CN111920821A - 番茄碱在制备抗病毒药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种番茄碱在制备抗病毒药物中的应用。番茄碱具有抑制半胱氨酸蛋白酶活性的新功能，对含3CLpro的病毒均有广谱抑制作用，可用于抗病毒药物研发。

Description

番茄碱在制备抗病毒药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种番茄碱在制备抗病毒药物中的应用。
背景技术
猪流行性腹泻病毒(PEDV)是一种单股正链RNA病毒，属于冠状病毒科冠状病毒属成员，主要引起感染猪水样腹泻。2012年我国PEDV流行毒株出现变异，引起全国猪群暴发流行，商品疫苗不能提供有效保护，造成严重经济损失。2013年PEDV变异株传入美国，并迅速传播美国16个洲，引起规模化猪场仔猪严重腹泻，经济损失巨大。迄今尚无有效疫苗。PEDV基因组编码一种半胱氨酸蛋白酶(Nsp5)，称为3CL蛋白酶(3CLpro)，在病毒复制过程中发挥重要作用。冠状病毒科冠状病毒属成员较多，可通过呼吸道和消化道传播，造成严重经济损失和公共卫生问题，包括严重急性呼吸系统综合症(SARS)和中东呼吸综合征(MERS)，以及引起猪腹泻的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)。这些病毒均含有3CLpro。此外，微RNA 病毒和动脉炎病毒也含有3CLpro，如口蹄疫(FMDV)、脑心肌炎病毒(EMCV)、塞尼卡谷病毒(SVA)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等，在我国人和动物中普遍存在。因此，研究开发新的广谱特异性抗病毒药物十分必要和迫切。
天然产物，特别是传统中草药因在临床治疗病毒感染性疾病中疗效显著，成为研发新药的宝贵资源，如著名的抗癌药物紫杉醇和抗疟疾青蒿素。番茄碱(Tomatidine)，是从青色番茄中提取的一种天然化合物，又称番茄胺、番茄定，化学式C27H45NO2，分子量415.65。番茄碱具有多种生物活性，能够保护番茄自身生长过程中免受细菌、真菌、病毒和某些昆虫的侵害，可增强肌肉并防止肌肉萎缩，通过阻断NF-κB和JNK信号发挥抗炎作用。番茄碱毒性很小，口服适量无毒性反应。2019年荷兰学者首次报道番茄碱通过控制宿主细胞蛋白激活转录子4(ATF4)抑制登革热病毒复制(Antivirus Res 2019)。迄今，尚无其它番茄碱拮抗病毒及其分子机制的研究报道。
发明内容
为了解决以上现有技术中急需广谱特异性抗病毒药物的问题，本申请提供了一种番茄碱在抑制半胱氨酸蛋白酶活性中的应用。
本发明还提供了番茄碱在抑制病毒复制中的应用。
本发明还提供了番茄碱在制备抗病毒制剂中的应用
本发明是通过以下步骤得到的：
番茄碱在抑制半胱氨酸蛋白酶活性中的应用。
番茄碱对半胱氨酸蛋白酶活性的抑制作用随番茄碱浓度增大而增大。
番茄碱浓度为50μM和25μM时，对半胱氨酸蛋白酶活性抑制率分别为75.5％和47.1％，可高达80％～90％。
番茄碱在抑制病毒复制中的应用。
所述病毒为含有3C或3CL蛋白酶的小RNA或微RNA病毒样病毒，优选为冠状病毒、动脉炎病毒。更优选为冠状病毒TGEV，动脉炎病毒PRRSV，猪脑心肌炎病毒EMCV 或塞内卡病毒SVA。
番茄碱在抑制病毒感染中的应用。
番茄碱在制备抗病毒制剂中的应用。
本发明的有益效果：
1)本研究发现番茄碱(Tomatidine)可有效抑制PEDV复制，细胞毒性作用CC50为45.9μM，抑制病毒IC50为3.44μM。通过药物分子与病毒蛋白分子对接和分子动力学生物信息学模拟分析，发现番茄碱与PEDV 3CL蛋白酶活性口袋的关系最为密切。采用含3CLpro剪切条带可视化方法和荧光共振能量转移试验(FRET)方法证实，番茄碱能够有效抑制PEDV 3CL蛋白酶活性，从而抑制病毒核酸转录，抑制病毒复制，抑制效率达90％以上。通过Westernblot 和qPCR研究发现，番茄碱可有效抑制TGEV、PRRSV、EMCV和SAV复制，病毒抑制效率为80％～90％。
