PT98566A - Um processo de producao de um polipeptido do cmv gh humano - Google Patents

Description

Titular: CHIRON CORPORATION

Epígrafe: "UM PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM POLIPEPTIDO gH de CMV HUMANO"

MEMÓRIA DESCRITIVA

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Campo Técnico

Esta invenção refere-se, na generalidade, a vacinas e diagnósticos. Mais particularmente refere-se a métodos de produzir glicoproteinas humanas de CMV recombinantes, particularmente, ao uso do sistema de dispersão de células de baculovirus-insecto para expressar quantidades úteis de glicoproteina-H (gH).

Descrição da Técnica Relacionada 0 citomegalovirus humano (CMV) é um agente ubiquo em populações humanas. As infecções sâo geralmente assintomáticas mas podem haver manifestações médicas sérias da doença em indivíduos imonodeficientes (receptores de transplantes e pacientes da SIDA), e em recém-nascidos infectados congenitamente.

Enquanto as cadeias humanas do CMV têm sido testadas em vacinas, existem muitas objecções ao uso das vacinas 1

experimentais de virus de vida atenuada. Na ausência de uma completa compreensão da biologia do CMV, a tentativa mais racional para uma vacina envolveria o desenvolvimento de vacinas subunitárias baseadas na superfície de glicoproteinas do virus, usando glicoproteinas virais recombinadas as quais permitem a formação dos anticorpos neutralizantes. Infelizmente, a maioria das tentativas recombinantes para este problema não forneceram quantidades de glicoproteina suficientemente grandes para o uso em vacinas. ) 0 CMV especifica múltiplas glicoproteinas (Stinski, M. (1976) Virol. 19:924-932; Pereira, L. et al. (1982) Infect. Immun. 36:924-932). A caracterização destas tem envolvido estudos de células infectadas por CMV e viriões purificados usando anticorpos poli- e monoclonais (Pereira, L. et al. (1984) Viroloqy 139:73-86; Britt,W.J. (1984) Viroloqy 135:369-378; Nowak, B. et al. (1984) Virolocry 132:325-338; Law, K.M. et al. (1985) Med. Virol. JL7s255-266; Rasmussen, L. et al. (1984)

Proc. Natl. Acad, Sei. USA 81:876-880; e Britt e Auger (1986) J. Virol. 58:185-191).

Entre os polipeptideos que têm sido associados com o CMV humano, está uma glicoproteina de 86 kD (gH) que tem sido identificada em células infectadas por CMV e em viriOes, e demonstrada como complemento de indução independente de anticorpos neutralizantes em cobaias (Rasmussen et al., supra, e (1985) Viroloqy 145:186-190; Pachl, C. et al., Viroloqy (1989) 169:418-426; USSN 367.363).

Cranage et al. (1988) Virol. 62^:1416-1422 reportaram que o mapeamento e a análise de sequência do genoma do CMV 2

indicava que um fragmento, designado HindiII L, continha uma estrutura aberta de leitura demonstrando alguma similaridade com os genes do gH do virus herpes simplex 1 (HSV1) e o virus Epstein-Barr (EBV). Esta publicação também mostrou que a terminação 3' do gene gH do CMV estava localizada 222 bp do local HindIII, na fronteira do fragmento HindIII L e o fragmento HindIII, imediatamente acima na cadeia, designado HindIII D. Esta publicação é reiterada na PCT/GB87/00164 (Publicação No. WO87/05326). Aquele pedido PCT descreve ainda a clonagem e ) estrutura do gene humano gH do CMV e a sua expressão usando virus de vacina.

Os requerentes ensinam, no comumente concedido Pedido de Patente Norte Americano co-pendente com o No. de Série 367.363, de 16 de Junho de 1989, aqui incorporado como referência, a localização e sequência de um gene estrutural do CMV humano o qual codifica o gH juntamente com a sequência de aminoácidos do gH. 0 gene e vários análogos truncados do mesmo foram inseridos em vectores de dispersão dos mamíferos e em gH do CMV, e análogos truncados dos mesmos foram expressos a niveis baixos mas detectáveis em células COS. O gH recombinante e certos análogos foram imunologicamente reactivos com um anticorpo monoclonal neutralizante (murina monoclonal 1G6, Rasmussen et al., PMAS (1984) 81:876-880) para a proteina inactiva (gp86).

Apesar do progresso que tem sido feito, um grande obstáculo ao desenvolvimento de uma vacina de subunidade de CMV, tem sido a incapacidade de exprimir altos niveis de polipeptideos relacionados com o gH do CMV humano em qualquer dos sistemas de expressão convencionais. 3

Recentemente, foi desenvolvido um sistema de dispersão que utiliza vectores de baculovirus para introduzir genes estruturais de mamíferos em células de insectos em cultura e subsequentemente efectuar a expressão dos polipeptideos heterólogos. Isto tem demonstrado sucesso na expressão recombinante de algumas proteínas. Veja-se, por exemplo, Ju, G., et al., Curr. Communic. in Mol. Biol. - Gene Transfer vectors for Mammalian Cells (1987), C.S.H.L. Press pps. 39-45); Atkinson, A.E., et al., Pestic. Sei. (1990) 28:215-224. ll Em alguns casos, proteínas virais foram expressadas.

Veja-se, por exemplo, a Publicação PCT No. W090/02566 (proteina de fusão do paramixovirus), Publicação EPO No. 341.611 (Vp-2 do parvovirus canino), Publicação EPO No. 329.257 (antigene do circumsporozoito do plasmodium), Publicação PCT No. WO89/05823 (antigene virai sinsicial quimérico respiratório humano), e Publicação EPO No. 272.858 (proteina envelope do HIV).

