KR20180079448A - 조류 난에서의 바이러스 생산 - Google Patents

조류 난에서의 바이러스 생산 Download PDF

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앤드류 빈
존 윌리엄 로웬탈
루이스 페르난도 말라버-올테가
랄프 에이 트립
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커먼웰쓰 사이언티픽 앤드 인더스트리얼 리서치 오가니제이션
유니버시티 오브 조지아 리서치 파운데이션, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 바이러스를 증가된 수준으로 생산하는 데 사용될 수 있는 변형된 조류 난에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 조류 난에서 바이러스를 생산하는 방법뿐만 아니라, 백신 조성물을 제조하기 위한, 수득된 바이러스의 용도에 관한 것이다.

Description

조류 난에서의 바이러스 생산
본 발명의 기술분야
본 발명은 바이러스를 증가된 수준으로 생산하는 데 사용될 수 있는 변형된 조류 난에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 조류 난(avian egg)에서 바이러스를 생산하는 방법뿐만 아니라, 백신 조성물을 제조하기 위한 수득된 바이러스의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 배경
바이러스 감염은 인간 및 경제적으로 중요한 가축, 둘 모두에서 유해한 경제적 및 사회적 결과를 초래하면서, 중요한 건강상의 문제로 남아 있다.
동물을 바이러스성 질환으로부터 보호하는 주된 접근법 중 하나는 백신접종이다. 충분한 양의 바이러스의 이용가능성, 및 바이러스 생산과 연관된 비용이 백신 제조에 있어 제한 인자가 된다. 현행 바이러스 생산 방법은 세포 배양물 및 난내 생산 시스템을 포함한다. 그러나, 모든 바이러스가 세포 배양물에서 및/또는 난내 생산 시스템에서 잘 복제되는 것은 아니다. 예를 들어, 모든 인플루엔자 바이러스가 난에서 잘 복제되는 것은 아니다(문헌 [Horimoto et al., 2006]; [Horimoto et al., 2007]).
따라서, 개선된 바이러스 생산 방법 개발이 요구되고 있다. 본 발명자들이 난내에서 바이러스 생산을 증가시키는 방법을 개발하였다는 것은 상기를 배경으로 한 것이다.
본 발명의 요약
본 발명자들은 조류 난에서 항바이러스 유전자의 발현, 및/또는 항바이러스 단백질 활성 수준을 감소시키는 것이 바이러스 생산을 증가시키는 데 사용될 수 있다는 것을 입증하였다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은
1) 유전자 변형되지 않은 동종동계 난(isogenic egg)과 비교할 때, 난에서 항바이러스 유전자의 발현을 감소시키는 유전자 변형, 및/또는
2) 외인성 화합물로 처리되지 않은 동종동계 난과 비교할 때, 난에서 항바이러스 유전자의 발현을 감소시키고/거나, 항바이러스 단백질 활성 수준을 감소시키는 외인성 화합물을 포함하는 조류 난으로서,
여기서, 난은 동종동계 난에서보다 더 많은 바이러스를 생산할 수 있는 것인 조류 난을 제공한다.
한 실시양태에서, 항바이러스 유전자 및/또는 단백질은 타입 I, 타입 II 또는 타입 III 인터페론 경로에 있는 것이다. 한 실시양태에서, 항바이러스 유전자 및/또는 단백질은 타입 I 인터페론 경로에 있는 것이다.
한 실시양태에서, 항바이러스 유전자 및/또는 단백질은 IFNAR1, IL-6, CNOT4, MDA5, IFNα, IFNβ, IFNγ, IFNλ, IFNAR2, UBE1DC1, GNAZ, CDX2, LOC100859339, IL28RA, ZFPM2, TRIM50, DNASEIL2, PHF21A, GAPDH, BACE2, HSBP1, PCGF5, IL-1RA, DDI2, CAPN13, UBA5, NPR2, IFIH1, LAMP1, EFR3A, ARRDC3, ABI1, SCAF4, GADL1, ZKSCAN7, PLVAP, RPUSD1, CYYR1, UPF3A, ASAP1, NXF1, TOP1MT, RALGAPB, SUCLA2, GORASP2, NSUN6, CELF1, ANGPTL7, SLC26A6, WBSCR27, SIL1, HTT, MYOC, TM9SF2,CEP250, FAM188A, BCAR3, GOLPH3L, HN1, ADCY7, AKAP10, ALX1, CBLN4, CRK, CXORF56, DDX10, EIF2S3, ESF1, GBF1, GCOM1, GTPBP4, HOXB9, IFT43, IMP4, ISY1, KIAA0586, KPNA3, LRRIQ1, LUC7L, MECR, MRPL12, POLR3E, PWP2, RPL7A, SERPINH1, SLC47A2, SMYD2, STAB1, TTK, WNT3, IFNGR1, IFNGR2, IL-10R2, IFNκ, IFNΩ, IL-1RB 및 XPO1 중 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 것으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 항바이러스 유전자 및/또는 단백질은 IFNAR1, IL-6, CNOT4, MDA5, IFNα, IFNβ, IFNγ, IFNλ, BACE2, UBA5, ZFPM2, TRIM50, DDI2, NPR2, CAPN13, DNASE1L2, PHF21A, PCGF5, IFIH1, IL-1RA, LAMP1, EFR3A, ABI1, GADL1, PLVAP, CYYR1, ASAP1, NXF1, NSUN6, ANGPTL7, SIL1, BCAR3, GOLPH3L, HN1, ADCY7, CBLN4, CXORF56, DDX10, EIF2S3, ESF1, GCOM1, GTPBP4, IFT43, KPNA3, LRRIQ1, LUC7L, MRPL12, POLR3E, PWP2, RPL7A, SMYD2, XPO1 및 ZKSCAN7 중 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 것으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 항바이러스 유전자 및/또는 단백질은 IFNAR1, IL-6, CNOT4, MDA5, IFNα, IFNβ, IFNγ, IFNλ 및 IL-1RA 중 1, 2, 3, 4개, 또는 그 모두로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 항바이러스 유전자 및/또는 단백질은 IFNAR1이다. 한 실시양태에서, 항바이러스 유전자 및/또는 단백질은 IL-6이다. 한 실시양태에서, 항바이러스 유전자 및/또는 단백질은 MDA5이다. 한 실시양태에서, 항바이러스 유전자 및/또는 단백질은 CNOT4이다. 또 다른 실시양태에서, 항바이러스 유전자 및/또는 단백질은 IFNα이다. 또 다른 실시양태에서, 항바이러스 유전자 및/또는 단백질은 IFNβ이다. 또 다른 실시양태에서, 항바이러스 유전자 및/또는 단백질은 IFNγ이다. 또 다른 실시양태에서, 항바이러스 유전자 및/또는 단백질은 IFNλ이다. 또 다른 실시양태에서, 항바이러스 유전자 및/또는 단백질은 IL-1RA이다.
한 실시양태에서, 유전자 변형은 게놈에 있다. 한 실시양태에서, 게놈은 동형접합성인 것이다. 한 실시양태에서, 유전자 변형은 난에 함유된 배아의 미토콘드리아 DNA(mtDNA: mitochondrial DNA) 또는 핵 DNA에 있다.
유전자 변형은 조류 난에서 항바이러스 유전자의 발현, 및/또는 항바이러스 단백질 활성 수준을 감소시키는 원하는 효과를 달성하는, 자연적으로 발생된 조류 난 또는 이의 모체에 대한 임의 변이일 수 있다.
한 실시양태에서, 유전자 변형은 항바이러스 유전자 또는 이의 조절 영역의 결실, 치환, 또는 그 내로의 삽입이다. 예를 들어, 유전자 변형은 프로그램가능한 뉴클레아제에 의해 도입될 수 있었다. 또 다른 예에서, 유전자 변형은 예컨대, 항바이러스 유전자의 일부 또는 그 모두를 결실시키거나, 외인성 폴리뉴클레오티드를 항바이러스 유전자 내로 삽입하거나, 또는 항바이러스 유전자 중 일부(예컨대, 엑손)의 배향을 재배열시킴으로써 수행되는 것과 같이, 상동성 재조합에 의해 도입될 수 있었고, 이로써, 항바이러스 활성을 가진 단백질은 더 이상 코딩되지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 유전자 변형을 비상동성 말단 연결에 의해 도입되었다. 추가의 다른 실시양태에서, 유전자 변형은 화학적 돌연변이 유발원에 의해 도입되었다.
한 실시양태에서, 유전자 변형은 점 돌연변이이다.
한 실시양태에서, 유전자 변형은 조류 난에서 항바이러스 유전자의 발현, 및/또는 항바이러스 단백질 활성 수준을 감소시키는 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 트랜스진에 의해 도입되었다. 폴리뉴클레오티드의 예로는 안티센스 폴리뉴클레오티드, 센스 폴리뉴클레오티드, 마이크로RNA, 항바이러스 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 트랜스포존, 압타머, 이중 가닥 RNA 분자 또는 이로부터 유도된 프로세싱된 RNA 분자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
한 실시양태에서, 트랜스진은 조류 난에서 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시하는 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다.
한 실시양태에서, 외인성 화합물은 소형 탄소계 분자, 단백질 결합제, 프로그램가능한 뉴클레아제, 폴리뉴클레오티드, 또는 이들 중 2 이상의 조합이다.
한 실시양태에서, 단백질 결합제 또는 폴리뉴클레오티드는 난에 투여된 트랜스진으로부터 발현된다.
한 실시양태에서, 트랜스진은 난에서 배양되는 바이러스에 존재한다.
한 실시양태에서, 단백질 결합제는 항체이다.
한 실시양태에서, 바이러스는 동물 바이러스이다. 한 실시양태에서, 동물은 인간, 닭, 돼지, 어류, 양, 또는 소이다. 한 실시양태에서, 동물은 인간이다.
한 실시양태에서, 바이러스는 오르토믹소비리다에(Orthomyxoviridae) 과, 헤르페스비리다에(Herpesviridae) 과, 파라믹소비리다에(Paramyxoviridae) 과, 플라비비리다에(Flaviviridae) 과 및 코로나비리다에(Coronaviridae) 과로부터 선택되는 과의 것이다.
한 실시양태에서, 바이러스는 인플루엔자 바이러스, 개 홍역 바이러스, 홍역 바이러스, 레오바이러스, 동부형 말 뇌염 바이러스, 개 파라인플루엔자 바이러스, 광견병 바이러스, 계두 바이러스, 서부형 말 뇌염 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 말 뇌척수염, 풍진 바이러스, 산란 저하 증후군 바이러스, 조류 항암(oncolytic) 바이러스, 조류 전염성 후두기관염 헤르페스바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 소 파라인플루엔자 바이러스, 두창 바이러스, 전염성 F 낭병(Infectious bursal disease), 소 이바라기 바이러스, 재조합 폭스바이러스, 조류 아데노바이러스 I형, II형 또는 III형, 돼지 일본 뇌염 바이러스, 황열 바이러스, 헤르페스 바이러스, 신드비스 바이러스, 감염성 기관지염 바이러스, 셈리키 삼림 바이러스, 뇌척수염 바이러스, 베네수엘라 EEV 바이러스, 닭 빈혈 바이러스, 마렉병 바이러스, 파르보바이러스, 구제역 바이러스, 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스, 고전 돼지 열병 바이러스, 청설병(Bluetongue) 바이러스, 카바네(Kabane) 바이러스, 전염성 연어 빈혈 바이러스, 전염성 조혈 괴사 바이러스, 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 및 전염성 췌장 괴사 바이러스로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 바이러스는 인플루엔자 바이러스이다.
한 실시양태에서, 조류 난은 계란이다. 한 실시양태에서, 조류 난은 오리알이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 바이러스를 포함하는 본 발명의 조류 난을 제공한다. 한 실시양태에서, 바이러스는 인플루엔자 바이러스이다.
추가 측면에서, 본 발명은
1) 유전자 변형을 포함하는 본 발명의 조류 난을 수득하는 단계,
2) 난에 바이러스를 접종하는 단계,
3) 미리 결정된 기간 동안 난을 인큐베이션하여 바이러스를 복제하는 단계를 포함하는, 바이러스를 복제하는 방법을 제공한다.
대안적 측면에서, 본 발명은
1) 조류 난을 수득하는 단계,
2) 화합물로 처리되지 않은 동종동계 난과 비교할 때, 난에서 항바이러스 유전자의 발현을 감소시키고/거나, 항바이러스 단백질 활성 수준을 감소시키는 화합물을 투여하는 단계,
3) 난에 바이러스를 접종하는 단계, 및
4) 미리 결정된 기간 동안 난을 인큐베이션하여 바이러스를 복제하는 단계를 포함하는, 바이러스를 복제하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 난으로부터 복제된 바이러스 또는 이의 입자를 수확하는 단계를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 수확 단계는 난으로부터 요막액을 수득하는 것을 포함한다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 본 발명의 난에서 바이러스를 복제하는 방법은 당업계의 표준 기술을 사용하여 수행될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 조류 난을 사용하고/거나, 본 발명의 방법을 이용하여 생산된 바이러스를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
1) 본 발명의 방법을 이용하여 바이러스를 복제하는 단계,
2) 난으로부터 복제된 바이러스 또는 이의 입자를 수확하는 단계, 및
3) 수확된 바이러스로부터 백신 조성물을 조제하는 단계를 포함하는, 백신 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 단계 2) 또는 단계 3)은 바이러스를 불활성화시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 바이러스를 불활성화시키는 것 UV, 가열 또는 화학적 불활성화를 포함한다.
한 실시양태에서, 단계 2) 또는 단계 3)은 바이러스를 파괴시켜 분할 바이러스 입자 또는 서브유니트 바이러스 입자를 생산하는 것을 포함한다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 본 발명의 난에서 백신 조성물을 제조하는 방법은 당업계의 표준 기술을 사용하여 수행될 수 있다.
한 실시양태에서, 복제된 바이러스 또는 이의 입자를 수확하는 단계는 하기 단계: 1) 정화, 2) 농축, 3) 불활성화, 4) 뉴클레아제 처리, 5) 분리/정제, 6) 연마; 및/또는 7) 멸균 여과 중 하나 이상의 것을 포함한다.
본 발명의 방법을 이용하여 제조된 백신 조성물 또한 제공한다.
한 실시양태에서, 백신 조성물은 약독화된 백신이다. 한 실시양태에서, 백신 조성물은 불활성화된 백신 조성물이다. 한 실시양태에서, 백신 조성물은 인플루엔자 백신 조성물이다.
추가 측면에서, 본 발명은 유전자 변형을 포함하는 트랜스제닉 조류(transgenic avian)로서, 여기서, 유전자 변형은 유전자 변형되지 않은 동종동계 조류에 의해 생산된 난과 비교할 때, 상기 트랜스제닉 조류에 의해 생산된 난에서 항바이러스 유전자의 발현을 감소시키는 것인, 트랜스제닉 조류를 제공한다.
한 실시양태에서, 조류는 닭이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
1) 유전자 변형을 조류 세포 내로 도입시키는 단계,
2) 세포로부터 암컷 조류를 생산하는 단계,
3) 암컷 조류로부터 하나 이상의 난을 수득하고, 유전자 변형되지 않은 동종동계 난보다 더 많은 바이러스를 생산할 수 있는 능력에 대하여 난(들)을 스크리닝하는 단계,
4) 유전자 변형되지 않은 동종동계 난보다 더 많은 바이러스를 생산하는 유전자 변형을 지닌 난을 생산하는 암컷 조류를 선택하는 단계, 및
5) 임의적으로, 암컷 조류를 사용하여 더 많은 조류를 육종하는 단계를 포함하는, 본 발명의 조류를 생산하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 유전자 변형은 세포의 게놈에 있다.
한 실시양태에서, 유전자 변형은 프로그램가능한 뉴클레아제에 의해 도입된다.
추가의 실시양태에서, 조류는 닭이다.
본원의 임의의 실시양태는 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 임의의 다른 실시양태에 준용하여 적용된다는 것을 이해하여야 한다. 예를 들어, 당업자가 이해하는 바와 같이, 본 발명의 조류 난에 대하여 상기에 개요된 프로그램가능한 뉴클레아제의 예는 본 발명의 방법에도 동등하게 적용된다.
본 발명은, 단지 예시 목적으로 의도되는 것인 본원에 기술된 구체적인 실시양태에 의해 범주가 제한되지 않아야 한다. 본원에 기술된 바와 같이, 기능적으로 등가인 생성물, 조성물 및 방법은 명백히 본 발명의 범주 내에 있다.
본 명세서 전역에 걸쳐, 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 또는 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단일 단계, 물질 조성물, 단계 군 또는 물질 조성물 군에 관한 언급은 하나의, 및 복수 개의(즉, 하나 이상의) 상기 단계, 물질 조성물, 단계 군 또는 물질 조성물 군을 포함하는 것으로 이해하여야 한다.
이하, 본 발명은 하기 비제한적인 실시예에 의해 및 첨부된 도면을 참조로 하여 기술된다.
첨부된 도면에 관한 간단한 설명
도 1. 바이러스 중화 검정법에서의 재조합 닭( rch : recombinant chicken) IFNα, IFNβ , IFNγ 및 IFNλ의 항바이러스 활성. 세포 생존율 증가는 OD 증가와 같다. 흡광도 값은 2회의 독립 실험으로부터의 이중 값의 평균 ± SE이다. 세포 단독 및 세포 + 바이러스 대조군은 24 웰로부터의 평균으로서 제시되어 있다.
