDV病毒颗粒包含两个主要表面糖蛋白：融合蛋白(F)和血凝素-神经氨酸酶(HN)，他们都包含胞质结构域、跨膜结构域和胞外结构域。相应地，在某些实施方式中，融合蛋白的TM和/或CT域对应于NDV的F蛋白或者HN蛋白的TM和/或CT域。
NDV F和HN蛋白的TM和CT域在结构上的差异在于该结构域位于F蛋白的C末端和HN蛋白的N末端。因此，当设计将被工程改造进NDV的融合蛋白时，将被融合入NDV糖蛋白的TM和/或CT域的传染性物质的胞外结构域的方向将会引导TM和/或CT域的选择。
在某些实施方式中，嵌合NDV的至少一个融合蛋白包含TM域和1到15、1到10、1到5、1到3、2或者1个直接相邻的NDV必需糖蛋白的胞外结构域残基。例如，在具体实施方式中，融合蛋白包含NDV F蛋白的跨膜结构域，1到15、1到10、1到5、1到3、2或1个直接相邻的NDV F蛋白的胞外结构域残基，和NDV的传染性物质的胞外结构域或其片段，由此融合蛋白可以功能性替代F蛋白的功能。在另一具体实施方式中，融合蛋白包含NDV F蛋白的胞质结构域和跨膜结构域，与NDV F蛋白的跨膜结构域直接相邻的1到15、1到10、1到5、1到3、2或1个NDV F蛋白的胞外结构域的残基，以及非NDV的传染性物质的胞外结构域或其片段，由此融合蛋白可以功能性替代F蛋白。在另一实施方式中，融合蛋白包含NDV HN蛋白的跨膜结构域，1到15、1到10、1到5、1到3、2或1个直接相邻的NDVHN蛋白胞外结构域的残基，和非NDV的传染性物质的胞外结构域或者其片段，由此融合蛋白能够功能性替代HN蛋白的功能。在另一具体实施方式中，融合蛋白包含流感病毒NDV HN蛋白的胞质结构域和跨膜结构域，与NDV HN蛋白的跨膜结构域直接相邻的1到15、1到10、1到5、1到3、2或1个NDV HN蛋白胞外结构域的残基，和NDV的传染性物质的胞外结构域或其片段，由此融合蛋白可以功能性替代HN蛋白。
在某些实施方式中，NDV表面糖蛋白(即HN或者F蛋白)被提供NDV糖蛋白所需功能的融合蛋白所替代。根据这些实施方式，选择融合蛋白的胞外结构域由此其将提供替代的NDV糖蛋白的所需功能。在另一实施方式中，除天然NDV表面糖蛋白以外，融合蛋白表达并被结合入NDV病毒颗粒中。
在某些实施方式中，本发明的嵌合NDV的至少一个融合蛋白不包含异源蛋白的完整胞外结构域(例如，包含异源传染性物质的蛋白的胞外结构域的抗原性片段)，而且可能或者可能不进一步包含天然必需糖蛋白的一个或者多个胞外结构域的片段。相应地，在某些实施方式中，融合蛋白的胞外结构域可包含异源传染性物质的蛋白的胞外结构域的片段。在其它实施方式中，融合蛋白的胞外结构域可同时包含天然必需糖蛋白片段和异源传染性物质蛋白片段。在融合蛋白取代必需表面糖蛋白的实施方式中，表面糖蛋白的功能必须由融合蛋白提供，即融合蛋白必须展现出它替代的表面糖蛋白的功能。
如果无需用本章5.2描述的融合蛋白替代必需病毒糖蛋白的功能，融合蛋白的胞外结构域可对应于或者源自任何异源分子，包括但不仅限于，任何传染性物质抗原(包括，病毒、细菌和寄生虫传染性物质抗原)，以及任何疾病抗原。传染性物质抗原和疾病抗原的非限定性例子在下文5.3章提供。
本发明包含编码本章5.2描述的融合蛋白的核苷酸序列。在具体实施方式中，核苷酸序列包含编码Kozak序列的核酸，接着是基因末端、顺反子间区核苷酸(T)和NDV F蛋白基因起始序列，接着是H7N2的HA蛋白的5’非翻译区和ORF。
在优选实施方式中，用于本发明的NDV株是缓发型毒株，即这些病毒株典型地表现出低毒性或者对禽类感染后无征兆，例如，B1株、LaSota株或者Met95株。本发明还包含NDV的高毒性株的应用，例如，YG97或者F48E9或者已使用本领域已知的或本文例举的方法通过遗传重组改造的NDV株。在具体实施方式中，发明包含NDV的应用，其中NDV F蛋白已经在切割位点被遗传修饰从而提高了融合活性。在本发明的具体实施例中，经修饰的F蛋白包含位于F切割位点的两个或者三个氨基酸突变。替代骨架病毒的必需表面蛋白或者在病毒基因组引入编码融合蛋白的核苷酸序列可能减弱或进一步减弱生成的嵌合病毒，即相比野生型，嵌合病毒会展现出受损的复制能力。在本发明的某些实施方式中，嵌合病毒的减弱或进一步减弱是需要的，由此嵌合病毒至少部分保留了感染性并且可以在体内复制，但是只产生低滴度，导致非致病性的亚临床水平感染。这样的减毒嵌合病毒特别适用于本发明的实施方式，其中病毒作为免疫原如活体疫苗施用于个体。可以通过本领域已知的任何方法将病毒减毒。
5.3 可被工程改造进本发明的嵌合病毒的抗原
根据本发明，任何异源分子可以被工程改造进病毒骨架从而引发对所述分子的免疫应答。在具体实施方式中，任何传染性病原体的任何抗原或与能够引发免疫应答的疾病相关联的抗原可被工程改造进NDV和/或流感骨架病毒。在具体实施方式中，抗原是糖蛋白。在某些优选实施方式中，抗原能够功能性替代流感病毒和/或NDV的必需糖蛋白。在具体实施方式中，抗原展示神经氨酸酶或血凝素(例如，受体结合/融合性)活性。在选择表达抗原的病毒骨架时，考虑编码抗原的核苷酸的方向。例如，当抗原天然地通过其氨基末端锚定时，用来将融合蛋白工程改造的TM和CT域或者TM域就对应于骨架病毒或相关病毒的必需病毒蛋白的TM和CT域或TM域，它们也是天然通过氨基末端锚定的，例如，流感病毒N蛋白或者NDV的HN蛋白。
在具体实施方式中，病毒抗原被工程改造进NDV或者流感病毒骨架。病毒抗原的非限定性例子包括来自腺病毒科(如哺乳动物腺病毒属和禽腺病毒属)、疱疹病毒科(如单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、单纯疱疹病毒5、单纯疱疹病毒6、爱泼斯坦-巴尔病毒、HHV6-HHV8和细胞巨化病毒)、光滑病毒科(如光滑病毒、肠杆菌相MS2、别光滑病毒)、痘病毒科(如脊椎动物痘病毒亚科、副痘病毒属、禽痘病毒属、羊痘病毒属、兔痘病毒属、猪痘病毒属、软体动物痘病毒属、和昆虫痘病毒属)、乳多空病毒科(如多瘤病毒和乳头瘤病毒)、副粘病毒科(如副粘病毒属、副流感病毒1、运动病毒(如麻疹病毒)、腮腺炎病毒属(如腮腺炎病毒))肺炎病毒科(如肺炎病毒属、人类呼吸多核体病毒)、人类呼吸多核体病毒和多元肺炎病毒(如禽类肺炎病毒和人类多元肺炎病毒))、细小核糖核酸病毒(如肠道病毒、鼻病毒、肝病毒(如人类甲肝病毒)、心脏病毒、和牛口蹄疫病毒)、呼肠孤病毒科(如正呼肠孤病毒属、环状病毒属、轮状病毒属、质型多角体病毒属、矮缩病毒属、水稻病毒属、植物呼肠孤病毒属)、反向病毒科(例如哺乳动物B型反向病毒、哺乳动物C型反向病毒、禽类C型反向病毒、D型反向病毒组、BLV-HTLV反向病毒、慢病毒属(如人类免疫缺陷病毒1和人类免疫缺陷病毒2(例如HIV gp160)、泡沫病毒属)、黄病毒科(如丙肝病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒)、嗜肝DNA病毒科(如乙肝病毒)、披膜病毒科(如甲病毒(如油棉病毒)和风疹病毒(如风湿疹病毒))、棒状病毒科(如水疱病毒属、狂犬病毒属、弹状病毒属、植物棒状病毒A亚种、坏死棒状病毒)、沙砾病毒科(如沙砾病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、爱皮病毒、和拉沙病毒)、冠状病毒科(如冠状病毒和念状病毒)的抗原。在具体实施方式中，病毒抗原是HIV p120、HIV nef、RSV F糖蛋白、RSV G糖蛋白、流感病毒神经氨酸酶、流感病毒血凝素、HTLVtax、单纯疱疹病毒糖蛋白(如gB、gC、gD和gE)或者乙肝表面抗原、丙肝病毒E蛋白或者冠状病毒刺突蛋白。在某些实施方式中，病毒抗原不是gp41。在某些实施方式中，病毒抗原来自副粘病毒。在其它实施方式中，病毒抗原不来自副粘病毒。在某些实施方式中，病毒抗原来自人类帕拉丁流感病毒1、人类帕拉丁流感病毒3、RSV或者来自仙台病毒。在其它实施方式中，病毒抗原不来自人类帕拉丁流感病毒1、人类帕拉丁流感病毒3、RSV或者来自仙台病毒。在具体实施方式中，病毒骨架是流感病毒且被工程改造进流感病毒骨架的抗原不是流感抗原。在其它具体实施方式中，病毒骨架是NDV且被工程改造进NDV骨架的抗原不是NDV抗原。
在另一实施方式中，细菌抗原(如，细菌外壳蛋白或者所述细菌相关的保护性抗原)被工程改造进NDV或者流感病毒骨架。细菌抗原的非限定性例子包括来自水螺菌家族、固氮螺菌家族、固氮菌科家族、拟杆菌科家族、巴尔通体家族、蛭弧菌体家族、弯曲杆菌种、衣原体种(如肺炎衣原体)、梭菌、肠杆菌科家族(如柠檬酸杆菌种、爱德华氏菌属、产气肠杆菌、欧文氏菌属、大肠杆菌、蜂窝哈夫尼亚菌种、克雷白氏菌噬菌体种、摩尔根氏菌种、寻常变形杆菌、普罗威登斯菌属、沙门氏菌、灵杆菌、弗累克斯讷氏杆菌)、嘉丁氏菌家族、流感嗜血杆菌、嗜盐菌科家族、螺旋菌家族、军团菌科家族、李氏杆菌种、甲基球菌科家族、分枝菌(如结核杆菌)、奈瑟氏菌科家族、海洋螺旋菌家族、巴斯德氏菌科家族、肺炎球菌种、假单孢菌种、根瘤菌家族、螺旋菌家族、螺旋小体科家族、葡萄球菌(如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和柠檬色酿脓葡萄球菌)、链球菌(如肠炎链球菌、粪链球菌、链球菌肺炎)、蝙蝠弧螺旋菌家族、耶尔森氏菌家族、戴文氏杆菌和蝙蝠弧菌家族的细菌的抗原。
在其它实施方式中，寄生虫(如原生动物)相关保护性抗原被工程改造进NDV或者流感病毒骨架。任何寄生虫相关抗原或者寄生虫(如原生动物)保护性抗原可被用于本发明的方法。寄生虫抗原的非限定性例子包括来自寄生虫如阿米巴虫、疟原虫、变形体、克氏锥虫的抗原。
在另一实施方式中，真菌抗原被工程改造进NDV或者流感病毒骨架。真菌抗原的非限定性例子包括来自犁头霉菌种(如伞支犁头霉和分支犁头霉)、曲霉种(如黄曲霉、烟曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、土曲霉)蛙粪霉、皮炎芽生菌、假丝酵母种(如白色念珠菌、光滑假丝酵母、科尔假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、近平滑假丝酵母、假热带念珠菌、季也蒙假丝酵母、皱落假丝酵母、类星形念珠菌、热带假丝酵母)、粗球孢子菌、耳霉属、新生隐球菌、小克银汉霉菌种、皮霉癣菌、荚膜组织胞浆菌、石膏样小孢子菌、渺小毛霉菌、巴西芽生菌、波氏假阿利什霉、鼻孢子菌、卡氏肺囊虫、酒曲菌属种(如少根根霉、米根霉、小孢根霉菌)、酵母菌种、孢子丝菌属、接合菌亚纲、和纲例如接合菌亚纲、子囊菌类、担子菌类、知菌纲和卵菌纲的真菌的抗原。
在另一实施方式中，肿瘤相关抗原被工程改造进NDV或者流感病毒骨架。本领域熟知的任何肿瘤相关抗原可被用于根据本发明的方法。肿瘤相关抗原的非限定性例子包括MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、N-乙酰葡萄糖胺-V、p-15、MART-1/MelanA、TRP-1(gp75)、酪氨酸酶、细胞周期蛋白依赖性激酶4、β-连接素、MUM-1、CDK4、HER-2/neu、人类乳头瘤病毒-E6、人类乳头瘤病毒-E7、半胱氨酸蛋白酶-8、CD5、CD20、CEA、粘蛋白-1、Lewisx、CA-125、表皮生长因子受体、p185HER2、IL-2R、Fap-α、肌糖蛋白、金属蛋白酶相关抗原、和CAMPATH-1。
5.4 本发明嵌合病毒的构建和增殖
可以使用反向遗传技术生成本发明的嵌合病毒。反向遗传技术涉及合成重组病毒RNA的制备，该RNA包含负链的非编码区，对病毒聚合酶识别和生成成熟病毒颗粒所需的包装信号而言必需的病毒RNA。重组RNA从重组DNA模板合成并在体外使用纯化的病毒聚合酶复合体重新构建从而形成可被用于转染细胞的重组核糖核蛋白(RNP)。如果在合成RNA的体外或体内转录中存在病毒聚合酶蛋白，将实现更有效的转染。合成的重组RNP可被捕获进传染病毒颗粒。前述技术描述于1992年11月24日授权的美国专利号5,166,057；1998年12月29日授权的美国专利号5,854,037；1996年2月20日公开的欧洲专利公开文本EP0702085A1；美国专利申请序列号09/152，845；1997年4月3日公开的国际专利公开本文PCT WO97/12032；1996年11月7日公开的WO96/34625；欧洲专利公开文本EP A780475；1999年1月21日公开的WO99/12032；1998年11月26日公开的WO98/53078；1998年1月22日公开的WO98/02530；1999年4月1日公开的WO99/15672；1998年4月2日公开的WO98/13501；1997年2月20日公开的WO97/06270；和1997年6月25日公开的EPO780475A1，各文献的内容均完整引入本文作为参考。
无辅助质粒技术也可被用来工程改造本发明的嵌合病毒。简单说，相对于流感病毒，病毒片段全长cDNA通过使用具有独特酶切位点的引物通过PCR扩增，可以使PCR产物插入到到质粒载体中(Flandorfer等，2003，J.Virol.77：9116-9123；Nakaya等，2001，J.Virol.75：11868-11873；两者均完整引入本文作为参考)。设计质粒载体以将PCR产物置于截断的人RNA聚合酶I启动子和丁型肝炎核酶序列之间，由此从聚合酶I启动子生成准确的负性(vRNA义)转录物。包含各病毒片段的独立质粒载体和包含必需病毒蛋白的表达载体被转染到细胞中，导致重组病毒颗粒的生成。无辅助质粒技术的详细描述参见，例如国际公开号WO01/04333；美国专利号6,649,372；Fodor等，1999，J.Virol.73：9679-9682；Hoffmann等，2002，Proc.Natl.Acad.Sci.96：9345-9350，各文献均完整引入本文作为参考。相似地，关于NDV的单个节段基因组，完整的希契纳B1株cDNA被构建，插入到质粒载体并工程改造以在P和M基因之间包含独特酶切位点。根据本发明工程改造的融合蛋白可在独特酶切位点被插入病毒基因组。单个片段被置于T7启动子和丁型肝炎核酶之间由此从T7聚合酶生成精确的负转录物。质粒载体和包含必需病毒蛋白的表达载体被转染入细胞中从而产生重组病毒颗粒(参见，Swayne等，2003，Avian Dis.47：1047-1050和Swayne等，2001，J.Virol.11868-11873，各文献均完整引入本文作为参考)。
本发明的嵌合流感病毒可经工程改造以包含是双顺反子的RNA片段。双顺反子技术通过使用IRES序列使得多个蛋白的编码序列可被工程改造进单个mRNA中。IRES序列指引核糖体向RNA分子的内部募集并使以帽非依赖性方式进行下游翻译。简单说，一个蛋白的编码区插入到第二个蛋白的ORF中。插入物两侧是IRES和任何实现正常表达和/或功能的所需的非翻译信号序列。插入必须不破坏开放阅读框、多聚腺苷酸化或者第二个蛋白的转录启动子(参见，如，Garcia-Sastre等，1994，J.Virol.68：6254-6261和Garcia-Sastre等，1994 Dev.Biol.Stand.82：237-246)，各文献均被完整引入本文作为参考。
