CN102549152B - 基于腺病毒的载体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了能够表达来自感染性病原体例如流感病毒的抗原的复制型腺病毒载体。所述腺病毒载体可用于接种受试者以抗所述感染性病原体。所述腺病毒载体包含编码所述抗原的异源序列。可将所述异源序列插入腺病毒载体的多个位置，包括特定的E3缺失中或其附近，和/或整合入腺病毒六邻体编码区。所述腺病毒载体可来源于任何腺病毒血清型，特别是Ad4或Ad7血清型。

Description

基于腺病毒的载体
交叉参考相关申请
本申请要求2009年7月31日提交的第61/230,617号美国临时申请的权益，将所述临时申请通过引用整体并入本文。
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发明背景
腺病毒作为传染因子、作为用于基础研究的受试者以及因为它们在基因疗法和疫苗中的潜在用途而已得到广泛研究。已鉴定了49个人腺病毒血清型，并且基于核酸比较、纤维蛋白特征和生物学性质将它们分类成6个亚属(A至F)。例如，A组包括血清型12和31，B组包括血清型3和7，C组包括血清型2和5，D组包括血清型8和30，E组包括血清型4，以及F组包括血清型40和41。
就一般结构而言，迄今为止所检查的所有腺病毒都是直径约80纳米的无包膜正二十面体。腺病毒包含线性双链DNA，所述DNA与核心蛋白复合并且被腺病毒壳体包围。单个病毒体包含按照它们在SDS凝胶上递减的大小的顺序由罗马数字(II-XII)指定的约11种不同的蛋白质。
壳体由7种结构蛋白质：II(六邻体)、III(五邻体)、IIIa、IV(纤维)、VI、VII和IX组成。壳体包含252个壳粒(capsomere)，其240个是六邻体壳粒，12个是五邻体壳粒。作为六邻体蛋白质的三聚体的六邻体壳粒组成约75％的壳体的蛋白质。作为五邻体蛋白质的五聚体的五邻体壳粒位于病毒体的12个顶角的每一个顶角上。每一个五邻体壳粒与6个相邻的六邻体壳粒和纤维连接。通常为纤维蛋白的三聚体的纤维从五邻体壳粒伸出来。六邻体蛋白质以及在较低程度上纤维蛋白质包含腺病毒的主要抗原决定簇并且也决定了血清型特异性。
研究者已检查和比较了不同腺病毒血清型的衣壳蛋白质、特别地六邻体蛋白质的结构，以试图确定所述蛋白质的引发针对其的中和抗体的区域。中和抗体所针对的六邻体蛋白质的主要区域似乎存在环1和2(即，分别地LI或l1以及LII或l2)中，其从六邻体壳粒的基部向外伸出。来自不同腺病毒六邻体蛋白质的环1和2的分析揭示存在7个分开的高变区(HVR1或HVR7)，所述高变区相应于其中六邻体蛋白质在血清型之间显著相异的位置。
腺病毒病毒体的核心包含线性双链DNA基因组和结合蛋白V、VII、X(mu)、IVa2以及末端蛋白(TP)。不同腺病毒的基因组组织是保守的并且已有人提出具有定时功能，其中基因组的末端首先被转录(立即早期基因E1和E4位于线性基因组的相反末端)。E1和E4的早期转录导致基因组的中央区域的开放，从而允许中央区域的转录。
腺病毒基因组通常包含8个RNA聚合酶II转录单位：5个早期单位E1A、E1B、E2A-E2B、E3和E4；2个延迟早期单位IX和IVa2；和主要晚期转录单位。主要晚期转录单位基于选择性剪接位点的使用进一步被细分为L1-L5区域。转录单位通常表达相似功能的蛋白质。例如，E1A单位编码负责当细胞感染时激活转录和诱导S期的两种蛋白质；E1B转录单位编码抑制细胞凋亡的两种蛋白质；E3转录单位参与免疫应答的逃避；主要晚期转录单位编码壳体装配所必需的结构蛋白质。
为了进行基因治疗和接种，重组腺病毒载体已被设计用以编码和表达异源基因和抗原。Ad2和Ad5血清型已被广泛用于该背景中。已将异源序列插入腺病毒基因组，包括早期转录单位和各种结构蛋白(例如六邻体、五邻体和纤维)的编码区中。在许多情况下，腺病毒基因组中(例如E1区中)的缺失已被用于产生复制缺陷型腺病毒载体，其通常被认为给人受试者施用是安全的。尽管进行了如此广泛的研究和发展，但在本领域仍然存在对适合例如用作用于感染性疾病的疫苗的新型重组腺病毒载体的需要。
发明概要
本发明涉及用作有效疫苗的重组腺病毒载体。本发明部分基于以高水平表达异源序列的新型重组腺病毒载体的开发。本发明也部分地基于经设计用以提高宿主免疫反应和设法避免预存中和抗体的新型重组腺病毒载体的开发。本发明也部分基于被用作抗原特异性和/或通用流感疫苗的新型重组腺病毒载体的开发。
因此，在一个方面，本发明提供了包含含有第一异源序列的腺病毒载体的疫苗，其中所述腺病毒载体具有复制能力并且具有部分E3缺失。在某些实施方案中，腺病毒载体来源于Ad2、Ad3、Ad4、Ad5、Ad6、Ad7、Ad11、Ad20、Ad21、Ad22、Ad23、Ad24、Ad25、Ad26、Ad28、Ad34、Ad35、Ad40、Ad41、Ad48、Ad49或Ad50腺病毒。在其它实施方案中，腺病毒载体源自黑猩猩腺病毒例如AdC1、AdC3、AdC6、AdC7或Ad68。在某些实施方案中，第一异源序列被整合入包含部分E3缺失的位置。在某些实施方案中，第一异源序列处于腺病毒转录和/或翻译控制序列的控制之下或与其有效连接。例如，所述第一异源序列可处于腺病毒主要晚期启动子(MLP)、腺病毒三联前导(adenoviraltripartiteleader)(TPL)序列、腺病毒剪接受体序列和/或腺病毒多腺苷酸信号序列的控制之下或与其有效连接。在某些实施方案中，第一异源序列包含和/或处于非腺病毒转录和/或翻译控制序列例如来自巨细胞病毒(CMV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)或猿猴病毒40(SV40)的增强子、启动子、内含子序列和/或前导序列或此类元件的任何组合的控制之下。在某些实施方案中，第一异源序列经修饰以增加表达。例如，第一异源序列可以是经最优化和/或修饰以包含共有Kozak序列的密码子。在某些实施方案中，第一异源序列编码来自感染性病原体例如流感病毒、人乳头瘤病毒(HPV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、芽孢杆菌属(Bacillus)、志贺氏菌属(Shigella)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、疟原虫属(Plasmodium)等的免疫原性多肽。在某些实施方案中，第一异源序列编码来自感染性病原体的至少两个分开的多肽和/或免疫原性表位的多聚体。
在另一个方面，本发明提供了包含含有第一异源序列的腺病毒载体的疫苗，其中所述腺病毒载体具有复制能力并且具有全长E3缺失。在某些实施方案中，所述腺病毒载体来源于Ad2、Ad3、Ad4、Ad5、Ad6、Ad7、Ad11、Ad20、Ad21、Ad22、Ad23、Ad24、Ad25、Ad26、Ad28、Ad34、Ad35、Ad40、Ad41、Ad48、Ad49或Ad50腺病毒。在其它实施方案中，腺病毒载体来源于黑猩猩腺病毒例如AdC1、AdC3、AdC6、AdC7或Ad68。在某些实施方案中，第一异源序列被整合入包含全长E3缺失的位置。在某些实施方案中，第一异源序列处于腺病毒转录和/或翻译控制序列的控制之下或与其有效连接。例如，第一异源序列可处于腺病毒主要晚期启动子(MLP)、腺病毒三联前导(TPL)序列、腺病毒剪接受体序列和/或腺病毒多腺苷酸信号序列的控制之下或与其有效连接。在某些实施方案中，第一异源序列包含和/或处于非腺病毒转录和/或翻译控制序列例如来自巨细胞病毒(CMV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)或猿猴病毒40(SV40)的增强子、启动子、内含子序列和/或前导序列或此类元件的任何组合的控制之下。在某些实施方案中，第一异源序列经修饰以增加表达。例如，第一异源序列可以是经最优化和/或修饰以包含共有Kozak序列的密码子。在某些实施方案中，第一异源序列编码来自感染性病原体例如流感病毒、人乳头瘤病毒(HPV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、芽孢杆菌属、志贺氏菌属、分枝杆菌属、疟原虫属等的免疫原性多肽。在某些实施方案中，所述第一异源序列编码来自感染性病原体的至少两个分开的多肽和/或免疫原性表位的多聚体。
在另一个方面，本发明提供了包含含有第一异源序列的腺病毒载体的疫苗，其中所述腺病毒载体具有复制能力并且其中所述第一异源序列的表达处于腺病毒转录和/或翻译控制序列的控制之下。在某些实施方案中，所述腺病毒载体来源于Ad2、Ad3、Ad4、Ad5、Ad6、Ad7、Ad11、Ad20、Ad21、Ad22、Ad23、Ad24、Ad25、Ad26、Ad28、Ad34、Ad35、Ad40、Ad41、Ad48、Ad49或Ad50腺病毒。在其它实施方案中，腺病毒载体来源于黑猩猩腺病毒例如AdC1、AdC3、AdC6、AdC7或Ad68。在某些实施方案中，第一异源序列具有全长或部分E3缺失。在某些实施方案中，第一异源序列被整合入包含全长或部分E3缺失的位置。在某些实施方案中，第一异源序列处于腺病毒MLP的控制之下或与其有效连接。在某些实施方案中，所述第一异源序列处于腺病毒MLP和腺病毒TPL序列的控制之下或与其有效连接。在某些实施方案中，第一异源序列还处于腺病毒剪接受体序列和/或腺病毒多腺苷酸信号序列的控制之下或与其有效连接。在某些实施方案中，在某些实施方案中，第一异源序列经修饰以增加表达。例如，第一异源序列可以是经最优化和/或修饰以包含共有Kozak序列的密码子。在某些实施方案中，第一异源序列编码来自感染性病原体例如流感病毒、人乳头瘤病毒(HPV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、芽孢杆菌属、志贺氏菌属、分枝杆菌属、疟原虫属等的免疫原性多肽。在某些实施方案中，第一异源序列编码来自感染性病原体的至少两个分开的多肽和/或免疫原性表位的多聚体。
在另一个方面，本发明提供了包含含有第一异源序列和第二异源序列的腺病毒载体的疫苗，其中所述第二异源序列被整合入腺病毒六邻体区域，其中所述第一异源序列被整合入腺病毒非六邻体区域，并且所述腺病毒载体具有复制能力。在某些实施方案中，所述腺病毒载体来源于Ad2、Ad3、Ad4、Ad5、Ad6、Ad7、Ad11、Ad20、Ad21、Ad22、Ad23、Ad24、Ad25、Ad26、Ad28、Ad34、Ad35、Ad40、Ad41、Ad48、Ad49或Ad50腺病毒。在其它实施方案中，腺病毒载体来源于黑猩猩腺病毒例如AdC1、AdC3、AdC6、AdC7或Ad68。在某些实施方案中，所述第一异源序列具有全长或部分E3缺失。在某些实施方案中，所述第一异源序列被整合入包含全长或部分E3缺失的位置。在某些实施方案中，所述第一异源序列处于腺病毒转录和/或翻译控制序列的控制之下或与其有效连接。例如，所述第一异源序列可处于腺病毒主要晚期启动子(MLP)、腺病毒三联前导(TPL)序列、腺病毒剪接受体序列和/或腺病毒多腺苷酸信号序列的控制之下或与其有效连接。
在某些实施方案中，所述第二异源序列被整合入六邻体区域的一个或多个高变区。例如，所述第二异源序列可被整合入六邻体HVR1、HVR2、HVR4或HVR5序列或其组合。在某些实施方案中，所述第二异源序列编码一部分病毒膜蛋白质(例如，内在膜蛋白质或外在膜蛋白(peripheralmembraneprotein))。例如，所述第二异源序列可编码保守病毒膜蛋白的细胞外部分。在某些实施方案中，所述第二异源序列编码一部分流感病毒M2蛋白质、流感基质蛋白质、流感NP蛋白质或来自具有不同血清型的腺病毒的六邻体高变区。在某些实施方案中，所述第二异源序列编码两个或更多拷贝的蛋白质，例如病毒膜蛋白质或其片段。
在某些实施方案中，所述腺病毒载体包含一个或多个额外的异源序列，其中每一个额外的异源序列被整合入六邻体区域并且与所述第二异源序列不同。例如，所述额外的异源序列可以是所有来自具有不同血清型的腺病毒的高变区。
在另一个方面，本发明提供了包含含有第二异源序列的腺病毒载体的疫苗，其中所述第二异源序列编码病毒的膜蛋白质的区域和被整合入腺病毒载体的六邻体区域。在某些实施方案中，所述腺病毒载体来源于Ad2、Ad3、Ad4、Ad5、Ad6、Ad7、Ad11、Ad20、Ad21、Ad22、Ad23、Ad24、Ad25、Ad26、Ad28、Ad34、Ad35、Ad40、Ad41、Ad48、Ad49或Ad50腺病毒。在其它实施方案中，腺病毒载体来源于黑猩猩腺病毒例如AdC1、AdC3、AdC6、AdC7或Ad68。在某些实施方案中，所述第二异源序列与内源腺病毒序列相邻。在其它实施方案中，所述第二异源序列侧翼连接间隔区。在某些实施方案中，所述间隔区编码肽序列“LGS”。在某些实施方案中，所述第二异源序列来自流感病毒。例如，所述第二异源序列可编码流感病毒M2、流感基质蛋白(influenzamatrix)或流感NP多肽或其片段。
在另一个方面，本发明提供了使用本文中描述的基于重组腺病毒载体的疫苗进行接种的方法。在某些实施方案中，所述接种针对流感病毒、人乳头瘤病毒(HPV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、登革热病毒、链球菌属(Streptococcus)、芽孢杆菌属、志贺氏菌属、分枝杆菌属或疟原虫属。
附图简述
图1是参与pPV-Ad4vax重组腺病毒载体的产生的多个克隆步骤的示意图。
图2是举例说明不同阅读框架的位置、E3的示例性部分和完全缺失的终点和其中可将异源序列插入区域的代表性位置的Ad4E3区域的示意图。
图3是显示腺病毒基因组中多个转录单位的位置的示意图。
图4.通过对利用4种不同Ad4H5-HA病毒感染的A549细胞的血凝素表达进行蛋白质印迹的检测。利用2.5×107vp/mL的每一种病毒感染A549细胞(在6孔板中50-70％的汇合)并且于37℃下在CO2培养箱中进行温育。在24或48小时后，制备全细胞裂解物。利用SDS-PAGE分离蛋白质，将其转移至硝酸纤维素，利用抗体探测印迹以检测HA、β-肌动蛋白和α-微管蛋白，如所指示的。标志泳道和对照(未感染的和非相关重组病毒)也被鉴定。除了非最优化的CMV病毒PXVX0113(其表达显著更低水平的HA)外，所有重组病毒都强劲地表达HA。
图5显示流感HA蛋白从本发明的两个不同腺病毒载体的表达，如通过蛋白质印迹分析测定的。PXVX0101载体包含部分E3缺失和编码HA的异源序列，其中所述异源序列被插入部分E3缺失并且在内源MLP的控制之下。PXVX0111载体包含全长E3缺失和编码HA的异源序列，其中所述异源序列被插入E3缺失的近侧并且包含CMV启动子。
图6显示通过实时PCR分析产生的利用PXVX0101感染的A549细胞的H3HA抗原和腺病毒蛋白质的mRNA表达。
图7显示FACS测定中的HA的表面表达，其中利用PXVX0101和PXVX0111感染A549细胞。
图8A和8B显示描述可用于测试本发明的腺病毒载体的产生的一步生长测定法的流程图和PXVX0101和PXVX0111在3个不同细胞系中的测定结果。
图9A和9B显示红细胞在利用流感病毒(A)或PVXV0101(B)感染的A549细胞上凝集。
图10是参与产生可用于产生嵌合六邻体编码序列的六邻体序列的多个克隆步骤的示意图。
图11是六邻体HVR1-6区域在用于构建嵌合序列的六邻体编码序列的片段中的定位的示意图。
图12描述了可用于替代六邻体HVR序列的多个流感表位序列。H5M2e(SEQIDNO：339-341)；H7M2e(SEQIDNO：342-343)；H9M2e(SEQIDNO：344-345)；人M2e(SEQIDNO：346-347)、NP(SEQIDNO：348-349)；MatrixCTL58-66(SEQIDNO：350-351)。
图13描述了一系列嵌合Ad4六邻体结构并且指明哪个HVR可被流感病毒M2、Matrix和/或NP序列或其它Ad7六邻体HVR序列替代。
图14描述了小鼠中由PXVX0103和PXVX0116重组腺病毒诱导的HA特异性抗体反应。
图15.Ad4-H5-Vtn载体设计(PXVX0103)的示意图。去除多碱基结构域的H5HA天然编码序列来源于A/越南/1194/2004流感病毒，并且被插入Ad4病毒E3基因区域。使Ad4病毒E324.8K、E36.8K和E329.7K基因缺失以容纳HA转基因，并且保留E324.8K的剪接受体位点以驱动HA转基因的表达。将来源于Ad5的E3A多腺苷酸化信号序列置于HA编码序列的下游。
图16.(A)显示H5HA的细胞表面表达的PXVX0103的表征。通过在用小鼠抗鸟类H5单克隆抗体(克隆19C11，AdvancedImmunoChemical)染色表面之前，用不同水平的PXVX0103(如所指示的)感染1×106个A549细胞进行48小时来确认HA(H5-Vtn)表面表达。利用山羊抗小鼠IgG-PE第二抗体进行检测。Ad4野生型用作用于比较Ad4-H5-Vtn感染的细胞(系)的对照(阴影区域)。随着Ad4-H5-Vtn的量不断增加，显著的向右偏移显示细胞在细胞表面上正在表达稳定水平的H5蛋白。(B)在(A)中用于流式细胞术的相同样品的Western分析。
图17.如通过病毒感染的A549细胞的红细胞玫瑰花结形成(redbloodcellrosetting)测量的，从PXVX0103表达的重组HA(Vtn)是有功能的。用(A)PXVX0103或(B)Ad4-wt感染24小时，清洗，随后在人供体红细胞(RBC)存在的情况下温育的A549细胞的代谢性照片。玫瑰花结由白色箭头指示，作为A549细胞(更大的细胞)表面上病毒表达的HA与在RBC(更小的细胞)的表面上发现的N-乙酰神经氨酸(细胞中发现的占优势的唾液酸)之间相互作用的记号。这只有在HA正确折叠的情况下才发生。
图18.Ad4-H5-Vtn(PXVX0103)病毒生长在多种人细胞系中相对于Ad4野生型病毒被减弱。将Ad4-H5-Vtn病毒的生长与Ad4WT病毒在几种人细胞系中的生长相比较；A549(肺癌；A)，H1299(肺癌；B)，HepG2(肝细胞癌；C)，HuTu80(十二脂肠腺癌；D)和MRC-5(胚胎肺成纤维细胞；E)。
图19.Ad4特异性中和抗体滴度(A)和在Ad4wt免疫后Ad4特异性细胞免疫(B)。用每小鼠1×109vp的Ad4wt病毒鼻内免疫小鼠以建立针对所述载体的预存免疫。在免疫后4周，使10只单个小鼠放血，并且测定Ad4特异性中和抗体(A)。处死2只小鼠，将脾细胞混合以测定Ad4wt病毒特异性细胞免疫，如通过IFN-γELISPOT测定的(B)。
图20.在Ad4-H5-Vtn疫苗免疫和H5N1重配株(reassortant)病毒攻击后加强Ad4-H5-Vtn疫苗诱导的HAI抗体滴度(A)和HA特异性细胞免疫反应(B)。利用Ad4WT病毒免疫(预处理)成组的小鼠以建立预存免疫。随后利用Ad4-H5-Vtn疫苗的剂量调整(1×109、1×108、1×107和1×106vp/小鼠)鼻内免疫预处理的和首次接受试验的小鼠，在疫苗免疫后6周使小鼠放血，在H5N1重配株病毒攻击后5天再次免疫小鼠以测定HAI抗体滴度。将来自组的3只小鼠放血，将血清混合以测定HAI抗体滴度(A)。也在H5N1攻击前后在相同的时间点上处死两只小鼠，将脾细胞混合以测定特异于4种H5HA(Vtn)-衍生的15-mer肽的H5HA特异性细胞免疫，如通过IFN-γELISPOT评估的(B)。利用Ad4WT病毒预处理并且用H5N1重配株病毒攻击的小鼠在流感病毒攻击后5天未显示可检测的HAI抗体滴度和H5HA特异性细胞反应。
图21.利用更高剂量的Ad4-H5-Vtn疫苗免疫的小鼠体重未减轻(A)，在致死性H5N1重配株病毒攻击后存活(B)并且在肺中显示H5N1重配株病毒的减少(C)。利用Ad4WT病毒免疫成组的小鼠以建立预存免疫。随后通过Ad4-H5-Vtn疫苗的剂量调整鼻内免疫小鼠。在Ad4-H5-Vtn疫苗免疫后6周，用致死剂量的H5N1重配株病毒攻击小鼠。每日评估小鼠的重量(A)，在14天的时期内评估小鼠的存活率(B)以及在H5N1重配株病毒攻击后5天，从一个亚组的小鼠回收肺以测定流感特异性病毒滴度，将其表示为相对于未免疫的小鼠的病毒滴度的减少的百分比(C)。
图22.当通过多种施用途径递送时，Ad4-H5-Vtn(PXVX0103)在兔中诱导的对H5HA转基因的免疫反应。对在第一次免疫后14天后(A)或43天后(其代表第二次免疫后14天)(B)收集的血液样品进行ELISA测定。利用终点测定分析ELISA数据并且所述分析示于表中(C)。
图23.当通过舌下、阴道和直肠途径递送时，Ad4-H5-Vtn(PXVX0103)流感疫苗在小鼠中诱导显著的H5HA特异性抗体反应。对在利用重组Ad4-H5-Vtn病毒颗粒通过舌下(A)、阴道(B)或直肠(C)施用途径第二次免疫后2-4周收集的血液样品进行ELISA测定。
图24.通过对来自用rAd4载体感染的A549细胞的可溶性(PA)和细胞结合的(PA+GPI)重组PA进行western分析的显示。在于SDS-PAGE凝胶上分离后，通过蛋白质印迹分析利用rAd4-PA感染的A549细胞的全细胞裂解物(左图)或细胞培养上清液(右图)。利用抗PA小鼠单克隆抗体探测硝酸纤维素膜。通过参照作为阳性对照的平行装载的商购可得的重组PA(rPA)进行重组蛋白质表达的确认。A549和利用Ad4野生型病毒(Ad4WT)感染的A549代表阴性对照，显示了对rPA的特异性。蛋白质水平显示为对于总蛋白质水平的相对量。
图25.在Ad4-PA感染的A549细胞上检测到的rPA的细胞表面表达。利用为100的MOI感染A549细胞，并且在培养24小时后，使用PA特异性单克隆抗体通过FACS分析测量PA的细胞表面表达。每一个组的平均荧光强度(MFI)示于右边。