도 2. a. 간접적 ELISA 분석은 정제된 항IFN ( IFNα , IFNβ , IFNγ 및 IFNλ ) 혈청이 상동성 단백질을 인식한다는 것을 보여준다. 그래프는 황산암모늄 침전된 다중클론 항chIFN 항혈청이 ELISA에서 상동성 단백질을 검출한다는 것을 보여주는 것이다. OD는 항체 수준의 척도이다. 제시된 흡광도 값은 2회의 독립 실험으로부터의 이중 값의 평균 ± SE이다. b. 항chIFN -α 항체는 난내에서 바이러스 역가를 증가시키는 것으로 보이지 않는다. 인플루엔자 백신 바이러스(PR8 또는 NIBRG14)와 함께 공동 접종된 항chIFN-α 항체는 난내에서 적혈구 응집 반응(HA: haemagglutination) 검정법에 의해 측정된 적혈구 응집 반응(HA) 역가를 증강시키지 않는다. 막대 그래프는 4회 실험의 평균 ± SE를 나타낸다. c. 항chIFN -β 항체는 난내에서 바이러스 역가를 증가시키는 것으로 보이지 않는다. 정제된 항chIFN-β 항체 및 인플루엔자 백신 바이러스(PR8 또는 NIBRG14)의 공동 투여는 HA 검정법에 의해 측정된 난내 바이러스 HA 역가에 영향을 주지 않는다. 막대 그래프는 최대 3회 실험의 평균 ± SE를 나타낸다.
도 3. a. 항chIFN -λ 항체는 난내에서 바이러스 역가를 증가시킨다. 정제된 항chIFN-λ 항체 및 인플루엔자 백신 바이러스(PR8 또는 NIBRG14) 접종은 HA 검정법에 의해 측정된 난내 HA 역가를 증가시킨다. 막대 그래프는 최대 7회 실험의 평균 ± SE를 나타낸다. 통계학적 유의도는 별표 1개(*)는 p<0.05, 별표 2개(**)는 p<0.005 및 별표 3개(***)는 p=0.0001을 나타내는 바와 같이 제시된다. b. 항 chIFN-γ 항체는 난내에서 바이러스 역가를 증가시킨다. 항chIFN-γ 항체 및 인플루엔자 백신 바이러스(PR8 또는 NIBRG14)의 공동 투여는 HA 검정법에 의해 측정된 난내 바이러스 HA 역가를 증가시킨다. 막대 그래프는 2회 실험의 평균 ± SE를 나타낸다. 통계학적 유의도는 별표 1개(*) p<0.05인 것으로 제시된다. c. 항chIL -6 항체는 난내에서 바이러스 역가를 증가시킨다. 정제된 항chIL-6 항체 및 인플루엔자 백신 바이러스(PR8 또는 NIBRG14), 둘 모두를 주사한 효과는 난내에서 HA 검정법에 의해 측정된 HA 바이러스 역가를 증가시킨다. 막대 그래프는 최대 5회 실험의 평균 ± SE를 나타낸다. 통계학적 유의도는 별표 1개(*) p<0.05, 별표 2개(**) p<0.005인 것으로 제시된다.
도 4. 조류 인플루엔자의 백신 제조를 위한 항바이러스 유전자의 스크리닝 및 확인. a. 음성 대조군 siRNA(siNT1)로, 또는 21개의 후보 숙주 유전자를 표적화하는 siRNA로 형질감염된 DF-1 세포의 생존율. 생존율을 형질감염 후 72 h째, 바이러스 감염 시점에 측정하였다. b. 무한증식 닭 섬유아세포 세포주에서, DF-1 중 대조군 세포(siNT1)에서, 또는 21개의 숙주 유전자의 발현을 침묵화시키는 siRNA로 형질감염된 세포에서 성장된 인플루엔자 A/WSN의 역가. siRNA를 사용한 넉 다운(KD: knock down) 이후, TCDI50으로서 측정된 바이러스 역가의 유의적인 증가가 관찰되었고, 여기서, IFNRA1이 바이러스 역가의 가장 높은 증가를 보인다. c. DF1 세포 상에서의 바이러스 입자의 면역 염색은 siRNA에 의한 IFNAR1 발현 억제 이후, 바이러스 성장이 유의적으로 증가하였다는 것을 보여주는 것이다.
도 5. 숙주의 유전자 발현의 siRNA 하향 조절이 시험관내 바이러스 성장을 증가시킨다. DF-1 세포를 음성 대조군 siRNA(siNT1)로, 또는 4개의 풀링된 siRNA 이중체(스마트풀)로서, 또는 개별 siRNA 이중체로서의, CNOT4, IFNAR 또는 MDA5를 표적화하는 siRNA로 형질감염시켰다. siNT1로 형질감염된 세포에서의 mRNA 수준 대비 *p<0.05. 형질감염 후 72 h째에 정량적 실시간 PCR에 의해 택맨(Taqman) 프로브를 사용하여 mRNA 수준을 정량화하였다. 각각의 siRNA 복합체를, 표적 유전자를 KD시킬 수 있는 그의 능력(좌측에 제시), 및 바이러스 역가를 증가시킬 수 있는 그의 능력(우측에 제시)에 대하여 개별적으로 평가하였다. 세포를 48 h 동안 인플루엔자 A/WSN 바이러스(MOI 0.1)로 감염시켰다. 세포 상청액 중의 바이러스 수준을 TCID50 검정법에 의해 정량화하였다. siNT1로 형질감염된 세포에서의 바이러스 수준 대비 *p<0.05.
도 6. 난으로부터의 TCID 50 WSN. a. ABA-21/117Q를 사용하여 전달된 siRNA에 의한 하향 조절 이후의 난으로부터의 TCID 50 WSN. 값은 단일 반복 실험으로서 제시되어 있다. b . ABA-21/117Q를 사용하여 전달된 siRNA에 의한 하향 조절 이후의 난으로부터의 TCID 50 WSN. 값은 평균+2 SD로 제시되어 있다.
도 7. 난으로부터의 TCID 50 WSN. a. ABA-21/117Q를 사용하여 전달된 siRNA에 의한 하향 조절 이후의 난으로부터의 TCID50 PR8 백신 균주. 값은 평균+2 SD로 제시되어 있다. b. TCID50 역가와 IFNAR1의 넉다운의 상관관계. c. ABA-21/117Q를 사용하여 전달된 siRNA에 의한 하향 조절에 의해 얻은 HA 및 TCID50 최대 값, 이는 대조군 대비 3 로그 증가에 상응한다. shIFNAR1는 난에서의 인플루엔자 성장을 증가시킨다. d. 0일째 RCAS-shIFNA1 주사 및 배아발생 10일째 인플루엔자(PR8 균주)로 감염 후 12일째 배아의 심장에서 shIFNAR1의 발현 및 인플루엔자 RNA의 수준을 측정하였다. 실시간 PCR로부터의 원시 CT 값은 shIFNAR1의 발현과 인플루엔자 RNA 수준 사이의 상관관계를 보여준다. shIFNAR1의 발현 및 인플루엔자 RNA가 높을수록 더 낮은 CT 값으로 표시된다(N=6).
도 8. IFNAR1 DF-1 KO 세포주 생성. 형질감염 후, 모체 세포주로부터의 세포는 PCR 스크리닝 동안 대립유전자의 약 30%로 대체 앰플리콘을 제시하였다. a. 서열분석에 의해 결실을 확인하였다. 세포를 분류하여, 대립 유전자(WT: Wild Type)와 비교할 때, 이중 대립유전자성(A136 및 A142), 단일 대립유전자성(A13) 결실을 제시하거나, 또는 어떤 뚜렷한 결실(A143)도 제시하지 않는 단일 클론을 수득하였다. b. IFNAR1A 유전자 발현을 qPCR에 의해 평가하였다. KO 세포주에서 생산된 하우스키핑 WSN 바이러스 입자에 대한 ΔΔct 값의 평균 +/- 2 표준 편차(SD: standard deviation)로 표현된 결과. 상이한 세포주에서 성장된 H1N1 A/WSN/1933으로 MDCK 세포를 감염시킨 후, 전체 바이러스 수율의 지표로서 Pfu 및 TCID50을 확립하였다. c. 0 및 48 h째의 유전자 KO. d . KO 세포주에서 생산된 WSN 바이러스 입자. 상이한 세포주에서 성장된 H1N1 A/WSN/1933으로 MDCK 세포를 감염시킨 후, 전체 바이러스 수율의 지표로서 Pfu 및 TCID50을 확립하였다.
도 9. 헨드라 바이러스에 대한 항바이러스 유전자의 스크리닝 및 확인. 무한증식 인간 세포주 HeLa에서, 대조군 세포(siNT1)에서, 또는 열거된 발현을 침묵화시키는 siRNA로 형질감염된 세포에서의 헨드라 바이러스 복제. siRNA를 사용하였을 때, 바이러스 복제의 유의적인 증가가 관찰되었다. LAMP1이 바이러스 역가의 가장 높은 증가를 보인다.
본 발명의 상세한 설명
일반 기술 및 선택된 정의
달리 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당업계(예컨대, 세포 배양, 분자 유전학, 트랜스제닉 조류, 면역학, 면역조직화학, 정밀 게놈 조작, 단백질 화학, 및 생화학에서)의 숙련가가 보편적으로 이해하는 것과 같은 의미를 가지는 것으로 이해되어야 한다
달리 명시되지 않는 한, 본 발명에서 사용된 세포 배양 및 면역학적 기술은 당업자에게 널리 공지된 표준 방법이다. 상기 기술은 예컨대, 문헌 [J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984)], [J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)], [T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991)], [D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996)], 및 [F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience](1988, 현재까지의 모든 업데이트물 포함)], [Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)], 및 [J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons](현재까지의 모든 업데이트물 포함)와 같은 출처들의 문헌 전역에 걸쳐 기술되고, 설명되어 있다.
"및/또는," 예컨대, "X 및/또는 Y"라는 용어는 "X 및 Y" 또는 "X 또는 Y"를 의미하는 것으로 이해되어야 하고, 둘 모두의 의미 또는 어느 하나의 의미를 뒷받침할 수 있는 명백한 증거를 제공하는 것으로 간주되어야 한다.
본 명세서 전역에 걸쳐, "포함하다(comprise)"라는 단어, 또는 예컨대, "포함하다(comprises)" 또는 "포함하는"이라는 파생어는 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 군을 배제시키는 것이 아니라, 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 군을 포함한다는 것을 암시하는 것으로 이해될 것이다.
본원에서 사용되는 바, "조류"라는 용어는 분류학상 아베스(Aves) 강의 유기체의 임의의 종, 아종 또는 종류, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 예컨대, 닭, 칠면조, 오리, 거위, 메추라기, 꿩, 앵무새, 피리새, 매, 까마귀, 및 타조, 에뮤 및 화식조를 비롯한 주금류와 같은 유기체들을 지칭한다. 상기 용어는 갈루스 갈루스(Gallus gallus)(닭)의 다양한 공지된 계통들, 예를 들어, 흰색 레그혼(White Leghorn), 갈색 레그혼(Brown Leghorn), 줄무늬-락(Barred-Rock), 서섹스(Sussex), 뉴햄프셔(New Hampshire), 로드 아일랜드(Rhode Island), 오스트랄로프(Australorp), 코니쉬(Cornish), 미노르카(Minorca), 암록스(Amrox), 캘리포니아 그레이(California Gray), 이탈리안 파티지-색상(Italian Partidge-coloured)의 계통들 뿐만 아니라, 상업적인 양으로 통상적으로 사육되는 칠면조, 꿩, 메추라기, 오리, 게임 헨(game hen), 호로새, 새끼 비둘기, 타조 및 다른 가금류의 계통들을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "유전자 변형"이라는 용어는 조류 난에 있는 유전 물질에 대한 임의의 인공 변경이다. 변형은 난에, 난의 한쪽 모체 또는 양 모체 모두에, 또는 양 모체 중 한쪽 모체의 선조에 대해 이루어질 수 있다. 한 예에서, 유전자 변형은 프로그램가능한 뉴클레아제에 의해 도입되는, 게놈 중 내인성 유전자에 대한 돌연변이이다. 예를 들어, 돌연변이는 유전자가 더 이상 기능성 단백질을 코딩하지 못하게 하는 프레임시프트 및/또는 결실일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상동성 재조합은 항바이러스 단백질이 생산되지 못하도록 표적 항바이러스 유전자 모두의 일부를 결실시키는 데 사용된다. 대체 실시양태에서, 유전자 변형은 난에서 원하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는, 예를 들어, 핵산 구성물 중의 트랜스진의 삽입이다. 트랜스진은 염색체외에 있을 수 있거나, 또는 난의 게놈 내로 통합될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "외인성 화합물"은 원하는 결과를 얻기 위해 난에 투여되는 임의의 물질, 예컨대, 소형 탄소계 분자, 단백질 또는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "동종동계 난보다 더 많은 바이러스를 생산하는"이라는 용어는 동종동계 난보다 더 많은 바이러스를 배양하는 데 사용될 수 있는 본 발명의 조류 난의 능력을 지칭한다. 한 실시양태에서, 동종동계 난은 본 발명의 조류 난과 동일한 계통의 조류로부터의 것이다. 한 실시양태에서, 동종동계 조류 난은 유전자 변형 및/또는 외인성 화합물의 존재를 제외하면, 본 발명의 난과 유전적으로 동일한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조류는 유전자가 변형되지 않고/거나, 외인성 화합물로 처리되지 않은 동종동계 난과 비교할 때, 적어도 0.5배, 또는 적어도 1배, 또는 적어도 2배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 5배, 또는 적어도 10배, 또는 적어도 15배, 또는 적어도 20배, 또는 적어도 50배, 또는 적어도 100배 더 많은 바이러스를 생산한다. 상기와 같은 바이러스 생산 증가는 통상의 기술을 사용하여 당업자에 의해 쉽게 측정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 난, 및 동종동계 난은 동일한 양의 동일한 바이러스를 접종받을 수 있고, 동일한 조건하에서 동일한 기간 동안 인큐베이션될 수 있고, 각각의 난 중에 존재하는 바이러스 입자의 양은 표준 기술, 예컨대, 실시예에 개요된 기술을 사용하여 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "바이러스 또는 이의 입자"라는 용어는 불활성화될 수 있거나, 또는 불활성화될 수 없는 전체 바이러스, 및 상기 바이러스의 입자를 지칭한다. 바이러스 입자는 분할 바이러스 백신 또는 서브유니트 바이러스 백신 용도로 적합한 임의 크기일 수 있다. 전체 바이러스, 또는 바이러스의 입자는 난의 요막액으로부터 수확될 수 있다. 수확된 전체 바이러스는 분할 바이러스 백신 또는 서브유니트 바이러스 백신용으로 적합한 크기의 입자를 형성하기 위해 백신 조성물 제조 동안 파괴될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "항바이러스 유전자의 발현을 감소시킨다"라는 용어는 동종동계 난에서의 수준(들)과 비교할 때, RNA 전사체의 수준, 및/또는 난에서 RNA 전사체로부터의 번역 수준을 하향 조절할 수 있는 유전자 변형 및/또는 외인성 화합물의 능력을 지칭한다. 한 실시양태에서, 동종동계 난은 본 발명의 조류 난과 동일한 계통의 조류로부터의 것이다. 한 실시양태에서, 동종동계 조류 난은 유전자 변형 및/또는 외인성 화합물의 존재를 제외하면, 본 발명의 난과 유전적으로 동일한 것이다. 한 실시양태에서, 유전자는 항바이러스 단백질을 코딩하고, 따라서, 난에서의 항바이러스 단백질 활성 수준 또한 동종동계 난에서의 수준과 비교할 때, 감소될 것이다. 한 실시양태에서, 유전자 변형 및/또는 외인성 화합물은 유전자가 변형되지 않고/거나, 외인성 화합물로 처리되지 않은 동종동계 난과 비교할 때, 적어도 10%, 또는 적어도 20%, 또는 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100%만큼 난에서의 항바이러스 유전자의 발현을 감소시킨다. 상기 감소는 표준 방법을 이용하여 확인될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "항바이러스 단백질 활성의 수준을 감소시킨다"라는 용어는 동종동계 난에서의 수준과 비교할 때, 난에서의 항바이러스 단백질 활성의 수준을 하향 조절할 수 있는 유전자 변형 및/또는 외인성 화합물의 능력을 지칭한다. 한 실시양태에서, 동종동계 난은 본 발명의 조류 난과 동일한 계통의 조류로부터의 것이다. 한 실시양태에서, 동종동계 조류 난은 유전자 변형 및/또는 외인성 화합물의 존재를 제외하면, 본 발명의 난과 유전적으로 동일한 것이다. 단백질의 활성은 예를 들어, 난에서의 단백질의 양을 감소시킴으로써, 및/또는 단백질의 천연 기능을 수행할 수 있는 그의 능력을 감소시킴으로써(예컨대, 외인성 화합물(예를 들어, 항체)을 단백질의 활성 부위에 결합시킴으로써) 감소될 수 있다. 한 실시양태에서, 유전자 변형 및/또는 외인성 화합물은 유전자가 변형되지 않고/거나, 외인성 화합물로 처리되지 않은 동종동계 난과 비교할 때, 난에서의 항바이러스 단백질 활성의 수준을 적어도 10%, 또는 적어도 20%, 또는 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100%만큼 감소시킨다. 상기 감소는 표준 방법을 이용하여 확인될 수 있다.
