CN109125720A

CN109125720A - 一种含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物及其应用

Info

Publication number: CN109125720A
Application number: CN201710465252.5A
Authority: CN
Inventors: 田克恭; 袁于人; 李向东; 廖永洪; 习向锋; 胡东波; 肖燕; 姚亚丽; 吕超超; 孙进忠; 张许科
Original assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Current assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Priority date: 2017-06-19
Filing date: 2017-06-19
Publication date: 2019-01-04
Anticipated expiration: 2037-06-19
Also published as: CN109125720B

Abstract

本发明涉及一种含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物，其中，该免疫原性组合物包括免疫量的猪圆环病毒3型Cap蛋白抗原以及药学上可接受的载体。本发明的免疫原性组合物具有良好的免疫原性，一次免疫即能对猪圆环病毒3型毒株混合感染完全保护。

Description

一种含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物及其应用

技术领域

本发明属于兽药领域，具体涉及一种含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物及其应用。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circoviruses，PCV)是单股环状的DNA病毒，基因组长度约为1.7kb，是最小的动物DNA病毒之一。已经确定有两种类型的PCV，即猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)。PCV1于1974年首次在PK细胞培养物中作为一种污染物鉴定而发现，其对猪只没有致病性。PCV2于1998年首次报道，其在临床条件下能引起猪只的猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus associated diseases，PCVAD)，主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征，肺炎,猪皮炎和肾病综合征和繁殖障碍，主要表现为呼吸、泌尿、肠道、淋巴、心血管、神经、繁殖系统以及皮肤的功能紊乱，对全世界的生猪养殖造成了重大的经济损失。

然而，在一起猪的繁殖障碍病例中，分离到一株病毒基因组为2.0kb的圆环病毒，经后续试验证实，其与已知的圆环病毒无论在核苷酸还是氨基酸序列的同源性均小于50％，根据国际病毒学分类委员会的标准，圆环病毒属中同一种的病毒应该具有＞75％的基因组核苷酸序列的同源性，Cap蛋白具有＞70％的氨基酸序列的同源性，据此可以肯定这是一种新的猪圆环病毒。其能与多种病原混合感染引起猪的皮炎肾病综合征、增生性坏死性肺炎、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应。

当初早在1985年由PCV2导致的系统疾病就已经以零星状态爆发，由于未能重视，导致九十年代末大规模爆发该疾病，而新的猪圆环病毒PCV3在PNDS和繁殖障碍方面具有与PCV2相似病原学特性，且目前无疫苗产品可针对该PCV3感染进行预防或治疗，因此现阶段开发能有效预防PCV3感染或者与其他病原大规模混合感染的疫苗需求迫切，针对该新临床疫情制备新的免疫原性组合物，对猪场疾病控制十分重要。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供一种预防和/或治疗新型猪圆环病毒混合感染的免疫原性组合物，该免疫原性组合物能对新型猪圆环病毒混合感染提供有效的保护，显示出显著的免疫特性。

为此，本发明的一个目的在于提供一种预防和/或治疗新型猪圆环病毒混合感染的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含免疫量的猪圆环病毒3型抗原、其他病原抗原以及载体；其中，所述猪圆环病毒3型抗原为免疫原性蛋白或重组有所述免疫原性蛋白基因的活载体。

本发明的猪圆环病毒3型免疫原性蛋白抗原，其制备的免疫原性组合物能有效保护流行株的感染，且针对不同来源的猪圆环病毒3型的混合感染提供完全的保护。

本发明的另一个目的在于提供上述免疫原性组合物在制备预防和/或治疗猪圆环病毒3型混合感染疾病的药物中的应用。

本发明首次采用猪圆环病毒3型免疫原性蛋白抗原基因高效表达后，制备免疫原性组合物，可预防或治疗猪圆环病毒3型混合感染引起的疫情，免疫原性组合物中各抗原成分之间不发生干扰，一次免疫也能针对各自的病原产生完全保护。

本发明猪圆环病毒3型抗原制备的免疫原性组合物，其免疫原性好，在低含量时，一次免疫也能对猪只的攻毒产生完全保护。

本发明的猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物能有效对多种地域来源的野毒株进行预防，即在临床应用上能对猪圆环病毒3型的感染、蔓延进行预防、治疗和控制。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行说明。

“猪圆环病毒3型”为基因组2.0kb的圆环病毒，其与已知的圆环病毒无论是核苷酸还是氨基酸序列的同源性均小于50％，是一种新的猪圆环病毒，其能与多种病原混合感染引起猪的皮炎肾病综合征、增生性坏死性肺炎、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应。

本发明涉及一种含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物，其中，所述含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物包括免疫量的猪圆环病毒3型Cap蛋白抗原以及药学上可接受的载体；所述猪圆环病毒3型Cap蛋白抗原为猪圆环病毒3型Cap蛋白或重组有所述猪圆环病毒3型Cap蛋白基因的活载体；其中，所述含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物还包含由免疫量的以下抗原组成的组中的一种或多种：猪瘟病毒抗原、猪伪狂犬病病毒抗原、猪流感病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪细小病毒抗原、猪乙型脑炎病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪链球菌抗原、猪波氏杆菌抗原、猪传染性胸膜肺炎抗原、猪多杀性巴氏杆菌抗原、猪霍乱沙门氏菌抗原、猪肺炎支原体抗原、猪鼻支原体抗原。

本发明首次发现猪圆环病毒3型Cap蛋白具有良好的免疫原性，其制备的亚单位抗原或含有其重组基因的活载体均能在免疫后产生良好的免疫效力，对猪只提供100％的保护。

术语“免疫原性组合物”指含有猪圆环病毒3型免疫原性的药物组合物，该药物组合物可诱发、刺激或增强猪只针对猪圆环病毒3型的免疫反应。

术语“免疫量”应当理解为“免疫有效量”，又称免疫保护量或产生免疫应答的有效量，为可在接受者体内有效诱导免疫应答的抗原量，该量足以预防或改善疾病的体征或症状，包括不利的健康影响或其并发症。所述免疫应答可能足以用于诊断目的或其它试验，或可能适合用于预防疾病的征兆或症状，包括由病原体引起的感染所造成的不利的健康结果或其并发症。体液免疫力或由细胞介导的免疫力或此二者均可被诱导。动物对免疫原性组合物的免疫应答可通过例如测量抗体效价、淋巴细胞增殖分析而间接评估，或在以野生型毒株攻击后通过监测征兆或症状来直接评估，而该由免疫原性组合物提供的保护性免疫力可通过测量例如受试动物的临床征兆如健康产仔的减少、死胎数量的增加、受试动物总体生理状况及总体健康和表现来评估。所述免疫应答可包括但不限于诱导细胞性和/或体液免疫力。

本发明所述的猪圆环病毒3型Cap蛋白抗原可以是重组表达的Cap蛋白亚单位抗原，其表达体系可以为原核表达系统、真核表达系统，也可以是通过人工合成的合成肽抗原；或者可以是重组有所述猪圆环病毒Cap蛋白基因的活载体。

“亚单位抗原”指的是利用基因工程方法将病原体的保护性抗原基因克隆到原核或真核表达系统中，使其高效表达而制成的抗原。它比全病毒抗原引起副反应的可能性小。

“合成肽抗原”指的是一种仅含免疫决定簇组分的小肽,即用人工方法按天然蛋白质的氨基酸顺序合成保护性短肽,与载体连接后加佐剂所制成的抗原。

“活载体”指的是非致病微生物通过基因工程的方法使之携带并表达某种抗原或抗原决定簇的基因，产生免疫原性，非致病微生物可以是细菌和病毒，病毒活载体常作为载体的病毒有痘苗病毒、禽痘病毒、火鸡疱疹病毒、腺病毒、伪狂犬病毒、反转录病毒、慢病毒；细菌活载体可以是减毒沙门菌、卡介苗、减毒单核细胞李氏杆菌、减毒霍乱弧菌、减毒志贺氏菌、乳酸球菌、芽胚乳酸杆菌、高氏链球菌。