图26.PXVX0212和PXVX0214重组Ad4-PA腺病毒在两个人细胞系中显示与Ad4WT相比较减弱的生长。在A549(肺癌)或MRC-5(胚胎肺成纤维细胞，二倍体)细胞的rAd4-PA病毒感染后，利用TCID50测量rAd4水平的时间过程。使用最低感染性水平(对于A549而言1小时以及对于MRC-5而言24小时)作为参照(从而修正感染的差异)计算细胞裂解量。
图27.来自rAd4感染的A549的细胞裂解物保护小鼠免受致死毒素攻击。通过腹膜内注射(IP)相当于利用Ad4WT、重组Ad4-PA或重组Ad4-PA-GPI的病毒颗粒感染的5×108个细胞的全细胞裂解物来免疫小鼠(6/组)。作为阳性对照，皮下(S.C.)施用10μgrPA。免疫后5周，利用致死毒素(120μgPA与60μgLF的组合)静脉内攻击小鼠，并且每天监测小鼠。
图28.在rAd4-PA感染的A549细胞裂解物的IP递送后检测针对rPA的抗体反应。测量获自使用A549细胞(利用重组Ad4-PA腺病毒感染的)的全细胞裂解物腹膜内免疫的小鼠的血清的抗体反应。在免疫后21天，利用ELISA(左图)和基于体外巨噬细胞的毒素中和测定法(右图)分析抗体反应。从6只动物/组计算EC50。
图29.在利用纯化的rAd4PA病毒鼻内免疫小鼠后进行的致死攻击实验的示意图描述。在第0天利用指定的5种不同抗原之一免疫小鼠(n＝25/组)。以每动物1×1010vp(于50-62.5μLPBS中)鼻内(I.N.)施用rAd4病毒，以野生型Ad4病毒作为阴性对照。100μLPBS的终体积中的皮下注射的阳性对照包含单独的10μg重组保护性抗原(rPA)或吸附至1mg氢氧化铝凝胶(RehydragelHPA)的10μgrPA。在免疫后27天测量来自2只小鼠/组的混合的脾细胞中的细胞免疫(IFN-γELISPOT和IL-4ELISPOT)。在第54天测定第1次毒素攻击(免疫后第20天，n＝10/组)幸存的小鼠的细胞免疫。在免疫后14天和40天将相同的9只小鼠/组(5组)放血以进行ELISA和毒素中和测定。也在免疫后46天对每组总共10只小鼠进行致死毒素攻击(利用120μgPA与60μg致死因子的组合)。攻击后监测存活率，进行30天。
图30.在利用纯化的Ad4-PA和Ad4-PA-GPI病毒鼻内免疫后第14天和40天测量血清的抗体反应。利用ELISA分析的抗PAIgG反应示于左图中，并且通过体外基于鼠巨噬细胞的毒素中和测定测量的毒素中和抗体(TNA)示于右图中。通过使用S型剂量反应曲线拟合来自样品的系列稀释的数据来计算EC50。
图31.存活曲线显示当用rAd4-PA病毒免疫时保护小鼠免受致死毒素攻击。在第0天用5种不同免疫原(rPA，rPA+明矾、Ad4野生型、Ad4-PA和Ad4-PA-GPI)之一免疫小鼠(n＝10/组)并且在免疫后第20和46天用致死毒素(60μgPA和30μgLF于100μL总体积的PBS中)进行攻击。监测存活率，进行30天。左图显示在于免疫后第20天攻击后的存活率。右图显示在于免疫后第46天攻击后的存活率。
图32.利用rAd4-PA病毒对小鼠的免疫诱导在致死毒素攻击后被检测到的细胞介导的免疫反应。在免疫后27天，测量在第0天利用5种不同免疫原(rPA、rPA+白蛋白、Ad4野生型、Ad4-PA和Ad4-PA-GPI)之一免疫的小鼠(2只小鼠/组)的混合的脾细胞的细胞介导的免疫反应(IFN-γELISPOT和IL-4ELISPOT)。在第54天(攻击后34天)测定第1次毒素攻击(免疫后第20天，n＝10/组)幸存的小鼠的细胞免疫反应。左图：利用IFN-γELISPOT测量的Th1反应。右图：利用IL-4ELISPOT测量的Th2。
图33.52.5K多肽的Ad4-CMV-HTL24(PXVX0109)表达。(A)包含24个各自被GPGPG间隔区序列(SEQIDNO：353)分隔的流感病毒辅助者表位的HTL24多肽基因的示意图。(B)来自用具有E3区域的全长缺失并且由CMV启动子驱动的HTL24表达的重组Ad4病毒(PXVX0109)感染的A549细胞的细胞裂解物的蛋白质印迹分析。作为阳性对照，利用A/乌拉圭/716/2007(A/布里斯班/10/2007-样)流感病毒(NYMCX-175C重配株，NIBSC)感染A549细胞。PVXV0109重组腺病毒高效地表达HTL24多肽，如通过在52.5kDa上迁移的条带所显示的。
发明详述
如本文中所使用的，下列术语应当具有下列意义。
术语“腺病毒载体”是指野生型、突变型和/或重组腺病毒基因组以及包含这样的基因组的腺病毒。腺病毒载体可包含任何腺病毒血清型的基因组的全部或部分以及其组合(即，杂交基因组(hybridgenome))。
术语“感染性病原体”是指能够感染人和引起健康的衰退和/或触发免疫反应的任何试剂。在某些实施方案中，感染性病原体是病毒，例如流感病毒、逆转录病毒(例如，HIV、劳斯肉瘤病毒(RSV)、人内源性逆转录病毒K(humanendogenousretrovirusK(HERV-K))、人内源性逆转录病毒K(HERV-K))、乳头瘤病毒(例如，人乳头瘤病毒)、细小核糖核酸病毒(例如，甲型肝炎、脊髓灰质炎病毒)、嗜肝DNA病毒(例如，乙型肝炎)、黄病毒(例如，丙型肝炎、黄热病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒、西尼罗病毒)、披盖病毒(togavirus)(例如，基孔肯雅病毒(chikungunyavirus)、东方马脑炎病毒(EEE)病毒、西方马脑炎(WEE)病毒、委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒、疱疹病毒(例如，巨细胞病毒)、副粘病毒(副流感病毒、肺炎病毒、毛细支气管炎病毒、普通感冒病毒(commoncoldvirus)、麻疹病毒、腮腺炎病毒)、弹状病毒(例如，狂犬病病毒)、丝状病毒(filovirus)(例如，埃博拉病毒(Ebolavirus))、布尼亚病毒(例如，汉坦病毒、裂谷热病毒(RiftValleyFevervirus))、杯状病毒(例如，诺如病毒)或呼肠孤病毒(reovirus)(例如，轮状病毒、EB病毒(Epstein-Barrvirus)、单纯疱疹病毒1和2型)。
在另一个实施方案中，所述感染性病原体是原核生物例如革兰阴性细菌、革兰阳性细菌或其它类型的细菌。此类原核生物包括但不限于芽孢杆菌属(Bacillus)(例如，炭疽杆菌(Bacillusanthracis))、分枝杆菌属(Mycobacterium)(例如，结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、麻风分枝杆菌(MycobacteriumLeprae))、志贺氏菌属(Shigella)(例如，宋氏志贺氏菌(Shigellasonnei)、痢疾志贺氏菌(Shigelladysenteriae)、福氏志贺氏菌(Shigellaflexneri))、螺杆菌属(Helicobacter)(例如，幽门螺杆菌(Helicobacterpylori))、沙门菌属(Salmonella)(例如，肠炎沙门菌(Salmonellaenterica)、伤寒沙门菌(Salmonellatyphi)、鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium))、奈瑟氏菌属(Neisseria)(例如，淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis))、莫拉菌属(Moraxella)(例如，粘膜炎莫拉菌(Moraxellacatarrhalis))、嗜血菌属(Haemophilus)(例如，流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae))、克雷伯菌属(Klebsiella)(例如，肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae))、军团菌属(Legionella)(例如，嗜肺军团菌(Legionellapneumophila))、假单胞菌(Pseudomonas)(例如，铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa))、不动杆菌属(Acinetobacter)(例如，鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii))、李斯特氏菌属(Listeria)(例如，单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes))、葡萄球菌属(Staphylococcus)(例如，抗甲氧西林、多重抗药的或抗苯唑西林金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus))、链球菌属(Streptococcus)(例如，肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae))、棒状杆菌属(Corynebacterium)(例如，白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheria))、梭菌属(Clostridium)(例如，肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、破伤风梭菌(Clostridiumtetani)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile))、衣原体属(Chlamydia)(例如，肺炎衣原体(Chlamydiapneumonia)、沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis))、弯曲菌属(Camphylobacter)(例如，空肠弯曲菌(Camphylobacterjejuni))、博德特氏菌属(Bordetella)(例如，百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis))、肠球菌属(Enterococcus)(例如，粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、屎肠球菌(Enterococcusfaecum)、抗万古霉素肠球菌(VRE))、弧菌属(Vibrio)(例如，霍乱弧菌(Vibriocholerae))、耶尔森氏菌属(Yersinia)(例如，鼠疫耶尔森氏菌(Yersiniapestis))、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)(例如，洋葱伯克霍尔德氏菌群(Burkholderiacepaciacomplex))、柯克斯体属(Coxiella)(例如，伯氏柯克斯体(Coxiellaburnetti))、弗朗西斯菌属(Francisella)(例如，土拉热弗朗西斯菌(Francisellatularensis))和埃希氏菌属(Escherichia)(例如，肠毒性、肠出血性(enterohemorrhagic)或产生志贺毒素的大肠杆菌例如ETEC、EHEC、EPEC、EIEC和EAEC))。
在其它实施方案中，感染性病原体是真核生物。真核生物的实例包括但不限于原生生物例如疟原虫属(Plasmodium)(例如，恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)、间日疟原虫(Plasmodiumvivax)、卵形疟原虫(Plasmodiumovale)、三日疟原虫(Plasmodiummalariae)、腹泻疟原虫(Plasmodiumdiarrhea)和真菌例如念珠菌属(Candida)(例如，白色念珠菌)、曲霉属(Aspergillus)(例如，烟曲霉(Aspergillusfumigatus))、隐球菌属(Cryptococcus)(例如，新型隐球菌(Cryptococcusneoformans))、组织胞浆菌属(Histoplasma)(例如，荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum))、肺囊虫属(Pneumocystis)(例如，杰氏肺囊虫(Pneumocystisjirovecii))和球孢菌属(Coccidioides)(例如，粗球孢子菌(Coccidioidesimmitis))。
术语“癌症”是指特征在于特定细胞群体的增殖的异常增加的医疗状况(medicalcondition)。癌细胞可来源于任何组织或器官，包括例如，皮肤、肌肉、肺、心脏、肝、肾、神经组织等。在某些实施方案中，所述癌症是良性的(例如，良性肿瘤)。在其它实施方案中，所述癌症是恶性的(例如，恶性肿瘤)。在某些实施方案中，所述癌症是转移性的(即，癌细胞能够从它们的起源位置迁移至另一个组织或器官)。
必要时应在整个说明书中定义其它术语。
本发明涉及重组腺病毒疫苗。部分基于以高水平表达异源序列的新型重组腺病毒载体的开发。本发明也部分地基于经设计用以提高宿主免疫反应和设法避开预存中和抗体的新型重组腺病毒载体的开发。本发明也部分基于被用作抗原特异性和/或通用流感疫苗的新型重组腺病毒载体的开发。
因此，在一个方面，本发明提供了包含第一异源序列的腺病毒载体。如本文中所使用的，“异源序列”是当整合入腺病毒载体时产生腺病毒序列与所述核酸序列的非天然存在的并置的核酸序列。通常，异源序列可包含在非腺病毒来源的核酸序列。例如，异源序列可以是完全、大部分或部分是非腺病毒(例如，腺病毒和非腺病毒序列的嵌合体)来源的。然而，在某些实例中，异源序列可以完全是腺病毒来源的，例如来自一种类型的腺病毒的腺病毒序列可被整合入从不同类型的腺病毒产生的腺病毒载体。例如，可将编码来自一种类型的腺病毒的六邻体或纤维蛋白质的腺病毒序列整合入从不同类型的腺病毒产生的腺病毒载体，以产生具有来自不同血清型的纤维蛋白质的重组腺病毒和/或具有嵌合的六邻体和纤维蛋白质的腺病毒。包含第一异源序列的腺病毒载体可用作例如抗感染性病原体或癌细胞的疫苗。因此，所述第一异源序列可编码来自感染性病原体的抗原。可选择地，所述第一异源序列可编码与癌细胞相关的抗原。
在某些实施方案中，所述第一异源序列编码由感染性病原体产生的蛋白质的全部或部分。所述蛋白质或其片段(例如，切割产物、结构域、二级结构的单元、B细胞表位、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位、辅助T淋巴细胞(HTL)表位等)可位于感染性病原体的表面。例如，所述蛋白质或其片段可具有高度抗原性，参与细胞靶向和/或参与细胞进入。可选择地，所述蛋白质或其片段(例如，切割产物、结构域、二级结构的单元、B细胞表位、CTL或TTL表位等)可位于感染性病原体的内部。例如，所述蛋白质或其片段可以是细胞内蛋白质、有包膜病毒的衣壳或核心蛋白质、无包膜病毒的核心蛋白质。
在某些实施方案中，所述表位、结构域或二级结构的单元是进化上保守的。如本文中所使用的，术语“进化上保守的”意指序列在不同组的特定感染性病原体的株系中至少约50％的保守。对于病毒，一组多样性株系包括用于疫苗的来自每一个鉴定的亚分类(例如，血清型)的至少一个分离株(其能够感染，从而在目标群体中引发疾病或病症)，或包括此类株系的已知多样性的代表性数目的感染性分离株。例如，在某些实施方案中，不同组的流感病毒株系包括与人、猪和/或鸟类的疾病相关的代表性株系，包括H1N1株系(例如，A/威尔逊-史密斯/33、A/新喀里多尼亚/20/99、A/猪韩国/S10/2004、A/布雷维格教区/1/1918、A/波多黎各/8/34/西奈山、A/加利福尼亚/7/2009、A/加利福尼亚/05/2009、A/加利福尼亚/08/2009、A/德克萨斯/04/2009、A/猪/萨斯喀彻温/18789/02、A/绿头鸭/艾伯塔/130/2003、A/绿头鸭/艾伯塔/2001、A/猪/Cotesd’Armor/1482/99、A/猪/Betzig/2/2001和/或A/火鸡/德国/3/91)、H3N2株系(例如，A/珀斯/16/2009)、H2N2株系(例如，A/日本/305/57、A/阿纳博/6/60、A/加拿大/720/05、A/绿头鸭/NY/6750/78、A/绿头鸭/波茨坦/177-4/83和/或A/鸭/北海道/95/2001)、N3N2株系(例如，A/香港/1/66、A/夏洛特维尔/03/2004、A/坎特伯雷/129/2005、A/福建/411/01-样、A/鸭/韩国/S9/2003、A/猪/德克萨斯/4199-2/98、A/火鸡/俄亥俄/313053/2004和/或A/火鸡/北卡罗来纳/12344/03)、H5N1株系(例如，A/猪/山东/2/03、A/鹅/广东/1/96、A/鸭/湖南/114/05、A/越南/1203/2004、A/越南/DT-036/2005、A/越南/1194/2004、A/越南/1203/2004、A/安徽/1/2005、A/埃及/2321/2007、A/埃及/3300-NAMRU3/2008、A/壁虎/诺沃西比尔斯克/29/2005、A/斑头雁/Mondolia/1/05、A/猫/泰国/KU-02/04、A/香港/213/03、A/鸡/广东/174/04和/或A/HK/159/97)、H6N1株系(例如，A/水鸭/香港/1073/99)、H6N2株系(例如，A/鸡/加利福尼亚/0139/2001和/或A/海鸠/瑞典/3/2000)、H6N9株系(例如，A/鹅/香港/W217/97)、H7N1株系(例如，A/FPV/罗斯托克/34)、H7N3株系(例如，A/鸡/英属哥伦比亚/04和/或A/火鸡/意大利/220158/2002)、H7N7株系(例如，A/鸡/荷兰/1/2003、A/荷兰/219/03、A/FPV/Dobson/27和/或A/鸡/FPV/Weybridge)、H9N2株系(例如，A/滨鸟/特拉华/9/96、A/猪/韩国/S452/2004、A/鸭/香港/Y439/97、A/香港/1073/99、A/HK/2108/2003、A/鹌鹑/香港/G1/97、A/鸭/香港/Y280/97、A/鸡HK/FY23/03和/或A/鸡HK/G9/97)和B流感病毒株系(例如，B/布里斯班/60/2008)。在某些实施方案中，不同组的流感病毒株系包括所有上述株系以及已知与人、猪或鸟类的疾病相关的其它流感病毒株系。对于细胞病原体，例如细菌、原生生物、真菌等，一组多样性株系包括来自每一个种的至少一个分离株(其能够感染，从而在疫苗的目标群体中引起疾病或病症)，或包括此类株系的已知多样性的代表性数目的感染性分离株。在某些实施方案中，所述表位和/或结构基元是至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高度保守的。
在某些实施方案中，所述第一异源序列编码存在于由感染性病原体产生的蛋白质中的多个表位(例如，B细胞、CTL或HTL表位)和/或结构基元(例如，蛋白质结构域或二级结构的单元)。在某些实施方案中，多个表位和/或结构基元的一个或多个在进化上是保守的。在某些实施方案中，所述第一异源序列编码至少5、10、15、20、25、30、35、40或更多个表位和/或结构基元。多个表位和/或结构基元可来自单个蛋白质或来自多个蛋白质。在某些实施方案中，多个表位和/或结构基元由单个表位或结构基元的多聚体组成或包含所述多聚体。在其它实施方案中，多个表位和/或结构基元包含不同表位和/或结构基元的多聚体。例如，所述多聚体可包括来自单个蛋白质的2个或更多个表位和/或结构基元或来自两个或更多个蛋白质的每一个的一个或多个表位和/或结构基元。如本文中所使用的，“多聚体”是包含一系列分开的多肽(所述多肽已被连接起来形成单个更大的多肽)的蛋白质序列。在某些实施方案中，连接体序列用于将相邻分开的多肽连接在多聚体中。本领域技术人员可容易地鉴定能够在多聚体中用作连接体的短肽序列。