본원에서 언급되는 "트랜스진"은 생물공학 분야에서 통상적인 의미를 가지고, 재조합 DNA 또는 RNA 기술에 의해 생산되거나, 또는 변경되고, 조류 난, 또는 난의 모체(들), 또는 이의 선조 내로 도입된 유전자 서열을 포함한다. 트랜스진은 조류 세포로부터 유래된 유전자 서열을 포함할 수 있다. 전형적으로, 트랜스진은 예컨대, 예를 들어, 형질전환과 같은 인간 조작에 의해 조류, 또는 이의 난 내로 도입되었지만, 당업자가 이해하고 있는 바와 같이, 임의의 방법이 사용될 수 있다. 트랜스진은 염색체 내로 도입되는 유전자 서열 뿐만 아니라, 염색체외에 있는 것도 포함한다. 트랜스진은 전형적으로, 조류 난에서 폴리뉴클레오티드를 발현하는 데 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함할 것이다. 트랜스진은 상동성 재조합에 의해 삽입될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "소형 탄소계 분자"라는 용어는 분자량이 2,000 달톤 미만, 바람직하게, 1,500 달톤 미만, 더욱 바람직하게, 1,000 달톤 미만, 더욱더 바람직하게, 750 달톤 미만, 더욱더 바람직하게, 500 달톤 미만인 화학 화합물 또는 분자를 지칭한다.
항바이러스 유전자 및/또는 단백질
본원에서 사용되는 바, "항바이러스 유전자"는, 그의 발현이 임의 수단에 의하여 난에서의 바이러스 생산을 제한하는 것인, 임의의 내인성 조류 유전자이다. 항바이러스 유전자는 항바이러스 단백질을 코딩할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "항바이러스 단백질"은 그의 존재가 난에서의 바이러스 생산을 제한하는 것인, 임의의 내인성 조류 단백질이다.
항바이러스 유전자 및/또는 단백질은 바이러스 감염에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있는 성체 조류의 능력에 관여할 수 있다. 한 실시양태에서, 항바이러스 유전자 및/또는 단백질은 인터페론(IFN) 경로의 일부를 형성한다. 한 실시양태에서, 항바이러스 유전자 및/또는 단백질은 타입 I, 타입 II 또는 타입 III 인터페론 경로에 있다. 한 실시양태에서, 항바이러스 유전자 및/또는 단백질은 타입 I 또는 타입 III 인터페론 경로에 있다. 한 실시양태에서, 항바이러스 유전자 및/또는 단백질은 IFN-α/β 수용체1(IFNAR1) 쇄이다. 또 다른 실시양태에서, 항바이러스 유전자 및/또는 단백질은 IL-6이다.
대체 실시양태에서, 항바이러스 유전자 및/또는 단백질은 바이러스 감염에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있는 성체 조류의 능력에 관여할 수 있거나, 또는 관여하는 것으로 공지되어 있을 수 있다. 상기 유전자/단백질의 앞서 공지된 일부 기능의 예로는 세포 대사, 배아 발생, 세포 신호전달 또는 핵산 합성에 관여하는 것을 포함한다.
대체 실시양태에서, 항바이러스 유전자 및/또는 단백질의 발현을 감소시키는 것이 바이러스로 감염된 조류 난의 세포의 아폽토시스를 감소시킨다.
한 실시양태에서, 항바이러스 유전자 및/또는 단백질은 IFNAR1, IL-6, CNOT4, MDA5, IFNα, IFNβ, IFNγ, IFNλ, IFNAR2, UBE1DC1, GNAZ, CDX2, LOC100859339, IL28RA, ZFPM2, TRIM50, DNASEIL2, PHF21A, GAPDH, BACE2, HSBP1, PCGF5, IL-1RA, DDI2, CAPN13, UBA5, NPR2, IFIH1, LAMP1, EFR3A, ARRDC3, ABI1, SCAF4, GADL1, ZKSCAN7, PLVAP, RPUSD1, CYYR1, UPF3A, ASAP1, NXF1, TOP1MT, RALGAPB, SUCLA2, GORASP2, NSUN6, CELF1, ANGPTL7, SLC26A6, WBSCR27, SIL1, HTT, MYOC, TM9SF2,CEP250, FAM188A, BCAR3, GOLPH3L, HN1, ADCY7, AKAP10, ALX1, CBLN4, CRK, CXORF56, DDX10, EIF2S3, ESF1, GBF1, GCOM1, GTPBP4, HOXB9, IFT43, IMP4, ISY1, KIAA0586, KPNA3, LRRIQ1, LUC7L, MECR, MRPL12, POLR3E, PWP2, RPL7A, SERPINH1, SLC47A2, SMYD2, STAB1, TTK, WNT3, IFNGR1, IFNGR2, IL-10R2, IFNκ, IFNΩ, IL-1RB 및 XPO1, 또는 이의 상응하는 수용체 또는 효능제 중 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 것으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, IFNα는 하기 이소폼: IFNα1, IFNα2, IFNα4, IFNα5, IFNα6, IFNα7, IFNA8, IFNα10, IFNα13, IFNα14, IFNα16, IFNα17 및 IFNα21 중 하나 이상의 것이다. 한 실시양태에서, IFNλ는 하기 이소폼: IFNλ1, IFNλ2, IFNλ3, IFNλ4 중 하나 이상의 것이다.
한 실시양태에서, 항바이러스 유전자 및/또는 단백질은 IFNAR1, IL-6, CNOT4, MDA5, IFNα, IFNβ, IFNγ, IFNλ, BACE2, UBA5, ZFPM2, TRIM50, DDI2, NPR2, CAPN13, DNASE1L2, PHF21A, PCGF5, IFIH1, IL-1RA, LAMP1, EFR3A, ABI1, GADL1, PLVAP, CYYR1, ASAP1, NXF1, NSUN6, ANGPTL7, SIL1, BCAR3, GOLPH3L, HN1, ADCY7, CBLN4, CXORF56, DDX10, EIF2S3, ESF1, GCOM1, GTPBP4, IFT43, KPNA3, LRRIQ1, LUC7L, MRPL12, POLR3E, PWP2, RPL7A, SMYD2, XPO1 및 ZKSCAN7 또는 이의 상응하는 수용체 또는 효능제 중 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 것으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 항바이러스 유전자 및/또는 단백질은 IL-6, CNOT4, MDA5, IFNα, IFNβ, IFNγ, IFNAR2, UBE1DC1, GNAZ, CDX2, LOC100859339, IL28RA, ZFPM2, TRIM50, DNASEIL2, PHF21A, GAPDH, BACE2, HSBP1, PCGF5, IL-1RA, DDI2, CAPN13, UBA5, NPR2, IFIH1, LAMP1, EFR3A, ARRDC3, ABI1, SCAF4, GADL1, ZKSCAN7, PLVAP, RPUSD1, CYYR1, UPF3A, ASAP1, NXF1, TOP1MT, RALGAPB, SUCLA2, GORASP2, NSUN6, CELF1, ANGPTL7, SLC26A6, WBSCR27, SIL1, HTT, MYOC, TM9SF2,CEP250, FAM188A, BCAR3, GOLPH3L, HN1, ADCY7, AKAP10, ALX1, CBLN4, CRK, CXORF56, DDX10, EIF2S3, ESF1, GBF1, GCOM1, GTPBP4, HOXB9, IFT43, IMP4, ISY1, KIAA0586, KPNA3, LRRIQ1, LUC7L, MECR, MRPL12, POLR3E, PWP2, RPL7A, SERPINH1, SLC47A2, SMYD2, STAB1, TTK, WNT3, IFNGR1, IFNGR2, IL-10R2, IFNκ, IFNΩ, IL-1RB 및 XPO1 또는 이의 상응하는 수용체 또는 효능제 중 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 것으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 항바이러스 유전자 및/또는 단백질은 IL-6, CNOT4, MDA5, IFNAR2, UBE1DC1, GNAZ, CDX2, LOC100859339, IL28RA, ZFPM2, TRIM50, DNASEIL2, PHF21A, GAPDH, BACE2, HSBP1, PCGF5, IL-1RA, DDI2, CAPN13, UBA5, NPR2, IFIH1, LAMP1, EFR3A, ARRDC3, ABI1, SCAF4, GADL1, ZKSCAN7, PLVAP, RPUSD1, CYYR1, UPF3A, ASAP1, NXF1, TOP1MT, RALGAPB, SUCLA2, GORASP2, NSUN6, CELF1, ANGPTL7, SLC26A6, WBSCR27, SIL1, HTT, MYOC, TM9SF2,CEP250, FAM188A, BCAR3, GOLPH3L, HN1, ADCY7, AKAP10, ALX1, CBLN4, CRK, CXORF56, DDX10, EIF2S3, ESF1, GBF1, GCOM1, GTPBP4, HOXB9, IFT43, IMP4, ISY1, KIAA0586, KPNA3, LRRIQ1, LUC7L, MECR, MRPL12, POLR3E, PWP2, RPL7A, SERPINH1, SLC47A2, SMYD2, STAB1, TTK, WNT3, IFNGR1, IFNGR2, IL-10R2, IFNκ, IFNΩ, IL-1RB 및 XPO1 또는 이의 상응하는 수용체 또는 효능제 중 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 것으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 항바이러스 유전자 및/또는 단백질은 IFNAR1이다. 한 실시양태에서, 항바이러스 유전자 및/또는 단백질은 IL-6이다. 한 실시양태에서, 항바이러스 유전자 및/또는 단백질은 MDA5이다. 한 실시양태에서, 항바이러스 유전자 및/또는 단백질은 CNOT4이다. 또 다른 실시양태에서, 항바이러스 유전자 및/또는 단백질은 IFNα이다. 또 다른 실시양태에서, 항바이러스 유전자 및/또는 단백질은 IFNβ이다. 또 다른 실시양태에서, 항바이러스 유전자 및/또는 단백질은 IFNγ이다. 또 다른 실시양태에서, 항바이러스 유전자 및/또는 단백질은 IFNλ이다. 또 다른 실시양태에서, 항바이러스 유전자 및/또는 단백질은 IL-1RA이다. 또 다른 실시양태에서, 항바이러스 유전자 및/또는 단백질은 IL-1RB이다.
표적화될 수 있는 항바이러스 유전자 및/또는 단백질에 관한 추가의 상세한 설명은 하기 표 1에 제시되어 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
조류 난에서의 항바이러스 유전자의 발현 및/또는 항바이러스 단백질 활성의 수준 감소
바이러스 생산 증가는 유전적으로 변형된 조류 난, 및/또는 본원에 정의된 바와 같은 외인성 화합물로 처리된 조류 난의 사용을 통해 달성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 조류 난에서의 항바이러스 유전자의 발현은 유전자 변형의 도입에 의해 감소된다. 한 예에서, 유전자 변형은 조류 난 내로 직접 도입된다. 대체 예에서, 유전자 변형은 난의 모체인 모계 및/또는 부계 생식세포 계열 내로 도입된다. 유전자 변형이 난의 모체인 모계 및/또는 부계 생식세포 계열 내로 도입되면, 트랜스제닉 조류가 생산된다. 상기 경우에, 난은 모계 및/또는 부계 모체로부터의 유전자 변형을 물려받게 될 것이다.
일부 실시양태에서, 조류 난에서의 항바이러스 유전자의 발현 및/또는 단백질 활성은 외인성 화합물에 의해 감소된다. 외인성 화합물의 방법의 예로는 소형 탄소계 분자, 단백질 결합제, 프로그램가능한 뉴클레아제, 폴리뉴클레오티드, 또는 이들 중 2 이상의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
유전자 변형
유전자 변형은 조류 난에서 항바이러스 유전자의 발현 및/또는 항바이러스 단백질 활성의 수준이 감소되는 것인 원하는 효과를 달성하는, 자연적으로 발생된 조류 난 또는 이의 모체에 대한 임의의 인공 변이일 수 있다. 세포를 유전적으로 변형시키는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 한 실시양태에서, 유전자 변형은 유전자를 부분적으로 또는 완전히 불활성화시키는, 내인성 유전자의 돌연변이, 예컨대, 점 돌연변이, 삽입, 또는 결실 (또는 이의 하나 이상의 것의 조합)이다. 점 돌연변이는 유전자 또는 코딩된 폴리펩티드의 활성을 감소시키는, 조기 정지 코돈(넌센스 돌연변이), 스플라이스 부위 돌연변이, 결실, 프레임시프트 돌연변이 또는 아미노산 치환 돌연변이일 수 있다.
한 실시양태에서, 유전자 변형은 프로그램가능한 뉴클레아제에 의해 도입된다. 한 실시양태에서, 유전자 변형은 상동성 재조합에 의해 도입된다. 한 실시양태에서, 유전자 변형은 비상동성 말단 연결에 의해 도입된다. 한 실시양태에서, 유전자 변형은 화학적 돌연변이 유발원에 의해 도입된다. 대안적 실시양태에서, 유전자 변형은 외인성 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 트랜스진에 의해 도입된다. 한 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 DNA 분자, RNA 분자 또는 DNA/RNA 하이브리드 분자에 의해 코딩된다. 내인성 유전자의 발현을 감소시키는 외인성 폴리뉴클레오티드의 예는 안티센스 폴리뉴클레오티드, 센스 폴리뉴클레오티드, 마이크로RNA, 내인성 효소에 결합하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 트랜스포존, 압타머, 이중 가닥 RNA 분자 및 그로부터 유도된 프로세싱된 RNA 분자로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 트랜스진은 조류 난에서 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시하는 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다.
프로그램가능한 뉴클레아제
일부 실시양태에서, 유전자 변형되지 않은 동종동계 난과 비교할 때, 난에서 항바이러스 유전자의 발현을 감소시키는 유전자 변형은 프로그램가능한 뉴클레아제를 통해 조류 난, 또는 난의 모체인 모계 및/또는 부계 생식세포 계열 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, 화합물로 처리되지 않은 동종동계 난과 비교할 때, 난에서 항바이러스 유전자의 발현을 감소시키고/거나, 항바이러스 단백질 활성의 수준을 감소시키는 외인성 화합물은 프로그램가능한 뉴클레아제이다.
본원에서 사용되는 바, "프로그램가능한 뉴클레아제"라는 용어는 조류 난의 게놈 중의, 또는 조류 난의 모체인 모계 및/또는 부계 생식세포 계열에서의 미리 결정된 부위를 인식하고, 편집하도록 "표적화된"("프로그램화된") 뉴클레아제에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 프로그램가능한 뉴클레아제는 게놈 중의 미리 결정된 부위에서 부위 특이적 DNA 절단을 유도할 수 있다. 한 실시양태에서, 프로그램가능한 뉴클레아제는 DNA 결합 단백질 도메인, 또는 DNA 결합 단백질 도메인의 조합에 의해 게놈 위치를 인식하도록 프로그램화될 수 있다. 한 실시양태에서, 뉴클레아제는 결실, 치환 또는 삽입을 항바이러스 유전자 또는 이의 조절 영역 내로 도입한다.
한 실시양태에서, 프로그램가능한 뉴클레아제는 DNA 결합 아연 핑거 단백질(ZFP: zinc-finger protein) 도메인의 조합에 의해 게놈 위치를 인식하도록 프로그램화될 수 있다. ZFP는 DNA 서열 중 특이적인 3 bp를 인식하고, ZFP의 조합은 특이적인 특이적인 게놈 위치를 인식하는 데 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 프로그램가능한 뉴클레아제는 전사 활성인자 유사 이펙터(TALE: transcription activator-like effector) DNA 결합 도메인에 의해 게놈 위치를 인식하도록 프로그램화될 수 있다.
대체 실시양태에서, 프로그램가능한 뉴클레아제는 하나 이상의 RNA 서열에 의해 게놈 위치를 인식하도록 프로그램화될 수 있다. 대체 실시양태에서, 프로그램가능한 뉴클레아제는 하나 이상의 DNA 서열에 의해 프로그램화될 수 있다. 대체 실시양태에서, 프로그램가능한 뉴클레아제는 하나 이상의 하이브리드 DNA/RNA 서열에 의해 프로그램화될 수 있다. 대체 실시양태에서, 프로그램가능한 뉴클레아제는 RNA 서열, DNA 서열 및 하이브리드 DNA/RNA 서열 중 하나 이상의 것에 의해 프로그램화될 수 있다.
대체 실시양태에서, 프로그램가능한 뉴클레아제는 다중 침묵화를 위해, 즉, 2, 3, 4, 5개 이상의 항바이러스 유전자가 동시에 표적화될 수 있도록 1개 초과의 "표적화" 또는 "프로그램화 서열"(즉, 2, 3, 4, 5개 이상의 프로그램화 서열)을 이용하여 프로그램가능한 뉴클레아제를 전달하는 데 사용될 수 있다(문헌 [Kim et al., 2014]).
