JP2018534948A - トリの卵におけるウイルスの生産 - Google Patents

Abstract

本発明は、ウイルスレベルを増加させるために使用することができる、修飾されたトリの卵に関する。本発明はまた、本発明のトリの卵においてウイルスを生産する方法、及びワクチン組成物を調製するために得られたウイルスの使用にも関する。【選択図】なし

Description

本発明は、ウイルスレベルの増加に使用できる改変されたトリの卵に関する。本発明はまた、本発明のトリの卵におけるウイルスの製造方法、及びワクチン組成物を調製するために得られるウイルスの使用も関する。

ウイルス感染は、ヒト及び経済に重要な家畜の両方において、経済的且つ社会的影響を及ぼす重要な健康問題である。

ウイルス性疾患から動物を守る主なアプローチの１つは、ワクチン接種である。充分な量のウイルスが利用可能であること並びにウイルス生産に関連するコストが、ワクチンの生産の制限要因である。現在のウイルス生産方法として、細胞培養及び卵生産システムがある。しかし、全てのウイルスが細胞培養及び／又は卵生産システムにおいてうまく複製されるわけではない。例えば、全てのインフルエンザウイルスが卵においてよく複製されるわけではない（Ｈｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｈｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００７）。

したがって、ウイルス生産の改善方法を開発する必要がある。このような背景に鑑み、本発明者らは、ウイルス生産を卵で増加させる方法を開発した。

本発明者らは、ウイルス産生を増加させるために、抗ウイルス遺伝子の発現を減少させること、及び／又はトリの卵における抗ウイルスタンパク質活性のレベルを使用することができることを実証した。

したがって、一態様において、本発明は、
（１）遺伝子改変を欠くアイソジェニック卵と比較した場合、卵中の抗ウイルス遺伝子の発現を減少させる遺伝子改変、並びに／又は、
（２）化合物を欠くアイソジェニック卵と比較した場合、卵における抗ウイルス遺伝子の発現を減少させるか、及び／若しくは抗ウイルスタンパク質活性のレベルを減少させる、外因性化合物を備え、
卵は、アイソジェニック卵よりも多くのウイルスを産生することができる、トリの卵を提供する。

一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、Ｉ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ型インターフェロン経路に存在する。一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、Ｉ型インターフェロン経路に存在する。

一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＩＦＮＡＲ１、ＩＬ−６、ＣＮＯＴ４、ＭＤＡ５、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮλ、ＩＦＮＡＲ２、ＵＢＥ１ＤＣ１、ＧＮＡＺ、ＣＤＸ２、ＬＯＣ１００８５９３３９、ＩＬ２８ＲＡ、ＺＦＰＭ２、ＴＲＩＭ５０、ＤＮＡＳＥＩＬ２、ＰＨＦ２１Ａ、ＧＡＰＤＨ、ＢＡＣＥ２、ＨＳＢＰ１、ＰＣＧＦ５、ＩＬ−１ＲＡ、ＤＤＩ２、ＣＡＰＮ１３、ＵＢＡ５、ＮＰＲ２、ＩＦＩＨ１、ＬＡＭＰ１、ＥＦＲ３Ａ、ＡＲＲＤＣ３、ＡＢＩ１、ＳＣＡＦ４、ＧＡＤＬ１、ＺＫＳＣＡＮ７、ＰＬＶＡＰ、ＲＰＵＳＤ１、ＣＹＹＲ１、ＵＰＦ３Ａ、ＡＳＡＰ１、ＮＸＦ１、ＴＯＰ１ＭＴ、ＲＡＬＧＡＰＢ、ＳＵＣＬＡ２、ＧＯＲＡＳＰ２、ＮＳＵＮ６、ＣＥＬＦ１、ＡＮＧＰＴＬ７、ＳＬＣ２６Ａ６、ＷＢＳＣＲ２７、ＳＩＬ１、ＨＴＴ、ＭＹＯＣ、ＴＭ９ＳＦ２、ＣＥＰ２５０、ＦＡＭ１８８Ａ、ＢＣＡＲ３、ＧＯＬＰＨ３Ｌ、ＨＮ１、ＡＤＣＹ７、ＡＫＡＰ１０、ＡＬＸ１、ＣＢＬＮ４、ＣＲＫ、ＣＸＯＲＦ５６、ＤＤＸ１０、ＥＩＦ２Ｓ３、ＥＳＦ１、ＧＢＦ１、ＧＣＯＭ１、ＧＴＰＢＰ４、ＨＯＸＢ９、ＩＦＴ４３、ＩＭＰ４、ＩＳＹ１、ＫＩＡＡ０５８６、ＫＰＮＡ３、ＬＲＲＩＱ１、ＬＵＣ７Ｌ、ＭＥＣＲ、ＭＲＰＬ１２、ＰＯＬＲ３Ｅ、ＰＷＰ２、ＲＰＬ７Ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＳＬＣ４７Ａ２、ＳＭＹＤ２、ＳＴＡＢ１、ＴＴＫ、ＷＮＴ３、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＬ−１０Ｒ２、ＩＦＮκ、ＩＦＮΩ、ＩＬ−１ＲＢ、及びＸＰＯ１のうち、１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上から選択される。

一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＩＦＮＡＲ１、ＩＬ−６、ＣＮＯＴ４、ＭＤＡ５、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮλ、ＢＡＣＥ２、ＵＢＡ５、ＺＦＰＭ２、ＴＲＩＭ５０、ＤＤＩ２、ＮＰＲ２、ＣＡＰＮ１３、ＤＮＡＳＥ１Ｌ２、ＰＨＦ２１Ａ、ＰＣＧＦ５、ＩＦＩＨ１、ＩＬ−１ＲＡ、ＬＡＭＰ１、ＥＦＲ３Ａ、ＡＢＩ１、ＧＡＤＬ１、ＰＬＶＡＰ、ＣＹＹＲ１、ＡＳＡＰ１、ＮＸＦ１、ＮＳＵＮ６、ＡＮＧＰＴＬ７、ＳＩＬ１、ＢＣＡＲ３、ＧＯＬＰＨ３Ｌ、ＨＮ１、ＡＤＣＹ７、ＣＢＬＮ４、ＣＸＯＲＦ５６、ＤＤＸ１０、ＥＩＦ２Ｓ３、ＥＳＦ１、ＧＣＯＭ１、ＧＴＰＢＰ４、ＩＦＴ４３、ＫＰＮＡ３、ＬＲＲＩＱ１、ＬＵＣ７Ｌ、ＭＲＰＬ１２、ＰＯＬＲ３Ｅ、ＰＷＰ２、ＲＰＬ７Ａ、ＳＭＹＤ２、ＸＰＯ１、及びＺＫＳＣＡＮ７のうち、１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上から選択される。

一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＩＦＮＡＲ１、ＩＬ−６、ＣＮＯＴ４、ＭＤＡ５、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮλ、及びＩＬ−１ＲＡのうち、１つ、２つ、３つ、４つ、又はこれら全てから選択される。

一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＩＦＮＡＲ１である。一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＩＬ−６である。一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＭＤＡ５である。一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＣＮＯＴ４である。別の実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＩＦＮαである。別の実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＩＦＮβである。別の実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＩＦＮγである。別の実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＩＦＮλである。別の実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＩＬ−１ＲＡである。

一実施形態において、遺伝子改変はゲノム中にある。一実施形態において、ゲノムはホモ接合体である。一実施形態において、遺伝子改変は、卵に含まれる胚のミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）又は核ＤＮＡに存在する。

遺伝子改変は、トリの卵における抗ウイルス遺伝子の発現、及び／又は抗ウイルスタンパク質のレベルを減少させる所望の効果を達成する天然に存在するトリの卵若しくはその親におけるあらゆる変化であり得る。

一実施形態において、遺伝子改変は、抗ウイルス遺伝子若しくはその調節領域に対する、欠失、置換、又は挿入である。例えば、遺伝子改変はプログラム可能なヌクレアーゼによって導入されてもよい。別の例において、遺伝子改変は、抗ウイルス遺伝子の一部若しくは全部を削除したり、外因性ポリヌクレオチドを抗ウイルス遺伝子に挿入したり、又は一部の抗ウイルス遺伝子（エキソン等のような）の向きを再配列したりすることによって、抗ウイルス活性を有するタンパク質をコードしないように、相同組換えによって導入され得る。別の実施形態において、遺伝子改変は非相同末端接合によって導入された。さらに別の実施形態において、遺伝子改変は化学的突然変異原によって導入された。

一実施形態において、遺伝子改変は点突然変異である。

一実施形態において、遺伝子改変は、トリの卵における抗ウイルス遺伝子の発現及び／又は抗ウイルスタンパク質活性のレベルを減少させるポリヌクレオチドをコードする導入遺伝子によって導入された。ポリヌクレオチドの例には、これらに限定されないが、アンチセンスポリヌクレオチド、センスポリヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、抗ウイルス遺伝子によりコードされたタンパク質に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、トランスポゾン、アプタマー、二本鎖ＲＮＡ分子、又はそれに由来するプロセシングされたＲＮＡ分子が含まれる。

一実施形態において、導入遺伝子は、トリの卵におけるポリヌクレオチドの発現を指示するプロモーターに動作可能に連結されたポリヌクレオチドをコードする、オープンリーディングフレームを含む。

一実施形態において、外因性化合物は、炭素系小分子、タンパク質結合剤、プログラム可能なヌクレアーゼ、ポリヌクレオチド、又はこれら２つ以上の組み合わせである。

一実施形態において、タンパク質結合剤又はポリヌクレオチドは、卵に投与される導入遺伝子から発現される。

一実施形態において、導入遺伝子は、卵で培養されるウイルスに存在する。

一実施形態において、タンパク質結合剤は、抗体である。

一実施形態において、ウイルスは、動物ウイルスである。一実施形態において、動物は、ヒト、ニワトリ、ブタ、魚、ヒツジ、又はウシである。一実施形態において、動物は、ヒトである。

一実施形態において、ウイルスは、オルトミクソウイルス科、ヘルペスウイルス科、パラミクソウイルス科、フラビウイルス科、及びコロナウイルス科から選択される科である。

一実施形態において、ウイルスは、インフルエンザウイルス、イヌジステンパーウイルス、麻疹ウイルス、レオウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、鶏痘ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ムンプスウイルス、ウマ脳脊髄炎、風疹ウイルス、軟卵症候群ウイルス、トリ腫瘍退縮ウイルス、トリ感染性喉頭気管炎ヘルペスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ウシパラインフルエンザウイルス、天然痘ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、ウシイバラキウイルス、組換えポックスウイルス、トリアデノウイルスＩ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ型、ブタ日本脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス、ヘルペスウイルス、シンドビスウイルス、感染性気管支炎ウイルス、セムリキ森林ウイルス、脳脊髄炎ウイルス、ベネズエラＥＥＶウイルス、ニワトリ貧血ウイルス、マレック病ウイルス、パルボウイルス、口蹄疫ウイルス、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、ブタコレラウイルス、ブルータングウイルス、カバネウイルス、伝染性サケ貧血ウイルス、伝染性造血器壊死症ウイルス、ウイルス性出血性敗血症ウイルス、及び伝染性膵臓壊死症ウイルスから選択される。一実施形態において、ウイルスは、インフルエンザウイルスである。

一実施形態において、トリの卵は、鶏卵である。一実施形態において、トリの卵は、アヒル卵である。

別の態様において、本発明は、ウイルスを含む本発明のトリの卵を提供する。一実施形態において、ウイルスは、インフルエンザウイルスである。

さらなる態様において、本発明は、ウイルスを複製する方法を提供し、本方法は、
（１）遺伝子改変を含むトリの卵を得ること、
（２）卵にウイルスを播種すること、及び、
（３）所定の時間、ウイルスを複製するために卵を培養すること、を含む。

代替的な態様において、本発明は、ウイルスを複製する方法を提供し、本方法は、
（１）トリの卵を得ること、
（２）化合物を欠くアイソジェニック卵と比較した場合、抗ウイルス遺伝子の発現を減少させるか、及び／又は卵における抗ウイルスタンパク質活性のレベルを減少させる化合物を投与すること、
（３）卵にウイルスを播種すること、並びに、
（４）所定の時間、ウイルスを複製するために卵を培養すること、を含む。

一実施形態において、本明細書に記載の方法は、複製されたウイルス又はその粒子を卵から採取することをさらに含む。

一実施形態において、採取は、卵からの尿中の流体を得ることを含む。

当業者が理解するように、本発明の卵中のウイルスを複製する方法は、当該技術分野における標準的な技術を用いて実施することができる。

別の態様において、本発明は、本発明のトリの卵を用いるか、及び／又は本発明の方法を使用して生産されたウイルスを提供する。

別の態様において、本発明は、ワクチン組成物を生産する方法を提供し、本方法は、
（１）本発明の方法を用いてウイルスを複製すること、
（２）卵に由来する複製されたウイルス、又はその粒子を収穫すること、及び、
（３）収集されたウイルスからワクチン組成物を調製すること、を含む。

一実施形態において、ステップ（２）又はステップ（３）は、ウイルスを不活性化することを含む。一実施形態において、ウイルスを不活性化することは、ＵＶ、熱、又は化学的不活性化を含む。

一実施形態において、ステップ（２）又はステップ（３）は、ウイルスを分裂させて、スプリットウイルス粒子又はサブユニットウイルス粒子を産生することを含む。

当業者が理解するように、本発明の卵においてワクチン組成物を生産する方法は、当該技術分野における標準的な技術を用いて実施することができる。

一実施形態において、複製ウイルス又はその粒子の収穫は、（１）浄化、（２）濃縮、（３）不活性化、（４）ヌクレアーゼ処理、（５）分離／精製、（６）研磨、及び／又は（７）滅菌濾過を含む。

本発明の方法を用いて製造されたワクチン組成物もまた提供される。

一実施形態において、ワクチン組成物は、弱毒化ワクチンである。一実施形態において、ワクチン組成物は、不活化ワクチン組成物である。一実施形態において、ワクチン組成物は、インフルエンザワクチン組成物である。

さらなる態様において、本発明は遺伝子改変を含むトランスジェニック鳥類を提供し、遺伝子改変は、遺伝子改変を欠くアイソジェニック鳥類によって生産される卵と比較した場合、鳥類によって生産される卵における抗ウイルス遺伝子の発現を減少させる。

一実施形態において、トリは、ニワトリである。

別の態様において、本発明は、本発明のトリを生産する方法を提供し、本方法は、
（１）遺伝子改変をトリの細胞に導入すること、
（２）細胞からメスのトリを生産すること、
（３）メスのトリから１つ以上の卵を得ること、及び遺伝子改変を欠くアイソジェニック卵よりも多くのウイルスを生産する能力に関して卵をスクリーニングすること、
（４）遺伝子改変を欠くアイソジェニック卵よりも多くのウイルスを生産する遺伝子改変を有する卵を生産する、メスのトリを選択すること、並びに、
（５）随意に、メスのトリを用いてより多くのトリを繁殖させること、を含む。

一実施形態において、遺伝子改変は、細胞のゲノムに存在する。

一実施形態において、遺伝子改変は、プログラム可能なヌクレアーゼによって導入される。

さらなる実施形態において、トリは、ニワトリである。

本明細書中のあらゆる実施形態は、特に断りのない限り、あらゆる他の実施形態に準用される。例えば、当業者が本発明のトリの卵について上述したプログラム可能なヌクレアーゼの例を理解することは、本発明の方法に等しく適用される。

本発明は、本明細書に記載された特定の実施形態によって限定されるものではなく、例示の目的にのみ意図される。機能的に等価な製品、組成物、及び方法は、本明細書に記載されるように、本発明の範囲内に明確にある。

本明細書中では、特に明記されていない限り、又は文脈によって求められない限り、単一のステップ、材料の組成、ステップの群、又は材料の組成物の群に対する参照は、これらのステップ、材料の組成物、ステップの群、又は材料の組成物の群の単数及び複数（すなわち、１つ以上）を包含するものと考えられるべきである。