本发明的含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物能保护猪只对于猪圆环病毒3型和其他病原的混合感染。本发明的含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物经一次免疫，其中的抗原成分就能针对各自的病原产生完全保护。

本发明的含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物能针对不同地域来源的猪圆环病毒3型病毒进行完全保护。

作为本发明的一种实施方式，在本发明含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物中，所述的猪圆环病毒3型Cap蛋白为序列SEQ.ID NO.1编码的蛋白。

本发明的Cap蛋白可以通过本领域内任何已知的方法制备，例如可以通过重组表达Cap基因制备Cap蛋白，表达系统可以使用任何已知的表达系统，例如：真核表达系统、原核表达系统。或者直接合成Cap蛋白。真核表达系统可以包括哺乳动物细胞表达系统，酵母表达系统和昆虫表达系统。

作为本发明的一种实施方式，在本发明含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物中，所述的猪圆环病毒3型Cap蛋白其编码基因具有SEQ.ID NO 1所示的核苷酸序列或其简并序列。

作为本发明的一种实施方式，在本发明含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物中，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白含量为≥20μg/ml。

本发明含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物免疫原性好，当猪圆环病毒3型Cap蛋白含量低至20μg/ml时，也能刺激免疫系统产生免疫反应，对猪圆环病毒3型病毒产生完全保护。

作为本发明的一种优选实施方式，在本发明含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物中，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白含量为20μg/ml～100μg/ml。

作为本发明的一种更优选实施方式，在本发明含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物中，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白含量为20μg/ml～50μg/ml。

作为本发明的一种更优选实施方式，在本发明含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物中，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白含量为30μg/ml～50μg/ml。

在本发明的免疫原性组合物中，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白含量范围还可以选自20μg/ml～30μg/ml，30μg/ml～100μg/ml，或50μg/ml～100μg/ml含量范围。

作为本发明的一种实施方式，在本发明含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物中，所述重组有猪圆环病毒3型Cap蛋白基因的活载体为重组减毒沙门氏菌、重组新城疫病毒、重组痘病毒或重组腺病毒。

本发明的活载体免疫原性组合物因为兼具有灭活疫苗和活疫苗的优点，在免疫效力上可以保证能够对猪进行保护，且其免疫效力更强，可以不添加佐剂。

作为本发明的一种实施方式，在本发明含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物中，所述含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物包含由免疫量的以下抗原组成的组中的一种或多种：猪瘟病毒减毒抗原、猪伪狂犬病病毒减毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒减毒抗原、猪细小病毒亚单位抗原、副猪嗜血杆菌灭活抗原、猪肺炎支原体灭活抗原。

作为本发明的一种实施方式，在本发明含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物中，所述含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物包含由免疫量的以下抗原组成的组中的一种或多种：猪瘟病毒减毒抗原、猪伪狂犬病病毒灭活抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒减毒抗原、猪细小病毒亚单位抗原、副猪嗜血杆菌灭活抗原、猪肺炎支原体灭活抗原。

本发明含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物中，各抗原成分之间不发生干扰，一次免疫即能保护猪对于各自病原的攻毒。

作为本发明的一种实施方式，在本发明含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物中，所述猪瘟病毒减毒抗原为猪瘟病毒兔化弱毒株、所述猪伪狂犬病病毒减毒抗原为HN1201-R株、所述猪伪狂犬病病毒灭活抗原为HN1201株灭活抗原、所述猪繁殖与呼吸综合征病毒减毒抗原为JXA1-R株、所述猪细小病毒亚单位抗原为猪细小病毒HN-2011株VP2蛋白、所述副猪嗜血杆菌灭活抗原为副猪嗜血杆菌血清4型JS株和5型ZJ株灭活抗原、所述猪肺炎支原体灭活抗原为HN0613株灭活抗原。

作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物中，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白含量为20μg/ml～100μg/ml，所述猪瘟病毒减毒抗原含量为10^4.0～10^6.0TCID₅₀/ml，所述猪伪狂犬病病毒减毒抗原含量为10^6.0～10^7.0TCID₅₀/ml，所述猪伪狂犬病病毒灭活抗原含量为灭活前10^6.0～10^7.0TCID₅₀/ml，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒减毒抗原含量为10^5.0～10^7.0TCID₅₀/ml，所述猪细小病毒VP2蛋白血凝价为2⁹～2¹⁶，所述副猪嗜血杆菌灭活抗原含量为灭活前10^8.0～10^10.0CFU/ml，所述猪肺炎支原体灭活抗原含量为灭活前10^8.0～10^10.0CCU/ml。

本发明含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物中各抗原成分具有良好的免疫原性，一次免疫就能对猪只提供完全保护。

作为本发明的一种更优选实施方式，在本发明含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物中，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白含量为20μg/ml～100μg/ml，所述猪瘟病毒减毒抗原含量为10^5.0TCID₅₀/ml，所述猪伪狂犬病病毒减毒抗原含量为10^6.0TCID₅₀/ml，所述猪伪狂犬病病毒灭活抗原含量为灭活前10^6.0TCID₅₀/ml，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒减毒抗原含量为10^6.0TCID₅₀/ml，所述猪细小病毒VP2蛋白血凝价为2¹²，所述副猪嗜血杆菌灭活抗原含量为灭活前10^9.0CFU/ml，所述猪肺炎支原体灭活抗原含量为灭活前10^9.0CCU/ml。

作为本发明的一种实施方式，在本发明含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物中，所述药学上可接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括白油、德雷克油，以及动物油、植物油或矿物油；或氢氧化铝、磷酸铝及金属盐；或Montanide^TMGel、卡波姆、角鲨烷或角鲨烯、ISA206佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂。

作为本发明的一种更优选实施方式，在本发明含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物中，所述佐剂为Montanide^TMGel。

本发明的免疫原性组合物可使用可用技术来调配，优选为药学上可接受的载体一起调配。例如，油可有助于稳定调配物，且另外充当疫苗佐剂。油佐剂既可以是自然来源，也可以是经过人工合成获得的。

术语“佐剂”指加入到本发明的组合物中以增加组合物的免疫原性的物质。已知的佐剂包括，但不限于：(1)氢氧化铝、皂苷(Saponine)(例如QuilA)、阿夫立定、DDA，(2)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的聚合物，(3)免疫原性组合物可以以水包油、油包水或水包油包水乳剂形式制成，或(4)Montanide^TMGel。

尤其是，乳剂可以基于轻液体石蜡油、类异戊二烯油，例如角鲨烷或角鲨烯；烯烃，特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油，带直链烷基的酸或醇形成的酯，更特别是植物油，油酸乙基酯，丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)，甘油三(辛酸酯/癸酸酯)，丙二醇二油酸酯；分支脂肪酸酯或醇的酯，特别是异硬脂酸酯。油与乳化剂一起使用形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，特别是聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)，脱水山梨糖醇、甘露醇(例如脱水甘露醇油酸酯)、甘油、聚甘油、丙二醇和可选地乙氧基化的油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸、羟基硬脂酸形成的酯，脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚，聚氧丙稀-聚氧乙烯嵌段共聚物，特别是PluronicR，尤其是L121(参照Hunter等，1995，“The Theory and Practical ApplicationofAdjuvants”(Steward-Tull，D.E.S主编)John Wiley and Sons，NY，51-94；Todd等，Vaccine，1997，15，564-570)。

特别地，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物通过糖或多元醇的聚链烯基醚交联。这些化合物被称作卡波姆。