Em alguns casos, sub-unidades de proteínas de virus da familia do Herpes têm sido apresentadas. Veja-se, por exemplo, ^ Frech, B. et al., Virol. (1990) 64:2759-2767 (EBV-TP-1,

Kristie, T.M. et al., EMBO J. (1989) 8:4229-4238 (HSV alfa TIF), Dodson, M.S., et al. Biol. Chem. (1989) 264:20835-20838 (helicase do HSV-1), Olivo, P.D. et al., Virol. (1989) 63:196-204 (enzimas de replicaçâo do HSV-1), Publicação PCT No. WO89/10965 (polipeptideos de pseudo-rabies e virus infeccioso rhinotracheitus de bovino), e Publicação EPO No. 340.359 (proteina inicial próxima do CMV). A remoção do dominio transmembranal das glicoproteinas superficiais da célula virai dos virus da gripe (Sveda, M.M., et 4 al.r Cell (1982) 30:649-656, Gething, M.J. & J. Sambrook, Nature (1982) 300:598-603) e do virus da estomatite vesicular (Rose,J.K. & J.E. Bergmann; Cell (1982) 30^:753-762) resulta na secreção de glicoproteinas truncadas das células dos mamíferos hospedeiros. Veja-se também, a Publicação EPO No. 139.417. Como se fez notar acima, uma tal tentativa para a expressão do gH em células de mamíferos nao produziu ainda niveis aceitáveis de expressão.

Exposição da Invenção

Sumário da Invenção

Uma dificuldade geral na expressão de genes recombinantes de mamíferos, ê que muitas das proteínas sao resistentes à expressão, particularmente a altos niveis de expressão, em muitos sistemas, e a probabilidade de sucesso para a expressão de uma dada proteina é dificil de prever.

Tentativas anteriores para exprimir niveis elevados de gH do CMV humano foram infrutíferas. Consequentemente, os requerentes tentaram expressar o gH no sistema de expressão celular baculovirus/insecto. Surpreendentemente, verificou-se que pode conseguir-se um aumento de, pelo menos dez vezes (relativamente à expressão em células de mamíferos), na expressão de um polipeptideo imunologicamente útil.

Esta invenção apresenta materiais e métodos para a produção de um polipeptideo humano de CMV, particularmente de análogos do gH, por intermédio de: a) fornecimento de uma célula de insecto hospedeira que contenha DNA codificador do polipeptideo; b) incubação da célula sob condições em que o polipeptideo seja expresso; e c) isolamento do polipeptideo. 5

Num aperfeiçoamento, a invenção inclui vectores de transferência de baculovirus, que consistem num plasmideo bacteriano contendo DNA substancialmente homólogo ao DNA do baculovirus, e um segmento de DNA que codifica um polipeptideo gH do CMV.

Num outro aperfeiçoamento, a invenção inclui um baculovirus contendo DNA que codifica um polipeptideo humano de gH do CMV, no qual a expressão do polipeptideo é controlada por um elemento regulador do baculovirus.

Outro aperfeiçoamento consiste numa célula de insecto contendo DNA que codifica um polipeptideo humano gH do CMV capaz de exprimir o polipeptideo numa quantidade útil.

Num aperfeiçoamento final, a invenção inclui um polipeptideo gH do CMV que é reconhecido por um anticorpo com especificidade para gH do CMV, no qual o polipeptideo é produzido pelo método apresentado abaixo.

Breve Descrição dos Esquemas A FIG. 1 apresenta mapas de restrição mostrando a posição do gene gH no interior do genoma CMV Towne. A Linha A é um mapa de restrição HindiII do genoma de 235 kb CMV Towne, apresentado na orientação do protótipo. As sequências especiais sao indicadas por uma linha fina e os elementos repetidos ab, b'a'cf, ca sao marcados com caixas. A Linha B é um mapa de restrição desde os 3910 bp HindIII A/H ao fragmento PstI codificando o gH. A barra negra corresponde â região de codificação do gH e a seta indica a direcçao de transcrição. As designações dos sitios de restrição são: A, Apal; B, BamHI; Bg, 6 =ssS*