在某些实施方案中，所述多个表位包括多个HTL表位，其中每一个HTL表位包含HLAII类结合肽。如本文中使用的，“HLAII类结合肽”是以小于1000nM的IC50结合HLAII类分子的肽。一般而言，HLAII类结合肽在长度上为约6至约25个氨基酸或约13至约21个氨基酸。在某些实施方案中，所述多个HTL表位的一个或多个表位包括结合HLAII类分子的HLAII类结合肽，所述HLAII类分子选自HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0301、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0402、HLA-DRB1*0404、HLA-DRB1*0405、HLA-DRB1*0701、HLA-DRB1*0801、HLA-DRB1*0802、HLA-DRB1*0901、HLA-DRB1*1001、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB1*1107、HLA-DRB1*1201、HLA-DRB1*1301、HLA-DRB1*1302、HLA-DRB1*1333、HLA-DRB1*1401、HLA-DRB1*1403、HLA-DRB1*1447、HLA-DRB1*1501、HLA-DRB1*1601、HLA-DRB3*0101、HLA-DRB3*0201、HLA-DRB3*0215、HLA-DRB3*0301、HLA-DRB4*0101和HLA-DRB5*0101、HLA-DRB5-0202。在某些实施方案中，所述多个HTL表位的一个或多个包括结合HLAII类分子的HLAII类结合肽，所述HLAII类分子选自如例如Doytchinova和Flower(2005)JImmunol174：7085和/或Southwood等人(1998)JImmunol160：3363中所述的HLA-DR1、HLA-DR3、HLA-DR4、HLA-DR5、HLA-DR9超型变体。在某些实施方案中，所述多个HTL表位的一个或多个表位包含结合HLAII类的肽，该肽结合多个HLAII类分子(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多)。所述多个HLAII类分子可以例如选自HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0301、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0402、HLA-DRB1*0404、HLA-DRB1*0405、HLA-DRB1*0701、HLA-DRB1*0801、HLA-DRB1*0802、HLA-DRB1*0901、HLA-DRB1*1001、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB1*1107、HLA-DRB1*1201、HLA-DRB1*1301、HLA-DRB1*1302、HLA-DRB1*1333、HLA-DRB1*1401、HLA-DRB1*1403、HLA-DRB1*1447、HLA-DRB1*1501、HLA-DRB1*1601、HLA-DRB3*0101、HLA-DRB3*0201、HLA-DRB3*0215、HLA-DRB3*0301、HLA-DRB4*0101以及HLA-DRB5*0101、HLA-DRB5-0202。在某些实施方案中，所述多个HTL表位的一个或多个包含结合HLAII类分子的HLAII类结合肽，所述HLAII类分子选自如例如Doytchinova和Flower(2005)JImmunol174：7085和/或Southwood等人(1998)JImmunol160：3363中所述的HLA-DR1、HLA-DR3、HLA-DR4、HLA-DR5、HLA-DR9超型变体。在某些实施方案中，多个HTL表位包括共同地结合各个HLAII类分子的HLAII类结合肽，所述HLAII类分子选自HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0301、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0402、HLA-DRB1*0404、HLA-DRB1*0405、HLA-DRB1*0701、HLA-DRB1*0801、HLA-DRB1*0802、HLA-DRB1*0901、HLA-DRB1*1001、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB1*1107、HLA-DRB1*1201、HLA-DRB1*1301、HLA-DRB1*1302、HLA-DRB1*1333、HLA-DRB1*1401、HLA-DRB1*1403、HLA-DRB1*1447、HLA-DRB1*1501、HLA-DRB1*1601、HLA-DRB3*0101、HLA-DRB3*0201、HLA-DRB3*0215、HLA-DRB3*0301、HLA-DRB4*0101和HLA-DRB5*0101、HLA-DRB5-0202。在某些实施方案中，所述多个HTL表位的一个或多个包括结合HLAII类分子的HLAII类结合肽，所述HLAII类分子选自如例如Doytchinova和Flower(2005)JImmunol174：7085和/或Southwood等人(1998)JImmunol160：3363中所述的HLA-DR1、HLA-DR3、HLA-DR4、HLA-DR5、HLA-DR9超型变体。
在某些实施方案中，所述多个表位包括多个CTL表位，其中每一个CTL表位包括HLAI类结合肽。如本文中所使用的，“HLAI类结合肽”是以小于500nM的IC50结合HLAII类分子的肽。一般而言，HLAI类结合肽在长度上为约8至约13个氨基酸或约8、9、10或11个氨基酸。在某些实施方案中，所述多个CTL表位的一个或多个包括结合HLAI类分子的HLAI类结合肽，所述HLAI类分子选自如例如Sidney等人(2008)BMCImmunol9：1中描述的HLA-A01、HLA-A02、HLA-A03、HLA-A24、HLA-B07、HLA-B08、HLA-B27、HLA-B58、HLA-B62和HLA-B44超型变体。在某些实施方案中，所述多个CTL表位的一个或多个包括结合多个HLAI类分子(例如，至少2、3、4、5或6个)的HLAI类结合肽的HLAI类结合肽。例如，CTL表位可结合：多个HLA-A01超型变体(例如，选自A*0101、A*2601、A*2602、A*2603、A*2902、A*3001、A*3002、A*3003、A*3004和A*3201)；多个HLA-A02超型变体(例如，选自A*0201、A*0202、A*0203、A*0204、A*0205、A*0206、A*0207、A*0214、A*0217、A*6802和A*6901)；多个HLA-A03超型变体(例如，选自A*0301、A*1101、A*3101、A*3301、A*6601、A*6801和A*7401)；多个HLA-A24超型变体(例如，选自A*2301、A*2402和A*2902)；多个HLA-B07超型变体(例如，选自B*0702、B*0703、B*0705、B*1508、B*3501、B*3503、B*4201、B*5101、B*5102、B*5103、B*5301、B*5401、B*5501、B*5502、B*5601、B*6701和B*7801)；多个HLA-B08超型变体(例如，选自B*0801和B*0802)；多个HLA-B27超型变体(例如，选自B*1402、B*1503、B*1509、B*1510、B*1518、B*2702、B*2703、B*2704、B*2705、B*2706、B*2707、B*2709、B*3801、B*3901、B*3902、B*3909、B*4801和B*7301)；多个HLA-B44超型变体(例如，选自B*1801、B*3701B*4001、B*4002、B*4006、B*4402、B*4403和B*4501))；多个HLA-B58超型变体(例如，选自B*1516、B*1517、B*5701、B*5702、B*5801和B*5802)；或多个HLA-B62超型变体(例如，选自B*1501、B*1502、B*1512、B*1513、B*4601和B*5201)。在某些实施方案中，所述多个CTL表位包括共同地结合至少一个HLAI类分子的HLAI类结合肽，所述HLAI类分子选自HLA-A01、HLA-A02、HLA-A03、HLA-A24、HLA-B07、HLA-B08、HLA-B58、HLA-B62和HLA-B44超型的每一个。
人研究已显示细胞免疫反应在控制流感病毒感染中起着重要作用。参见，例如，McMichael等人(1983)，NewEnglandJ.Med.309(1)：13；Sonoguchi等人(1985)，JInfect.Disease151(1)：81。细胞免疫反应的保护效应可以在老年人(参见人，例如，Almanzar等人(2007)，Wien.Med.Wochenschr157/5-6：116，McElhaney等人(2006)，JImmunol.176：6333)和在年幼儿童(参见，例如，Forest等人(2008)Clin.VaccineImmunol.15(7)：1042)中特别相关。为了评估已特异于已鉴定的表位的免疫原性，可使用人供体外周血单核细胞(PBMC)和肽进行回忆应答。可假定表位特异性回忆应答是先前流感病毒感染的结果，并且此类T细胞的存在表明表位通常是天然产生的，从而是疫苗包裹体(vaccineinclusion)的优良选择。在某些实施方案中，由所述第一异源序列编码的CTL或HTL表位具有当ELISPOT测定分析时产生为本底反应的至少2倍以上，例如300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、2000、2500、3000或更多倍的人干扰素γ(IFN-γ)反应(具体地，斑点形成细胞(SFC)/1×106个细胞)的能力。可以通过两种方式测试所选择的CTL或HTL肽：(1)直接地离体测试，其中解冻PBMC，在培养基中放置5天，然后利用IFN-γELISPOT测定法测量反应，和(2)在培养步骤后，利用肽增加灵敏性。可将来自指定的表位的显著反应定义为大于本底反应的平均值+(2.0×标准差)的反应。测定本方法的本底反应是至关重要的。可使用来自供体未暴露于的病原体例如HIV、HBV、HCV和恶性疟原虫的超型CTL和HTL结合肽来测定本底反应。在某些实施方案中，由所述第一异源序列编码的CTL或HTL表位在进化上是保守的并且具有当ELISPOT测定分析时产生为本底反应的至少2倍以上，例如300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、2000、2500、3000或更多倍的人IFN-γ反应的能力。在某些实施方案中，由所述第一异源序列编码的CTL或HTL表位在进化上是保守的，具有当ELISPOT测定分析时产生为本底反应的至少2倍以上，例如300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、2000、2500、3000或更多倍的人IFN-γ反应的能力，并且分别展示减弱的与HLAI类或II类分子的结合(即，结合超过一个)。用于测试CTL或HTL表位结合HLAI类和II类分子并且产生人FN-γ反应的能力的方法在本领域内是已知的并且已描述于例如2007年5月18日提交的WO2008/054540(Alexander等人)、2007年7月23日提交的WO2008/039267(Alexander等人)和Assarsson等人(2008)，JVirol82：12241中，将每一篇所述文献的内容通过引用并入本文。
在某些实施方案中，所述第一异源序列编码来自流感病毒的抗原。适当的流感可以是表面抗原例如血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、M2或其片段(例如，一个或多个HTL或CTL表位)。其它适当的流感抗原包括M1、NP、NS1、NS2、PA、PB1和PB2或其片段(例如，一个或多个HTL或CTL表位)。
在某些实施方案中，所述第一异源序列编码全长流感HA蛋白或其部分例如外部(即，位于流感病毒的外表面上的部分)、HA1片段、HA2片段或一个或多个表位(例如，B-细胞、HTL或CTL表位)。在某些实施方案中，所述部分、片段或表位来自进化上保守的序列。在某些实施方案中，所述表位是分别展示减弱的对HLAI类或II类分子的结合和/或具有当使用人供体PBMC进行ELISPOT测定分析时产生人干扰素γ(IFN-γ)反应的能力的HTL或CTL表位。如上文中所论述的，HTL或CTL表位可形成串联体，其中重复单个HTL或CTL表位和/或其中将多个HTL和/或CTL表位连接在一起。在某些实施方案中，所述第一异源序列编码一个或多个选自表1中显示的组(即，SEQIDNO：1-12)的HAHTL表位。在其它实施方案中，所述第一异源序列编码一个或多个选自表2中显示的组(即，SEQIDNO：62-67)的HACTL表位。
表1
a)保守性％基于来自51个流感病毒株(H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H9N2等)的序列分析。
b)结合的等位基因#是指选自被肽结合的HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0301、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0404、HLA-DRB1*0405、HLA-DRB1*0701、HLA-DRB1*0802、HLA-DRB1*0901、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB1*1302、HLA-DRB1*1501、HLA-DRB4*0101和HLA-DRB5*0101的HLAII类分子的数目。
c)回忆是指展示当ELISPOT测定分析时高于2倍本底反应的IFN-γ反应的人供体的数目。
表2
a)结合的等位基因#是指被肽结合的来自特定HLA超型的HLAI类分子的数目。对于HLA-A1，测试A*101、A*2601、A*2902和A*3002；对于HLA-A2，测试A*0201、A*0202、A*0203、A*0206和A*6802；对于HLA-A3，测试A*0301、A*1101、A*3101、A*3301和A*6801；对于HLA-A24，测试A*2301、A*2402、A*2902和A*3002；结于HLA-B7，测试B*0702、B*3501、B*5101、B*5301和B*5401；对于HLA-B44，测试B*1801、B*4001、B*4002、B*4403和B*4501。
在某些实施方案中，所述第一异源序列编码全长流感病毒NA蛋白质或其部分，例如外部(即，位于流感病毒的外表面上的部分)、片段或表位(例如，一个或多个B-细胞、HTL或CTL表位)。在某些实施方案中，所述部分、片段或表位来自进化上保守的序列。在某些实施方案中，所述表位是分别展示减弱的对HLAI类或II类分子的结合和/或具有当使用人供体PBMC进行ELISPOT测定分析时产生人干扰素γ(IFN-γ)反应的能力的HTL或CTL表位。如上文中所论述的，HTL或CTL表位可形成串联体，其中重复单个HTL或CTL表位和/或其中将多个HTL和/或CTL表位连接在一起。在某些实施方案中，所述第一异源序列编码一个或多个拷贝的SEQIDNO：19(参见表1)。在其它实施方案中，所述第一异源序列编码一个或多个选自表3中显示的组(即，SEQIDNO：86-109)的NACTL表位。
表3
a)参见表2的脚注(a)。
在某些实施方案中，所述第一异源序列编码全长流感病毒M2蛋白或其部分，例如外部(即，M2e，位于流感病毒的外表面上的蛋白质)、片段或表位(例如，一个或多个B-细胞、HTL或CTL表位)。在某些实施方案中，所述部分、片段或表位来自进化上保守的序列。例如，在某些实施方案中，外部M2部分具有表4中显示的序列。所述第一异源序列可编码两个或更多个M2片段或部分的串联体(例如，表4中显示的单个M2e序列或表4中显示的两个或更多个M2e序列的两个或更多个重复)。在某些实施方案中，所述第一异源序列编码包含SEQIDNO：312、SEQIDNO：318、SEQIDNO：321、SEQIDNO：327或其任何组合(例如，所有4个序列的至少一个拷贝)的重复序列。在某些实施方案中，所述M2表位是分别展示减弱的对HLAI类或II类分子的结合和/或具有当使用人PBMC进行的ELISPOT测定分析的肽再刺激时产生人干扰素γ(IFN-γ)反应的能力的HTL或CTL表位。如上文中所论述的，所述HTL或CTL表位可形成串联体，其中重复单个HTL或CTL表位和/或其中将多个HTL和/或CTL表位连接在一起。在某些实施方案中，所述第一异源序列编码一个或多个拷贝的SEQIDNO：18(参见表1)。在其它实施方案中，所述第一异源序列编码一个或多个选自表5中显示的组(即，SEQIDNO：80-85)的M2CTL表位。
表4
表5
a)参见表2的脚注(a)。
在某些实施方案中，所述第一异源序列编码全长流感病毒M1蛋白或其部分，例如表位(例如，一个或多个HTL或CTL表位)。在某些实施方案中，所述部分或表位来自进化上保守的序列。在某些实施方案中，所述表位是分别展示减弱的对HLAI类或II类分子的结合和/或具有当使用人PBMC进行ELISPOT测定分析时产生人干扰素γ(IFN-γ)反应的能力的HTL或CTL表位。如上文中所论述的，所述HTL或CTL表位可形成串联体，其中重复单个HTL或CTL表位和/或其中将多个HTL和/或CTL表位连接在一起。在某些实施方案中，所述第一异源序列编码一个或多个选自表1中显示的组(即，SEQIDNO：13-17)的M1HTL表位。在其它实施方案中，所述第一异源序列编码一个或多个选自表6中显示的组(即，SEQIDNO：68-79)的M1CTL表位。
表6
a)参见表2的脚注(a)。
在某些实施方案中，所述第一异源序列编码全长流感病毒NP蛋白或其部分，例如表位(例如，一个或多个HTL或CTL表位)。在某些实施方案中，所述部分或表位来自进化上保守的序列。在某些实施方案中，所述表位是分别展示减弱的对HLAI类或II类分子的结合和/或具有当使用人PBMC进行ELISPOT测定分析时产生人干扰素γ(IFN-γ)反应的能力的的HTL或CTL表位。如上文中所论述的，所述HTL或CTL表位可形成串联体，其中重复单个HTL或CTL表位和/或其中将多个HTL和/或CTL表位连接在一起。在某些实施方案中，所述第一异源序列编码一个或多个选自表1中显示的组(即，SEQIDNO：20-26)的NPHTL表位。在其它实施方案中，所述第一异源序列编码一个或多个选自表7中显示的组(即，SEQIDNO：110-139)的NPCTL表位。在其它实施方案中，所述第一异源序列编码一个或多个拷贝的SEQIDNO：337的NP序列(即，LELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRAS)。
表7
a)参见表2的脚注(a)。
在某些实施方案中，所述第一异源序列编码全长流感病毒NS1蛋白或其部分，例如表位(例如，一个或多个HTL或CTL表位)。在某些实施方案中，所述部分或表位来自进化上保守的序列。在某些实施方案中，所述表位是分别展示减弱的对HLAI类或II类分子的结合和/或具有当使用人PBMC进行ELISPOT测定分析时产生人干扰素γ(IFN-γ)反应的能力的HTL或CTL表位。如上文中所论述的，所述HTL或CTL表位可形成串联体，其中重复单个HTL或CTL表位和/或其中将多个HTL和/或CTL表位连接在一起。在某些实施方案中，所述第一异源序列编码一个或多个选自表1中显示的组(即，SEQIDNO：27-29)的NS1HTL表位。在其它实施方案中，所述第一异源序列编码一个或多个选自表8中显示的组(即，SEQIDNO：140-152)的NS1CTL表位。
表8
a)参见表2的脚注(a)。
在某些实施方案中，所述第一异源序列编码全长流感病毒NS2蛋白或其部分，例如表位(例如，一个或多个HTL或CTL表位)。在某些实施方案中，所述部分或表位来自进化上保守的序列。在某些实施方案中，所述表位是分别展示减弱的对HLAI类或II类分子的结合和/或具有当使用人PBMC进行ELISPOT测定分析时产生人干扰素γ(IFN-γ)反应的能力的HTL或CTL表位。如上文中所论述的，所述HTL或CTL表位可形成串联体，其中重复单个HTL或CTL表位和/或其中将多个HTL和/或CTL表位连接在一起。在某些实施方案中，所述第一异源序列编码一个或多个选自表1中显示的组(即，SEQIDNO：30-33)的NS2HTL表位。在其它实施方案中，所述第一异源序列编码一个或多个选自表9中显示的组(即，SEQIDNO：153-163)的NS2CTL表位。
表9
a)参见表2的脚注(a)。
在某些实施方案中，所述第一异源序列编码全长流感病毒PA蛋白或其部分，例如表位(例如，一个或多个HTL或CTL表位)。在某些实施方案中，所述部分或表位来自进化上保守的序列。在某些实施方案中，所述表位是分别展示减弱的对HLAI类或II类分子的结合和/或具有当使用人PBMC进行ELISPO测定分析时产生人干扰素γ(IFN-γ)反应的能力的HTL或CTL表位。如上文中所论述的，HTL或CTL表位可形成串联体，其中重复单个HTL或CTL表位和/或其中将多个HTL和/或CTL表位连接在一起。在某些实施方案中，所述第一异源序列编码一个或多个选自表1中所示的组(即，SEQIDNO：34-40)的PAHTL表位。在其它实施方案中，所述第一异源序列编码一个或多个选自表10中所示的组(即，SEQIDNO：164-205)的PACTL表位。
表10
a)参见表2的脚注(a)。
在某些实施方案中，所述第一异源序列编码全长流感病毒PB1蛋白或其部分，例如表位(例如，一个或多个HTL或CTL表位)。在某些实施方案中，所述部分或表位来自进化上保守的序列。在某些实施方案中，所述表位是分别展示减弱的对HLAI类或II类分子的结合和/或具有当使用人PBMC进行ELISPO测定分析时产生人干扰素γ(IFN-γ)反应的能力的HTL或CTL表位。如上文中所论述的，HTL或CTL表位可形成串联体，其中重复单个HTL或CTL表位和/或其中将多个HTL和/或CTL表位连接在一起。在某些实施方案中，所述第一异源序列编码一个或多个选自表1中所示的组(即，SEQIDNO：41-54)的PB1HTL表位。在其它实施方案中，所述第一异源序列编码一个或多个选自表11中所示的组(即，SEQIDNO：206-264)的PB1CTL表位。
表11
a)参见表2的脚注(a)。
在某些实施方案中，所述第一异源序列编码全长流感病毒PB2蛋白或其部分，例如表位(例如，一个或多个HTL或CTL表位)。在某些实施方案中，所述部分或表位来自进化上保守的序列。在某些实施方案中，所述表位是分别展示减弱的对HLAI类或II类分子的结合和/或具有当使用人PBMC进行ELISPO测定分析时产生人干扰素γ(IFN-γ)反应的能力的HTL或CTL表位。如上文中所论述的，HTL或CTL表位可形成串联体，其中重复单个HTL或CTL表位和/或其中将多个HTL和/或CTL表位连接在一起。在某些实施方案中，所述第一异源序列编码一个或多个选自表1中所示的组(即，SEQIDNO：55-61)的PB2HTL表位。在其它实施方案中，所述第一异源序列编码一个或多个选自表12中所示的组(即，SEQIDNO：265-309)的PB2CTL表位。