5.4.1 嵌合病毒的增殖
本发明的嵌合流感病毒可以在任何基质中增殖，该基质允许病毒生长到实现本文所述的嵌合病毒的用途的滴度。在一实施方式中，基质允许嵌合病毒生长到可与相应的野生型病毒确定的滴度相当的滴度。在具体实施方式中，本发明的减毒嵌合病毒在IFN缺陷型基质中增殖。
本发明的嵌合病毒可以生长在细胞中(如，鸟类细胞、鸡细胞等)，此类细胞易于被病毒、胚卵或者动物(如鸟)感染。这些方法是本领域技术人员已知的。在具体实施方式中，用于增殖具有减弱的拮抗干扰素活性的减毒流感病毒的细胞是IFN-缺陷型。在一实施方式中，本发明的嵌合禽病毒在鸡细胞或者胚卵中增殖。代表性鸡细胞包括但不仅限于鸡胚纤维细胞或者鸡胚肾细胞。
本发明嵌合病毒可以在胚卵中增殖，如6到14天大的胚卵。初期或者未成熟的胚卵可被用于增殖本发明的减毒嵌合流感病毒。未成熟胚卵包括小于十天卵龄的卵，如6到9天的卵，其是INF缺陷型。未成熟的胚卵还包含人工模拟的未成熟卵，其直至但小于十天卵龄，通过生长环境的改变产生，如，孵卵温度的改变；药物处理；或者任何其它能导致卵发育迟缓的方法，从而使IFN系统相比十天或者十二天卵龄的卵没有发育完全。本发明的嵌合病毒可以在不同的胚卵区域增殖，如尿囊腔。关于病毒生长和增殖的详细讨论，尤其是具有减弱的拮抗干扰素活性的减毒流感病毒，参见，如美国专利号6,852,522和美国专利号6,852,522，两者均被完整引入本文作为参考。
关于病毒分离，典型地通过已知的纯化方法，如梯度离心和柱层析法，将嵌合病毒从细胞培养物中移出并从细胞组分中分离，且根据需要通过本领域技术人员已知的方法如空斑分析进一步纯化。
5.5 嵌合病毒的应用
本发明的嵌合病毒可以用于个体的自动免疫。在一方面，本发明嵌合病毒可以用来预防、控制或治疗一或者多种疾病。在具体的方面，本发明的嵌合病毒可以用来预防、控制和/或治疗两种传染性物质造成的感染。关于免疫原性制剂和这些制剂在诱导个体免疫应答中的应用的描述参见5.5.1章。本发明的嵌合病毒还可以用来制备抗体，其可被用于诊断免疫分析、被动免疫疗法和产生抗独特型抗体。例如，包含具有非流感病毒的传染性物质的胞外结构域的融合蛋白的嵌合病毒可被施用给个体(如小鼠、大鼠、猪、马、驴、鸟或者人)来产生针对流感骨架和传染性物质的抗体，这些抗体随后可被分离并应用于诊断免疫分析、被动免疫疗法和产生抗独特型抗体。产生的抗原可以使用本领域熟知的标准技术分离(如免疫亲和层析法、离心法、沉淀法等)并被用于诊断免疫分析、被动免疫疗法和产生抗独特型抗体。分离的抗体在被应用于被动免疫疗法之前可以被修饰，如抗体可以被嵌合或者人源化。关于生成嵌合和人源化抗体的综述，参见如美国专利号4,444,887和4,716,111；和国际公开号WO98/46645、WO98/50433、WO98/24893、WO98/16654、WO96/34096、WO96/33735和WO91/10741，各文献均被完整引入本为作为参考。
关于由嵌合病毒产生的用于被动免疫疗法的抗体，施用给个体的剂量通常为0.0001mg/kg到100mg/kg患者体重。优选地，施用给患者的剂量为0.0001mg/kg到20mg/kg、0.0001mg/kg到10mg/kg、0.0001mg/kg到5mg/kg、0.0001mg/kg到2mg/kg、0.0001mg/kg到1mg/kg、0.0001mg/kg到0.75mg/kg、0.0001mg/kg到0.5mg/kg、0.0001mg/kg到0.25mg/kg、0.0001mg/kg到0.15mg/kg、0.0001mg/kg到0.10mg/kg、0.001mg/kg到0.5mg/kg、0.01到0.25mg/kg或者0.01到0.10mg/kg个体体重。本发明包含的抗体可以和其它用于传染性疾病或病症或其症状的免疫获得或治疗、控制或预防的预防性或者治疗性组合物一同施用。施用本发明的抗体剂量可以通过弹丸注射或者更慢地通过IV提供(如经过约5分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约1小时、约2小时、约4小时、或者约6小时)。本发明的抗体剂量也可以在疗程中(如2周、1个月、2个月、4个月、6个月、8个月、10个月、12个月、16个月、20个月、或者24个月或者更长)重复(如每天、每2天、每3天、每周、每2周、每3周、每6周、每9周、每12周、每4个月、每6个月、每12个月、每18个月、或每2年)。在某些实施方式中，本发明的嵌合病毒产生的抗体通过肠道外施用，如静脉内、肌肉内或者皮下施用，或者通过口服或者鼻内施用。本发明包含的抗体还可以作为缓稀制剂施用。
从施用了本发明嵌合病毒的个体中分离的抗体还可被用于监控治疗和/或疾病进展。本领域已知的任何免疫分析系统可以被用于此目的，包括但不限于竞争性或者非竞争性分析系统，其使用技术如放射免疫分析、ELISA(酶联免疫吸附分析)、“三明治”免疫分析、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散分析、凝集分析、补体结合分析、免疫放射分析、荧光免疫分析、蛋白A免疫分析和免疫电泳分析等。
本发明的嵌合病毒产生的抗体还可被用来产生抗独特型抗体。抗独特型抗体可随后用于免疫，从而产生结合嵌合病毒初始抗原的抗体亚群(Jerne，1974，Ann.Immunol.(Paris)125c：373；Jerne等，1982，EMBO J.1：234)。
在免疫过程中，将被使用的免疫原量和免疫程序表由本领域熟练的医师决定并且参考个体免疫应答和抗体滴度施用。
5.5.1 免疫原性制剂
本发明还包含本发明嵌合病毒在免疫原性制剂中的应用，如疫苗制剂。当免疫原性制剂包含嵌合流感病毒时，该制剂可被用于预防、控制、中和、治疗和/或改良流感病毒感染和/或由其它传染性物质和/或者疾病引发的感染的方法。当免疫原性制剂包含嵌合NDV时，该制剂可被用于预防、控制、中和、治疗和/或改良NDV感染、由其它传染性物质和/或疾病引发的感染。
免疫原性制剂可以包含活的或者失活的本发明的嵌合病毒。嵌合病毒可以通过本领域技术人员已知的方法灭活。一般方法使用福尔马林或者加热来灭活。参见如美国专利号6,635,246，其内容完整引入本文作为参考。其它方法包含在美国专利号5,891,705；5,106,619和4,693,981中描述的方法，这些文献均完整引入本文作为参考。
活的免疫原性制剂是优选的因为在个体内的复制会导致和天然感染中发生的相似种类和量级的延长的刺激，因此产生实质性的、持久的免疫性。这些活的重组免疫原性制剂的制备可以通过使用传统方法完成，方法包括嵌合病毒在细胞培养或者胚卵(如鸡胚卵)中增殖并随后纯化。此外，嵌合病毒可以诱发强有力的IFN应答，会在体内导致其它的生物学结果，即产生抗后续感染的保护作用。
在优选实施方式中，本发明的免疫原性制剂包含有效量的本发明的嵌合病毒和药学可接受的载体。术语“药学可接受的”指被联邦或州政府的管理机构批准或被美国药典或者其它普通公认的药典列为可用于动物，甚至尤其是人类。术语“载体”指与药物组合物(如免疫原性或者疫苗制剂)一同施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或运载体。盐溶液和葡萄糖和甘油水溶液也可以作为液体载体，尤其是作为可注射性溶液。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽糖、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸纳、单硬脂酸甘油酯、云母、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。合适的药学载体的例子在E.W.Martin的“Remington’s Pharmaceutical Sciences”中有描述。制剂应当适合施用的方式。具体制剂可能还取决于嵌合病毒是否是活的或被灭活的。
本发明免疫原性制剂可以施用于朴素个体(naive subject)，即无病或以前没有且现在也没有被一或者两种传染性物质感染的个体。在一实施方式中，将免疫原性制剂施用于朴素个体，即无病或者以前没有且现在也没被一或两种传染性物质感染，但是有获得这种疾病(如病毒感染)的风险的个体。在一实施方式中，本发明的免疫原性制剂被施用给个体，该个体没有患病，或者以前且现在都没有被传染性物质之一感染，嵌合病毒诱导针对该传染性物质的免疫应答。在另一实施方式中，本发明的免疫制剂被施用给个体，该个体以前且现在都没有被两种传染性物质感染，嵌合病毒诱导针对这两种传染性物质的免疫应答。本发明的免疫原性制剂还可以施用给个体，该个体正在或已经被传染性物质的一种或者两者或者另一类型、亚型或株的物质感染，嵌合病毒诱发针对它们的免疫应答。
很多方法可被用于引入免疫原性制剂，如上文描述的疫苗制剂，它们包括但不限于鼻内、气管内、口服、皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、结膜和皮下途径。在鸟中，方法可进一步包括鼻后孔接种法。作为肠胃外给药的替换，本发明还包括用于农业目的的大量施用途径如通过饮用水或者喷雾。通过野生型病毒感染的天然途径引入嵌合流感病毒免疫原性制剂可能是优选的。或者，通过获得融合蛋白的物质的感染天然途径引入本发明的嵌合病毒可能是优选的。嵌合病毒引发强分泌和细胞免疫应答的能力可被有利地利用。例如，嵌合病毒通过呼吸道的感染可引发强烈的分泌免疫应答，如泌尿系统，伴随抗特定致病物质的保护作用。此外，在优选实施方式中，希望通过任何合适途径将本发明的药物制剂引入肺中。肺部施用也可以被采用，例如使用吸入器或者喷雾器，且具有雾化剂的制剂用作喷雾。
在某些实施方式中，本发明的免疫原性制剂不导致对感染(如病毒感染或者非病毒传染性物质的感染)的完全保护，但相对于未经治疗的个体可以导致病原体(如病毒)较低的滴度或减少的数量。在某些实施方式中，相对于未经治疗的个体，本发明的免疫原性制剂的施用导致0.5倍、1倍、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、15倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、125倍、150倍、175倍、200倍、300倍、400倍、500倍、750倍、或者1000倍或者更大程度的病原体滴度的降低。病原体滴度、数量或者总负荷减低的益处包括但不限于感染症状的严重程度降低和与感染相关的疾病或病症期的长度缩短。
在某些实施方式中，本发明的免疫原性制剂被用于在朴素个体中针对疾病(如感染)进行保护。在具体实施方式中，本发明的免疫原性抗体被用于针对流感病毒或者至少一种不是流感病毒的其它传染性物质引发的感染进行保护或者针对在朴素个体中感染相关的疾病或症状进行保护。在其它实施方式中，本发明的免疫原性制剂被用来针对NDV和/或至少一个其它传染性物质进行保护和/或针对在朴素个体中与之相关的疾病或症状进行保护。这些其它的传染性物质的非限定性例子是乳头状瘤病毒、疱疹病毒、逆转录病毒(如HIV)、肝炎病毒、鼻病毒、呼吸性合胞病毒、NDV、细胞巨化病毒、腺病毒、梭菌属、沙门氏菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、弧菌属、大肠杆菌、马链球菌、肺炎支原体、肺炎克雷白杆菌、和绿脓假单胞菌、和刚果嗜皮菌或者原生动物如阿米巴虫、疟原虫或锥体虫。
本发明的免疫原性制剂的预防和/或治疗效果部分基于获得或者引发免疫应答(如体液免疫应答)。一方面，在个体或者其动物模型中(如，小鼠、大鼠或者犬科模型)，免疫原性制剂针对嵌合病毒抗原引发可检测的抗体血清滴度。抗体血清滴度可使用本领域技术人员已知的技术确定，如免疫分析法例如ELISA。在一实施方式中，抗体特异性地结合至少一个融合蛋白的抗原，即与传染性物质或疾病相关的引入蛋白的胞外结构域的抗原。在具体实施方式中，通过施用本发明的免疫原性制剂产生的抗体是中和抗体。
在一实施方式中，本发明的嵌合病毒向个体或者其动物模型的施用导致特异性结合嵌合病毒骨架的抗原的抗体的血清滴度为约1微克/毫升、约2微克/毫升、约5微克/毫升、约6微克/毫升、约10微克/毫升、约15微克/毫升、约20微克/毫升、约25微克/毫升、约50微克/毫升、约75微克/毫升、约100微克/毫升、约125微克/毫升、约150微克/毫升、约175微克/毫升、约200微克/毫升、约225微克/毫升、约250微克/毫升、约275微克/毫升、或约300微克/毫升或更多。在其它实施方式中，本发明嵌合病毒向个体或者其动物模型的施用导致特异性结合融合蛋白抗原(即与传染性物质或疾病相关的引入蛋白的胞外结构域的抗原)的抗体血清滴度为约1微克/毫升、约2微克/毫升、约5微克/毫升、约6微克/毫升、约10微克/毫升、约15微克/毫升、约20微克/毫升、约25微克/毫升、约50微克/毫升、约75微克/毫升、约100微克/毫升、约125微克/毫升、约150微克/毫升、约175微克/毫升、约200微克/毫升、约225微克/毫升、约250微克/毫升、约275微克/毫升、或约300微克/毫升或更多。优选地，在施用本发明的免疫原性制剂的第一剂后约20天(优选25、30、35或40天)且不再施用任何其它剂量的制剂时实现这些抗体的约1微克/毫升、约2微克/毫升、约5微克/毫升、约6微克/毫升、约10微克/毫升、约15微克/毫升、约20微克/毫升、约25微克/毫升、约50微克/毫升、约75微克/毫升、约100微克/毫升、约125微克/毫升、约150微克/毫升、约175微克/毫升、约200微克/毫升、约225微克/毫升、约250微克/毫升、约275微克/毫升、或约300微克/毫升或更多的血清滴度。可以在个体或者动物模型中确定免疫应答，该应答随后与在个体(如人)中预期的应答相关联或外推出预期应答。