2)本研究首次报道番茄碱具有抑制半胱氨酸蛋白酶活性的新功能，对含3CLpro的病毒均有广谱抑制作用，可用于抗病毒药物研发。
附图说明
图1为番茄碱抗PEDV复制的剂量范围筛选数据汇总图；
图2为不同浓度番茄碱抗PEDV感染和复制作用的阶段的数据汇总图；
图3为番茄碱对接到PEDV不同复制酶的活性口袋中数据汇总图；
图4为荧光共振能量转移试验测定番茄碱抑制3CL蛋白酶活性数据汇总图；
图5为不同浓度番茄碱对TGEV、PRRSV、EMCV和SVA抗病毒效果数据汇总图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：
实施例1
1材料与方法
1.1细胞与病毒
Vero细胞，ST细胞，Macr-145细胞和BHK-21细胞由本实验室保存。传代于Vero细胞的PEDV MS，YZ，SH和CV777毒株，传代于ST细胞的TGEV JS2012，传代于Marc-145 细胞的PRRSV BB0907，传代于BHK-21细胞的EMCV NJ08和SVA CH-SD均由本实验室保存。
1.2主要试剂
用于体外实验的番茄碱购自Selleck Chemicals公司，纯度为>99％。
1.3细胞活力检测
用含有不同浓度番茄碱的DMEM-10％FBS培养Vero细胞，37℃孵育48h。细胞活力用增强型CCK8试剂盒检测(Beyotime)。用GraphPad Prism 6.0软件计算出使50％细胞产生细胞毒性的番茄碱浓度(CC50)。同时采用DMSO作为阴性对照。
1.4 PEDV感染抑制试验
采用间接免疫荧光法(IFA)检测番茄碱对感染Vero细胞PEDV复制的影响。连续稀释番茄碱添加到培养基中，使其最终浓度为0.5、2、4、6、8和10μM。阴性对照为DMSO。接种PEDV 0.01MOI，37℃孵育16h。用4％多聚甲醛固定Vero细胞20min,PBS洗涤，0.1％TritionX-100 37℃透膜20min。将处理后的细胞与本实验室制备的小鼠抗PEDV N蛋白单克隆抗体(1:2000稀释)在37℃孵育2h。PBS洗涤3次，加入FITC标记山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体(1:200稀释)(Beyotime)37℃孵育1h。使用DAPI染液(Beyotime)对细胞核进行染色。PBS洗涤后，在荧光倒置显微镜下观察细胞，利用ImageJ软件测定荧光总密度。用ZEN blue软件合并N 蛋白荧光图像和DAPI图像。采用Graphpad Prism 6.0软件测定抑制50％病毒的番茄碱浓度(IC50)。选择性指数(SI)为CC50与IC50的比值。
1.5蛋白质免疫印迹试验(Western blot)
细胞处理后，在细胞孔内添加100uL RIPA裂解液(Beyotime)在冰上裂解15min，收集细胞裂解蛋白进行SDS-PAGE电泳，半干法转移至硝化纤维素膜上。将膜置于5％脱脂乳封闭缓冲液中室温孵育2h，加入如下一抗：anti-PEDV N-protein(1:1000)、anti-PRRSV N-protein(1:1000)、anti-TGEV N-protein(1:1000)、anti-EMCV VP1-protein(1:1000)、anti-SVA VP1-protein(1:1000)(以上抗体均由本实验室制备)、anti-GAPDH(1:5000；Proteintech)、 anti-β-actin(1:1000；Santa Cruze)、anti-GFP(1:2000；Proteintech)、anti-Flag(1:5000；Proteintech). anti-His(1:2000；Proteintech)，孵育2h。加入HRP标记的山羊抗小鼠或兔IgG (H-L)(1:1000；Beyotime)二抗，孵育1h。使用ECL发光液在蛋白曝光仪进行曝光(Tanon)。
1.6 RNA提取和qRT-PCR