BglII; Bs, Bsphl; E, EcoRI; H, HindIII; P, PstI; S, Smal; T, Tthllll. A FIG.2 é a sequência de nucleotideos do gene gH do CMV Towne. A sequência do DNA, e a sequência de aminoácidos prevista são apresentadas. As sequências putativas TATA, CAT e de poliadenilação foram sublinhadas. Os sitios potenciais de glicosilação N-ligados encontram-se marcados por cima e a sequência de sinal prevista e o dominio transmembranar estão assinalados com caixas. As localizações de peptideos tripticos p86 são indicadas a tracejado (Gln354 até Pro3g4 e Gln37Q até Gln377)· A FIG.3 é um mapa da análise hidropática do gH do CMV Towne. A proteina gH é representada desde a Meti até a CÍS742, da esquerda para a direita, ao longo do eixo dos xx. A hidropatia relativa a cada posição é computada usando uma janela móvel de sete aminoácidos. Os pontos acima do eixo dos xx indicam aumento de hidrofilia e os pontos abaixo do eixo indicam aumento de hidrofobia. A FIG.4 é um diagrama do plasmideo bacteriano pAc373, vulgarmente usado como vector de transferência no sistema de expressão de baculovirus (AcNPV) mostrando os sitios da endonuclease de restrição. A porção em realce do plasmideo mostra as sequências do baculovirus com o gene da polihedrina, marcadas como uma barra aberta. As sequências de nucleotideos e aminoácidos em torno do codão de iniciação do gene da polihedrina são também apresentados. "+1" corresponde ao A do codão de iniciação AUG. A FIG.5 é um diagrama dos vectores de transferência de 7 um gH (pACgH2) e gH truncado no qual o gH do CMV (pACgH6), nos quais as sequências de codificação do gH do CMV foram unidas no sitio BamHl do pAC373. A FI6.6 apresenta a secreção do gH truncado de células de insecto infectadas com gH truncado de expressão recombinante de baculovirus. A FIG.7 apresenta a expressão ao longo do tempo do gH segregado e gH truncada de célula Sf9 infectadas com recombinantes truncados, a todo o comprimento ou no C-terminalf de baculovirus, como foram medidos pelos ensaios ELISA. A FIG.8 apresenta a secreção do gH truncado, expresso pelas células transfectadas com um plasmideo de expressão de células humanas, pCMAd-H6, e célula Sf9 de insecto infectadas com um recombinante de baculovirus, pACgH6.

Descrição Detalhada da Invenção I. Definições "Polipeptideo gH do CMV" refere-se a polipeptideos contendo um fragmento de gH de CMV humano nativo. Assim, o termo inclui ambos os polipeptideos compreendendo a sequência nativa do gH (todo o comprimento e truncado), bem como análogos do mesmo. Os análogos preferidos são aqueles que são substancialmente homólogos à correspondente sequência de aminoácidos nativa e, ainda mais preferencialmente, codificam pelo menos um dos epitopos do gH nativo, por exemplo um epitopo neutralizante. Uma classe particularmente preferida dos polipeptideos gH do CMV São aqueles a que falta uma porção suficiente do dominio C-terminal transmembranal, para promover a expressão eficiente e/ou secreção 8 do polipeptideo gH do CMV, a altos níveis, a partir dos hospedeiros de expressão de células de insectos da presente invenção. Pensa-se que cerca dos 25 residuos de aminoácidos C-terminais (residuos 717 a 742 da cadeia Towne, FIG. 2), incluem o dominio transmembranal, mas outras regiões podem também ser criticas para a ligação transmembranal. A remoção de todos ou partes de tais dominios, que eliminam ou fazem decrescer substancialmente a ligação transmembranal, é desejável e constituirá tipicamente uma remoção de, pelo menos, cerca de 5 aminoácidos, preferencialmente pelo menos cerca de 10 residuos e ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 20 residuos da sequência de dominio nativa. Exemplos de tais remoções de uma cadeia são os residuos numerados na Figura 2, 732 a 742, 722 a 742, 720 a 742, 717 a 742 e 712 a 742. Claro que outras delecções funcionais podem ser prontamente definidas pelos peritos no ramo, construindo e verificando remoções do mesmo ou outros dominios, expressando os polipeptideos nas células de insecto. O único verdadeiro limite superior das remoções são as limitações práticas de epitopos úteis (e.g., epitopos neutralizantes). Tipicamente, no entanto, as remoções não constituirão mais de cerca de 100 aminoácidos da sequência gH nativa, particularmente os 100 residuos C-terminais. Deve também ser entendido que "remoção" de uma porção de dominio transmembranal significa apenas que as sequências particulares de aminoácidos nativas não aparecem no polipeptideo, e que outros aminoácidos (tais como residuos hidrofilicos) podem ser substituidos pelos residuos removidos. Os polipeptideos gH do CMV humano da presente invenção são produzidos em células de insecto hospedeiras de expressão. 9

Assim, quando o polipeptideo foi segregado e glicosilado, terá o padrão de glicosilaçâo exclusivo à expressão deste polipeptideo numa célula de insecto hospedeira. 0 termo "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade de polipeptideo gH do CMV suficiente para induzir uma resposta imunitária no sujeito a quem é administrada. A resposta imunitária pode compreender, sem limitação, indução de imunidade celular e/ou humoral. Preferencialmente, a quantidade efectiva é suficiente para efectuar o tratamento, como definido acima. A quantidade exacta varia de sujeito para sujeito dependendo da espécie, idade e condição geral do indivíduo, a gravidade da situação a ser tratada, o polipeptideo particular seleccionado, o seu modo de administração, etc. Assim, não é possivel especificar uma quantidade exacta. No entanto, a quantidade efectiva apropriada pode ser determinada por um perito no ramo, utilisando apenas experiências de rotina.

Um "fragmento" de um polipeptideo de referência é qualquer sequência de aminoácidos contigua encontrada no polipeptideo de referência. Preferencialmente, o fragmento codifica um epitopo do polipeptideo, mais preferencialmente um epitopo neutralizante. Um primeiro polipeptideo contém um fragmento de outro polipeptideo, mesmo se o dominio homólogo no primeiro polipeptideo é flanqueado por sequências de aminoácido que não são fragmentos do outro polipeptideo.

