ES2655013T3 - Proteínas sintéticas de la cápside y usos de las mismas - Google Patents

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Abstract

Una proteína que comprende una secuencia seleccionada de la SEQ ID nº: 2, 4 o 6, o una secuencia que tiene al menos un 90% de identidad con una cualquiera de dichas secuencias y es capaz de provocar o estimular una respuesta inmunitaria contra un virus CVP2.

Description

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gondii; virus de la estomatitis vesicular y virus de exantema porcino u otras cepas y subtipos de circovirus porcino.
La presente invención también proporciona un recipiente que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de una proteína, ácido nucleico o vacuna como se describió anteriormente. La invención también proporciona equipos de vacunación que comprenden un recipiente opcionalmente estéril que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de la vacuna, medios para administrar la vacuna a animales, y opcionalmente un manual de instrucciones que incluye información para la administración de la cantidad inmunológicamente eficaz de la composición para tratar y/o prevenir las enfermedades asociadas a CVP2.
Composiciones y métodos de diagnóstico
Una descripción adicional de la invención reside en un método para diagnosticar la presencia de un circovirus en animales no humanos, reactivos usados para los mismos y equipos de diagnóstico.
En base a las secuencias de nucleótidos como se describió anteriormente, es posible producir reactivos capaces de reconocer circovirus porcinos. Una persona experta en la técnica podría seleccionar fragmentos de alrededor de 20 a 50 pb dentro de la SEQ ID nº: 1, 3 o 5, para llevar a cabo un diagnóstico específico. Por lo tanto, las secuencias de ADN descritas en la presente memoria y sus fragmentos pueden usarse como sondas y/o cebadores para detectar la presencia de circovirus por hibridación o experimentos de PCR. Los antígenos codificados por el virus o expresados mediante un vector también pueden usarse como un reactivo para diagnóstico que puede detectarse por inmunofluorescencia o experimentos de transferencia Western. Los anticuerpos monoclonales o policlonales como se describió anteriormente se pueden usar en pruebas de diagnóstico y reactivos según técnicas que son bien conocidas en la técnica, por ejemplo por ELISA e inmunocromatografía.
La presente invención describe además un método para generar un anticuerpo que es capaz de unirse a un virus CVP2. El método puede comprender inmunizar un animal no humano, tal como un conejo, cobaya o roedor, con una proteína o péptido de la invención y recoger el anticuerpo producido de ese modo. Los anticuerpos de la invención pueden ser preparados de anticuerpos policlonales o monoclonales, antisueros monoespecíficos, anticuerpos humanos, o pueden ser anticuerpos híbridos o mixtos, tales como anticuerpos humanizados, fragmentos de anticuerpos alterados (Fab')2, fragmentos F(ab), fragmentos Fc, anticuerpos de un solo dominio, fragmentos o montajes de anticuerpos diméricos o triméricos o fragmentos funcionales de los mismos que se unen al antígeno en cuestión. Los anticuerpos pueden producirse empleando técnicas bien conocidas de por si para los expertos en la técnica y descritas en "A Laboratory Manual, Harlow y Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1988)".
El equipo de diagnóstico por lo tanto puede comprender sondas o cebadores de ADN, antígenos y/o anticuerpos policlonales o monoclonales específicos para las proteínas de la invención, y las pruebas de diagnóstico pueden realizarse en una muestra de fluido fisiológico (sangre, plasma, suero y similares) o un muestra de tejido (ganglios, hígado, pulmones, riñones y similares) obtenida de un cerdo a analizar.
La invención describe además un anticuerpo (o un derivado o uno de sus fragmentos) que se une específicamente a una proteína o péptido de la invención.
La invención también describe un anticuerpo (o un derivado o uno de sus fragmentos) que se une a un epítopo contenido en la SEQ ID nº: 7.
Otros aspectos y ventajas de la invención se proporcionan en el apartado siguiente, que debe considerarse solamente ilustrativo.
Ejemplos
A. Síntesis y estructura de PRO1 y PRO2
PRO1 (SEQ ID nº: 2) y PRO2 (SEQ ID nº: 4) fueron diseñados por los inventores para proporcionar vacunas mejoradas contra la infección por CVP2. Partiendo de un análisis de múltiples proteínas víricas de la cápside de origen natural, los inventores han diseñado y concebido proteínas nuevas y artificiales. Estas proteínas son estructuralmente distintas de las proteínas de la cápside de origen natural y presentan potente inmunogenia. Se pueden producir de manera eficiente a partir de células anfitrionas recombinadas.
Se produjeron dos proteínas. Su secuencia se expone en las SEQ ID nº: 2 y nº: 4. La secuencia de un ácido nucleico codificante se representa en las SEQ ID nº: 1 y nº: 3, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos de estas proteínas se construyeron y clonaron en un vector de expresión. El vector de expresión se usó para (i) replicar y mantener el ácido nucleico en un anfitrión bacteriano y (ii) para producir la proteína.
B. Síntesis y estructura de PRO3 (SEQ ID nº: 6)
La secuencia PRO2 (SEQ ID nº: 4) se utilizó como una secuencia de referencia y se modificó además para crear la secuencia PRO3: Entre otras, se realizaron las siguientes optimizaciones:
Se eliminó un punto de escisión potencial en la posición de aminoácido 165.
Se introdujo una mutación en la posición 200.
Se hizo una sustitución en la posición 161.
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Se hizo una sustitución en la posición 170.
Se sustituyó el resto S en la posición 225 por un D.
Se hizo una sustitución en la posición 143.
Se hicieron dos sustituciones en el terminal N de la secuencia (posiciones 13 y 20).
La secuencia de nucleótidos se construyó y se clonó en un vector de expresión. La secuencia se representa en la SEQ ID nº: 5. La secuencia de proteína codificada se representa como SEQ ID nº: 6. El vector de expresión se usa para (i) replicar y mantener el ácido nucleico en un anfitrión bacteriano y (ii) para producir la proteína.
C. Expresión de PRO1 e inmunogenia
Se logró expresar PRO1 en células Sf9 dando como resultado un producto que tenía las propiedades antigénicas esperadas. La transferencia Western demostró que la proteína tiene el peso molecular esperado y se detectó la proteína PRO1 por diferentes mAb de CVP2 en experimentos de ELISA.
C1: Generación de baculovirus recombinantes
El ADN de baculovirus linealizado (ADN viral BD BaculoGold™, nº en Cat. 554739), ADN de vector de transferencia de baculovirus recombinante que contiene el gen de inserción (pVL1393-Flag-PRO1 y Reactivo de Transfección PolyFect (Qiagen nº en Cat. 301105) se mezclaron en medio sin proteína Xpress de insecto (Lonza, nº en Cat. 12730Q) y se incubaron con células de insecto Sf9 recién sembradas (Invitrogen nº 12659-017) a 27ºC durante 6 días.
C2: Amplificación de virus
Se utilizaron células Sf9 en fase logarítmica en un matraz de cultivo hístico de 175 cm2 (al 50-70% de confluencia, aproximadamente 2,5 a 3,5 x 107células/matraz). Se mezcló y se añadió a las células 1 ml del solución madre de virus (véase el ejemplo 1) y 4 ml de medio sin suero Lonza reciente enriquecido con solución de Penicilina-Estreptomicina (nº en Cat. Sigma: P4333). Las células se incubaron a 27°C durante 3 horas y luego se añadieron 15 ml de medio reciente a las células infectadas, y las células se incubaron a 27°C durante 5-6 días más. Dado que las partículas de virus se liberaron en el medio, el sobrenadante se recogió pipeteando el medio en un tubo de polipropileno estéril de 50 ml. La suspensión se centrifugó a 2.000 g durante 5 minutos y la solución madre se almacenó a 4°C. La amplificación de virus se realizó varias veces para lograr un alto valor de virus. Para la primera amplificación se usó el sobrenadante de la cotransfección, más tarde las soluciones madre de virus generadas. La solución madre de virus del pase 3 se utilizó para la producción de proteínas.
C3: expresión de proteína recombinada en células Sf9
Se usaron células Sf9 en fase logarítmica en matraces de cultivo hístico de 175 cm2 (confluencia 70-80%). Se añadieron a las células medio ml de solución madre vírica de alto valor y medio reciente enriquecido con penicilinaestreptomicina. Se incubaron las células a 27°C durante 3 horas, luego se añadieron 15 ml de medio nuevo a las células transfectadas. Las células se incubaron más a 27°C durante 4-5 días. Se retiraron las células del matraz con un raspador celular (Sarstedt 83.1830) y se centrifugaron a 2.500 g durante 5 minutos. Después de descartar el sobrenadante, los cultivos celulares se volvieron a poner en suspensión en 1 ml de amortiguador PBS (GIBCO, nº en Cat.: 14040). Las células en suspensión se recogieron, la suspensión se sometió a ultrasonidos cuatro veces durante 40 segundos. La suspensión sometida a ultrasonidos se centrifugó a 3.000 g durante 10 minutos a 4°C. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y se centrifugó a 5.000 g durante 10 minutos a 4ºC. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y se almacenó a -20°C.
C4: Detección del antígeno Baculo-PRO1 por inmunofluorescencia
Se infectaron células Sf9 en placas de 24 pocillos (4 x 106/pocillo) con diluciones de 10 veces del virus Baculo PRO1. Las placas se incubaron durante 4 días a 27°C. Después de la incubación, las placas se fijaron con acetona preenfriada durante 30 minutos a 4°C. Después de la fijación, las placas se lavaron tres veces en solución salina amortiguada con fosfato (PBS). Después del lavado, el antígeno primario (VMRD, nº en Cat.: PAB-CVP2, dilución 1:500) se dispuso en capas sobre los pocillos y se incubó durante 30 minutos a 37°C, luego se lavó tres veces en PBS. Por último, el conjugado secundario (anticuerpo anti-IgG-FITC de cerdo producido en conejo, SIGMA, nº en Cat.: F-1638, dilución 1:1000) se dispuso en capas sobre el cultivo hístico fijado durante 30 minutos a 37°C, luego se lavaron las placas tres veces en PBS. La presencia de Baculo PRO1 se detectó al microscopio de UV.
C5: Inactivación de Baculo PRO1 y formulación
La muestra de BaculoPRO1 recolectada se inactivó con 300 µg/ml de etilenimina a 37ºC durante 24 horas. El control de la inactivación se realizó en la estirpe celular Sf9.
El baculovirus inactivado no puede infectar las células Sf9.
En los ejemplos siguientes, la composición de la vacuna utilizada comprende el baculoPRO1 inactivado formulado en una emulsión de agua en aceite.
C6: Detección de la proteína Baculo PRO1 por inmunotransferencia Western
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