在一实施方式中，本发明提供了在个体中预防至少一种疾病(如流感感染和/或非流感的另一传染性物质的感染)的方法，该方法包含对所述个体施用第一剂有效量的免疫原性制剂，该制剂包含本发明的嵌合流感病毒，该嵌合病毒包含异源序列(如疾病抗原)的融合蛋白，其中该有效量是导致免疫特异性结合嵌合病毒骨架的抗原或者抗原决定簇的抗体的血清滴度在首次施用后2天、5天、10天、15天、20天或者优选30天且在任何后继施用前达到约10微克/毫升、约20微克/毫升、约30微克/毫升、约40微克/毫升、约50微克/毫升、约60微克/毫升、约70微克/毫升、约80微克/毫升、约100微克/毫升或者更多的量。在另一实施方式中，本发明提供了在个体中预防至少一种疾病(如流感感染和/或非流感的另一传染性物质的感染)的方法，该方法包含对所述个体施用第一剂有效量的免疫原性制剂，该制剂包含本发明的嵌合流感病毒，该嵌合病毒包含异源序列(如疾病抗原)的融合蛋白，其中该有效量是导致免疫特异性结合融合蛋白的抗原(即与疾病相关的引入蛋白的胞外结构域的抗原)的抗体的血清滴度在首次施用后2天、5天、10天、15天、20天或者优选30天且在任何后继施用前达到约10微克/毫升、约20微克/毫升、约30微克/毫升、约40微克/毫升、约50微克/毫升、约60微克/毫升、约70微克/毫升、约80微克/毫升、约100微克/毫升或者更多的量。可以在个体或者动物模型中确定免疫应答，该应答随后与在个体(如人)中预期的应答相关联或外推出预期应答。在一实施方式中，本发明提供了在鸟类中预防禽流感感染和/或非禽流感的另一传染性物质的感染的方法，该方法包含对所述个体施用第一剂有效量的本发明的嵌合鸟类病毒的免疫原性制剂，该制剂包含本发明的嵌合禽流感病毒，该嵌合禽病毒包含含有异源蛋白序列的融合蛋白，其中该有效量是导致免疫特异性结合嵌合病毒的抗原的抗体和/或特异性结合融合蛋白的抗原的抗体的血清滴度在首次施用后2天、5天、10天、15天、20天或者优选30天且在任何后继施用前达到约10微克/毫升、约20微克/毫升、约30微克/毫升、约40微克/毫升、约50微克/毫升、约60微克/毫升、约70微克/毫升、约80微克/毫升、约100微克/毫升或者更多的量。在一些实施方式中，施用给个体或动物模型的嵌合流感病毒的剂量是102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011、1012pfu。
在一实施方式中，本发明提供了在个体中治疗至少一种疾病(如流感感染和/或非流感的另一传染性物质的感染)的方法，该方法包含对所述个体施用第一剂有效量的免疫原性制剂，该制剂包含本发明的嵌合流感病毒，该嵌合病毒包含异源序列(如疾病抗原)的融合蛋白，其中该有效量是导致免疫特异性结合嵌合病毒骨架的抗原或者抗原决定簇的抗体的血清滴度在首次施用后2天、5天、10天、15天、20天或者优选30天且在任何后继施用前达到约10微克/毫升、约20微克/毫升、约30微克/毫升、约40微克/毫升、约50微克/毫升、约60微克/毫升、约70微克/毫升、约80微克/毫升、约100微克/毫升或者更多的量。在另一实施方式中，本发明提供了在个体中治疗至少一种疾病(如流感感染和/或非流感的另一传染性物质的感染)的方法，该方法包含对所述个体施用第一剂有效量的免疫原性制剂，该制剂包含本发明的嵌合流感病毒，该嵌合病毒包含异源序列(如疾病抗原)的融合蛋白，其中该有效量是导致免疫特异性结合融合蛋白的抗原(即与疾病相关的引入蛋白的胞外结构域的抗原)的抗体的血清滴度在首次施用后2天、5天、10天、15天、20天或者优选30天且在任何后继施用前达到约10微克/毫升、约20微克/毫升、约30微克/毫升、约40微克/毫升、约50微克/毫升、约60微克/毫升、约70微克/毫升、约80微克/毫升、约100微克/毫升或者更多的量。可以在个体或者动物模型中确定免疫应答，该应答随后与在个体(如人)中预期的应答相关联或外推出预期应答。在一实施方式中，本发明提供了在鸟类中治疗禽流感感染和/或非禽流感的另一传染性物质的感染的方法，该方法包含对所述个体施用第一剂有效量的本发明的嵌合鸟类病毒的免疫原性制剂，该制剂包含本发明的嵌合禽流感病毒，该嵌合禽病毒包含含有异源蛋白序列的融合蛋白，其中该有效量是导致免疫特异性结合嵌合病毒的抗原的抗体和/或特异性结合融合蛋白的抗原的抗体的血清滴度在首次施用后2天、5天、10天、15天、20天或者优选30天且在任何后继施用前达到约10微克/毫升、约20微克/毫升、约30微克/毫升、约40微克/毫升、约50微克/毫升、约60微克/毫升、约70微克/毫升、约80微克/毫升、约100微克/毫升或者更多的量。在一些实施方式中，施用给个体或动物模型的嵌合流感病毒的剂量是102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011、1012pfu。
在一实施方式中，本发明提供了在个体中控制和/或缓解至少一种疾病(如流感感染和/或非流感的另一传染性物质的感染)的方法，该方法包含对所述个体施用第一剂有效量的免疫原性制剂，该制剂包含本发明的嵌合流感病毒，该嵌合病毒包含异源序列(如疾病抗原)的融合蛋白，其中该有效量是导致免疫特异性结合嵌合病毒骨架的抗原或者抗原决定簇的抗体的血清滴度在首次施用后2天、5天、10天、15天、20天或者优选30天且在任何后继施用前达到约10微克/毫升、约20微克/毫升、约30微克/毫升、约40微克/毫升、约50微克/毫升、约60微克/毫升、约70微克/毫升、约80微克/毫升、约100微克/毫升或者更多的量。在另一实施方式中，本发明提供了在个体中控制和/或缓解至少一种疾病(如流感感染和/或非流感的另一传染性物质的感染)的方法，该方法包含对所述个体施用第一剂有效量的免疫原性制剂，该制剂包含本发明的嵌合流感病毒，该嵌合病毒包含异源序列(如疾病抗原)的融合蛋白，其中该有效量是导致免疫特异性结合融合蛋白的抗原(即与疾病相关的引入蛋白的胞外结构域的抗原)的抗体的血清滴度在首次施用后2天、5天、10天、15天、20天或者优选30天且在任何后继施用前达到约10微克/毫升、约20微克/毫升、约30微克/毫升、约40微克/毫升、约50微克/毫升、约60微克/毫升、约70微克/毫升、约80微克/毫升、约100微克/毫升或者更多的量。可以在个体或者动物模型中确定免疫应答，该应答随后与在个体(如人)中预期的应答相关联或外推出预期应答。在一实施方式中，本发明提供了在鸟类中控制和/或缓解禽流感感染和/或非禽流感的另一传染性物质的感染的方法，该方法包含对所述个体施用第一剂有效量的本发明的嵌合鸟类病毒的免疫原性制剂，该制剂包含本发明的嵌合禽流感病毒，该嵌合禽病毒包含含有异源蛋白序列的融合蛋白，其中该有效量是导致免疫特异性结合嵌合病毒的抗原的抗体和/或特异性结合融合蛋白的抗原的抗体的血清滴度在首次施用后2天、5天、10天、15天、20天或者优选30天且在任何后继施用前达到约10微克/毫升、约20微克/毫升、约30微克/毫升、约40微克/毫升、约50微克/毫升、约60微克/毫升、约70微克/毫升、约80微克/毫升、约100微克/毫升或者更多的量。在一些实施方式中，施用给个体或动物模型的嵌合流感病毒的剂量是102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011、1012pfu。
在一实施方式中，本发明提供了在个体中预防至少一种疾病(如NDV感染和/或非NDV的另一传染性物质的感染)的方法，该方法包含对所述个体施用第一剂有效量的免疫原性制剂，该制剂包含本发明的嵌合NDV，该嵌合病毒包含异源序列(如疾病抗原)的融合蛋白，其中该有效量是导致免疫特异性结合嵌合病毒骨架的抗原或者抗原决定簇的抗体的血清滴度在首次施用后2天、5天、10天、15天、20天或者优选30天且在任何后继施用前达到约10微克/毫升、约20微克/毫升、约30微克/毫升、约40微克/毫升、约50微克/毫升、约60微克/毫升、约70微克/毫升、约80微克/毫升、约100微克/毫升或者更多的量。在另一实施方式中，本发明提供了在个体中预防至少一种疾病(如NDV感染和/或非NDV的另一传染性物质的感染)的方法，该方法包含对所述个体施用第一剂有效量的免疫原性制剂，该制剂包含本发明的嵌合NDV，该嵌合病毒包含异源序列(如疾病抗原)的融合蛋白，其中该有效量是导致免疫特异性结合融合蛋白的抗原(即与疾病相关的引入蛋白的胞外结构域的抗原)的抗体的血清滴度在首次施用后2天、5天、10天、15天、20天或者优选30天且在任何后继施用前达到约10微克/毫升、约20微克/毫升、约30微克/毫升、约40微克/毫升、约50微克/毫升、约60微克/毫升、约70微克/毫升、约80微克/毫升、约100微克/毫升或者更多的量。可以在个体或者动物模型中确定免疫应答，该应答随后与在个体(如人)中预期的应答相关联或外推出预期应答。在一实施方式中，本发明提供了在鸟类中预防NDV感染和/或非NDV的另一传染性物质的感染的方法，该方法包含对所述个体施用第一剂有效量的本发明的嵌合病毒的免疫原性制剂，该制剂包含本发明的嵌合NDV，该嵌合NDV包含含有异源蛋白序列的融合蛋白，其中该有效量是导致免疫特异性结合嵌合病毒的抗原的抗体和/或特异性结合融合蛋白的抗原的抗体的血清滴度在首次施用后2天、5天、10天、15天、20天或者优选30天且在任何后继施用前达到约10微克/毫升、约20微克/毫升、约30微克/毫升、约40微克/毫升、约50微克/毫升、约60微克/毫升、约70微克/毫升、约80微克/毫升、约100微克/毫升或者更多的量。在一些实施方式中，施用给个体或动物模型的嵌合流感病毒的剂量是102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011、1012pfu。
在一实施方式中，本发明提供了在个体中治疗至少一种疾病(如NDV感染和/或非NDV的另一传染性物质的感染)的方法，该方法包含对所述个体施用第一剂有效量的免疫原性制剂，该制剂包含本发明的嵌合NDV，该嵌合病毒包含异源序列(如疾病抗原)的融合蛋白，其中该有效量是导致免疫特异性结合嵌合病毒骨架的抗原或者抗原决定簇的抗体的血清滴度在首次施用后2天、5天、10天、15天、20天或者优选30天且在任何后继施用前达到约10微克/毫升、约20微克/毫升、约30微克/毫升、约40微克/毫升、约50微克/毫升、约60微克/毫升、约70微克/毫升、约80微克/毫升、约100微克/毫升或者更多的量。在另一实施方式中，本发明提供了在个体中治疗至少一种疾病(如NDV感染和/或非NDV的另一传染性物质的感染)的方法，该方法包含对所述个体施用第一剂有效量的免疫原性制剂，该制剂包含本发明的嵌合NDV，该嵌合病毒包含异源序列(如疾病抗原)的融合蛋白，其中该有效量是导致免疫特异性结合融合蛋白的抗原(即与疾病相关的引入蛋白的胞外结构域的抗原)的抗体的血清滴度在首次施用后2天、5天、10天、15天、20天或者优选30天且在任何后继施用前达到约10微克/毫升、约20微克/毫升、约30微克/毫升、约40微克/毫升、约50微克/毫升、约60微克/毫升、约70微克/毫升、约80微克/毫升、约100微克/毫升或者更多的量。可以在个体或者动物模型中确定免疫应答，该应答随后与在个体(如人)中预期的应答相关联或外推出预期应答。在一实施方式中，本发明提供了在鸟类中治疗NDV感染和/或非NDV的另一传染性物质的感染的方法，该方法包含对所述个体施用第一剂有效量的本发明的嵌合病毒的免疫原性制剂，该制剂包含本发明的嵌合NDV，该嵌合NDV包含含有异源蛋白序列的融合蛋白，其中该有效量是导致免疫特异性结合嵌合病毒的抗原的抗体和/或特异性结合融合蛋白的抗原的抗体的血清滴度在首次施用后2天、5天、10天、15天、20天或者优选30天且在任何后继施用前达到约10微克/毫升、约20微克/毫升、约30微克/毫升、约40微克/毫升、约50微克/毫升、约60微克/毫升、约70微克/毫升、约80微克/毫升、约100微克/毫升或者更多的量。在一些实施方式中，施用给个体或动物模型的嵌合流感病毒的剂量是102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011、1012pfu。
在一实施方式中，本发明提供了在个体中控制和/或缓解至少一种疾病(如NDV感染和/或非NDV的另一传染性物质的感染)的方法，该方法包含对所述个体施用第一剂有效量的免疫原性制剂，该制剂包含本发明的嵌合NDV，该嵌合病毒包含异源序列(如疾病抗原)的融合蛋白，其中该有效量是导致免疫特异性结合嵌合病毒骨架的抗原或者抗原决定簇的抗体的血清滴度在首次施用后2天、5天、10天、15天、20天或者优选30天且在任何后继施用前达到约10微克/毫升、约20微克/毫升、约30微克/毫升、约40微克/毫升、约50微克/毫升、约60微克/毫升、约70微克/毫升、约80微克/毫升、约100微克/毫升或者更多的量。在另一实施方式中，本发明提供了在个体中控制和/或缓解至少一种疾病(如NDV感染和/或非NDV的另一传染性物质的感染)的方法，该方法包含对所述个体施用第一剂有效量的免疫原性制剂，该制剂包含本发明的嵌合NDV，该嵌合病毒包含异源序列(如疾病抗原)的融合蛋白，其中该有效量是导致免疫特异性结合融合蛋白的抗原(即与疾病相关的引入蛋白的胞外结构域的抗原)的抗体的血清滴度在首次施用后2天、5天、10天、15天、20天或者优选30天且在任何后继施用前达到约10微克/毫升、约20微克/毫升、约30微克/毫升、约40微克/毫升、约50微克/毫升、约60微克/毫升、约70微克/毫升、约80微克/毫升、约100微克/毫升或者更多的量。可以在个体或者动物模型中确定免疫应答，该应答随后与在个体(如人)中预期的应答相关联或外推出预期应答。在一实施方式中，本发明提供了在鸟类中控制和/或缓解NDV感染和/或非NDV的另一传染性物质的感染的方法，该方法包含对所述个体施用第一剂有效量的本发明的嵌合病毒的免疫原性制剂，该制剂包含本发明的嵌合NDV，该嵌合NDV包含含有异源蛋白序列的融合蛋白，其中该有效量是导致免疫特异性结合嵌合病毒的抗原的抗体和/或特异性结合融合蛋白的抗原的抗体的血清滴度在首次施用后2天、5天、10天、15天、20天或者优选30天且在任何后继施用前达到约10微克/毫升、约20微克/毫升、约30微克/毫升、约40微克/毫升、约50微克/毫升、约60微克/毫升、约70微克/毫升、约80微克/毫升、约100微克/毫升或者更多的量。在一些实施方式中，施用给个体或动物模型的嵌合流感病毒的剂量是102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011、1012pfu。
本发明还提供了预防、治疗和/或控制至少一种疾病的方法，该方法包含对所述个体施用有效量的免疫原性制剂，该制剂包含本发明的嵌合流感病毒，其中该有效量是导致相比于没有施用本发明的免疫原性制剂的个体而言致死率降低、入院率降低、疾病严重程度降低和/或疾病临床症状减轻的量。在某些实施方式中，该个体是人。在一些实施方式中，施用给个体的嵌合流感病毒的剂量是102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011、1012pfu。
在另一实施方式中，本发明提供了在个体中(优选鸟类)预防、治疗和/或控制至少一种疾病(如禽流感感染和/或非禽流感的另一传染性物质的感染)的方法，该方法包含对所述个体施用有效量的免疫原性制剂，该制剂包含本发明的嵌合禽流感病毒，其中该有效量是导致相比于没有施用本发明的免疫原性制剂的个体而言传染性物质的滴度或数量减少、致死率降低、入院率降低、感染严重程度降低和/或感染临床症状减轻的量。在一些实施方式中，施用给个体的嵌合禽流感病毒的剂量是102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011、1012pfu。在某些实施方式中，施用本发明的免疫原性制剂导致相对于未施用本发明免疫原性制剂的个体而言传染性物质的复制减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、或者80％或者更多，如使用本领域熟知的或者本文例举的任何方法(如，病毒滴度的测定)在所述施用后2天、5天、10天、15天、20天或者优选30天测定的。在其它实施方式中，施用本发明的免疫原性制剂导致相对于未施用本发明免疫原性制剂的个体而言传染性物质的复制或传染性物质的负荷减少1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、75或100倍，如使用本领域熟知的或者本文例举的任何方法(如，病毒滴度或细菌负荷和/或浓度的测定)在所述施用后2天、5天、10天、15天、20天或者优选30天测定的。