Um polipeptideo é "imunologicamente reactivo" com um anticorpo quando é capaz de ser especificamente reconhecido e ligado por um anticorpo. A reactividade iraunológica pode ser determinada por um imunoensaio padrão, por exemplo ensaio de 10 competição, como é conhecido no ramo. "Ligado operacionalmente" refere-se a uma justaposição, na qual os componentes assim descritos estão numa relação que permite que funcionem da maneira pretendida. Um elemento regulatório, "ligado operacionalmente" a uma sequência estrutural, está ligado de uma tal forma que a expressão da sequência estrutural é conseguida sob condiçOes compatíveis com os elementos regulatórios. 0 termo "polipeptideo" refere-se a um polimero de resíduos de aminoácidos e não está limitado a um comprimento mínimo do produto. Assim, peptideos, oligopeptideos e proteínas estão incluídos na definição de polipeptideo. Este termo inclui ainda modificaçOes de pós-expressão do polipeptideo, por exemplo, glicosilação, acetilação, fosforilação e similares. "Recombinante", como aqui usado para descrever um polinucleotideo, significa um polinucleotideo de origem genómica, de cDNA, semi-sintética ou sintética, o qual, em virtude da sua origem ou manipulação: (1) não está associado com todo ou uma porção do polinucleotideo com o qual está associado na natureza, e/ou (2) está ligado a um polinucleotideo diferente daquele a que está ligado na natureza. 0 termo "recombinante", como usado em relação a uma proteína ou polipeptideo, significa um polipeptideo produzido por expressão de um polinucleotideo recombinante. "Células hospedeiras recombinantes", "células hospedeiras", "células", "linhas celulares", "culturas celulares", e outros termos como estes denotando microorganismos procarióticos ou linhas celulares eucarióticas, cultivadas como entidades unicelulares, são utilizados intermutavelmente e 11

referem-se a células que podem ser, ou foram, usadas como receptores para o vector recombinante ou outro DNA de transferência, e incluem a progenia da célula original que foi transfectada. E entendido que a progenia de uma única célula mãe pode nao ser necessariamente completamente idêntica, em morfologia ou genoma ou complemento de DNA total, ao progenitor original, devido a mutação acidental ou deliberada. Progenias de células progenitoras, que sejam suficientemente similares ao progenitor, para que possam ser caracterizadas por uma propriedade relevante como, por exemplo, a presença de uma sequência de nucleotideos de codificação de um peptideo desejado, estão incluidas nas progenias desta definição, e estão cobertas pelos termos acima referidos.

Um "elemento regulatório" refere-se a uma sequência de polinucleotideos que efectua a expressão de uma sequência codificadora à qual se encontra ligado. A natureza de tais elementos regulatórios em eucariontes, particularmente em células de insecto, inclui promotores, terminadores, sequências determinadoras e, em alguns casos, activadores.

Um "replicâo" é qualquer elemento genético, e.g., plasmideo, cosmideo, cromossoma, virus ou fago, que se comporta como uma unidade autónoma de replicaçâo de polinucleotideos no interior da célula.

Uma sequência que é "substancialmente homóloga" a uma sequência de referência, partilha pelo menos cerca de 50% da sequência homóloga, preferencialmente pelo menos cerca de 75%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 85%, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 90%. 12

"Transformação", como aqui usado, refere-se à inserção de um polinucleotideo exógeno numa célula hospedeira, independentemente do método usado para a inserção: por exemplo, inserção directa, transdução ou acasalamento-f. 0 polinucleotideo exógeno pode ser mantido como um vector não integrado, por exemplo, um plasmideo ou, alternativamente, integrado no genoma do hospedeiro.

Como aqui usado, "tratamento" refere-se a qualquer (i) prevenção de infecçao ou re-infecção como numa vacina tradicional, (ii) redução ou eliminação de sintomas, ou (iii) eliminação substancial do virus. 0 tratamento pode ser efectuado profilaticamente (por administração antes da infecçao) ou terapeuticamente (por administração durante ou depois da infecçao).

Um "vector" é um replicao no qual um segmento de polinucleotideo heterólogo está ligado, de modo a permitir a replicaçao e/ou expressão do segmento ligado como, por exemplo, ura plasmideo, transposao, fago, etc. II. Modos de Realização da Invenção A. Sequenciaçao de Nucleotideos e Aminoácidos do qH Os dois maiores isolados laboratoriais de CMV humano sao o AD169 (Rasmussen,L. et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1984) 81:876-880) e a cadeia Towne (Pachl,C. et al., Viroloqy (1989) 169:418-426). Ambas as cadeias codificam o gH, e estas glicoproteinas partilham de uma similaridade de sequência substancial e são imunologicamente reactivas. Outras cadeias de CMV podem ser prontamente usadas para a fonte de sequências de 13

gH. A identificação e isolamento do fragmento de 3910 bp HindIII a Pst I do genoma da cadeia CMV Towne, o qual contém 2226 pb da estrutura de iniciação de leitura do gH é descrita por Pachl, C. et al., Viroloqy (1989) 169:418-426, aqui incorporada por referência e apresentada nas Figuras 1 e 2. A sequência do gH tem 742 aminoácidos (84,3 kD) e tem as caracteristicas de uma glicoproteina de membrana. 0 perfil hidropático, Figura 3, indica um dominio hidrofóbico N-terminal que é provavelmente uma sequência de sinal clivável. Como indicado na Figura 2, a região hidrofilica externa prevista do gH, os residuos Arg24 a Arg7^7, contêm seis sitios possiveis de glicosilaçâo N-ligada, Asn-X-Thr/Ser, onde X pode ser qualquer um dos 20 aminoácidos.