表12
a)参见表2的脚注(a)。
在某些实施方案中，所述第一异源序列编码表1中所列的多个HTL表位(即，SEQIDNO：1-61)，其中所述多个HTL表位包括来自多个流感病毒蛋白质的表位。所述编码的序列可以例如编码来自不同流感病毒蛋白质的HTL表位的多聚体。在某些实施方案中，部分基于序列的保守性％、结合的HLAII类等位基因的数目和类型(例如，以确保与广谱的HLAII类等位基因结合)、IFN-γ反应(当使用人PBMC进行ELISPOT测定分析时)或其任何组合来选择所述多个HTL表位。在某些实施方案中，所述第一异源序列编码一个或多个选自表13中所列的组的HTL表位。在某些实施方案中，所述第一异源序列编码表13中所列的全部HTL表位的多聚体。
表13
a)参见表1的脚注(a)。
b)参见表1的脚注(b)。
c)参见表1的脚注(c)。
在其它实施方案中，所述第一异源序列编码多个表2-3和5-12中所列的CTL表位(即，SEQIDNO：62-309)，其中所述多个CTL表位包括来自多个流感病毒蛋白质的表位。所述编码的序列可以例如编码来自不同流感病毒蛋白质的CTL表位的多聚体。在某些实施方案中，部分基于序列的保守性％、结合的HLAI类等位基因的数目和类型(例如，以确保与广谱的HLAI类等位基因结合)、IFN-γ反应(当使用人PBMC进行ELISPOT测定分析时)或其任何组合来选择所述多个CTL表位。在某些实施方案中，所述第一异源序列编码一个或多个选自表14中所列的组的CTL表位。在某些实施方案中，所述第一异源序列编码表14中所列的全部CTL表位的多聚体。
表14
a)参见表2的脚注(a)。
b)Assarsson等人(2008)，JVirol82：12241。
所述第一异源序列可编码来自本文中公开的任何感染性病原体的免疫原性蛋白质或抗原。例如，在某些实施方案中，所述第一异源序列编码来自病毒、细菌、原生生物和/或真菌的免疫原性蛋白质。在某些实施方案中，所述第一异源序列编码来自流感病毒、脊髓灰质炎病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、人乳头瘤病毒(HPV)、切昆贡亚病毒和/或登革热病毒的免疫原性蛋白质。在另一个实施方案中，所述第一异源序列编码来自芽孢杆菌属(例如，炭疽杆菌)、分枝杆菌属(例如，结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌)、志贺氏菌属(例如，宋氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌)、链球菌属和/或埃希氏菌属(例如，肠毒性、肠出血性或产志贺毒素的大肠杆菌)的免疫原性蛋白质。在另一个实施方案中，所述第一异源序列编码来自肠毒素大肠杆菌(ETEC)、肠病原性大肠杆菌(EPEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)和/或肠聚集性大肠杆菌(EAEC)的免疫原性蛋白质。在另一个实施方案中，所述第一异源序列编码免疫原性蛋白质，所述蛋白质来自伯克霍尔德氏菌属(例如，洋葱伯克霍尔德氏菌群)、假单胞菌属(例如，铜绿假单胞菌)、梭菌属(例如，肉毒梭菌、破伤风梭菌、艰难梭菌)、葡萄球菌属(例如，抗甲氧西林、多抗药性或抗苯唑西林的金黄色葡萄球菌)、肠球菌属(例如，粪肠球菌、屎肠球菌、抗万古霉素肠球菌(VRE))、链球菌属(例如，肺炎链球菌、化脓性链球菌、无乳链球菌)和/或弧菌属(例如，霍乱弧菌)。在另一个实施方案中，所述第一异源序列编码免疫原性蛋白质，所述免疫原性蛋白质来自弯曲菌属(例如，空肠弯曲菌)、博德特氏菌属(例如，百日咳博德特氏菌)、衣原体属(例如，肺炎衣原体、沙眼衣原体)、棒状杆菌属(例如，白喉棒状杆菌)、军团菌属(例如，嗜肺军团菌)、李斯特氏菌属(例如，单核细胞增生李斯特氏菌)、奈瑟氏菌属(例如，淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌)、沙门菌属(例如，肠炎沙门菌、伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌)、耶尔森氏菌属(例如，鼠疫耶尔森氏菌)、嗜血菌属(例如，流感嗜血菌)、螺杆菌属(例如、幽门螺杆菌)、柯克斯体属(例如，伯氏柯克斯体)和/或弗朗西丝菌属((例如，土拉热弗朗西丝菌)。在某些实施方案中，所述第一异源序列编码来自流感病毒、HIV、HPV、炭疽芽孢杆菌、疟原虫属和/或志贺氏菌属的免疫原性蛋白质。在另一个实施方案中，所述第一异源序列编码来自流感病毒、HIV和/或炭疽芽孢杆菌的免疫原性蛋白质。
由所述第一异源序列编码的流感病毒抗原可来自任何流感病毒株系，现有的或随后分离的，包括例如与1918年的的西班牙流行性感冒(H1N1)、1957年的亚洲流行性感冒(H2N2)、1968的香港流行性感冒(H3N2)、1997年的香港流行性感冒(H5N1)、2004年的越南流行性感冒(H5N1)、2009年的猪流行性感冒(H1N1)等相关的株系。因此，例如，所述HA抗原可以是H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16或BHA抗原，而所述NA抗原可以例如是N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9NA抗原。在某些实施方案中，所述HA抗原是H1、H3、H5或BHA抗原。可以是本发明的异源序列的基础的流感病毒株系的非限定性实例包括：A/鹅/广东/1/96(H5N1)；A/布雷维格教区/1/1918(H1N1)；A/威尔逊-史密斯/33(H1N1)；A/波多黎各/8/34/西奈山(H1N1)；A/蒙茅斯堡/1/47(H1N1)；A/USSR/90/1977(H1N1)；A/新喀里多尼亚/20/1999(H1N1)；A/所罗门群岛/3/2006(H1N1)；A/布里斯班/59/2007(H1N1)；A/加利福尼亚/7/2009(H1N1)；A/加利福尼亚/14/2009(H1N1)；A/加利福尼亚/08/2009(H1N1)；A/加利福尼亚/05/2009(H1N1)；A/德克萨斯/04/2009(H1N1)；A/墨西哥/InDRE4114/2009(H1N1)；A/纽约/1669/2009(H1N1)；A/加拿大-AB/RV1532/2009(H1N1)；A/伦宁格拉德/134/47/57(H2N2)；A/阿纳博/6/60(H2N2)；A/柏林/3/64(H2N2)；A/东京/3/67(H2N2)；A/新加坡/1/57(H2N2)；A/香港/1/68(H3N2)；A/奥巴尼/1/76(H3N2)；A/巴拿马/2007/99(H3N2)；A/威斯康星/67/05(H3N2)；A/香港/1774/99(H3N2)；A/莫斯科/10/99(H3N2)；A/广岛/52/2005(H3N2)；A/加利福尼亚/7/2004(H3N2)；A/纽约/55/2004(H3N2)；A/布里斯班/10/2007(H3N2)；A/珀斯/16/2009(H3N2)；A/鹅/贵阳/337/2006(H5N1)进化枝4；A/HK/156/97(H5N1)；A/HK/483/97(H5N1)；A/越南/1194/2004(H5N1)进化枝1；A/越南/1203/2004(H5N1)进化枝1；A/鸭/NCVD1/07(H5N1)；A/鸡/越南/NCVD-21/07(H5N1)；A/印度尼西亚/5/05(H5N1)进化枝2.1；A/火鸡/65-596/06(H5N1)进化枝2.2；A/鸡/印度/NIV33487/2006(H5N1)进化枝2.2；A/火鸡/火鸡/1/2005(H5N1)进化枝2.2；A/埃及/902782/2006(H5N1)；A/埃及/2321/2007(H5N1)；A/埃及/3300-NAMRU3/2008(H5N1)；A/安徽/1/2005(H5N1)；A/中国/GD01/2006(H5N1)；A/喜鹊/香港/50525/07(H5N1)进化枝2.3.2；A/暗绿绣眼鸟/香港/1038/2006(H5N1)进化枝2.3.4；A/鸡/越南/NCVD-15/2007(H5N1)；A/鸡/意大利/2335/2000(H7N1)；A/火鸡/意大利/3675/99(H7N1)；A/鸡/纽约/21211-2/05(H7N2)；A/纽约/107/03(H7N2)；A/鸡/英属哥伦比亚/GSC人B/04(H7N3)；A/加拿大/rv504/04(H7N3)；A/鸡/英属哥伦比亚/CN-6/04(H7N3)；A/马/圣保罗/4/76(H7N7)；A/海豹/Mass/1/1980(H7N7)；A/鸡/维多利亚/1/1985(H7N7)；A/鸡/荷兰/2586/2003(H7N7)；A/绿头鸭/加利福尼亚/HKWF1971/2007(H7N7)；A/鸡/北京/1/94(H9N2)；A/鹌鹑/香港/G1/1997(H9N2)；A/韩国/KBNP-0028/2000(H9N2)；A/鸡/香港/G9/97(H9N2)；A/鸡/香港/CSW153/2003(H9N2)；A/鸡/汕头/6781/2005(H9N2)；A/鸡/江苏/L1/2004(H9N2)；A/香港/1073/99(H9N2)；A/香港/2108/2003(H9N2)；A/鸡/设拉子/AIV-IR004/2007(H9N2)；A/鸡/淄博/L2/2008(H9N2)；A/鸡/河南/L1/2008(H9N2)；A/鸟类/以色列/313/2008(H9N2)和B/布里斯班/60/2008。可由本领域技术人员容易地鉴定另外的流感病毒株系。例如，WO2008/054540的表1提供了迄今已分离的不同流感病毒株系的详尽列表，同样地在美国生物技术信息中心(NCBI)的网站上提供了该列表。
在某些实施方案中，所述第一异源序列编码选自H1、H3、H5或B流感病毒的流感病毒HA抗原。HA抗原在某些实施方案中可以来源于一个或多个选自A/越南/1194/2004、A/越南/1203/2004、A/安徽/1/2005、A/埃及/2321/2007、A/埃及/3300-NAMRU3/2008、A/珀斯/16/2009、A/加利福尼亚/05/2009或B/布里斯班/60/2008的株系。在某些实施方案中，所述第一异源序列编码流感病毒NP或M1抗原。在某些实施方案中，NP或M1抗原来源于A/德克萨斯/04/2009或A/加利福尼亚/08/2009流感病毒株系。
在其它实施方案中，所述第一异源序列编码来自人乳头瘤病毒(HPV)的抗原。所述HPV可是以任何已知或以后发现的株系(例如，HPV-1、HPV-2、HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-45等)。在某些实施方案中，所述第一异源序列编码来自HPV-16或HPV-18株系的抗原。在某些实施方案中，所述HPV抗原是表面抗原，例如全长L1蛋白或其片段(例如，进化上保守的表位和/或HTL或CTL表位)。在某些实施方案中，所述第一异源序列编码经完全或部分密码子最优化的全长L1蛋白。在其它实施方案中，所述HPV抗原是全长L2或其片段(例如，进化上保守的表位和/或HTL或CTL表位)。在其它实施方案中，所述HPV抗原是L1杂交多肽或L1/L2杂交多肽。例如，在一个具体的实施方案中，所述HPV抗原是包含L2多肽的片段的L1多肽(例如，可将L2片段插入L1多肽的环境内)。在其它实施方案中，所述HPV抗原是全长E6或E7蛋白或其片段(例如，进化上保守的表位和/或HTL或CTL表位)。在其它实施方案中，所述HPV抗原是包含L1、L2和/或E6及E7蛋白的融合蛋白质。例如，在某些实施方案中，所述HPV抗原是包含融合至E7蛋白的L1/L2杂交多肽的融合蛋白质。在其它实施方案中，所述HPV抗原是包含融合至E6蛋白的L1/L2杂交多肽的融合蛋白质。
在其它实施方案中，所述第一异源序列编码来自人免疫缺陷病毒(HIV)的抗原。所述HIV可以是任何已知的或以后发现的株系(例如，HIV-1、HIV-2等)。在某些实施方案中，所述HIV抗原是表面抗原，例如全长Env蛋白(例如，gp160)或其片段或寡聚物(例如，gp140、gp120、gp41、进化上保守的表位，和/或HTL或CTL表位)。在其它实施方案中，所述HIV抗原是全长衣壳蛋白(p24)、基质蛋白(p17)或其片段(例如，进化上保守的表位和/或HTL或CTL表位)。在其它实施方案中，所述HIV抗原是Tat(例如，p16或p14)、Rev(p19)、Vif(p23)、Vpr(p14)、Nef(p27)、Vpu(p16)或Gag蛋白。所述HIV抗原可以是任何HIV蛋白，全长或非全长的，例如HTL或CTL表位，并且可以是任何进化上保守的序列。在某些实施方案中，所述HIV抗原序列可经工程改造以包含异源三聚化结构域(例如，来自酵母的GCN，例如来自GCN4和T4噬菌体fibritin-FT基元)或某些翻译后修饰的信号序列，例如糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定位点。例如，在一个实施方案中，可修饰HIV包膜蛋白例如gp140或gp120以包含GPI锚定位点。在另一个实施方案中，可修饰HIVgp140序列以包含异源GCN三聚化结构域和/或GPI锚定位点。在某些实施方案中，将所述GCN三聚化结构域或GPI锚定位点融合至HIV包膜蛋白序列(例如，HIVgp140序列)的羧基末端。
在其它实施方案中，所述第一异源序列编码来自芽孢杆菌属的抗原。所述芽孢杆菌属可以是许多致病种类的任一种(例如，炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)等)并且可以是这样的种类的任何已知的或以后发现的分离株。在某些实施方案中，所述芽孢杆菌属抗原是表面抗原，例如存在于细胞膜中的蛋白质或其片段(例如，在进化上保守的表位和/或HTL或CTL表位)。在其它实施方案中，所述芽孢杆菌属抗原是细胞内蛋白质或其片段(例如，在进化上保守的表位和/或HTL或CTL表位)。在某些实施方案中，所述芽孢杆菌属抗原与宿主细胞进入相关。例如，所述芽孢杆菌属抗原可以是结合靶细胞的蛋白质(例如，保护性抗原(PrAg或PA))、金属肽酶(例如，致死因子(LF))、腺苷酸环化酶(例如，水肿因子(edemafactor)(EF))或其片段(例如，进化上保守的表位和/或HTL或CTL表位)。在某些实施方案中，可修饰芽孢杆菌属抗原以缺失嗜热菌蛋白酶切割位点或包含GPI锚。在某些实施方案中，所述第一异源序列编码保护性抗原或已被修饰以除去嗜热菌蛋白酶切割位点或包含GPI锚的经修饰的保护性抗原。
在其它实施方案中，所述第一异源序列编码来自志贺氏菌属的抗原。所述志贺氏菌属可以是许多致病种类(例如，宋氏志贺氏菌(S.sonnei)、痢疾志贺氏菌(S.dysenteriae)、福氏志贺氏菌(S.flexneri等)的任一种，并且可以是这样的种类的任何已知的或以后发现的分离株。在某些实施方案中，所述志贺氏菌属抗原是表面抗原，例如存在于细胞膜中或与其结合的蛋白质，例如内在膜蛋白质或外在膜蛋白或其片段(例如，进化上保守的表位和/或HTL或CTL表位)。例如，所述抗原可以是外膜蛋白例如Karp株系p56。在其它实施方案中，所述志贺氏菌属抗原是细胞内蛋白质或其片段(例如，进化上保守的表位和/或HTL或CTL表位)。在某些实施方案中，所述志贺氏菌属抗原与宿主细胞进入相关，例如侵袭性蛋白质IpaB、IpaC或IpaD蛋白质。在另一个实施方案中，所述志贺氏菌属抗原是包含IcsP和/或SigA多肽的通用抗原。
在其它实施方案中，所述第一异源序列编码来自分枝杆菌属的抗原。所述分枝杆菌属可以是许多致病种类(例如，结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、弥漫性麻风分枝杆菌等)的任一种，并且可以是这样的种类的任何已知的或以后发现的分离株。在某些实施方案中，所述分枝杆菌属抗原是表面抗原，例如存在于细胞膜中或与其结合的蛋白质，例如内在膜蛋白质或外在膜蛋白或其片段(例如，进化上保守的表位和/或HTL或CTL表位)。在其它实施方案中，所述分枝杆菌属抗原是细胞内蛋白质或其片段(例如，进化上保守的表位和/或HTL或CTL表位)。在某些实施方案中，所述分枝杆菌属抗原选自Ag85A、Ag85B、Ag85C、ESAT-6、CFP-10、HspX和其组合。
在其它实施方案中，所述第一异源序列编码来自疟原虫属的抗原。所述疟原虫属可以是许多致病种类(例如，恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫等)的任一种，并且可以是这样的种类的任何已知的或以后发现的分离株。在某些实施方案中，所述疟原虫属抗原是表面抗原，例如存在于细胞膜中或与其结合的蛋白质，例如内在膜蛋白质或外在膜蛋白或其片段(例如，进化上保守的表位和/或HTL或CTL表位)。在其它实施方案中，所述疟原虫属抗原是细胞内蛋白质或其片段(例如，进化上保守的表位和/或HTL或CTL表位)。在某些实施方案中，所述疟原虫属抗原选自CS、CSP(未切割的)、MSP1、MSP2(c末端p42)、LSA1、EBA-175、AMA1、FMP1、Pfs48/45和MSP3。
在某些实施方案中，所述第一异源序列编码来自肺炎链球菌(例如肺炎球菌)的抗原。在某些实施方案中，所述肺炎链球菌抗原是表面抗原，例如存在于细胞膜中或与其结合的蛋白质，例如内在膜蛋白质或外在膜蛋白或其片段(例如，进化上保守的表位和/或HTL或CTL表位)。在其它实施方案中，所述肺炎链球菌抗原是细胞内蛋白质或其片段(例如，进化上保守的表位和/或HTL或CTL表位)。在某些实施方案中，所述肺炎链球菌原选自肺炎球菌表面蛋白质(例如，PspA、PspC)、肺炎链球菌溶血素(Ply)、神经氨酸酶(例如，NanA、NanB)、自溶素A(LytA)和肺炎链球菌溶血素。
在其它实施方案中，所述第一异源序列编码来自任何其它感染性病原体的表面抗原、内在蛋白质、毒素、侵袭相关蛋白质(invasion-associatedprotein)、蛋白酶或其它酶、热激蛋白或其它抗原。例如，所述表面抗原可来自感染性病原体，所述病原体选自百日咳博德特氏菌、肺炎衣原体(例如，膜蛋白D、外膜蛋白质)、沙眼衣原体(例如，膜蛋白D、外膜蛋白质)、嗜肺军团菌、金黄色葡萄球菌(包括抗甲氧西林、多抗药性和抗苯唑西林株系(例如，IsdA、IsdB、SdrD、SdrE))、肺炎链球菌(例如，PsPA)、铜绿链球菌(Streptococcusaeruginosa)(例如，鞭毛Ag、孔蛋白类)、化脓性链球菌(例如，M蛋白、纤连蛋白结合蛋白Sfb1)、无乳链球菌、肠出血性大肠杆菌(例如，Intimin、FimH粘附素)、流感嗜血杆菌(Haemophilisinfluenzae)(例如，Pili、P1、P2、P4、P6)、念珠菌属(例如，Als1p、Als3p)、粗球孢子菌(例如，Ag2)、铜绿假单胞菌(例如，鞭毛抗原、孔蛋白类)、劳斯肉瘤病毒(例如，F蛋白、G蛋白)、人内源逆转录病毒K(例如，黑素瘤抗原HERV-K-MEL)、疱疹病毒(例如，糖蛋白D2)、登革热病毒(例如，DEN1、DEN2、DEN3、DEN4包膜蛋白、四价4xEDIII结构域蛋白)等。毒素可选自空肠弯曲菌的不耐热肠毒素、艰难梭菌的毒素A和B、来自化脓性链球菌的致热外毒素和内毒素类、霍乱弧菌的毒素B、肠出血性大肠杆菌的志贺毒素(例如，Stx-1、Stx-2)、来自铜绿假单胞菌的外毒素A等。蛋白酶或其它酶可选自衣原体的分泌型蛋白酶因子、肺炎链球菌的肺炎链球菌溶血素、自溶素或神经氨酸酶、来自化脓性链球菌的半胱氨酸蛋白酶或C5a肽酶、来自幽门螺杆菌的尿素酶、粗球孢子菌的尿素酶、荚膜组织胞浆菌的His-62、H抗原和hsp70等。
在某些实施方案中，所述第一异源序列编码由癌细胞产生的蛋白质的全部或部分。所述蛋白质或其片段(例如，切割产物、结构域、二级结构的单元、B细胞表位、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位、辅助T淋巴细胞(HTL)表位等)可位于癌细胞的表面。例如，所述蛋白质或其片段可具有高度抗原性和/或癌细胞的标志(例如，癌细胞特异性标志或高度富集在癌细胞上的抗原)。可选择地，蛋白质或其片段(例如，切割产物、结构域、二级结构的单元、HTL或CTL表位等)可位于癌细胞的内部。例如，所述蛋白质或其片段可以是细胞溶胶蛋白、核蛋白等。
在某些实施方案中，所述第一异源序列包含至少一个完整的开放阅读框架(ORF)，其中所述至少一个完整的ORF编码能够在被腺病毒载体感染的宿主细胞中表达的分开的多肽。在某些实施方案中，所述第一异源序列包含两个或更多个完整ORF，其各自编码能够在被腺病毒载体感染的宿主细胞中表达的分开的多肽。一个或多个所述分开的多肽可以是全长蛋白质或其片段，如上文中所描述的。同样地，一个或多个所述分开的多肽可以是蛋白质结构域、结构基元或表位(例如，B-细胞、HTL或CTL表位)的多聚体，如上文中所描述的。例如，在某些实施方案中，所述第一异源序列包含编码全长蛋白质(例如，流感病毒HA)的第一ORF和编码蛋白质结构域、结构基元或表位的多聚体(例如，一个或多个选自表4的流感病毒M2序列的多聚体、一个或多个流感病毒B细胞表位的多聚体、一个或多个选自表1或表13的流感病毒HTL表位的多聚体或一个或多个选自表2-3和5-12或表14的流感病毒CTL表位的多聚体等)的第二ORF。