优选地，本发明选用的佐剂为Montanide^TMGel。

适用于本发明的组合物的佐剂的量优选地是有效量。所述“有效量”是指佐剂在同本发明抗原联合施用时在宿主中发挥它们的免疫学作用而言必须或足够的而不导致过度副作用所需的量。待施用的佐剂的精确的量将根据多种因素如所用的成分和治疗的疾病的类型，待治疗动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。

作为本发明的一种实施方式，在本发明含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物中，所述佐剂含量为5～20V/V％。

作为本发明的一种优选实施方式，在本发明含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物中，所述佐剂含量为10V/V％。

本发明免疫原性组合物还可以进一步将其他的试剂加入到本发明的组合物中。例如，本发明的组合物还可以包含以下试剂，如：药物，免疫刺激剂(如：α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2(IL2))、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂。为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。

可以根据本发明的免疫原性组合物制备成口服剂型或非口服剂型。

优选的是可通过皮内、肌肉、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内或硬脑膜外途径给予的非口服剂型。

本发明还涉及上述含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物在制备预防和/或治疗猪圆环病毒3型相关疾病的药物中的应用。

本发明所用术语“猪圆环病毒3型相关疾病”用于指由猪圆环病毒3型感染引起的疾病。非穷举性包括，猪的皮炎肾病综合征、增生性坏死性肺炎、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应，但不限于此。

作为本发明的一种实施方式，所述猪圆环病毒3型相关疾病包括断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪的皮炎肾病综合征、增生性坏死性肺炎、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应。

本发明还涉及上述含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物在制备预防和/或治疗猪圆环病毒3型混合感染导致的疾病的药物中的应用。

本发明含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物中的抗原成分能针对各自病原产生完全保护，能有效预防和/或治疗猪圆环病毒3型和其他病原的混合感染。

术语“预防和/或治疗”在涉及猪圆环病毒3型混合感染时是指抑制包括猪圆环病毒3型的复制、抑制包括猪圆环病毒3型的传播或防止包括猪圆环病毒3型在其宿主体内定居，以及减轻包括猪圆环病毒3型感染的疾病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1PCV3的分离鉴定

1、病料来源

在国内一商品化猪场，与历史平均值相比，出现母猪死亡率增加9.4％，受孕率降低了1.2％，木乃伊胎增加8.2％的现象。临床表现上，受影响的母猪表现出厌食，呈多灶性丘疹，斑点和表面皮炎的症状。在流产的窝中含有不同胎龄的木乃伊化胎儿，与PCV2相关流产的症状一致。虽然在母猪中观察到的总体临床表现以及流产症状与猪圆环病毒2型导致的繁殖障碍疾病一致，但所有母猪的不同组织，包括肾、淋巴结、肺、皮肤以及死胎，通过免疫组化和定量PCR对PCV2、PRRSV、PPV、CSFV、猪肺炎支原体检测均为阴性。为进一步查清原因，选取各组织病料进行病原分离。

2、病毒株的分离与培养

将病料以1：10(体积比)加入DMEM培养液，研磨，制备组织悬液；组织悬液经反复3次冻融后，于12000r/min离心15min，收集上清液；上清液再经0.22μm滤膜滤器过滤；滤液在PK15细胞上传代，37℃培养1h，替换加入含2％犊牛血清的DMEM培养液，置于37℃培养5日。收获含病毒的培养液，培养液经2次冻融后，收获病毒。

3、PCR及测序分析鉴定病毒种属

取以上步骤收获的病毒培养物，用核酸提取试剂盒提取病毒样品的核酸，使用圆环病毒种属特异性引物进行PCR扩增鉴定，结果显示，PCR扩增出2000bp目的条带。PCR产物送测序公司进行核苷酸序列测定，序列测定结果进行遗传进化分析。结果显示该病毒株全基因组序列和氨基酸序列同已经报道过的其他圆环病毒的同源性都少于50％，而根据国际病毒学分类委员会的标准，圆环病毒属中同一种的病毒应该具有＞75％的基因组核苷酸序列的同源性，Cap蛋白具有＞70％的氨基酸序列的同源性，据此可以肯定，它是一种新的猪圆环病毒，也是目前猪体上发现的第三种圆环病毒。

实施例2pET28a-PCV3-Cap表达载体的构建

1、PCV3病毒DNA的提取

质粒提取试剂盒购自天根生物；T4DNA Ligase购自BioLab；pET28a质粒购自Novagen；琼脂糖凝胶胶回收试剂盒购自天泽生物，其他试剂均为分析纯。

按照病毒DNA提取试剂盒说明书，取0.2ml猪圆环病毒3型病毒液于无菌1.5ml离心管中，加0.4ml VB于病毒液中，旋涡混匀，室温静置10分钟。加0.45ml AD buffer于病毒液中，用力混匀。将VB柱放入2ml收集管中，取0.6ml上述混合了试剂的病毒液加入VB柱中，14000g离心1分钟，再将剩余的上述混合了试剂的病毒液加入VB柱中，14000g离心1分钟，弃掉2ml收集管，将VB柱放入新的2ml收集管中，加入0.4ml W1buffer，14000g离心30秒，再加0.6ml Wash buffer于VB柱，14000g离心30秒，然后不加buffer再空置离心3分钟，将该VB柱放入新的1.5ml EP管中，加入50μl RNase free water置于膜中央，静置3分钟，14000g离心1分钟，EP管中离心下来的液体即为猪圆环病毒3型病毒DNA基因组溶液。

2、Cap基因扩增

根据Cap基因5’和3’末端的保守区序列合成寡聚核苷酸引物，进行PCR。引物序列见表1。

表1Cap基因扩增引物

Cap-F	CCA CAG AAG GCG CTA TGT C
		Cap-R	CCG CAT AAG GGT CGT CTT G

将PCR产物送Invitrogen公司测序，根据测序结果对Cap基因进行密码子优化，优化后的Cap基因序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

3、表达载体构建

优化后Cap基因送苏州泓迅生物科技股份有限公司进行全序列合成，并连接到pET28a质粒上。连接后的质粒和分子伴侣质粒pG-Tf2共转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单克隆在含有100μg/ml卡那霉素和20μg/ml氯霉素的LB培养基中培养过夜，提取质粒后测序分析，确定合成序列正确，阳性克隆即为pET28a-PCV3-Cap/pG-Tf2表达菌株pET28a-PCV3-Cap/pG-Tf2/E.Coli BL21(DE3)。

实施例3Cap蛋白的表达

将实施例2中制备的pET28a-PCV3-Cap/pG-Tf2/E.Coli BL21(DE3)菌株接种到含50-100μg/ml卡那霉素和20μg/ml氯霉素的LB培养基中，同时LB培养基中含有5-10ng/ml四环素用于分子伴侣蛋白的诱导表达，接种量为1％(V/V)，于37℃振荡培养。当OD₆₀₀＝0.4～0.6时，于28℃放置30分钟。加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为0.1～1.0mM，于28℃振荡培养24小时。培养结束后，收集菌体，并用PBS(PBS组分：氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.44g，磷酸二氢钾0.24g，调节pH至7.4，定容1L)重悬菌体，超声破碎菌体，超声破碎后的裂解液离心取上清。表达产物中可溶性目的蛋白含量较高，表达量可达菌体蛋白总量的25％，内毒素含量为0.28×10⁵EU/ml。