Fragmentos imunologicamente equivalentes de gH do CMV humano, por exemplo, do ADI69 ou da cadeia de Towne, podem ser identificados fazendo análogos da sequência de polinucleotideos codificando a proteína, que estão truncados nas terminações 3' e/ou 5' da sequência, e/ou têm uma ou mais delecçOes internas, exprimindo sequências de polinucleotideos análogas, e determinando se os fragmentos resultantes reagem imunológicamente com o anticorpo CMV ou induzem a produção de tais anticorpos in vivo, particularmente, anticorpos neutralizantes. Por exemplo, a delecçâo no interior ou ao longo de um peptideo hidrofóbico de 13 aminoácidos (residuos Met34Q a Ala352), podem facilitar a secreção do gH. Similarmente, delecçOes no interior ou ao longo dos 33 residuos (709-742) da transmembrana C-terminal e regiOes internas facilitam a secreção. Várias versões truncadas diferentes do gH são descritas na USSN 367.363, incluindo a 14

delecção dos últimos 22 residuos C-terminais (equivalentes ao fragmento descrito no Exemplo 2 abaixo). Este fragmento retem os primeiros três aminoácidos do dominio transmembranal putativo do gH. B. Proteínas de Fusão

Polipeptideos do gH de CMV humano podem ser produzidos na forma de uma proteina de fusão. Se se deseja expressar uma proteína madura, então a sequência estrutural codificadora para a proteina heteróloga é unida pelas extremidades antes do codão de iniciação da sequência codififadora do polipeptideo do baculovirus, por exemplo o codão de iniciação AT6 do gene da poliedrina, onde A é o nucleotideo +1 na Figura 4. Veja-se Secção II.C., abaixo.

No entanto, sob algumas circunstâncias, pode ser desejável reter as sequências iniciais do polipeptideo baculoviral numa proteina de fusão, por exemplo para aumentar a eficiência da secreção em células de insecto. Aqui, os sitios de união pelas extremidades, para a introdução da sequência do código heterólogo, encontra-se a jusante do codão de iniciação do gene virai. Vectores com sitios de restrição do vector de transferência únicos, de +5 até +175 do gene poliedrina, encontram-se disponíveis no laboratório Max Summers (Summers & Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletim No. 1555 (1987)).

Pode também ser desejável expressar polipeptideos hibridos que contenham o polipeptideo gH de CMV, por exemplo, de forma a aumentar a expressão, secreção, recuperação ou 15 imunogenicidade. Estes híbridos podem ser feitos combinando o DNA que codifica o polipeptideo gH de CMV com DNA que codifica um fragmento de polipeptideo adicional, por exemplo, um fragmento relacionado com o antigene de superfície da hepatite B (HBSAg), beta-galactosidase, SOD ou ubiquitina, e exprimindo o DNA combinado no sistema de expressão celular baculovlrus/insecto. Os hibridos podem também ter sequências codificando epitopos de outros polipeptideos CMV, por exemplo, gB, ou outros virus, por exemplo, HSV ou HBV. C. Sistemas de Expressão de Baculovlrus

Os materiais, métodos e técnicas usados na construção de vectores, transfecçao de células, repicagem de placas, crescimento de células em cultura e similares, são conhecidos no ramo e há manuais disponíveis descrevendo estas técnicas. No entanto, como um guia geral, em seguida apresenta-se os procedimentos, materiais e métodos, bem como as fontes comerciais.

Geralmente, os componentes do sistema de expressão incluem um vector de transferência, usualmente um plasmideo bacteriano, o qual contém simultaneamente, um fragmento do genoma do baculovlrus e um sitio de restrição conveniente para inserção do gene heterólogo a ser expresso: um baculovlrus de estirpe selvagem com uma sequência homóloga ao fragmento especifico de baculovlrus no vector de transferência (isto permite recombinação homóloga do gene heterólogo no genoma do baculovlrus), e células hospedeiras de insecto e meio de cultura apropriados.

Apôs a inserção do gene heterólogo no vector de 16 transferência, o vector e o genoma virai de estirpe selvagem são transfectados para o interior de uma célula hospedeira de insecto, onde o vector e o genoma virai se recombinam. 0 virus recombinante empacotado é expresso e as placas recombinantes são identificadas e purificadas. Materiais e métodos para sistemas de expressão de células de baculovirus/insecto encontram-se comercialmente disponíveis na forma de kits, a partir da, inter alia, Invitrogen, San Diego CA). Estas técnicas são geralmente conhecidas pelow peritos no ramo e completamente descritas em Summers e Smith, Texas Aqricultural Experiment Station Bulletim No. 1555 (1987)), aqui incorporada para referência. C.1. - Vectores Células de insecto e vectores compatíveis, os quais são úteis como sistemas de expressão recombinante, são conhecidos no ramo e incluem, por exemplo, expressão de insectos e vectores de transferência derivados do virus de poliedrose nuclear do baculovirus Autoqrapha californica (AcNPV), o qual é um vector de expressão virai, auxiliar independente. Os vectores de expressão virai deste sistema usam usualmente o forte promotor do gene da poliedrina virai para conduzir a expressão dos genes heterólogos.

Antes de se inserir um gene estranho no genoma do baculovirus, os componentes acima descritos, compreendendo um promotor, lider (se desejado), sequência de codificação de interesse, e sequência de terminação da transcrição, são normalmente reunidos num constructo de translocação intermediária (vector de transferência). Os constructos de translocaçâo intermediária são frequentemente mantidos num 17

replicao, como um elemento extracromassomal (e.g., plasmideos) capazes de uma manutenção estável num hospedeiro, como uma bactéria. 0 replicao terá um sistema de replicação, permitindo assim a sua manutenção num hospedeiro apropriado para clonagem e amplificação.