因此，在一些实施方案中，所述第一异源序列编码融合蛋白。所述融合蛋白可包含一个或多个来自抗原性蛋白质的表位或片段或来自相同感染性病原体或不同感染性病原体的全长蛋白质。例如，在某些实施方案中，所述融合蛋白包含融合至HPV的E6或E7蛋白的如本文中描述的HPV的L1/L2杂交多肽。在某些实施方案中，所述融合蛋白包含融合至E7蛋白的来源于HPV-16的L1/L2杂交多肽(例如，具有插入L1环的HPV-16L2片段的全长HPV-16L1蛋白)。在其它实施方案中，所述融合蛋白质可包含融合至E6蛋白的来源于HPV-18的L1/L2杂交多肽(例如，具有插入L1环的HPV-18L2片段的全长HPV-18L1蛋白)。在另一个实施方案中，所述融合蛋白质包含融合在一起的来自流感病毒HA和NA蛋白的免疫原性片段(例如，如本文中描述的流感病毒HA或NA蛋白的中和表位)。在另一个实施方案中，所述融合蛋白质包含融合至全长流感病毒NA蛋白的如本文中描述的流感病毒HA蛋白的一个或多个中和表位。在另一个实施方案中，所述融合蛋白可以是如本文中所描述的多个表位的多聚体。例如，所述融合蛋白可以是HTL表位的多聚体，其中每一个表位通过连接体序列连接(关于代表性多聚体，参见实施例13)。在某些实施方案中，由第一异源序列编码的融合蛋白质包含来自感染性病原体的两个或更多个种类或血清型的抗原。例如，所述融合蛋白质可包含来自包膜蛋白(来自4个登革热病毒血清型1-4的每一个)的EDIII结构域。
在某些实施方案中，所述第一异源序列包含两个完整ORF，其中所述第一和第二ORF平行排列(例如，头对尾)。在某些相关实施方案中，所述第一异源序列还包含位于第一ORF的终止密码子的3’和第二ORF的起始密码子的5’的内部核糖体进入位点(IRES)，从而允许由第一和第二ORF编码的多肽从单个mRNA转录物翻译。本领域技术人员可容易地鉴定在哺乳动物(例如，人)细胞中具有功能的适当的IRES序列以及应当怎样放置此类序列以确保第二ORF的充分翻译。
在某些相关实施方案中，所述第一异源序列包括两个完整ORF，其中所述第一和第二ORF平行排列(例如，头对尾)，并且还包含位于第一ORF的终止密码子的3’和第二ORF的起始密码子的5’的剪接受体，从而允许由第一和第二ORF编码的多肽从单个mRNA转录物或两个分开的mRNA转录物翻译。本领域技术人员可鉴定剪接元件并且以正确的方式整合它们。取决于需要的结果，剪接受体可以是共有序列(例如SV40剪接位点)或非共有序列(例如Ad5ADP剪接受体)。例如，在腺病毒主要晚期转录单位中，具有3’剪接位点的非典型嘧啶区(polypyrimidinetracts)在病毒感染的晚期是优选的。参见，例如，Muhlemann等人(1995)，J.Virology69(11)：7324。
在某些相关实施方案中，所述第一异源序列包含两个完整的ORF，其中所述第一与第二ORF按平行方向排列(例如，头对尾)，并且还包括框内位于第一ORF的3’末端(去除了终止密码子的)与第二ORF的起始密码的框内5’之间的2A跳跃元件(skippingelement)(核糖体内自身加工)，从而允许由第一和第二ORF编码的多肽从单个mRNA转录物翻译为单个多肽，所述多肽“跳过”A2元件的位置上的肽键，从而产生两个多肽。本领域技术人员可鉴定2A跳跃元件例如来源于口蹄疫病毒(FMDV)和细小核糖核酸病毒的那些跳跃元件，并且组织它们以便两个ORF形成单个连续肽。
在某些实施方案中，所述第一异源序列包含完整的ORF，其中所述第一与第二ORF按端对端方向排列。例如，第一ORF的3’末端可与第二ORF的3’末端相邻。可选择地，第一ORF的5’末端可与第二ORF的5’末端相邻。
一般而言，所述第一异源序列是最低程度包含转录增强子和/或启动子以及多腺苷酸化序列的转录单位的部分。在某些实施方案中，所述转录单位还包含一个或多个内含子、一个或多个剪接增强子、前导序列、共有Kozak序列、一个或多个增加RNA稳定性和/或加工的元件或其任何组合。
在某些实施方案中，所述第一异源序列处于腺病毒转录和/或翻译控制序列的控制之下或与其有效连接。如在本文中在该背景下所使用的，“处于......的控制之下”和“与......有效连接”意指异源序列中包含的ORF的转录和/或翻译受到所述控制序列的影响。因此，例如，ORF的转录和/或翻译可因腺病毒转录和/或翻译控制序列而被增加。在某些实施方案中，“与......有效连接”表示控制序列与异源序列彼此紧密相邻。例如，在某些实施方案中，与异源序列有效连接的腺病毒控制序列位于距离所述异源序列的一个末端约100bp，约100至约200bp，约200至约300bp，约300至约400bp或约400至约500bp内。
如本文中所使用的，“腺病毒转录和/或翻译控制序列”是参与转录和/或翻译调控的核酸序列，其来源于腺病毒。此类序列包括但不限于腺病毒启动子(例如，主晚期启动子(MLP)或主要晚期转录单位(MLTU)的启动子)、腺病毒转录增强子、腺病毒剪接受体位点(例如，用于Ad4E324.8kORF的MLP驱动的转录的天然剪接受体位点或Ad5ADP剪接受体序列)、腺病毒剪接增强子、腺病毒前导序列(例如，三联前导(TPL)序列)、增加RNA稳定性和/或加工的腺病毒元件(例如，顺式作用RNA输出元件)和腺病毒多腺苷酸信号序列(例如，Ad5E3A多腺苷酸化序列)。腺病毒转录和/或翻译控制序列可来自任何腺病毒株系。因此，本发明的腺病毒载体(例如，Ad4载体)可包含来源于不同腺病毒株系(即，非Ad4株系)的腺病毒转录和/或翻译控制序列。腺病毒转录和/或翻译控制序列可具有野生型序列(即，在天然存在的腺病毒中发现的序列)或其变异序列。腺病毒转录和/或翻译控制序列已在本领域中进行了描述。例如，腺病毒TPL序列描述于美国专利申请2006/0115456中；增强子描述于Massie等人(1995)，Biotechnology13(6)：602中；多腺苷酸化序列描述于Bhat和Wold(1986)，J.Virology57(3)：1155中。其它腺病毒转录和/或翻译控制序列可由本领域技术人员来鉴定。
在某些实施方案中，所述第一异源序列处于腺病毒MLP之下(即，处于其控制之下)。如本文中所使用的，“主要晚期启动子(MLP)”可与主要晚期转录单位(MLTU)启动子互换使用。在其它实施方案中，所述第一异源序列处于腺病毒MLP和腺病毒TPL之下。在其它实施方案中，所述第一异源序列处于腺病毒MLP之下并且与腺病毒剪接受体序列有效连接。在其它实施方案中，所述第一异源序列处于腺病毒MLP和腺病毒TLP之下，并且与腺病毒剪接受体序列有效连接。在某些实施方案中，腺病毒剪接受体序列是非共有序列。不期望受理论限制，当将它们与腺病毒MLP结合使用时，非共有剪接受体据认为表现比共有剪接受体更好。在上述实施方案的任何实施方案中，还可将所述第一异源序列与腺病毒多腺苷酸信号序列有效连接。
在某些实施方案中，所述第一异源序列处于内源腺病毒转录和/或翻译控制序列之下(即，处于其控制之下)。如本文中所使用的，“内源”腺病毒转录和/或翻译控制序列是参与转录和/或翻译调控的核酸序列，其对于腺病毒载体是天然的并且未被通过重组技术引入或移至新位置。例如，存在于Ad4腺病毒载体中的任何Ad4转录和/或翻译控制序列对于Ad4腺病毒载体是内源的，只要所述序列的位置未利用重组技术进行改变。
在某些实施方案中，所述第一异源序列包含异源转录和/或翻译控制序列。如本文中所使用的，“异源”转录和/或翻译控制序列是指非腺病毒转录和/或翻译控制序列或从其野生型背景取出并且被置于异源序列内的新背景中的腺病毒转录和/或翻译控制序列。异源转录和/或翻译控制序列的实例包括但不限于哺乳动物细胞中具有功能的启动子(例如，组成型启动子，例如CMV启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、SV40启动子、二氢叶酸还原酶(DHFR)启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子、EF1α启动子(Invitrogen)等)、哺乳动物细胞中具有功能的增强子序列(例如，CMV或RSV增强子序列)、剪接信号、剪接增强子、前导序列、Kozak序列、增加RNA稳定性和/或加工的序列(例如，顺式作用RNA输出元件、旱獭肝炎病毒翻译后调控元件(WPRE))、多腺苷酸信号序列(例如，牛生长激素(BGH)或SV40多腺苷酸信号序列)等。已在现有技术中描述了多种适当的转录和/或翻译控制序列。已在例如美国专利申请2006/0115456中描述了适当的CMV启动子。已在例如Donello等人(1998)，J.Virology72(6)：5085中描述了WPRE元件。WPRE元件必须位于ORF信息内，通常位于基因的3’末端与5’多腺苷酸化序列之间。不期望受理论束缚，据认为WPRE通过增加mRNA从细胞核迁移的功效以及增加RNA翻译和稳定来起作用。Kozak序列也已描述于例如Kozak，NucleicAcidRes15(20)，8125-48(1987)中。
适当的转录和/或翻译控制序列，无论是腺病毒还是其它的，包括天然存在的序列以及此类序列的经修饰的形式。此类经修饰的形式可包括经设计用以增强与转录和/或翻译控制序列相关的所需活性或减小或消除与内源腺病毒转录和/或翻译控制序列相关的不想要的活性的一个或多个碱基变化(例如，缺失、插入、置换)。
在某些实施方案中，所述第一异源序列包含多个转录或翻译控制序列。例如，所述第一异源序列可包含足够的转录或翻译控制序列以确保当利用腺病毒载体感染适当的细胞(例如，人细胞)时所述第一异源序列中的ORF表达。在某些实施方案中，所述第一异源序列包含启动子(例如，CMV启动子)和腺病毒TPL序列。在其它实施方案中，所述第一异源序列包含启动子(例如，CMV启动子)、腺病毒TPL和腺病毒多腺苷酸信号序列(例如，Ad5E3A多腺苷酸信号序列)。与任何前述实施方案结合，所述第一异源序列还可包含Kozak序列。
在某些实施方案中，所述第一异源序列对于两个或更多个ORF的每一个包含一个或多个转录或翻译控制序列。例如，所述第一异源序列可包含足够的转录的转录或翻译控制序列以确保两个或更多个ORF的每一个表达。因此，在某些实施方案中，所述第一异源序列对于两个ORF的每一个包含启动子和多腺苷酸信号序列。所述第一异源序列对于每一个ORF还可包含腺病毒TPL和/或Kozak序列。可选择地，在某些实施方案中，所述第一异源序列可包含足够的转录或翻译控制序列以确保一个ORF的表达(例如，启动子和/或增强子和多腺苷酸信号序列)同时包含在内源腺病毒转录或翻译控制序列的控制之下或与其有效连接的第二ORF。
在某些实施方案中，已最优化所述第一异源序列以增加或使至少一个ORF的表达和/或翻译最大化。例如，在某些实施方案中，已对第一异源序列中的ORF进行密码子最优化(例如，以用于在哺乳动物细胞例如人细胞中表达)。在一个实施方案中，所述第一异源序列已被密码子最优化并且处于非腺病毒启动子例如CMV启动子的控制之下。在其它实施方案中，与ORF有效连接的Kozak序列是已被最优化以产生例如共有Kozak序列的第一异源序列。在其它实施方案中，所述第一异源序列已被最优化以去除潜在抑制序列，例如外显子剪接沉默子或隔离子序列(insulatorsequence)(例如，用于组织染色质并且阻止启动子和/或增强子的长程效应的序列)。密码子最优化和其它类型的序列最优化在本领域内是常规的并且本领域技术人员可容易地理解如何进行此类最优化。
在某些其中所述第一异源序列处于MLP启动子的控制之下的实施方案中，所述第一异源序列未进行密码子最优化，即所述第一异源序列是来自感染性病原体的天然序列。例如，在某些实施方案中，所述腺病毒载体包含处于腺病毒MLP启动子的控制之下的非密码子最优化的第一异源序列，其中所述腺病毒载体具有复制能力并且具有部分E3缺失。在另一个实施方案中，所述腺病毒载体来源于Ad4。
将所述第一异源序列插入腺病毒载体的多个不同位置，包括E1、E2、E3、E4、L3和L5区域或E4-ITR边界。在某些实施方案中，所述第一异源序列被插入E1、E2B、E3、L3或L5区域或E4-ITR边界。在其它实施方案中，将所述第一异源序列插入E3区域、L3区域或E4-ITR边界。在其它实施方案中，将所述第一异源序列插入E3区域。在某些实施方案中，适当的E3区域插入位点位于E3B多腺苷酸信号序列的下游。在某些实施方案中，适当的L3区域插入位点位于L323k蛋白酶基因的下游(例如，Ad5载体的23k蛋白酶基因或任何其它腺病毒载体中的等同序列)。可选择腺病毒区域或边界内的精确插入位点以便所述第一异源序列处于一个或多个内源腺病毒转录和/或翻译控制序列的控制之下或与其有效连接。可选择地，或此外，可选择精确的插入位点以使对所得的重组腺病毒载体在哺乳动物(例如，人)细胞中复制的能力的任何影响减小至最低程度。
本发明的腺病毒载体可包含腺病毒基因组中的缺失。此类缺失可以例如提供用于异源序列(例如，第一异源序列)的插入的空间，并且帮助使插入对所得的重组腺病毒载体在哺乳动物(例如，人)细胞中复制的能力的任何影响减至最低。腺病毒载体可在多个不同的位置包括E1、E2、E3、E4、L3和L5区域或E4-ITR边界中缺失。在某些实施方案中，所述腺病毒载体在E1、E2B、E3、L3或L5区域或E4-ITR边界中缺失。在其它实施方案中，所述腺病毒载体在E3区域、L3区域或E4-ITR边界中缺失。在其它实施方案中，所述腺病毒载体在E3区域中缺失。在某些实施方案中，将所述第一异源序列插入或使其与任何前述缺失邻近。例如，可将所述第一异源序列插入E3部分缺失或邻近E3完全缺失。
在某些实施方案中，腺病毒载体中的缺失缺失一个或多个开放阅读框架。例如，可缺失1、2、3或更多个开放阅读框架。所述开放阅读框架具有已知或未知的功能。在某些实施方案中，所述缺失存在于E3区域中并且在E3区域中包含1、2、3或更多个ORF的缺失(例如，具有未知功能的E3ORF)。E3区域中的缺失可以是部分缺失。可选择地，E3区域中的缺失可以是完全缺失。图2显示Ad4的E3区域的示例性部分或完全缺失。示例性Ad4部分E3缺失除去了24.8k、6.3k和29.7k的ORF，其全部目前具有未知功能，而Ad4完全E3缺失除去了23.3k、19k、24.8k、6.3k、29.7k、10.4k、14.5k和14.7k的ORF。一个可选择的部分E3缺失除去了24.8k、6.3k、29.7k、10.4k、14.5k和14.7k的ORF。
因此，在某些实施方案中，本发明的腺病毒载体是包含E324.8k、6.3k和29.7k的ORF的一个或多个(例如，全部)的缺失的Ad4载体。在相关实施方案中，所述腺病毒载体是包含相应于GenBank序列AY594254的约28,446至约30,226的核苷酸的缺失的Ad4载体。在其它实施方案中，本发明的腺病毒载体是包含E3区域的缺失但保留选自23.3k、19k、24.8k、6.3k、29.7k、10.4k、14.5k和14.7k的一个或多个E3ORF(例如，可保留23.3k和19k的ORF，可保留10.4k、14.5k和14.7k的ORF或可保留23.3k、19k、10.4k、14.5k和14.7k的ORF)的Ad4载体。在相关实施方案中，所述腺病毒载体是包含相应于GenBank序列AY594254的约28,446至约31,282或约17,356至约30,226的核苷酸的缺失的Ad4载体。在其它实施方案中，本发明的腺病毒载体是不保留23.3k、19k、24.8k、6.3k、29.7k、10.4k、14.5k和14.7k的E3ORF的任一个的Ad4载体。在某些相关实施方案中，所述腺病毒载体是包含相应于GenBank序列AY594254的约27,356至约31,282的核苷酸的缺失的Ad4载体。
在某些实施方案中，ORF被认为是缺失的，即使包含所述ORF的核酸序列的部分仍然存在于腺病毒载体中(即，即使所述ORF仅部分缺失)。在某些实施方案中，可通过进一步操作ORF的序列消除从部分缺失的ORF的表达。例如，在某些实施方案中，可消除所述ORF的起始密码子。在某些实施方案中，所述Ad4E3区域的部分或完全缺失导致E323.3kORF的部分缺失。在某些实施方案中，具有部分缺失的E323.3kORF的Ad4载体还包含除去E323.3kORF的起始密码子的突变(例如，存在于GenBank序列AY594254的位点27279上的ATG密码子的突变)。
在其它实施方案中，本发明的腺病毒载体可包含相应于Ad5基因组的ADP区域(例如，Ad5E3pg19kORF与Ad5E3RID-αORF之间的区域)的E3区域的部分缺失。例如，图2中显示的Ad4的部分E3缺失相应于来自Ad5的E3区域的ADP区域的缺失。类似地，Ad7E318.3kORF与Ad7E310.3kORF之间的区域(即，包含Ad7E320.1k，20.6k和7.7k的ORF的区域)相应于来自Ad5E3区域的ADP区域。本领域技术人员可容易地确定来自除了Ad4或Ad7外的血清型的腺病毒载体中哪个区域相应于Ad5的ADP区域。
可将第一异源序列插入腺病毒载体的缺失(例如，上文中所述的缺失)中。可选择地，可将所述第一异源序列在邻近缺失(例如，上文中所述的缺失)的位置中插入腺病毒载体。例如，在某些实施方案中，将所述第一异源序列插入部分E3缺失(例如，Ad4载体的部分E3缺失)。在其它实施方案中，将所述第一异源序列插入完全E3缺失(例如，Ad4载体的完全E3缺失)。在其它实施方案中，将所述第一异源序列插入邻近部分或完全E3缺失的区域(例如，E3B多腺苷酸信号序列与下游序列例如L5纤维基因或U外显子之间)。在某些实施方案中，将所述第一异源序列插入部分E3缺失以便其处于内源启动子(例如，LTP)的控制之下。在某些实施方案中，所述第一异源序列包含异源启动子和任选地其它转录或翻译控制序列，并且被插入部分或完全E3缺失。在某些实施方案中，不将第一异源序列整合入编码腺病毒蛋白质的ORF内。如本文中在该背景中所使用的，术语“整合”意指将异源序列插入腺病毒ORF以便所得的序列编码嵌合蛋白质，其中嵌合蛋白质的部分由腺病毒ORF编码并且所述嵌合蛋白质的部分由所述异源序列编码。
在某些实施方案中，本发明的腺病毒载体包含处于腺病毒启动子(例如，主要晚期启动子)的控制之下的第一异源序列，其中所述第一异源序列编码来自流感病毒、芽孢杆菌属、HIV、HPV、披盖病毒(例如登革热病毒)、志贺氏菌属、分枝杆菌属、链球菌属或疟原虫属的抗原。在某些实施方案中，所述第一异源序列编码来自流感病毒的H1HA，H3HA，H5HA或BHA抗原。在另一个实施方案中，所述第一异源序列编码来自炭疽芽孢杆菌的保护性抗原或经修饰的保护性抗原。在另一个实施方案中，所述第一异源序列编码包膜蛋白(例如gp160、gp140、gp120)、经修饰的包膜蛋白或来自HIV的gag蛋白。在另一个实施方案中，所述第一异源序列编码来自HPV包括HPV16和HPV18的L1蛋白、L2蛋白、E6蛋白、E7蛋白或其融合蛋白。在另一个实施方案中，所述第一异源序列编码来自疟原虫属的CSP、Pfs48/45、MSP1、MSP(C-末端，p42)或LSA1。在某些实施方案中，所述第一异源序列编码来自分枝杆菌属的Ag85、ESAT、HspX或其组合。在其它实施方案中，所述第一异源序列编码来自志贺氏菌属的PSSP、r56Karp蛋白或侵袭性蛋白质(例如，IpaB、IpaC或IpaD蛋白)。在其它实施方案中，所述腺病毒载体还可包含腺病毒三联前导序列。例如，所述第一异源序列可处于腺病毒MLP和三联前导序列的控制之下，其中所述第一异源序列编码来自流感病毒、芽孢杆菌属、HIV、HPV、披盖病毒(例如登革热病毒)、志贺氏菌属、分枝杆菌属、链球菌属或疟原虫属的抗原。
在其它实施方案中，本发明的腺病毒载体包含处于非腺病毒启动子(例如，CMV启动子、RSVLTR启动子、SV40启动子、DHFR启动子、β-肌动蛋白启动子、PGK启动子、EF1α启动子)的控制之下的第一异源序列，其中所述第一异源序列编码来自流感病毒、芽孢杆菌属、HIV、HPV、披盖病毒(例如登革热病毒)、志贺氏菌属、分枝杆菌属、链球菌属或疟原虫属的抗原。例如，在某些实施方案中，所述第一异源序列处于CMV启动子的控制之下并且编码来自流感病毒、芽孢杆菌属或HIV的抗原。在一个具体的实施方案中，所述第一异源序列是来自流感病毒、芽孢杆菌属或HIV的密码子最优化的序列。在另一个实施方案中，所述第一异源序列是来自流感病毒、芽孢杆菌属或HIV的天然序列。在另一个实施方案中，所述第一异源序列编码来自流感病毒的H1HA、H3HA、H5HA、BHA、NP或M1抗原。在另一个实施方案中，所述第一异源序列编码来自炭疽芽孢杆菌的保护性抗原或经修饰的保护性抗原。在另一个实施方案中，所述第一异源序列编码包膜蛋白(例如gp160、gp140、gp120)、经修饰的包膜蛋白或来自HIV的gag蛋白。在某些实施方案中，所述腺病毒载体还可包含腺病毒三联前导序列。例如，所述第一异源序列可处于CMV启动子和腺病毒三联前导序列控制之下，其中所述第一异源序列编码来自流感病毒、芽孢杆菌属、HIV、HPV、披盖病毒(例如登革热病毒)、志贺氏菌属、分枝杆菌属、链球菌属或疟原虫属的抗原。
在某些实施方案中，本发明的腺病毒包含第二异源序列。因此，在某些实施方案中，本发明的腺病毒载体包含第一异源序列和第二异源序列。可选择地，本发明的腺病毒载体包含第二异源序列以代替第一异源序列。
所述第二异源序列可具有上文中针对所述第一异源序列所描述的结构并且可被以上述任何方式插入腺病毒基因组中。因此，在某些实施方案中，所述第二异源序列可编码全长抗原或其片段(例如，结构域、二级结构的单元、保守的表位、B细胞、HTL或CTL表位或其组合)。在某些实施方案中，所述第二异源序列编码治疗性蛋白质，例如细胞因子或生长因子或刺激免疫系统的其它蛋白质。例如，在某些实施方案中，所述第二异源序列编码刺激白细胞例如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的蛋白质。在某些实施方案中，所述第一异源序列编码来自感染性病原体的抗原并且所述第二异源序列编码治疗性蛋白质。在一个具体的实施方案中，所述第一异源序列编码流感病毒抗原(例如，H1HA、H3HA、H5HA或BHA抗原)并且所述第二异源序列编码刺激白细胞的蛋白质(例如，GM-CSF)。在某些实施方案中，将所述第二异源序列插入与第一异源序列插入的区域相同的腺病毒载体的区域(例如，以便所述第一和第二异源序列彼此靠近)。在其它实施方案中，将所述第一和第二异源序列插入腺病毒载体的不同区域。