본 개시내용에 따라 사용될 수 있는 프로그램가능한 뉴클레아제로는 박테리아의 일정한 간격으로 주기적으로 분포하는 짧은 회문 구조의 반복부(CRISPR: clustered regularly interspaced short palindromic repeat)-cas(CRISPR 연관) 시스템으로부터 유래된 RNA 가이드된 조작된 뉴클레아제(RGEN: RNA-guided engineered nuclease), 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN: zinc-finger nuclease), 전사 활성인자 유사 뉴클레아제(TALEN: transcription activator-like nuclease), 및 아르고노트를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
(CRISPR)-cas(CRISPR 연관) 시스템은 침입 파지 및 플라스미드에 대한 방어에 관여하는 미생물 뉴클레아제 시스템이다. 미생물 숙주에서의 CRISPR 유전자좌는 CRISPR 연관(Cas) 유전자의 조합 뿐만 아니라, CRISPR 매개 핵산 절단의 특이성을 프로그램화할 수 있는 비코딩 RNA 요소를 함유한다. II RGEN 부류를 가지는 매우 광범위한 박테리아 숙주에 걸쳐 3가지 유형(I-III)의 CRISPR 시스템이 확인되었다(문헌 [Makarova et al., 2015]). 각 CRISPR 유전자좌의 한 가지 중요한 특징은 비반복 서열(스페이서)의 짧은 스트레치가 그 사이의 공간을 차지하고 있는 반복 서열(직접 반복부)로 이루어진 어레이가 존재한다는 것이다. 비코딩 CRISPR 어레이는 전사되고, 직접 반복부 내에서, Cas 뉴클레아제를 표적 부위로 유도하는 개별 스페이서 서열(프로토스페이서)을 함유하는 짧은 crRNA로 절단된다.
타입 II CRISPR은 4개의 순차적 단계로 표적화된 DNA 이중 가닥 파단을 수행한다(예를 들어, 문헌 [Cong et al., 2013] 참조). 첫 번째로, 2개의 비코딩 RNA, 프리crRNA 어레이, 및 tracrRNA가 CRISPR 유전자좌로부터 전사된다. 두 번째로, tracrRNA가 프리crRNA의 반복 영역에 하이브리드화하고, 프리crRNA를, 개별 스페이서 서열을 함유하는 성숙한 crRNA로 프로세싱하는 것을 매개한다. 세 번째로, 성숙한 crRNA:tracrRNA 복합체는, 표적 인식을 위한 추가 요건인 프로토스페이서 인접 모티프(PAM: protospacer adjacent motif) 옆에 위치하는 표적 DNA 상의 프로토스페이서와 crRNA 상의 스페이서 사이의 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 형성을 통해 Cas9를 표적 DNA로 유도한다. 마지막으로, Cas9는 표적 DNA의 절단을 매개하여 프로토스페이서 내에 이중 가닥 파단을 생성한다. CRISPR 시스템은 또한 게놈에서 단일 가닥 파단을 생성하는 데에도 사용될 수 있다. 따라서, CRISPR 시스템은 RNA 가이드된(또는 RNA 프로그램화된) 부위 특이적 게놈 편집을 위해 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 뉴클레아제는 RNA 가이드된 조작된 뉴클레아제(RGEN)이다. 한 실시양태에서, RGEN은 고세균 게놈으로부터의 것이거나, 또는 이의 재조합 버전이다. 한 실시양태에서, RGEN은 박테리아 게놈으로부터의 것이거나, 또는 이의 재조합 버전이다. 한 실시양태에서, RGEN은 타입 I (CRISPR)-cas(CRISPR 연관) 시스템으로부터의 것이다. 한 실시양태에서, RGEN은 타입 II (CRISPR)-cas(CRISPR 연관) 시스템으로부터의 것이다. 한 실시양태에서, RGEN은 타입 III (CRISPR)-cas(CRISPR 연관) 시스템으로부터의 것이다. 한 실시양태에서, 뉴클레아제는 부류 I RGEN이다. 한 실시양태에서, 뉴클레아제는 부류 II RGEN이다. 한 실시양태에서, RGEN은 다성분 효소이다. 한 실시양태에서, RGEN은 단일 성분 효소이다. 한 실시양태에서, RGEN은 CAS3이다. 한 실시양태에서, RGEN은 CAS10이다. 한 실시양태에서, RGEN은 CAS9이다. 한 실시양태에서, RGEN은 Cpf1이다(문헌 [Zetsche et al., 2015]). 한 실시양태에서, RGEN은 단일 RNA 또는 DNA에 의해 표적화된다. 한 실시양태에서, RGEN은 1개 초과의 RNA 및/또는 DNA에 의해 표적화된다. 한 실시양태에서, CAS9는 스트렙토코쿠스 피오게네스(Steptococcus pyogenes)로부터의 것이다.
한 실시양태에서, 프로그램가능한 뉴클레아제는 전사 활성인자 유사 이펙터(TALE) 뉴클레아제일 수 있다(예컨대, 문헌 [Zhang et al., 2011] 참조). TALE는 새로운 DNA 표적에 결합하도록 쉽게 조작될 수 있는, 식물 병원체 크산토모나스(Xanthomonas)로부터의 전사 인자이다. TALE 또는 이의 말단절단된 버전을 엔도뉴클레아제, 예컨대, Fokl의 촉매 도메인에 연결시켜 TALE 뉴클레아제 또는 TALEN으로 불리는 표적화 엔도뉴클레아제를 생성할 수 있다.
한 실시양태에서, 프로그램가능한 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)이다. 한 실시양태에서, ZFN의 각 단량체는 3개 이상의 아연 핑거 기반 DNA 결합 도메인을 포함하며, 여기서, 각각의 아연 핑거 기반 DNA 결합 도메인은 3 bp 하위부위에 결합한다. 다른 실시양태에서, ZFN은 비의존성 뉴클레아제에 작동가능하게 연결된 아연 핑거 기반 DNA 결합 도메인을 포함하는 키메라 단백질이다. 한 실시양태에서, 비의존성 엔도뉴클레아제는 FokI 엔도뉴클레아제이다. 한 실시양태에서, 뉴클레아제 제제는 제1 ZFN 및 제2 ZFN을 포함하고, 여기서, 제1 ZFN 및 제2 ZFN은 각각 FokI 뉴클레아제에 작동가능하게 연결되어 있고, 여기서, 제1 및 제2 ZFN은 표적 DNA 서열의 각 가닥에서 약 6 bp 내지 약 40 bp 절단 부위 또는 약 5 bp 내지 약 6 bp 절단 부위만큼 이격되어 있는 2개의 인접한 표적 DNA 서열을 인식하고, 여기서, FokI 뉴클레아제는 이량체화되고, 이중 가닥 파단을 형성한다(예를 들어, US20060246567, US20080182332, US20020081614, US20030021776, WO/2002/057308, US20130123484, US20100291048 및 WO 11/017293 참조).
한 실시양태에서, 프로그램가능한 뉴클레아제는 DNA 프로그램화된 아르고노트일 수 있다(WO 14/189628). 원핵성 및 진핵성 아르고노트는 RNA 간섭 경로에 관여하는 효소이다. 아르고노트는 디자인된 핵산-표적화 산과 복합체를 형성함으로써 표적 핵산에 결합하고, 절단할 수 있다. 절단은 비상동성 말단 연결 기구에 의해 수복될 수 있는 이중 가닥 파단을 표적 핵산에 도입할 수 있다. DNA "가이드된" 또는 "프로그램화된" 아르고노트는 DNA 중 미리 결정된 위치에서 이중 가닥 DNA 파단을 도입하도록 유도될 수 있다. 한 실시양태에서, 아르고노트는 나트로노박테리움 그레고리이(Natronobacterium gregoryi)로부터의 것이다.
상동성 재조합
한 실시양태에서, 유전자 변형은 상동성 재조합에 의해 도입된다. 상동성 재조합은, 이중 가닥 파단 수복(DSBR: double-strand break repair) 경로의 사용 및 합성 의존성 가닥 어닐링(SDSA 경로: synthesis-dependent strands annealing pathway)을 포함할 수 있는, 유사하거나, 또는 동일한 두 DNA 분자 사이에서 뉴클레오티드 서열의 교환이 이루어지는 유전자 재조합의 한 유형이다(문헌 [Lodish et al., 2000]; [Weaver, 2002]). 상동성 재조합은 유전자 또는 이의 일부를 결실시키는 데, 또는 항바이러스 유전자 또는 이의 조절 영역 내로의 치환 또는 삽입을 도입하는 데 사용될 수 있다. 추가로, 상동성 재조합은 트랜스진을 삽입하는 데 사용될 수 있다. 상동성 재조합은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 숙주 세포의 DNA 내로 유전자 변형을 도입하는 데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 상동성 재조합은 프로그램가능한 뉴클레아제에 의해 구동될 수 있다.
이중 가닥 RNA
한 실시양태에서, 유전자 변형은 RNAi를 위한 dsRNA 분자를 코딩하는, 바람직하게, 조류의 게놈 내로 통합된 트랜스진이다. 또 다른 실시양태에서, 외인성 화합물은 RNAi를 위한 dsRNA 분자, 또는 dsRNA를 코딩하는 트랜스진(예를 들어, 적합한 발현 벡터, 예컨대, 바이러스로 제공)이다.
"RNA 간섭," "RNAi" 또는 "유전자 침묵화"라는 용어는 일반적으로, dsRNA 분자가 이중 가닥 RNA 분자와 실질적인 또는 완전한 상동성을 공유하는 핵산 서열의 발현을 감소시키는 프로세스를 지칭한다. 그러나, RNA 간섭은 비RNA 이중 가닥 분자를 사용하여 달성될 수 있는 것으로 밝혀졌다(예를 들어, US 20070004667 참조).
본 발명은 본 발명에서의 사용을 위한 용도의 RNA 간섭을 위한 이중 가닥 영역을 포함하고/거나, 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 핵산 분자는 전형적으로 RNA이지만, 이는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 및 비뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
이중 가닥 영역은 적어도 19개의 인접한 뉴클레오티드, 예를 들어, 약 19 내지 23개의 뉴클레오티드이어야 하거나, 또는 예를 들어, 30 또는 50개의 뉴클레오티드, 또는 100개 이상의 뉴클레오티드인 것과 같이, 더욱 장쇄일 수 있다. 전체 유전자 전사체에 상응하는 전장의 서열이 사용될 수 있다. 바람직하게, 그 길이는 약 19 내지 약 23개의 뉴클레오티드 길이이다.
핵산 분자의 이중 가닥 영역의 표적화된 전사체와의 동일성 정도는 적어도 90% 및 더욱 바람직하게, 95-100%이어야 한다. 핵산 분자는 물론 분자를 안정화시키는 작용을 할 수 있는 비관련 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "짧은 간섭 RNA" 또는 "siRNA(short interfering RNA)"라는 용어는 예를 들어, 서열 특이적인 방식으로 RNAi를 매개함으로써 유전자 발현을 억제시키거나, 또는 하향 조절할 수 있는 리보뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자로서, 여기서, 이중 가닥 부분의 길이는 50개 미만의 뉴클레오티드 길이, 바람직하게, 약 19 내지 약 23개의 뉴클레오티드 길이인 것인 핵산 분자를 지칭한다. 예를 들어, siRNA는 자기 상보적 센스 및 안티센스 영역을 포함하는 핵산 분자일 수 있고, 여기서, 안티센스 영역은 표적 핵산 분자 또는 이의 일부 중의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 센스 영역은 표적 핵산 서열 또는 이의 일부에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 가진다. siRNA는, 한 가닥은 센스 가닥이고, 나머지 다른 한 가닥은 안티센스 가닥이며, 여기서, 안티센스 및 센스 가닥은 자기 상보적인 것인, 별개의 두 올리고뉴클레오티드로부터 조립될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, siRNA라는 용어는 서열 특이적 RNAi를 매개할 수 있는 핵산 분자, 예를 들어, 마이크로 RNA(miRNA: micro-RNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA: short hairpin RNA), 짧은 간섭 올리고뉴클레오티드, 짧은 간섭 핵산(siNA: short interfering nucleic acid), 짧은 간섭 변형된 올리고뉴클레오티드, 화학적으로 변형된 siRNA, 전사 후 유전자 침묵화 RNA(ptgsRNA: post-transcriptional gene silencing RNA) 등을 기술하는 데 사용되는 다른 용어와 등가라는 것을 의미한다. 추가로, 본원에서 사용되는 바, RNAi라는 용어는 서열 특이적 RNA 간섭, 예컨대, 예컨대, 전사 후 유전자 침묵화, 번역 억제, 또는 후성유전학상의 것을 기술하는 데 사용되는 다른 용어와 등가라는 것을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 siRNA 분자는 전사 후 수준 또는 전사 전 수준, 둘 모두에서 유전자를 후성유전학적으로 침묵화시키는 데 사용될 수 있다. 비제한적인 예에서, 본 발명의 siRNA 분자에 의한 유전자 발현의 후성유전학적 조절은 유전자 발현을 변경시키기 위한 크로마틴 구조의 siRNA 매개 변형으로부터 이루어질 수 있다.
"shRNA" 또는 "짧은 헤어핀 RNA"란, 약 50개 미만의 뉴클레오티드, 바람직하게, 약 19 내지 약 23개의 뉴클레오티드가 동일한 RNA 분자 상에 위치하는 상보적 서열과 염기쌍을 형성하고, 여기서, 상기 서열 및 상보적 서열은 염기 상보성의 두 영역에 의해 생성된 스템 구조 위의 단일 가닥 루프를 형성하는 적어도 약 4 내지 약 15개의 뉴클레오티드로 이루어진 쌍을 형성하지 않는 영역에 의해 이격되어 있는 것인 RNA 분자를 의미한다. 단일 가닥 루프의 서열의 예로는 5' UUCAAGAGA 3'을 포함한다.
shRNA에는 RNA 분자가 단일 가닥 스페이서 영역에 의해 이격되어 있는 상기 스템-로프 구조를 2개 이상 포함하는 것인 이중 또는 바이핑거 및 다중 핑거 헤어핀 dsRNA도 포함된다.
일단 디자인되고 나면, 이중 가닥 영역을 포함하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어, 시험관내 전사에 의해, 재조합적으로, 또는 합성 수단에 의해 생성될 수 있다.
뉴클레오티드의 변형 또는 유사체는 본 발명의 핵산 분자의 특성을 개선시키기 위해 도입될 수 있다. 개선되는 특성으로는 뉴클레아제 내성 증가 및/또는 세포막을 투과할 수 있는 능력 증가를 포함한다. 따라서, "핵산 분자" 및 "이중 가닥 RNA 분자"라는 용어는 합성적으로 변형된 염기, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 이노신, 크산틴, 히포크산틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸-, 2-프로필- 및 다른 알킬- 아데닌, 5-할로 우라실, 5-할로 시토신, 6-아자 시토신 및 6-아자 티민, 슈도 우라실, 4-티오우라실, 8-할로 아데닌, 8-아미노아데닌, 8-티올 아데닌, 8-티올알킬 아데닌, 8-하이드록실 아데닌 및 다른 8-치환된 아데닌, 8-할로 구아닌, 8-아미노 구아닌, 8-티올 구아닌, 8-티오알킬 구아닌, 8-하이드록실 구아닌 및 다른 치환된 구아닌, 다른 아자 및 데아자 아데닌, 다른 아자 및 데아자 구아닌, 5-트리플루오로메틸 우라실 및 5-트리플루오로 시토신을 포함한다.
소분자
일부 실시양태에서, 외인성 화합물은 소분자이다. 한 실시양태에서, 소분자는 항바이러스 단백질에 결합함으로써 바이러스로 감염된 조류 난에서 그의 정상적인 기능을 수행할 수 있는 단백질의 능력을 감소시킨다.
한 실시양태에서, 투여되는 화합물은, 비활성이거나, 또는 비교적 활성이 부족하지만, 투여 이후에는 화합물로 처리되지 않은 동종동계 난과 비교할 때, 난에서 항바이러스 유전자의 발현 및/또는 단백질 활성을 감소시키는 화합물로 전환되는(예컨대, 대사되는) 전구체 화합물일 수 있다. 상기 실시양태에서, 투여되는 화합물은 프로드럭으로 지칭될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 투여되는 화합물은 화합물로 처리되지 않은 동종동계 난과 비교할 때, 난에서 항바이러스 유전자의 발현 및/또는 단백질 활성을 감소시키는 활성을 가지는 활성 대사산물을 생산하도록 대사될 수 있다. 상기 활성 대사산물의 용도 또한 본 개시내용의 범주 내에 포함된다.
외인성 화합물에 존재하는 치환기에 의존하여, 화합물은 임의적으로 염 형태로 존재할 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 화합물의 염은 카운터 이온이 약학적으로 허용되는 것인 염이다. 적합한 염으로는 유기산 또는 무기산, 또는 유기 염기 또는 무기 염기와 형성된 것을 포함한다. 특히, 산과 형성된 것으로 적합한 염으로는 광산, 강한 유기 카복실산, 예컨대, 비치환된, 또는 예를 들어, 할로겐에 의해 치환된, 1 내지 4개의 탄호 원자로 이루어진 알칸 카복실산, 예컨대, 포화 또는 불포화 디카복실산, 예컨대, 하이드록시카복실산, 예컨대, 아미노산과 형성된 것, 또는 유기 술폰산, 예컨대, 비치환된, 또는 예를 들어, 할로겐에 의해 치환된, (C1-4)-알킬- 또는 아릴-술폰산과 형성된 것을 포함한다. 약학적으로 허용되는 산 부가 염으로는 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 시트르산, 타르타르산, 아세트산, 인산, 락트산, 피루브산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 숙신산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 옥살로아세트산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-술폰산, 벤젠술폰산, 이세티온산, 아스코르브산, 말산, 프탈산, 아스파르트산, 및 글루탐산, 리신, 및 아르기닌과 형성된 것을 포함한다. 약학적으로 허용되는 염기 염으로는 암모늄 염, 알칼리 금속 염, 예를 들어, 칼륨 및 나트륨의 염, 알칼리토 금속 염, 예를 들어, 칼슘 및 마그네슘의 염, 및 유기 염기, 예를 들어 디사이클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 모르폴린, 티오모르폴린, 피페리디엔, 피롤리딘, 모노-, 디- 또는 트리-저급 알킬아민, 예를 들어 에틸-, t-부틸-, 디에틸-, 디이소프로필-, 트리에틸-, 트리부틸- 또는 디메틸-프로필아민, 또는 모노-, 디- 또는 트리하이드록시 저급 알킬아민, 예를 들어, 모노-, 디- 또는 트리에탄올아민과의 염을 포함한다. 상응하는 내부 염 또한 형성될 수 있다.