Correntemente, o vector de transferência mais comumente usado para introduzir genes estranhos no interior do AcNPV é o pAc373 (Fig. 4). Muitos outros vectores, conhecidos dos peritos no ramo, têm também sido desenhados. Estes incluem, por exemplo, pVL985 (o qual altera o codâo de iniciação da poliedrina de ATG para ATT, e o qual introduz um sitio de clonagem BamHl, 32 pares de bases a jusante do ATT; veja-se Luckow e Summers, Viroloqy (1989) 17:31. A porção de poliedrina do AcNPV dos vectores de transferência pAc373 e pVL985, para expressão de proteínas heterólogas não fundidas, é mostrada na Figura 4. Na figura, os números apresentados referem-se a posições no interior do gene nativo, onde o A do codâo ATG é +1. A Figura 4 mostra também um mapa da endonuclease de restrição do vector de transferência pAc373. O mapa mostra que um único sitio BamHl está localizado a seguir à posição -8, relativamente ao codão de iniciação de translacçâo ATG do gene da poliedrina. Não existem sitios de clivagem para Smal, PstI, BglII, Xbal ou SstI. 0 plasmideo contém ainda usualmente o sinal de poliadenilação da poliedrina (Miller et al. (1988) Ann. Rev. Microbiol., 42^:177) e um gene de resistência à ampicilina procariótica (amp) e origem da replicaçâo para selecção e propagação em coli. 18

Após a inserção do gene heterólogo, o vector de transferência e o genoma baculoviral da estirpe selvagem são co— transfectados para uma célula hospedeira de insecto. 0 promotor e a sequência de terminação de transcrição do constructo, conterão tipicamente uma secção de 2-5 kb do genoma do baculovirus. Métodos para introduzir DNA heterólogo no sitio desejado do virus do baculovirus são conhecidos no ramo (veja-se Summers e Smith (1987), Ju et al. (1987), Smith et al., Mol. Cell. Biol. (1983) 3:2156 e Luckow e Summers (1989)). Por exemplo, a inserção pode ser para o interior de um gene, tal como o gene da poliedrina, por recombinação homóloga de "crossover" duplo; a inserção pode também ser para o interior de um sitio da enzima de restrição desenhado para o interior do desejado gene de baculovirus. Miller et al., Bioessays (1989) 4:91. 0 vector de expressão acabado de formar do baculovirus é subsequentemente empacotado num baculovirus recombinante infeccioso e purificado em placa por técnicas conhecidas pelos especialistas no ramo. Summers e Smith (1987); Miller et al. (1989). C.2. - Promotores de Vectores

Vectores de expressão de baculovirus contêm usualmente um promotor de baculovirus. Um promotor de baculovirus é qualquer sequência de DNA capaz de ligação a uma RNA polimerase de baculovirus e iniciação da transcrição a jusante (3') de uma sequência de codificação (e.g., gene estrutural) num mRNA. Um promotor terá uma região de iniciação de transcrição a qual está usualmente colocada próxima da extremidade 5' da sequência de 19

codificação. Esta região de iniciação de transcrição inclui tipicamente um sitio de ligação de ENA polimerase e um sitio de iniciação de transcrição. Um promotor de baculovirus pode também ter um segundo dominio chamado um incrementador, o qual, se presente, esta usualmente distante do gene estrutural. A expressão pode ser quer regulada ou constitutiva.

Genes estruturais, abundantemente transcritos nos últimos tempos do ciclo de infecção, providenciam sequências de promotor particularmente úteis. Exemplos incluem sequências derivadas a partir do gene de codificação da proteína poliedrona virai [Friesen et al. (1986) " The Regulation of Baculovirus Gene Expression", em: The Molecular Bioloqy of Baculoviruses (ed. Walter Doerfler); Publicação E.P.O. Nos. 127.839 e 155.476] e o gene codificador da proteína plO [Vlak et al. (1988) Gen. Virol. 69.:765]. C.3. - Expressão e Secreção Intracelular Um polipeptideo recombinante pode ser expresso intracelularmente ou, se é expresso com sequências regulatórias próprias, pode ser segregado. A boa expressão intracelular de proteínas estranhas, não fundidas, usualmente requer genes heterólogos que têm idealmente uma sequência lider curta contendo sinais de iniciação de translação apropriados precedendo um sinal de iniciação ATG. Se desejado, a metionina no N-terminal pode ser clivada a partir da proteína madura, por incubação in vitro com brometo de cianogénio.

Alternativamente, as proteínas recombinantes podem também ser segregadas de células hospedeiras pela criação de 20

moléculas de DNA quiméricas que codificam uma proteína de fusão compreendendo um fragmento de sequência lider, que permite a segregação da proteína estranha em insectos. 0 fragmento da sequência lider codifica tipicamente um peptideo de sinal constituído de aminoácidos hidrofóbicos que dirigem a segregação da proteína a partir da célula.