实施例4大肠杆菌表达Cap蛋白内毒素清除

1.5ml离心管中加入0.5ml待处理的含可溶性Cap蛋白的上清溶液和终浓度为1％(v/v)的曲拉通X-114(Triton X-114)(加入量5μl)，涡旋振荡。涡旋振荡混匀的样品在冰上放置5分钟。样品冷却后，离心管立即放入37℃水浴中温浴5min，使得产生新的两相。然后，把样品在37℃离心60s。离心过后，目的蛋白将留在上层，而含有内毒素的非离子表面活性剂将会以油滴的形状残留在离心管底部，分离两相。上述整个去除内毒素的操作循环3次。最终的纯化产物经测定，蛋白纯度没有降低，内毒素含量下降为0.008×10⁵EU/ml；同时，通过200KV透射电镜，放大倍数60000倍，观察经5％磷钨酸负染、固定于喷碳的铜网上的PCV3病毒样颗粒，结果显示大量的病毒样颗粒，且大小均匀，呈现为空心粒子状态。

实验结果表明Triton X-114能够清除重组蛋白中残留的内毒素，且对蛋白的纯度没有影响；同时，也没有影响PCV3病毒样颗粒的形成及稳定形态。

实施例5CSFV抗原的制备

将长成良好单层的ST细胞用含0.125％胰酶和0.03％EDTA的消化液,进行消化分散，细胞计数后接种细胞培养瓶，加入3％犊牛血清的DMEM细胞培养液，同时按照M.O.I.＝0.1接毒剂量加入猪瘟病毒种毒(购自中监所，保藏号AVCC NO.AV1412),置于37℃温箱中进行培养。培养三天后进行第一次收获病毒，病毒收获后补加含1.5％犊牛血清的细胞维持液，以后每隔2天收获病毒一次，可连续收获病毒5次。最后将各批收毒的抗原混合置于-20℃储藏。

实施例6PRV减毒抗原的制备

将猪伪狂犬病病毒HN1201-R株(公开于中国专利申请CN105087506A)培养物按病毒培养液量的1％(V/V)接入形成单层的ST细胞培养物中，置于37℃培养，当病变达到80％时，收获含毒细胞培养液，经2次冻融后，收获病毒液，测定毒价，置于低温保存。

实施例7PRV灭活抗原的制备

将猪伪狂犬病病毒HN1201株的gE基因缺失株(公开于中国专利申请CN103923884A)培养物按病毒培养液量的1％(V/V)接入形成单层的ST细胞培养物中，置于37℃培养，当病变达到80％时，收获含毒细胞培养液，经2次冻融后，收获病毒液，测定毒价。

向病毒液中加入10％(v/v)甲醛溶液使甲醛的终浓度为0.2％(V/V)，于37℃灭活18小时，每4小时搅拌1次，每次搅拌10min，灭活完全后备用。

实施例8PRRSV减毒抗原的制备

选取所需数量的Marc-145细胞(已长成单层的细胞转瓶)，弃去生长液，按1％(V/V)接种生产用毒种病毒JXA1-R株(公开于中国专利申请CN101307305A)，加入含2％胎牛血清的DMEM细胞培养液，于37℃旋转(9～12转/小时)培养，在显微镜下观察由病毒引起的细胞病变(CPE)，当CPE达到70％以上时收获细胞培养物，细胞培养物冻融1次，经离心或过滤除去细胞碎片，冻存于-40℃以下。

实施例9PPV亚单位抗原的制备

1、VP2目的基因的TA克隆

VP2基因来自猪细小病毒HN-2011株(公开于中国专利申请CN103908664A)，利用引物扩增序列。引物序列见表2，PCR扩增体系见表3。

表2VP2基因扩增引物

VP2-F	TGAGGATCCATGAGTGAAAATGTGGAAC
		VP2-R	CGCGTCGACTTCTAGTATAATTTTCTTG

表3PCR扩增体系

5×PS Buffer	10μL
		PPV基因组DNA	1μL
FD，RV(10pM/μL)	1μL
		dNTPs(2.5mM)	4μL
PrimeSTAR(2.5U/μL)	0.3μL
		ddH<sub>2</sub>O	33.7μL

反应条件：95℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃2min，共30个循环；72℃7min。

2、VP2蛋白表达重组质粒的构建

将步骤1得到的PCR产物与PMD-18T载体连接，并转化大肠杆菌DH5α，碱裂解法提取质粒，用BamHⅠ和SalⅠ进行双酶切，获得阳性克隆命名为PT-VP2。对PT-VP2进行测序鉴定VP2基因序列。测序结果确定该基因PCR产物序列正确。用BamHⅠ和SalⅠ双酶切PT-VP2与pFastBac1，将VP2基因克隆至pFastBac1载体，用BamHⅠ和SalⅠ双酶切载体鉴定，鉴定正确的重组阳性质粒命名为pFastBac-VP2。

3、重组杆状病毒的获得

将pFastBac-VP2转化至DH10bac感受态细胞，筛选出阳性重组菌落，提取重组Bacmid-VP2，转染sf-9昆虫细胞，2天后收取上清即为重组的杆状病毒。

4、蛋白的表达

重组病毒以M.O.I.＝0.1感染剂量接种sf21细胞，3天后，收获感染细胞，反复冻融裂解昆虫细胞，使蛋白从细胞中释放出来，12000r/min离心10min，取上清，用1％(体积比)的Triton X-100(购自sigma)灭活杆状病毒，再经超滤膜透析使体积变为原来的10％，即为所需要的蛋白抗原VP2。

实施例10HPs灭活抗原的制备

一级种子的繁殖：副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株(公开于中国专利申请CN102908615A)冻干菌种，分别划线接种于TSA/NAD(TSA为BD公司生产，NAD为Roche公司生产)平板上，置于37℃培养18～24小时，选取符合要求的菌落，接种于TSB/NAD(TSB为BD公司生产，NAD为Roche公司生产)液体培养基中，置于37℃培养12～16小时，经检验纯粹后作为一级种子；

二级种子的繁殖：取上述制备的副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株一级种子的培养物，按1％的量加入TSB/NAD液体培养基中，于37℃培养12～16小时，经检验纯粹后作为二级种子；

在TSB培养基中，加入0.01～0.05％NAD、5～10％的小牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)、0.1～5％的葡萄糖，将副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株二级种子按1％的量加进培养基中分别培养，混匀后置于37℃培养16～18小时，当菌液的浓度OD₆₀₀达到2.5以上、DO值开始上升、pH值降低到6.5以下时停止培养。

培养物活菌计数后，按总量的0.2％(V/V)加入37％的甲醛溶液(烟台市双双化工有限公司)，放置于37℃灭活24h，期间搅拌3～5次，灭活完全后备用。

实施例11Mhp灭活抗原的制备

液体培养基的配方(按1065ml计)：牛心浸出液300ml，ddH₂O(二次蒸馏水)360ml，校正pH值到7.4，121℃灭菌15分钟。再加入下列过滤除菌的成份：Hank’s平衡盐溶液(10×)(10倍浓缩)40ml，0.25％酚红10ml，马血清200ml，5％水解乳蛋白100ml，25％酵母浸出液20ml，10000IU/ml青霉素10ml，1％醋酸铊溶液25m1；

一级种子的繁殖：冻干菌种HN0613株(公开于中国专利申请CN103031258A)启封后，按10％接种量接种液体培养基，置于37℃振荡培养3～7日，待pH值由7.5降至6.8时收获，经检验纯粹后，作为一级生产种子；

二级种子的繁殖：取上述制备的一级种子按5％接种量接种液体养基，置于37℃振荡培养3～7日，待pH值由7.5降至6.8时收获培养物，经检验纯粹后，作为二级生产种子；

将二级种子液以5％(v/v)接种于液体培养基中，置于37℃下培养3～7日，待pH值由7.5降至6.8时收获菌液。

取检验合格的上述制备的猪肺炎支原体菌液，按菌液体积总量缓慢加入终浓度为0.2％的甲醛溶液(v/v)，放置于37℃灭活，其间每隔3～4h搅拌一次，24h后取出，灭活完全后备用。