使用总RNA提取试剂盒(Omega Bio-tek)进行细胞总RNA的抽提，使用HiScriptqRT SuperMix(诺维赞)进行反转录。以上述cDNA为模板，SYBR Green实时PCR检测细胞中的病毒含量。引物序列为
PEDV N(F:5’-TTCTTGTTTCACAGGTGGATG-3’；R:5’-GCTGCTGCGTGGTTTCA-3’)；
TGEV N(F:5’-CAATTCCCGTGGTCGGAAGA-3’；R:5’-TTTACGTTGGCCCTTCACCA-3’)；
PRRSV N(F:5’-AATAACAACGGCAAGCAGCAG-3’；R:5’-CCTCTGGACTGGTTTTGTTGG-3’)；
EMCV VP1(F-5’-CCCCACCTCTGCTAAGATACTAAC-3’；
R-5’-TGGGACTGGACCTATCATAGAAG)；
SVA VP1(F-5’-AACCGGCTGTGTTTGCTAGAG-3’；R-5’-GAACTCGCAGACCACACCAA)；
GAPDH(F-5’-CCTTCCGTGTCCCTACTGCCAAC-3’；
R-5’-GACGCCTGCTTCACCACCTTCT-3’)。反应体系为：2×Power SYBR Green PCRMaster Mix(诺维赞)10μL，cDNA 2μL，引物F/R浓度均为400nmo1/L。反应在ABI 7300realtime PCR仪上进行。反应程序为：预变性95℃2min；95℃15s，61℃31min；共40个循环。
1.7病毒滴度TCID50测定
96孔板培养的Vero细胞接种连续倍比稀释的PEDV病毒液，每个梯度4个重复。37℃孵育1h后，用新的DMEM代替原培养基。37℃培养48～72h，观察病变。使用Reed-Muench 法计算PEDV滴度。
2结果
2.1番茄碱抑制PEDV复制作用
为了确定番茄碱抑制PEDV复制的剂量范围，分别用2.5、5和10μM番茄碱处理Vero细胞，再感染PEDV。TCID50、Western blot和qRT-PCR分析都表明病毒滴度，N蛋白和mRNA 水平均以剂量依赖的水平降低(图1中A～C)。在感染后16h，CPE和IFA都表明感染细胞数明显减少(图1中D)。并且，番茄碱对经典毒株CV777和不同的变异毒株均具有很好的抗病毒效果(图1中E)。
2.2番茄碱抑制PEDV感染的阶段
2.2.1杀灭作用：番茄碱(10μM)或DMSO与PEDV病毒液0.01MOI在37℃孵育3或5h，随后接种入24孔板的Vero细胞中。37℃孵育1h后，用新鲜DMEM替代培养上清，再孵育12h(图 2中A)，PBS洗涤细胞，qRT-PCR检测细胞中PEDV N和GAPDH mRNA水平。
2.2.2病毒吸附作用：Vero细胞使用番茄碱(10μM)或DMSO在37℃处理1h，随后与PEDV 病毒液在4℃孵育15min,30min，1h(图2中B)。使用预冷的PBS洗涤细胞，qRT-PCR检测细胞中PEDV N和GAPDH mRNA水平。
2.2.3病毒内化作用：Vero细胞与PEDV病毒液在4℃孵育1h，随后使用含有番茄碱(10μM) 或DMSO的培养液取代原培养液，在37℃培养30min，1h和2h(图2中C)。用柠檬酸缓冲液洗涤细胞以去除未内化的病毒粒子，qRT-PCR检测细胞中PEDV N和GAPDH mRNA水平。
2.2.4病毒复制作用：Vero细胞与PEDV病毒液在37℃孵育1h，使用PBS洗三遍以去除自由病毒粒子。感染后4h，使用含有番茄碱或DMSO的新鲜培养液取代原培养基。在感染后6、 8和10h，qRT-PCR检测细胞中PEDV N和GAPDH mRNA水平(图2中D)。
2.2.5病毒释放作用：采用0.01MOI PEDV感染Vero细胞1h，然后用新鲜的DMEM代替培养基。感染后10h,PBS洗涤细胞三次,使用含有番茄碱或DMSO的新鲜培养液取代原培养基。37℃孵育0.5、1、2h，收获上清液，用荧光定量法测定释放病毒中PEDV N的mRNA 水平(图2中E)。