在另一实施方式中，本发明提供了在个体中(优选鸟类)预防、治疗和/或控制至少一种疾病(如NDV感染和/或非NDV的另一传染性物质的感染)的方法，该方法包含对所述个体施用有效量的免疫原性制剂，该制剂包含本发明的嵌合NDV病毒，其中该有效量是导致相比于没有施用本发明的免疫原性制剂的个体而言传染性物质的滴度或数量减少、致死率降低、入院率降低、感染严重程度降低和/或感染临床症状减轻的量。在一些实施方式中，施用给个体的嵌合NDV病毒的剂量是102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011、1012pfu。在某些实施方式中，施用本发明的免疫原性制剂导致相对于未施用本发明免疫原性制剂的个体而言传染性物质的复制减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、或者80％或者更多，如使用本领域熟知的或者本文例举的任何方法(如，病毒滴度的测定)在所述施用后2天、5天、10天、15天、20天或者优选30天测定的。在其它实施方式中，施用本发明的免疫原性制剂导致相对于未施用本发明免疫原性制剂的个体而言传染性物质的复制或传染性物质的负荷减少1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、75或100倍，如使用本领域熟知的或者本文例举的任何方法(如，病毒滴度的测定)在所述施用后2天、5天、10天、15天、20天或者优选30天测定的。
将有效治疗、预防和/或缓解特定疾病(如病毒感染)的本发明免疫原性制剂的量将取决于疾病的特性，且可以通过标准临床技术测定。此外，体外分析可任选地用来帮助确定最佳剂量范围。将被用于制剂的精确剂量还取决于给药方式，感染或者不适的严重度，且应当根据医师的判断和每个个体的状况决定。然而，合适的给药剂量范围一般约为102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011或1012pfu，而最优约为104到约1012，而且可以一次、两次、三次或根据需要间隔地多次施用给个体。有效剂量可以根据体外或者动物模型试验系统得到的剂量应答曲线外推得到。
在各种实施方式中，将本发明的免疫原性制剂或者本发明的嵌合病毒产生的抗体与一种或多种用于预防至少一种疾病(如流感感染和/或非流感病毒的另一传染性物质引起的感染)的其它治疗(例如抗病毒或免疫调节治疗)联合施用给个体。在其它实施方式中，将本发明的免疫原性制剂或者本发明的嵌合病毒产生的抗体与一种或多种用于治疗至少一种疾病(如流感感染和/或非流感病毒的另一传染性物质引起的感染)的其它治疗(例如抗病毒或免疫调节治疗)联合施用给个体。在其它实施方式中，将本发明的免疫原性制剂或者本发明的嵌合病毒产生的抗体与一种或多种用于控制和/或缓解至少一种疾病(如流感感染和/或非流感病毒的另一传染性物质引起的感染)的其它治疗(例如抗病毒或免疫调节治疗)联合施用给个体。在具体实施方式中，将本发明的免疫原性制剂或者本发明的嵌合病毒产生的抗体与一种或多种用于预防禽流感感染和/或非禽流感病毒的另一传染性物质引起的感染的其它治疗(例如抗病毒或免疫调节治疗)联合施用给个体。在另一具体实施方式中，将本发明的免疫原性制剂或者本发明的嵌合病毒产生的抗体与一种或多种用于治疗禽流感感染和/或非禽流感病毒的另一传染性物质引起的感染的其它治疗(例如抗病毒或免疫调节治疗)联合施用给个体。在其它具体实施方式中，将本发明的免疫原性制剂或者本发明的嵌合病毒产生的抗体与一种或多种用于预防NDV感染和/或非NDV的另一传染性物质引起的感染的其它治疗(例如抗病毒或免疫调节治疗)联合施用给个体。在其它具体实施方式中，将本发明的免疫原性制剂或者本发明的嵌合病毒产生的抗体与一种或多种用于治疗NDV感染和/或非NDV的另一传染性物质引起的感染的其它治疗(例如抗病毒或免疫调节治疗)联合施用给个体。在某些实施方式中，施用该治疗(如，预防性或者治疗性试剂)的间隔少于5分钟、少于30分钟、1小时、大约1小时、约1小时到约2小时、约2小时到约3小时、约3小时到约4小时、约4小时到约5小时、约5小时到约6小时、约6小时到约7小时、约7小时到约8小时、约8小时到约9小时、约9小时到约10小时、约10小时到约11小时、约11小时到约12小时、约12小时到约18小时、约18小时到约24小时、约24小时到约36小时、约36小时到约48小时、约48小时到约52小时、约52小时到约60小时、约60小时到约72小时、约72小时到约84小时、约84小时到约96小时、约96小时到约120小时。在优选实施方式中，两个或者多个治疗在同一次患者诊疗中施用。
本领域技术人员已知的任何抗病毒剂均可被用在本发明的制剂(如疫苗制剂)和方法中。抗病毒性剂的非限定性例子包括抑制和/或降低病毒与其受体结合、病毒整合入细胞内、病毒的复制、病毒从细胞中的释放的蛋白、多肽、肽段、融合蛋白抗体、核酸分子、有机分子、无机分子和小分子。特别地，抗病毒剂包括但不限于核苷类似物(如齐多夫定、三环奎烷胺、gangcyclovir、阿糖腺苷、疱疹净、三氟丙嗪和病毒唑)、膦甲酸、金刚烷胺、金刚乙胺、沙奎那韦、茚地那韦、利托那韦、α-干扰素和其它干扰素，和AZT。
在具体实施方式中，抗病毒剂是对病毒抗原具有免疫特异性的免疫调节剂。本文所用的术语“病毒抗原”包括但不限于能够诱发免疫应答的任何病毒肽、多肽和蛋白(如HIV gp120、HIV nef、RSV F糖蛋白、RSV G糖蛋白、流感病毒神经氨酸酶、流感病毒血凝素、HTLV tax、单纯疱疹病毒糖蛋白类(如gB、gC、gD和gE)和乙肝表面抗原)。本发明可用于治疗病毒感染疾病的抗体包括但不限于针对致病病毒抗原的抗体，作为举例包括但不限于：腺病毒(如哺乳动物腺病毒属、禽类腺病毒属)、疱疹病毒科(如单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、单纯疱疹病毒5、单纯疱疹病毒6)、光滑病毒科(如光滑病毒、肠细菌相MS2、别光滑病毒)、痘病毒科(如脊椎动物痘病毒亚科、副痘病毒属、禽痘病毒属、羊痘病毒属、兔痘病毒属、猪痘病毒属、软体动物痘病毒属、和昆虫痘病毒属)、乳多空病毒科(如多瘤病毒和乳头瘤病毒)、副粘病毒科(如副粘病毒属、副流感病毒1、运动病毒(如麻疹病毒)、腮腺炎病毒属(如腮腺炎病毒))、肺炎病毒科(如肺炎病毒属、人类呼吸多核体病毒)、和多元肺炎病毒(如禽类肺炎病毒和人类多元肺炎病毒))、细小核糖核酸病毒(如肠道病毒、鼻病毒、肝病毒(如人类甲肝病毒)、心脏病毒、和牛口蹄疫病毒)、呼肠孤病毒科(如正呼肠孤病毒属、环状病毒属、轮状病毒属、质型多角体病毒属、矮缩病毒属、水稻病毒属、植物呼肠孤病毒属)、逆转录病毒科(如哺乳动物B型逆转录病毒、哺乳动物C型逆转录病毒、禽类C型逆转录病毒、D型逆转录病毒组、BLV-HTLV逆转录病毒、慢病毒属(如人类免疫缺陷病毒1和人类免疫缺陷病毒2)、泡沫病毒属)、黄病毒科(如丙肝病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒)、嗜肝DNA病毒科(如乙肝病毒)、披膜病毒科(如甲病毒(如油棉病毒)和风疹病毒(如风湿疹病毒))、棒状病毒科(如水疱病毒属、狂犬病毒、弹状病毒属、短暂热病毒属、坏死棒状病毒)、沙砾病毒科(如沙砾病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、爱皮病毒和拉沙病毒)和冠状病毒科(如冠状病毒和念状病毒)。
本领域技术人员已知的用于预防、治疗、控制或者缓解细菌感染的任何抗菌剂和治疗剂可用在本发明的组合物(如免疫原性制剂)和方法中。抗菌剂的非限定性例子包括抑制或者降低细菌感染、抑制或者降低细菌的复制、抑制或者降低细菌向其它个体的传播的蛋白、多肽、肽、融合蛋白、抗体、核酸分子、有机分子、无机分子和小分子。特别地，抗菌剂的例子包括但不限于青霉素、头孢菌素、亚胺培南、安曲南、万古霉素、环丝氨酸、崔西杆菌素、氯霉素、红霉素、氯林大霉素、四环素、链霉素、托普霉素、庆大霉素、氨丁卡霉素、卡那霉素、新霉素、奇霉素、甲氧苄氨嘧啶、氟哌酸、利福平、多粘菌素、两性霉素B、制真菌素、酮康唑、异烟肼、甲硝哒唑和戊烷脒。抗菌治疗剂及其剂量、给药途径和推荐用法是本领域已知的且已描述于例如Physician’s Desk Reference(第56版，2002)的文献中。关于呼吸感染和抗菌治疗的额外信息可获自Cecil Textbook of Medicine(第18版，1988)。
本领域技术人员已知的用于预防、控制、治疗和/或缓解真菌感染或其一或多种症状(例如真菌呼吸感染)的抗真菌剂和治疗剂可用在本发明的组合物(如免疫原性制剂)和方法中。抗真菌剂的非限定性例子包括抑制和/或降低真菌感染、抑制和/或降低真菌的复制、或抑制和/或降低真菌向其它个体传播的蛋白、多肽、肽、融合蛋白、抗体、核酸分子、有机分子、无机分子和小分子。抗真菌剂的具体例子包括但不限于唑类药物(如双氯苯咪唑、酮康唑
Figure A200680052285D00941
卡泊芬净醋酸
Figure A200680052285D00942
咪唑、三唑(如氟康唑
Figure A200680052285D00943
和伊曲康唑
Figure A200680052285D00944
聚烯(如制霉菌素、两性霉素
Figure A200680052285D00945
两性霉素B脂质复合体(“ABLC”)
Figure A200680052285D00946
两性霉素B胶体分散体(“ABCD”)
Figure A200680052285D00947
脂质体两性霉素
Figure A200680052285D00948
碘酸钾嘧啶(如氟胞嘧啶)、和伏立康唑
Figure A200680052285D009411
抗真菌治疗剂及其剂量、给药途径和推荐用法是本领域已知的且已描述于例如Dodds等，2000 Pharmacotherapy 20(11)1335-1355；Physician’s Desk Reference(第57版，2003)和Merk Manual of Diagnosis andTherapy(第17版，1999)的文献中。
在某些实施方式中，将本发明的免疫原性制剂作为单一剂量施用给个体，在3到6周后施用第二剂。根据这些实施方式，在二次接种后间隔6到12个月对个体进行加强接种。在一实施方式中，个体是哺乳动物。在另一实施方式中，个体是鸟类。在另一实施方式中，个体是人类。在更优选的实施方式中，个体是存在接触NDV或者禽流感病毒感染风险的鸡。
在某些实施方式中，本发明的相同的免疫原性制剂的施用可以重复，施用可间隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月、或者至少6个月。
5.6 生物学分析
5.6.1 体外分析
本发明的嵌合病毒的生长可以通过本领域已知的或者在此说明的任何方法评估(如在细胞培养中(如鸡胚肾细胞培养物或者鸡胚成纤维细胞(CEF)培养物))。本发明的减毒嵌合病毒的生长可以在IFN完全型和IFN缺陷型细胞中评估。在具体实施方式中，CEF细胞以MOI为0.0005和0.001、0.001和0.01、0.01和0.1、0.1和1、或1和10、或者MOI为0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5或10被感染并在补充了5％尿囊液的无血清培养基中培养。病毒滴度如下文所述通过CEF细胞中的HA菌斑在上清液中测定。可以评价其中的病毒滴度的其它细胞包括但不限于EFK-2细胞、Vero细胞、原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、H292人上皮细胞系和Hela细胞。
融合蛋白向本发明的嵌合病毒病毒颗粒的结合可以通过本领域已知的或本文说明的任何方法评价(如，在细胞培养物中、动物模型中或在胚卵病毒培养物中)。例如，来自胚卵尿囊液细胞培养物的病毒颗粒可以通过蔗糖垫离心纯化且随后使用本领域已知的方法通过Western印迹法分析融合蛋白的表达。
病毒分析包括使用本领域熟知的方法体外测量培养细胞中病毒复制的改变(如通过斑块形成测定)或者病毒蛋白的生成(如通过Western印迹法分析测定)或者病毒RNA的生成(通过RT-PCR或者Northern印迹法分析测定)。
本发明的嵌合病毒生成的抗体或其片段可以通过本领域技术人员已知的各种方法来表征(如，ELISA、表面等离子共振展示(BIAcore)、Western印迹法、免疫荧光、免疫染色和/或微量中和法分析)。尤其是，可分析本发明的嵌合病毒生成的抗体或其片段免疫特异结合嵌合骨架病毒抗原或者融合蛋白的抗原或者抗原决定簇的能力。这样的分析可以在溶液中(如，Houghten，1992，Bio/Techniques 13：412-421)、微珠上(Lam，1991，Nature 354：82-84)、芯片上(Fodor，1993，Nature 364：555-556)、细菌上(美国专利号5,223,409)、芽孢上(美国专利号5,571,698；5,403,484；和5,223,409)、质粒上(Cull等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：1865-1869)或噬菌体上(Scott和Smith，1990，Science249：386-390；Cwirla等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6378-6382；和Felici，1991，J.Mol.Biol.222：301-310)(各文献均完整引入本文作为参考)。随后可对已被鉴定为免疫特异结合嵌合骨架病毒抗原或者融合蛋白的抗原或抗原决定簇的本发明的嵌合病毒生成的抗体或者其片段进一步分析其与所述抗原的特异性。
可使用本领域已知的任何方法分析本发明的嵌合病毒生成的抗体或其片段与本发明的嵌合病毒抗原(如嵌合病毒骨架的抗原或抗原决定簇或融合蛋白的抗原或者抗原决定簇(如疾病相关抗原))的免疫特异结合和与其它抗原的交叉反应性。可用于分析免疫特异结合和交叉反应性的免疫分析包括但不限于，竞争和非竞争分析系统，其采用如Western印迹法、放射性免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附分析)、“三明治”免疫分析、免疫沉淀法、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散分析、凝集分析、补体结合分析、免疫放射分析、荧光免疫分析、蛋白A免疫分析等技术。这些分析是常规的且是本领域已知的(参见如，Ausubel等编，1994，Current Protocols in MolecularBiology，第1卷，John Wiley&Sons公司，New York，其被完整引入本文作为参考)。示例免疫分析将在下文简要说明(但并非意图以任何方式进行限制)。