还可将所述第二异源序列插入腺病毒ORF。在某些实施方案中，所述腺病毒ORF编码腺病毒结构蛋白质(例如，衣壳蛋白，例如六邻体蛋白质或纤维蛋白质)。因此，在某些实施方案中，将所述第二异源序列整合入腺病毒的六邻体ORF，其中所得的六邻体ORF与异源序列的融合物编码嵌合六邻体蛋白质。在其它实施方案中，将所述第二异源序列整合入腺病毒纤维ORF，其中所得的纤维ORF与异源序列的融合物编码嵌合纤维蛋白质。一般而言，本发明的嵌合六邻体或纤维蛋白质将保留六邻体或纤维功能(例如，形成六邻体壳粒或纤维并且促成壳体形成)，同时在所得的腺病毒的表面上呈现新型抗原。本发明的重组腺病毒的表面的新型抗原的呈现是有利的，因为其帮助避免关于一般群体中的预存腺病毒免疫的问题，所述问题可降低基于腺病毒的疫苗的功效。此外，在重组腺病毒的表面上呈现来自感染性病原体的抗原可通过将更多种感染性病原体抗原呈递给服用本发明的基于腺病毒的疫苗的受试者的免疫系统来扩展由所述疫苗刺激的免疫反应。
在某些实施方案中，所述第二异源序列编码来自不同腺病毒血清型的纤维蛋白质并且所述第二异源序列替代编码腺病毒的天然纤维蛋白质的序列。因此，所得的重组腺病毒表达来自另一个腺病毒血清型的纤维。例如，在某些实施方案中，Ad5腺病毒表达来自Ad4、Ad7、Ad2等腺病毒的纤维蛋白质。
因此，在某些实施方案中，将所述第二异源序列整合入腺病毒结构蛋白质(例如，衣壳蛋白，例如六邻体或蛋白质)的ORF，其中所述第二异源序列编码来自感染性病原体的抗原。所述感染性病原体和其抗原可以是如上文中所描述的。在某些实施方案中，所述抗原来自流感病毒表面蛋白质例如M2(例如，M2的外部结构域、片段或表位)。在某些实施方案中，所述M2抗原选自表4中所列的M2肽序列的组(例如，SEQIDNO.312、318、321或327)。在某些实施方案中，所述第二异源序列编码表4中所列的M2肽序列之一。例如，所述第二异源序列可编码至少2个来自H1、H2和/或H3流感病毒株系(例如，至少两个选自SEQIDNO：312-317的序列)、H5流感病毒株系(例如，至少两个选自SEQIDNO：318-320的序列)、H7流感病毒株系(例如，至少两个选自SEQIDNO：321-326的序列)或H9流感病毒株系(例如，至少两个选自SEQIDNO：327-335的序列)的M2序列。可选择地，所述第二异源序列可编码来自多个不同流感病毒血清型的M2序列(例如，与至少一个选自SEQIDNO：318-320的序列、至少一个选自SEQIDNO：321-326的序列、至少一个选自SEQIDNO：327-335的序列组合的至少一个选自SEQIDNO：312-317的序列，或其任意组合)。在其它实施方案中，所述第二异源序列可编码一个或多个拷贝的流感病毒Matrix序列(例如，GAAAGILGFVFTLNAA-SEQIDNO：336)或流感病毒NP序列(例如，LELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRAS-SEQIDNO：337)。在其它实施方案中，所述流感病毒抗原是HTL或CTL表位。例如，所述第二异源序列可编码选自表1或13的一个或多个HTL表位或选自表2-3和5-12或表14的一个或多个CTL表位。
在其它实施方案中，所述第二异源序列编码来自对于其预存免疫(例如，在人群体中)不显著的腺病毒血清型的腺病毒六邻体蛋白质的一个或多个部分。例如，在人群体中存在最小的针对腺病毒血清型Ad35的预存免疫。参见，例如，Vogels等人(2003)，J.Virology77(15)：8263。对于其存在最小的预存免疫的其它腺病毒血清型包括例如Ad11、Ad34、Ad43、Ad48、Ad50、Ad26、Ad28、Ad45和Ad49。具有稍微更高但仍然低水平的预存免疫的腺病毒血清型包括例如Ad22、Ad24、Ad36、Ad37、Ad38、Ad46、Ad47和Ad10。因此，本发明的基于腺病毒的疫苗可来源于例如Ad4血清型，并且可包含编码来自Ad35六邻体蛋白质的一个或多个片段的第二异源序列，以便所述重组腺病毒编码对于Ad4和Ad35序列来说是嵌合的六邻体蛋白质。可选择地，本发明的基于腺病毒的疫苗可来源于例如Ad25血清型，并且可包含编码来自Ad68六邻体蛋白质的一个或多个片段的第二异源序列，以便所述重组腺病毒编码对于Ad25和Ad68序列而言是嵌合的六邻体蛋白质。当然，关于预存免疫的关注取决于疾病的目标群体-具体的腺病毒血清型是否与目标群体中的预存免疫无关将取决于目标群体。本领域技术人员因此可容易地评估该问题并且选择适当的六邻体序列用于所述第二异源序列。异源序列至腺病毒结构蛋白质例如六邻体内的整合已描述于例如美国专利6,127,525中。
在某些实施方案中，将所述第二异源序列整合入编码高变区(HVR)的六邻体ORF的部分。例如，可将所述第二异源序列作为插入物整合或以便其替代全部或部分编码六邻体HVR的ORF。可以以该方式改变或替代任何六邻体HVR。在某些实施方案中，可将所述第二异源序列整合入(和，任选地，替代)六邻体HVR5编码区。在其它实施方案中，将所述第二异源序列整合入(和，任选地，替代))六邻体HVR1、HVR2或HVR4编码区。选择哪个HVR来进行改变可基于不同HVR的相对多样性。例如，Ad5的HVR5对于Ad5六邻体HVR具有最大的多样性。在其它实施方案中，超过一个六邻体HVR可具有插入或替换。因此，在某些实施方案中，所述第二异源序列编码六邻体编码区域的嵌合片段，其中HVR编码区的至少两个区域具有插入或已被替代。如上文中所论述的，所述第二异源序列可编码来自感染性病原体和/或其它腺病毒血清型的抗原。因此，六邻体HVR的一个或多个可包含来自感染性病原体的抗原的插入物或可被这样的抗原或来自另一种腺病毒血清型的HVR替代。在某些实施方案中，六邻体HVR的一个或多个可包含插入物或抗原或可被这样的抗原替代，同时其它六邻体HVR的一个或多个可被来自另一种腺病毒血清型的HVR(例如，对于其在目标群体中存在最低预存免疫的血清型)的HVR替代。可用于本发明的腺病毒载体的嵌合六邻体构建体的示意图示于图13中。
本领域技术人员可容易地鉴定六邻体HVR的边界。已鉴定了例如Ad5六邻体的六邻体HVR。参见，例如，美国专利No.6,127,525。因此，来自其它血清型的六邻体蛋白质与Ad5六邻体的比对可用于鉴定此类其它血清型中的六邻体HVR。可选择地，来自不同组的腺病毒血清型的六邻体蛋白质的比对可用于鉴定HVR边界。例如，对于Ad4，HVR边界对应于GenBank序列AY594254的L5六邻体序列的氨基酸残基136-172(HVR1)、192-208(HVR2)、227-235(HVR3)、268-278(HVR4)、300-305(HVR5)、329-334(HVR6)和442-480(HVR7-9)。
可被插入单个六邻体HVR的序列的量取决于具体的HVR(例如，HVR1、HVR2等)和HVR的长度。一般而言，所述插入物可编码相应于HVR多肽序列(如果HVR序列被替代的话)的长度+另外的0至75、1至70、2至65、3至60、4至55或5至50个氨基酸的多肽序列。已在Matthews等人(2008)，VirologyJournal5：98中描述了例如Ad5的六邻体HVR插入物。
编码来自感染性病原体的抗原的序列可替代六邻体HVR以便所述六邻体序列和抗原序列彼此相邻。如本说明中在该背景中所使用的，术语“相邻的”是指六邻体编码序列与抗原编码序列之间的框内融合，其中不存在连接所述六邻体与抗原序列的连接体序列。可选择地，可将连接体序列用于连接六邻体与抗原序列。在某些实施方案中，所述连接体序列是编码三肽“LGS”的序列。可以例如在抗原序列的起始和末端包含连接体序列，如图12中所显示的。不期望受理论束缚，LGS连接体序列被认为提供了结构柔性，提高了所得的六邻体融合蛋白的稳定性，和/或减小了六邻体蛋白质序列与由异源序列编码的蛋白质序列之间的接头的免疫原性。在其它实施方案中，所述连接体序列编码肽序列“GAAA”(SEQIDNO：352)或“NAA”。可将此类连接体序列与例如由异源序列编码的蛋白质的N末端上的GAAA序列和C末端上的“NAA”序列组合使用。可由本领域技术人员鉴定其它适当的连接体序列。
在某些实施方案中，本发明的腺病毒载体包含第三异源序列。因此，在某些实施方案中，本发明的腺病毒载体包含第一、第二和第三异源序列。可选择地，本发明的腺病毒载体可包含第二和第三异源序列。所述第三异源序列可具有如上文中针对所述第一异源序列或所述第二异源序列所描述的结构，并且可被以上述任何方式插入腺病毒基因组。
本发明的腺病毒可来源于目前已知或以后发现的任何腺病毒血清型或分离株。例如，在某些实施方案中，所述腺病毒载体可来源于Ad4血清型。在其它实施方案中，所述腺病毒载体来源于Ad7血清型。在其它实施方案中，所述腺病毒载体来源于Ad2、Ad3、Ad4、Ad5、Ad6、Ad7、Ad11、Ad20、Ad21、Ad22、Ad23、Ad24、Ad25、Ad26、Ad28、Ad34、Ad35、Ad40、Ad41、Ad48、Ad49或Ad50血清型。在某些实施方案中，所述腺病毒载体来源于黑猩猩腺病毒。例如，在某些实施方案中，所述腺病毒载体来源于AdC1、AdC3、AdC6、AdC7或Ad68。
本发明的腺病毒载体在大小上可与所述载体所源自的野生型腺病毒的相应大小(即，基因组大小)的相应大小不同。然而，一般而言，大小的显著差异与缺陷型腺病毒复制相关。例如，缺失大部分腺病毒基因组可导致正确的病毒复制和功能所必需的基因组区域的去除。可选择地，添加大的插入物可导致太大以至于不能有效地包装在腺病毒壳体中，从而破坏正确病毒复制和功能的基因组。因此，在某些实施方案中，本发明的腺病毒载体具有为约95％至约110％，约97％至约105％，约99％至约103％，约99.5％至约102％或约100％至约101％的所述载体所源自的野生型腺病毒基因组长度的长度。在其它实施方案中，本发明的腺病毒载体具有约34,000bp至约38,000bp、约34,500bp至约37,500bp、约35,000bp至约37,000bp、约35,500bp至约36,500bp、约35,750bp至约36,250bp或约36,000bp的长度。
无论已被引入的具体改变(例如，异源序列的数目和类型、缺失的数目和类型等)是什么，本发明的腺病毒通常具有复制能力。术语“复制能力”是指腺病毒载体在受试者中复制的能力。在某些实施方案中，本发明的复制型腺病毒载体能够在人受试者内复制。在其它实施方案中，本发明的复制型腺病毒载体能够在哺乳动物受试者(例如，家畜例如猪、牛、马、绵羊、山羊等；动物园动物，例如狮子、虎、大象、犀牛、河马、长颈鹿、斑马、猴子、猿等；或宠物例如狗、猫、兔、豚鼠、仓鼠、沙鼠、大鼠、小鼠等)内复制。在某些实施方案中，本发明的复制型腺病毒载体的体外裂解量(例如，如在细胞培养物中测量的)为至少1000、2000、3000、4000、5000、7500、10k、15k、20k、25k、30k、35k、40k、45k、50k、75k、100k、150k、200k、300k、400k或更多。在其它实施方案中，本发明的复制型腺病毒载体的体内裂解量(例如，在受试者中)为至少1000、2000、3000、4000、5000、7500、10k、15k、20k、25k、30k、35k、40k、45k、50k、75k、100k、150k、200k、300k、400k或更多。在某些实施方案中，本发明的复制型腺病毒载体能够刺激受试者的免疫反应(例如，体液免疫反应、细胞免疫反应或两者)。在某些实施方案中，免疫反应包括针对由插入或整合入腺病毒载体的异源序列编码的表位可测量的反应(例如，可测量的体液或细胞免疫或其组合)。本发明的复制型腺病毒载体对于克服与针对目标受试者的腺病毒的预存免疫相关的问题是特别有用的。例如，在某些实施方案中，可利用更低剂量(与表达本文中描述的异源抗原的复制型腺病毒载体的剂量相比较)的表达相同抗原的复制型腺病毒载体在具有针对腺病毒的受试者中诱导针对异源抗原的有效免疫反应。因此，在某些实施方案中，本发明的复制型腺病毒载体的有效剂量为复制型腺病毒载体的有效剂量的1/2、1/3、1/4、1/5或1/10。
用于构建、遗传操作和扩增重组腺病毒载体的技术公开于下文中所示的实施例中。参见，例如，WO2008/010864、美国专利申请2006/0115456和美国专利6,127,525，将其内容通过引用并入本文。
在另一个方面，本发明提供了包含本发明的一种或多种腺病毒载体的疫苗。如本文中所使用的，术语“疫苗”是指包含本发明的腺病毒载体和载体的组合物。在某些实施方案中，所述腺病毒载体是病毒。在其它实施方案中，所述腺病毒载体是单独的基因组并且不包含腺病毒壳体。在某些实施方案中，所述载体是佐剂。此类佐剂的实例包括但不限于盐例如磷酸钙、磷酸铝、氢氧化钙和氢氧化铝；天然聚合物例如藻类葡聚糖(例如，β-葡聚糖)、壳聚糖或结晶的菊粉；合成的聚合物例如聚乳酸、聚羟乙酸、聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物或丙烯酸甲酯聚合物；形成胶束的阳离子或非离子嵌段共聚物或表面活性剂例如普朗罗尼类(Pluronics)、L121、122或123、Tween80或NP-40；脂肪酸、脂质或基于脂质和蛋白质的小囊泡例如脂质体、蛋白脂质体、ISCOM和螺旋状结构(cochleatestructure)；和由合成的或天然的油和水溶液组成的表面活性剂稳定的乳状剂。在某些实施方案中，本发明的疫苗，在给受试者施用后，能够刺激受试者的免疫反应(例如，体液免疫反应、细胞免疫反应或两者)。在某些实施方案中，免疫反应包括可测量的对由插入或整合入疫苗的腺病毒载体的异源序列编码的表位的反应(例如，可测量的体液或细胞免疫反应或其组合)。在某些实施方案中，本发明的疫苗能够提供抗感染性病原体或抗癌症的保护作用。例如，在某些实施方案中，所述疫苗能够刺激抗一种或多种抗原(例如，由异源序列编码的)的免疫反应，以便在以后遭遇这样的抗原时，接受所述疫苗的受试者具有比在先前未施用所述疫苗的情况下本来具有的免疫反应更强的免疫反应。在某些实施方案中，本发明的疫苗能够在具有对腺病毒的预存免疫的受试者中提供抗感染性病原体或癌症的保护作用。在其它实施方案中，本发明的疫苗能够缓解病原体感染或癌症和/或减轻病原体感染或癌症的至少一个症状。例如，在某些实施方案中，本发明的疫苗诱导抗一种或多种由异源序列编码的抗原的治疗性免疫反应，以便缓和、减轻或改善患有这样的感染或癌症的受试者的病原体感染或癌症的症状和/或并发症。
可按照本领域内公知的技术制备用于所述疫苗的腺病毒载体并且将其配制用于以给哺乳动物施用。用于口服施用的制剂可由包含预定量的本发明的重组腺病毒载体的胶囊或片剂、液体溶液(例如有效量的溶解在可摄入的稀释剂例如水、盐水、橙汁等中的药物)、适当液体中的悬浮液和适当的乳状液组成。
可将本发明的腺病毒载体例如配制为用于口服施用的肠溶胶囊(如先前所描述的)以避开上呼吸道并且允许在肠中进行病毒复制。参见，例如，Tacket等人，Vaccine10：673-676，1992；Horwitz，于Fields等人编辑，FieldsVirology，第3版，第2卷，第2149-2171页，1996中；Takafuji等人，J.Infec.Dis.140：48-53，1979以及Top等人，J.Infec.Dis.124：155-160，1971。可选择地，可将所述疫苗载体配制在常规溶液例如无菌盐水中，并且其可掺入一种或多种药学可接受的载体或赋形剂。所述药物组合物还可包含其它活性剂。
在某些实施方案中，本发明的制剂可包含含有药学上可接受的载体中的腺病毒载体(例如，病毒)的缓冲液。可使用许多种载体，例如缓冲盐水、水等。此类溶液通常是无菌的并且不含不合需要的物质。此类组合物可利用常规的公知的灭菌技术进行灭菌，或可对其过滤灭菌。必要时，所述组合物可包含药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，例如pH调节和缓冲剂、张力调节剂等，例如，醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、醋酸钠等。
药学上可接受的载体可包含生理上可接受的化合物，所述化合物用于例如稳定组合物或增加或减少病毒和/或药物组合物的吸收。生理上可接受的化合物可包括例如碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖(dextran)、抗氧化剂例如抗坏血酸或谷胱甘肽、螯合剂、低分子量蛋白质、减少任何共施用的试剂的清除或水解的组合物或赋形剂或其它稳定剂和/或缓冲剂。还可使用去垢剂稳定组合物或增加或减少吸收。本领域技术应当理解，药学上可接受的载体包括生理可接受的化合物的选择取决于例如腺病毒制剂的施用途径和任何共施用的试剂的具体生理-化学特征。
还可以以脂质制剂的形式，更具体地与脂质体复合或与脂质/核酸复合物复合或封装在脂质体中来施用腺病毒载体。可还将单独的或与其它适当的成分组合的本发明的载体制备成有待通过吸入施用的气雾剂制剂。还可将疫苗配制用以通过鼻道施用。适合用于经鼻施用的制剂(其中载体是固体)包括具有例如在约10至约500微粒范围内的粒度的粗粉，以其中采用从鼻中吸入，即，通过从拿至靠近鼻的粉剂的容器经鼻道快速吸入的方式来施用所述粗粉。其中载体是用于施用如例如鼻喷雾剂、滴鼻剂或利用喷雾器的气溶胶施用的液体的适当制剂包括活性成分的水性或油性溶液。在某些实施方案中，可将本发明的腺病毒载体配制为栓剂，例如用于直肠或阴道施用。
疫苗可具有在单次剂量中包含约103至约1013(例如，约103至约104、约104至约105、约105至约106、约106至约107、约107至约108、约108至约109、约109至约1010、约1010至约1011、约1011至约1012、约1012至约1013)个重组腺病毒的单位剂量。剂量可基于施用途径而变化。例如，配制用于舌下或鼻内施用的疫苗可包含比配制用于口服施用的疫苗更低的腺病毒剂量/单次剂量。取决于感染或癌症的类型以及待使用的施用途径，本领域技术人员可确定用于具体患者的适当的剂量而无需过度实验。
在另一个方面，本发明提供了诱导受试者的对本文中描述的任何感染性病原体的免疫反应的方法，包括给所述受试者施用本发明的疫苗。在某些实施方案中，本发明提供了接种受试者以抗感染性病原体的方法，包括给处于被感染性病原体感染的风险中的受试者施用有效量的本发明的疫苗。在另一个实施方案中，所述受试者具有由感染性病原体诱发的感染。因此，例如，在某些实施方案中，本发明提供了在经历由感染性病原体诱发的感染的受试者中诱导治疗性免疫反应的方法。在某些实施方案中，在施用所述疫苗后，受试者的感染的一个或多个症状或并发症得到减轻或缓和。本发明的疫苗可用于接种人或兽医受试者。
可单独地施用本发明的疫苗，或将其与其它免疫组合物、抗原性组合物、疫苗组合物或治疗性组合物共施用或相继施用。此类组合物可包含赋予或扩展免疫反应的其它试剂，例如IL-2或其它细胞因子，可在指定的时间间隔上施用或连续施用所述试剂(参见，例如，Smith等人，NEnglJMed1997Apr.24；336(17)：1260-1；和Smith，CancerJSciAm.1997December；3Suppl1：S137-40)。还可将所述疫苗与其它疫苗或载体结合施用。例如，可在施用不同血清型的腺病毒之前或之后施用本发明的腺病毒。还可将腺病毒制剂用于例如引发使用另外的疫苗试剂的疫苗方案。
可全身性、局域性或局部递送腺病毒制剂。局域性施用是指至特定解剖学空间例如腹膜内、鞘内、硬膜下或至特定器官等的施用。局部施用是指组合物至有限的或局限的解剖学空间的施用，例如至肿瘤团块内的瘤内注射、皮下注射、肌内注射等。本领域技术人员应理解，局部施用或局域性施用也可导致病毒制剂至循环系统的进入。常见的递送途径包括胃肠外施用，例如真皮内、肌内或皮下途径。其它途径包括口服施用，包括至口腔粘膜(例如，扁桃体)的施用、鼻内、舌下、膀胱内(例如，膀胱内部)、经直肠和阴道内途径。为了递送腺病毒，通常可通过吸入进行施用。可将气溶胶制剂例如置于加压的药学上可接受的喷射剂例如二氯二氟甲烷、氮气等中。还可将它们配制为用于无压制剂(例如在喷雾器或雾化器中)的药物制剂。通常，此类施用在如上文中描述的水性药学上可接受的缓冲液中。还可以例如使用支气管镜来实现至肺的递送。
取决于期望的用途，例如预防性疫苗或治疗性方案以及施用途径，可以以多种单位剂型施用本发明的疫苗。关于治疗性用途，每一个患者的具体的状态或疾病以及一般医疗状况可影响给药方案。药学上可接受的赋形剂中腺病毒的浓度可以是例如每剂量约103至约1013个病毒颗粒，每剂量约104至约1011个病毒颗粒，每剂量约106至约1010个病毒颗粒，每剂量约107至约109个病毒颗粒，每剂量约109至约1011个病毒颗粒。在其它实施方案中，药学上可接受的赋形剂中腺病毒的浓度可以是例如每剂量约103至约109，约104至约108或约105至约107个感染单位。
通常以比通过体内施用的复制缺陷型腺病毒重组体获得等同的所编码的转基因的表达水平所需的剂量低得多的剂量施用本发明的复制型腺病毒载体。可以一定的剂量范围施用复制型腺病毒载体(参见，例如，美国专利4,920,209；Smith等人，J.Infec.Dis.122：239-248，1970；Top等人，J.Infect.Dis.124：155-160，1971；Takafuji等人，J.Infec.Dis.140：48-53，1979；Tacket等人，Vaccine10：673-676，1992)。例如，可施用104至109个50％组织培养感染剂量(或噬斑形成单位)。通常复制型腺病毒的口服剂量为约107个50％组织培养感染剂量或或107个噬斑形成单位。在某些实施方案中，复制型腺病毒的口服剂量为约1011个噬斑形成单位。腺病毒重组体的常用鼻内施用通常在约103至约105个噬斑形成单位的剂量内。还可取决于例如初始施用后体内原位转基因表达和载体保留的水平调整病毒的确切浓度、制剂的量和施用的频率。