以下、以下の非限定的な実施例及び添付の図を参照して本発明を説明する。

図１は、ウイルス中和アッセイにおける組換えニワトリ（ｒｃｈ）ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、及びＩＦＮλの抗ウイルス活性を示す。細胞生存率の増加はＯＤの増加に等しい。吸光度値は、平均±標準偏差であり、２つの独立した実験からの重複を意味する。細胞単独及び細胞＋ウイルス対照は、２４ウェルからの平均として示されている。 図２Ａは、間接ＥＬＩＳＡ分析が、精製抗ＩＦＮ（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、及びＩＦＮλ）血清が相同タンパク質を認識することを明らかにすることを示す。グラフは、硫酸アンモニウム沈降ポリクローナル抗ｃｈＩＦＮ抗血清がＥＬＩＳＡで相同タンパク質を検出することを示す。ＯＤは抗体レベルの尺度である。示されている吸光度値は、平均±標準偏差であり、２つの独立した実験からの重複を意味する。図２Ｂは、抗ｃｈＩＦＮ−α抗体が、卵におけるウイルス力価を増加させるものではないことを示す。卵においてインフルエンザワクチンウイルス（ＰＲ８又はＮＩＢＲＧ１４）を同時接種した抗ｃｈＩＦＮ−α抗体は、血球凝集反応（ＨＡ）アッセイで測定した赤血球凝集反応（ＨＡ）力価を増強しない。棒グラフは、４件の実験±標準偏差の平均値を表す。図２Ｃは、抗ｃｈＩＦＮ−β抗体が、卵においてウイルス力価が増加するようではないことを示す。精製抗ｃｈＩＦＮ‐β抗体とインフルエンザワクチンウイルス（ＰＲ８又はＮＩＢＲＧ１４）との同時投与は、ＨＡアッセイによって決定された卵中のウイルスＨＡ力価に影響を及ぼさない。棒グラフは、最大３件の実験±標準偏差の平均値を表す。 図３Ａは、抗ｃｈＩＦＮ−λ抗体が、ウイルス価を卵中で増加させることを示す。精製抗ｃｈＩＦＮ−λ抗体及びインフルエンザワクチンウイルス（ＰＲ８又はＮＩＢＲＧ１４）の接種は、ＨＡアッセイによって測定された卵におけるＨＡ力価の増加をもたらす。棒グラフは最大７件の実験±標準偏差の平均値である。統計学的有意差はアスタリスク１つ（＊）ｐ＜０．０５、アスタリスク２つ（＊＊）ｐ＜０．００５、アスタリスク３つ（＊＊＊）で表す。ｐ＝０．０００１。図３Ｂは、抗ｃｈＩＦＮ−γ抗体が、ウイルス力価を卵中で増加させることを示す。抗ｃｈＩＦＮ−γ抗体及びインフルエンザワクチンウイルス（ＰＲ８又はＮＩＢＲＧ１４）の同時投与は、ＨＡアッセイによって測定された卵におけるウイルスＨＡ力価の増加をもたらす。棒グラフは２件の実験±標準偏差の平均値を表す。統計学的有意差はアスタリスク１つ（＊）ｐ＜０．０５で表される。図３Ｃは、抗ｃｈＩＬ−６抗体が、ウイルス力価を卵中で増加させることを示す。精製した抗ｃｈＩＬ−６抗体及びインフルエンザワクチンウイルス（ＰＲ８又はＮＩＢＲＧ１４）の両方を卵に注入する効果は、ＨＡアッセイによって測定されるＨＡウイルス力価の増加をもたらす。棒グラフは、最大５件の実験±標準偏差の平均値を表す。統計学的有意差は、アスタリスク１つ（＊）ｐ＜０．０５、アスタリスク２つ（＊＊）ｐ＜０．００５で表される。 図４は、鳥インフルエンザのワクチン生産のための抗ウイルス遺伝子のスクリーニングと同定を示す。Ａ．陰性対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＴ１）、又は２１の候補宿主遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＤＦ−１細胞の生存能。生存率は、ウイルス感染時、トランスフェクションから７２時間後に測定した。Ｂ．インフルエンザＡ／ＷＳＮの力価は、不死化ニワトリ線維芽細胞株、ＤＦ−１、対照細胞（ｓｉＮＴ１）、又はｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞内で、２１の宿主遺伝子の発現を沈黙させるために増殖した。ｓｉＲＮＡを用いてノックダウン（ＫＤ）後にＴＣＤＩ₅₀として測定したウイルス力価の有意な増加が観察され、ＩＦＮＲＡ１はウイルス力価の最高の増加を示す。Ｃ．ＤＦ１細胞上のウイルス粒子の免疫染色は、ｓｉＲＮＡによるＩＦＮＡＲ１発現の阻害後のウイルス増殖の有意な増加を示す。 図５は、宿主の遺伝子発現のｓｉＲＮＡ下方制御が、インビトロでウイルス増殖を増加させることを示す。ＤＦ−１細胞は、陰性対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＴ１）を取らすフェクトするか、又はＣＮＯＴ４、ＩＦＮＡＲ若しくはＭＤＡ５を標的とし、プールされた（スマートプール）４つのｓｉＲＮＡ二本鎖、若しくは個々のｓｉＲＮＡ二本鎖としてのいずれかを標的とするｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。ｓｉＮＴ１でトランスフェクトされた細胞のｍＲＮＡレベルと比較して、ｐ＜０．０５。ｍＲＮＡレベルを、定量的リアルタイムＰＣＲ法によるトランスフェクションの７２時間後に、Ｔａｑｍａｎプローブを用いて定量した。ｓｉＲＮＡ複合体の各々を、標的遺伝子ＫＤに対する能力（左側に表示）、及びウイルス力価を増加させる能力（右側に表示する）で評価した。細胞を、インフルエンザＡ／ＷＳＮウイルス（ＭＯＩ０．１）に４８時間感染させた。細胞上清中のウイルスレベルを、ＴＣＩＤ₅₀アッセイによって定量した。ｓｉＮＴ１でトランスフェクトされた細胞のウイルスレベルと比較して、ｐ＜０．０５。 図５は、宿主の遺伝子発現のｓｉＲＮＡ下方制御が、インビトロでウイルス増殖を増加させることを示す。ＤＦ−１細胞は、陰性対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＴ１）を取らすフェクトするか、又はＣＮＯＴ４、ＩＦＮＡＲ若しくはＭＤＡ５を標的とし、プールされた（スマートプール）４つのｓｉＲＮＡ二本鎖、若しくは個々のｓｉＲＮＡ二本鎖としてのいずれかを標的とするｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。ｓｉＮＴ１でトランスフェクトされた細胞のｍＲＮＡレベルと比較して、ｐ＜０．０５。ｍＲＮＡレベルを、定量的リアルタイムＰＣＲ法によるトランスフェクションの７２時間後に、Ｔａｑｍａｎプローブを用いて定量した。ｓｉＲＮＡ複合体の各々を、標的遺伝子ＫＤに対する能力（左側に表示）、及びウイルス力価を増加させる能力（右側に表示する）で評価した。細胞を、インフルエンザＡ／ＷＳＮウイルス（ＭＯＩ０．１）に４８時間感染させた。細胞上清中のウイルスレベルを、ＴＣＩＤ₅₀アッセイによって定量した。ｓｉＮＴ１でトランスフェクトされた細胞のウイルスレベルと比較して、ｐ＜０．０５。 図５は、宿主の遺伝子発現のｓｉＲＮＡ下方制御が、インビトロでウイルス増殖を増加させることを示す。ＤＦ−１細胞は、陰性対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＴ１）を取らすフェクトするか、又はＣＮＯＴ４、ＩＦＮＡＲ若しくはＭＤＡ５を標的とし、プールされた（スマートプール）４つのｓｉＲＮＡ二本鎖、若しくは個々のｓｉＲＮＡ二本鎖としてのいずれかを標的とするｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。ｓｉＮＴ１でトランスフェクトされた細胞のｍＲＮＡレベルと比較して、ｐ＜０．０５。ｍＲＮＡレベルを、定量的リアルタイムＰＣＲ法によるトランスフェクションの７２時間後に、Ｔａｑｍａｎプローブを用いて定量した。ｓｉＲＮＡ複合体の各々を、標的遺伝子ＫＤに対する能力（左側に表示）、及びウイルス力価を増加させる能力（右側に表示する）で評価した。細胞を、インフルエンザＡ／ＷＳＮウイルス（ＭＯＩ０．１）に４８時間感染させた。細胞上清中のウイルスレベルを、ＴＣＩＤ₅₀アッセイによって定量した。ｓｉＮＴ１でトランスフェクトされた細胞のウイルスレベルと比較して、ｐ＜０．０５。 図５は、宿主の遺伝子発現のｓｉＲＮＡ下方制御が、インビトロでウイルス増殖を増加させることを示す。ＤＦ−１細胞は、陰性対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＴ１）を取らすフェクトするか、又はＣＮＯＴ４、ＩＦＮＡＲ若しくはＭＤＡ５を標的とし、プールされた（スマートプール）４つのｓｉＲＮＡ二本鎖、若しくは個々のｓｉＲＮＡ二本鎖としてのいずれかを標的とするｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。ｓｉＮＴ１でトランスフェクトされた細胞のｍＲＮＡレベルと比較して、ｐ＜０．０５。ｍＲＮＡレベルを、定量的リアルタイムＰＣＲ法によるトランスフェクションの７２時間後に、Ｔａｑｍａｎプローブを用いて定量した。ｓｉＲＮＡ複合体の各々を、標的遺伝子ＫＤに対する能力（左側に表示）、及びウイルス力価を増加させる能力（右側に表示する）で評価した。細胞を、インフルエンザＡ／ＷＳＮウイルス（ＭＯＩ０．１）に４８時間感染させた。細胞上清中のウイルスレベルを、ＴＣＩＤ₅₀アッセイによって定量した。ｓｉＮＴ１でトランスフェクトされた細胞のウイルスレベルと比較して、ｐ＜０．０５。 図６は、卵由来のＴＣＩＤ₅₀ＷＳＮを示す。Ａ．ＡＢＡ−２１／１１７Ｑ値を用いて送達されたｓｉＲＮＡによる下方制御後の卵由来のＴＣＩＤ₅₀ＷＳＮは、単一複製として得られる。Ｂ．ＡＢＡ−２１／１１７Ｑを用いて送達されたｓｉＲＮＡによって下方制御された卵由来のＴＣＩＤ₅₀ＷＳＮ。値は平均＋２標準偏差として得られる。 図７は、卵由来のＴＣＩＤ₅₀ＷＳＮを示す。Ａ．ＡＢＡ−２１／１１７Ｑを用いて送達されたｓｉＲＮＡによる下方制御後の、卵由来のＴＣＩＤ₅₀ＰＲ８ワクチン株。値は平均＋２標準偏差として得られる。Ｂ．ＴＣＩＤ₅₀力価とＩＦＮＡＲ１のノックダウンとの相関。Ｃ．ＡＢＡ−２１／１１７Ｑを用いて送達されたｓｉＲＮＡによる下方制御によって得られたＨＡ及びＴＣＩＤ₅₀最大値は、対照と比較して３ｌｏｇの増加に相当する。ｓｈＩＦＮＡＲ１は卵のインフルエンザ増殖を増加させる。Ｄ．ｓｈＩＦＮＡＲ１の発現及びインフルエンザＲＮＡのレベルを、０日目のＲＣＡＳ‐ｓｈＩＦＮＡ１注射後の１２胚の心臓、及び胚発生の１０日目のインフルエンザ（ＰＲ８株）への感染時にて、測定した。リアルタイムＰＣＲの生ＣＴ値は、ｓｈＩＦＮＡＲ１及びインフルエンザＲＮＡレベルの発現との相関を示す。ｓｈＩＦＮＡＲ１及びインフルエンザＲＮＡの発現が高いほど、ＣＴ値は低いことが示されている（Ｎ＝６）。 図７は、卵由来のＴＣＩＤ₅₀ＷＳＮを示す。Ａ．ＡＢＡ−２１／１１７Ｑを用いて送達されたｓｉＲＮＡによる下方制御後の、卵由来のＴＣＩＤ₅₀ＰＲ８ワクチン株。値は平均＋２標準偏差として得られる。Ｂ．ＴＣＩＤ₅₀力価とＩＦＮＡＲ１のノックダウンとの相関。Ｃ．ＡＢＡ−２１／１１７Ｑを用いて送達されたｓｉＲＮＡによる下方制御によって得られたＨＡ及びＴＣＩＤ₅₀最大値は、対照と比較して３ｌｏｇの増加に相当する。ｓｈＩＦＮＡＲ１は卵のインフルエンザ増殖を増加させる。Ｄ．ｓｈＩＦＮＡＲ１の発現及びインフルエンザＲＮＡのレベルを、０日目のＲＣＡＳ‐ｓｈＩＦＮＡ１注射後の１２胚の心臓、及び胚発生の１０日目のインフルエンザ（ＰＲ８株）への感染時にて、測定した。リアルタイムＰＣＲの生ＣＴ値は、ｓｈＩＦＮＡＲ１及びインフルエンザＲＮＡレベルの発現との相関を示す。ｓｈＩＦＮＡＲ１及びインフルエンザＲＮＡの発現が高いほど、ＣＴ値は低いことが示されている（Ｎ＝６）。 図８は、ＩＦＮＡＲ１ＤＦ−１ＫＯ細胞株の生成を示す。Ａ．トランスフェクション後、親細胞株由来の細胞は、対立遺伝子の約３０％でＰＣＲスクリーニング中に代替アンプリコンを提示した。欠失は配列決定によって確認された。野生型（ＷＴ）と比較した場合、細胞を選別して、２対立遺伝子（Ａ１３６及びＡ１４２）、単一対立遺伝子（Ａ１３）、又は明確な欠失なし（Ａ１４３）を示す単一クローンを得た。Ｂ．ＩＦＮＡＲ１Ａ遺伝子発現をｑＰＣＲにより評価した。結果は、ＫＯ細胞株上で産生されるハウスキーピングＷＳＮウイルス粒子に対する、ΔΔｃｔ値＋／−２標準偏差（ＳＤ）の平均として表した。全ウイルス収率を示す指標として、異なる細胞株上のＨ１Ｎ１Ａ／ＷＳＮ／１９３３成長を用いてＭＤＣＫ細胞を感染させた後、Ｐｆｕ及びＴＣＩＤ₅₀を確立した。Ｃ．遺伝子ＫＯは０時間と４８時間である。Ｄ．ＫＯ細胞株上で産生されるＷＳＮウイルス粒子。全ウイルス収率を示す指標として、異なる細胞株上のＨ１Ｎ１Ａ／ＷＳＮ／１９３３成長を用いてＭＤＣＫ細胞を感染させた後、Ｐｆｕ及びＴＣＩＤ₅₀を確立した。 図８は、ＩＦＮＡＲ１ＤＦ−１ＫＯ細胞株の生成を示す。Ａ．トランスフェクション後、親細胞株由来の細胞は、対立遺伝子の約３０％でＰＣＲスクリーニング中に代替アンプリコンを提示した。欠失は配列決定によって確認された。野生型（ＷＴ）と比較した場合、細胞を選別して、２対立遺伝子（Ａ１３６及びＡ１４２）、単一対立遺伝子（Ａ１３）、又は明確な欠失なし（Ａ１４３）を示す単一クローンを得た。Ｂ．ＩＦＮＡＲ１Ａ遺伝子発現をｑＰＣＲにより評価した。結果は、ＫＯ細胞株上で産生されるハウスキーピングＷＳＮウイルス粒子に対する、ΔΔｃｔ値＋／−２標準偏差（ＳＤ）の平均として表した。全ウイルス収率を示す指標として、異なる細胞株上のＨ１Ｎ１Ａ／ＷＳＮ／１９３３成長を用いてＭＤＣＫ細胞を感染させた後、Ｐｆｕ及びＴＣＩＤ₅₀を確立した。Ｃ．遺伝子ＫＯは０時間と４８時間である。Ｄ．ＫＯ細胞株上で産生されるＷＳＮウイルス粒子。全ウイルス収率を示す指標として、異なる細胞株上のＨ１Ｎ１Ａ／ＷＳＮ／１９３３成長を用いてＭＤＣＫ細胞を感染させた後、Ｐｆｕ及びＴＣＩＤ₅₀を確立した。 図８は、ＩＦＮＡＲ１ＤＦ−１ＫＯ細胞株の生成を示す。Ａ．トランスフェクション後、親細胞株由来の細胞は、対立遺伝子の約３０％でＰＣＲスクリーニング中に代替アンプリコンを提示した。欠失は配列決定によって確認された。野生型（ＷＴ）と比較した場合、細胞を選別して、２対立遺伝子（Ａ１３６及びＡ１４２）、単一対立遺伝子（Ａ１３）、又は明確な欠失なし（Ａ１４３）を示す単一クローンを得た。Ｂ．ＩＦＮＡＲ１Ａ遺伝子発現をｑＰＣＲにより評価した。結果は、ＫＯ細胞株上で産生されるハウスキーピングＷＳＮウイルス粒子に対する、ΔΔｃｔ値＋／−２標準偏差（ＳＤ）の平均として表した。全ウイルス収率を示す指標として、異なる細胞株上のＨ１Ｎ１Ａ／ＷＳＮ／１９３３成長を用いてＭＤＣＫ細胞を感染させた後、Ｐｆｕ及びＴＣＩＤ₅₀を確立した。Ｃ．遺伝子ＫＯは０時間と４８時間である。Ｄ．ＫＯ細胞株上で産生されるＷＳＮウイルス粒子。全ウイルス収率を示す指標として、異なる細胞株上のＨ１Ｎ１Ａ／ＷＳＮ／１９３３成長を用いてＭＤＣＫ細胞を感染させた後、Ｐｆｕ及びＴＣＩＤ₅₀を確立した。 図９は、ヘンドラウイルスに対する抗ウイルス遺伝子のスクリーニング及び同定を示す。不死化ヒト細胞株ＨｅＬａ、対照細胞（ｓｉＮＴ１）、又はｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞中における、ヘンドラウイルス複製。ｓｉＲＮＡを用いたウイルス複製の有意な増加が観察された。ＬＡＭＰ１はウイルス力価の最大上昇を示した。

一般的技術及び選択した定義
特に定義されていない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有するものとする（例えば、細胞培養、分子遺伝学、トランスジェニック鳥類、免疫学、免疫組織化学、精密ゲノム工学、タンパク質化学、生化学など）。

特に明記されない限り、本発明で利用される細胞培養及び免疫学的技術は、当業者によく知られている標準的な手順である。そのような技術は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８４），Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９），Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（編集者）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １ ａｎｄ ２，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１），Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（編集者）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １−４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９５及び１９９６）、及びＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（編集者）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までの全ての更新を含む）、Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（編集者）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）、及びＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（編集者）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（現在までの全ての更新を含む）のような文献を通して記述され、説明されている。