유기 화학 및/또는 의약 화학 분야의 당업자는 유기 화합물이 그 중에서 반응하거나, 또는 그로부터 침전이 이루어지거나, 또는 결정화되는 것인 용매와 함께 다수의 유기 화합물이 복합체를 형성할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이들 복합체는 "용매화물"로서 공지되어 있다. 예를 들어, 물과의 복합체는 "수화물"로서 공지되어 있다. 용매화물, 예컨대, 수화물은 약물 물질이 용매, 예컨대, 물을 혼입하였을 때, 화학량론적 또는 비화학량론적 양으로 결정 격자로 존재한다. 약물 물질은, 어느 단계에서든 발생할 수 있기 때문에, 용매화물, 예컨대, 수화물의 존재에 대해 통상 스크리닝된다. 따라서, 본 발명에 유용한 화합물은 용매화물, 예컨대, 수화물 형태로 존재할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 화합물의 용해화된 형태는 회합된 용매가 약학적으로 허용되는 것인 용해화된 형태이다. 예를 들어, 수화물은 약학적으로 허용되는 용매화물의 예이다.
본 발명에 유용한 화합물은 비정질 형태 또는 결정질 형태로 존재할 수 있다. 다수의 화합물은 다중 다형체 형태로 존재하고, 상기와 같은 모든 형태의 화합물의 용도가 본 개시내용에 포함된다.
본 개시내용에 유용한 소분자는 표준 방법을 이용하여, 예컨대, 후보 화합물의 라이브러리를 본 발명의 항바이러스 표적 단백질에의 결합에 대하여 스크리닝한 후, 이어서, 결합한 화합물 중 임의의 것이 단백질 활성을 감소시켰는지 여부를 측정함으로써 확인할 수 있다. 예를 들어, 닭 IFN-α/β 수용체 1의 활성을 감소시키는 데 유용한 소분자는 수용체에 결합할 것이고, 세포 신호를 유도할 수 있는 상기 수용체의 리간드(예컨대, IFNα)의 능력을 억제시킬 것이다.
결합제
한 실시양태에서, 외인성 화합물은 항바이러스 단백질에 결합하고, 그의 활성을 감소시키는 단백질이다. 한 실시양태에서, 결합제는 항체 또는 이의 단편이다. 일부 실시양태에서, 항체는 IFNAR1, IL-6, CNOT4, MDA5, IFNα, IFNβ, IFNγ, IFNλ, IFNAR2, UBE1DC1, GNAZ, CDX2, LOC100859339, IL28RA, ZFPM2, TRIM50, DNASEIL2, PHF21A, GAPDH, BACE2, HSBP1, PCGF5, IL-1RA, DDI2, CAPN13, UBA5, NPR2, IFIH1, LAMP1, EFR3A, ARRDC3, ABI1, SCAF4, GADL1, ZKSCAN7, PLVAP, RPUSD1, CYYR1, UPF3A, ASAP1, NXF1, TOP1MT, RALGAPB, SUCLA2, GORASP2, NSUN6, CELF1, ANGPTL7, SLC26A6, WBSCR27, SIL1, HTT, MYOC, TM9SF2,CEP250, FAM188A, BCAR3, GOLPH3L, HN1, ADCY7, AKAP10, ALX1, CBLN4, CRK, CXORF56, DDX10, EIF2S3, ESF1, GBF1, GCOM1, GTPBP4, HOXB9, IFT43, IMP4, ISY1, KIAA0586, KPNA3, LRRIQ1, LUC7L, MECR, MRPL12, POLR3E, PWP2, RPL7A, SERPINH1, SLC47A2, SMYD2, STAB1, TTK, WNT3, IFNGR1, IFNGR2, IL-10R2, IFNκ, IFNΩ, IL-1RB 및 XPO1 유전자 및/또는 단백질 또는 이의 상응하는 수용체 또는 효능제에 대한 것이고/거나, 그의 발현 또는 활성을 감소시킨다.. 일부 실시양태에서, 결합제는 IFNAR1, IL-6, CNOT4, MDA5, IFNα, IFNβ, IFNγ, IFNλ, IFNAR2, UBE1DC1, GNAZ, CDX2, LOC100859339, IL28RA, ZFPM2, TRIM50, DNASEIL2, PHF21A, GAPDH, BACE2, HSBP1, PCGF5, IL-1RA, DDI2, CAPN13, UBA5, NPR2, IFIH1, LAMP1, EFR3A, ARRDC3, ABI1, SCAF4, GADL1, ZKSCAN7, PLVAP, RPUSD1, CYYR1, UPF3A, ASAP1, NXF1, TOP1MT, RALGAPB, SUCLA2, GORASP2, NSUN6, CELF1, ANGPTL7, SLC26A6, WBSCR27, SIL1, HTT, MYOC, TM9SF2,CEP250, FAM188A, BCAR3, GOLPH3L, HN1, ADCY7, AKAP10, ALX1, CBLN4, CRK, CXORF56, DDX10, EIF2S3, ESF1, GBF1, GCOM1, GTPBP4, HOXB9, IFT43, IMP4, ISY1, KIAA0586, KPNA3, LRRIQ1, LUC7L, MECR, MRPL12, POLR3E, PWP2, RPL7A, SERPINH1, SLC47A2, SMYD2, STAB1, TTK, WNT3, IFNGR1, IFNGR2, IL-10R2, IFNκ, IFNΩ, IL-1RB 및 XPO1 또는 이의 수용체 또는 효능제 중 2개 이상의 것의 임의의 조합에 대한 이중특이적 항체이다. 한 실시양태에서, 항체는 조류 난의 세포를 투과하거나, 또는 그에 의해 (수동적으로 또는 능동적으로) 흡수되도록 변형된 항체이다. 한 실시양태에서, 결합제는 B18R이 아니다.
본원에서 사용되는 바, "항체"라는 용어는 다중클론 항체, 단일클론 항체, 이중특이적 항체, 융합 디아바디, 트리아바디, 이종접합체 항체, 무손상 분자 뿐만 아니라, 그의 단편도 포함하는 키메라 항체, 및 다른 항체 유사 분자를 포함한다. 항체는 예를 들어, VH 또는 VL 도메인을 비롯한 도메인 항체, 중쇄 가변 영역의 이량체(VHH, 카멜리드(camelid)에 대해 기술되는 경우), 경쇄 가변 영역의 이량체 (VLL), 직접 또는 링커를 통해 연결될 수 있는 오직 경쇄 가변 영역(VL: light chain variable region) 및 중쇄 가변 영역(VH: heavy chain variable region)만을 함유하는 Fv 단편, 또는 중쇄 가변 영역 및 CH1 도메인을 함유하는 Fd 단편을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 다양한 형태의 변형을 포함한다.
함께 연결되어 단일 쇄 항체를 형성하는 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로 구성된 scFv(문헌 [Bird et al., 1988]; [Huston et al., 1988]) 및 scFv의 올리고머, 예컨대, 디아바디, 및 트리아바디 또한 "항체"라는 용어에 포함된다. 항체의 단편, 예컨대, 가변 영역 및 불변 영역의 일부분을 함유하는 Fab, (Fab')2 및 FabFc2 단편 또한 포함된다. 상보성 결정 영역(CDR: Complementarity determining region) 이식된 항체 단편 및 항체 단편의 올리고머 또한 포함된다. Fv의 중쇄 및 경쇄 성분은 동일한 항체 또는 상이한 항체로부터 유래될 수 있고, 이로써, 키메라 Fv 영역이 생성될 수 있다. 항체는 동물(예를 들어, 마우스, 토끼, 또는 래트) 항체일 수 있거나, 또는 키메라 항체일 수 있다(문헌 [Morrison et al., 1984]). 항체는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다.
본원에 제공된 가이드라인, 및 상기 인용된 참고문헌에 및 문헌 [Harlow & Lane, Antibodies: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)]과 같은 공개문헌에 기술되어 있는 당업자에게 널리 공지된 방법을 이용하여, 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 항체를 쉽게 생산할 수 있다.
항체는 경쇄 및 중쇄가 직접 또는 링커를 통해 연결될 수 있는 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH)를 포함하는 Fv 영역일 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 링커는 경쇄 및 중쇄에 공유적으로 연결되고, 경쇄 및 중쇄가 그러한 형태로 그의 지향 대상이 되는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 입체구조를 달성할 수 있도록 두 쇄 사이에 충분한 간격 및 가요성을 제공하는 분자를 지칭한다. 단백질 링커는 융합 폴리펩티드의 Ig 부분의 고유한 성분으로서 발현될 수 있기 때문에, 특히 바람직하다.
한 실시양태에서, 항체는 세포내 전달 능력을 가진다. 세포내 전달 능력을 가진 항체로는 항체, 예컨대, 카멜리드 및 라마 항체, 상어 항체(IgNAR), scFv 항체, 인트라바디 또는 나노바디, 예를 들어, scFv 인트라바디 및 VHH 인트라바디를 포함한다. 상기 항원 결합제는 문헌 [Harmsen and De Haard (2007)], [Tibary et al. (2007), 및 [Muyldermans et al. (2001)에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 효모 SPLINT 항체 라이브러리는 단백질-단백질 상호작용을 파괴시킬 수 있는 인트라바디에 대해 시험하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, 그의 제조 방법에 관하여 문헌 [Visintin et al. (2008)] 참조). 상기 결합제는 세포 투과 펩티드 서열 또는 핵 국재화 펩티드 서열, 예컨대, 문헌 [Constantini et al. (2008)]에 개시되어 있는 것을 포함할 수 있다. 벡토셀(Vectocell) 또는 디아토(Diato) 펩티드 벡터, 예컨대, 문헌 [De Coupade et al. (2005)] 및 [Meyer-Losic et al. (2006)]에 개시되어 있는 것 또한 생체내 전달에 유용하다.
추가로, 항체는 세포 투과제, 예를 들어, 세포 투과 펩티드에 융합될 수 있다. 세포 투과 펩티드로는 Tat 펩티드, 페너트라틴(Penetratin), 짧은 양친매성 펩티드, 예컨대, Pep 및 MPG 패밀리로부터 유도된 것, 올리고아르기닌 및 올리고리신을 포함한다. 한 예에서, 세포 투과 펩티드 또한 세포내 전달을 개선시키기 위해 지질(C6-C18 지방산) 도메인에 접합된다(문헌 [Koppelhus et al., 2008]). 세포 투과 펩티드의 예는 문헌 [Howl et al. (2007)] 및 [Deshayes et al. (2008)]에서 살펴볼 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 임의적으로 N 말단 또는 C 말단에서 공유 결합(예컨대, 펩티드 결합)을 통해 세포 투과 펩티드 서열에 융합된 항체의 용도를 제공한다.
핵산 구성물
유전자 변형의 조류 내로의 및/또는 조류의 난 내로의 도입은 핵산 구성물의 사용을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 핵산 구성물은 트랜스진을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "핵산 구성물"이란, 예를 들어, 프로그램가능한 뉴클레아제를 "가이드"하거나, 또는 "표적화"하는, 본원에 정의된 바와 같은 이중 가닥 RNA 분자, RNA, DNA 또는 RNA/DNA 하이브리드 서열, 또는 벡터 중 관심 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 임의의 핵산 분자를 지칭한다. 전형적으로, 핵산 구성물은 이중 가닥 DNA 또는 이중 가닥 RNA, 또는 이의 조합일 것이다. 추가로, 핵산 구성물은 전형적으로 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결된 적합한 프로모터를 포함할 것이다. 핵산 구성물은 예를 들어, 이중 가닥 RNA 분자의 제1 단일 가닥을 코딩하는 제1 오픈 리딩 프레임을 포함할 수 있고, 여기서, 상보적인(제2) 가닥은 상이한, 또는 바람직하게, 동일한 핵산 구성물에 의해 제2 오픈 리딩 프레임에 의하여 코딩된다. 핵산 구성물은 선형 단편 또는 고리형 분자일 수 있고, 복제가 가능할 수 있거나, 또는 복제가 불가능할 수 있다. 당업자는 본 발명의 핵산 구성물이 적합한 벡터 내에 포함될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 핵산 구성물의 수혜자 세포로의 형질감염 또는 형질전환을 통해 세포가 핵산 구성물에 의해 코딩되는 RNA 또는 DNA 분자를 발현하게 할 수 있다.
또 다른 예에서, 핵산 구성물은 이중 가닥 영역, 예를 들어, 짧은 헤어핀 RNA를 포함하는, 동일한, 및/또는 하나 이상의(예컨대 1, 2, 3, 4, 5개 이상의) 다중의 상이한 RNA 분자의 다중 카피를 발현시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 핵산 구성물은 문헌 [Schusser et al. (2013)]에 기술되어 있는 바와 같이, 유전자 표적화 카세트일 수 있다.
핵산 구성물은 또한 추가의 유전 요소를 함유할 수 있다. 구성물에 포함될 수 있는 요소 유형은 어느 방식으로든 제한되지 않고, 이는 당업자에 의해 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 구성물은 트랜스진으로서 숙주 세포 내로 삽입된다. 상기 경우에서, RNA 분자를 코딩하는 서열을 트랜스진 삽입 프로세스로부터 보호하기 위해, 및 외부 전사 번역 초과(read through)의 위험을 감소시키기 위해 디자인된 "스터퍼" 단편을 구성물에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 스터퍼 단편은 또한 예컨대, 프로모터와 코딩 서열 및/또는 종결인자 성분 사이의 거리를 증가시키기 위해 구성물에 포함될 수 있다. 스터퍼 단편은 5-5,000개 이상의 뉴클레오티드 길이인 임의 길이일 수 있다. 프로모터 사이에 하나 이상의 스터퍼 단편이 존재할 수 있다. 다중 스터퍼 단편인 경우, 그 길이는 동일하거나, 또는 상이할 수 있다. 스터퍼 DNA 단편은 바람직하게 상이한 서열이다. 바람직하게, 스터퍼 서열은 그가 삽입된 세포, 또는 이의 자손 내에서 발견되는 것과 동일한 서열을 포함한다. 추가 실시양태에서, 핵산 구성물은 이중 가닥 RNA(들)를 코딩하는 오픈 리딩 프레임(들) 측면에 위치하는 스터퍼 영역을 포함한다.
대안적으로, 핵산 구성물은 전위 요소, 예를 들어, 이중 가닥 RNA(들)를 코딩하는 오픈 리딩 프레임(들) 측면에 위치하는 말단 역위 반복 서열을 특징으로 하는 트랜스포존을 포함할 수 있다. 적합한 트랜스포존의 예로는 Tol2, 미니-Tol, 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty), 마리너(Mariner) 및 갈루홉(Galluhop)을 포함한다.
핵산 구성물에 포함시킬 수 있는 추가의 유전 요소의 다른 예로는 리포터 유전자, 예컨대, 형광성 마커 단백질, 예컨대, GFP 또는 RFP; 쉽게 검정되는 효소, 예컨대, 베타-갈락토시다제, 루시페라제, 베타-글루쿠로니다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 또는 분비된 배아 알칼리성 포스파타제; 또는 그에 대해 면역검정법이 쉽게 이용가능한 것인 단백질, 예컨대, 호르몬 또는 사이토카인에 대한 하나 이상의 유전자를 포함한다. 본 발명의 실시양태에서 유용할 수 있는 다른 유전 요소로는 세포 상에서 선택적으로 성장할 수 있는 이점을 부여하는 단백질, 아데노신 데아미나제, 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제, 디하이드로폴레이트 리덕타제, 하이그로마이신-B-포스포트랜스퍼라제, 또는 약물 내성을 코딩하는 것을 포함한다.
핵산 구성물을 조류 내로 형질감염시키고자 하는 경우, 프로모터 및 임의의 추가의 유전 요소는 조류의 게놈에서 자연적으로 발생된 뉴클레오티드 서열로 구성되는 것이 바람직할 수 있다.
일부 경우에서, 핵산 구성물을 벡터 내로 삽입하는 것이 바람직할 수 있다. 벡터는 예컨대, 예를 들어, 박테리오파지, 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스, 레트로바이러스, 폭스바이러스 또는 헤르페스바이러스로부터 유래된 플라스미드, 바이러스 또는 인공 염색체일 수 있다. 상기 벡터는 염색체, 에피좀, 및 바이러스 유래 벡터, 예컨대, 박테리아 플라스미드, 박테리오파지, 및 바이러스로부터 유래된 벡터, 그의 조합으로부터 유래된 벡터, 예컨대, 플라스미드 및 박테리오파지 유전 요소, 코스미드 및 파지미드로부터 유래된 벡터를 포함한다.