As sequências de sinal apropriadas de codificação do DNA podem ser derivadas de genes para proteínas segregadas de baculovirus ou insectos, tais como o gene da poliedrina de baculovirus (Carbonell et al. (1988) Gene, 73:409). Alternativamente, dado que os sinais de modificaçOes translaccionais em células de mamíferos (tais como clivagem do peptideo de sinal, clivagem proteolitica e fosforilação), parecem ser reconhecidas por células de insecto, e sinais requeridos para a secreção e acumulação nuclear, parecem ser conservados entre células de invertebrados e células de vertebrados, lideres de origem que nao de insectos, tais como aqueles derivados de genes que codificam o α-interferao humano [Maeda et al. (1985) Nature, 315:5921, o peptideo de libertação de gastrina humana [Lebacq-Verheyden et al. (1988) Molec. Cell Biol., 8:3129], IL-2 humano [Smith et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82:8404], IL-3 de rato [Niyagima et al. (1987) Gene, 58:273] e glucocerebrosidase humana [Martin et al. (1988) DNA, 7:99], podem também ser usados para proporcionar a secreção em insectos. C.4. Cultura de Células de Insecto

Os vectores de expressão de baculovirus têm sido desenvolvidos para infecção em várias células de insectos. Por 21

exemplo, baculovirus recombinantes têm sido desenvolvidos por inter alia: Aedes aeqypti, Autoqrapha californica, Bômbix mori, Drosophila melanoqaster, Spodoptera fruqiperda e Trichoplusia ni (Publicação P.C.T. No. WO89/046699, Carbonell et al. (1985) Virol♦, 56:153, Wright (1986) Nature, 321:718, Smith et al. (1983) Mol. Cell, Biol., 3i2156 e veja-se ainda geralmente Fraser et al. (1989) In Vitro Cell. Dev. Biol., 25:225). Células e meios de cultura encontram-se comercialmente disponíveis, quer para expressão directa quer para expressão de fusão de polipeptideos heterólogos numa expressão baculovirus, e a tecnologia de cultura de células é geralmente conhecida dos especialistas na técnica descrita em Summers e Smith (1987).

D. Purificação dos Polipeptideos gH de CMV 0 polipeptideo gH de CMV é preferencialmente secretado por células de insecto e purificado do meio recolhido. No entanto, é também possivel purificar polipeptideos gH de CMV, a partir de culturas completas, lisando primeiro as células com uma solução salina tamponizada (e.g., PBS hipotónico) e um detergente normalmente não iónico (e.g., NP-40 a 1%). Tipicamente, um tampão de disrupçao pode também conter 0.5% de deoxicolato de sódio, 0.1% SDS e 1 mH de fluoreto de fenilmetilsulfunilo (Weir, J.P. e B. Moss, J. Virol. (1985), 56:534-540).

Os polipeptideos de gH de CMV podem ser purificados a partir, quer do meio ou do lisado por imunoprecipitaçâo, uma técnica bem conhecida no ramo (veja-se, por exemplo, Weir e Moss (1985)). O anticorpo monoclonal da murina 1G6 (Rasmussen et al., PNAS (1984) 81:876-880), descrito na Patente Norte Americana com 22

o No. de Série 367.363, pode ser usado quer em imunoprecipitaçâo ou coluna cromatográfica de afinidade, como descrito abaixo.

Um método particular de purificar o polipeptideo gH de CMV é por cromatografia de afinidade usando o anticorpo monoclonal 1G6, descrito acima, o qual liga selectivamente à proteína. A proteína pode estar selectivamente ligada a suportes sólidos tais como celulose, poliestireno, poliacrilamida, dextrano de ligação cruzada, leito de agarose ou vidro de poro controlado, usando agentes de junção bifuncionais que reagem com os grupos funcionais no suporte e grupos funcionais (i.e., cadeias laterais reactivas dos aminoácidos) na molécula de anticorpo. Veja-se cientific Foundations of Clinicai Biochemistry, vol. 1, pp. 202 et seq, (1978), A fase sólida contendo anticorpo monoclonal resultante é posta em contacto com os preparados por disrupção de células infectadas com CMV ou meios condicionados com CMV usando condições redutoras, pH, força iónica, temperatura (tipicamente fisiológica), e tempos de residência que permitem ao polipeptideo gH ligar-se ao anticorpo monoclonal imobilizado. As células podem ser disruptas por sonicação, lise ou outros métodos. A fase sólida é separada do preparado por disrupção, após a incubação, e lavada com tampão para remover o preparado por disrupção não ligado residual. A proteína é eluida da fase sólida por passagem de um eluente que dissocia pontes de hidrogénio através do leito. Bases que baixem o pH abaixo de cerca de 3 ou soluções de NaCl acima de cerca de 2M são comumente usados como eluentes.

Alternativamente, pode ser usado um anticorpo 23 4 1 * *

monoclonal, preparado por selecção de um anticorpo criado contra o gH de CMV humano. Anticorpos monoclonais para a glicoproteina podem ser feitos pelas técnicas de hibridização de células somáticas, descritas inicialmente por Kohler, B. e Milstein, C., Nature (1975) 256:495-497, 0 procedimento envolve a imunização de um animal hospedeiro (tipicamente um rato, devido à disponibilidade dos mielomas de murina) com CMV humano obtido de culturas infectadas ou com a proteína em si. 0 CMV pode ser cultivado em fibroblastos humanos, num meio de cultura liquido suplementado com soro convencional, como RPMI 1640 ou o meio minimo essencial da Dulbecco. Os virus pode ser sedimentados dos sobrenadantes da cultura por centrifugação.