用語「及び／又は」、例えば「Ｘ及び／又はＹ」とは、「Ｘ及びＹ」又は「Ｘ又はＹ」のいずれかを意味するものと解釈され、両方の意味又はいずれかの意味について明示的な支持を提供するために取られる。

本明細書全体を通して、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のようなバリエーションは、指定された要素、整数若しくはステップ、又は要素の群、整数若しくはステップ、あらゆるその他の要素の除外をしないが、整数若しくはステップの群、又は要素の群、整数若しくはステップを包含することを意味するものと理解されたい。

本明細書で使用される用語「トリ」とは、ニワトリ、七面鳥、カモ、ガチョウ、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、カラス、並びにダチョウ、エミュー、及びヒクイドリを含む猛禽類といった、分類学的の鳥綱の生物の、あらゆる種、亜種、又は生物の品種を指すが、これらに限定されない。この用語は、ニワトリ（チキン）、例えば、白色レグホン、茶色レグホン、バードロック、サセックス、ニューハンプシャー、ロードアイランド、オーストラロープ種、コーンウォール、ミノルカ、アムロックス、カリフォルニアグレー、イタリアパートリッジカラーの種々の既知の系統、並びに七面鳥、ウズラ、アヒル、ゲームヘン、ホロホロ鳥、子バト、ダチョウ、及び商業的な量で一般に繁殖されているその他の家禽類の系統を含む。

本明細書で用いられる場合、用語「遺伝子改変」とは、トリの卵における遺伝物質に対するあらゆる人工的改変である。この組換えは卵、卵の片方若しくは両方の親、又は両親の一方の祖先に行われていてもよい。一実施例において、遺伝子改変は、プログラム可能なヌクレアーゼによって導入されたゲノム中の内因性遺伝子に対する突然変異である。例えば、変異は、もはや機能性タンパク質をコードしなくなった、フレームシフト及び／又は欠失であってもよい。別の実施形態において、抗ウイルスタンパク質が産生されないように標的抗ウイルス遺伝子全体の一部を削除するために相同組換えが用いられる。代替的な実施形態において、遺伝子改変は例えば、卵に所望のポリヌクレオチドを発現する核酸構築物中の導入遺伝子の命令である。導入遺伝子は染色体外であるか、又は卵のゲノムに組み込まれていてもよい。

本明細書で用いられる場合、「外因性化合物」は、所望の結果を生成するために卵に投与される、炭素系小分子、タンパク質、又はポリヌクレオチドといったあらゆる物質であり得る。

本明細書で用いられる場合、用語「アイソジェニック卵よりも多くのウイルスを産生する」とは、アイソジェニック卵よりも多くのウイルスを培養するために使用される本発明のトリの卵の能力を指す。一実施形態において、アイソジェニック卵は、本発明のトリの卵と同一のトリの系統由来である。一実施形態において、アイソジェニック鳥類の卵は、遺伝子改変及び／又は外因性化合物の存在とは別に、本発明の卵と遺伝的に同一である。一実施形態において、本発明のトリは、遺伝子改変及び／又は外因性化合物を欠くアイソジェニック卵と比べた場合、少なくとも０．５倍、又は少なくとも１倍、又は少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍、又は少なくとも１５倍、又は少なくとも２０倍、又は少なくとも５０倍、又は少なくとも１００倍以上のウイルスを生成する。このようなウイルス生産の増加は、ルーチン技術を用いて熟練者によって容易に決定できる。例えば、本発明の卵及びアイソジェニック卵は、同一の量の同一のウイルスを接種することができ、並びに同一の期間に同一の条件下でインキュベートすることができ、そして各卵におけるウイルス粒子の量は、実施例にて概説するような技術といった一般的な技術を用いて決定することができる。

本明細書で用いられる場合、用語「ウイルス又はその粒子」とは、不活性化されていても又はいなくてもよい全ウイルス、又はそのようなウイルスの粒子に関する。ウイルス粒子は、スプリットウイルスワクチン又はサブユニットウイルスワクチンで使用するのに適したあらゆるサイズであり得る。全ウイルス又はウイルスの粒子は、卵の尿中の液体から採取することができる。収穫された全ウイルスは、ワクチン組成物の調製中に破壊されて、スプリットウイルスワクチン又はサブユニットウイルスワクチンに適当なサイズの粒子を形成することができる。

本明細書で用いられる場合、用語「抗ウイルス遺伝子の発現を減少させる」とは、遺伝子改変及び／又は外因性化合物が、アイソジェニック卵中のレベルと比較した場合、卵中においてＲＮＡ転写物のレベル及び／又はＲＮＡ転写物からの翻訳レベルを下方制御する能力を指す。一実施形態において、アイソジェニック卵は、本発明のトリの卵と同一の系統に由来する。一実施形態において、アイソジェニック鳥類の卵は、遺伝子改変及び／又は外因性化合物の存在とは別に、本発明の卵と遺伝的に同一である。一実施形態において、この遺伝子は抗ウイルスタンパク質をコードし、それによって卵内の抗ウイルスタンパク質活性レベルはまた、アイソジェニック卵のレベルと比較して、減少する。一実施形態において、遺伝子改変及び／又は外因性化合物は、遺伝子改変及び／又は外因性化合物を欠くアイソジェニック卵と比較した場合、少なくとも１０％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％又は９５％以上、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％まで、卵中の抗ウイルス遺伝子の発現を減少する。このような減少は、標準的な手順を用いて同定することができる。

本明細書で用いられる場合、用語「抗ウイルスタンパク質活性のレベルを低下させる」とは、アイソジェニック卵におけるレベルと比較した場合、遺伝子改変及び／又は外因性化合物が、卵中の抗ウイルスタンパク質活性レベルを下方制御する能力を指す。一実施形態において、アイソジェニック卵は、本発明のトリの卵と同一の系統のトリ由来である。一実施形態において、アイソジェニック鳥類の卵は、遺伝子改変及び／又は外因性化合物の存在とは別に、本発明の卵と遺伝的に同一である。タンパク質の活性は、例えば、卵中のタンパク質の量を減少させること、及び／又はタンパク質の自然機能を果たす能力を低下させることによって（外因性化合物（例えば、抗体）を活性部位に結合させることによってなど）減少させることができる。一実施形態において、遺伝子改変及び／又は外因性化合物は、遺伝子改変及び／又は外因性化合物を欠くアイソジェニック卵と比較した場合、少なくとも１０％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％以上、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％まで、卵中の抗ウイルスたんぱく活性レベルを低下させる。このような減少は、標準的な手順を用いて同定することができる。

本明細書に言及されている「導入遺伝子」とは、バイオテクノロジー分野における通常の意味を有し、組換えＤＮＡ又はＲＮＡ技術によって製造又は改変されている、並びにトリの卵又は卵の親、又はその前駆体に導入されている遺伝子配列を含む。導入遺伝子には、トリの細胞由来の遺伝子配列が含まれていてもよい。典型的には、導入遺伝子は、例えば形質転換によって、ヒトの操作によりトリ又はその卵に導入されているが、あらゆる方法を当業者は使用することができる。導入遺伝子には、染色体に導入される遺伝子配列及び染色体外の遺伝子配列が含まれる。この導入遺伝子は、典型的には、トリの卵中のポリヌクレオチドを発現するために好適なプロモーターに作動可能に連結された目的のポリヌクレオチドをコードするオープンリーディングフレームを含む。導入遺伝子は相同組換えによって挿入されてもよい。

本明細書に言及される用語「炭素系小分子」とは、分子量が、２０００ダルトン以下、好ましくは１５００ダルトン未満、さらに好ましくは１０００ダルトン未満、さらにより好ましくは７５０ダルトン未満、それ以上さらにより好ましくは５００ダルトン以下の、化学物質又は分子を指す。

抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質
本明細書で用いられる場合、「抗ウイルス遺伝子」とは、あらゆる内因性のトリ遺伝子であり、あらゆる手段によって卵におけるウイルスの産生を制限する発現である。抗ウイルス遺伝子は、抗ウイルスタンパク質をコードすることができる。

本明細書で用いられる場合、「抗ウイルスタンパク質」とは、内在性のトリタンパク質であり、その存在は卵内のウイルスの産生を制限する。

抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ウイルス感染に対する免疫応答をマウントする大人のトリの能力に関連していてもよい。一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、インターフェロン（ＩＦＮ）経路の一部を形成する。一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、Ｉ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ型インターフェロン経路に存在する。一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、Ｉ型又はＩＩＩ型インターフェロン経路に存在する。一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＩＦＮ−α／β受容体１（ＩＦＮＡＲ１）鎖である。別の実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＩＬ−６である。

代替的な実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ウイルス感染に対する免疫応答をマウントする大人のトリの能力に関与するか、又は関与することが既知であってもよい。このような遺伝子／タンパク質のいくつかの既知の機能の例として、細胞代謝、胚発生、細胞シグナル伝達、又は核酸合成に関与していることが挙げられる。

代替的な実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質の発現を減少させることにより、ウイルスに感染したトリの卵の細胞のアポトーシスが減少する。

一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＩＦＮＡＲ１、ＩＬ−６、ＣＮＯＴ４、ＭＤＡ５、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮλ、ＩＦＮＡＲ２、ＵＢＥ１ＤＣ１、ＧＮＡＺ、ＣＤＸ２、ＬＯＣ１００８５９３３９、ＩＬ２８ＲＡ、ＺＦＰＭ２、ＴＲＩＭ５０、ＤＮＡＳＥＩＬ２、ＰＨＦ２１Ａ、ＧＡＰＤＨ、ＢＡＣＥ２、ＨＳＢＰ１、ＰＣＧＦ５、ＩＬ−１ＲＡ、ＤＤＩ２、ＣＡＰＮ１３、ＵＢＡ５、ＮＰＲ２、ＩＦＩＨ１、ＬＡＭＰ１、ＥＦＲ３Ａ、ＡＲＲＤＣ３、ＡＢＩ１、ＳＣＡＦ４、ＧＡＤＬ１、ＺＫＳＣＡＮ７、ＰＬＶＡＰ、ＲＰＵＳＤ１、ＣＹＹＲ１、ＵＰＦ３Ａ、ＡＳＡＰ１、ＮＸＦ１、ＴＯＰ１ＭＴ、ＲＡＬＧＡＰＢ、ＳＵＣＬＡ２、ＧＯＲＡＳＰ２、ＮＳＵＮ６、ＣＥＬＦ１、ＡＮＧＰＴＬ７、ＳＬＣ２６Ａ６、ＷＢＳＣＲ２７、ＳＩＬ１、ＨＴＴ、ＭＹＯＣ、ＴＭ９ＳＦ２、ＣＥＰ２５０、ＦＡＭ１８８Ａ、ＢＣＡＲ３、ＧＯＬＰＨ３Ｌ、ＨＮ１、ＡＤＣＹ７、ＡＫＡＰ１０、ＡＬＸ１、ＣＢＬＮ４、ＣＲＫ、ＣＸＯＲＦ５６、ＤＤＸ１０、ＥＩＦ２Ｓ３、ＥＳＦ１、ＧＢＦ１、ＧＣＯＭ１、ＧＴＰＢＰ４、ＨＯＸＢ９、ＩＦＴ４３、ＩＭＰ４、ＩＳＹ１、ＫＩＡＡ０５８６、ＫＰＮＡ３、ＬＲＲＩＱ１、ＬＵＣ７Ｌ、ＭＥＣＲ、ＭＲＰＬ１２、ＰＯＬＲ３Ｅ、ＰＷＰ２、ＲＰＬ７Ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＳＬＣ４７Ａ２、ＳＭＹＤ２、ＳＴＡＢ１、ＴＴＫ、ＷＮＴ３、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＬ−１０Ｒ２、ＩＦＮκ、ＩＦＮΩ、ＩＬ−１ＲＢ、及びＸＰＯ１、又はその対応する受容体若しくはアゴニストのうち、１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上から選択される。一実施形態において、ＩＦＮαは、次のアイソフォーム：ＩＦＮα１、ＩＦＮα２、ＩＦＮα４、ＩＦＮα５、ＩＦＮα６、ＩＦＮα７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮα１０、ＩＦＮα１３、ＩＦＮα１４、ＩＦＮα１６、ＩＦＮα１７、及びＩＦＮα２１の１つ以上である。一実施形態において、ＩＦＮλは、次のアイソフォーム：ＩＦＮλ１、ＩＦＮλ２、ＩＦＮλ３、ＩＦＮλ４の１つ以上である。

一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＩＦＮＡＲ１、ＩＬ−６、ＣＮＯＴ４、ＭＤＡ５、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮλ、ＢＡＣＥ２、ＵＢＡ５、ＺＦＰＭ２、ＴＲＩＭ５０、ＤＤＩ２、ＮＰＲ２、ＣＡＰＮ１３、ＤＮＡＳＥ１Ｌ２、ＰＨＦ２１Ａ、ＰＣＧＦ５、ＩＦＩＨ１、ＩＬ−１ＲＡ、ＬＡＭＰ１、ＥＦＲ３Ａ、ＡＢＩ１、ＧＡＤＬ１、ＰＬＶＡＰ、ＣＹＹＲ１、ＡＳＡＰ１、ＮＸＦ１、ＮＳＵＮ６、ＡＮＧＰＴＬ７、ＳＩＬ１、ＢＣＡＲ３、ＧＯＬＰＨ３Ｌ、ＨＮ１、ＡＤＣＹ７、ＣＢＬＮ４、ＣＸＯＲＦ５６、ＤＤＸ１０、ＥＩＦ２Ｓ３、ＥＳＦ１、ＧＣＯＭ１、ＧＴＰＢＰ４、ＩＦＴ４３、ＫＰＮＡ３、ＬＲＲＩＱ１、ＬＵＣ７Ｌ、ＭＲＰＬ１２、ＰＯＬＲ３Ｅ、ＰＷＰ２、ＲＰＬ７Ａ、ＳＭＹＤ２、ＸＰＯ１、及びＺＫＳＣＡＮ７、又はその対応する受容体若しくはアゴニストのうち、１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上から選択される。

一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＩＬ−６、ＣＮＯＴ４、ＭＤＡ５、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮＡＲ２、ＵＢＥ１ＤＣ１、ＧＮＡＺ、ＣＤＸ２、ＬＯＣ１００８５９３３９、ＩＬ２８ＲＡ、ＺＦＰＭ２、ＴＲＩＭ５０、ＤＮＡＳＥＩＬ２、ＰＨＦ２１Ａ、ＧＡＰＤＨ、ＢＡＣＥ２、ＨＳＢＰ１、ＰＣＧＦ５、ＩＬ−１ＲＡ、ＤＤＩ２、ＣＡＰＮ１３、ＵＢＡ５、ＮＰＲ２、ＩＦＩＨ１、ＬＡＭＰ１、ＥＦＲ３Ａ、ＡＲＲＤＣ３、ＡＢＩ１、ＳＣＡＦ４、ＧＡＤＬ１、ＺＫＳＣＡＮ７、ＰＬＶＡＰ、ＲＰＵＳＤ１、ＣＹＹＲ１、ＵＰＦ３Ａ、ＡＳＡＰ１、ＮＸＦ１、ＴＯＰ１ＭＴ、ＲＡＬＧＡＰＢ、ＳＵＣＬＡ２、ＧＯＲＡＳＰ２、ＮＳＵＮ６、ＣＥＬＦ１、ＡＮＧＰＴＬ７、ＳＬＣ２６Ａ６、ＷＢＳＣＲ２７、ＳＩＬ１、ＨＴＴ、ＭＹＯＣ、ＴＭ９ＳＦ２、ＣＥＰ２５０、ＦＡＭ１８８Ａ、ＢＣＡＲ３、ＧＯＬＰＨ３Ｌ、ＨＮ１、ＡＤＣＹ７、ＡＫＡＰ１０、ＡＬＸ１、ＣＢＬＮ４、ＣＲＫ、ＣＸＯＲＦ５６、ＤＤＸ１０、ＥＩＦ２Ｓ３、ＥＳＦ１、ＧＢＦ１、ＧＣＯＭ１、ＧＴＰＢＰ４、ＨＯＸＢ９、ＩＦＴ４３、ＩＭＰ４、ＩＳＹ１、ＫＩＡＡ０５８６、ＫＰＮＡ３、ＬＲＲＩＱ１、ＬＵＣ７Ｌ、ＭＥＣＲ、ＭＲＰＬ１２、ＰＯＬＲ３Ｅ、ＰＷＰ２、ＲＰＬ７Ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＳＬＣ４７Ａ２、ＳＭＹＤ２、ＳＴＡＢ１、ＴＴＫ、ＷＮＴ３、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＬ−１０Ｒ２、ＩＦＮκ、ＩＦＮΩ、ＩＬ−１ＲＢ、及びＸＰＯ１、又はその対応する受容体若しくはアゴニストのうち、１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上から選択される。