한 실시양태에서, 핵산 구성물은 프로모터를 포함한다. 당업자는 프로모터, 예컨대, 구성적 프로모터, 조직 특이적 또는 발생 단계 특이적 프로모터, 또는 유도성 프로모터가 본 발명에서 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 한 실시양태에서, 프로모터는 조류 프로모터이다. 한 실시양태에서, 프로모터는 Pol I, Pol II 또는 Pol II 프로모터이다. 조류 프로모터의 예로는 7sK RNA 폴리머라제 III 프로모터, U6 RNA 폴리머라제 II 프로모터를 포함한다(문헌 [Bannister et al., 2007]; [Massine et al., 2005]).
트랜스제닉 조류
"트랜스제닉 조류"란, 세포 중 하나 이상의 것, 또는 세포 모두가 유전자 변형을 함유하는 것인 조류를 지칭한다. "유전자 변형"의 예로는 유전자 및/또는 이의 조절 영역 중의 결실, 치환 또는 삽입을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. "삽입"은 단일 뉴클레오티드의 삽입, 또는 핵산 구성물("트랜스진")의 삽입을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 유전자 변형은 트랜스제닉 조류의 생식세포 계열에 존재한다. 한 실시양태에서, 프로그램가능한 뉴클레아제를 사용하여 생성된 유전자 변형은 기능성 단백질이 생산되지 못하도록, 또는 코딩된 단백질이 감소된 활성을 가지도록, 내인성 조류 항바이러스 유전자의 코딩 영역을 변경시킨다. 유전자 변형은 염색체외에 있을 수 있거나, 또는 난의 핵 또는 미토콘드리아 게놈 게놈 내로 통합될 수 있다.
생식세포 계열에 유전자 변형을 포함하는 트랜스제닉 조류는 생식세포 계열 유전자 변형을 포함하는 조류 및/또는 난을 생산하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 트랜스제닉 조류는, 유전자 변형되지 않은 동종동계 난과 비교할 때, 난에서 항바이러스 유전자의 발현 및/또는 단백질을 감소시키는 유전자 변형을 포함하는 난을 생산하는 데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 유전자 변형은 동물 및/또는 이의 자손 및/또는 조류에 의해 생산된 난 또는 이의 자손에서 하나 이상의 유전자 및/또는 단백질의 발현을 감소시킨다. 한 실시양태에서, 유전자가 넉아웃된 동물이 생산될 수 있다. 한 실시양태에서, 표적화된 생식세포 계열 유전자 변형은 성 염색체에 존재한다. 대체 실시양태에서, 표적화된 생식세포 계열 유전자 변형은 체세포 염색체에 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 유전자 변형은 적어도 (단세포 단계에서) 수정란의 DNA 내로 도입된다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 본 실시양태에서, 유전자 변형은 모계 또는 부계 유래 DNA, 또는 그 둘 모두의 DNA 내로 도입될 수 있다.
트랜스제닉 동물을 생산하는 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 본 주제에 관하여 유용한 일반 교재는 문헌 [Houdebine, Transgenic animals - Generation and Use (Harwood Academic, 1997)]이다.
이종성 DNA는 예를 들어, 수정란 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 전능 또는 만능 줄기 세포는 미세주입, 인산칼슘 매개 침전, 리포솜 융합, 레트로바이러스 감염 또는 다른 수단에 의해 형질전환될 수 있고, 이어서, 형질전환된 세포는 배아 내로 도입되고, 이어서, 배아는 트랜스제닉 동물로 발생하게 된다. 한 방법에서, 발생 배아를 원하는 DNA를 함유하는 레트로바이러스로 감염시키고, 감염된 배아로부터 트랜스제닉 동물이 생산된다. 그러나, 대안적 방법에서는, 적절한 DNA가 바람직하게는 단세포 단계에서 배아의 전핵 또는 세포질로 공동 주사되고, 배아는 성숙한 트랜스제닉 동물로 발생할 수 있게 된다.
트랜스제닉 조류를 생산하는 데 사용되는 또 다른 방법은 표준 방법에 의해 전핵 단계의 난 내로 핵산을 미세주입하는 것을 포함한다. 이어서, 주사받은 난을 배양한 후, 가임신 수혜자의 난관으로 전달한다.
트랜스제닉 조류는 또한 핵 전달 기술에 의해 생산될 수 있다. 상기 방법을 이용하여, 기증자 동물로부터의 섬유아세포를, 조절 서열의 제어하에 관심 결합 도메인 또는 결합 파트너에 대한 코딩 서열을 도입한 플라스미드로 안정적으로 형질감염시킨다. 이어서, 안정적인 형질감염체를 제핵 난모세포에 융합시키고, 배양하고, 암컷 수혜제로 전달한다.
정자 매개 유전자 전달(SMGT: Sperm mediated gene transfer)은 트랜스제닉 동물을 생성하는 데 사용될 수 있는 또 다른 방법이다. 상기 방법은 (Lavitrano et al.)(1989)에 의해 최초로 기술되었다.
트랜스제닉 동물을 생산하는 또 다른 방법은 링커 기반 정자 매개 유전자 전달 기술(LB-SMGT: linker based sperm-mediated gene transfer technology)이다. 상기 방법은 US 7067308에 기술되어 있다. 간략하면, 새로 수확된 정액을 세척하고, (ATCC 수탁 번호 PTA-6723으로 지정된 하이브리도마에 의해 분비된) 뮤린 단일클론 항체 mAbC 및 구성물 DNA와 함께 인큐베이션한다. 단일클론 항체는 DNA의 정액에의 결합을 지원한다. 이어서, 정자/DNA 복합체를 암컷에게 인공적으로 정액 주입시킨다.
트랜스제닉 조류를 생산하는 데 사용되는 또 다른 방법은 상동성 재조합이다. 상기 방법의 한 예는 문헌 [Schusser et al. (2013)]에 제시되어 있다. (Schusser et al.)는 유전자 특이적 넉아웃된 조류를 생성하기 위해 배양된 원시 생식 세포에서 상동성 재조합에 의해 수행되는 유전자 표적화를 기술하였다. 한 예에서, 트랜스제닉 조류은 문헌 [Schusser et al. (2013)]에 기술되어 있는 유전자 침묵화 카세트를 사용하여 생산된다.
생식세포 계열 트랜스제닉 닭은 새로 낳은 난에서 닭 배반엽의 배하강 내로 복제 결손 레트로바이러스를 주사함으로써 생산될 수 있다(US 5,162,215; [Bosselman et al., 1989]; [Thoraval et al., 1995]). 외래 유전자를 보유하는 레트로바이러스 핵산은 배아 세포의 염색체 내로 무작위로 삽입되고, 이로써, 트랜스제닉 동물이 생성되고, 그 중 일부는 그의 생식세포 계열 중에 트랜스진을 보유한다. 삽입 부위에서의 위치 효과를 극복하기 위해 융합된 유전자 구성물의 5' 또는 3' 영역에 삽입된 절연인자 요소의 용도가 기술된 바 있다(문헌 [Chim et al., 1993]).
생식세포 계열 트랜스제닉 동물을 생성하는 또 다른 방법은 트랜스포존, 예를 들어, Tol2 트랜스포존을 사용하여 본 발명의 핵산 구성물을 동물의 게놈 내로 통합시키는 것이다. 송사리 오리지아스 라티페스(Oryzias latipes)로부터 최초로 단리되었고, 트랜스포존의 hAT 패밀리에 속하는 Tol2 트랜스포존은 문헌 [Koga et al. (1996)] 및 [Kawakami et al. (2000)]에 기술되어 있다. 미니-Tol2는 Tol2의 변종이고, 문헌 [Balciunas et al. (2006)]에 기술되어 있다. Tol2 및 미니-Tol2 트랜스포존은 상기 Tol2 트랜스포사제와 함께 작용할 때, 유기체의 게놈 내로의 트랜스진의 통합을 촉진시킨다. Tol2 트랜스포사제를 별개의 비복제성 플라스미드 상에 전달함으로써, 오직 Tol2 또는 미니-Tol2 트랜스포존 및 트랜스진만을 게놈 내로 통합시고, Tol2 트랜스포사제를 함유하는 플라스미드는 제한된 수의 세포분열 이내에 손실된다. 따라서, 통합된 Tol2 또는 미니-Tol2 트랜스포존은 후속의 전위 이벤트를 수행할 수 있는 능력을 더 이상 가지지 않을 것이다. 추가로, Tol2는 자연적으로 발생된 조류 트랜스포존인 것으로 공지되어 있지 않는 바, 조류 세포, 예를 들어, 닭 세포에는 추가의 전위 이벤트를 유발하는 내인성 트랜스포사제 활성이 존재하지 않는다.
본 발명의 방법에서 임의의 다른 적합한 트랜스포존 시스템이 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 트랜스포존 시스템은 슬리핑 뷰티, 프로그 프린스(Frog Prince) 또는 Mos1 트랜스포존 시스템이거나, 또는 트랜스포존의 tc1/마리너 또는 hAT 패밀리에 속하는 임의의 트랜스포존이 사용될 수 있다.
키메라 조류를 얻기 위해 조류 배아 줄기 세포를 수혜자 배아 내로 주사하는 것이 US 7,145,057에 기술되어 있다. 생성된 키메라를 육종함으로써, 그의 게놈이 외인성 DNA로 구성된 트랜스제닉 조류를 얻게 된다.
조류 원시 생식 세포(PGC: primordial germ cell)의 장기간 배양물로부터 트랜스제닉 닭을 수득하는 방법은 US 20060206952에 기술되어 있다. 공지된 방법에 의해 숙주 조류 배아와 조합하였을 때, 상기 변형된 PGC는 생식세포 계열을 통해 전달되고, 이로써, 트랜스제닉 자손이 생성된다.
본 발명의 핵산 구성물을 세포로 전달하는 데 임의의 적절한 바이러스에 기반한 바이러스 전달 시스템이 사용될 수 있다. 추가로, 하이브리드 바이러스 시스템이 유용할 수 있다. 바이러스 전달 시스템 선택은 다양한 파라미터, 예컨대, 관심 세포, 조직, 또는 기관 내로의 전달 효율, 시스템의 형질도입 효율, 병원성, 면역학적 및 독성 관심사 등에 의존할 것이다. 모든 적용에 적합한 단일 바이러스 시스템이 존재하지 않는다는 것은 명백하다. 본 발명에서 사용하기 위한 바이러스 전달 시스템을 선택할 때, 핵산 구성물 함유 바이러스 입자가 바람직하게는 1) 재현가능하게 및 안정적으로 증식되고; 2) 고역가로 정제될 수 있고; 3) 표적화된 전달(광범위하게 파종되지 않으면서, 관심 세포, 조직, 또는 기관으로 핵산 발현 구성물을 전달)을 매개할 수 있는 시스템을 선택하는 것이 중요하다.
한 실시양태에서, 형질감염 시약은 본원에 기술된 단리된 핵산 분자, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 구성물과 혼합될 수 있고, WO 2013/155572에 기술된 바와 같이, 발생 조류 배아의 혈액 내로 직접 주사될 수 있다. 상기 방법은 본원에서 "직접 주사"로 지칭된다. 상기 방법을 이용하여, 트랜스진을 배아의 원시 생식 세포(PGC) 내로 도입하고, 조류의 게놈 내로 삽입한다. 직접 주사는 추가로 프로그램가능한 뉴클레아제를 투여하는 데에도 사용될 수 있다.
따라서, 폴리뉴클레오티드, 예컨대, 본원에서 정의된 바와 같은 트랜스진 및/또는 핵산 구성물은 적합한 형질감염 시약과 복합체를 형성하거나, 또는 혼합될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "형질감염 시약"이라는 용어는 조류 세포, 예컨대, 원시 생식 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는 진핵 세포 내로의 폴리뉴클레오티드의 흡수를 증강시키기 위해 폴리뉴클레오티드에 첨가되는 조성물을 지칭한다. 진핵 세포를 형질감염시키는 데 적합한 것으로 당업계에 공지된 임의의 형질감염 시약이 사용될 수 있지만, 양이온성 지질을 포함하는 형질감염 시약이 특히 유용하다. 양이온성 지질을 포함하는 것으로서, 상업적으로 이용가능하고, 적합한 형질감염 시약의 비제한적인 예로는 리포펙트아민(Life Technologies) 및 리포펙트아민 2000(Life Technologies)을 포함한다.
제조사의 설명서 또는 공지된 프로토콜에 따라 폴리뉴클레오티드를 형질감염 시약과 "혼합"할 수 있다(또는 "복합체를 형성"시킬 수 있다). 예로서, 플라스미드 DNA를 리포펙트아민 2000 형질감염 시약(Invitrogen, Life Technologies)으로 형질감염시킬 때, DNA를 50 ㎕ 옵티-MEM(Opti-MEM) 배지 중에서 희석시키고, 완만하게 혼합시킬 수 있다. 리포펙트아민 2000 시약을 완만하게 혼합하고, 적절한 양을 50 ㎕ 옵티-MEM 배지 중에서 희석시킨다. 5분 동안 인큐베이션한 후, 희석된 DNA 및 형질감염 시약을 조합하고, 실온에서 20분 동안 완만하게 혼합한다.
이어서, 적합한 부피의 형질감염 혼합물을 본 발명의 방법에 따라 조류 배아 내로 직접 주사할 수 있다. 비록 적합한 부피는 예컨대, 배아 단계 및 주사받는 조류의 종과 같은 인자에 의해 결정될 수 있지만, 전형적으로, 조류 배아 내로의 적합한 주사 부피는 약 1 ㎕ 내지 약 3 ㎕이다. 형질감염 시약 및 DNA를 혼합하기 위한 프로토콜 뿐만 아니라, 조류 배아로 주사되는 부피는 본 명세서의 교시를 고려하여 최적화될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
주사 이전에, 난을 배아 발생에 적합한 온도에서, 예를 들어, 약 37.5 내지 38℃에서 끝이 뾰족한 부분이 위쪽을 향하게 하여 대략 2.5일 동안(12-17기), 또는 배아 혈관이 주사할 수 있을 정도로 충분한 크기가 될 때까지 인큐베이션한다. 형질감염 혼합물을 주사하기에 최적인 시간은 PGC 이동 시점이고, 전형적으로는 약 12-17기에, 더욱 바람직하게, 13-14기에 이루어진다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 브로일러 계통의 닭은 전형적으로 배아 성장이 빠른 바, 이에 PGC 이동 시점에 형질감염 혼합물을 혈류 내로 도입시키기 위해서는 주사가 13-14기에서 조기에 이루어져야 한다.
조류 배아의 혈관에 접근하기 위해, 난각에 구멍을 만든다. 예를 들어, 적합한 도구, 예컨대, 겸자를 사용하여 난의 끝이 뾰족한 부분에 대략 10 mm 구멍을 만들 수 있다. 배아와 그의 막이 손상되지 못하게 방지하면서, 난각 및 회합되어 있는 막의 절편을 조심히 제거한다.
형질감염 혼합물을 조류 배아의 혈관 내로 주사한 후, 충분한 양의 파라필름, 또는 당업계에 공지된 다른 적합한 실란트 필름을 사용하여 난을 실링한다. 예를 들어, 난각에 10 mm 구멍이 만들어진 경우, 대략 20 mm짜리 정사각형 파라필름 조각을 이용하여 구멍을 덮을 수 있다. 이어서, 가온된 외과용 메스 날을 사용하여 파라필름을 난 외부 표면에 부착시킬 수 있다. 이어서, 끝이 뾰족한 부분이 아래로 향하는 위치로 난을 돌려 놓고, 배아 발생을 위해 충분한 온도에서, 예컨대, 추후 분석시까지 또는 부화시까지 인큐베이션한다. 직접 주사 기술은, US 61/636,331로부터 우선권을 주사하는 WO 2013/155572에 추가로 기술되어 있다.
본 발명의 방법을 이용하여 생산된 동물 및/또는 난을 유전자 변형의 존재에 대해 스크리닝할 수 있다. 이 단계는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 핵산 샘플, 예컨대, 게놈 DNA 샘플을, 표준 DNA 증폭 및 유전자 변형이 게놈의 표적화된 부위(유전자좌)에 존재하는지 여부를 측정하는 서열분석 방법을 이용하여 분석할 수 있다. 한 실시양태에서, 스크리닝은 또한 동물 및/또는 난이 유전자 변형에 대하여 동형접합성인지 또는 이형접합성인지를 측정한다. 또 다른 실시양태에서, 조류는 유전자 변형이 그의 자손에게 전달될 수 있게 생식세포 계열에서 발견될 수 있는지 여부를 확인하기 위해 스크리닝된다.
바이러스
본 발명의 조류 난에서 생산될 수 있는 바이러스로는 조류 난에서 새로운 바이러스 입자를 복제하고, 생산할 수 있는 임의의 바이러스를 포함한다. 상기 바이러스로는 DNA 및 RNA 바이러스를 포함한다. 한 실시양태에서, 바이러스는 동물 바이러스이다. 한 실시양태에서, 동물 바이러스는 인간 바이러스이다. 한 실시양태에서, 바이러스는 비인간 바이러스이다. 한 실시양태에서, 바이러스는 조류 바이러스이다.
본 발명에서 사용하기 위한 바이러스의 예로는 오르토믹소비리다에 과, 헤르페스비리다에 과, 파라믹소비리다에 과, 플라비비리다에 과 및 코로나비리다에 과로부터 선택되는 바이러스 과의 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 바이러스는 오르토믹소비리다에 과의 구성원이다.