可由临床医生确定病毒的量和浓度以及给定剂量的制剂或“治疗有效”剂量。疫苗的治疗有效剂量是可刺激对由病毒载体包含的异源核酸编码的蛋白质的免疫反应的腺病毒的量。剂量日程表，即给药方案将取决于多个因素，例如，患者健康的一般状态、体格状态、年龄等。现有技术水平允许临床医生确定每一个个体患者的给药方案。腺病毒许多年来已被安全用于人疫苗。参见，例如，Franklin等人，同上；Jag-Ahmade等人，J.Virol.，57：267，1986；Ballay等人，EMBOJ.4：3861，1985；第WO94/17832号PCT公布案。这些说明性实例还可用作当实施本发明的方案时确定给药方案的指导。
腺病毒制剂的单次或多次施用可作为预防性或治疗性疫苗来进行施用。在某些实施方案中，给受试者施用多个剂量(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个或5个或更多个剂量)以诱导或加强保护性或治疗性免疫反应。两个或更多个剂量可通过周期性间隔例如1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月或6个月的间隔分开。
在另一个方面，本发明还提供了包括本发明的载体、载体系统或疫苗的试剂盒。所述试剂盒可以例如也包括用于培养本发明的腺病毒的细胞。所述试剂盒还可包括教导使用试剂盒产生腺病毒的方法的指导材料以及对于疫苗，可包括用于表示施用的剂量、途径和方法等的说明书。
下列实施例举例说明本发明的不同方面。当然，应当理解所述实施例仅举例说明本发明的某些实施方案并且不构成对本发明的范围内的限定，本发明的范围由在本说明书结尾处所附的权利要求确定。
实施例
实施例1：重组腺病毒载体的构建
使用大肠杆菌的同源重组快速且可靠地产生重组病毒载体。作为例子，从军用Ad4片剂(来自比号4958221，WyethLabs，USGov’tLicenseNo.3)分离野生型Ad4病毒DNA并且通过同源重组将其克隆入能够在大肠杆菌中复制的细菌质粒。所得的载体称为pPV-Ad4vax。
通过野生型Ad4的左臂的合成基因合成，将合成片段插入细菌质粒来产生用于pPV-Ad4vax载体的起始构建体。所得的质粒称为pPV-Ad4LeftArmTM。提供在Ad4合成基因片段的3’末端上添加的XbaI/EcoRI多接头以允许随后插入Ad4右臂片段。参见图1。通过高保真PCR从从军用Ad4片剂分离的Ad4基因组DNA产生Ad4的右臂片段，随后将其克隆入XbaI/EcoRI多接头位点。称为pPV-Ad4RHT&LFTArmTM的所得的质粒包括通过唯一的XbaI、ClaI和SpeI限制性位点分隔的Ad4的左臂和右臂片段。参见图1。在利用XbaI和SpeI线性化和去磷酸化后，将线性化的pPV-Ad4RHT&LFTarmTM载体与野生型Ad4基因组DNA共转化入BJ1583重组型细菌。在转化进入TOP10细胞之前通过限制性内切酶降解筛选克隆。通过测序进行pPV-Ad4pax的最终确认。
可使用穿梭质粒将Ad4基因组的异源序列和修饰引入pPV-Ad4pax载体。穿梭质粒经工程改造包含侧翼连接有足够的野生型Ad4DNA的异源序列，从而允许所述穿梭载体与pPV-Ad4vax之间的同源重组。异源序列包括编码绿色荧光蛋白(GFP)和流感病毒血凝素(HA)的基因。从HABbn(GenBank序列EU199366-“硫感A型病毒(A/布里斯班/10/2007(H3N2))区段4血凝素(HA)基因，全长编码序列”)、HAVT/1203(GenBank序列EF541403-A/越南/1203/2004(H5N1))和HAVT/1194(GenBank序列EF54140-A/越南/1194/2004(H5N1))人工合成分开的全长HA基因。所述穿梭质粒与pPV-Ad4pax之间的同源重组导致包含所需修饰的重组腺病毒载体的产生。通过多个酶限制性分析法和DNA测序确认重组腺病毒载体的本体。
实施例2：表达处于腺病毒MLTU的控制之下的异源序列的重组腺病毒载体
为了通过腺病毒主要晚期转录单位(MLTU)容纳异源序列和支持它们的表达，产生Ad4基因组的E3区域的部分缺失。所述部分缺失由1780个碱基对组成并且位于GenBank序列AY594254的核苷酸位置28446-30226上。所述部分缺失经设计保留E3区域的已知功能同时除去3个未知功能的开放阅读框架(E324.8k、E36.3k和E329.7k)。参见图2。所述缺失的区域与Ad5的ADP区域类似，虽然Ad4不编码ADP-样基因。
通过将所述异源序列克隆入所述部分E3缺失(以便使异源序列与天然E324.8k剪接受体有效连接以进行MLP驱动的表达)将不同异源序列(例如，HABbn、HAVT/1194或GFP)的表达与内源腺病毒MLTU联系起来。所述天然E324.8k剪接受体接近于共有序列，这样所述序列不需要修饰。为了增加最强的翻译起始，使紧接异源序列的ATG起始密码子之前的序列最优化至共有Kozak序列。在所得的重组病毒载体中，某些早期低水平表面可在病毒复制的早期通过内源E3启动子发生，但当MLP在DNA在感染的细胞中复制起始时变得活跃时，表达获得极大增加。为了更好地定义早期与晚期E3基因产物之间的边界，将小段包含29bp的Ad5E3A多腺苷酸信号序列的DNA整合在异源序列的下游。可在Ad4的更下游发现与Ad5E3A多腺苷酸序列潜在相似的序列，该序列可帮助在早期控制转录并且使异源序列的表达最大化。
表征异源序列的MTLU驱动的表达的不同重组腺病毒载体列于表15中。对于Ad4-HA-Bbn载体，基因组大小比野生型Ad4军用株系小22个碱基对，如下面所指出的：
a)-1780bp具有E3区域的部分缺失(AY594254的nt28446-30226)；
b)+10bp共有Kozak序列的5’添加；
c)+1701bp全长HA基因(A/布里斯班/10/2007(H3N2))
d)+18bp剩余多接头
e)+29bpAd5E3A多腺苷酸信号序列
表15：表达流感病毒抗原的重组腺病毒载体
1天然或密码子最优化的序列的基因描述。
实施例3：表达处于异源启动子的控制之下的异源序列的重组腺病毒载体
产生另一组重组腺病毒载体，其中将目的异源序列整合入由CMV启动子、Ad4三联前导序列、多接头和牛生长激素(BGH)多腺苷酸信号序列组成的表达盒的多接头。将所得的表达盒整合入包含部分或完全E3缺失的Ad4载体。部分E3缺失是如实施例2中所描述的。由3926个碱基对组成的完全E3缺失位于GenBank序列AY594254的核苷酸位点27,356至31,282，并且还在23.3kORF的ATG起始密码子中包含突变，其仅为部分缺失。参见图2。无论E3缺失的类型是什么，将表达盒在E3多腺苷酸信号序列与L5纤维基因之间插入Ad4载体。参见图2。
表征CMV驱动的异源序列的表达的不同重组腺病毒载体列于表15中。“Opt.”是指抗原序列的密码子最优化。
实施例4：重组腺病毒的产生
通过用相应于重组腺病毒基因组的线性DNA片段转染A549(MCB)细胞来产生重组腺病毒。切割线性DNA片段以除去所有异源细菌质粒序列。一旦在A549细胞中观察到致细胞病变效应(通常在7-10天后)，立即收获病毒并且进行系列传代以获得更高产率。为了确保病毒的本体是正确的，使用改进的Hirt方案分离病毒DNA，通过PCR、限制性降解和异源插入物及侧翼序列的测序来进行分析。序列确认所述异源插入物和侧翼区域在核苷酸水平上是正确的。
实施例5：从重组腺病毒表达异源序列
针对异源序列的表达分析利用重组腺病毒感染的A549细胞。图4显示来自4个不同重组Ad4H5HA腺病毒的HA的表达，所述腺病毒是：来自A/越南/1194/2004的处于内源MLP启动子的控制之下的H5HA(PVXV0103)；来自A/越南/1194/2004的处于CMV启动子的控制之下的H5HA(PVXV0113)；来自A/越南/1203/2004的处于CMV启动子的控制之下的H5HA，E3的完全缺失(PVXV0114)；和来自A/越南/1203/2004的处于CMV启动子的控制之下的H5HA，部分E3缺失(PVXV0124)。图5显示HA从腺病毒载体PXVX0101的内源MLP和从腺病毒载体PXVX0111中的CMV启动子的表达。实时PCR分析确认H3HA从腺病毒载体PXVX0101的表达水平与远端腺病毒蛋白纤维相似。参见图6。在用这些构建体感染2天后，HA抗原存在于A549细胞的表面上，如图7的FACS结果中显示的。与这些结果一致，已显示利用PVXV0101感染的A549细胞与红细胞凝集。参见图9A和9B。通过使用一步生长测定法(图8A)，PXVX0101和PXVX0111在A549、HepG2和HuTu80细胞中展示接近野生型的生长(图8B)。
实施例6：来自流感病毒的抗原在Ad4六邻体的HVR中的整合
图10描述了用于产生六邻体修饰的载体的一个策略。所述策略依赖于沉默突变至Ad4六邻体序列中的整合，以便包含HVR区域1-6的DNA片段可在单个步骤中被替换。所述策略将XbaI和XhoI克隆位点整合入Ad4六邻体编码区。随后通过合成基因合成产生每一个XbaI/XhoI片段。图11显示限制性位点相对于HVR区域的位置。此外，必要时，可使用所述XhoI位点和内源BstXI位点替代HVR7或HVR7-9。在不同流感病毒的M2e序列周围设计一系列表位(参见图12)。所述序列为来自流感病毒的H5、H7和H9株系的M2蛋白提供了共有序列。人M2E代表H1和H3M2e的共有序列。以最优化免疫反应方式将间隔区序列包含在整合的序列的位置中。所述序列经设计用以阻止针对表位之间的边界产生抗体。图13描述了一系列可产生的17个六邻体修饰。
实施例7：来自A549细胞的Ad4-H5-Vtn纯化的病毒在小鼠中诱导HA特异性抗体
如表16中所示测试纯化的Ad4-H5-VtnPXVX0103和PXVX0116病毒在小鼠中的免疫原性。对照是wtAd4病毒(阴性对照)和H5HA蛋白(日性对照)。
利用Ad4-H5-VtnPXVX0103(MLTU启动子)和PXVX0116(CMV启动子)病毒感染A549细胞。随后分离病毒，利用离子交换层析纯化病毒。对于免疫原性研究中的每一个组，使用6至8周龄的6只C57Bl/6×Balb/cF1雌性小鼠。使用1×1010、1×109、1×108vp/小鼠的剂量调整和肌内(i.m.)施用途径在第0天(引发)免疫小鼠，随后在第14天(加强)再免疫一次。在10天和27天后，通过眶后放血收集0.2mL血液，利用HA终点ELISA和血凝抑制反应(HAI)测定血清抗体滴度。
简而言之，对于ELISA测定，用1.5ug/ml(5×109个颗粒/ml)腺病毒或5ug/ml纯化的HA蛋白质(ImmuneTechnologies)包被高结合96孔ELISA板，并且将其在4℃下温育过夜。随后洗涤ELISA板，用PBS+3％BSA封闭2小时。将系列稀释的血清加入板中并且温育2小时。在充分洗涤后，使用HRP偶联的二抗检测抗原特异性血清抗体。利用HRP底物试剂使板显色，用酸终止反应，在450nm处在PolarStar板读数器上测量吸光度。终点ELISA滴度表示为产生高于平均本底3个标准差的读数的最高稀释度的倒数。在HAI滴度的情况下，使系列稀释的血清与固定剂量(4HAU)的流感病毒或HA蛋白反应，然后加入鸡RBC。在中和抗体存在的情况下，所述病毒凝集RBC的能力被抑制。抗体HAI滴度是能够抑制凝集的血清的最终稀释度的倒数。
表16：免疫原、剂量、途径
组 描述 颗粒/剂量 体积 途径
1 Ad4-H5-Vtn病毒PXVX0103a，b 1×1010 0.1mL IM
2 Ad4-H5-Vtn病毒PXVX0103 1×109 0.1mL IM
3 Ad4-H5-Vtn病毒PXVX0103 1×108 0.1mL IM
4 Ad4-H5-Vtn病毒PXVX0116c 1×1010 0.1mL IM
5 Ad4-H5-Vtn病毒PXVX0116 1×109 0.1mL IM
6 Ad4-H5-Vtn病毒PXVX0116 1×108 0.1mL IM
7 wt Ad4病毒 1×1010 0.1mL IM
8 H5重组蛋白 5μg 0.2mL SC
a)H5-Vtn(来自A/越南/1194/2004株系的血凝素(HA))
b)具有由MLTU启动子驱动的HA转基因的PXVX0103-Ad4
c)具有由CMV启动子驱动的HA转基因的PXVX0116-Ad4载体
如图14、A、B和C中显示的，利用高剂量(1×1010vp)纯化的Ad4-H5-Vtn(PXVX0103)病毒免疫的小鼠在1次和2次免疫后，当通过ELISA测量时分别产生约2.5×104和7×104的强HA特异性抗体滴度。在1次和2次免疫后，还使用更低剂量的病毒(1×109vp)分别诱导了约2.5×103和2×104的更低的但显著的HA特异性反应。在使用的最低病毒剂量(1×108vp)上，在2次免疫后观察到8×103抗体终点滴度的显著反应。当利用CMV(PXVX0116)驱动H5转基因时，诱导约3倍的更高抗体反应。如所预期的，利用wtAd4纯化的病毒(1×1010vp)免疫的小鼠(其不包含HA转基因)不诱导可检测的HA特异性抗体反应。在2次免疫后，所述H5蛋白诱导约7×104的HA抗体终点反应。关于HAI滴度，利用1×1010vp纯化的Ad4-H5-Vtn(PXVX0103)免疫的小鼠在1次和2次免疫后分别产生1∶20和1∶40的显著的HAI抗体滴度。在第二次免疫后，更低剂量的1×109vp的Ad4-H5-Vtn(PXVX0103)诱导1∶20的显著的HAI反应。对于wtAd4病毒未检测到HA特异性反应。再次地，Ad4-H5-Vtn(PXVX0116)诱导约4倍的更高HAI滴度。纯化的H5蛋白在第二次免疫后诱导1∶40的显著反应。这些结果与使用感染的细胞进行的研究一致，在所述研究中，已显示需要纯化的H5蛋白的2次免疫来诱导可测量的HAI抗体滴度。
使用纯化的Ad4-H5-Vtn病毒的这些免疫原性研究显示尽管在小鼠中不存在病毒复制，但所述病毒在体内进入细胞并且转基因得到充分表达，从而诱导了H5特异性抗体反应。
实施例8：小鼠中腺病毒血清型4流感病毒H5血凝素疫苗的评估腺病毒血清型4H5HA疫苗的设计
在鼠模型中评估实施例7中描述的Ad4-H5-Vtn(PXVX0103)重组腺病毒作为疫苗的安全性、免疫源性和功效。如图15中描述的，利用经缺失以容纳来自A/越南/1194/2004H5N1流感病毒的HA基因的Ad4病毒E324.8K、6.8K和29.7K基因构建Ad4H5HA疫苗。保留E324.8K基因的剪接受体以驱动HA转基因的表达。使用除去了多碱基切割位点的HA天然编码序列。将来源于Ad5的E3A多腺苷酸化信号序列置于HA编码序列的下游。DNA的直接测序确认了HA转基因和侧翼连接的载体序列的完整性。一旦鉴定和分离正确的重组体，就立即用适当的限制性内切酶降解其以除去外来细菌质粒序列但保留编码HA转基因的完整重组Ad4基因组DNA。
为了产生用于表征的病毒，将该线性Ad4H5HADNA序列转染进入哺乳动物A549细胞(ATCC，Manassas，VA)。在转染前一天，将3×105个A549细胞于DMEM(Hyclone，Logan，UT/10％胎牛血清(FBS)(Hyclone)中涂板在6孔板(BDBiosciencesSanJose，CA)的每一个孔中，将板在5％CO2的潮湿大气中于37℃下进行温育。第二天，细胞达到50-90％汇合，随后按照制造商的说明书(Roche，Indianapolis，IN)以8μL/孔使用FugeneHD转染剂，每孔利用2μg线性化Ad4H5HADNA转染所述细胞。一旦观察到致细胞病变效应(CPE)(通常在转染后7-10天)，通过使用16cm细胞刮棒(VWR，WestChester，PA)取出感染的细胞，然后进行3轮冷冻-解冻细胞破裂(液氮和37℃水浴)从6个孔的至少3个孔收获病毒。通过在4℃下以1,800g离心澄清裂解物，进行10分钟，收集约6mL的上清液以进行两步骤病毒扩增法。在具有15mLDMEM/10％FCS的终体积的75cm2培养瓶(BDBiosciences)中将3mL上清液用于在感染悬浮的1.5×106个A549细胞。在观察到CPE后3至7天中，使用16cm细胞刮棒取出细胞，将其经历冷冻-解冻和澄清方法以获得病毒上清液。
为了评估来自Ad4H5HA重组病毒的HA表达，利用流式细胞术体外评估HA蛋白表达。利用Ad4H5HA病毒颗粒(vp)的剂量调整感染A549细胞，48小时后使用H5特异性一抗和PE标记的二抗进行分析。如图16A中显示的，利用Ad4H5HA疫苗感染的A549细胞以剂量依赖性方式表达HA蛋白。相应于使用的最高疫苗剂量的检测到的HA蛋白的平均荧光强度(MFI)与用作阴性对照的Ad4wt-感染的细胞(其中检测到约2.0的MFI)相比较为约34.0。
为了确认Ad4H5HA重组病毒对HA蛋白的体外诱导和确保在A549细胞中连续15次传后稳定表达，使用蛋白质印迹分析。收获Ad4H5HA重组病毒感染的A549细胞，制备全细胞提取物。利用SDS-PAGE凝胶分离不同量的感染的细胞提取物，然后将其转移至硝酸纤维素。使用H5HA特异性抗血清检测HA蛋白，同时将抗β肌动蛋白抗体用作蛋白质上样对照。如图16B中显示的，相对于纯化的重组(r)H5蛋白阳性对照(100和200ng)，在适当的大小80kDa上检测到来源于Ad4H5HA重组病毒感染的细胞裂解物(2.5％和5％)的HA蛋白。使用来自未感染的A549细胞(2.5％和5％)(阴性对照)未检测到HA特异性蛋白。也在Ad4H5HA感染的A549细胞裂解物中观察到相应于切割的HA0的HA1和HA2片段的小片段。Western分析也确认了Ad4H5HA重组病毒稳定地表达H5HA，即使在A549细胞中15次传代后亦如此。与这些结果相一致，已显示利用PVXV0103感染的A549细胞与红细胞凝集。参见图17。
Ad4H5HA重组腺病毒作为疫苗的功效
为了阐明重组病毒的安全性，在几种人细胞系：A549、H1299、HepG2、HuTu80和MRC-5中比较Ad4H5HA病毒对Ad4wt病毒的生长。虽然可通过扩散测定法测量Ad5病毒，但Ad4不以相似的方式行为，从而不容易在体外裂解细胞。因此，将常规的一步生长测定法用于评估生长动力学(参见图8A)。Ad4H5HA病毒的生长与Ad4wt病毒相似或相对于其减弱。参见图18。具体地，当在感染后第48和72小时时间点上评估时，在细胞裂后测量的感染性颗粒在测试的5个细胞系的4个中对于Ad4wt病毒为Ad4H5HA病毒的1.1至2.3倍，图18。对于第5个细胞系H1299，相对于Ad4H5HA，对于Ad4wt测量的感染性颗粒在48小时和72小时的时间点上分别为7至6.5倍。Ad4H5HA载体的生长决不高于Ad4wt病毒。
免疫原性和安全性评估过程的初始期将建立针对Ad4wt病毒的预存免疫以评估对疫苗潜能的效应。因此，利用1×109vpAd4wt病毒鼻内免疫小鼠，一个月后，测定Ad4特异性中和抗体滴度和细胞免疫。收集来自10只已免疫的小鼠的免疫血清，测量的Ad4特异性中和抗体滴度在133至3140的范围内变化，算术和几何平均数分别为866和569，图19A。也诱导了显著的Ad4特异性细胞免疫。将来自2只小鼠的未纯化的脾细胞混合，并且用于ELISPOT测定。当利用热灭活的Ad4wt病毒温育时，相对于使用来自已免疫的小鼠的脾细胞的18IFN-γSFC从Ad4wt免疫的小鼠检测到140IFN-γ斑点形成细胞(SFC)/1×106个脾细胞，图19B。随后将这些小鼠和不具有预存Ad4wt免疫的初次接受实验的小鼠用于Ad4H5HA疫苗免疫。
在Ad4H5HA疫苗的单次免疫后6周测量到显著的血凝抑制反应(HAI)抗体滴度。如图20A中显示的，观察到剂量反应；109vp(40HAI)、108vp(20HAI)和107vp(10HAI)。疫苗的最低剂量106vp不具有免疫原性。存在Ad4wt预存免疫对疫苗潜能的影响，其中在109vp剂量上测量到为20的HAI抗体滴度，但更低剂量不具有免疫原性。在H5N1重配株病毒攻击后，HA1反应通常高一个稀释度，例如在109vp疫苗剂量上40至80和20至40。再次地，最低剂量的疫苗106vp不具有免疫原性。对于比较者(comparator)阴性和阳性对照，分别用1×1010vpAd4wt病毒和15μg重组H5HA蛋白免疫小鼠。如所预期的，Ad4wt病毒不诱导可检测的HAI抗体滴度反应。重组蛋白质在流感病毒攻击前后分别诱导10和20HAI抗体滴度的HAI抗体滴度反应。
H5HA特异性细胞免疫的疫苗诱导经评估特异于来源于A/越南/1194/2004HA蛋白的4种15-mer肽的混合物，图20B。混合物中的肽由：HA.156，seqKSSFFRNVVWLIKKN(SEQIDNO：2)；HA.241seqRMEFFWTILKPNDAI(SEQIDNO：5)；HA.325seqNRLVLATGLRNSPQR(SEQIDNO：8)和HA.529seqIYQILSIYSTVASSLALAI(SEQIDNO：338)组成。当利用107、108和109vp的剂量的Ad4H5HA疫苗免疫时，测量到大于80SFC的IFN-γ反应。预存Ad4wt免疫也影响细胞免疫的疫苗诱导，因为仅109vp剂量的Ad4H5HA疫苗具有免疫原性，诱导约100IFN-γSFC。在H5N1重配株病毒攻击后5天，细胞反应得到增强。在预存Ad4wt免疫存在或不存在的情况下，107、108和109vp剂量的Ad4H5HA疫苗诱导300至600IFN-γSFC。应当指出，在预存Ad4wt免疫以及107和108vp的疫苗剂量存在的情况下，小于50SFC的最小IFN-γ反应被加强至大于500SFC，这表明即使更低的疫苗剂量也引发细胞反应。在所有情况下，106vp剂量不具有免疫原性。作为比较者对照，利用15μg重组H5HA蛋白免疫的小鼠在H5N1重配株病毒攻击前后诱导80和680IFN-γSFC。在病毒攻击后5天，在只用Ad4wt病毒免疫并且随后用H5N1重配株病毒攻击的小鼠中未检测到显著的HA特异性细胞反应。