免疫沉淀流程一般包括在补充了蛋白磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(如EDTA、PMSF、抑肽酶、矾酸钠)的裂解缓冲液例如RIPA缓冲液(1％NP-40或Triton X-100、1％脱氧胆酸钠、0.1％SDS、0.15M NaCl、0.01M磷酸钠、pH 7.2、1％抑肽酶)中裂解细胞群，将感兴趣的抗体加入细胞裂解液中，在40℃放置一段时间(如1到4小时)，将蛋白A和/或蛋白G琼脂糖珠加入细胞裂解液中，在40℃下放置约一个小时或者更久，洗涤裂解缓冲液中的珠子并将珠子重悬于SDS/样品缓冲液中。感兴趣的抗体免疫沉淀特定抗原的能力可以通过如，Western印迹分析评价。关于可被调整从而提高抗体与抗原的结合并降低背景的参数本领域技术人员应当熟知(如用琼脂糖珠预清洗细胞裂解液)。关于免疫沉淀流程的进一步讨论参见如Ausubel等编，1994，CurrentProtocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley&Sons公司，New York的10.16.1节。
Western印迹分析通常包含准备蛋白样品，在聚丙烯酰胺凝胶中进行蛋白质样品的电泳(如8％-20％SDS-PAGE，取决于抗原的分子量)，将蛋白样品从聚丙烯酰胺凝胶转移到膜上例如硝化纤维素、PVDF尼龙，将膜放置在封闭液中(如含有3％BSA或者无脂牛奶的PBS)，用洗涤缓冲液(如PBS-Tween20)洗涤膜，将膜与稀释在封闭缓冲液中的一抗(感兴趣的抗体)共同放置，用洗涤缓冲液洗涤膜，将膜与稀释在封闭缓冲液中的二抗(该抗体识别一抗，如抗人抗体)共同放置，该二抗偶联酶底物(如辣根过氧物酶或者碱性磷酸酶)或者放射性分子(如32P或者125I)，用洗涤缓冲液洗膜，然后检测抗原的存在。关于可被调整从而提高可检测信号并降低背景噪音的参数，本领域技术人员应当熟知。关于Western印迹法的进一步讨论参见如，Ausubel等编，1994，Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley&Sons公司，New York的10.8.1节。
ELISA包括准备抗原，用抗原包被96孔微量滴定板的孔，将与可检测化合物如酶底物(如辣根过氧物酶或者碱性磷酸酶)偶联的感兴趣的抗体加入到孔中并放置一段时间，检测抗原的存在。在ELISA中，感兴趣的抗体并不必须与可检测的化合物偶联；取而代之，可将与可检测化合物偶联的二抗(该抗体识别感兴趣的抗体)加入到孔上。此外，代替用抗原包被孔，也可用抗体包被孔。这种情况下，可在向包被孔中加入感兴趣的抗原之后，加入与可检测的化合物偶联的二抗。关于可被调整以增强可检测的信号的参数以及本领域已知的ELISA的其它变量，本领域技术人员应当熟知。在优选实施方式中，可通过用2微克/毫升的rhu-IL-9的PBS过夜包被高结合96孔微量滴定板(Costar)来进行ELISA。在用PBS三次洗涤后，在25℃将板与Fab三倍系列稀释液共同放置1小时。在用PBS再次洗脱三次后，加入1毫克/毫升抗人κ碱性磷酸酶偶联物，然后将板在25℃放置1小时。在PBST三次洗涤后，50微升/AMP/PPMP底物中测定碱性磷酸酶活性。终止反应并用VMAX酶标仪测定60nm的吸光率。关于ELISA的进一步讨论参见如Ausubel等编，1994，Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley&Sons公司，New York的11.2.1节。
可以通过竞争性结合分析确定抗体对抗原的结合亲和力还有抗体抗原相互作用的解离率。竞争性结合分析的一个例子是放射免疫分析，包含在存在递增量的未标记抗原的情况下，将标记的抗原(如3H或125I)与感兴趣的抗体共同放置，并检测与标记抗原结合的抗体。可以通过scatchard作图分析的数据确定本发明抗体或者其片段与IL-9多肽的亲和力和结合的解离率。与二抗的竞争也可以用放射免疫分析法测定。在该例中，在递增量的未标记的二抗的存在下，将IL-9多肽与偶联了标记化合物(如3H或者125I)的本发明的抗体共同放置。
在优选实施方式中，BIAcore动力学分析被用来测定本发明抗体与本发明嵌合病毒抗原(如嵌合病毒骨架的抗原或者抗原决定簇或者融合蛋白的抗原或者抗原决定簇(如疾病相关抗原))的结合与解离率。BIAcore动力学分析包含分析肽(包含感兴趣的抗原)与表面上固定了本发明的嵌合病毒产生的抗体的芯片的结合和解离。典型的BIAcore动力分析包括在感受器芯片表面注射250微升不同浓度的抗体试剂(mAb，Fab)的含有0.005％Tween-20的HBS缓冲液，在该芯片表面上已经固定了抗原。流速维持在恒定的75微升/分。在15分钟或如果必要，在更长的时间内收集解离数据。在每次注射/解离循环后，使用简单的1分钟脉冲稀酸(一般为10-100mM盐酸)将结合的mAb从抗原表面洗脱，尽管条件允许的话，可以使用其它再生剂。更具体地，为了测定结合率k结合和解离率k解离，通过使用标准胺类结合化学(即EDC/NHS方法(EDC＝N-二乙基氨丙基)-碳二亚胺)将包含抗原的多肽直接固定在感受器芯片表面上。简单地说，制备5-100nM的包含抗原的多肽的10mM NaOAc溶液，pH 4或pH 5，并使其通过EDC/NHS活化表面直到大约30-50RU量的抗原被固定。在此之后，通过注射1M Et-NH2将未反应的活性酯“灭活”。在相同固定条件下制备没有任何抗原的空白表面用于对照。一旦制备了适当的表面，在HBS/Tween-20中制备每个抗体试剂的合适的稀释系列，并使其通过以串联方式连接的抗原和对照细胞表面。制备的抗体浓度的范围是可变的，取决于估计的平衡结合常数KD。如上所述，在每次注射/解离循环后，使用合适的再生剂去除结合的抗体。
可以使用本领域技术人员已知的技术分析本发明的嵌合病毒产生的抗体或者其片段抑制本发明的嵌合病毒的抗原(如嵌合病毒骨架的抗原或者抗原决定簇或者融合蛋白的抗原或者抗原决定簇(如疾病相关抗原))与宿主细胞受体结合的能力。例如，可在本发明嵌合病毒产生的抗体或者其片段的存在或不存在的情况下将表达已知与所述抗原结合的受体的细胞与抗原接触，并通过例如流式细胞计数法或者闪烁分析测定抗体或其片段抑制抗原结合的能力。抗原或抗体或抗体片段可以用可检测化合物例如放射性标签(如32P、35S和125I)或者荧光标签(如异硫氰酸荧光素、若丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺)标记，从而可以检测抗原和细胞受体之间的相互作用。或者，可以在无细胞系统中测定本发明的嵌合病毒产生的抗体或者其片段抑制本发明的嵌合病毒的抗原(如嵌合病毒骨架的抗原或者抗原决定簇或者融合蛋白的抗原或者抗原决定簇(如疾病相关抗原))与受体结合的能力。例如，包含抗原的多肽可以与抗体或者其片段接触且可以确定抗体或者抗体片段抑制多肽与细胞受体结合的能力。优选地，抗体或抗体片段被固定在固体支持物上并多肽用可检测化合物标记。或者，包含抗原的多肽被固定在固体支持物上且抗体或其片段被可检测化合物标记。
5.6.2 体内分析
本发明嵌合病毒的毒力可以在个体，尤其是禽类或者其动物模型中进行评估。在一个例子中，其在病毒感染动物模型中引发肺部损伤和造成感染的能力与野生型病毒和拟病毒相比较。肺部损伤可以根据通过肉眼观察评估为健康肺叶的百分比。在感染后5天通过静脉内施用戊巴比妥对动物施行安乐死术，并将它们的肺完全移除。肉眼估计各肺叶表面被宏观损伤影响的百分比。将百分比平均以得到每个动物7个肺叶的平均值。在其它试验中，检测鼻液以确定病毒负荷或滴度。在验尸过程中获取鼻液来确定感染后的病毒负荷。
对于组织样品的病毒定量，将组织样品在磷酸缓冲盐(PBS)中匀浆化，澄清匀浆稀释液在37℃下吸附在单层细胞(如CEF或者MDCK细胞)上1小时。随后用包含0.1％牛血清白蛋白(BSA)、0.01％ DEAE-葡聚糖、0.1％NaHCO3和1％琼脂的最小必需培养基溶液覆盖被感染的单层。将板培养2到3天直到可以看见空斑。如下进行组织培养感染剂量(TCID)分析以测定来自PR8-感染样品的病毒。将96孔板中的汇合单细胞层(如CEF或者MDCK细胞)与澄清组织匀浆的对数稀释液在培养基中培养。接种后2到3天，通过血凝素分析(HA分析)评估来自各孔的0.05ml等份样品的病毒生长。
在其它的分析中，在感染后进行组织病理学评估。可以检查鼻甲和气管的上皮变化和上皮下炎症。可以检查肺在大、中、小以及末端支气管中的支气管上皮变化和支气管周边炎症。也可以评估肺泡的炎症变化。中支气管分为如下0到3+级别：0(正常：内衬中到高圆柱形带有纤毛尖边和基础假复层核的上皮细胞，最小化炎症)；1+(上皮层柱状且大体轮廓平滑伴随轻微的增生；在很多细胞中纤毛仍可见)；2+(上皮层发生从减弱到显著增生的显著改变；细胞排列错乱和细胞层轮廓内腔边界不规则)；3+(上皮层显著被破坏且排列错乱，在内腔有明显坏死细胞；一些支气管减弱而其它的则显著的反应性增生)。
气管被分为如下0到2.5+等级：0(正常：内衬着中到高圆柱形带有纤毛尖边和基础假复层核的上皮细胞。细胞质明显位于顶端边界和细胞核间。偶尔有鳞片状细胞的小病灶)；1+(上皮层呈病灶性的鳞状化生)；2+(大量上皮层呈弥散的鳞状化生，局部纤毛明显)；2.5+(弥散的鳞状化生伴随极少的可见的纤毛)。
使过病毒特异性单克隆抗体(如，NP-、N-或者HN-特异性单克隆抗体)进行病毒免疫组织化学。染色分为以下0到3+级别：0(无感染的细胞)；0.5+(极少感染的细胞)；1+(极少感染的细胞，为大范围分开的个体细胞)；1.5+(极少感染的细胞，为大范围分开的单个细胞和小细胞簇)；2+(中度数量的感染细胞，通常影响支气管内衬的部分上皮层或肺泡的小叶下小病灶的相邻细胞簇)；3+(很多感染细胞，影响大部分支气管内上皮层或者广泛分布在肺泡的小叶下大病灶)。
5.6.3 病毒滴度测定
通过将嵌合病毒系列稀释液接种到细胞培养物(如，CEF或MDCK)、鸡胚卵或者活体动物(如禽类)中来测定病毒滴度。在接种病毒一段特定时间后，使用标准方法将病毒分离。
HA分析可以在V底96孔板中进行。每个样本在PBS中的系列两倍稀释液与相同体积0.5％的鸡红血球在PBS中的悬浮液一起放置在冰上1小时。阳性孔包含红细胞的贴壁均一层；阴性孔包含非贴壁沉淀。
可通过对病毒上清液进行PCR(Quinn和Trevor，1997；Morgan等，1990)、血凝素分析、组织培养感染剂量(TCID50)或者卵感染剂量(EID50)来进行病毒滴度的物理定量。
5.6.4 毒性研究
可以在在细胞培养物或者实验动物中通过使用标准药物学步骤确定本发明的组合物(如免疫原性制剂)的毒性和/或功效，例如确定LD50(50％群体致死的剂量)和ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果的剂量比即治疗指数，其可以表示为LD50/ED50之比。优选表现出大治疗指数的药剂。尽管有毒副作用的治疗剂可被使用，应当小心设计将这样的试剂靶向至受感染组织的位点的给药系统以将对未感染细胞的潜在影响最小化，因此减少副作用。
通过细胞培养分析和动物研究获得的数据可以用来计算用于个体的治疗剂的剂量范围。这些试剂的剂量优选地在包含ED50而具有极少或没有毒性的循环浓度范围内。根据使用的剂型和使用的给药途径，剂量可以在此范围内变化。对于本发明方法中使用的任何治疗剂，治疗有效剂量都可以首先从细胞培养物分析中估测。可以在动物模型中配制剂量以获得包含细胞培养中测定的IC50(即实现对症状的最大半数抑制的待测化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。此信息可以用来更精确地测定个体(如马)中的有用剂量。血浆水平可以通过如高效液相色谱法测量。
此外，可以用本领域技术人员已知的任何分析来评估本文公开的组合物(如疫苗制剂)和联合治疗对病毒感染或与之相关的病症或症状、非病毒感染的感染或与之相关的病症或症状，或在将本发明的减毒嵌合病毒用作载体以诱导对与该病症相关的抗原的免疫应答的病症中的预防和/或治疗作用。
5.7 本发明的具体实施方式
本发明提供了嵌合禽流感病毒，包含融合蛋白，该蛋白具有
(i)包含异源肽序列的胞外结构域，该异源序列包含非流感传染性物质的保护性抗原或者疾病相关抗原的至少一个抗原决定簇，其融合到
(ii)由流感病毒的必需基因编码的糖蛋白的跨膜结构域和胞质结构域，
其中该融合蛋白结合进禽流感病毒，在该禽流感病毒中必需基因的功能由融合蛋白或者该禽流感病毒的天然糖蛋白提供。在某些实施方式中，流感病毒的必需基因是血凝素(HA)基因。在其它实施方式中，流感病毒的必需基因是神经氨酸酶(NA)基因。在某些实施方式中，嵌合禽流感病毒是减毒的。根据这些实施方式，可通过NS1基因中的突变将嵌合禽流感病毒减毒。
本发明提供了嵌合禽流感病毒，包含融合蛋白，该蛋白具有
(i)NDV HN蛋白的胞外结构域，其融合到
(ii)流感病毒NA蛋白的跨膜结构域和胞质结构域，
其中该融合蛋白结合进禽流感病毒，在该禽流感病毒中NA蛋白的功能由融合蛋白或者禽流感病毒天然糖蛋白提供。在某些实施方式中，嵌合禽流感病毒是减毒的。根据这些实施方式，可通过NS1基因中的突变将嵌合禽流感病毒减毒。
本发明提供了减毒嵌合流感病毒，包含融合蛋白，该蛋白具有
(i)包含异源肽序列的胞外结构域，该异源序列包含非流感传染性物质的保护性抗原或者与非流感传染性物质的保护性抗原的疾病相关的抗原的至少一个抗原决定簇，其融合到
(ii)由流感病毒的必需基因编码的糖蛋白的跨膜结构域和胞质结构域，
其中该融合蛋白结合进减毒流感病毒，在该减毒流感病毒中必需基因的功能由融合蛋白或者该减毒流感病毒的天然糖蛋白提供。在某些实施方式中，流感病毒的必需基因是血凝素(HA)基因。在其它实施方式中，流感病毒的必需基因是神经氨酸酶(NA)基因。
本发明提供了嵌合NDV，包含融合蛋白，该蛋白具有
(i)包含异源肽序列的胞外结构域，该异源序列包含非NDV的传染性物质的保护性抗原或者疾病相关抗原的至少一个抗原决定簇，其融合到
(ii)由NDV的必需基因编码的糖蛋白的跨膜结构域和胞质结构域，
其中该融合蛋白结合进NDV，在NDV中必需基因的功能由融合蛋白或者NDV天然糖蛋白提供。
本发明提供了嵌合禽流感病毒，包含编码神经氨酸酶融合蛋白的包装的流感病毒NA片段，其中NA开放阅读框经修饰由此编码NA胞外结构域的核苷酸被编码非流感传染性物质的通过N末端锚定的神经氨酸酶抗原胞外结构域的核苷酸所替代，从而神经氨酸酶融合蛋白被表达并结合进嵌合禽流感病毒中。