一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＩＬ−６、ＣＮＯＴ４、ＭＤＡ５、ＩＦＮＡＲ２、ＵＢＥ１ＤＣ１、ＧＮＡＺ、ＣＤＸ２、ＬＯＣ１００８５９３３９、ＩＬ２８ＲＡ、ＺＦＰＭ２、ＴＲＩＭ５０、ＤＮＡＳＥＩＬ２、ＰＨＦ２１Ａ、ＧＡＰＤＨ、ＢＡＣＥ２、ＨＳＢＰ１、ＰＣＧＦ５、ＩＬ−１ＲＡ、ＤＤＩ２、ＣＡＰＮ１３、ＵＢＡ５、ＮＰＲ２、ＩＦＩＨ１、ＬＡＭＰ１、ＥＦＲ３Ａ、ＡＲＲＤＣ３、ＡＢＩ１、ＳＣＡＦ４、ＧＡＤＬ１、ＺＫＳＣＡＮ７、ＰＬＶＡＰ、ＲＰＵＳＤ１、ＣＹＹＲ１、ＵＰＦ３Ａ、ＡＳＡＰ１、ＮＸＦ１、ＴＯＰ１ＭＴ、ＲＡＬＧＡＰＢ、ＳＵＣＬＡ２、ＧＯＲＡＳＰ２、ＮＳＵＮ６、ＣＥＬＦ１、ＡＮＧＰＴＬ７、ＳＬＣ２６Ａ６、ＷＢＳＣＲ２７、ＳＩＬ１、ＨＴＴ、ＭＹＯＣ、ＴＭ９ＳＦ２、ＣＥＰ２５０、ＦＡＭ１８８Ａ、ＢＣＡＲ３、ＧＯＬＰＨ３Ｌ、ＨＮ１、ＡＤＣＹ７、ＡＫＡＰ１０、ＡＬＸ１、ＣＢＬＮ４、ＣＲＫ、ＣＸＯＲＦ５６、ＤＤＸ１０、ＥＩＦ２Ｓ３、ＥＳＦ１、ＧＢＦ１、ＧＣＯＭ１、ＧＴＰＢＰ４、ＨＯＸＢ９、ＩＦＴ４３、ＩＭＰ４、ＩＳＹ１、ＫＩＡＡ０５８６、ＫＰＮＡ３、ＬＲＲＩＱ１、ＬＵＣ７Ｌ、ＭＥＣＲ、ＭＲＰＬ１２、ＰＯＬＲ３Ｅ、ＰＷＰ２、ＲＰＬ７Ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＳＬＣ４７Ａ２、ＳＭＹＤ２、ＳＴＡＢ１、ＴＴＫ、ＷＮＴ３、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＬ−１０Ｒ２、ＩＦＮκ、ＩＦＮΩ、ＩＬ−１ＲＢ、及びＸＰＯ１又はその対応する受容体若しくはアゴニストのうち、１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上から選択される。

一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＩＦＮＡＲ１である。一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＩＬ−６である。一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＭＤＡ５である。一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＣＮＯＴ４である。別の実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＩＦＮαである。別の実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＩＦＮβである。別の実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＩＦＮγである。別の実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＩＦＮλである。別の実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＩＬ−１ＲＡである。別の実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＩＬ−１ＲＢである。

標的化可能な抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質に関するさらなる詳細は、以下の表１に示す。

トリの卵における抗ウイルス遺伝子の発現及び／又は抗ウイルスタンパク質活性レベルの減少
ウイルス生産の増加は、遺伝的改変されたトリの卵及び／又は本明細書に定義される外因性化合物で処理されたトリの卵を使用することによって達成することができる。

いくつかの実施形態において、トリの卵における抗ウイルス遺伝子の発現は、遺伝子改変の導入によって減少する。一実施例において、遺伝子改変はトリの卵に直接導入される。別の実施例において、遺伝子改変は、卵の親の母方及び／又は父方の生殖ラインに導入される。卵の親の母方及び／又は父方生殖ラインへの遺伝子改変の導入によって、トランスジェニック鳥類が作成される。そのような場合、卵は母方又は父方の親から遺伝子改変を受け継ぐ。

いくつかの実施形態において、トリの卵における抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質活性の発現は、外因性化合物によって減少する。外因性化合物の方法の例としては、炭素系小分子、タンパク質結合剤、プログラム可能なヌクレアーゼ、ポリヌクレオチド、又はこれらの２つ以上の組み合わせを含むが、これらに限定されない。

遺伝子改変
遺伝子改変は、トリの卵における抗ウイルス遺伝子の発現、及び／又は抗ウイルス活性のレベルを低下させる、所望の効果を達成する天然のトリの卵、又はその親に対するあらゆる人工の変更であり得る。細胞を遺伝的に改変する方法は、当技術分野において周知である。一実施形態において、遺伝子改変は、点突然変異、挿入、又は欠失（若しくは、これらの一つ以上の組み合わせ）といった、遺伝子を部分的又は完全に不活性化する内因性遺伝子の突然変異である。点突然変異は、早期停止コドン（ナンセンス変異）、スプライス部位突然変異、欠失、フレームシフト突然変異、又は遺伝子若しくはコードされたポリペプチドの活性を低下させるアミノ酸置換変異であってもよい。

一実施形態において、遺伝子改変は、プログラム可能なヌクレアーゼによって導入される。一実施形態において、遺伝子改変は、相同組換えによって導入される。一実施形態において、遺伝子改変は、非相同末端接合によって導入される。一実施形態において、遺伝子改変は、化学的変異原によって導入される。別の実施形態において、遺伝子改変は、外因性ポリヌクレオチドによってコードされる導入遺伝子によって導入される。一実施形態において、外因性ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子によってコードされる。内因性遺伝子の発現を減少させる外因性ポリヌクレオチドの例は、アンチセンスポリヌクレオチド、センスポリヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、内因性酵素を結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、トランスポゾン、アプタマー、二本鎖ＲＮＡ分子、及びこれらに由来するプロセシングＲＮＡ分子からなる群から選択される。一実施形態において、導入遺伝子は、トリの卵におけるポリヌクレオチドの発現を指示するプロモーターに対し、動作可能に連結されたポリヌクレオチドをコードする、オープンリーディングフレームを含む。

プログラム可能なヌクレアーゼ
いくつかの実施形態において、遺伝子改変を欠くアイソジェニック卵と比較した場合、卵内の抗ウイルス遺伝子の発現を減少させる遺伝子改変は、プログラム可能なヌクレアーゼを介してトリの卵、又は卵の親の母方及び／若しくは父方の生殖ラインに導入される。いくつかの実施形態において、その化合物を欠くアイソジェニック卵と比較した場合に抗ウイルス遺伝子の発現を減少させ、及び／又は卵内の抗ウイルスタンパク質活性レベルを減少させる外因性化合物は、プログラム可能なヌクレアーゼである。

本明細書で用いられる場合、用語「プログラム可能なヌクレアーゼ」とは、トリの卵のゲノム内、又はトリの卵の母方若しくは父方の生殖ラインにおいて、予め決定された部位を認識し編集するための、「標的化された」（「プログラムされた」）であるヌクレアーゼを指す。

一実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼは、ゲノム内の所定の部位において部位特異的ＤＮＡ切断を誘導することができる。一実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼは、ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、又はＤＮＡ結合タンパク質ドメインの組み合わせを有するゲノム位置を認識するようプログラムされてもよい。一実施形態において、ヌクレアーゼは、抗ウイルス遺伝子又はその調節領域へ、欠失、置換、又は挿入を導入する。

一実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼは、ＤＮＡ結合ジンクフィンガータンパク質（ＺＥＰ）ドメインの組み合わせによってゲノム位置を認識するようプログラムされてもよい。ＺＦＰはＤＮＡ配列中の特定の３塩基対を認識し、ＺＦＰの組み合わせは特異的なゲノム位置を認識するために使用できる。

一実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼは、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインによってゲノム位置を認識するようプログラムされてもよい。

別の実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼは、１つ以上のＲＮＡ配列によってゲノム位置を認識するようプログラムされてもよい。別の実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼは、１つ以上のＤＮＡ配列によってプログラムされ得てもよい。別の実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼは、１つ以上のハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ配列によってプログラムされてもよい。別の実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼは、１つ以上のＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、及びハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ配列によってプログラムされてもよい。

別の実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼは、複数のサイレンシングに使用することができる。すなわち、２、３、４、５、又はそれ以上の抗ウイルス遺伝子を同時に標的化できるように、２つ以上の「標的化」又は「プログラミングシーケンス」（すなわち、２、３、４、５又はそれ以上のプログラミングシーケンス）を有するプログラム可能なヌクレアーゼの送達に使用することができる（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。

本開示に従って使用することのできるプログラム可能なヌクレアーゼは、細菌クラスタ化された定期挿入短パリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）−ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）系由来のＲＮＡ誘導操作ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＥＮ）、転写活性化因子様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びアルゴノートを含むが、これらに限定されない。

（ＣＲＩＳＰＲ）−ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）システムは、侵入ファージ及びプラスミドに対する防御に関与する微生物ヌクレアーゼシステムである。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子と、ＣＲＩＳＰＲ媒介核酸開裂の特異性をプログラミングすることができる非コードＲＮＡ要素との組合せを含有する。３種（Ｉ〜ＩＩＩ）のＣＲＩＳＰＲシステムが、ＩＩ型ＲＧＥＮクラスを有する広範囲の細菌宿主にわたって同定されている（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。各ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の一つの重要な特徴は、反復配列（直反復）の配列の存在が、非反復配列（スペーサー）の短いストレッチによって間隔をあけていることである。非コードＣＲＩＳＰＲ配列は、個々のスペーサー配列を含有する短ｃｒＲＮＡに直接反復して転写及び開裂され、これによってＣａｓヌクレアーゼを標的部位（プロトパッカー）へ導く。

ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、標的化ＤＮＡ二本鎖切断を４つステップにて行う（例えば、Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３を参照のこと）。第一に、２つの非コードＲＮＡ、前ｃｒＲＮＡ配列、及びｔｒａｃＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第二に、ｔｒａｃＲＮＡは前ｃｒＲＮＡの反復領域にハイブリダイズし、前ｃｒＲＮＡのプロセシングを、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへと媒介する。第三に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃＲＮＡ複合体は、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと、プロトパッカサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の標的ＤＮＡ上のプロトパッカーとの間のワトソン−クリック塩基対を介して、標的認識の追加要件であるＣａｓ９を標的ＤＮＡに導く。そして、Ｃａｓ９は標的ＤＮＡの開裂を媒介して、プロトパッカー内において二本鎖切断を生む。ＣＲＩＳＰＲシステムはまた、ゲノム中の一本鎖切断を生成するためにも使用できる。したがって、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＲＮＡ誘導（又はプログラムされたＲＮＡ）部位特異的ゲノム編集に使用できる。

一実施形態において、ヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導操作ヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）である。一実施形態において、ＲＧＥＮは古細菌ゲノム由来であるか、又はその組換えバージョンである。一実施形態において、ＲＧＥＮは、細菌ゲノム由来であるか、又はその組換えバージョンである。一実施形態において、ＲＧＥＮは、Ｉ型（ＣＲＩＳＰＲ）−ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）システムに由来する。一実施形態において、ＲＧＥＮは、ＩＩ型（ＣＲＩＳＰＲ）−ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）システムに由来する。一実施形態において、ＲＧＥＮは、ＩＩＩ型（ＣＲＩＳＰＲ）−ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）システムに由来する。一実施形態において、ヌクレアーゼは、Ｉ型ＲＧＥＮである。一実施形態において、ヌクレアーゼは、ＩＩ型ＲＧＥＮである。一実施形態において、ＲＧＥＮは、複数成分の酵素である。一実施形態において、ＲＧＥＮは、単一成分の酵素である。一実施形態において、ＲＧＥＮは、ＣＡＳ３である。一実施形態において、ＲＧＥＮは、ＣＡＳ１０である。一実施形態において、ＲＧＥＮは、ＣＡＳ９である。一実施形態において、ＲＧＥＮは、Ｃｐｆ１である（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。一実施形態において、ＲＧＥＮは、単一のＲＮＡ又はＤＮＡによって標的化される。一実施形態において、ＲＧＥＮは、２つ以上のＲＮＡ及び／又はＤＮＡによって標的化される。一実施形態において、ＣＡＳ９は、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来である。

一実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼは、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼであってもよい（例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１を参照のこと）。ＴＡＬＥは植物病原体ザントモナス由来の転写因子であり、新規のＤＮＡ標的に結合するよう容易に操作できる。ＴＡＬＥ又はその切断されたバージョンは、Ｆｏｋｌなどのエンドヌクレアーゼの触媒ドメインにリンクして、ＴＡＬＥヌクレアーゼ又はＴＡＬＥＮと呼ばれる標的エンドヌクレアーゼを生成する。

一実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。一実施形態において、ＺＦＮの各モノマーは、３つ以上のジンクフィンガー系ＤＮＡ結合ドメインを含み、各ジンクフィンガー系ＤＮＡ結合ドメインは３塩基対のサブサイトに結合する。その他の実施形態において、ＺＦＮは、独立ヌクレアーゼに動作可能に連結されたジンクフィンガー系ＤＮＡ結合ドメインを含む、キメラタンパク質である。一実施形態において、独立エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである。一実施形態において、ヌクレアーゼ剤は第１ＺＦＮ及び第２ＺＦＮを含み、第１ＺＦＮ及び第２ＺＦＮの各々は、約６塩基対〜約４０塩基対の切断部位、又は約５塩基対〜約６塩基対の切断部位によって分離した、標的ＤＮＡ配列の各鎖において、２つの隣接する標的ＤＮＡ配列を認識し、そしてＦｏｋＩヌクレアーゼは二量体化し、二本鎖切断を行う（例えば、米国特許第２００６０２４６５６７号明細書、同第２００８０１８２３３２号明細書、同第２００２００８１６１４号明細書、同第２００３００２１７７６号明細書、国際公開第２００２／０５７３０８号パンフレット、米国特許第２０１３０１２３４８４号明細書、同第２０１００２９１０４８明細書、及び国際公開第１１／０１７２９３号パンフレットを参照のこと）。

一実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼは、ＤＮＡプログラムされたアルゴノート（国際公開第１４／１８９６２８号パンフレット）であってもよい。原核生物及び真核生物のアルゴノートは、ＲＮＡ干渉経路に関与する酵素である。アルゴノートは、設計された核酸標的化酸と複合体を形成することによって、標的核酸を結合及び開裂することができる。開裂は、非相同末端結合機構によって修復できる標的核酸において、二本鎖切断を導入することができる。ＤＮＡ「誘導された」又は「プログラムされた」アルゴノートは、ＤＮＡの所定の位置に二本鎖ＤＮＡ切断を導入することができる。一実施形態において、アルゴノートは、ナトロノバクテリウムグレゴリイ（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｅｇｏｒｙｉ）である。

相同体組換え
一実施形態において、遺伝子改変は、相同組換えによって導入される。相同組換えとは、二本鎖切断修復（ＤＳＢＲ）経路及び合成依存鎖アニーリング（ＳＤＳＡ経路）の使用を関与させることができる、２つの類似又は同一分子のＤＮＡ間でヌクレオチド配列を交換する遺伝子改変の一種である（Ｌｏｄｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｗｅａｖｅｒ，２００２）。相同組換えは、遺伝子又はその部分を削除するか、又は抗ウイルス遺伝子又はその調節領域への置換又は挿入を導入するために用いることができる。さらに、相同組換えを用いて導入遺伝子を挿入することもできる。相同組換えを用いて、当業者に公知のあらゆる方法によって、宿主細胞のＤＮＡに遺伝子改変を導入することができる。一実施形態において、相同組換えは、プログラム可能なヌクレアーゼによってトリガーされ得る。

二本鎖ＲＮＡ
一実施形態において、遺伝子改変は、好ましくはトリのゲノムに統合された、ＲＮＡｉ用のｄｓＲＮＡ分子をコードする導入遺伝子である。別の実施形態において、外因性化合物は、ＲＮＡｉ用のｄｓＲＮＡ分子、又はｄｓＲＮＡをコードする導入遺伝子である（例えば、ウイルスなどの好適な発現ベクターに提供される）。

用語「ＲＮＡ干渉」、「ＲＮＡｉ」、又は「遺伝子サイレンシング」とは一般に、ｄｓＲＮＡ分子が、二本鎖ＲＮＡ分子が実質的又は全相同性を共有する核酸配列の発現を減少させるプロセスを指す。しかしながら、ＲＮＡ干渉は、非ＲＮＡ二本鎖分子を用いて達成できることが示されている（例えば、米国特許第２００７０００４６６７号明細書を参照のこと）。

本発明は、本発明において使用するＲＮＡ干渉のための二本鎖領域を含む及び／又はコードする、核酸分子を含む。核酸分子は典型的にはＲＮＡであるが、化学的に修飾されたヌクレオチド及び非ヌクレオチドを含んでいてもよい。

二本鎖領域は、少なくとも１９個の連続ヌクレオチド、例えば約１９〜２３ヌクレオチド、又はより長くてもよく、例えば３０若しくは５０ヌクレオチド、又は１００ヌクレオチド以上でなければならない。遺伝子転写物全体に対応する全長配列を用いることができる。好ましくは、約１９〜約２３ヌクレオチド長である。

標的転写物に対する核酸分子の二本鎖領域の識別度は、少なくとも９０％、より好ましくは９５〜１００％でなければならない。核酸分子は当然、分子の安定化に機能し得る、関連した配列を含むことができる。