实施例12含PCV3抗原免疫原性组合物的制备

分别将实施例5制备的CSFV减毒抗原、实施例6制备的PRV减毒抗原、实施例8制备的PRRSV减毒抗原加入耐热保护剂(2wt％明胶水溶液与15wt％乳糖水溶液以1:1(v/v)比例配制)以1:1(v/v)比例混合后充分混匀，定量分装，迅速进行冷冻真空干燥，即为CSFV活病毒抗原部分、PRV活病毒抗原部分、PRRSV活病毒抗原部分。用实施例4制备的PCV3Cap蛋白抗原缓缓加入到水溶性佐剂Gel佐剂(法国赛比克公司)中，加的过程中不断用转速为800rpm乳化机搅拌12min，混匀，即为PCV3Cap蛋白免疫原性组合物部分。使用时用PCV3Cap蛋白免疫原性组合物部分稀释活病毒抗原部分，两种抗原比例见表4。

表4含PCV3抗原免疫原性组合物成分配比(活病毒抗原部分)

分别取实施例4制备的PCV3Cap蛋白抗原、实施例7制备的PRV灭活抗原、实施例9制备的PPV VP2蛋白抗原、实施例10制备的HPs灭活抗原、实施例11制备的Mhp灭活抗原，将五种抗原根据组合物最终的抗原含量配制，加入到水溶性佐剂Gel佐剂(法国赛比克公司)中，加的过程中不断用转速为800rpm乳化机搅拌12min，混匀。免疫原性组合物的具体配方及含量见表5。

表5含PCV3抗原免疫原性组合物成分配比(灭活抗原、亚单位抗原部分)

实施例13含PCV3抗原免疫原性组合物免疫原性试验

1、PCV3抗原部分免疫原性试验

将28～30日龄经ELISA检测PCV2、PCV3抗原、抗体阴性的健康仔猪45头随机分成9组，5头/组。第1～8组分别免疫实施例12制备的免疫原性组合物1～8，第9组不免疫作为攻毒对照组。各免疫组注射免疫原性组合物2ml/头，攻毒对照组接种DMEM培养基2ml/头。免疫后28日进行攻毒，攻毒剂量为猪圆环病毒3型SG株(Porcine Circovirus type 3，strainSG，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.V201712，保藏日期为2017年3月23日，保藏地址：中国武汉·武汉大学)10^5.0TCID₅₀/头，攻毒后连续观察各仔猪，根据各仔猪临床症状、病理变化和病毒检测、保护率结果进行判定，具体结果见表6。

表6含PCV3抗原免疫原性组合物PCV3部分免疫原性试验结果

结果显示，含PCV3抗原免疫原性组合物免疫仔猪后，一次免疫即能针对PCV3感染为仔猪提供100％(5/5)保护，而攻毒对照组仔猪攻毒后全部发病。表明本发明提供的含PCV3抗原免疫原性组合物中PCV3抗原部分具有很好的保护效力，能对猪提供100％的保护，且病毒检测均为阴性。因为本发明的含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物免疫攻毒后在猪体内均不能检测到病毒，这说明当免疫本发明的免疫原性组合物后，即便野毒感染了免疫的猪只，也不会对猪的发育生长、进食增肥产生影响。

本发明的PCV3抗原与多种病毒抗原、细菌抗原之间不干扰，能共同组成免疫原性组合物后施用。

2、CSFV部分免疫原性试验

将20日龄经ELISA检测PCV2、PCV3、CSFV抗原、抗体阴性的健康仔猪8头随机分成2组，4头/组。第10组免疫实施例12制备的免疫原性组合物1，第11组不免疫作为攻毒对照组。将每头份2ml免疫原性组合物稀释3000倍，肌肉注射，每头1ml，攻毒对照组接种DMEM培养基1ml/头。10～14日后，连同条件相同的攻毒对照组4头，注射猪瘟石门系血毒1.0ml/头(10⁵MLD)，观察16日。结果见表7。

表7含PCV3抗原免疫原性组合物CSFV部分免疫原性试验结果

组别	免疫头份	保护率	临床症状
				10	1/3000	100％(4/4)	无体温反应
11	DMEM培养基1ml	0％(0/4)	4头均死亡

根据中国兽药典标准，检测CSFV疫苗免疫效力，需将疫苗稀释300倍以上免疫后，再进行检测，结果显示，本发明含PCV3抗原免疫原性组合物1/3000头份免疫仔猪后，能针对CSFV感染为仔猪提供100％(4/4)保护，且没有体温反应，而攻毒对照组仔猪攻毒后全部发病死亡。表明本发明提供的含PCV3抗原免疫原性组合物中的CSFV抗原部分具有很好的保护效力及安全性，一次免疫即可提供完全保护。

3、PRV部分免疫原性试验

将9日龄经ELISA检测PCV2、PCV3、PRV抗原、抗体阴性的健康仔猪15头随机分成3组，5头/组，第12组免疫实施例12制备的免疫原性组合物2，第13组免疫实施例12制备的免疫原性组合物4，第14组不免疫作为攻毒对照组。免疫组注射免疫原性组合物2ml/头，攻毒对照组接种DMEM培养基2ml/头。免疫后21日进行攻毒，攻毒剂量为猪伪狂犬病病毒HN1201株10^7.0TCID₅₀/头，攻毒后每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况，具体结果见表8。

表8含PCV3抗原免疫原性组合物PRV部分免疫原性试验结果

结果显示，含PCV3抗原免疫原性组合物一次免疫免疫仔猪后，可阻断病毒感染(出现临床症状)，能针对PRV感染为仔猪提供100％(5/5)保护，而攻毒对照组仔猪攻毒后4日全部死亡。表明本发明提供的含PCV3抗原免疫原性组合物中的PRV灭活抗原或活病毒抗原部分均具有很好的保护效力，一次免疫即可提供完全保护。

4、PRRSV部分免疫原性试验

将4～6周龄经ELISA检测PCV2、PCV3、PRRSV抗原、抗体阴性的健康仔猪10头随机分成2组，5头/组，第15组免疫实施例12制备的免疫原性组合物3，第16组不免疫作为攻毒对照组。免疫组注射免疫原性组合物2ml/头，攻毒对照组接种DMEM培养基2ml/头。免疫后28日进行攻毒，攻毒剂量为猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株10^5.0TCID₅₀/头，每日测温并观察临床症状和死亡情况。具体结果见表9。

表9含PCV3抗原免疫原性组合物PRRSV部分免疫原性试验结果

结果显示，含PCV3抗原免疫原性组合物免疫仔猪后，一次免疫即能针对PRRSV感染为仔猪提供100％(5/5)保护，而攻毒对照组仔猪攻毒后全部发病且死亡3头。表明本发明提供的含PCV3抗原免疫原性组合物中的PRRSV抗原部分具有很好的保护效力，一次免疫即可提供完全保护。

5、PPV部分免疫原性试验

将10～20kg经ELISA检测PCV2、PCV3、PPV抗原、抗体阴性的健康仔猪10头随机分成2组，5头/组，第17组免疫实施例12制备的免疫原性组合物5，第18组不免疫作为空白对照组。免疫组注射免疫原性组合物2ml/头，空白对照组接种DMEM培养基2ml/头。免疫后28日，连同空白对照组采血，测定抗体，空白对照组应为阴性(HI抗体效价≤1:8)，免疫组至少4头出现抗体反应，HI抗体效价≥1:64。具体结果见表10。

表10含PCV3抗原免疫原性组合物PPV部分免疫原性试验结果

结果显示，含PCV3抗原免疫原性组合物一次免疫仔猪后，PPV的HI抗体均大于1:64，能针对PPV感染为仔猪提供100％(5/5)保护。表明本发明提供的含PCV3抗原免疫原性组合物中的PPV抗原部分具有很好的保护效力。