本发明提供了嵌合禽流感病毒，包含编码血凝素融合蛋白的包装的流感病毒HA片段，其中HA开放阅读框经修饰由此编码HA胞外结构域的核苷酸被编码非流感传染性物质的通过C末端锚定的血凝素抗原胞外结构域的核苷酸所替代，从而血凝素融合蛋白被表达并+结合进嵌合禽流感病毒中。
本发明提供了嵌合禽流感病毒，包含包装的双顺反子流感病毒HA片段，其包含：
(a)编码禽流感病毒血凝素蛋白的第一开放阅读框，和
(b)编码血凝素融合蛋白的第二开放阅读框，其中编码血凝素胞外结构域的核苷酸被编码异源肽序列的核苷酸替代，该异源肽序列包含非流感传染性物质的保护性抗原或者疾病相关抗原的通过C末端锚定的至少一个抗原决定簇，
由此流感血凝素和融合蛋白均被表达并结合进嵌合禽流感病毒中。
本发明提供了嵌合禽流感病毒，包含包装的双顺反子流感病毒NA片段，其包含
(a)编码禽流感病毒神经氨酸酶蛋白的第一开放阅读框，和
(b)编码神经氨酸酶融合蛋白的第二开放阅读框，其中编码神经氨酸酶胞外结构域的核苷酸被编码异源肽序列的核苷酸替代，该异源肽序列包含非流感传染性物质的保护性抗原或者疾病相关抗原的通过N末端锚定的至少一个抗原决定簇，
由此流感神经氨酸酶和融合蛋白均被表达并结合进嵌合禽流感病毒中。
本发明提供了嵌合禽流感病毒，包含编码神经氨酸酶融合蛋白的包装的流感病毒NA片段，其中NA开放阅读框经修饰由此编码NA胞外结构域的核苷酸被编码NDV的HN抗原胞外结构域的核苷酸所替代，由此神经氨酸酶融合蛋白被表达并结合进嵌合禽流感病毒中。
在某些实施方式中，209-211和213-217段中的嵌合禽流感病毒包含封装的NS1基因片段，其编码经修饰的NS1蛋白，该蛋白减弱病毒的细胞干扰素拮抗活性。在其它实施方式中，209-211和213-217段中的嵌合禽流感病毒包含HA片段，该片段包含经修饰以去除血凝素多元切割位点的开放阅读框。在其它实施方式中，215段中的嵌合禽流感病毒的第一开放阅读框被修饰以去除血凝素多元切割位点。
本发明提供了编码213和216段中NA片段的重组核酸分子(如重组DNA分子)。本发明还提供了编码214到215段中HA片段的重组核酸分子(如重组DNA分子)。
本发明提供了209-211和213-218段中的嵌合禽流感病毒的增殖方法，包括在胚卵或者对禽流感病毒易感的细胞系中培养嵌合禽流感病毒。本发明还提供了制备免疫原性制剂的方法，该方法包括：
(a)在胚卵或者对禽流感病毒易感的细胞系中增殖209-211和213-218段中的嵌合禽流感病毒；和
(b)收集后代病毒，
其中病毒生长到足够量并在足以使病毒不被污染的条件下生长，由此后代病毒适用于免疫原性制剂，如疫苗制剂。
本发明提供了减毒嵌合流感病毒，包含编码神经氨酸酶融合蛋白的包装的流感病毒NA片段，其中NA开放阅读框经修饰由此编码NA胞外结构域的核苷酸被编码非流感传染性物质的通过N末端锚定的神经氨酸酶抗原胞外结构域的核苷酸所替代，由此神经氨酸酶融合蛋白被表达并结合进减毒嵌合禽流感病毒中。
本发明提供了减毒嵌合禽流感病毒，其包含编码血凝素融合蛋白的包装的流感病毒HA片段，其中HA开放阅读框经修饰由此编码HA胞外结构域的核苷酸被编码非流感传染性物质的通过C末端锚定的血凝素抗原胞外结构域的核苷酸所替代，由此血凝素融合蛋白被表达并结合进减毒嵌合禽流感病毒中。
本发明提供了减毒嵌合禽流感病毒，包含封装的双顺反子流感病毒HA片段，其包含
(a)编码禽流感病毒血凝素蛋白的第一开放阅读框，和
(b)编码血凝素融合蛋白的第二开放阅读框，其中编码血凝素胞外结构域的核苷酸被编码异源肽序列的核苷酸替代，该异源肽序列包含非流感传染性物质的保护性抗原或者疾病相关抗原的抗原决定簇，所述融合蛋白通过C末端锚定，
由此流感血凝素和融合蛋白均被表达并结合进减毒嵌合流感病毒中。
本发明提供了减毒嵌合流感病毒，包含包装的双顺反子流感病毒NA片段，其包含
(a)编码禽流感病毒神经氨酸酶蛋白的第一开放阅读框，和
(b)编码神经氨酸酶融合蛋白的第二开放阅读框，其中编码神经氨酸酶胞外结构域的核苷酸被编码异源蛋白的核苷酸替代，所述蛋白包含非流感传染性物质的保护性抗原或者疾病相关抗原的抗原决定簇，所述融合蛋白通过N末端锚定，
由此流感神经氨酸酶和融合蛋白均被表达并结合进减毒嵌合流感病毒中。
在某些实施方式中，221-224段中的减毒嵌合流感病毒包含包装的NS1基因片段，该片段编码经修饰的NS1蛋白，该蛋白减弱病毒的细胞干扰素拮抗活性。在某些其它实施方式中，221-224段中的减毒嵌合流感病毒包含HA片段，其具有经修饰以去除血凝素多元切割位点的开放阅读框。在其它实施方式中，223段中的减毒嵌合流感病毒的第一开放阅读框被修饰以去除血凝素多元切割位点。
本发明提供了编码221和224段中NA片段的重组DNA分子。本发明还提供编码222到223段中HA片段的重组DNA分子。
本发明提供了221-225段中的减毒嵌合流感病毒的增殖方法，包括在胚卵或者对禽流感病毒易感的细胞系中培养减毒嵌合流感病毒。本发明还提供了制备免疫原性制剂的方法，该方法包括：
(a)在胚卵或对禽流感病毒易感的细胞系中增殖211和221-225段中的减毒嵌合流感病毒；和
(b)收集后代病毒，
其中病毒生长到足够量并在足以使病毒不被污染的条件下生长，由此后代病毒适用于免疫原性制剂，如疫苗制剂。
本发明提供了嵌合NDV，包含包装的基因组，该基因组包含编码F蛋白-融合蛋白的核苷酸序列，该蛋白具有F蛋白的跨膜结构域和胞质结构域和由C末端锚定的非NDV的传染性物质抗原的胞外结构域，由此F蛋白-融合蛋白被表达并被结合进嵌合NDV中。
本发明提供了嵌合NDV，包含包装的基因组，该基因组包含编码HN融合蛋白的核苷酸序列，该蛋白具有HN蛋白的跨膜结构域和胞质结构域和由N末端锚定的非NDV的传染性物质抗原的胞外结构域，由此HN融合蛋白被表达并被结合进嵌合NDV中。
在某些实施方式中，213和228-229段的嵌合NDV的基因组包含编码F蛋白的核苷酸序列，由此除F蛋白-融合蛋白之外F蛋白被表达并结合进嵌合NDV。在其它实施方式中，编码NDV F蛋白-融合蛋白的核苷酸序列替代编码NDV F蛋白的核苷酸序列并且F蛋白-融合蛋白为228段的嵌合NDV提供F蛋白的功能。
在某些实施方式中，212和223-224段的嵌合NDV的基因组包含编码HN蛋白的核苷酸序列，由此HN蛋白被表达并结合入嵌合NDV。在其它实施方式中，编码HN融合蛋白的核苷酸序列替代编码NDV HN蛋白的核苷酸序列并且HN融合蛋白为229段的嵌合NDV提供HN蛋白的功能。
本发明提供了212和228-229段中的嵌合NDV的增殖方法，包括在胚卵或者对NDV易感的细胞系中培养嵌合NDV。本发明还提供了制备免疫原性制剂的方法，该方法包括：
(a)在胚卵或者细胞中增殖212和228-229段中的嵌合NDV；和
(b)收集后代病毒，
其中病毒生长到足够量并在足以使病毒不被污染的条件下生长，由此后代病毒适用于免疫原性制剂，如疫苗制剂。
本发明提供了包含209-210、212-218和228-229段的嵌合病毒的胚卵。本发明还提供了包含209-210、212-218和228-229段嵌合病毒的细胞系。本发明还提供了包含209-210、212-218和228-229段嵌合病毒的免疫原性制剂。
本发明提供了包含211和221-225段减毒嵌合病毒的胚卵。本发明还提供了包含211和221-225段减毒嵌合病毒的细胞系。本发明还提供了包含211和221-225段减毒嵌合病毒的免疫原性制剂。
本发明提供了在鸟类中诱发对两种传染性物质的免疫应答的方法，该方法包含施用有效量的209-210和213-218段中的嵌合禽流感病毒。本发明还提供了在鸟类中诱发对两种传染性物质的免疫应答的方法，该方法包含施用有效量的212和228-229段中的嵌合NDV。本发明还提供了在个体中诱发对两种传染性物质的免疫应答的方法，该方法包含施用有效量的211和221-225段中的减毒嵌合流感病毒。在某些实施方式中，个体是人个体。在其它实施方式中，个体是非人的哺乳动物(如猪、马、狗、猫或牛)。在其它实施方式中，个体是禽类个体。
6.实施例
6.1 工程改造具有新城疫病毒抗原决定簇的嵌合禽流感病毒
以下实施例描述了示例性嵌合禽流感病毒的制备。尤其是，该实施例描述了将禽流感病毒，流感A/越南/1203/04(H5N1)工程改造以表达融合蛋白并将其结合进其病毒颗粒，该融合蛋白包含禽流感病毒NA蛋白的跨膜和胞质域和NDV HN蛋白胞外结构域。融合蛋白功能性地替代禽流感病毒NA蛋白。
6.1.1 材料和方法
6.1.1.1 质粒构建
所有用于重组病毒的单纯性质粒补救(plasmid-only rescue)的质粒构建体均采用相同的策略进行克隆。使用包含SapI限制性位点的引物通过PCT扩增病毒片段的全长cDNA，该限制性位点使得PCR产物可以插入pPolI-SapI-Rb质粒的SapI位点(Flandorfer等，2003，J.Virol.77：9116-9123；Nakaya等，2001，J.Virol.75：11868-11873；两者均全文引入本文作为参考)。所有PCR插入片段的序列均经过确认(Mount Sinai DNA测序组，NY)，合适的话，PCR过程中引入的任何核苷酸变化通过QuickChange XL定点突变试剂盒(Stragene，La Jolla，CA)进行修正。流感A/越南/1203/04(H5N1)、流感A/WSN/33(WSN)和NDV的GenBank序列在表2中提供。
表2.病毒片段的GenBank录入号
Figure A200680052285D01111
6.1.1.2 嵌合病毒片段的构建
使用本领域熟知的重组技术构建编码NDV B1 HN胞外结构域及流感A/WSN/33神经氨酸酶(NA)胞内尾巴(CT)和跨膜(TM)域的cDNA(A/越南/1203/04-A/WSN/33NA(CT+TM)-NDV B1 HN(胞外结构域))。该构建体包含WSN NAvRNA的3’非编码区的19个核苷酸、编码NA编码区1-36位氨基酸(对应于NA蛋白的胞内尾巴和跨膜结构域和NA胞外结构域的第一个氨基酸)的核苷酸(108个核苷酸)、编码NDV B1 HN蛋白(HN胞外结构域)的第51-568位氨基酸的核苷酸、两个连续的终止密码子、WSN NA阅读框的157个非翻译核苷酸及WSN vRNA的5’非编码区(图1)。
6.1.1.3 编码嵌合H5N1-NDV的质粒构建体的构建
为了通过单纯性质粒补救的方法基于H5N1(宿主病毒)制备经工程改造以带有NDV表面糖蛋白的嵌合病毒，构建质粒构建体。选择编码表面糖蛋白NA的H5N1片段被包含编码NA蛋白CT和TM结构域及A/WSN/33的NA胞外结构域的第一个氨基酸以及NDV-B1的HN蛋白的胞外结构域的重组片段替代。融合蛋白A/越南/1203/04-A/WSN/33NA(CT+TM)-NDV B1HN(胞外结构域)为嵌合禽流感病毒提供神经氨酸酶活性。嵌合片段的图示参见图1。
表2中所列H5N1的其它7个片段(NS、M、NP、HA、PA、PB1和PB2)被克隆进pPol1以分别生成pPol1VN1203-NS、pPol1VN1203-M、pPol1VN1203-NP、pPol1VN1203-HA、pPol1VN1203-PA、pPol1VN1203-PB1和pPol1VN1203-PB2。为确保H5N1嵌合病毒被减毒，改变H5N1HA编码片段以将其紧邻HA切割位点之前的天然多元氨基酸序列(H5N1 HA编码序列第10113-1039核苷酸)转换成基于流感A H5的无毒禽类株的一致序列。该区域的氨基酸序列由QRERRRKKRG(SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:14第2-11位氨基酸)转换为QRETRG(SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:16第2-7位氨基酸)，将下划线氨基酸用苏氨酸替换(图2)。为了将通过聚合酶滑脱(splippage)在该序列中再次引入腺苷残基并因此将碱性氨基酸残基引入HA切割位点的几率最小化，进一步改变该区域使用的密码子以降低腺苷残基的数目。只有同义突变被引入无毒HA序列中(图3)。生成的片段被克隆进pPol1质粒，如前所述产生pPol1VN1203-HALO，该片段编码改造过的HA糖蛋白，对应于禽流感A低毒性株。除PB1和PB2之外，H5N1片段编码的基因产物和GeneBank序列相比未作改变。PB1和PB2序列因引入SapI限制性位点而发生变化。PB1编码序列第32位鸟嘌呤核苷酸非同义替代产生了赖氨酸到精氨酸的突变；PB2编码序列第1393位胸腺嘧啶核苷酸非同义替代产生了脯氨酸到丝氨酸的突变。H5N1的所有基因产物在vRNA的第4位为腺苷残基。
除编码野生型H5N1 NS的质粒构建体pPol1VN1203-NS之外，也制备了编码H5N1NS基因片段不同截断形式的3个pPol1构建体。这些编码NS片段的改变形式的构建体将可用于将生成的嵌合病毒进一步的减毒(参见如美国专利号6,669,943，其被完整引入本文作为参考)。这三种构建体在由质粒构建体表达NS1蛋白的氨基酸(自氨基端)数量上不同。从野生型NS1蛋白的氨基末端开始计算，pPol1VN1203 NS1-126、pPol1VN1203 NS1-99和pPol1VN1203 NS1-73分别编码前126、前99和前73个氨基酸。产生截断构建体的突变不影响NEP的开放阅读框(图4)。
6.1.1.4 用质粒构建体补救感染性病毒
通过本文所述的或本领域已知的任何方法对本发明的重组嵌合病毒进行补救。例如，可以用8个上述的pPol1质粒来转染293T、HEp-2或A549细胞，这些质粒被选择以实现理想的病毒减毒水平且因此提供8个片段，即用pPol1VN WSN-NA(CT+TM)-NDV B1 HN(胞外结构域)、pPol1VN1203 HA或pPol1VN1203 HALO、pPol1VN1203 NS、pPol1VN1203 NS1-126、pPol1VN1203 NS1-99或pPol1VN1203 NS1-73、pPol1VN1203-M、pPol1VN1203-NP、pPol1VN1203-PA、pPol1VN1203-PB1和pPol1VN1203-PB2来转染细胞。再用编码NA、PA、PB1和PB2的真核质粒转染细胞，这些蛋白是vRNA转录和复制所必需的。在过夜培养后，将被转染的细胞与鸡胚成纤维细胞共培养来扩增生成的病毒；在2-3天培养后，将共培养物上清液注入9或10天大的鸡胚卵尿囊腔内进行增殖。对于减毒病毒来说，可采用不具有完全的干扰素系统的7天大的卵。通过根据本领域已知的标准技术分析收获的尿囊液中的血凝素可以确认病毒的生长。
6.2 工程改造具有外源抗原决定簇的嵌合新城疫病毒
下述实施例描述了示例性NDV嵌合病毒的制备。特别的，本实施例描述了将嵌合NDV病毒工程改造以表达融合蛋白并将其结合进病毒颗粒，该蛋白包含NDV的必需蛋白的跨膜结构域和胞质结构域及禽流感病毒的胞外结构域。该实施例证实该种嵌合病毒诱发对流感病毒和NDV的后续感染的保护。