本明細書で用いられる場合、用語「短干渉ＲＮＡ」又は「ｓｉＲＮＡ」とは、例えば配列特異的方法でＲＮＡｉを仲介することによって、遺伝子発現を阻害するか又は下方制御することのできるリボヌクレオチドを含む、核酸分子を指し、二本鎖部分は、５０ヌクレオチド長以下、好ましくは約１９〜約２３ヌクレオチド長である。例えば、ｓｉＲＮＡは、自己相補的センス及びアンチセンス領域を含む核酸分子であり得、アンチセンス領域は、標的核酸分子又はその標的核酸配列中のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列、及び標的核酸配列又はその一部と対応するヌクレオチド配列を有するセンス領域を含む。ｓｉＲＮＡは、１本の鎖がセンス鎖であり、もう一方がアンチセンス鎖である、２つの別々のオリゴヌクレオチドから組み立てることができ、アンチセンス及びセンス鎖は自己相補的である。

本明細書で用いられる場合、ｓｉＲＮＡという用語は、配列特異的ＲＮＡｉ、例えばマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短干渉オリゴヌクレオチド、短干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学修飾ｓｉＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）などを媒介することのできる核酸分子を描写するために使用されるその他の用語と、同等であることを意味する。さらに、本明細書で用いられる場合、ＲＮＡｉという用語は、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、又はエピジェネティクスのような、配列特異的ＲＮＡ干渉を描写するために使用されるその他の用語と、同等であることを意味する。例えば、本発明のｓｉＲＮＡ分子を、転写後レベル又は転写前レベルの両方において、エピジェネティックに無音遺伝子へ用いることができる。非限定的な例において、本発明のｓｉＲＮＡ分子による遺伝子発現のエピジェネティック調節は、遺伝子発現を変化させるために、クロマチン構造のｓｉＲＮＡ媒介修飾によって生じてもよい。

「ｓｈＲＮＡ」又は「短ヘアピンＲＮＡ」とは、約５０ヌクレオチド未満、好ましくは約１９〜約２３ヌクレオチドのＲＮＡ分子を意味し、同一のＲＮＡ分子上に位置する相補的配列と対合しており、この配列及び相補配列は、塩基相補性の２つの領域によって生成されるステム構造の上に一本鎖ループを形成する、少なくとも約４〜約１５ヌクレオチドの不対領域によって分離されている。一本鎖ループのシーケンスの例としては、５’ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ３’が挙げられる。

包含されるｓｈＲＮＡは、二重又は二指及び多指のヘアピンｄｓＲＮＡであり、ＲＮＡ分子は、一本鎖スペーサー領域によって分離されたこのようなステム−ループ構造の２つ以上を含む。

一旦設計されると、二本鎖領域を含む核酸分子は、当技術分野で公知のあらゆる方法、例えば、インビトロ転写、組換え体、又は合成手段によって生成され得る。

ヌクレオチドの修飾又は類似体を導入して、本発明の核酸分子の特性を改善することができる。改良された性質には、ヌクレアーゼ耐性の増加及び／又は細胞膜透過能の増加が含まれる。したがって、用語「核酸分子」及び「二本鎖ＲＮＡ分子」は、シンシン、キサンチンキサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル−、２−プロピル−、及びその他のアルキル−アデニン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、６−アザシトシン、及び６−アザチミン、シュードウラシル、４−チウラシル、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオオールアデニン、８−チオールアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニン、並びにその他の８−置換アデニン、８−ハログアニン、８−アミノグアニン、８−チオールグアニン、８−チオアルキルグアニン、８−ヒドロキシルグアニン、及びその他の置換グアニン、その他のアザ及びデアザアデニン、その他のアザ及びデアザグアニン、５−トリフルオロメチルウラシル及び５−トリフルオロシトシンなどの合成修飾塩基を含む。

小分子
いくつかの実施形態において、外因性化合物は、小分子である。一実施形態において、小分子は抗ウイルスタンパク質に結合することによって、ウイルス感染したトリの卵において正常な機能を遂行するタンパク質の能力を低下させる。

一実施形態において、投与される化合物は、不活性又は比較的低い活性である前駆体化合物であり得るが、化合物を欠くアイソジェニック卵と比較した場合、投与後に、卵中において抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質活性の発現を減少させる化合物へ変換される（例えば、代謝される）。これらの実施形態において、投与される化合物は、プロドラッグと称することができる。あるいは、又はその上、化合物を欠いたアイソジェニック卵と比較した場合、投与される化合物は代謝されて、卵中において抗ウイルス遺伝子及び／又は卵のタンパク質活性の発現を減少させる活性を有する、活性代謝物を生成してもよい。このような活性代謝物の使用もまた、本開示の範囲内である。

外因性化合物中に存在する置換基に応じて、化合物は、随意に塩の形で存在していてもよい。本発明における使用に好適な化合物の塩は、カウンターイオンが薬学的に許容されるものである。好適な塩として、有機酸若しくは無機酸、又は塩基で形成されたものが含まれる。薬学的に許容可能な酸添加塩として、塩酸、臭化水素、硝酸、窒素、クエン酸、酒石、酢酸、リン酸、乳酸、ピルビン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、コハク酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、オキサロ酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸、イセチオン酸、アスコルビン酸、リンゴ酸、フタル酸、アスパラギン酸、及びグルタミン酸、リジン、並びにアルギニンから形成されるものが挙げられる。薬学的に様可能な塩基塩として、アンモニウム塩、アルカリ金属塩、例えばカリウム及びナトリウム、アルカリ土類金属塩、例えばカルシウム及びマグネシウムなど、並びに有機塩基を有する塩、例えば、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルコミン、モルホリン、チオモルホリン、ピペリジン、ピロリジン、モノ−、ジ−、又はトリ−低級アルキルアミン、例えば、エチル−、ｔ−ブチル−、ジエチル−、ジイソプロピル−、トリエチル−、トリブチル−、若しくはジメチル−プロピルアミン、又はモノ−、ジ−、若しくはトリヒドロキシ低級アルキルアミン、例えばモノ−、ジ−、若しくはトリエタノールアミンが挙げられる。対応する内部塩もまた形成することができる。

有機及び／又は医薬化学の当業者は、多くの有機化合物が反応される溶媒と錯体を形成することができるか、又はそれらが沈殿若しくは結晶化されることを理解するであろう。これらの複合体は「溶媒和物」と呼ばれる。例えば、水との複合体は「水和物」と呼ばれる。化学量論的又は非化学量論的量のいずれかでおける結晶格子中に原体が水などの溶媒と相互作用する場合、含水塩といった溶媒和化合物が存在する。薬物物質は、水和物のような溶媒和物の存在について日常的にスクリーニングされるが、これらはあらゆる段階において遭遇することがある。したがって、本発明に有用な化合物は、水和物のような溶媒和物の形態で存在することができることが理解されよう。本発明において使用するのに適した化合物の溶媒和形態は、関連する溶媒が薬学的に許容されるものである。例えば、水和物は、薬学的に許容される溶媒和物の一例である。

本発明に有用な化合物は、非晶質形態又は結晶形で存在することができる。多くの化合物は多型形態で存在し、全てのこのような形態における化合物の使用は本開示によって包含される。

本開示に有用な小分子は、本発明の抗ウイルス標的タンパク質に結合するための候補化合物のライブラリーをスクリーニングし、そしてタンパク質活性を低下させる化合物がいずれであるかを決定するような標準的な方法を用いて、同定することができる。例えば、ニワトリＩＦＮ−α／β受容体１の活性を低下させるために有用な小分子は、受容体に結合し、受容体（ＩＦＮなど）のリガンドが細胞シグナルを誘導する能力を阻害する。

結合剤
一実施形態において、外因性化合物は、抗ウイルスタンパク質の活性を結合し、減少させるタンパク質である。一実施形態において、結合剤は、抗体又はその断片である。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩＦＮＡＲ１、ＩＬ−６、ＣＮＯＴ４、ＭＤＡ５、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮλ、ＩＦＮＡＲ２、ＵＢＥ１ＤＣ１、ＧＮＡＺ、ＣＤＸ２、ＬＯＣ１００８５９３３９、ＩＬ２８ＲＡ、ＺＦＰＭ２、ＴＲＩＭ５０、ＤＮＡＳＥＩＬ２、ＰＨＦ２１Ａ、ＧＡＰＤＨ、ＢＡＣＥ２、ＨＳＢＰ１、ＰＣＧＦ５、ＩＬ−１ＲＡ、ＤＤＩ２、ＣＡＰＮ１３、ＵＢＡ５、ＮＰＲ２、ＩＦＩＨ１、ＬＡＭＰ１、ＥＦＲ３Ａ、ＡＲＲＤＣ３、ＡＢＩ１、ＳＣＡＦ４、ＧＡＤＬ１、ＺＫＳＣＡＮ７、ＰＬＶＡＰ、ＲＰＵＳＤ１、ＣＹＹＲ１、ＵＰＦ３Ａ、ＡＳＡＰ１、ＮＸＦ１、ＴＯＰ１ＭＴ、ＲＡＬＧＡＰＢ、ＳＵＣＬＡ２、ＧＯＲＡＳＰ２、ＮＳＵＮ６、ＣＥＬＦ１、ＡＮＧＰＴＬ７、ＳＬＣ２６Ａ６、ＷＢＳＣＲ２７、ＳＩＬ１、ＨＴＴ、ＭＹＯＣ、ＴＭ９ＳＦ２、ＣＥＰ２５０、ＦＡＭ１８８Ａ、ＢＣＡＲ３、ＧＯＬＰＨ３Ｌ、ＨＮ１、ＡＤＣＹ７、ＡＫＡＰ１０、ＡＬＸ１、ＣＢＬＮ４、ＣＲＫ、ＣＸＯＲＦ５６、ＤＤＸ１０、ＥＩＦ２Ｓ３、ＥＳＦ１、ＧＢＦ１、ＧＣＯＭ１、ＧＴＰＢＰ４、ＨＯＸＢ９、ＩＦＴ４３、ＩＭＰ４、ＩＳＹ１、ＫＩＡＡ０５８６、ＫＰＮＡ３、ＬＲＲＩＱ１、ＬＵＣ７Ｌ、ＭＥＣＲ、ＭＲＰＬ１２、ＰＯＬＲ３Ｅ、ＰＷＰ２、ＲＰＬ７Ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＳＬＣ４７Ａ２、ＳＭＹＤ２、ＳＴＡＢ１、ＴＴＫ、ＷＮＴ３、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＬ−１０Ｒ２、ＩＦＮκ、ＩＦＮΩ、ＩＬ−１ＲＢ、及びＸＰＯ１遺伝子、並びに／若しくはタンパク質、又はそれらの対応する受容体若しくはアゴニストの、発現又は活性を方向付けるか、及び／又は減少させる。いくつかの実施形態において、結合剤は、ＩＦＮＡＲ１、ＩＬ−６、ＣＮＯＴ４、ＭＤＡ５、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮλ、ＩＦＮＡＲ２、ＵＢＥ１ＤＣ１、ＧＮＡＺ、ＣＤＸ２、ＬＯＣ１００８５９３３９、ＩＬ２８ＲＡ、ＺＦＰＭ２、ＴＲＩＭ５０、ＤＮＡＳＥＩＬ２、ＰＨＦ２１Ａ、ＧＡＰＤＨ、ＢＡＣＥ２、ＨＳＢＰ１、ＰＣＧＦ５、ＩＬ−１ＲＡ、ＤＤＩ２、ＣＡＰＮ１３、ＵＢＡ５、ＮＰＲ２、ＩＦＩＨ１、ＬＡＭＰ１、ＥＦＲ３Ａ、ＡＲＲＤＣ３、ＡＢＩ１、ＳＣＡＦ４、ＧＡＤＬ１、ＺＫＳＣＡＮ７、ＰＬＶＡＰ、ＲＰＵＳＤ１、ＣＹＹＲ１、ＵＰＦ３Ａ、ＡＳＡＰ１、ＮＸＦ１、ＴＯＰ１ＭＴ、ＲＡＬＧＡＰＢ、ＳＵＣＬＡ２、ＧＯＲＡＳＰ２、ＮＳＵＮ６、ＣＥＬＦ１、ＡＮＧＰＴＬ７、ＳＬＣ２６Ａ６、ＷＢＳＣＲ２７、ＳＩＬ１、ＨＴＴ、ＭＹＯＣ、ＴＭ９ＳＦ２、ＣＥＰ２５０、ＦＡＭ１８８Ａ、ＢＣＡＲ３、ＧＯＬＰＨ３Ｌ、ＨＮ１、ＡＤＣＹ７、ＡＫＡＰ１０、ＡＬＸ１、ＣＢＬＮ４、ＣＲＫ、ＣＸＯＲＦ５６、ＤＤＸ１０、ＥＩＦ２Ｓ３、ＥＳＦ１、ＧＢＦ１、ＧＣＯＭ１、ＧＴＰＢＰ４、ＨＯＸＢ９、ＩＦＴ４３、ＩＭＰ４、ＩＳＹ１、ＫＩＡＡ０５８６、ＫＰＮＡ３、ＬＲＲＩＱ１、ＬＵＣ７Ｌ、ＭＥＣＲ、ＭＲＰＬ１２、ＰＯＬＲ３Ｅ、ＰＷＰ２、ＲＰＬ７Ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＳＬＣ４７Ａ２、ＳＭＹＤ２、ＳＴＡＢ１、ＴＴＫ、ＷＮＴ３、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＬ−１０Ｒ２、ＩＦＮκ、ＩＦＮΩ、ＩＬ−１ＲＢ、及びＸＰＯ１、又はこれらの受容体若しくはアゴニストのうち、２つ以上のあらゆる組み合わせに向けられた二重特異抗体である。一実施形態において、抗体は、トリの卵の細胞によって、（受動的又は積極的に）侵入又は取り込まれるように修飾された抗体である。一実施形態において、結合剤はＢ１８Ｒではない。

本明細書で用いられる場合、用語「抗体」とは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異抗体、融合糖尿病、トリアボジン、ヘテロ結合体抗体、無傷分子を含むキメラ抗体、並びにこれらの断片、及びその他の抗体様分子を含む。抗体として、例えば、ＶＨ又はＶＬドメイン、重鎖可変領域（ラクダ科において記述されているような、ＶＨＨ）の二量体、軽鎖可変領域（ＶＬＬ）の二量体、直接若しくはリンカーを通じて接続し得る軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）可変領域のみを含有するＦｖ断片、又は重鎖可変領域及びＣＨ１ドメインを含有するＦｄ断片のいずれかを含む、ドメイン抗体を含む種々の形態における修飾が挙げられるが、これらに限定されない。

重鎖と軽鎖の可変領域からなるｓｃＦｖは、単鎖抗体（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９８８； Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８）を形成するために結合し、糖尿病やトリアボイズのようなｓｃＦｖのオリゴマーも用語「抗体」によって包含される。また、可変領域及び定常領域の一部を含むＦａｂ、（Ｆａｂ’）２、及びＦａｂＦｃ２フラグメントのような抗体の断片も包含される。相補性決定領域（ＣＤＲ）グラフト化抗体フラグメント及び抗体フラグメントのオリゴマーも包含される。Ｆｖの重鎖及び軽鎖成分は、同じ抗体又は異なる抗体から誘導されてもよく、それによってキメラＦｖ領域を生成する。抗体は動物（例えば、マウス、ウサギ、又はラット）であってもよいし、キメラ（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８４）であってもよい。抗体は、当技術分野で公知の任意の方法によって製造することができる。

本明細書に記載されたガイドライン及びこれらの方法は、上記文献に記載されている当業者に周知の方法で知られており、また、Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， （１９８８）は、本発明の方法に用いる抗体を容易に作成することができる。

抗体は可変光（ＶＬ）と、光及び重鎖を直接又はリンカーを通して結合させる可変重鎖（ＶＨ）とを含むＦｖ領域とすることができる。本明細書で使用されるリンカーは、光及び重鎖に共有結合され、それらが方向づけられるエピトープを特異的に結合することができるコンホメーションを達成できるように、２つの鎖間の充分な間隔と柔軟性を提供する分子を指す。タンパク質リンカーは、融合ポリペプチドのＩｇ部分の固有成分として発現することができるので特に好ましい。

一実施形態において、抗体は細胞内伝播能を有する。細胞内伝播の能力を有する抗体は、ラクダ及びラマ抗体、サメ抗体（イグナール）、ｓｃＦｖ抗体、イントラコード又はナノダイオードなどの抗体、例えばｓｃＦｖイントロン及びＶＨＨイントロンを含む。このような抗原結合剤は、Ｈａｒｍｓｅｎ ａｎｄ Ｄｅ Ｈａａｒｄ （２００７）、Ｔｉｂａｒｙ ｅｔ ａｌ． （２００７）、及びＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ ｅｔ ａｌ． （２００１）によって記述される。酵母ＳＰＬＩＮＴ抗体ライブラリーは、タンパク質−タンパク質相互作用（例えば、Ｖｉｓｉｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ． （２００８）の製造方法について参照）を阻害することができるイントラダイズの検査に利用できる。このような薬剤は、Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ． （２００８）に開示された細胞貫通ペプチド配列又は核局在化ペプチド配列を含むことができる。また、Ｄｅ Ｃｏｕｐａｄｅ ｅｔ ａｌ． （２００５）及びＭｅｙｅｒ−Ｌｏｓｉｃ ｅｔ ａｌ． （２００６）にて開示されているようなＶｅｃｔｏｃｅｌｌ又はＤｉａｔｏペプチドベクターが、インビボ送達に有用である。