오르토믹소비리다에 바이러스는 예를 들어, 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 인플루엔자 C 바이러스, 이사바이러스, 토고토바이러스 및/또는 쿼란자바이러스일 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스일 수 있다. 인플루엔자 A 바이러스는 동물로부터 단리된 인플루엔자 A 바이러스로부터 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, 동물은 인간 또는 조류이다. 특히, 인플루엔자 A 바이러스는 H1N1, H1N2, H1N3, H1N4, H1N5, H1N6, H1N7, H1N9, H2N1, H2N2, H2N3, H2N4, H2N5, H2N7, H2N8, H2N9, H3N1, H3N2, H3N3, H3N4, H3N5, H3N6, H3N8, H4N1, H4N2, H4N3, H4N4, H4N5, H4N6, H4N8, H4N9, H5N1, H5N2, H5N3, H5N6, H5N7, H5N8, H5N9, H6N1, H6N2, H6N3, H6N4, H6N5, H6N6, H6N7, H6N8, H6N9, H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N5, H7N7, H7N8, H7N9, H9N1, H9N2, H9N3, H9N5, H9N6, H9N7, H9N8, H10N1, H10N3, H10N4, H10N6, H10N7, H10N8, H10N9, H11N2, H11N3, H11N6, H11N9, H12N1, H12N4, H12N5, H12N9, H13N2, H13N6, H13N8, H13N9, H14N5, H15N2, H15N8, H15N9 및 H16N3으로부터 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, 인플루엔자 A 바이러스는 H1N1, H3N2, H7N7, 및/또는 H5N1로부터 선택된다.
헤르페스비리다에 바이러스는 예를 들어, HSV-1, HSV-2, 수두 대상 포진 바이러스, 엡스타인-바 바이러스 또는 사이토메갈로바이러스일 수 있다.
파라믹소비리다에 바이러스는 예를 들어, 파라믹소비리나에(Paramyxovirinae) 또는 뉴모비리나에(Pneumovirinae)일 수 있다. 한 실시양태에서, 파라믹소비리다에는 뉴캐슬병 바이러스이다.
플라비비리다에는 예를 들어, 플라비바이러스, 헤파시바이러스, 페기바이러스, 페스티바이러스일 수 있다. 한 실시양태에서, 플라비비리다에는 아포이(Apoi) 바이러스, 아로아(Aroa) 바이러스, 바가자(Bagaza) 바이러스, 반지(Banzi) 바이러스, 보우보우이(Bouboui) 바이러스, 부칼라사 바트(Bukalasa bat) 바이러스, 카시파코레(Cacipacore) 바이러스, 카레이 아일랜드(Carey Island) 바이러스, 카우본 릿지(Cowbone Ridge) 바이러스, 다카르 바트(Dakar bat) 바이러스, 뎅기(Dengue) 바이러스, 엣지 힐(Edge Hill) 바이러스, 엔테베 바트(Entebbe bat) 바이러스, 가제츠 굴리(Gadgets Gully) 바이러스, 일헤우스(Ilheus) 바이러스, 이스라엘 터키 놔수막척수염 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 주그라(Jugra) 바이러스, 주티아파(Jutiapa) 바이러스, 카담(Kadam) 바이러스, 케도우고우(Kedougou) 바이러스, 코코베라(Kokobera) 바이러스, 코우탕고(Koutango) 바이러스, 키아사누르(Kyasanur) 삼림병 질환 바이러스, 란가트(Langat) 바이러스, 도약병 바이러스, 메아반(Meaban) 바이러스, 모독(Modoc) 바이러스, 몬타나 미오티스(Montana myotis) 백질뇌염 바이러스, 머레이 밸리(Murray valley) 뇌염 바이러스, 엔타야(Ntaya) 바이러스, 옴스크(Omsk) 출혈열 바이러스, 프놈-펜 바트(Phnom-Penh bat) 바이러스, 포와산(Powassan) 바이러스, 리오 브라보(Rio Bravo) 바이러스, 로얄 팜(Royal Farm) 바이러스, 사보야(Saboya) 바이러스, 살 비에자(Sal Vieja) 바이러스, 산 페를리타(San Perlita) 바이러스, 사우마레즈 리프(Saumarez Reef) 바이러스, 세픽(Sepik) 바이러스, 세인트 루이스 뇌염 바이러스, 템부수(Tembusu) 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스, 튤레니(Tyuleniy) 바이러스, 우간다 S(Uganda S) 바이러스, 우수투(Usutu) 바이러스, 웨셀스브론(Wesselsbron) 바이러스, 웨스트 나일(West Nile) 바이러스, 야운데(Yaounde) 바이러스, 황열 바이러스, 요코세(Yokose) 바이러스, 지카(Zika) 바이러스일 수 있다.
코로나비리다에 바이러스는 예를 들어, 코로나비리나에(Coronavirinae) 또는 코로비리나에(Corovirinae)일 수 있다. 코로나비리나에는 알파코로나바이러스, 베타코로나바이러스, 델타코로나바이러스, 또는 감마코로나바이러스일 수 있다. 토로비리나에(Torovirinae)는 알파코로나바이러스 또는 베타코로나바이러스일 수 있다. 한 실시양태에서, 코로나비리다에는 SARS(중증 급성 호흡기 증후군: severe acute respiratory syndrome) 코로나바이러스이다.
한 실시양태에서, 바이러스는 인플루엔자 바이러스, 개 홍역 바이러스, 홍역 바이러스, 레오바이러스, 동부형 말 뇌염 바이러스, 개 파라인플루엔자 바이러스, 광견병 바이러스, 계두 바이러스, 서부형 말 뇌염 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 말 뇌척수염, 풍진 바이러스, 산란 저하 증후군 바이러스, 조류 항암 바이러스, 조류 전염성 후두기관염 헤르페스바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 소 파라인플루엔자 바이러스, 두창 바이러스, 전염성 F 낭병, 소 이바라기 바이러스, 재조합 폭스바이러스, 조류 아데노바이러스 I형, II형 또는 III형, 돼지 일본 뇌염 바이러스, 황열 바이러스, 헤르페스 바이러스, 신드비스 바이러스, 감염성 기관지염 바이러스, 셈리키 삼림 바이러스, 뇌척수염 바이러스, 베네수엘라 EEV 바이러스, 닭 빈혈 바이러스, 마렉병 바이러스, 파르보바이러스, 구제역 바이러스, 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스, 고전 돼지 열병 바이러스, 청설병 바이러스, 카바네 바이러스, 전염성 연어 빈혈 바이러스, 전염성 조혈 괴사 바이러스, 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 및 전염성 췌장 괴사 바이러스로부터 선택된다.
난에서의 백신 제조
조류 난에서 바이러스를 복제하고, 상기 난으로부터 백신을 제조하는 방법은 70년 그 초과의 기간 동안 진행되어 왔는 바, 당업계에는 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 인플루엔자 백신 조성물을 제조하는 종래 방법은 전형적으로 부화란에서 바이러스를 성장시키는 것을 포함하였다. 이어서, 상기 방법에 의해 성장된 바이러스는 예를 들어, 생 약독화된 바이러스, 사멸된 전체 바이러스 또는 서브유니트 백신 조성물을 제조하는 데 사용된다. 인플루엔자 백신 조성물을 제조하기 위한 한 가지 방법은 10-11일된 부화란 내로의 생 인플루엔자 바이러스의 접종에 의해 이루어진다. 상기 접종된 백신 바이러스를 바이러스 복제가 이루어질 수 있도록 하기 위해 미리 결정된 시간 기간 동안, 예컨대, 2일 이상 인큐베이션한 후, 바이러스가 풍부한 요막액을 수확한다(문헌 [Hoffmann et al., 2002]). 한 예에서, 미리 결정된 시간은 적어도 12시간, 또는 적어도 24시간, 또는 적어도 18시간, 또는 적어도 24시간, 또는 적어도 48시간, 또는 적어도 72시간, 또는 적어도 4일, 또는 적어도 5일, 또는 적어도 6일, 또는 적어도 7일, 또는 적어도 8일, 또는 적어도 9일, 또는 적어도 10일이다.
전형적인 작업에서, 난은 검란되어야 하고, 난각은 멸균처리되어야 하고, 각각의 난은 요막강 내로의 소량의 바이러스의 주사에 의해 접종되어야 한다. 이어서, 주사받은 난을 33℃-37℃에서 48-72시간동안 인큐베이션하고, 다시 검란하고, 밤새도록 냉장하고, 요막액 수확을 위해 난을 깬다. 이어서, 수확된 요막액을 여과 및/또는 원심분리에 의해 정화시킨 후, 추가 정제를 위해 프로세싱할 수 있다(문헌 [Requirements For Inactivated Influenza Vaccine, World Health Organization Technical Report Series, 384 (1966)]). 미국내에서 상업적으로 이용가능한 다수의 인플루엔자 백신이 부화란에서 복제되고 있다. 한 실시양태에서, 난은 계란이고, 바이러스는 8일째 내지 11일째에 수확된다. 한 실시양태에서, 난은 계란이고, 바이러스는 약 10일째에 수확된다.
복제된 바이러스 또는 이의 입자의 난으로부터의 수확
복제된 바이러스 또는 이의 입자 (예컨대, 분할 바이러스 입자 또는 서브유니트 바이러스 입자)는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 난으로부터, 바람직하게, 난의 요막액으로부터 수확될 수 있다. 예를 들어, 복제된 바이러스 또는 이의 입자를 수확하는 것은 하기 단계: 정화, 농축, 불활성화, 뉴클레아제 처리, 분리/정제, 연마 및 멸균 여과 중 하나 이상의 것을 포함할 수 있다 (문헌 [Wolf et al., 2008]; [Wolf et al., 2011]; [Kalbfuss et al., 2006]; [Josefsberg et al., 2012]). 한 예에서, 정화는 원심분리, 미세여과 및/또는 심층 여과에 의해 수행된다. 한 예에서, 농축은 원심분리, 한외여과, 침전, 모놀리스 및/또는 막 흡착제에 의해 수행된다. 한 예에서, 불활성화는 UV, 열 또는 화학물질 처리에 의해 수행된다. 화학적 형태의 불활성화는 포르말린, 이원 에틸렌이민 및 β-프로피오락톤, 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, 뉴클레아제 처리는 벤조나제를 이용한 처리이다. 한 예에서, 분리/정제는 초원심분리(예를 들어, 밀도 구배), 비드 크로마토그래피(예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피), 및/또는 막 흡착제(예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피)에 의해 수행된다. 한 예에서, 연마는 한외여과 및/또는 투석여과에 의해 수행된다. 한 예에서, 바이러스 또는 바이러스 입자는 알콜 또는 폴리에틸렌 글리콜 침전에 의해 농축될 수 있다. 한 예에서, 복제된 바이러스 또는 이의 입자를 수확하는 것은 문헌 [Grein et al. (2013)]에 기술된 바와 같이 막을 사용하는 것을 포함한다.
또 다른 예에서, 복제된 바이러스를 수확하는 것은 분할 백신 조성물 또는 서브유니트 백신 조성물용으로 적합한 크기의 바이러스 입자를 생산하기 위해 백신 파괴 단계를 포함할 수 있다(문헌 [Wolf et al., 2008]; [Josefsberg et al., 2012]). 상기 단계는 분할 백신 조성물 또는 서브유니트 백신 조성물용으로 적합한 크기의 바이러스 입자를 생산하는 임의 방법일 수 있다. 한 예에서, 파괴 단계는 계면활성제 용해화이다.
당업자는 수확된 바이러스(전체 약독화된 또는 불활성화된) 또는 수확된 바이러스 입자(분할 바이러스 입자 또는 서브유니트 바이러스 입자)가 백신 조성물로 제제화될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 상기 조성물은 애주번트, 부형제, 결합제, 보존제, 캐리어 커플링제, 완충화제, 안정화제, 유화제, 습윤화제, 비바이러스 벡터 및 형질감염 촉진 화합물 중 하나 이상의 것을 포함할 수 있다(문헌 [Josefsberg et al., 2011]; [Jones, 2008]). 당업자는 상기 백신 조성물이 동결건조될 수 있다는 것을 추가로 이해할 것이다. 한 예에서, 제조된 백신 조성물은 인간용으로 적합하다. 한 예에서, 제조된 백신 조성물은 수의과적 용도로 적합하다.
실시예
실시예 1 - 중화 항체에 의한 인터페론 반응 파괴가 난내 바이러스 수율을 증가시킨다.
pQE50 발현 시스템을 사용하여, IPTG로 유도한 후, ChIFNα, ChIFNβ, ChIFNγ 및 ChIFNλ의 ORF를 톱(Top) F'10 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)(E. 콜라이(E. coli)) 적격 세포에서 발현시켰다. 재조합 단백질을 가용화시키고, Ni-NTA-아가로스를 사용하여 정제하였다. 바이러스 중화 검정법을 사용하여 rchIFN의 생물학적 활성을 측정하였다(문헌 [Lowenthal et al., 1995]). rchIFN은 다양한 농도 범위에 걸쳐 세포를 보호하였는 바, 따라서, 이는 생물학적으로 활성을 띤다(도 1).
rchIFN을 상동성 재조합 단백질에 대한 토끼 항혈청을 생성하기 위해 면역원으로서 사용하였다. 뉴질랜드 암컷 흰색 토끼를 퀼라자 사포나리아(Quilaja saponaria) (Quil A) 칵테일 애주번트 중 rchIFN 단백질로 최대 7회에 걸쳐 피하로 면역화시켰다. 황산암모늄을 사용하여 토끼 항chIFN 항혈청 중 구상 혈청 단백질을 농축시켰다. 분광광도계(NanoDrop® ND-1000, NanoDrop Technologies, 미국 소재)를 사용하여 농축된 항혈청을 정량화한 후, 난내 주사를 위해 항체를 0.2 ㎛ 여과 멸균(Sartorius, 독일 소재)시켰다. 간접적 ELISA 분석을 사용하여 혈청 및 다중클론 항체 인식의 반응성을 시험하였다. 간략하면, 정제된 rchIFN을 96 웰 ELISA 플레이트 중 코팅 완충제에서 5 ㎍/mL로 희석시키고, 타이터테크 멀티스캔 플러스(Titertek Multiscan Plus) 플레이트 판독기 상에서 450 nm에서 판독하였다. 분석 결과, 상응하는 단백질에 대한 혈청의 용량 효과 반응성이 나타났다(도 2a).
이어서, 배아 나이가 10-11일째인 하이라인(Hyline) 갈색 난(Hy-Line, 오스트레일리아 소재)에 항체 및/또는 바이러스를 요막액을 통해 접종하였다. (CSL Pty Ltd에 의해 제공받은) 인플루엔자 바이러스 스톡을 1% 네오마이신/폴리믹신을 함유하는 바이러스 희석제 중에서 10-5로 희석시켰다. 난의 PR8(H1N1) 또는 H5N1 백신 바이러스(NIBRG-14)(CSL, 오스트레일리아 소재) 접종을 따로 수행하였다. 난 1개당 1,000 ㎍, 200 ㎍ 또는 20 ㎍으로 난 내로 접종하기 위해 정제된 항chIFN 및 항chIL-6 항체 또한 바이러스 희석제 용액 중에서 희석시켰다. 접종 후, 난을 35℃에서 48 h 동안 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후, 난을 검란하여 생존율을 체크한 후, 수확용 제제 중에서 4℃에서 O/N 냉각시켰다. 추가 분석을 위해 요막액(5 mL)을 각각의 난으로부터 제거하였다. 수확 당일 HA 검정법을 수행하였다. 간략하면, 요막액 샘플을 PBS 중에서 1/25로 연속하여 희석시키고, 둥근 바닥 96 웰 플레이트 (ICN Biochemicals, 미국 소재)의 마지막 줄에 이중으로 첨가하였다. 50 ㎕의 0.5%의 세척된 닭 RBC를 모든 웰에 첨가하고, 약하게 톡톡 두드려 혼합시키고, RT에서 적어도 40 min 동안 그대로 방치하고, HA 종점을 측정하였다. 난내에서의 실험 결과, 항chIFN-α 항체(도 2b) 및 항chIFN-β 항체(도 2c)가 모든 농도에서 난에서의 PR8 또는 NIBRG-14 바이러스의 HA 역가에 어떤 유의적인 영향도 미치지 못한 것으로 나타났다. 그러나, 항chIFN-λ 항체(도 3a)는 200 ㎍/난으로 투여되었을 때, PR8 바이러스의 역가를 통계학적으로 개선시키는 것으로 나타났다(p=0.04). H5N1 백신 바이러스 역가는, 항체가 1,000 ㎍/난(p=0.0045) 및 20 ㎍/난(p=0.0001)으로 주사되었을 때, 두 농도 모두에서 최대 1.5배까지 통계학적으로 개선되었다. 유사하게, 항chIFN-γ 항체(도 3b)는 1,000 ㎍/난(p=0.015)으로 접종되었을 때, H5N1 백신 바이러스의 HA 역가를 개선시킬 수 있었다. 추가로, 항chIL-6 항체(도 3c) 또한 난에서 H5N1 백신 바이러스 역가를 통계학적으로 증진시켰다.
실시예 2 - 시험관내 siRNA에 의한 다수의 유전자 파괴가 바이러스 역가를 증가시킨다.