实施例还描述了将示例性NDV工程改造以表达融合蛋白并将其结合进病毒颗粒，该蛋白包含NDV F的胞质域和人角质细胞生长因子受体(KGFR)的胞外结构域和跨膜结构域。
6.2.1 材料和方法
6.2.1.1 细胞系
MDCK、HEp-2和A549细胞在补充了10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的Dulbecco’s改良的Eagle培养基(DMEM)中生长。NDV病毒Hitchner B1株的全长cDNA已被公布，其genebank录入号为AF375823(Nakaya等，2001，J.Virol.75：11868-11873，其内容完整引入本文作为参考)。
6.2.1.2 质粒构建
已经说明了将NDV的重组cDNA工程改造以编码外源蛋白(Nakaya等，2001，J.Virol.75：11868-11873)。简言之，将NDV全长cDNA引入质粒的T7启动子和丁型肝炎病毒(HDV)核酶及T7终止子之间，形成pNDV/B1质粒。在NDV cDNA的P基因和M基因之间工程改造引入XbalI位点，使得外源序列作为额外转录单位被引入NDV基因组中(图5)。所有的插入基因经工程改造以依次包含：基因末端；5’-TTAGAAAAAA-3’(SEQ ID NO:18)；顺反子间核苷酸T；基因起始序列；5’-ACGGGTAGAA-3’(SEQ ID NO:19)(GE/GS序列)。
通过反向遗传学方法从来自NDV病毒Hitchner B1株的全长cDNA拷贝生成rNDV/B1-KGFR、rNDV/B1-KGFR/F-CT及rNDV/B1-H7HA/F-TMCT病毒。为构建这些病毒，如针对其它ORF所述方法(Nakaya等，2001，J.Virol.75：11868-11873，Nakaya等，2004，J.Virol.78：9366-9375，此两篇文献均完整引入本文作为参考)，将KGFR或H7HA(来自流感病毒A H7N2亚型的HA蛋白)ORF作为额外转录单元克隆到NDV/B1cDNA的P基因和M基因之间。KGFR和H7HA均为跨膜蛋白，各自包含TM和CT域。在KGFR/F-CT构建体中，KFGR蛋白的CT域被NDV F蛋白的CT域所替换；在H7HA/F-TMCT构建体中，H7 HA蛋白的TM和CT域为NDV F蛋白的相应区域所替换。用本领域已知的标准技术从cDNA获得重组NDV病毒并进行增殖(参见如Swayne等，2003，Avian Dis.47：1047-1053和Nakaya等，2001，两者均全文引入本文作为参考)。重组病毒中新转录单元的插入采用逆转录PCR后通过序列分析进行确认。
例如，通过PCR使用下列引物(包括GE/GS序列)制备H5 HA基因的胞外结构域(ECTO)：NheI-H5HA P，5’-CG GCT AGC TTAGAAAAAA TACGGTAGAA GTGAA ACTAGT CC GCC ACC ATG GAA AGA ATA GTG ATTGCC TTT GCA-3’(SEQ ID NO:20)和HpaI-H5HA P，5’-CG GTT AAC CTG ATAAGC CCC CAT TGA TTC TAAT-3’(SEQ ID NO:21)，H5HAectoPCR片段经NheI和HpaI消化后克隆到pSL1180中(Amersham PharmaciaBiotech)(pSLHAHAecto)；通过PCR使用下列引物扩增NDV F基因的TM和CT：HpaI-NDVF(TM+CYTO)P，5’-CG GTT AAC CTC ATT ACC TAT ATCGTT TTG ACT-3’(SEQ ID NO:22)，SacI-NheI-NDVF(TM+CYTO)M，5’-CGGAG CTC AA GCT AGC TTA TCA CAT TTT TGT AGT GGC TCT CAT CT-3’(SEQ ID NO:23)。为了与H5HAecto融合，将NDV F基因的TM和CT用HpaI和SacI消化后克隆到pSLH5HAecto得到杂交融合基因。最后，将包含杂交H5HA基因的质粒用NheI消化后克隆到rNDV的cDNA的P基因和M基因间。
6.2.1.3 Western印迹法和生物学分析
细胞或鸟囊腔提取物中的病毒用30％蔗糖垫超速离心进行纯化。用特异性抗体和常规技术通过Western印迹法监测结合进病毒的蛋白的水平。
通过用3×107pfu的嵌合病毒腹腔免疫BALB/c小鼠及三周后使用相同剂量加强免疫来测定嵌合病毒在体内呈现非病毒蛋白KGFR的能力。第二次免疫两周后，通过对转染KGFR编码质粒的MDCK细胞进行免疫染色来检测接种小鼠血清中KGFR抗体的存在。
设计了体内系统来对用包含杂交H7HA/F-TMCT的rNDV进行的免疫是否能针对H7或NDV的后续感染提供保护进行评估。两周大的小鸡通过滴眼液法用100μl下列三种疫苗进行免疫：rNDV、rNDV-H7 HA/F-TMCT和空白对照。4周大时，通过后鼻孔狭缝施用100μl含105.1平均胚胎感染剂量的HPAIV(A/Steele/ACC-10/59[H7N7])，观察鸟的HP AIV感染的信号和损伤。记录死亡率，所有存活动物在6周大时用戊巴比妥钠(100mg/kg)进行安乐死。
6.2.2 结果
6.2.2.1 表达KGFR或KGFR/F-CT的嵌合NDV病毒对KGFR的呈现
嵌合病毒rNDV/B1-KGFR和rNDV/B1-KGFR/F-CT在10天大的鸡胚卵的尿囊腔中生长。用小鼠抗KGFR抗体通过Western印迹分析检测纯病毒中KFGR或KGFR/F-CT的存在。在从接种rNDV/B1-KGFR/F-CT的卵分离出的样品中检测出阳性反应，但接种rNDV/B1-KGFR的没有(图6)。
这些嵌合病毒种的每一种也被用于免疫三只BALB/c小鼠。分析免疫动物血清种KGFR抗体的存在。使用该试验，用rNDV/B1-KGFR病毒免疫的动物没有产生可测水平的KGFR抗体。相反，在rNDV/B1-KGFR/F-CT病毒免疫的三只动物中通过该试验对KGFR抗体的存在均呈阳性。
6.2.2.2 rNDV-H7HA/F-TMCT免疫后对H7感染的保护
野生型H7HA蛋白的TM和CT域被NDV F蛋白的TM和CT域替换以生成杂交HA蛋白，H7HAecto-NDV/F(TM+CT)。在Western印迹分析中，表达H7HA完整ORF的对照rNDV，rNDV-H7HA和表达杂交H7HAecto-NDV/F(TM+CT)的嵌合rNDV，rNDV-H7HAecto-NDV/F(TM+CT)均对H7抗体产生阳性反应；但rNDV-H7HAecto-NDV/F(TM+CT)所产生的信号强许多倍(图7)。当用H7流感致死剂量攻击曾经用rNDV-H7HAecto-NDV/F(TM+CT)免疫的小鸡时，10只经免疫的小鸡中有9只存活(90％)。当用NDV致死剂量攻击曾经用rNDV-H7HAecto-NDV/F(TM+CT)免疫的小鸡时，10只经免疫的小鸡中10只均存活(100％)。
6.3 工程改造呈现外源抗原决定簇的嵌合新城疫病毒
下述实施例描述了嵌合的经修饰的NDV的制备。特别地，制备重组NDV以改善实施例6.2中所用NDV骨架的毒性。本实施例证实rNDV增强的毒性也提高了包含基于rNDV的嵌合病毒的免疫制剂的免疫原性。
6.3.1 材料和方法
除非另外说明，本章节中所述的所有材料和方法均与前述实施例6.2中所述和所示之材料与方法相同。
6.3.1.1 F蛋白中具有经修饰的切割位点的rNDV的制备
利用反向遗传学方法制备重组NDV病毒rNDV/F2aa和rNDV/F3aa，此两种病毒在NDV Hitchner B1株的F基因切割位点有两个或三个氨基酸突变。简言之，为了产生rNDV/F2aa，首先利用全长NDV B1克隆，质粒pT7NDV/B1作为模板及下列引物获得PCR片段：正向：F2aa-1(+)5’-GGATCC CGG TTG GCG CCC TCC AGG(SEQ IN NO:24)，反向：F2aa-1(-)5’-AAG GCG CCt CTG TCT CCg CCC TCC AGA TGT AGT CAC AG-3’(SEQ IDNO:25)；再利用pT7NDV/B1为模板及下述引物来产生另一个PCR片段：正向F2aa-2(+)5’-GGc GGA GAC AGa GGC GCC TTA TAG GCG CCA TTA TTGG-3’(SEQ ID NO:26)，反向F2aa-2(-)5’-CCA TAT TCC CAC CAG CTA GATTGT-3’(SEQ ID NO:27)。小写字母显示的核苷酸被突变以使F蛋白切割位点的氨基酸序列从NDV/B1病毒株的序列(GGRQGR↓L)变为GRRQRR↓L。这两个重叠的PCR片段(重叠区在引物序列中以下划线显示)用引物F2aa-1(+)和F2aa-2(-)通过PCR进行组合。生成的包含完整的F基因的PCR片段被克隆进pSL1180(Amersham Pharmacia Biotech)，命名为pSLF2aa。切取pSLF2aa的StuI-NotI片段(4646-4952位核苷酸)替换pT7NDV/B1质粒中的相应片段，产生pT7NDV/F2aa质粒，此质粒用于用反向遗传学方法制备rNDV/F2aa病毒。为了制备rNDV/F3aa，采用与以上所述相同的策略，用pT7NDV/B1为模板及下述引物进行PCR基因突变：正向，F3aa-1(+)5’-GGATCC CGG TTG GCG CCC TCC AGG-3’(SEQ ID NO:28)；反向，F3aa-1(-)5’-AAa GCG CCt CTG TCT CCg CCC TCC AGA TGT AGT CAC AG-3’(SEQ IDNO:29)；正向，F3aa-2(+)5’-GGc GGA GAC AGa GGC GCt TTA TAG GCGCCA TTA TTG G-3’(SEQ ID NO:30)；反向，F3aa-2(-)5’-CCA TAT TCC CACCAG CTA GAT TGT-3’(SEQ ID NO:31)(突变核苷酸以小写字母显示)。这两个重叠PCR片段(重叠区在引物序列中以下划线显示)用引物F3aa-1(+)和F3aa-2(-)通过PCR进行组合，将切割位点从GGRQGR↓L变为GRRQRR↓F。切取pSLF3aa的StuI-NotI片段(4646-4952)替换pT7NDV/B1质粒的相应片段，产生质粒pT7NDV/F3aa，此质粒用于产生rNDV/F3aa病毒。
6.3.1.2 制备表达嵌合H7HA蛋白的融合rNDV载体
为将嵌合H7 HA基因构建为rNDV/F3aa基因组的额外转录单元，首先以含NDV F基因的质粒为模板，用下述引物通过PCR制备含NDV F基因跨膜结构域(TM)和胞质尾巴(CYTO)的片段：HpaNDVF(TM+CYTO)P，5’-cgGTTAA CCT CAT TAC CTA TAT CGT TTT GACT-3’(SEQ ID NO:32)和SacNheNDVF(TM+CYTO)M，5’cg GAG CTC AAG CTA GCT TAT CAC ATTTTT GTA GTG GCT CTC ATC TG-3’(SEQ ID NO:33)。此PCR产物经SacI和HpaI消化后克隆入含NDV基因终止和基因起始信号的pNhe-NDV-GE/GS质粒，产生pNhe-NDV-GE/GS-NDVF(TM+CYTO)质粒。然后，为了将含H7HA胞外结构域的片段与含NDV F基因的TM和CYTO区的片段相连，以含A/鸡/NY/13142-5/94(H7N2)的H7HA基因的质粒为模板，用下述引物通过PCR制备H7HA胞外区：SpeH7(ECTO)P，5’-cgACT AGT CCG CCA CCATGA ACA CTC AAA TTC TGG CAT TCAT-3’(SEQ ID NO:34)，HpaH7(ECTO)M，5’-cgG TTA ACG TCT TTG TAT CCA CTA CTC AAT TTCAC-3’(SEQ ID NO:35)。该PCR产物经SpeI和HpaI消化后插入质粒pNhe-NDV-GE/GS-NDVF(TM-CYTO)。最后，质粒pNhe-NDV-GE/GS-NDVF(TM-CYTO)经NheI消化后，切出嵌合H7HA基因。该片段DNA被克隆入pT7NDV/F3aa的P基因和M基因之间，产生pT7NDV/F3aa-嵌合H7。表达嵌合H7HA蛋白的rNDV/F3aa病毒通过前述方法从pT7NDV/F3aa-chimericH7质粒中获得。
6.3.1.3 病毒生长动力学
将rNDV/B1、rNDV/F2aa、rNDV/F3aa、rNDV/B1-H7或rNDV/F3aa-嵌合H7病毒(100PFU/卵)接种到10天大的鸡胚卵中。于不同时间点(24、48及72小时)采集尿囊液检测病毒滴度。通过免疫荧光(IFA)分析确定尿囊液中每、种病毒的50％组织培养感染剂量(TCID50)。为了该目的，用10倍系列稀释的样品感染培养于96孔板中的Vero细胞，通过IFA确定NDV蛋白或嵌合H7HA蛋白的存在。
6.3.2 免疫荧光分析
6.3.2.1 免疫荧光分析
用转染流感病毒感染的MDCK细胞被固定并经冰甲醇透化。用抗NDVHN单克隆抗体(7B1)、抗流感H1 HA单克隆抗体(2G9)和抗流感H5 HA多克隆血清检测病毒抗原。为了分析NDV生长及病毒蛋白的表达，用重组病毒感染汇合的Vero细胞，并于不同时间点(24、48、72小时)收获细胞。用含0.1％Titon X-100的2.5％甲醛固定感染细胞。固定的细胞用抗兔NDV多克隆抗体或抗鸡AIV H7多克隆血清处理、洗涤用异硫氰酸荧光素(FITC)偶联的抗鸡免疫球蛋白(DAKO)对AIV H7HA进行染色或用德克萨斯红偶联的抗兔免疫球蛋白对NDV病毒蛋白染色。用荧光显微镜检测病毒蛋白表达。
6.3.2.2 平均死亡时间
为检测重组病毒对鸡胚卵的致病性，测定平均死亡时间(MDT)。简言之，用10倍系列稀释的病毒感染5个10天大的鸡胚卵。将卵培养于37℃，每天监测两次，连续监测7天。记录鸡胚死亡时间。杀死所有鸡胚的最高稀释度确定为最小致死剂量。MDT计算为最小致死剂量杀死胚的平均时间。
6.3.2.3 鸡的免疫和攻击
经结膜囊滴眼法，在白色Leghorn鸡2周及4周大时用105.7-6.1平均鸡胚感染剂量(EID50)的rNDV/F3aa-嵌合H7进行1次或2次接种、或用105.7- 6.3EID50的亲代NDV/B1(pNDV)进行2次接种、或无菌组织培养液(空白对照)进行两次接种。在6周大时，用强毒NDV Fontana株(vvNDV)(105.1EDI50/每只)或A/人/Steele/59(H7N7)HPAI(105.1EID50/每只)鼻内攻击鸡。存活的鸡于攻击后14日进行放血及安乐死。用标准方法确定血凝素抑制(HI)血清滴度。
6.3.3 结果
6.3.3.1 制备融合性rNDV突变体