在致死H5N1重配株病毒攻击后，体重减轻、存活率和肺流感病毒滴度的减少是疫苗剂量依赖性的。在H5N1重配株株攻击后测量动物的体重，进行14天，图21A。如果动物连续2天被记录丧失20％或更多的它们的原始体重，那么使它们安乐死。通常，必需在攻击后6-12天处死动物。在不具有Ad4wt病毒预处理的动物中，在107、108和109vp疫苗剂量上观察到极少至无体重减轻。在Ad4wt预处理的情况下，只有109vp的高疫苗剂量防止任何体重减轻。当利用Ad4wt预处理动物时，在更低的疫苗剂量108vp疫苗剂量(最大平均6％的体重减轻)和107vp疫苗剂量(最大平均17％的体重减轻)上记录到更严重的体重减轻。接受106vp的疫苗剂的动物不能防止严重的体重减轻。用重组H5HA蛋白免疫的小鼠未失去体重，然而Ad4wt免疫的小鼠死于疾病。
在致死性H5N1重配株病毒攻击后小鼠的存活率示于图21B中。接受108和109vp的疫苗的成组的小组被完全保护，10只小鼠都存活。利用Ad4wt预处理小鼠以建立针对载体的预存免疫在这些剂量上不影响动物存活。然而，在107和106vp的更低疫苗剂量上，疫苗不再无效。针对Ad4wt病毒的预存免疫影响107vp的疫苗剂量，因为在Ad4wt特异性免疫存在的情况下相对于当不用Ad4wt病毒预处理小鼠时10只动物都存活，10只小鼠中只有3只存活。106vp的最低疫苗剂量不具有保护性。利用Ad4wt病毒的免疫不保护动物，10只动物都死亡。利用重组H5HA蛋白免疫小鼠完全保护小鼠，10只动物都存活。
最后，作为功效的测量，在H5N1重配株病毒攻击后5天获得代表每个组的2只小鼠的肺来评估流感病毒滴度，图21C。在107、108和109vp的更高Ad4H5HA疫苗剂量上观察到大于85％的流感病毒滴度的减少。例外是其中用Ad4wt预处理动物组的107vp的疫苗剂量导致约40％的流感病毒滴度的减少，从而表明预存Ad4wt免疫对疫苗潜能的影响。当用106vp的疫苗剂量或用Ad4wt1010vp阴性对照免疫时，未观察到流感病毒滴度的减少。利用重组H5HA蛋白免疫的小鼠也展示肺中大于85％的攻击病毒的减少。
概括而言，Ad4H5HA疫苗对H5HA特异性体液和细胞免疫的诱导通常预测所述疫苗的功效。针对Ad4wt载体的预存免疫对免疫原性和功效都具有影响但在更低的疫苗剂量上所述影响更明显，这表明针对所述Ad载体的预存免疫可通过使用更高的疫苗剂量来克服。
实施例9：当通过多种途径递送时Ad4-H5-Vtn(PXVX0103)在哺乳动物中诱导针对H5HA转基因的免疫反应
为了评估当通过多种施用途径递送时重组Ad4-H5腺病毒在诱导免疫反应中的功效，通过4种不同施用途径之一利用包含Ad4-H5-Vtn(PXVX0103)病毒颗粒的不同制剂免疫兔子。将Ad4-H5-Vtn病毒疫苗在MRC-5细胞中扩增，利用阴离子交换层析和超滤纯化所述疫苗以用于动物研究。在PaxVax产生大体积药物(bulkdrugsubstance)(BDS)和肠溶胶囊，额外的BDS用于在Niro(Copenhagen，Denmark)上产生喷雾干燥的粉剂。不同制剂的成分描述于下文中：
以液体形式存在的BDS：5×1010个Ad4-H5-Vtn病毒颗粒、蔗糖、氯化钙六水合物、磷酸钾、甘油
喷雾干燥的粉剂：5×1010个Ad4-H5-Vtn病毒颗粒、麦芽糖糊精、β环糊精、蔗糖、氯化镁六水合物、磷酸钾、甘油、tween80
肠溶性喷雾干燥的粉剂：5×1010个Ad4-H5-Vtn病毒颗粒、EudragitL30D55、麦芽糖糊精、β环糊精、蔗糖、氯化镁六水合物、磷酸钾、甘油、tween80
肠溶胶囊：1×1010个Ad4-H5-Vtn病毒颗粒(每粒胶囊)、AcrylEZEwhite、HPMC胶囊、麦芽糖糊精、β环糊精、蔗糖、氯化镁六水合物、磷酸钾、甘油、tween80
使用上述不同Ad4-H5-Vtn疫苗制剂：大体积药物(BDS)、肠溶(E.C.)和非肠溶(非-E.C.)粉剂和肠溶胶囊(5粒胶囊，1×1010vp/胶囊)之一利用5×1010vp免疫(每组3只)成年新西兰雄性白兔。免疫动物2次，间隔30天。使用指定的多个施用途径：肌内(I.M.)、鼻内(I.N.)、舌下(S.L.)或灌胃(oralgavage)(O.G)。在第二次免疫后2周，将兔子放血以用于ELISA免疫测定。例外是针对I.N.递送的BDS显示的数据来自在只进行一次免疫后2周采集的免疫血清。
用2μg/mL纯化的rHA蛋白(eEnzyme)包被ELISA板，在洗涤之前在4℃下温育过夜，然后利用具有10％山羊血清的PBS封闭2小时。从每一个混合血清产生3倍连续稀释系列，加入板中，然后温育2小时。在充分洗涤后，使用HRP偶联的二抗检测抗原特异性血清抗体。利用HRP底物试剂使板显色，用酸终止显色，在450nm处测量吸光度。终点滴度表示为产生高于平均本底3个标准差的读出的最高稀释度的倒数。结果显示当通过不同途径递送时Ad4-H5-Vtn疫苗在兔中具有免疫原性。参见图22。
在另外一系列实验中，检查当通过舌下、阴道和直肠施用途径递送时重组Ad4-H5腺病毒在诱导免疫反应中的功效。通过舌下、阴道或直肠施用利用Ad4-H5-Vtn(PXVX0103)病毒颗粒免疫小鼠。为了进行舌下施用，在第0天(引发)免疫麻醉的小鼠，在第43天(加强)将1×1010Ad4-H5-Vtn病毒颗粒(于7μL大体积药物(BDS)配制缓冲液中)置于舌下并且让体积停留(通常1分钟的恢复时间)来加强免疫。为了进行阴道施用，在免疫前5天，皮下施用2.5mgDepo-Provera以使阴道壁变薄。在第0天(引发)经阴道免疫麻醉的小鼠，在第14天(加强)通过首先用Q-tip清除粘液，随后将1×1010vpAd4-H5-Vtn(于20μL体积的BDS配制缓冲液中)施用至阴道内来加强免疫。使小鼠在麻醉状态下保持面朝上10分钟。为了进行直肠施用，在第0天(引发)直肠免疫麻醉的小鼠，在第14天(加强)通过将1×1010vpAd4-H5-Vtn(于20μLBDS配制缓冲液中)施用至直肠中来进行加强。使小鼠在麻醉状态下保持面朝上10分钟。使用异氟醚麻醉所有小鼠，通过在免疫前的晚上移走食物使小鼠禁食。
在第二次免疫(例如，加强免疫)后2-4周将小鼠放血，如上所述使用重组H5(A/VN/1203/04)进行ELIS。结果显示当通过舌下、阴道和直肠施用途径递送时，Ad4-H5-Vtn流感病毒疫苗(PXVX0103)在小鼠中诱导显著的H5HA特异性抗体反应。参见图23。
实施例10：Ad4-H5-Vtn疫苗的1期临床安全性研究
开始1期双盲、安慰剂对照的递增剂量研究。连续招募4个剂量组群107、108、109和1010个病毒颗粒(vp)。每一个组群由大约24个已接种疫苗者和8个安慰剂接受者和所有与他们有接触的家族(HHC)组成。在每一个剂量组群中，已接种疫苗者或安慰剂接受者接受3次接种，相隔56天(第0、56和112天)。免疫功能的测量包括利用HAI和微量中和法对针对H5HA的抗体的测量；Ad4中和抗体；鼻、直肠和宫颈分泌物中针对HA和Ad4的IgG和IgA的评估；以及针对HA和针对Ad4的CMI反应的测量。利用PCR和来自直肠和咽喉拭子以及来自血液的培养物评估Ad4-H5-Vtn疫苗病毒的复制和分泌。利用基线Ad4中和抗体滴度通过分层分析免疫学和病毒学参数。目前已招募132个疫苗/安慰剂患者和67个HHC。组群1-3已接受全部3个剂量，并且组群4已接受其第1个剂量。目前组群4接受剂量2以及组群5(1011vp)正在进行招募。
主要安全性参数是致反应力(reactogenicity)、严重或重大的不利事件和临床安全性实验室异常(clinicalsafetylababnormality)。这些参数在5个DMC检查的每一检查之前已被正式评估，并且在进行性基础上进行“实时”评估。在最近的DMC检查中，检查在全部3次剂量施用后来自组群1、2和3和在第一次剂量施用后来自组群4的安全性数据。未鉴定安全性问题或剂量限制性毒性。不存在显著的实验室异常或严重或重大的不利事件。致反应力通常保持微弱至适度。在接种后第7天和/或14天在直肠拭子中检测到通过PCR监测的疫苗病毒的脱落(Shedding)。没有疫苗病毒的全身性或呼吸传播的证据。除了来自已接种疫苗者(其直肠拭子和血液通过PCR检测是阴性的)的PCR阳性咽喉拭子的单个实例外，所有咽喉拭子和血液样品对于Ad4-H5-Vtn病毒都是阴性的。该已接种疫苗者完全保留无症状。基于这些数据，DMC被批准用以给组群4施用剂量2，招募组群5。在研究过程中不同时间点上每一个组群的基线Ad4抗体状态示于表17中。
表17.Ad4-H5-Vtn疫苗的1期临床安全性研究
*组群1统计上异常地导致更少数目的Ad4阳性患者。
实施例11：表达炭疽抗原的重组腺病毒的构建和评估
利用与实施例1-3中描述的方法相似的方法产生具有完全或部分E3区域缺失的重组Ad4病毒，该病毒表达来自炭疽杆菌的保护性抗原(PA)。PA转基因的修饰包括用于在人细胞中最优化表达的密码子修饰、用于细胞表面表达的糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚的添加、和除去嗜热菌蛋白酶切割位点的两个苯丙氨酸的缺失。转基因表达由人CMV或天然MLTU启动子驱动。表征MTLU驱动的或CMV驱动的异源序列的表达的不同重组腺病毒载体列于表18中。
表18.表达炭疽抗原的重组腺病毒载体
构建体 转基因 启动子
1 Ad4-FDE3-CMV-PA(PXVX0212) 密码子最优化的PA CMV
2 Ad4-FDE3-CMV-PA-GPI(PXVX0214) 具有GPI锚的密码子最优化的PA CMV
3 Ad4-PDE3-MLTU-PA-GPI 具有GPI锚的天然PA MLTU
4 Ad4-FDE3-CMV-PA-GPI 具有GPI锚的天然PA CMV
5 Ad4-FDE3-CMV-PA FF 缺失的嗜热菌蛋白酶切割位点 CMV
6 Ad4-FDE3-CMV-PA-GPI FF 缺失的嗜热菌蛋白酶切割位点 CMV
FDE3＝除了E312.1k外，E3区域的完全缺失；PDE＝E3区域部分缺失。分析利用2.5×107个重组Ad4-PA腺病毒感染的A549细胞(5×105)的保护性抗原的表达。将细胞在37℃下温育48小时，然后收获。在于SDS-PAGE凝胶上分离后，利用蛋白质印迹分析来自每一个样品的全细胞裂解物(图24，左图)或细胞培养上清液(图24，右图)。利用抗PA小鼠单克隆抗体探测硝酸纤维素膜。通过参考作为阳性对照平行上样的商购可得的重组PA，确认重组蛋白质表达。利用Ad4WT感染的A549和A549代表阴性对照，显示了对rPA的特异性。蛋白质水平显示为相对于总蛋白质水平的相对量。参见图24。
在用这些构建体感染后一天，PA抗原呈出在A549细胞的表面上，如通过图25中所示的FACS分析显示的。显示每一个组的代表表示每细胞表达水平的荧光强度的测量的平均荧光强度(MFI)。使用一步生长测定法评估PXVX0212和PXVX0214重组腺病毒在A549(肺癌)和MRC-5(胚胎肺成纤维细胞，二倍体)细胞中的生长动力学(参见图8A)。在rAd4-PA病毒感染A549或MRC-5细胞后通过TCID50测量rAd4水平的时间过程。使用免疫感染性水平(对于A549而言1小时以及对于MRC-5而言24小时)作为参照计算细胞裂解量，从而修正感染的差异。裂解量确认PXVX0212和PXVX0214都显示与Ad4Wt相比较减少的生长率并且也导致每细胞更低的产率。参见图26。
实施例12：Ad4-PA重组腺病毒作为抗炭疽攻击的保护性疫苗的功效
为了确定表达来自炭疽杆菌的保护性抗原重组(PA)的重组腺病毒是否可诱导抗炭疽攻击的保护性免疫反应，利用用实施例11中描述的重组腺病毒载体之一感染的细胞的全细胞裂解物免疫小鼠。具体地，通过腹膜注射(IP)相当于用5×108个Ad4野生型(Ad4WT)、Ad4-PA(PXVX0212)或Ad4-PA-GPI(PXVX0214)的病毒颗粒感染的5×106个A549细胞的全细胞裂解物来免疫小鼠(6只动物/组)。作为阳性对照，皮下(S.C.)施用10μg重组保护性抗原(rPA)。免疫后5周，利用致死性毒素(120μgPA与60μg致死因子(LF)的组合)静脉内攻击小鼠，然后每天进行监测。实验结果示于图27中。Ad4-PA-GPI细胞裂解物完全保护小鼠免受致死性毒素攻击。
从在IP免疫后21天获得的血清测量被免疫的小鼠的抗体反应。利用ELISA(图28，左图)和基于体外巨噬细胞的毒素中和测定(图28，右图)分析抗体反应。从6只动物/组计算EC50。PA特异性IgG反应在利用来自用重组腺病毒感染的A549细胞的全细胞裂解物免疫后3周是可检测的。
在另一系列实验中，检查纯化的重组腺病毒在诱导保护性免疫反应中的功效。如图29的示意图中所指定的，在第0天利用5种不同抗原(Ad4野生型、Ad4-CMV-PA(PXVX0212)、Ad4-CMV-PA-GPI(PXVX0214)、rPA和rPA+明矾)之一免疫小鼠(n＝25/组)。以1×1010个病毒颗粒(vp)(于50-62.5μLPBS中)/动物鼻内(I.N.)施用rAd4病毒。野生型Ad4病毒用作阴性对照。以100μL终体积的含有单独的10μg重组保护性抗原(rPA)或10μg吸附至1mg氢氧化铝凝胶(RehydragelHPA)的rPA的PBS皮下注射阳性对照。在免疫后27天测量来自2只小鼠/组的混合的脾细胞的细胞介导的免疫反应(IFN-γELISPOT和IL-4ELISPOT)。在第54天测定第1次攻击(免疫后第20天，n＝10/组)幸存的小鼠的细胞免疫反应。在免疫后14和40天，将相同的9只小组/组(5组)放血以进行ELISA和毒素中和测定。也在免疫后46天对每组总共10只小鼠(包括来自已被放血的9只小鼠的7只小鼠)进行致死毒素攻击(利用120μgPA和60μg致死因子的组合)。攻击后测量存活率，进行30天。
在利用纯化的Ad4-PA和Ad4-PA-GPI病毒鼻内免疫后14和40天测量血清中的抗体反应(参见图29)。利用ELISA(图30，左图)分析抗PAIgG反应，同时利用基于体外鼠巨噬细胞的毒素中和测定(图30，左图)测量毒素中和抗体(TNA)。使用S形剂量反应曲线拟合来自样品的系列稀释度的数据来计算EC50。在免疫后14天只观察到最小抗PAIgG反应，未观察到可测量的TNA反应(图30)。在免疫后40天后，对于Ad4-PA(PXVX0212)和Ad4-PA-GPI(PXVX0214)相对于rPA或rPA和明矾观察到显著的抗PAIgG和TNA反应(图30)。两种重组PA腺病毒(Ad4-PA和Ad4-PA-GPI病毒)均诱导可比较的免疫反应。
在第0天用如图29中指示的5种不同免疫原之一免疫小鼠(n＝10/组)，在免疫后20和46天用致死性毒素(60μgPA和30μgLF，于总体积100μL的PBS中)进行攻击。监测存活率，进行30天。结果示于图31中。在免疫后20天攻击后，对于利用rPA-明矾免疫的小鼠观察到80％的存活率，然而Ad4-PA和Ad4-PA-GPI免疫的组合分别具有50％和20％的存活率(图31，左图)。Ad4野生型免疫的组中有一只小鼠存活，rPA免疫的组中没有存活。在免疫后46天攻击后，在rPA+明矾和Ad4-PA免疫的组中观察到100％的存活率，然而在Ad4-PA-GPI和rPA免疫的组中分别观察到90％和30％的存尖率(图31，右图)。在Ad4野生型处理的组中未观察到存活。结果表明在致死性毒素攻击中，两种Ad4-PA载体病毒在免疫后20天赋予了部分保护作用并且在免疫后46天赋予完全保护作用。在由Ad4-PA或Ad4-PA-GPI重组腺病毒提供的保护作用中不存在统计上显著的差异。
在免疫后27天测量来自用图29中指示的5种不同抗原之一免疫(2只小鼠/组)的小鼠的混合的脾细胞的细胞介导的免疫反应(IFN-γELISPOT和IL-4ELISPOT)。在第54天(攻击后34天)测量第1次毒素攻击(免疫后第20天，n＝10/组)幸存的小鼠的细胞免疫反应。重组Ad4-PA和Ad4-PA-GPI腺病毒都诱导针对PA的Th1和Th2反应，如通过IFN-γ和IL-4反应显示的，(图32)。
概括而言，本实施例中描述的实验的结果显示表达保护性抗原的重组腺病毒在小鼠中诱导体液和细胞介导的免疫并且提供抗致死性炭疽攻击的保护作用。
实施例13：来自重组腺病毒的多个HTL表位多肽的表达
设计合成的流感病毒抗原序列，其包含24个各自被GPGPG间隔区序列(SEQIDNO：353)分隔的流感病毒辅助T淋巴细胞(HTL)表位。参见图33A。利用与实施例3中描述的方法相似的方法产生具有E3区域的完全缺失的重组Ad4病毒，其表达处于CMV启动子(PXVX0109)的控制之下的该HTL24多肽。通过转染利用PXVX0109感染A549细胞以从两个等同的质粒克隆(15-4和19-1)产生病毒。在大于90％的致细胞病变(CPE)下收获感染的细胞，以1×106个细胞/100μL含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液制备细胞裂解物。作为阳性对照，用A/乌拉圭/716/2007(A/布里斯班/10/2007-样)流感病毒(NYMCX-175C重配株株，NIBSC)感染A549细胞。在于SDS-PAGE凝胶上分离和随后转移至印迹膜后，利用抗HA标签单克隆抗体和HRP山羊抗小鼠IgG二抗检测蛋白质。对于上样对照，利用抗β肌动蛋白兔多克隆抗体和HRP山羊抗兔IgG二抗探测平行膜。利用化学发光(SupersignalWestFemto，Thermoscientific)使蛋白质条带可视。如由图33B中蛋白质印迹分析的结果所显示的，重组Ad4腺病毒表达高水平的HTL24多肽。
本文中论述和引用的所有公布、专利和专利申请通过引用整体并入本文。应理解，本公开发明不限定于所述的具体方案、方案和材料，因为这些可变化。也应理解，本文中使用的术语仅为了描述特定实施方案并且无意限定本发明的范围，本发明的范围只受所附权利要求限定。应理解本公开发明不限定于所述的具体方法、方案和材料，因为这些可变化。还应理解，本文中使用的术语仅为了描述特定实施方案并且无意限定本发明的范围，本发明的范围只受所附权利要求限定。
本领域技术人员将承认或能够确定只使用常规实验，许多实施方案等同于本文中描述的本发明的具体实施方案。此类等同物意欲被在下列权利要求包括。

Claims (26)

1.一种包含含有第一异源序列的腺病毒载体的疫苗，其中所述腺病毒载体具有复制能力并且具有部分E3缺失，并且其中所述第一异源序列被整合入包含所述部分E3缺失的位置，并且在内源主要晚期启动子的控制之下与天然腺病毒剪接受体有效连接。
2.权利要求1所述的疫苗，其中所述腺病毒载体选自Ad2、Ad3、Ad4、Ad5、Ad6、Ad7、Ad11、Ad20、Ad21、Ad22、Ad23、Ad24、Ad25、Ad26、Ad28、Ad34、Ad35、Ad40、Ad41、Ad48、Ad49或Ad50。
3.权利要求1所述的疫苗，其中所述腺病毒载体来源于黑猩猩血清型AdC1、AdC3、AdC6、AdC7或Ad68。
4.权利要求1所述的疫苗，其中所述腺病毒载体来源于Ad4或Ad7。
5.权利要求1所述的疫苗，其中所述部分E3缺失包括所述E3区域内的至少1、2或3个开放阅读框架的缺失，使得E3区域的功能得以保留。
6.权利要求1所述的疫苗，其中所述部分E3缺失包括至少1、2或3个具有未知功能的开放阅读框架的缺失。
7.权利要求1所述的疫苗，其中所述部分E3缺失包括相应于Ad5的ADP区域的区域的缺失。
8.权利要求1所述的疫苗，其中所述腺病毒来源于Ad4并且所述部分E3缺失包括E324.8k、E36.3k和E329.7k的缺失。
9.权利要求1所述的疫苗，其中所述腺病毒载体源于Ad7并且所述部分E3缺失包括E320.1k、E320.6k和E37.7k的缺失。
10.权利要求1所述的疫苗，其中所述第一异源序列的表达处于内源主要晚期启动子和三联前导序列的控制之下。
11.权利要求1所述的疫苗，其中所述第一异源序列与天然E324.8k剪接受体有效连接。
12.权利要求1所述的疫苗，其中所述第一异源序列进一步与腺病毒多核苷酸信号序列有效连接。
13.权利要求12所述的疫苗，其中所述腺病毒多核苷酸信号序列是Ad5E3多核苷酸信号序列。
14.权利要求1所述的疫苗，其中所述第一异源序列编码感染性病原体的免疫原性蛋白质。
15.权利要求14所述的疫苗，其中所述感染性病原体选自病毒、细菌、原生生物和真菌。
16.权利要求15所述的疫苗，其中所述感染性病原体是流感病毒、人免疫缺陷病毒或人乳头瘤病毒。
17.权利要求15所述的疫苗，其中所述感染性病原体是芽孢杆菌属、志贺氏菌属、分枝杆菌属或疟原虫属。
18.权利要求1所述的疫苗，其中所述异源序列编码流感病毒血凝素、流感病毒神经氨酸酶、流感病毒的M2蛋白、M2e肽的多聚体、HTL表位的多聚体或CTL表位的多聚体。
19.权利要求1所述的疫苗，其中所述第一异源序列包含编码感染性病原体的免疫原性蛋白质的第一ORF和编码来自所述感染性病原体的表位的多聚体的第二ORF。
20.权利要求1所述的疫苗，其被配制用于口服、鼻内、舌下、膀胱内、直肠或阴道内施用。
21.权利要求1所述的疫苗，其还包含可接受的载体。
22.权利要求1所述的疫苗的剂量单位，其中单次剂量包含103至1013个腺病毒颗粒。
23.权利要求1的疫苗在制备用于在受试者中诱导对感染性病原体的免疫反应的药物中的用途。
24.权利要求23所述的用途，其中所述药物包含一个或多个剂量的所述疫苗。
25.权利要求23所述的用途，其中所述感染性病原体是流感病毒、HIV、HPV、芽孢杆菌属、疟原虫属、分枝杆菌属或志贺氏菌属。
26.权利要求23所述的用途，其中所述受试者具有由所述感染性病原体诱发的感染。
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