さらに、抗体は細胞貫通性ペプチド、例えば細胞貫通ペプチドに融合させることができる。細胞浸透ペプチドには、Ｔａｔペプチド、ペントラチン、Ｐｅｐｔ−及びＭＰＧファミリーからの短両親媒性ペプチド、オリゴアルギニン及びオリゴリシンが含まれる。一実施例において、細胞貫通ペプチドもまた、細胞内送達（Ｋｏｐｐｅｌｈｕｓ ｅｔ ａｌ．， ２００８）を改善するために脂質（Ｃ６−Ｃ１８脂肪酸）ドメインに結合される。細胞貫通ペプチドの例はＨｏｗｌ ｅｔ ａｌ．（２００７）及びＤｅｓｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００８）に見出される。したがって、本発明はまた、共有結合（例えばペプチド結合）を介して、任意オプションでＮ末端又はＣ末端を細胞貫通ペプチド配列に融合させた抗体を使用する。

核酸構築物
鳥類及び／又はトリの卵への遺伝子改変の導入は、核酸構築物の使用を含むことができる。一実施形態において、核酸構築物は、導入遺伝子を含むことができる。本明細書で使用される場合、「ターゲット」「核酸構築物」は、例えば、本明細書に定義される二本鎖ＲＮＡ分子、プログラム可能なヌクレアーゼ又はベクター中の興味のあるポリヌクレオチド「ガイド」を含むＲＮＡ、ＤＮＡ、又はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列をコードする任意の核酸分子を指す。典型的には、核酸構築物は二本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＲＮＡ又はそれらの組合せであろう。さらに、核酸構築物は、典型的には、ポリヌクレオチドをコードするオープンリーディングフレームに動作可能に連結された適切なプロモーターを含む。核酸構築物は、例えば、二本鎖ＲＮＡ分子の第１の一本鎖をコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、相補的（２番目）鎖は、異なる、好ましくは同一の核酸構築物によって第２のオープンリーディングフレームによってコードされる。核酸構築物は、直線状の断片又は環状分子であってもよく、また、複製が可能であるか否かを問わない。熟練者は、本発明の核酸構築物が適当なベクター内に含まれ得ることを理解するであろう。核酸構築物を受容細胞にトランスフェクション又は変換することにより、核酸構築物によってコードされるＲＮＡ又はＤＮＡ分子を発現させることができる。

別の実施例において、核酸構築物は、二本鎖領域、例えば短ヘアピンＲＮＡを含む、同一のＲＮＡ分子、及び／又は複数の異なるＲＮＡ分子を含む１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、若しくはそれ以上）の複数の複製を発現することができる。別の実施例において、核酸構築物は、Ｓｃｈｕｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３）に記載のように、遺伝子ターゲッティングカセットであってもよい。

核酸構築物はさらに、付加的な遺伝要素を含んでもよい。構成に含まれる可能性のある要素のタイプは、いかなる方法でも限定されず、当業者によって選択され得る。いくつかの実施形態において、核酸構築物は、導入遺伝子として宿主細胞に挿入される。そのような場合、導入遺伝子挿入プロセスからＲＮＡ分子をコードする配列を保護し、外部転写のリスクを低減するために設計された構成に「スタッファー」フラグメントを含めることが望ましい。スタッファー断片は、例えばプロモーターとコード配列及び／又はターミネーター成分との間の距離を増加させるために構築物中に含まれ得る。スタッファー断片は、５〜５０００個以上のヌクレオチドから任意の長さであることができる。プロモーター間に１つ以上のスタッファー断片が存在することができる。複数のスタッフフラグメントの場合、それらは同じ又は異なる長さであり得る。スタッファーＤＮＡ断片は、好ましくは異なる配列である。好ましくは、スタッファー配列は、それらが挿入された細胞又はその子孫内に見出される配列と同一の配列を含む。さらなる実施形態では、核酸構築物は、二本鎖ＲＮＡをコードするオープンリーディングフレームに隣接するスタッファー領域を含む。

あるいは、核酸構築物は、例えば、二本鎖ＲＮＡをコードするオープンリーディングフレームに隣接する末端反転配列を特徴とするトランスポゾン （例えば、トランスポゾン） を含むことができる。適切なトランスポゾンの例としては、Ｔｏｌ２、ｍｉｎｉ−Ｔｏｌ、Ｓｌｅｅｐ Ｂｅａｕｔｙ、ＭａｒｉｎｅｒとＧａｌｌｕｈｏｐがある。

核酸構築物中に含まれる追加遺伝要素の他の例は、ＧＦＰ又はＲＦＰのような蛍光マーカータンパク質の１つ以上の遺伝子のようなレポーター遺伝子を含む。；β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、クロラムフェニルアセチル転移酵素、又は分泌された胚性アルカリホスファターゼなどの容易にアッセイされる酵素；ホルモンやサイトカインなどのイムノアッセイが容易に利用できるタンパク質。本発明の実施形態で使用される他の遺伝的要素は、アデノシンデアミナーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、又は薬物耐性などの細胞上で選択的成長優位性を与えるタンパク質をコードするものを含む。

核酸構築物を鳥類にトランスフェクトする場合、プロモーター及び付加的な遺伝要素は、鳥類のゲノム中に自然に生じるヌクレオチド配列からなることが望ましい。

場合によっては、核酸構築物をベクターに挿入することが望ましい場合がある。ベクターは、例えば、バクテリオファージ、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス又はヘルペスウイルス由来のプラスミド、ウイルス又は人工染色体であってよい。このようなベクターには、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、ウイルス由来ベクター、プラスミド及びバクテリオファージ遺伝要素、コスミド及びファージミド由来のベクターなどのベクター、バクテリオファージ、及びウイルス由来のベクターが含まれる。

一実施形態において、核酸構築物はプロモーターを含む。熟練者は、構成プロモーター、組織特異的又は開発段階特異的プロモーター又は誘導プロモーターのようなプロモーターを本発明において使用することができることを理解するであろう。一実施形態において、プロモーターはトリプロモーターである。一実施形態において、プロモーターはＰｏｌ Ｉ、Ｐｏｌ ＩＩ又はＰｏｌ ＩＩプロモーターである。トリプロモーターの例としては、７ｓＫ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、Ｕ６ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター（Ｂａｎｎｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００７； Ｍａｓｓｉｎｅ ｅｔ ａｌ．， ２００５）がある。

トランスジェニック鳥類
「トランスジェニック鳥類」は、細胞の１つ以上又は全部が遺伝子改変を含む鳥類を指す。「遺伝子改変」の例は、遺伝子及び／又は調節領域における欠失、置換又は挿入に限定されるものではない。「挿入」には、単一ヌクレオチドの挿入又は核酸構築物（「遺伝子導入遺伝子」）の挿入に限定されるものではない。一実施形態において、遺伝子改変はトランスジェニック鳥類の生殖系列にある。一実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼを用いて作製された遺伝子改変は、機能性タンパク質が産生されないような内因性の鳥抗ウイルス遺伝子のコード領域を変化させ、又はコードされたタンパク質が活性を低下させる。遺伝子改変は染色体外であるか、又は卵の核又はミトコンドリアゲノムに組み込まれる。

生殖系列における遺伝子改変を含むトランスジェニック鳥類は、生殖細胞系遺伝子改変を含むアビジン及び／又は卵の産生に使用することができる。本発明のトランスジェニック鳥類は遺伝子改変を含む卵の産生に使用され、遺伝子改変は遺伝子改変を欠いたアイソジェニック卵と比較して、卵内の抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質の発現を減少させる。一実施形態において、遺伝子改変は、その動物及び／又は子孫中の１つ以上の遺伝子及び／又はタンパク質の発現を減少させ、それらのトリ又はその子孫によって産生される卵を減少させる。一実施形態において、遺伝子ノックアウト動物を作製することができる。一実施形態において、標的生殖系列遺伝子改変は性染色体にある。別の実施形態において、標的胚ライン遺伝子改変は体細胞染色体である。別の実施形態において、遺伝子改変は、少なくとも受精卵のＤＮＡ（単一細胞期で）に導入される。熟練者が理解するように、この実施形態では、遺伝子改変は母方由来又は父方由来のＤＮＡ又はその両方に導入され得る。

トランスジェニック動物を製造する技術は、当技術分野において周知である。この主題に関する有用な一般的な教科書は、Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ， Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｎｉｍａｌｓ - Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ （Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ， １９９７）である。

異種ＤＮＡを例えば受精卵に導入することができる。例えば、全能性又は多能性幹細胞はマイクロインジェクション、リン酸カルシウム媒介沈殿、リポソーム融合、レトロウイルス感染などの手段によって形質転換され、形質転換細胞は胚に導入され、次いで胚はトランスジェニック動物に成長する。ある方法では、発育中の胚は所望のＤＮＡを含むレトロウイルスに感染し、感染した胚から産生されるトランスジェニック動物に感染する。しかし、別の方法では、適切なＤＮＡを胚の前核又は細胞質に注入し、好ましくは単細胞ステージで、胚は成熟トランスジェニック動物に発育させる。

トランスジェニック鳥類を生産するために用いられる別の方法は、標準的な方法によって核酸を核内ステージ卵にマイクロ注入することである。注入された卵は、偽妊娠のレシピエントの卵管に移す前に培養される。

トランスジェニック鳥類は核移植技術によって生産されることもある。この方法を用いて、ドナー動物からの線維芽細胞を、調節配列の制御下にある結合ドメイン又は結合パートナーに対するコード配列を組み込んだプラスミドによって安定にトランスフェクトする。安定したトランスフェクタントを核摘出卵母細胞に融合し、培養し、雌レシピエントに移す。

精子媒介遺伝子導入（ＳＭＧＴ）は、トランスジェニック動物を生成するのに用いられる別の方法である。この方法はＬａｖｉｔｒａｎｏ ｅｔ ａｌ． （１９８９）によって最初に記述された。

トランスジェニック動物を製造する別の方法は、リンカーベース精子媒介遺伝子導入技術（ＬＢ−ＳＭＧＴ）である。この手順は、米国特許第７０６７３０８号明細書で説明されているが、簡単には、収穫された精液を洗浄し、マウスモノクローナル抗体ｍＡｂＣ（ＡＴＣＣ加盟番号ＰＴＡ−６７２３によって分泌される）とインキュベートし、次いで、ＤＮＡを精液に結合させるモノクローナル抗体でインキュベートする。精子／ＤＮＡ複合体は人工授精され、雌に受精する。

トランスジェニック鳥類を生産するために使用される別の方法は、相同組換えである。この手法の一例として、Ｓｃｈｕｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３）．が挙げられる。Ｓｃｈｕｓｓｅｒ ｅｔ ａｌは、遺伝子特異的なノックアウトトリを作成するために、培養した始原生殖細胞において相同組換えすることによる標的遺伝子改変を記述している。

生殖細胞系トランスジェニックニワトリは、複製欠損レトロウイルスを新たに産卵された卵（米国特許第５，１６２，２１５号明細書； Ｂｏｓｓｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９８９； Ｔｈｏｒａｖａｌ ｅｔ ａｌ．， １９９５）のニワトリ胞胚の胚芽下腔に注入することによって産生される。外来遺伝子をもつレトロウイルス核酸は、胚細胞の染色体にランダムに挿入され、トランスジェニック動物を生成し、そのうちのいくつかは導入遺伝子を生殖系列に負担する。挿入部位における位置効果を克服するために融合遺伝子構築物の５’又は３’領域に挿入された絶縁体要素の使用について述べた（Ｃｈｉｍ ｅｔ ａｌ．， １９９３）。

生殖系列トランスジェニック動物を生成する別の方法は、例えばＴｏｌ２トランスポゾンを用いて、本発明の核酸構築物を動物のゲノムに統合することである。Ｋｏｇａ ｅｔ ａｌ． （１９９６）及びＫａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ． （２０００）に、メダカのｈＡＴファミリーに属する、最初に分離されたＴｏｌ２トランスポゾンが記述されている。Ｍｉｎｉ−Ｔｏｌ２はＴｏｌ２の変種であり、Ｂａｌｃｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）に記載されている。Ｔｏｌ２及びＭｉｎｉ−Ｔｏｌ２トランスポゾンは、Ｔｏｌ２トランスポザーゼと協調するときに、生物のゲノムへの導入遺伝子の組込みを促進する。別の非複製プラスミドにＴｏｌ２トランスポザーゼを送達することにより、Ｔｏｌ２又はＭｉｎｉ−Ｔｏｌ２トランスポゾンと導入遺伝子のみがゲノムに組み込まれ、Ｔｏｌ２トランスポザーゼを含むプラスミドは限られた数の細胞分裂内で失われる。したがって、統合されたＴｏｌ２又はＭｉｎｉ−Ｔｏｌ２トランスポゾンは、もはやその後の転位事象を受ける能力をもたない。さらに、Ｔｏｌ２は天然に存在するトリトランスポゾンであることが知られていないので、トリの細胞、例えばニワトリ細胞には内因性トランスポザーゼ活性がないため、さらなる転位事象を引き起こす。

他の任意の好適なトランスポゾン系を本発明の方法に使用することができる。例えば、トランスポゾン系は睡眠美容、Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ又はＭｏｓ１トランスポゾン系、あるいはトランスポゾンのｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ又はｈＡＴファミリーに属するトランスポゾンである。

鳥類胚幹細胞のレシピエント胚への注入は、キメラトリを産生するために、米国特許第７，１４５，０５７号明細書で記述され、その結果生じるキメラは、外来ＤＮＡからなるゲノムを有するトランスジェニック鳥類を産出する。

鳥類始原生殖細胞（ＰＧＣｓ）の長期培養からトランスジェニックニワトリを得る方法は、米国特許第２００６０２０６９５２号明細書で記載されており、既知の手順によって宿主鳥類胚と結合すると、これらの改変ＰＧＣは生殖細胞系を通じて伝播され、トランスジェニック子孫を生じる。

任意の適切なウイルスに基づくウイルス送達システムを使用して、本発明の核酸構築物を細胞に送達することができる。さらに、ハイブリッドウイルスシステムが使用される可能性がある。ウイルス送達システムの選択は、細胞、組織又は関心の臓器への送達の効率、システムの導入効率、病原性、免疫学的及び毒性に関する懸念などの様々なパラメータに依存する。すべての応用に適した単一のウイルス系がないことは明らかである。本発明で用いるウイルス送達システムを選択する際には、核酸構築物含有ウイルス粒子が好ましくは１） 再現性があり安定して伝播するシステムを選択することが重要である。；２） 高価に精製可能；３） 目標配送を仲介することができる（関心のある細胞、組織又は臓器への核酸発現構築物の送達、広範な播種）。

一実施形態において、トランスフェクション試薬は、本明細書に記載された単離された核酸分子、ポリヌクレオチド又は核酸構築物と混合され、国際公開第２０１３／１５５５７２号パンフレットに記載されたように、鳥類胚の血液中に直接注入され、この方法は本明細書では「直接噴射」と呼ばれる。このような方法を用いて、胚の始原生殖細胞（ＰＧＣ）に導入遺伝子を導入し、鳥類のゲノムに挿入する。直接注入は、プログラム可能なヌクレアーゼを投与するために使用することができる。

したがって、本明細書に定義される導入遺伝子及び／又は核酸構築物のようなポリヌクレオチドは、複合体又は適当なトランスフェクション試薬と混合され得る。本明細書で使用される用語「トランスフェクション試薬」は、原始生殖細胞のようなトリの細胞を含むが限定されない真核細胞へのポリヌクレオチドの取り込みを増強するためにポリヌクレオチドに添加される組成物を指す。真核細胞をトランスフェクトするために当技術分野で公知であるトランスフェクション試薬はいずれも用いられるが、カチオン性脂質を含むトランスフェクション試薬は特に有用である。カチオン性脂質を含む適切な市販のトランスフェクション試薬の非限定的な例としては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が挙げられる。

ポリヌクレオチドは、製造業者の指示又は既知のプロトコルに従って、トランスフェクション試薬と混合（又は「複合体」）され得る。例として、プラスミドＤＮＡをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でトランスフェクトする場合、ＤＮＡを５０μＬのＯｐｉｔ−ＭＥＭ培地中で希釈し、穏やかに混合することができる。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００試薬を、５０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地で穏やかに混合し、適当な量を希釈する。５分間インキュベートした後、希釈したＤＮＡ及びトランスフェクション試薬を組み合わせ、室温で２０分間穏やかに混合する。

次いで、本発明の方法に従って、適当な量のトランスフェクション混合物をトリ胚に直接注入することができる。典型的には、鳥類胚への注射のための適切な容積は約１μＬ〜約３μＬであるが、適当な容積は、胚のステージ及び注射される鳥類の種のような因子によって決定され得る。熟練者は、トランスフェクション試薬とＤＮＡを混合するためのプロトコル及び鳥類胚に注入されるボリュームを、本明細書の教示に照らして最適化することができることを理解するであろう。

注射前に、卵を胚発生の適温、例えば３７．５〜３８℃程度の温度でインキュベートし（１２−１７病期）、ポイントを約２．５日間上方に、又は胚の血管が注射を可能にする充分な大きさであるまでインキュベートする。トランスフェクション混合物の注入の最適時間は、典型的にはステージ１２〜１７付近で発生するが、より好ましくはステージ１３〜１４で起こるＰＧＣ移行の時間である。熟練者が理解するように、ブロイラー線鶏は典型的には胚を増殖させ、ＰＧＣ移行時にトランスフェクション混合物を血流中に導入するように、好ましくはステージ１３〜１４の初期に注射を行うべきである。