为增强rNDV骨架的融合特性，构建了两个rNDV突变体rNDV/F2aa和rNDV/F3aa，其中F蛋白的切割位点分别由两种变化的多元切割位点之一所替换，该位点可被广泛表达的蛋白酶(如融合素蛋白酶)所活化(图8A)。用rNDV/F2aa和rNDV/F3aa感染鸡胚成纤维细胞(CEF)导致在无外加蛋白酶的条件下产生合胞体，而rNDV/B1感染则无此现象(图8B)。此外，与rNDV/F2aa相比，rNDV/F3aa在CEF细胞中会更迅速地诱导合胞体。由此推测，病毒在免疫动物体内更好的扩散可以增强对外源插入蛋白的免疫原性。据此，选择rNDV/F3aa作为骨架载体以构建设计用于保护家禽免受AIV和NDV感染的双价疫苗。
6.3.3.2 鸡胚卵中rNDV平台载体的平均死亡时间分析
基于对鸡的致病性，NDV可被分为高毒性(强毒力)、中度毒性(中等毒力)和无毒性(弱毒力)三类。因为已知具有多元切割位点的F蛋白的存在是NDV毒力因子，我们在10天大的鸡胚蛋中对具有经修饰的F蛋白的rNDV的致病性进行了分析。感染NDV的鸡胚平均死亡时间(MDT)在体内与毒力相关。低毒株(在鸟类中产生无症状感染)特征为多于90小时的MDT，中等毒株(鸟类中产生呼吸系统疾病)的MDT在60-90小时之间，强毒株(导致鸟类严重疾病)的MDT低于60小时。rNDV/F2aa的MDT显示低毒株特征，而rNDV/F3aa的MDT则具有典型的中毒株特征。此两株的MDT均无高致病性(强毒)株特征(表3)。
表3.rNDV在鸡胚卵中的MDT
 
病毒 胰蛋白酶需求(细胞培养物) 接种量EID50 MDT(小时)
rNDV/B1 是 10 113
1 122
rNDV/F2aa 否 10 100
1 104
 
rNDV/F3aa 否 10 80
1 84
rNDV/B1-H7 是 10 存活
1 存活
rNDV/3aa-嵌合H7 否 10 128
1 140
基于这些数据，rNDV/F3aa载体对鸟类不据危害，因此适于作为构建可保护鸟类免受AIV和NDV感染的双价疫苗的骨架载体。
6.3.3.3 制备表达AIV HA蛋白胞外结构域的融合性rNDV载体
如上所述，A/鸡/NY/131425/94(H7N2)的H7HA蛋白编码基因结合进rNDV/F3aa载体，形成rNDV/F3aa-嵌合H7(图9A)。鸡胚卵中rNDV/F3aa-嵌合H7的生长动力学与亲本rNDV/F3aa比较。表达嵌合H7 HA蛋白的病毒比没有插入片段的病毒生长更慢，其最大滴度大约低一个数量级。有趣的是，该病毒的MDT具有低毒株特征(128-140小时)(表3)。rNDV/F3aa-嵌合H7对嵌合H7HA蛋白的表达通过对感染后36小时的Vero细胞进行Western印迹分析加以确认(图9C)。
6.3.3.4 AIV H7 HA蛋白向rNDV病毒颗粒中提高的结合
为确定包含NDV F蛋白异源跨膜区和胞质尾区的嵌合H7 HA蛋白的表达是否与提高的蛋白向病毒颗粒中的结合相关，按6.3节中所述方法纯化rNDV/B1-H7和rNDV/F3aa-chimericH7病毒颗粒。利用抗鸡AIV H7多克隆抗体和抗兔NDV多克隆血清通过Western印迹法对来自rNDV/B1-H7或rNDV/F33-嵌合H7的H7 HA蛋白和NDV病毒蛋白的量进行测定。和预期的一样，与野生型H7 HA蛋白相比，嵌合H7HA蛋白向rNDV病毒颗粒中的结合显著提高(图9D)。该数据暗示NDV F蛋白的跨膜区和胞质尾区在改善外源蛋白向病毒表面中的结合中发挥重要作用。
6.3.3.5 鸡的免疫与攻击
经一次或两次rNDV/F3aa-嵌合H7接种后，50-80％的鸡具有对H7 AIV的血凝素抑制(HI)滴度，90-100％的鸡具有对NDV的HI活性(表4A和B)。尽管所有经亲本NDV/B1(pNDV)免疫两次的鸡都具有对NDV的HI滴度，但所有鸡均无对H7 AIV的HI滴度。所有无菌组织培养基(空白对照)感染的鸡对任何一种病毒均无滴度。当用vvNDV攻击时，100％的rNDV/F3aa-嵌合H7及pNDV免疫的鸡得到保护。与此相比，90％的rNDV/F3aa-嵌合H7免疫的鸡对HPAI H7病毒得到保护，而任何pNDV免疫的鸡均无对HPAI H7病毒的保护。作为对比，100％和70％的空白对照感染的鸡分别死于vvNDV和HPAI H7攻击。除了空白对照-HPAI H7病毒攻击组中缺乏受感染的血清学证据的三只存活动物外，其它存活动物均具有失忆反应，表现为对相应攻击病毒的HI滴度发生4倍以上的升高。
表4A 嵌合病毒免疫鸡受攻击前的HI血清学
 
免疫组* AIV/H7抗原 NDV抗原
rNDV/F3aa-嵌合H7，1X 8/10(11) 10/10(49)
rNDV/F3aa-嵌合H7，1X 7/10(10) 10/10(49)
rNDV/F3aa-嵌合H7，2X 8/10(13) 9/10(56)
rNDV/F3aa-嵌合H7，2X 5/10(9) 9/10(60)
pNDV，2X 0/10 10/10(34)
pNDV，2X 0/10 10/10(56)
空白，2X 0/10 0/10
空白，2X 0/10 0/10
表4B嵌合病毒免疫鸡受攻击后HI血清学(攻击后14天)
 
免疫组* 攻击病毒 无存活 AIV/H7抗原 NDV抗原
rNDV/F3aa-嵌合H7，1X vNDV 10/10 9/10(15) 10/10(416)
 
rNDV/F3aa-嵌合H7，1X HPAIV 9/10 9/9(2,048) 9/9(37)
rNDV/F3aa-嵌合H7，2X vNDV 10/10 7/10(17) 10/10(315)
rNDV/F3aa-嵌合H7，2X HPAIV 9/10 8/8(955) 8/8(30)
pNDV，2X vNDV 10/10 0/10 10/10(294)
pNDV，2X HPAIV 0/10 NA NA
空白，2X vNDV 0/10 NA NA
空白，2X HPAIV 3/10 0/3 0/3
空白＝无菌组织培养液
HPAIV＝A/人/Steele/59(H7N7)病毒
HI血清学显示为HI阳性血清鸡的数目/接种鸡的数目；括号中的值是几何平均滴度(GMT)
*n＝10只鸡/组，1X＝一次接种，2X＝2次接种
Man-Seong Park等，题为“Engineered Viral Vaccine Constructs with Dual Specificity：Avian Influenza and Newcastle Disease，”，PNAS 103：8203-8208(2006)的出版物被完整引入本文作为参考。
6.4 等同物
本发明不限于在此所述的具体实施方式的范围，这些实施方式意在对本发明的各方面进行单个示例，功能性等同的方法和组分都在本发明的范围之内。事实上，除了本文所展示和描述的内容外，根据前面的说明和附图，对本发明的各种修改对本领域技术人员而言将是显而易见的。这样的修改均落入所附权利要求书的范围之内。
本文中引用了各种出版物。它们的内容被完整引入本申请为各种目的作为参考。
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Claims (33)

1.一种嵌合禽流感病毒，包含包装的流感病毒NA片段，该片段编码神经氨酸酶融合蛋白，其中NA开放阅读框经修饰由此编码NA胞外结构域的核苷酸被编码非流感传染性物质的神经氨酸酶抗原的胞外结构域的核苷酸替代，该胞外结构域通过N端锚定，由此神经氨酸酶融合蛋白被表达并被结合进该嵌合禽流感病毒中。
2.一种嵌合禽流感病毒，包含包装的流感病毒HA片段，该片段编码血凝素融合蛋白，其中HA开放阅读框经修饰由此编码HA胞外结构域的核苷酸被编码非流感传染性物质的受体结合/融合性抗原的胞外结构域的核苷酸替代；该胞外结构域通过C端锚定，由此血凝素融合蛋白被表达并被结合进该嵌合禽流感病毒中。
3.一种嵌合禽流感病毒，包含包装的双顺反子流感病毒HA片段，包含：
a)编码禽流感血凝素蛋白的第一开放阅读框，和
b)编码血凝素融合蛋白的第二开放阅读框，其中编码该血凝素胞外结构域的核苷酸被编码非流感传染性物质的保护性抗原的胞外结构域替代，该胞外结构与通过C端锚定，
由此，该流感血凝素和该融合蛋白均被表达且被结合进该嵌合禽流感病毒中。
4.一种嵌合禽流感病毒，包含包装的双顺反子流感病毒NA片段，包含：
a)编码禽流感病毒神经氨酸酶蛋白第一开放阅读框，和
b)编码神经氨酸酶融合蛋白的第二开放阅读框，其中编码该神经氨酸酶胞外结构域的核苷酸被编码非流感传染性物质的保护性抗原的胞外结构域替代，该胞外结构与由N端锚定，
由此，该流感神经氨酸酶和该融合蛋白均被表达并被结合进该嵌合禽流感病毒中。
5.一种嵌合禽流感病毒，包含包装的流感病毒NA片段，该片段编码神经氨酸酶融合蛋白，其中NA开放阅读框经修饰由此编码NA胞外结构域的核苷酸被编码NDV的HN抗原的胞外结构域的核苷酸替代，由此该神经氨酸酶融合蛋白被表达并被结合进该嵌合禽流感病毒中。
6.权利要求1、2、3、4或5中所述的嵌合禽流感病毒，其包含包装的NS1基因片段，该片段编码降低该病毒的细胞干扰素拮抗活性的经修饰的NS1蛋白。
7.权利要求1、4或5中所述的嵌合禽流感病毒，其包含HA片段，该片段具有经修饰以去除血凝素多元切割位点的开放阅读框。
8.权利要求3中所述嵌合禽流感病毒，其中，所述第一开放阅读框经修饰以去除血凝素多元切割位点。
9.编码权利要求1、4或5所述NA片段的重组DNA分子。
10.编码权利要求2或3所述HA片段的重组DNA分子。
11.一种制备免疫原性制剂的方法，所述方法包括：
a)在胚蛋中增殖权利要求1、2、3、4或5中所述的嵌合禽流感病毒；和
b)收集后代病毒，
其中所述病毒生长至足够的量且在足以使该病毒免受污染的条件下生长，由此该后代病毒适用于免疫原性制剂。
12.一种制备免疫原性制剂的方法，所述方法包括：
a)在对禽流感病毒易感的细胞系中增殖权利要求1、2、3、4或5中所述的嵌合禽流感病毒；和
b)收集后代病毒，
其中该病毒生长至足够的量且在足以使该病毒免受污染的条件下生长，由此该后代病毒适用于免疫原性制剂。
13.一种减毒的嵌合流感病毒，包含包装的流感病毒NA片段，该片段编码神经氨酸酶融合蛋白，其中NA开放阅读框经修饰由此编码NA胞外结构域的核苷酸被编码非流感传染性物质的神经氨酸酶抗原胞外结构域的核苷酸替代，该胞外结构域通过N端锚定，由此该神经氨酸酶融合蛋白被表达并被结合进该减毒嵌合禽流感病毒中。
14.一种减毒的嵌合禽流感病毒，包含包装的流感病毒HA片段，该片段编码血凝素融合蛋白，其中HA阅读框经修饰由此编码HA胞外结构域的核苷酸被编码非流感传染性物质的受体结合/融合性抗原胞外结构域的核苷酸替代，该胞外结构域通过C端锚定，由此该血凝素融合蛋白可被表达并被结合进该减毒嵌合流感病毒中。
15.一种减毒嵌合禽流感病毒，包含包装的双顺反子流感病毒HA片段，包含：
a)编码禽流感血凝素蛋白的第一开放阅读框，和
b)编码血凝素融合蛋白的第二开放阅读框，其中编码该血凝素胞外结构域的核苷酸被编码包含非流感传染性物质的保护性抗原或疾病相关抗原的胞外结构域的至少一个抗原决定簇的蛋白的核苷酸替代，该蛋白通过C端锚定，
由此，该流感血凝素和该融合蛋白均被表达并被结合进该减毒嵌合流感病毒中。
16.一种减毒嵌合流感病毒，包含包装的双顺反子流感病毒NA片段，包含：
a)编码禽流感神经氨酸酶蛋白的第一开放阅读框，和
b)编码神经氨酸酶融合蛋白的第二开放阅读框，其中编码该神经氨酸酶胞外结构域的核苷酸被编码含非流感传染性物质的保护性抗原或疾病相关抗原的胞外结构域的至少一个抗原决定簇的蛋白的核苷酸替代，该蛋白通过N端锚定，
由此，该流感病毒神经氨酸酶和该融合蛋白均被表达并被结合进该减毒嵌合流感病毒中。
17.权利要求13、14、15或16中所述的减毒嵌合流感病毒，其包含包装的NS1基因片段，该片段编码降低该病毒的细胞干扰素拮抗活性的经修饰的NS1蛋白。
18.权利要求13或16中所述的减毒嵌合流感病毒，其包含HA片段，该片段具有经修饰以去除血凝素多元切割位点的开放阅读框。
19.权利要求15中所述的减毒嵌合流感病毒，其中该第一开放阅读框经修饰以去除血凝素多元切割位点。
20.编码权利要求13或16中所述NA片段的重组DNA分子。
21.编码权利要求14或15中所述HA片段的重组DNA分子。
22.一种制备免疫原性制剂的方法，所述方法包括：
a)在胚蛋中增殖权利要求13、14、15或16中所述的减毒嵌合流感病毒；和
b)收集后代病毒，
其中该病毒生长至足够的量且在足以使该病毒免受污染的条件下生长，由此该后代病毒适用于免疫原性制剂。
23.一种制备免疫原性制剂的方法，所述方法包括：
a)在对减毒流感病毒易感的细胞系中增殖权利要求13、14、15或16中所述的减毒嵌合流感病毒；和
b)收集后代病毒，
其中该病毒生长至足够的量且在足以使该病毒免受污染的条件下生长，由此该后代病毒适用于免疫原性制剂。
24.一种嵌合NDV，包含包装的基因组，该基因组包含编码F融合蛋白的核苷酸序列，该融合蛋白具有F蛋白跨膜结构域和胞质结构域以及非NDV传染性物质的保护性抗原或疾病相关抗原的胞外结构域的至少一个抗原决定簇，该融合蛋白通过C末端锚定，由此该F蛋白-融合蛋白被表达并被结合进该嵌合NDV病毒中。
25.权利要求24中所述的嵌合NDV，其中该基因组包含编码F蛋白的核苷酸序列，由此F蛋白可被表达并被结合进该嵌合NDV中。
26.权利要求24中所述的嵌合NDV，其中编码F融合蛋白的核苷酸序列替代编码NDV F蛋白的核苷酸序列，且F融合蛋白提供F蛋白的功能。
27.一种嵌合NDV，包含包装的基因组，该基因组包含编码HN融合蛋白的核苷酸序列，该融合蛋白具有HN蛋白的跨膜结构域和胞质结构域及非NDV传染性物质的保护性抗原或疾病相关抗原的胞外结构域的至少一个抗原决定簇，该融合蛋白通过N末端锚定，由此该HN蛋白-融合蛋白被表达并被结合进该嵌合NDV中。
28.权利要求27中所述的嵌合NDV，其中该基因组包含编码HN蛋白的核苷酸序列，由此该HN蛋白被表达并被结合进嵌合NDV中。
29.权利要求27中所述的嵌合NDV，其中编码该HN融合蛋白的核苷酸序列替代编码NDV HN蛋白的核苷酸序列，且F融合蛋白提供HN蛋白的功能。
30.一种制备免疫原性制剂的方法，该方法包括：
a)在胚蛋中增殖权利要求24-29中任一权利要求所述的嵌合NDV；和
b)收集后代病毒，
其中该病毒生长至足够的量且在足以使该病毒免受污染的条件下生长，由此该后代病毒适用于免疫原性制剂。
31.一种制备免疫原性制剂的方法，所述方法包括：
a)在对NDV易感的细胞系中增殖权利要求24-29中任一权利要求所述的嵌合NDV；和
b)收集后代病毒，
其中该病毒生长至足够的量且在足以使该病毒免受污染的条件下生长，由此该后代病毒适用于免疫原性制剂。
32.一种在禽类中诱导针对两种传染性物质的免疫应答的方法，所述方法包括施用权利要求1、2、3、4、5、13、14、15、16、24、25、26、27、28或29中所述的嵌合病毒。
33.一种在人类中诱导针对两种传染性物质的免疫应答的方法，所述方法包括施用权利要求13、14、16、24、25、26、27、28或29中所述的嵌合病毒。
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