6、HPs部分免疫原性试验

将14～21日龄仔猪经ELISA检测PCV2、PCV3、HPs抗原、抗体阴性的健康仔猪30头随机分成6组，5头/组，第19组、第20组免疫实施例12制备的免疫原性组合物6，第21组、第22组免疫实施例12制备的免疫原性组合物8，第23组、第24组不免疫作为攻毒对照组。免疫组注射免疫原性组合物2ml/头，攻毒对照组接种DMEM培养基2ml/头。免疫后35天，取免疫组第19组、第21组，攻毒对照组第23组，用4型JS株进行攻毒，腹腔注射3ml菌液，攻毒剂量为9.0×10⁹CFU/头；取免疫组第20组、第22组，攻毒对照组第24组，用5型ZJ株进行攻毒，腹腔注射3ml菌液，攻毒剂量为6.0×10⁹CFU/头；攻毒后观察其临床表现，观察14天后剖杀试验猪，进行病理观察。具体结果见表11。

表11含PCV3抗原免疫原性组合物HPs部分免疫原性试验结果

组别	仔猪数	4型JS株攻毒保护率	5型ZJ株攻毒保护率
				19	5	5/5	—
20	5	—	5/5
				21	5	5/5	—
22	5	—	5/5
				23	5	0/5	—
24	5	—	0/5

注：副猪嗜血杆菌病发病标准：发病猪出现发热(体温40.5℃以上，持续1～5日)、精神萎靡、咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行和被毛粗乱等临床症状。对濒死猪剖检，可见多发性浆膜炎(胸膜炎、心包炎、腹膜炎)、关节炎和脑膜炎等病变，各浆膜面(关节囊、心包膜、胸膜和腹膜)出现浆液性或纤维素性渗出物。

结果显示，含PCV3抗原免疫原性组合物一次免疫仔猪后，能针对HPs 4型、5型菌感染为仔猪提供100％(5/5)保护，而攻毒对照组仔猪攻毒后全部发病。表明本发明提供的含PCV3抗原免疫原性组合物中的4型、5型HPs抗原部分均具有很好的保护效力，一次免疫即可提供完全保护。

7、Mhp部分免疫原性试验

将14～21日龄仔猪经ELISA检测PCV2、PCV3、Mhp抗原、抗体阴性的健康仔猪15头随机分成3组，5头/组，第25组免疫实施例12制备的免疫原性组合物7，第26组免疫实施例12制备的免疫原性组合物8，第27组不免疫作为攻毒对照组。免疫组注射免疫原性组合物2ml/头，攻毒对照组接种DMEM培养基2ml/头。免疫后35天，取免疫组第25组、第26组，攻毒对照组第27组，用CVCC354株(购自中国兽医药品监察所，该菌株为中国兽医药品监察所保藏的猪支原体肺炎疫苗效力检验用毒株)气管注射5ml/头(100MID)，攻毒后观察28天，剖杀取肺，按28分法对试验猪的气喘病肺炎病变进行评分，按下列公式计算肺炎病变减少率。具体结果见表12。

肺炎病变减少率＝(攻毒对照猪肺炎病变平均分-免疫猪肺炎病变平均分)/攻毒对照猪肺炎病变平均分×100％

表12含PCV3抗原免疫原性组合物Mhp部分免疫原性试验结果

组别	仔猪数	平均肺病变指数±标准差	肺炎病变减少率
				25	5	2.0±0.82<sup>b</sup>	83.6％
26	5	1.9±1.24<sup>b</sup>	84.2％
				27	5	13.2±2.64<sup>a</sup>	/

注：差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，字母不同表示差异显著(P＜0.05)

结果显示，含PCV3抗原免疫原性组合物免疫仔猪后，针对Mhp感染，各免疫组与攻毒对照组相比，免疫组与对照组平均肺病变存在显著差异。表明本发明提供的含PCV3抗原免疫原性组合物中的Mhp抗原部分具有很好的保护效力，一次免疫即能提供很好的免疫保护。

综上，从以上不同免疫原性组合物针对PCV2、CSFV、PRV、PRRSV、PPV、HPs 4型菌、HPs 5型菌、Mhp的免疫原性试验结果来看，各免疫原性组合物均能达到较好的保护效果，表明本发明提供的含PCV3抗原免疫原性组合物中各抗原成分之间不发生干扰，均具有很好的保护力，一次免疫即可提供很好的保护。

实施例14含PCV3抗原免疫原性组合物广谱性保护试验

将28～30日龄经ELISA检测PCV2、PCV3抗原、抗体阴性的健康仔猪225头随机分成45组，5头/组，第28～32组免疫实施例12制备的免疫原性组合物1，第33～37组免疫实施例12制备的免疫原性组合物2，第38～42组免疫实施例12制备的免疫原性组合物3，第43～47组免疫实施例12制备的免疫原性组合物4，第48～52组免疫实施例12制备的免疫原性组合物5，第53～57组免疫实施例12制备的免疫原性组合物6，第58～62组免疫实施例12制备的免疫原性组合物7，第63～67组免疫实施例12制备的免疫原性组合物8，第68～72组不免疫作为攻毒对照组。各免疫组注射免疫原性组合物2ml/头，攻毒对照组接种DMEM培养基2ml/头。免疫后28日进行攻毒，第28组、第33组、第38组、第43组、第48组、第53组、第58组、第63组、第68组用新近从中国河南省分离的PCV3HN12株强毒株攻毒；第29组、第34组、第39组、第44组、第49组、第54组、第59组、第64组、第69组用新近从中国江苏省分离的PCV3JS08株强毒株攻毒；第30组、第35组、第40组、第45组、第50组、第55组、第60组、第65组、第70组用新近从中国吉林省分离的PCV3JL11株强毒株攻毒；第31组、第36组、第41组、第46组、第51组、第56组、第61组、第66组、第71组用新近从中国重庆市分离的PCV3CQ04株强毒株攻毒；第32组、第37组、第42组、第47组、第52组、第57组、第62组、第67组、第72组用新近从中国广东省分离的PCV3GD05株强毒株攻毒；攻毒剂量为10^5.0TCID₅₀/头，攻毒后连续观察各仔猪，根据各仔猪临床症状、病理变化和病毒检测、保护率进行判定，具体结果见表13～21。

表13含PCV3抗原的免疫原性组合物1广谱性保护试验结果

组别	临床症状	病理变化	病毒检测(阳性率)	保护率
					28	无异常	无异常	0％(0/5)	100％(5/5)
29	无异常	无异常	0％(0/5)	100％(5/5)
					30	无异常	无异常	0％(0/5)	100％(5/5)
31	无异常	无异常	0％(0/5)	100％(5/5)
					32	无异常	无异常	0％(0/5)	100％(5/5)

表14含PCV3抗原的免疫原性组合物2广谱性保护试验结果

组别	临床症状	病理变化	病毒检测(阳性率)	保护率
					33	无异常	无异常	0％(0/5)	100％(5/5)
34	无异常	无异常	0％(0/5)	100％(5/5)
					35	无异常	无异常	0％(0/5)	100％(5/5)
36	无异常	无异常	0％(0/5)	100％(5/5)
					37	无异常	无异常	0％(0/5)	100％(5/5)

表15含PCV3抗原的免疫原性组合物3广谱性保护试验结果

组别	临床症状	病理变化	病毒检测(阳性率)	保护率
					38	无异常	无异常	0％(0/5)	100％(5/5)
39	无异常	无异常	0％(0/5)	100％(5/5)
					40	无异常	无异常	0％(0/5)	100％(5/5)
41	无异常	无异常	0％(0/5)	100％(5/5)
					42	无异常	无异常	0％(0/5)	100％(5/5)