鳥胚の血管にアクセスするには、卵殻に穴を開ける。例えば、約１０ｍｍの孔を、鉗子などの適当な器具を用いて卵の尖端端に形成することができる。殻とそれに付随する膜の切片は、胚とその膜の損傷を避けながら注意深く除去される。

トリ胚の血管にトランスフェクション混合物を注入すると、卵は、当技術分野で公知の充分な量のパラフィルム又は他の適当なシーラント膜を用いて密封される。例えば、シェル内で１０ｍｍの穴を形成した場合、孔を覆うために、約２０ｍｍのパラフィルムを使用することができる。次いで、温かいメスの刃を用いて、パラフィルムを外側の卵表面に固定することができる。次に卵をポイント末端の位置にひっくり返し、その後の解析や孵化まで胚が発生するのに充分な温度でインキュベートする。直接注入技術は、米国特許第６１／６３６，３３１号明細書から優先権を主張する国際公開第２０１３／１５５５７２号パンフレットにさらに記載されている。

本発明の方法を用いて製造された動物及び／又は卵は、遺伝子改変の存在をスクリーニングすることができる。この方法は、当技術分野で公知の任意の適切な方法を用いて実行することができる。例えば、ゲノムＤＮＡサンプルのような核酸サンプルは、ゲノム中の標的部位（座位）に遺伝子改変が存在するかどうかを決定するための標準的なＤＮＡ増幅及び配列決定手順を用いて分析することができる。一実施形態において、スクリーニングはまた、動物及び／又は卵が遺伝子改変のためにホモ接合又はヘテロ接合であるかどうかも決定する。別の実施形態において、鳥に遺伝子改変が認められるかどうかを同定するために、鳥類をスクリーニングする。

ウイルス
本発明のトリの卵において産生されるウイルスは、トリの卵中に新たなウイルス粒子を複製し、生成することができる任意のウイルスを含む。このようなウイルスにはＤＮＡ及びＲＮＡウイルスが含まれる。一実施形態において、ウイルスは動物ウイルスである。一実施形態において、動物ウイルスはヒトウイルスである。一実施形態において、ウイルスは非ヒトウイルスである。一実施形態において、ウイルスは鳥ウイルスである。

本発明で使用するウイルスの例には、例えば、オルトミクソウイルス科、ヘルペスウイルス科、パラミクソウイルス科、フラビウイルス科、及びコロナウイルス科から選択されるウイルスが含まれる。一実施形態において、このウイルスは、オルソミノキソウイルス科のメンバーである。

オルソミックスウイルス科ウイルスは、例えばインフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、インフルエンザＣウイルス、イイウイルス、ソゴウイルス及び／又はＱｕａｒａｒｊａｖｉｒｕｓである。インフルエンザウイルスはインフルエンザＡウイルスかもしれません。インフルエンザＡウイルスは、動物から分離されたインフルエンザＡウイルスから選択される。一実施形態において、動物はヒト又は鳥である。特に、インフルエンザＡウイルスは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ１Ｎ３、Ｈ１Ｎ４、Ｈ１Ｎ５、Ｈ１Ｎ６、Ｈ１Ｎ７、Ｈ１Ｎ９、Ｈ２Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ２Ｎ３、Ｈ２Ｎ４、Ｈ２Ｎ５、Ｈ２Ｎ７、Ｈ２Ｎ８、Ｈ２Ｎ９、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ３、Ｈ３Ｎ４、Ｈ３Ｎ５、Ｈ３Ｎ６、Ｈ３Ｎ８、Ｈ４Ｎ１、Ｈ４Ｎ２、Ｈ４Ｎ３、Ｈ４Ｎ４、Ｈ４Ｎ５、Ｈ４Ｎ６、Ｈ４Ｎ８、Ｈ４Ｎ９、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ３、Ｈ５Ｎ６、Ｈ５Ｎ７、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ６Ｎ１、Ｈ６Ｎ２、Ｈ６Ｎ３、Ｈ６Ｎ４、Ｈ６Ｎ５、Ｈ６Ｎ６、Ｈ６Ｎ７、Ｈ６Ｎ８、Ｈ６Ｎ９、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ４、Ｈ７Ｎ５、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ８、Ｈ７Ｎ９、Ｈ９Ｎ１、Ｈ９Ｎ２、Ｈ９Ｎ３、Ｈ９Ｎ５、Ｈ９Ｎ６、Ｈ９Ｎ７、Ｈ９Ｎ８、Ｈ１０Ｎ１、Ｈ１０Ｎ３、Ｈ１０Ｎ４、Ｈ１０Ｎ６、Ｈ１０Ｎ７、Ｈ１０Ｎ８、Ｈ１０Ｎ９、Ｈ１１Ｎ２、Ｈ１１Ｎ３、Ｈ１１Ｎ６、Ｈ１１Ｎ９、Ｈ１２Ｎ１、Ｈ１２Ｎ４、Ｈ１２Ｎ５、Ｈ１２Ｎ９、Ｈ１３Ｎ２、Ｈ１３Ｎ６、Ｈ１３Ｎ８、Ｈ１３Ｎ９、Ｈ１４Ｎ５、Ｈ１５Ｎ２、Ｈ１５Ｎ８、Ｈ１５Ｎ９、及びＨ１６Ｎ３から選択してもよい。一実施形態において、インフルエンザＡウイルスはＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ７及び／又はＨ５Ｎ１から選択される。

ヘルペスウイルス科ウイルスは、例えば、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン−バーウイルス又はサイトメガロウイルスである。

パラミクソウイルス科ウイルスは、例えば、パラミクソウイルス亜科又は肺炎ウイルス亜科である。一実施形態において、パラミクソウイルス科はニューカッスル病ウイルスである。

フラビウイルス科は、例えば、フラビウイルス、ヘパシウイルス、ペギーウイルス、ペスチウイルスである。一実施形態において、フラビウイルス科は、アポイウイルス、アロアウイルス、バガザウイルス、バンジウイルス、ブブイウイルス、ブカラサコウモリウイルス、カシパコーウイルス、カレー島ウイルス、カウボーンリッジウイルス、ダカールコウモリウイルス、デングウイルス、エッジヒルウイルス、エンテベコウモリウイルス、ガジェッツガリーウイルス、イルヘウスウイルス、イスラエルトルコ脳膜脳脊髄炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、ジュグラウイルス、ジュチアパウイルス、カダムウイルス、ケロッグウイルス、ココベラウイルス、コウタンゴウイルス、キャサヌール森林病ウイルス、ランガットウイルス、跳躍病ウイルス、ミーバンウイルス、モドックウイルス、モンタナ筋炎白質脳炎ウイルス、マリーバレー脳炎ウイルス、ウンタヤウイルス、オムスク出血熱ウイルス、フノンペンコウモリウイルス、ポワッサンウイルス、リオブラボーウイルス、ロイヤルファームウイルス、サボヤウイルス、サルビージャウイルス、サンペリータウイルス、サウマレズリーフウイルス、セピクウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、テンブスウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、チュレーニーウイルス、ウガンダＳウイルス、ウスツウイルス、ヴェッセルスブロンウイルス、ウエストナイルウイルス、ヤオンデウイルス、黄熱病ウイルス、ヨコセウイルス、ジカウイルスであってもよい。

コロナウイルス科は、例えば、コロナウイルス又はコロウイルス亜科（Ｃｏｒｏｖｉｒｉｎａｅ）である。コロビリネーウイルスは、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、デルタコロナウイルス、又はガンマコロナウイルスである。トロウイルスは、アルファコロナイルス又はベータコロナウイルスである。実施例では、コロナウイルスはＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群）コロナウイルスであってもよい。

一実施形態において、ウイルスは、インフルエンザウイルス、イヌジステンパーウイルス、麻疹ウイルス、レオウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、鶏痘ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ムンプスウイルス、ウマ脳脊髄炎、風疹ウイルス、軟卵症候群ウイルス、トリ腫瘍退縮ウイルス、トリ感染性喉頭気管炎ヘルペスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ウシパラインフルエンザウイルス、天然痘ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、ウシイバラキウイルス、組換えポックスウイルス、トリアデノウイルスＩ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ、ブタ日本脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス、ヘルペスウイルス、シンドビスウイルス、感染性気管支炎ウイルス、セムリキ森林ウイルス、脳脊髄炎ウイルス、ベネズエラＥＥＶウイルス、ニワトリ貧血ウイルス、マレック病ウイルス、パルボウイルス、口蹄疫ウイルス、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、ブタコレラウイルス、ブルータングウイルス、カバネウイルス、伝染性サケ貧血ウイルス、伝染性造血器壊死症ウイルス、ウイルス性出血性敗血症ウイルス、及び伝染性膵臓壊死症ウイルスから選択される。

卵におけるワクチン生産
トリの卵でウイルスを複製し、これらの卵からワクチンを製造する方法は、７０年以上にわたり、この技術分野でよく知られている。例えば、インフルエンザワクチン組成物を製造する従来の方法は、典型的には、胚形成鶏卵におけるウイルスの増殖を含む。次いで、この方法によって増殖させたウイルスは、例えば弱毒化ウイルスを産生するために使用され、全ウイルス又はサブユニットのワクチン組成物を死滅させる。インフルエンザワクチン組成物の製造方法の１つは、１０〜１１日齢の鶏卵に生インフルエンザウイルスを接種することである。この接種ワクチンウイルスを、ウイルスの豊富な尿中液（Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， ２００２）の収穫前にウイルス複製を可能にするために、所定期間、例えば２日以上インキュベートする。一例において、所定時間は少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間若しくは少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間又は少なくとも１０日間である。

典型的な手術では、卵をろうそくにしなければならず、殻は滅菌され、各卵は少量のウイルスを卵管腔に注射しなければならない。注入された卵を、その後、３３°−３７℃で４８〜７２時間インキュベートし、再びキャンドルをキャンドルし、一晩冷蔵し、そして、尿中流体の収穫を可能にする。次いで、収穫された流体を濾過及び／又は遠心分離によって明確にして、さらなる精製のために処理することができる。「不活化インフルエンザワクチンに対する需要（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ Ｆｏｒ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖａｃｃｉｎｅ）、世界保健期間技術報告集（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｓｅｒｉｅｓ）、３８４（１９６６）」。米国で市販されているインフルエンザワクチンの多くは、胎生鶏卵で増殖している。一実施形態において、卵は鶏卵であり、ウイルスは８日目から１１日目に収穫され、一実施形態では卵は鶏卵であり、ウイルスは１０日頃に収穫される。

卵から複製されたウイルス又はその粒子の採取
複製されたウイルス又はその粒子（分裂ウイルス粒子やサブユニットウイルス粒子など）は、熟練者に公知の任意の方法によって卵の卵、好ましくは卵の尿中の流体から収穫することができる。例えば、複製されたウイルス又はその粒子の収穫は、明確化、濃度、不活性化、ヌクレアーゼ処理、分離／精製、研磨及び無菌濾過の１つ以上のステップを含むことができる（Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．， ２００８； Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．， ２０１１； Ｋａｌｂｆｕｓｓ ｅｔ ａｌ．， ２００６； Ｊｏｓｅｆｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）。一実施例において、遠心分離、微小濾過及び／又は深さ濾過によって明らかにする。一実施例において、濃縮は遠心分離、限外濾過、沈殿、モノ石及び／又は膜吸着器によって行われる。一実施例において、不活性化はＵＶ、熱又は化学処理によって行われる。不活性化の化学的形態としては、ホルマリン、バイナリーエチレンイミン、βプロピオラクトンなどが挙げられる。一実施形態において、ヌクレアーゼ処理はベンゾナーゼによる処理である。一実施例において、分離／精製は超遠心分離（密度勾配例）、ビーズクロマトグラフ（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー又はアフィニティークロマトグラフィー）、及び／又は膜吸着器（例えばイオン交換クロマトグラフィー又はアフィニティークロマトグラフィー）によって行われる。一実施例において、研磨は限外濾過及び／又は濾過によって行われる。一実施例において、ウイルス又はウイルス粒子は、アルコール又はポリエチレングリコール沈殿によって濃縮され得る。一実施例において、複製されたウイルス又はそれらの粒子の収穫は、Ｇｒｅｉｎ ｅｔ ａｌ． （２０１３）に記載されるように、膜の使用を含む。

別の実施例において、複製されたウイルスの収穫は、分割ワクチン組成物又はサブユニットワクチン組成物（Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．， ２００８； Ｊｏｓｅｆｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）に対して適当なサイズのウイルス粒子を産生するウイルス破壊工程を含むことができる。このような工程は、分割ワクチン組成物又はサブユニットワクチン組成物に対して適当なサイズのウイルス粒子を製造する任意の方法であることができる。一実施例において、破壊工程は洗剤可溶化である。

熟練者は、収穫されたウイルス（全体の減衰又は不活性化）又は収穫されたウイルス粒子（ウイルス粒子又はサブユニットウイルス粒子を分割する）がワクチン組成物に処方され得ることを理解するであろう。このような組成物は、アジュバント、賦形剤、バインダー、保存剤、キャリアカップリング、緩衝剤、安定化剤、乳化剤、湿潤剤、湿潤剤、非ウイルスベクター及びトランスフェクション促進化合物の１つ以上を含むことができる（Ｊｏｓｅｆｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１１； Ｊｏｎｅｓ， ２００８）。熟練者は、このようなワクチン組成物が凍結乾燥できることをさらに理解するであろう。一実施例において、製造されたワクチン組成物はヒトの使用に適している。一実施例において、製造されたワクチン組成物は獣医学的使用に適している。

実施例１−中和抗体によるインターフェロン反応の中断が卵におけるウイルス収量を増加させる
ＣｈＩＦＮα、ＣｈＩＦＮβ、ＣｈＩＦＮγ、及びＣｈＩＦＮλのＯＲＦを、ｐＱＥ５０発現系を用いてＴｏｐ Ｆ’１０エシェリキア・コリ（大腸菌）に発現させ、ＩＰＴＧを用いた誘導後に、Ｎｉ‐ＮＴＡ‐アガロースを用いて精製し精製した。ｒｃｈＩＦＮの生物活性をウイルス中和アッセイ（Ｌｏｗｅｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．， １９９５）を用いて測定した。ｒｃｈＩＦＮは、濃度範囲にわたって細胞を保護するため、生物学的に活性（図１）である。

ｒｃｈＩＦＮを免疫原として用い、同種組換えタンパク質に対するウサギ抗血清を生成した。ニュージーランド雌白色ウサギにキラヤサポナリア（Ｑｕｉｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ、クイルＡ）カクテルアジュバントのｒｃｈＩＦＮタンパク質を７回まで皮下免疫した。ウサギ抗ｃｈＩＦＮ抗血清中の球状血清タンパク質を濃縮するために硫酸アンモニウムを用いた。濃縮された抗血清は、卵中注射用抗体の０．２μｍフィルター滅菌（サルトリウス）前の分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）ＮＤ−１０００、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）を用いて定量した。血清の反応性とポリクローナル抗体認識を用い、間接ＥＬＩＳＡ分析を行った。簡単に言えば、精製されたｒｃｈＩＦＮを、Ｔｉｅｒｔｅｋ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ Ｐｌｕｓプレートリーダー上の４５０ｎｍで読み取られた９６ウェルＥＬＩＳＡプレート中のコーティング緩衝液中で５μｇ／ｍＬに希釈した。分析は、対応するタンパク質に対する血清の用量効果反応性を示した（図２Ａ）。

次に、胎齢日１０〜１１日のＨｙｌｉｎｅ褐色卵（ハイライン（オーストラリア））を抗体及び／又はウイルスを用いて尿中液を介して接種した。インフルエンザウイルス（ＣＳＬ Ｐｔｙ Ｌｔｄ．により提供）の株を、１％ネオマイシン／ポリミキシンを含むウイルス希釈液中で１０‐５に希釈した。卵のＰＲ８（Ｈ１Ｎ１型）又はＨ５Ｎ１ワクチンウイルス（ＮＩＢＲＧ−１４）（ＣＳＬ（オーストラリア））接種を別々に行った。精製抗ｃｈＩＦＮ及び抗ｃｈＩＬ−６抗体を、卵あたり１０００μｇ、２００μｇ又は２０μｇのいずれかの卵に接種するためのウイルス希釈液で希釈した。接種卵を３５℃で４８時間インキュベートした。

卵をインキュベーション後にキャンドルを用いて、収穫に備えて４℃で冷却Ｏ／Ｎを冷却する前に生存性を確認した。さらに分析用に各卵から尿膜の流体（５ｍＬ）を除去した。ＨＡアッセイは収穫と同じ日に実施した。簡単に述べれば、漿液試料をＰＢＳ中で１／２５希釈し、丸底底部９６ウェルプレート（ＩＣＮバイオケミカル）の最後の行に複製した。洗浄したニワトリＲＢＣの０．５％μＬを全てのウェルに添加し、穏やかにタップし、ＲＴを少なくとも５０ ４０分間室温で放置し、ＨＡ末端点を決定した。インビボ実験では、全濃度における抗ｃｈＩＦＮ‐α抗体（図２Ｂ）及び抗ｃｈＩＦＮ‐β抗体（図２Ｃ）は、卵中のＰＲ８又はＮＩＢＲＧ‐１４ウイルスのＨＡ価に有意な影響を及ぼさないことを示した。しかしながら、抗ｃｈＩＦＮ‐λ抗体（図３Ａ）は、２００μｇ／卵（ｐ＝０．０４）で投与した場合、ＰＲ８ウイルスの滴定を統計的に改善することが示された。１０００μｇ／卵（ｐ＝０．００４５）及び２０μｇ／卵（ｐ＝０．０００１）で抗体を注入すると、Ｈ５Ｎ１ワクチンウイルスタイターは統計的に改善され、１．５倍になった。同様に、抗ｃｈＩＦＮ‐γ抗体（図３Ｂ）は１０００μｇ／卵（ｐ＝０．０１５）で接種するとＨ５Ｎ１ワクチンウイルスのＨＡ価を改善することができた。さらに、抗ｃｈＩＬ‐６抗体（図３Ｃ）は、卵中のＨ５Ｎ１ワクチンウイルス価も統計的に増強した。