항바이러스 기능을 가진 유전자 후보를 확인하기 위해, 유전자 세트를 소형 간섭 RNA(siRNA) 검정법에 의해 평가하였다. DF-1 세포를 각 유전자에 대한 다중(스마트풀)의 siRNA로 형질감염킨 후, 조류 인플루엔자(AI: avian influenza) 바이러스로 감염시켰다. 결과는 KD 후, 세포에 대해서는 어떤 뚜렷한 독성 효과 없이, 바이러스 역가가 증가하였다는 것을 나타낸다(도 4). 적어도 일부 경우에서는 어떤 뚜렷한 효과도 관찰되지 않았지만, 이는 siRNA에가 효율적인 KD가 이루어질 정도로 충분히 빠른 조기 시점에 투여되지 않았다는 것이 이유가 될 수 있다(예를 들어, 항IL6 항체 데이터를 고려해 볼 때, 도 4에서의 IL-6 siRNA 데이터를 설명할 수 있는 가능성이 가장 높다). CNOT4, IFNAR 또는 MDA5에 대해, 개별 스마트풀 siRNA가 세포 생존율 및 유전자 침묵화에 미치는 효과를 사정하였다(도 5).
실시예 3 - 난내 shRNA에 의한 다수의 유전자의 하향 조절이 바이러스 역가를 증가시킨다.
난내 분석을 위해, 총 200 ㎕ 중 중합체 대 2 nmol siRNA가 4:1인 몰비로 siRNA를 ABA-21/117Q/PF 중합체(ABA-21/117Q; 폴리플루오르 579 염료 표지를 포함하지 않는 중합체)와의 복합체로서 전달하였다. 복합체를 포스페이트 완충처리된 염수(PBS: phosphate-buffered saline)의 존재하에 수용액 중에서 형성하였다. 물 중에 재현탁된 필요한 양의 중합체(316 ㎍)를 튜브에 첨가하고, 와동시켜 혼합하였다. 이어서, 30 ㎍의 si대조군, 또는 24.5 ㎍의 si항IFNAR1과 등가인 총 2 nmol을 튜브에 첨가하고, 샘플을 와동시켰다. 실온에서 1 h 동안 계속해서 복합체가 형성될 수 있도록 허용하였다. 복합체를 융모요막액 내로 직접 주사하였다. 48시간 후, 바이러스를 앞서 기술된 바와 같이 주사하고, 바이러스 감염 후 24시간째에 샘플을 수집하였다. 결과는 IFNAR1의 KD 후, 바이러스 성장이 증가하였다는 것을 나타낸다(도 6 및 도 7)
실시예 4 - 닭에서의 IFNAR1 유전자의 결실이 시험관내에서 바이러스 역가 를 증가시킨다.
닭 인터페론(알파, 베타 및 오메가) 수용체 1, IFNAR1(유전자 ID: 395665)의 영구 결실이 바이러스 수율에 영향을 미치는지 프로빙하기 위해; 닭 배아 섬유아세포의 연속 세포주(DF-1)로부터 KO 세포주를 생성하였다. 이중체 형성에 의해 이중의 이중 가닥 파단을 생성하도록 하기 위하여, 미생물의 일정한 간격으로 주기적으로 분포하는 짧은 회문 구조의 반복부(CRISPR/Cas9) 시스템으로부터의 RNA 가이드된 Cas9 뉴클레아제를 사용하여, 2개의 상이한 단일 가이드 RNA(sgRNA: single guide RNA)를 디자인하였다. 문헌 [Ran et al., 2013]에 따라 sgRNA를 클로닝하고, 전적으로 전사 개시 부위(TSS: transcription start site) 및 IFNAR1 전구체의 엑손 1이 제거된 약 200 bb의 결실을 코딩하는 것을 사용하여 DF-1 세포로 상응하는 구성물을 형질감염시켰다. BD FACS 아리아 II(BD FACS Aria II)™ 세포 분류기를 사용하여 분류한 후, 단일 세포를 단리시켰다. 야생형, 및 단일 대립유전자성 및 이중 대립유전자성 표적화된 세포주를 구별하는 게놈 PCR 스크리닝 후, 각 클론에서의 결실을 확인하였다.
형질감염 후, 앰플리콘의 클로닝 및 서열분석에 의해 확인된 바, 대립유전자의 약 30%가 200 bp 초과의 결실을 보였다. 단일 클론에 대한 세포 분류 후, 세포를 gDNA PCR에 의해 스크리닝하고, 단일 대립유전자성 및 이중 대립유전자성 세포주를 단리시켰다. 추가로, 유도된 결실은 유전자 투여량에 의존하는 방식으로 전사 수준에서 유전자의 발현을 방해하는 것으로 입증되었으며, 여기서, 단일 대립유전자성 세포주는 야생형과 비교할 때, 절반 정도의 발현 수준을 보였고, 이중 대립유전자성 세포주는 0에 가까운 수준을 보였다. 상기 효과는 심지어 바이러스, 또는 선천성 반응의 강력한 유도인자인 폴리(I:C)로 시험감염시킨 이후에도 지속되었다(도 8a, b 및 c).
결실이 백신 제조에 미치는 영향을 평가하기 위해, H1N1 균주 A/WSN/1933을 높은 다중 감염도 및 낮은 다중 감염도(각각 1 및 0.1 MOI)로 사용하였다. 상기 접근법 사용시, 감염 10시간 경과 후, 바이러스 수율은 이중 대립유전자성 세포주에서 플라크 형성 단위(PFU: plaque-forming unit) 검정법으로 측정하였을 때, 야생형 세포주에서 관찰된 수준의 약 3배 정도로 유의적으로 증가한다. 단리된 바이러스 또한 모체 세포주와 비교할 때, 이중 대립유전자성 세포주로부터 5배 더 높은 TCID50을 보였다(도 8d).
실시예 5 - 헨드라 바이러스에 대한 항바이러스 유전자의 스크리닝 및 확인
인간 HeLa 세포에서의 헨드라 바이러스(HeV) 감염을 위해 요구되는 단백질을 조사하는 siRNA 스크린에서 바이러스 생산과 관련된 다수의 유전자가 확인되었다. HeLa 세포(ATCC CCL-2)를 10% v/v 우태아 혈청(FBS: foetal bovine serum), 10 mM HEPES, 2 mM L-글루타민 및 100 U/ml 페니실린, 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신(P/S; Life Technologies)으로 보충된 성장 배지(이글즈 변형된 이글 배지; EMEM: Eagles Modified Eagle Medium) 중에서 유지시켰다. 밤새도록 옵티-MEM(Life Technologies) 중 다르마펙트-1(Dharmafect-1)(GE Life Sciences)을 사용하여 HeLa 세포(7 x 104)를 siRNA 풀(GE Life Sciences)로 역형질감염시키고, 그 후, 배지를 제거하고, 형질감염용 배지(성장 배지에서 항생제를 제거한 것)로 대체하고, 세포를 추가로 24시간 동안 인큐베이션하였다. 배지를 형질감염 후 ~6시간째에(h.p.t.: hours post transfection) 대체하고, 추가로 18시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 헨드라 바이러스(HeV)(헨드라 바이러스/오스트레일리아/말/1994/헨드라)로 감염시켰다. 50% 조직 배양 감염량(TCID50: tissue culture infective dose)을 위해, 96 웰 조직 배양물 중 배지에서 조직 배양 상청액의 10배 희석액을 제조하였다. 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 3일 동안 인큐베이션하고(HeV), 세포병변 효과에 대해 점수화하였다. 문헌 [Reed and Muench (1938)]의 방법에 의해 감염 역가를 계산하였다. 유전자가 침묵화된 경우의 바이러스 복제를 비표적화 siRNA 대조군(siNT)과 비교하였다. 다수의 유전자의 침묵화에 따른 바이러스 복제의 유의적인 증가가 관찰되었다(도 9 및 표 2 참조). ADCY7의 침묵화가 가장 높은 바이러스 역가 증가를 보였다(표 2 참조).
Figure pct00005
당업자는 광범위하게 기술된 바와 같은 본 발명의 정신 또는 범주로부터 벗어남 없이, 구체적인 실시양태에서 제시된 바와 같은 본 발명에 대하여 다수의 변형 및/또는 수정이 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 그러므로, 본 실시양태는 모든 점에 있어서 제한적인 것이 아니라, 예시적인 것으로 간주되어야 한다.
본 출원은 2015년 11월 24일 출원된 오스트레일리아 가출원 번호 2015904854(발명의 명칭: "Production of viruses in avian eggs")로부터 우선권을 주장하고, 상기 출원은 그 내용 전체가 본원에서 참조로 포함된다.
본원에서 논의 및/또는 참조된 모든 공개문헌은 그 전문이 본원에서 포함된다.
본 명세서에 포함된 문서, 행위, 물질, 장치, 물품 등에 대한 임의의 논의는 오직 본 발명에 대한 배경을 제공하기 위한 것이다. 상기 논의를, 상기 내용 중 임의의 것 또는 모두가 선행 기술의 일부를 형성하거나, 또는 본 출원의 각각의 특허청구범위 항의 우선일 이전에 존재하기 때문에 본 발명과 관련된 분야의 통상의 일반적인 지식임을 인정하는 것으로 간주해서는 안된다.
참고 문헌
Figure pct00006
Figure pct00007

Claims (34)

  1. 조류 난(avian egg)으로서,
    1) 유전자 변형되지 않은 동종동계 난(isogenic egg)과 비교할 때, 난에서 항바이러스 유전자의 발현을 감소시키는 유전자 변형, 및/또는
    2) 외인성 화합물로 처리되지 않은 동종동계 난과 비교할 때, 난에서 항바이러스 유전자의 발현을 감소시키고/거나, 항바이러스 단백질 활성의 수준을 감소시키는 외인성 화합물
    을 포함하고, 난은 동종동계 난에서보다 더 많은 바이러스를 생산할 수 있는 것인 조류 난.
  2. 제1항에 있어서, 항바이러스 유전자 및/또는 단백질이 IFNAR1, IL-6, CNOT4, MDA5, IFNα, IFNβ, IFNγ, IFNλ, BACE2, UBA5, ZFPM2, TRIM50, DDI2, NPR2, CAPN13, DNASE1L2, PHF21A, PCGF5, IL28RA, IFIH1, IL-1RA, LAMP1, EFR3A, ABI1, GADL1, PLVAP, CYYR1, ASAP1, NXF1, NSUN6, ANGPTL7, SIL1, BCAR3, GOLPH3L, HN1, ADCY7, CBLN4, CXORF56, DDX10, EIF2S3, ESF1, GCOM1, GTPBP4, IFT43, KPNA3, LRRIQ1, LUC7L, MRPL12, POLR3E, PWP2, RPL7A, SMYD2, XPO1 및 ZKSCAN7 중 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 것으로부터 선택되는 것인 조류 난.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항바이러스 유전자 및/또는 단백질이 IFNAR1, IL-6, CNOT4, MDA5, IFNα, IFNβ, IFNγ 및 IFNλ 중 1, 2, 3, 4개, 또는 그 모두로부터 선택되는 것인 조류 난.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 변형이 난의 게놈에 있는 것인 조류 난.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 변형이 프로그램가능한 뉴클레아제에 의해 도입되는 것인 조류 난.
  6. 제5항에 있어서, 뉴클레아제가 RNA 가이드된 조작된 뉴클레아제(RGEN), 전사 활성인자 유사 뉴클레아제(TALEN) 및 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)로부터 선택되는 것인 조류 난.
  7. 제6항에 있어서, 뉴클레아제가 RNA 가이드된 조작된 뉴클레아제(RGEN)인 조류 난.
  8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제가 결실, 치환 또는 삽입을 항바이러스 유전자, 또는 이의 조절 영역 내로 도입하는 것인 조류 난.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 변형이 난에서 항바이러스 유전자의 발현을 감소시키는 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 트랜스진인 조류 난.
  10. 제9항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 안티센스 폴리뉴클레오티드, 센스 폴리뉴클레오티드, 마이크로RNA, 항바이러스 유전자에 의해 코딩된 단백질에 결합하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이중 가닥 RNA 분자 또는 이로부터 유도된 프로세싱된 RNA 분자인 조류 난.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 화합물이 소형 탄소계 분자, 단백질 결합제, 프로그램가능한 뉴클레아제, 폴리뉴클레오티드, 또는 이들 중 2 이상의 조합인 조류 난.
  12. 제11항에 있어서, 단백질 결합제 또는 폴리뉴클레오티드가 난에 투여된 트랜스진으로부터 발현되는 것인 조류 난.
  13. 제12항에 있어서, 트랜스진이 난에서 배양되는 바이러스에 존재하는 것인 조류 난.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 결합제가 항체인 조류 난.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스가 동물 바이러스인 조류 난.
  16. 제15항에 있어서, 동물이 인간인 조류 난.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 바이러스가 오르토믹소비리다에(Orthomyxoviridae) 과, 헤르페스비리다에(Herpesviridae) 과, 파라믹소비리다에(Paramyxoviridae) 과, 플라비비리다에(Flaviviridae) 과 및 코로나비리다에(Coronaviridae) 과로부터 선택되는 과의 것인 조류 난.
  18. 제17항에 있어서, 바이러스가 인플루엔자 바이러스, 개 홍역 바이러스, 홍역 바이러스, 레오바이러스, 동부형 말 뇌염 바이러스, 개 파라인플루엔자 바이러스, 광견병 바이러스, 계두 바이러스, 서부형 말 뇌염 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 말 뇌척수염, 풍진 바이러스, 산란 저하 증후군 바이러스, 조류 항암(oncolytic) 바이러스, 조류 전염성 후두기관염 헤르페스바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 소 파라인플루엔자 바이러스, 두창 바이러스, 전염성 F 낭병(Infectious bursal disease), 소 이바라기 바이러스, 재조합 폭스바이러스, 조류 아데노바이러스 I형, II형 또는 III형, 돼지 일본 뇌염 바이러스, 황열 바이러스, 헤르페스 바이러스, 신드비스 바이러스, 감염성 기관지염 바이러스, 셈리키 삼림 바이러스, 뇌척수염 바이러스, 베네수엘라 EEV 바이러스, 닭 빈혈 바이러스, 마렉병 바이러스, 파르보바이러스, 구제역 바이러스, 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스, 고전 돼지 열병 바이러스, 청설병(Bluetongue) 바이러스, 카바네 바이러스, 전염성 연어 빈혈 바이러스, 전염성 조혈 괴사 바이러스, 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 및 전염성 췌장 괴사 바이러스로부터 선택되는 것인 조류 난.
  19. 제18항에 있어서, 바이러스가 인플루엔자 바이러스인 조류 난.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 계란인 조류 난.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스를 포함하는 조류 난.
  22. 바이러스를 복제하는 방법으로서,
    1) 유전자 변형을 포함하는, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 조류 난을 수득하는 단계,
    2) 난에 바이러스를 접종하는 단계, 및
    3) 미리 결정된 기간 동안 난을 인큐베이션하여 바이러스를 복제하는 단계
    를 포함하는 방법.
  23. 바이러스를 복제하는 방법으로서,
    1) 조류 난을 수득하는 단계,
    2) 화합물로 처리되지 않은 동종동계 난과 비교할 때, 난에서 항바이러스 유전자의 발현을 감소시키고/거나, 항바이러스 단백질 활성 수준을 감소시키는 화합물을 투여하는 단계,
    3) 난에 바이러스를 접종하는 단계, 및
    4) 미리 결정된 기간 동안 난을 인큐베이션하여 바이러스를 복제하는 단계
    를 포함하는 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 난으로부터, 복제된 바이러스 또는 이의 입자를 수확하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 수확 단계가 난으로부터 요막액을 수득하는 것을 포함하는 방법.
  26. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 조류 난을 사용하고/거나, 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 방법을 이용하여 생산된 바이러스.
  27. 백신 조성물을 제조하는 방법으로서,
    1) 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 방법을 이용하여 바이러스를 복제하는 단계,
    2) 난으로부터, 복제된 바이러스 또는 이의 입자를 수확하는 단계, 및
    3) 수확된 바이러스로부터 백신 조성물을 조제하는 단계
    를 포함하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 단계 2) 또는 단계 3)이 바이러스를 불활성화시키는 것을 포함하는 방법.
  29. 제27항 또는 제28항의 방법을 이용하여 제조된 백신 조성물.
  30. 유전자 변형을 포함하는 트랜스제닉 조류(transgenic avian)로서, 유전자 변형은, 유전자 변형되지 않은 동종동계 조류에 의해 생산된 난과 비교할 때, 상기 트랜스제닉 조류에 의해 생산된 난에서 항바이러스 유전자의 발현을 감소시키는 것인 트랜스제닉 조류.
  31. 제30항의 조류를 생산하는 방법으로서,
    1) 유전자 변형을 조류 세포 내로 도입하는 단계,
    2) 세포로부터 암컷 조류를 생산하는 단계,
    3) 암컷 조류로부터 하나 이상의 난을 수득하고, 유전자 변형되지 않은 동종동계 난보다 더 많은 바이러스를 생산할 수 있는 능력에 대하여 난(들)을 스크리닝하는 단계,
    4) 유전자 변형되지 않은 동종동계 난보다 더 많은 바이러스를 생산하는 유전자 변형을 지닌 난을 생산하는 암컷 조류를 선택하는 단계, 및
    5) 임의적으로, 암컷 조류를 사용하여 더 많은 조류를 육종하는 단계
    를 포함하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 유전자 변형이 세포의 게놈에 있는 것인 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 유전자 변형이 프로그램가능한 뉴클레아제에 의해 도입되는 것인 방법.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 조류가 닭인 방법.
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