表16含PCV3抗原的免疫原性组合物4广谱性保护试验结果

组别	临床症状	病理变化	病毒检测(阳性率)	保护率
					43	无异常	无异常	0％(0/5)	100％(5/5)
44	无异常	无异常	0％(0/5)	100％(5/5)
					45	无异常	无异常	0％(0/5)	100％(5/5)
46	无异常	无异常	0％(0/5)	100％(5/5)
					47	无异常	无异常	0％(0/5)	100％(5/5)

表17含PCV3抗原的免疫原性组合物5广谱性保护试验结果

组别	临床症状	病理变化	病毒检测(阳性率)	保护率
					48	无异常	无异常	0％(0/5)	100％(5/5)
49	无异常	无异常	0％(0/5)	100％(5/5)
					50	无异常	无异常	0％(0/5)	100％(5/5)
51	无异常	无异常	0％(0/5)	100％(5/5)
					52	无异常	无异常	0％(0/5)	100％(5/5)

表18含PCV3抗原的免疫原性组合物6广谱性保护试验结果

组别	临床症状	病理变化	病毒检测(阳性率)	保护率
					53	无异常	无异常	0％(0/5)	100％(5/5)
54	无异常	无异常	0％(0/5)	100％(5/5)
					55	无异常	无异常	0％(0/5)	100％(5/5)
56	无异常	无异常	0％(0/5)	100％(5/5)
					57	无异常	无异常	0％(0/5)	100％(5/5)

表19含PCV3抗原的免疫原性组合物7广谱性保护试验结果

表20含PCV3抗原的免疫原性组合物8广谱性保护试验结果

组别	临床症状	病理变化	病毒检测(阳性率)	保护率
					63	无异常	无异常	0％(0/5)	100％(5/5)
64	无异常	无异常	0％(0/5)	100％(5/5)
					65	无异常	无异常	0％(0/5)	100％(5/5)
66	无异常	无异常	0％(0/5)	100％(5/5)
					67	无异常	无异常	0％(0/5)	100％(5/5)

表21广谱性保护试验攻毒对照组试验结果

结果显示，第68～72组攻毒对照组攻毒后均不同程度出现体温升高40.5℃以上，持续3～5天，食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓等临床症状，剖检均出现不同程度肺实变、淋巴肿大、肾有坏死点的病理变化，通过各脏器组织进行PCR检测，可再次分离到PCV3病毒；而第28～67组免疫组攻毒后无异常临床症状，剖检各组织器官也无异常，通过各脏器组织进行PCR检测，均显示PCV3阴性。表明本发明提供的含PCV3抗原免疫原性组合物可对猪只针对不同地域来源的PCV3攻毒提供有效的、完全免疫保护，且从各脏器组织中不能检出攻毒的PCV3株。

表明本发明的含PCV3抗原免疫原性组合物具有广谱的免疫原性，对于不同地域来源的PCV3均能提供完全保护。当免疫本发明的免疫原性组合物后，即便野毒感染了免疫的猪只，也不会对猪的发育生长、进食增肥产生影响。

综上，从以上含PCV3抗原不同免疫原性组合物针对不同地域来源的PCV3免疫原性试验结果来看，各免疫原性组合物均能达到良好的保护效果，表明本发明提供的含PCV3抗原免疫原性组合物具有很好的保护效力，一次免疫即能提供完全保护。

实施例15含PCV3抗原免疫原性组合物混合感染保护试验

1、PCV3、CSFV混合感染保护试验

将28～30日龄经ELISA检测PCV2、PCV3、CSFV抗原、抗体阴性的健康仔猪15头随机分成3组，5头/组。第73组免疫实施例12制备的免疫原性组合物1，第74组、第75组不免疫作为攻毒对照组。免疫组注射免疫原性组合物2ml/头，攻毒对照组接种DMEM培养基2ml/头。免疫后28日进行攻毒，攻毒剂量为SG株猪圆环病毒10^5.0TCID₅₀/头，猪瘟石门系血毒1.0ml/头(10⁵MLD)，第73组同时攻毒PCV3和CSFV，第74组为PCV3攻毒对照组，第75组为CSFV攻毒对照组，攻毒后连续观察各仔猪，根据各仔猪临床症状、病理变化进行判定，具体结果见表22。

表22PCV3、CSFV混合感染保护试验结果

结果显示，含PCV3抗原免疫原性组合物免疫仔猪后，一次免疫能针对PCV3、CSFV混合感染为仔猪提供100％(5/5)保护，且没有体温反应，而两组攻毒对照组仔猪攻毒后全部发病或死亡。表明本发明提供的含PCV3抗原免疫原性组合物具有很好的保护力及安全性，一次免疫即能对PCV3、CSFV混合感染提供完全保护。

2、PCV3、PRV混合感染保护试验

将9日龄经ELISA检测PCV2、PCV3、PRV抗原、抗体阴性的健康仔猪20头随机分成4组，5头/组。第76组免疫实施例12制备的免疫原性组合物2，第77组免疫实施例12制备的免疫原性组合物4，第78组、第79组不免疫作为攻毒对照组。免疫组注射免疫原性组合物2ml/头，攻毒对照组接种DMEM培养基2ml/头。免疫后28日进行攻毒，攻毒剂量为SG株猪圆环病毒10^5.0TCID₅₀/头，猪伪狂犬病病毒HN1201株10^7.0TCID₅₀/头，第76组、第77组同时攻毒PCV3和PRV，第78组为PCV3攻毒对照组，第79组为PRV攻毒对照组，攻毒后连续观察各仔猪，根据各仔猪临床症状、病理变化和病毒检测、保护率结果进行判定，具体结果见表23。

表23PCV3、PRV混合感染保护试验结果

结果显示，含PCV3抗原免疫原性组合物免疫仔猪后，一次免疫即能针对PCV3、PRV混合感染为仔猪提供100％(5/5)保护，而两组攻毒对照组仔猪攻毒后全部发病或死亡。表明本发明提供的含PCV3抗原免疫原性组合物具有很好的保护效力及安全性，一次免疫即能对PCV3、PRV混合感染提供完全保护。

3、PCV3、PRRSV混合感染保护试验

将28～30日龄经ELISA检测PCV2、PCV3、PRRSV抗原、抗体阴性的健康仔猪15头随机分成3组，5头/组。第80组免疫实施例12制备的免疫原性组合物3，第81组、第82组不免疫作为攻毒对照组。免疫组注射免疫原性组合物2ml/头，攻毒对照组接种DMEM培养基2ml/头。免疫后28日进行攻毒，攻毒剂量为SG株猪圆环病毒10^5.0TCID₅₀/头，猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株10^5.0TCID₅₀/头，第80组同时攻毒PCV3和PRRSV，第81组为PCV3攻毒对照组，第82组为PRRSV攻毒对照组，攻毒后连续观察各仔猪，根据各仔猪临床症状、病理变化进行判定，具体结果见表24。

表24PCV3、PRRSV混合感染保护试验结果

结果显示，含PCV3抗原免疫原性组合物免疫仔猪后，一次免疫即能针对PCV3、PRRSV混合感染为仔猪提供100％(5/5)保护，而两组攻毒对照组仔猪攻毒后全部发病或死亡。表明本发明提供的含PCV3抗原免疫原性组合物具有很好的保护效力及安全性，一次免疫即能对PCV3、PRRSV混合感染提供完全保护。