上述5个试验结果显示：番茄碱对PEDV均无直接杀灭作用。番茄碱不影响PEDV的吸附、内化和释放(图2中A、B、C和E)。但是，如图2D显示，番茄碱显著抑制PEDV复制，并且降低N基因mRNA水平达90％。
2.3计算机分子模拟
2.3.1番茄碱与病毒非结构蛋白分子对接结果
PEDV nsp5晶体结构获得自Protein Data Bank(3CLpro,PDB:4XFQ)。通过Swissmodel 同源建模获得nsp3(PLP2),nsp12(RdRp),nsp13(NTP),nsp14(ExoN),nsp15(NendoU),nsp16 (2'-o-methyltransferase)的三维结构。番茄碱的三维结构获得自PubChem(Compound CID: 65576)。使用Autodock 4.2程序将Tomatidine与PEDV复制相关酶的活性口袋对接。利用遗传算法生成潜在的番茄碱—蛋白复合物。对计算的结合自由能进行排序，并对前两种配合物进行进一步的分子动力学分析。对接结果采用PyMOL 2.3.2进行可视化。
考虑到番茄碱能够显著抑制病毒的复制阶段，而多个复制酶调控病毒复制，我们推测番茄碱直接作用于病毒复制相关酶。为了弄清番茄碱作用于的复制酶，通过Autodock软件将番茄碱对接到PEDV不同复制酶的活性口袋中(图3A)。结合自由能分析，结果显示：番茄碱与nsp5和nsp16形成的复合物相对稳定(-9.14KJ/mol；-8.96KJ/mol)(图3B)。
2.3.2分子动力学分析番茄碱与nsp5和nsp16的关系
我们对分子对接结果进行进一步的分子动力学分析。使用PRODRG 2.5对配体施加GROMOS87/GROMOS96力场，使用Gromacs软件包对受体施加GROMOS96 43A1力场。对整个体系添加SPC216水环境。使用Na+和Cl-离子对体系进行电荷平衡。能量最小化后对体系进行NVT和NPT预平衡，分子动力学模拟10ns。使用骨架RMSD，配体和受体活性口袋的距离以及氢键数量来判断复合物结构稳定性和收敛性。结果显示：与nsp16-番茄碱复合物相比，nsp5-番茄碱复合物的RMSD小于0.25nm，并且于第7纳秒开始稳定(见图3C(i))。在模拟的过程中，番茄碱与nsp5活性口袋的距离保持更加稳定并且紧密(见图3C(ii))，其间形成了数量不等的氢键，从而获得分子间的极性作用，有利于番茄碱与nsp5复合物的稳定性 (图3C(iii))。这些数据都说明，3CLpro是番茄碱更加可靠的靶点，番茄碱可能阻断3CLpro 与底物的识别和连接，从而抑制PEDV复制。
2.4 3CLpro底物GFPnsp5/6表达质粒的构建与番茄碱的切割作用
对于PEDV 3CLpro真核表达和原核表达质粒的构建，从PEDV的cDNA中扩增得到3CLpro的编码序列，克隆至pCAGGS-Flag和pET-32a中。对于PEDV 3CLpro的底物构建，从PEDV cDNA中扩增出编码nsp5和nsp6接头蛋白(YGVNLQ^SG)的序列，通过重叠PCR 插入到GFP的G190和D191的编码序列之间。并克隆至pCAGGS中。质粒经测序和双酶切验证正确。
Vero细胞培养在24孔板中，共转染250ng GFPnsp5/6底物质粒，250ng 3CLpro表达质粒或空质粒。转染后12h，使用包含番茄碱(10、20和30μM)或DMSO的营养液替换原营养液。转染后24h，收集细胞，使用Western blot来检视断裂的GFPnsp5/6条带。Western blot分析显示：3CLpro和GFPnsp5/6质粒转染细胞后，3CLpro蛋白对GFPnsp5/6表达产物具有明显切割作用，番茄碱能够明显抑制3CLpro对其底物GFPnsp5/6的切割作用(图4中A)。
2.5 FRET法测定3CLpro酶活性
采用大肠杆菌系统表达纯化PEDV 3CL蛋白酶。转化原核表达质粒至BL21大肠杆菌中， 37℃培养至OD600约0.8，加入1mM IPTG 27℃诱导7h，收集菌体并超声破碎。使用Ni柱(GE Healthcare)进行上清纯化，最终使用线性梯度洗脱(20mM Tris,pH 7.4,500mMNaCl2, and 250mM imidazole)获得带有His标签的目的蛋白。目的蛋白使用超滤管(GEHealthcare) 进行浓缩脱盐。获得的蛋白使用SDS-PAGE和Western blot进行分析。结果显示：通过原核表达和Ni柱纯化，获得了特异单一的3CLpro(图4中B(i)(ii)(iii))。