実施例２−インビトロでのｓｉＲＮＡによる多数の遺伝子の破壊がウイルス力価を増加させる
抗ウイルス機能をもつ遺伝子候補を同定するために、一連の遺伝子を小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）アッセイにより評価した。ＤＦ‐１細胞を、トリインフルエンザ（ＡＩ）ウイルスの感染前に、ｓｉＲＮＡの多重（スマートプール）をｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。結果は、ＫＤ後のウイルス価が細胞に対して明白な毒性効果を示さないことを示した（図４）。少なくともいくつかの例では明らかな影響は認められなかったが、これは、効率的なＫＤを産生するのに充分な早期にｓｉＲＮＡが投与されないためであろう（例えば、抗ＩＬ６抗体データを考えると、図４のＩＬ−６ｓｉＲＮＡデータを説明するであろう）。ＣＮＯＴ４、ＩＦＮＡＲ、又はＭＤＡ５に対して、個々のスマートプールｓｉＲＮＡの細胞生存性及び遺伝子サイレンシングに対する効果を評価した（図５）。

実施例３−卵中のｓｈＲＮＡによる多数の遺伝子の下方制御がウイルス力価を増加させる
卵分析において、ｓｉＲＮＡを、合計２００μＬのポリマーの４：１のモル比で、２ｎｍｏｌのｓｉＲＮＡへＡＢＡ−２１／１１７Ｑ／ＰＦポリマー（ＡＢＡ−２１／１１７Ｑ；ＰｏｌｙＦｌｕｏｒ５７０染料ラベルのないポリマー）と複合体として送達した。錯体は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の存在下で水溶液中で形成された。水に再懸濁させた必要量のポリマー（３１６μｇ）をチューブに加え、ボルテックスにより混合した。次いで、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ３０μｇ又はｓｉＡｎｔＩＦＮＡＲ１ ２４．５μｇに相当する合計２ｎｍｏｌを試験管に加え、試料をボルテックスした。錯体を室温で１時間継続した。複合体を、皮質尿液中に直接注入した。４８時間後にウイルスを注射し、ウイルス感染後２４時間後に採取した。結果は、ＩＦＮＡＲ１（図６及び図７）のＫＤ後のウイルス増殖の増加を示した。

実施例４−ニワトリにおけるＩＦＮＡＲ１遺伝子の欠失がインビトロにてウイルス力価を増加させる
ニワトリインターフェロン（アルファ、ベータ、オメガ）受容体１、ＩＦＮＡＲ１（遺伝子番号：３９５６６５）の永久的欠失がウイルス収量に及ぼす影響を調べる；ニワトリ胚線維芽細胞（ＤＦ−１）の連続細胞株からのＫＯ細胞株が発生した。微生物クラスタ化した周期的に間隔を置いた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）系からＲＮＡ誘導Ｃａｓ９ヌクレアーゼを用いて２つの異なる単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を二本鎖切断を生成するために設計した。ｓｇＲＮＡは（Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）に従ってクローニングされ、対応する構築物は、約２００ｂｂの欠失をコードするＤＦ−１細胞に、完全に転写開始部位（ＴＳＳ）及びＩＦＮＡＲ１前駆体のエキソン１を除去した。ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ^TM細胞ソーターを用いて選別後単離した。ゲノムＰＣＲスクリーニング後に各クローンの欠失を同定し、野生型と単アレル性及び対立遺伝子標的細胞株を区別した。

約３０％の対立遺伝子のトランスフェクション後、２００ｂｐ以上の欠失が認められ、アンプリカムのクローニングと配列決定によって確認された。単一クローンへの細胞選別後、細胞をｇＤＮＡ ＰＣＲによってスクリーニングし、単アレル性及び二アレル性細胞株を単離した。さらに、誘導欠失は遺伝子用量依存的に遺伝子の発現を阻害し、単アレル細胞株は野生型と比較して発現の半分レベルを示し、二対立形質細胞株はゼロに近いレベルを示した。この効果はウイルス又はポリ（Ｉ：Ｃ）に挑戦した後も持続し、自然応答の強い誘導子であった（図８Ａ、Ｂ、Ｃ）。

ワクチン生産に及ぼす欠失の影響を評価するために、Ｈ１Ｎ１株Ａ／ＷＳＮ／１９３３を高い感染度と低い多重度（それぞれ１及び０．１ ＭＯＩ）で使用した。このアプローチを使用すると、１０時間の感染後の二アレル性細胞株において、プラーク形成単位（プフ）アッセイで測定した場合、野生型細胞株の約３倍のレベルでウイルス収量が著しく増加する。また、分離したウイルスは親細胞株（図８Ｄ）と比較して、両アレル細胞株から５倍高いＴＣＩＤ５０を示した。

実施例５−ヘンドラウイルスに対する抗ウイルス遺伝子のスクリーニングと同定
ヒトＨｅＬａ細胞におけるヘンドラウイルス（ＨｅＶ）感染に必要なタンパク質を調べるｓｉＲＮＡスクリーニングにおいて、ウイルス産生に関連する多数の遺伝子が同定された。ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２）（Ｅａｇｌｅｓ改良イーグル培地；ＥＭＥＭ）を、１０％ ｖ／ｖ胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン及び１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加した成長培地中で維持した。ＨｅＬａ細胞（７ｘ１０４）を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中のＤｈａｒｍａｆｅｃｔ−１（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、一晩逆トランスフェクトし、培地を除去し、トランスフェクション培地（増殖培地から抗生物質）及び細胞をさらに２４時間インキュベートした。培地をトランスフェクション後約６時間（ｈ．ｐ．ｔ．）交換し、さらに１８時間インキュベートした。次いで、細胞をヘンドラウイルス（ＨｅＶ）に感染させた（ヘンドラウイルス／オーストラリア／ウマ／１９９４／ヘンドラ）。５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）について、組織培養上清の１０倍希釈を９６ウェル組織培養中で培地中で作製した。プレートを３７℃及び５％ ＣＯ２で３日間（ハイブ）インキュベートし、細胞変性効果をスコア化した。感染力価はＲｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ（１９３８）法により計算した。サイレンシングされた遺伝子に対するウイルス複製を非標的ｓｉＲＮＡ制御（サイド）と比較した。ウイルス複製の有意な増加は多数の遺伝子（図９及び表２参照）のサイレンシングにより観察された。ＡＤＣＹ７のサイレンシングは、ウイルス量の最大増加を示した（表２参照）。

多数の変形及び／又は修正が、広範に解説されるような本発明の主旨又は範囲から逸脱せずに、特定の実施形態において示される本発明に対して行われてもよいということは、当業者に理解されよう。本実施形態は、したがって、全ての点で例示的なものであり、限定的なものではないことが理解されよう。

本出願は、２０１５年１１月２４日出願の「トリの卵におけるウイルスの生産」と題される豪州仮出願第２０１５９０４８５４号の優先権を主張するものであり、その出願の全内容を参照により本明細書に援用される。

本明細書に記載及び／又は参照されるすべての刊行物は、本明細書に全体として援用される。

本明細書中に含まれている文書、行為、材料、装置、物品等についてのあらゆる議論は、本発明の文脈を提供する目的のみで行われる。これらの事項のいずれか又は全てが、先行技術分野の基礎の一部を形作るか、又は本出願の各請求項の優先日以前に存在していたような本発明に関連する当該技術分野において一般的な知識であったということは、承認されるものではない。

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Claims (34)

1. トリの卵であって、
   （１）遺伝子改変を欠くアイソジェニック卵と比較した場合、卵における抗ウイルス遺伝子の発現を減少させる遺伝子改変、並びに／又は、
   （２）外因性化合物であって、当該化合物を欠くアイソジェニック卵と比較した場合、卵における抗ウイルス遺伝子の発現を減少させるか、及び／又は抗ウイルスタンパク質活性のレベルを減少させる、外因性化合物
   を含み、前記卵は、アイソジェニック卵よりも多くのウイルスを産生することができる、トリの卵。
2. 前記抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質が、以下の：ＩＦＮＡＲ１、ＩＬ−６、ＣＮＯＴ４、ＭＤＡ５、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮλ、ＢＡＣＥ２、ＵＢＡ５、ＺＦＰＭ２、ＴＲＩＭ５０、ＤＤＩ２、ＮＰＲ２、ＣＡＰＮ１３、ＤＮＡＳＥ１Ｌ２、ＰＨＦ２１Ａ、ＰＣＧＦ５、ＩＬ２８ＲＡ、ＩＦＩＨ１、ＩＬ−１ＲＡ、ＬＡＭＰ１、ＥＦＲ３Ａ、ＡＢＩ１、ＧＡＤＬ１、ＰＬＶＡＰ、ＣＹＹＲ１、ＡＳＡＰ１、ＮＸＦ１、ＮＳＵＮ６、ＡＮＧＰＴＬ７、ＳＩＬ１、ＢＣＡＲ３、ＧＯＬＰＨ３Ｌ、ＨＮ１、ＡＤＣＹ７、ＣＢＬＮ４、ＣＸＯＲＦ５６、ＤＤＸ１０、ＥＩＦ２Ｓ３、ＥＳＦ１、ＧＣＯＭ１、ＧＴＰＢＰ４、ＩＦＴ４３、ＫＰＮＡ３、ＬＲＲＩＱ１、ＬＵＣ７Ｌ、ＭＲＰＬ１２、ＰＯＬＲ３Ｅ、ＰＷＰ２、ＲＰＬ７Ａ、ＳＭＹＤ２、ＸＰＯ１、及びＺＫＳＣＡＮ７のうち１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれより多くから選択される、請求項１に記載のトリの卵。
3. 前記抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質が、以下：ＩＦＮＡＲ１、ＩＬ−６、ＣＮＯＴ４、ＭＤＡ５、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、及びＩＦＮλのうちの１つ、２つ、３つ、４つ又は全てから選択される、請求項１又は２に記載のトリの卵。
4. 前記遺伝子改変が、前記卵のゲノム内に存在する、請求項１から３のいずれか一項に記載のトリの卵。
5. 前記遺伝子改変が、プログラム可能なヌクレアーゼによって導入された、請求項１から４のいずれか一項に記載のトリの卵。
6. 前記ヌクレアーゼが、ＲＮＡ誘導操作ヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）、転写活性化因子様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）から選択される、請求項５に記載のトリの卵。
7. 前記ヌクレアーゼが、ＲＮＡ誘導操作ヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）である、請求項６に記載のトリの卵。
8. 導入した前記ヌクレアーゼが、欠失、置換、又は挿入を前記抗ウイルス遺伝子又はその調節領域へ導入した、請求項４から７のいずれか一項に記載のトリの卵。
9. 前記遺伝子改変が、前記卵における抗ウイルス遺伝子の前記発現を減少させるポリヌクレオチドをコードする導入遺伝子である、請求項１から４のいずれか一項に記載のトリの卵。
10. 前記ポリヌクレオチドが、前記抗ウイルス遺伝子、二本鎖ＲＮＡ分子、又はそれに由来する処理されたＲＮＡ分子によってコードされたタンパク質を結合するポリペプチドをコードする、アンチセンスポリヌクレオチド、センスポリヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、ポリヌクレオチドである、請求項９に記載のトリの卵。
11. 前記外因性化合物が、炭素系小分子、タンパク質結合剤、プログラム可能なヌクレアーゼ、ポリヌクレオチド、又はこれらのうち２つ以上の組合せである、請求項１から３のいずれか一項に記載のトリの卵。
12. 前記タンパク質結合剤又は前記ポリヌクレオチドが、前記卵へ投与される導入遺伝子から発現される、請求項１１に記載のトリの卵。
13. 前記導入遺伝子が、前記卵において培養されるウイルス中に存在する、請求項１２に記載のトリの卵。
14. 前記タンパク質結合剤が、抗体である、請求項１１から１３のいずれか一項に記載のトリの卵。
15. 前記ウイルスが、動物ウイルスである、請求項１から１４のいずれか一項に記載のトリの卵。
16. 前記動物が、ヒトである、請求項１５に記載のトリの卵。
17. 前記ウイルスが、オルトミクソウイルス科、ヘルペスウイルス科、パラミクソウイルス科、フラビウイルス科、及びコロナウイルス科から選択される科である、請求項１５又は請求項１６に記載のトリの卵。
18. インフルエンザウイルス、イヌジステンパーウイルス、麻疹ウイルス、レオウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、鶏痘ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ムンプスウイルス、ウマ脳脊髄炎、風疹ウイルス、軟卵症候群ウイルス、トリ腫瘍退縮ウイルス、トリ感染性喉頭気管炎ヘルペスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ウシパラインフルエンザウイルス、天然痘ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、ウシイバラキウイルス、組換えポックスウイルス、トリアデノウイルスＩ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ型、ブタ日本脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス、ヘルペスウイルス、シンドビスウイルス、感染性気管支炎ウイルス、セムリキ森林ウイルス、脳脊髄炎ウイルス、ベネズエラＥＥＶウイルス、ニワトリ貧血ウイルス、マレック病ウイルス、パルボウイルス、口蹄疫ウイルス、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、ブタコレラウイルス、ブルータングウイルス、カバネウイルス（Ｋａｂａｎｅ ｖｉｒｕｓ）、伝染性サケ貧血ウイルス、伝染性造血器壊死症ウイルス、ウイルス性出血性敗血症ウイルス（Ｖｉｒａｌ ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）、並びに伝染性膵臓壊死症ウイルスから選択される、請求項１７に記載のトリの卵。
19. 前記ウイルスが、インフルエンザウイルスである、請求項１８に記載のトリの卵。
20. 鶏卵である、請求項１から１９のいずれか一項に記載のトリの卵。
21. 前記ウイルスを含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載のトリの卵。
22. ウイルスを複製する方法であって、
    （１）遺伝子改変を含む請求項１から２０のいずれか一項に記載のトリの卵を得ること、
    （２）当該卵にウイルスを播種すること、及び、
    （３）所定の時間にわたり卵を培養して、ウイルスを複製させること、を含む、方法。
23. ウイルスを複製する方法であって、
    （１）トリの卵を得ること、
    （２）化合物であって、当該化合物を欠くアイソジェニック卵と比較した場合、抗ウイルス遺伝子の発現を減少させるか、及び／又は卵における抗ウイルスタンパク質活性のレベルを減少させるところの化合物を投与すること、
    （３）卵にウイルスを播種すること、並びに、
    （４）所定の時間、卵を培養して、ウイルスを複製させること
    を含む、方法。
24. 前記卵由来の前記複製したウイルス又はその粒子をさらに含む、請求項２２又は請求項２３に記載の方法。
25. 前記収穫が、前記卵から前記尿膜腔液を得ることを含む、請求項２４に記載の方法。
26. 請求項１から２１のいずれか一項に記載のトリの卵を用いることか、及び／又は請求項２２から２５のいずれか一項に記載の方法を用いることで産生される、ウイルス。
27. ワクチン組成物を生産する方法であって、
    （１）請求項２２から２５のいずれか一項に記載の方法を用いてウイルスを複製すること、
    （２）卵に由来する複製されたウイルス、又はその粒子を収穫すること、及び、
    （３）収集されたウイルスからワクチン組成物を調製すること、を含む、方法。
28. ステップ（２）又はステップ（３）が、前記ウイルスを不活化することを含む、請求項２７に記載の方法。
29. 請求項２７又は請求項２８に記載の方法を用いて製造したワクチン組成物。
30. 遺伝子改変は、遺伝子改変を欠くアイソジェニック鳥類によって生産された卵と比較して、前記鳥類によって生産された卵における抗ウイルス遺伝子の発現を減少させる、遺伝子改変を備えるトランスジェニック鳥類。
31. （１）遺伝子改変をトリの細胞に導入すること、
    （２）細胞からメスのトリを生産すること、
    （３）メスのトリから１つ以上の卵を得ること、及び遺伝子改変を欠くアイソジェニック卵よりも多くのウイルスを生産する能力に関して卵をスクリーニングすること、
    （４）遺伝子改変を欠くアイソジェニック卵よりも多くのウイルスを生産する遺伝子改変を有する卵を生産する、メスのトリを選択すること、並びに、
    （５）随意に、メスのトリを用いてより多くのトリを繁殖させること、を含む、請求項３０に記載のトリを生産する方法。
32. 前記遺伝子改変が、前記細胞の前記ゲノムである、請求項３１に記載の方法。
33. 前記遺伝子改変が、プログラム可能なヌクレアーゼによって導入される、請求項３１又は請求項３２に記載の方法。
34. 前記トリが、ニワトリである、請求項３１から３３のいずれか一項に記載の方法。