4、PCV3、HPs、Mhp混合感染保护试验

将21日龄经ELISA检测PCV2、PCV3、HPs、Mhp抗原、抗体阴性的健康仔猪25头随机分成5组，5头/组。第83组免疫实施例12制备的免疫原性组合物8，第84组、第85组、第86组、第87组不免疫作为攻毒对照组。免疫组注射免疫原性组合物2ml/头，攻毒对照组接种DMEM培养基2ml/头。免疫后35日进行攻毒，攻毒剂量为SG株猪圆环病毒10^5.0TCID₅₀/头，副猪嗜血杆菌4型JS株9.0×10⁹CFU/头、5型ZJ株6.0×10⁹CFU/头，猪肺炎支原体CVCC354株100MID/头，第83组同时攻毒PCV3、HPs和Mhp，第84组为PCV3攻毒对照组，第85组为HPs 4型攻毒对照组，第86组为HPs 5型攻毒对照组，第87组为Mhp攻毒对照组，攻毒后连续观察各仔猪，根据各仔猪临床症状、病理变化进行判定，具体结果见表25。

表25PCV3、HPs、Mhp混合感染保护试验结果

结果显示，含PCV3抗原免疫原性组合物免疫仔猪后，一次免疫即能针对PCV3、HPs、Mhp混合感染为仔猪提供100％(5/5)保护，而四组攻毒对照仔猪攻毒后全部发病。表明本发明提供的含PCV3抗原免疫原性组合物具有很好的保护效力及安全性，一次免疫即能对PCV3、HPs、Mhp混合感染提供完全保护。

综上，从以上含PCV3抗原不同免疫原性组合物针对PCV3与其他病原的混合感染免疫原性试验结果来看，各免疫原性组合物均能达到较好的保护效果，表明本发明提供的含PCV3抗原免疫原性组合物具有很好的保护效力。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 普莱柯生物工程股份有限公司

<120> 一种含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 645

<212> DNA

<213> 猪圆环病毒3型

<400> 1

atgcgtcacc gtgctatctt ccgtcgtcgt ccgcgtccgc gtcgtcgtcg tcgtcaccgt 60

cgtcgttacg ctcgtcgtaa actgttcatc cgtcgtccga ccgctggtac ctactacacc 120

aaaaaatact ctaccatgaa cgttatctct gttggtaccc cgcagaacaa caaaccgtgg 180

cacgctaacc acttcatcac ccgtctgaac gaatgggaaa ccgctatctc tttcgaatac 240

tacaaaatcc tgaaaatgaa agttaccctg tctccggtta tctctccggc tcagcagacc 300

aaaaccatgt tcggtcacac cgctatcgac ctggacggtg cttggaccac caacacctgg 360

ctgcaggacg acccgtacgc tgaatcttct acccgtaaag ttatgacctc taaaaaaaaa 420

cactctcgtt acttcacccc gaaaccgctg ctggctggta ccacctctgc tcacccgggt 480

cagtctctgt ctttcttctc tcgtccgacc ccgtggctga acacctacga cccgaccgtt 540

cagtggggtg ctctgctgtg gtctatctac gttccggaaa aaaccggtat gaccgacttc 600

tacggtacca aagaagtttg gatccgttac aaatctgttc tgtaa 645

Claims

1.一种含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物，其中，所述含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物包括免疫量的猪圆环病毒3型Cap蛋白抗原以及药学上可接受的载体；所述猪圆环病毒3型Cap蛋白抗原为猪圆环病毒3型Cap蛋白或重组有所述猪圆环病毒3型Cap蛋白基因的活载体；

其中，所述含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物还包含由免疫量的以下抗原组成的组中的一种或多种：猪瘟病毒抗原、猪伪狂犬病病毒抗原、猪流感病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪细小病毒抗原、猪乙型脑炎病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪链球菌抗原、猪波氏杆菌抗原、猪传染性胸膜肺炎抗原、猪多杀性巴氏杆菌抗原、猪霍乱沙门氏菌抗原、猪肺炎支原体抗原、猪鼻支原体抗原。

2.根据权利要求1所述的含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物，其中，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白为序列SEQ.ID No.1编码的蛋白。

3.根据权利要求1所述的含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物，其中，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白含量为≥20μg/ml。

4.根据权利要求1所述的含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物，其中，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白含量为20μg/ml～100μg/ml；优选地，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白含量为20μg/ml～50μg/ml；优选地，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白含量为30μg/ml～50μg/ml。

5.根据权利要求1所述的含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物，其中，所述重组有所述猪圆环病毒3型Cap蛋白基因的活载体为重组减毒沙门氏菌、重组新城疫病毒、重组痘病毒、或重组腺病毒。

6.根据权利要求1所述的含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物，其中，所述含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物包含由免疫量的以下抗原组成的组中的一种或多种：猪瘟病毒减毒抗原、猪伪狂犬病病毒减毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒减毒抗原、猪细小病毒亚单位抗原、副猪嗜血杆菌灭活抗原、猪肺炎支原体灭活抗原；或

所述含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物包含由免疫量的以下抗原组成的组中的一种或多种：猪瘟病毒减毒抗原、猪伪狂犬病病毒灭活抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒减毒抗原、猪细小病毒亚单位抗原、副猪嗜血杆菌灭活抗原、猪肺炎支原体灭活抗原；

优选地，所述猪瘟病毒减毒抗原为猪瘟病毒兔化弱毒株、所述猪伪狂犬病病毒减毒抗原为HN1201-R株、所述猪伪狂犬病病毒灭活抗原为HN1201株灭活抗原、所述猪繁殖与呼吸综合征病毒减毒抗原为JXA1-R株、所述猪细小病毒亚单位抗原为猪细小病毒HN-2011株VP2蛋白、所述副猪嗜血杆菌灭活抗原为副猪嗜血杆菌血清4型JS株和5型ZJ株灭活抗原、所述猪肺炎支原体灭活抗原为HN0613株灭活抗原。

7.根据权利要求6所述的含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物，其中，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白含量为20μg/ml～100μg/ml，所述猪瘟病毒减毒抗原含量为10^4.0～10^6.0TCID₅₀/ml，所述猪伪狂犬病病毒减毒抗原含量为10^6.0～10^7.0TCID₅₀/ml，所述猪伪狂犬病病毒灭活抗原含量为灭活前10^6.0～10^7.0TCID₅₀/ml，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒减毒抗原含量为10^5.0～10^7.0TCID₅₀/ml，所述猪细小病毒VP2蛋白血凝价为2⁹～2¹⁶，所述副猪嗜血杆菌灭活抗原含量为灭活前10^8.0～10^10.0CFU/ml，所述猪肺炎支原体灭活抗原含量为灭活前10^8.0～10^10.0CCU/ml；

优选地，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白含量为20μg/ml～100μg/ml，所述猪瘟病毒减毒抗原含量为10^5.0TCID₅₀/ml，所述猪伪狂犬病病毒减毒抗原含量为10^6.0TCID₅₀/ml，所述猪伪狂犬病病毒灭活抗原含量为灭活前10^6.0TCID₅₀/ml，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒减毒抗原含量为10^6.0TCID₅₀/ml，所述猪细小病毒VP2蛋白血凝价为2¹²，所述副猪嗜血杆菌灭活抗原含量为灭活前10^9.0CFU/ml，所述猪肺炎支原体灭活抗原含量为灭活前10^9.0CCU/ml。

8.根据权利要求1所述的含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物，其中，所述药学上可接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括白油、德雷克油，以及动物油、植物油或矿物油；或氢氧化铝、磷酸铝及金属盐；或Montanide^TMGel、卡波姆、角鲨烷或角鲨烯、ISA206佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；优选地，所述佐剂为Montanide^TMGel；

所述佐剂含量为5～20V/V％；更优选地，所述佐剂含量为10V/V％。

9.根据权利要求1～8任一项所述的含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物在制备预防和/或治疗猪圆环病毒3型相关疾病的药物中的应用；优选地，所述猪圆环病毒3型相关疾病包括断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪的皮炎肾病综合征、增生性坏死性肺炎、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应。

10.根据权利要求1～8任一项所述的含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物在制备预防和/或治疗猪圆环病毒3型混合感染导致的疾病的药物中的应用。