多肽底物Dabsyl-YNSTLQ↓AGLRKM-E-Edans由金斯瑞公司进行合成。使用终浓度为0.5、1和1.5μM的PEDV 3CL蛋白酶，与10μM底物多肽一起添加到黑色96孔酶标板中。 PRRSVGP5蛋白作为一个阴性对照。混合物在37℃孵育20min，并且每分钟监测340nm激发和485nm发射光荧光值。
番茄碱(25、50μM)或黄柏酮(50μM，阴性对照)或DMSO与3CLpro在37℃孵育 20min，随后添加入10μM多肽底物。混合物在37℃孵育20min，并且每分钟监测340nm激发和485nm发射光。相对荧光值(RFU)通过每组荧光值减去Mock组荧光值。抑制率(％) ＝100×[1-RLUof the tomatidine group(20min–0min)/RLU of the negative control group(20 min–0min)]。
荧光共振能量转移实验基于两个荧光基团的能量转移，用来检测两个被标记分子在极近距离的相互作用。结果证明，原核表达纯化获得的蛋白具有3CL蛋白酶活性(图4中C)。使用番茄碱预处理3CL蛋白酶能够抑制其蛋白酶活性，使用50μM和25μM番茄碱处理后的抑制率分别为75.5％和47.1％(图4中D)。
2.6广谱抗病毒测定
为了探究番茄碱对于含有3C或3CL蛋白酶的小RNA样病毒是否有广谱抗病毒作用，我们选择了另一种冠状病毒TGEV、动脉炎病毒PRRSV及两种小RNA病毒EMCV和SVA。 Westernblot和qRT-PCR用来检测番茄碱对含有3C或3CL的小RNA样病毒的抗病毒作用。将三个浓度的番茄碱(2.5、5和10μM，并且无可见的细胞毒性)添加到细胞中，DMSO作为阴性对照。PRRSV、TGEV、SVA和EMCV接种至添加有番茄碱的Marc-145、ST或BHK-21 细胞中，分别培养48、24和18h，收集蛋白和RNA进行Western blot和qPCR分析。结果显示：番茄碱能够在不产生细胞毒性的剂量下，对TGEV、PRRSV、EMCV和SVA均具有良好的抗病毒效果(图5)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.番茄碱在抑制半胱氨酸蛋白酶活性中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于番茄碱对半胱氨酸蛋白酶活性的抑制作用随番茄碱浓度增大而增大。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于番茄碱浓度为50μM和25μM时，对半胱氨酸蛋白酶活性抑制率分别为75.5％和47.1％。
4.番茄碱在抑制病毒复制中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述病毒为含有3CL蛋白酶的RNA病毒。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述病毒为冠状病毒、动脉炎病毒和微RNA病毒。
7.番茄碱在制备抗病毒制剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述病毒为含有3CL蛋白酶的RNA病毒。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述病毒为含有3CL蛋白酶的小RNA病毒或微RNA病毒。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述病毒为冠状病毒、动脉炎病毒、猪脑心肌炎病毒或塞内卡病毒。
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