As células produtoras de anticorpos (e.g., linfócitos sanguíneos periféricos e esplenócitos), são retiradas do hospedeiro imunizado e misturadas com um parceiro de fusão de tumor apropriado, num meio de cultura liquido contendo um fusogénio, tal como polietileno glicol de peso molecular de 2000 a 5000. Após a fusão, as células são lavadas para remover o meio de fusão residual e incubadas num meio de cultura selectivo (i.e., um meio de cultura contendo aditivos em relação aos quais a linha dos progenitores do tumor é sensivel), tal como o meio HAT. Apenas as células hibridas que possuem a capacidade das células não cancerosas parentes para sobreviver à cultura, no meio selectivo, e a cultura de sobreviventes de células de tumor parentes imortalizadas, em meio selectivo. Os hibridos sobreviventes podem ser expandidos e o seu meio de cultura pesquisado quanto à presença de anticorpos anti-CMV por rádio imunoensaio (RIA), um ensaio de micro-neutralização que detecta a 24

inibição de um efeito citopático virai (CPE) nas culturas celulares, ou outros ensaios que detectem actividade anti-viral (e.g., redução da placa). As culturas positivas podem ser pesquisadas quanto à sua capacidade de reconhecer e ligar o gH de CMV, por imunoprecipitação de extractos marcados com células infectadas com as culturas positivas, e analisando o precipitado com SDS-PAGE quanto à presença de um componente marcado de gH. Os hibridos, que produzem um anticorpo que se liga especificamente à proteína, podem ser sub-clonados e cultivados in vitro ou in vivo por procedimentos conhecidos. 0 anticorpo pode ser isolado do meio de cultura resultante ou do fluido corporal, consoante o caso, por procedimentos convencionais para o isolamento de imunoglobulinas.

E. Preparação de Vacinas Incorporando Polipeptideos gH

de CMV A preparação de vacinas que contém um polipeptideo(s) imunogénico(s) como ingrediente(s) activo(s) é conhecida dos peritos no ramo. Tipicamente, tais vacinas sao preparadas como injectáveis, quer como soluções ou suspensões liquidas; formas sólidas apropriadas para solução em, ou suspensão em liquido, antes da injecção, podem também ser preparadas. A preparação pode também ser emulsionada ou o polipeptideo encapsulado em lipossomas. Os ingredientes imunogénicos activos s3o muitas vezes misturados com excipientes que são farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente activo. Excipientes aceitáveis sao, por exemplo, água, sal, dextrose, glicerol, etanol, ou similares, e combinações dos mesmos. Em adição, se desejado, a vacina pode 25

ter quantidades menores de substâncias auxiliares, tais como agentes humidificantes ou emulsionantes, agentes de tamponizaçâo de pH e/ou adjuvantes que incrementam a efectividade da vacina.

Exemplos de adjuvantes que podem ser efectivos incluem, mas não estando limitados a estes, são: hidróxido de aluminio, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina ((CGP 11637), referido como nor-MDP), N-acetil-muramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1 2' -dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (CGP 19835Ά, referido como MTP-PE) e RIBI, o qual contém trôs componentes extraidos da bactéria, lipido A monofosforil, trealose dimicolato, e o esqueleto da parede celular (MPL+TDM+CWS), numa emulsão 2% de esqualeno/Tween 80. Exemplos de formulações de vacinas compreendendo emulsões de óleo em água de peptideos e antigenes muramilicos, preferencialmente numa emulsão de pequenas partículas (i.e., sub-micrónicas), são apresentadas Patentes comuns da requerente PCT/US90/02954, depositada em 24 de Maio de 1990 e EPA 90.305744.6, depositada em 25 de Maio de 1990, cujas descrições são aqui incorporadas para referência. A efectividade do adjuvante pode ser determinada pela medição da indução de anticorpos dirigida contra um polipeptideo imunogénico contendo um epitopo do polipeptideo gH de CMV, resultando os anticorpos da administração deste polipeptideo em vacinas, as quais são também constituídas dos vários adjuvantes.

Os polipeptideos podem ser formulados na vacina nas formas neutra e salina. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de adição ácida (formados com os grupos amino livres do peptideo) e os quais são formados com ácidos inorgânicos tais 26 como, por exemplo, os ácidos fosfórico ou cloridrico, ou ácidos orgânicos tais como o acético, o oxálico, o tartárico, o maleico e similares. Sais formados com os grupos carboxilicos livres podem também ser obtidos a partir de bases inorgânicos tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amónia, cálcio ou férrico, e bases orgânicas tais como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaina e similares.

As vacinas sao convencionalmente administradas parentericamente, por injecçâo, por exemplo, quer subcutaneamente ou intramuscularmente. Formulações adicionais, que sâo apropriadas noutras formas de administração incluem supositórios e, em alguns casos, formulações orais. Quanto aos supositórios, ligantes e transportadores tradicionais, podem incluir, por exemplo, polietilenoglicóis ou triglicéridos; tais supositórios podem ser formados a partir de misturas contendo o ingrediente activo na gama 0.5% a 10%, preferencialmente 1-2%. Formulações orais incluem excipientes normalmente utilizados tais como, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sal de sódio de sacarina, celulose, carbonato de magnésio e similares. Estas composições tomam a forma de soluções, suspensões, tabletes, comprimidos, drageias, formulações de descarga controlada, ou pós, e contém 10-95% do ingrediente activo, preferencialmente 25-70%.

As vacinas sâo administradas numa forma compatível com a formulação de dosagem, e numa quantidade tal que serão profilática e/ou terapeuticamente eficazes. A quantidade a ser administrada, a qual é geralmente na gama de 5 μ? a 250 ug de

antigene por dose, depende do indivíduo a ser tratado, da capacidade do sistema imunitário do indivíduo para sintetisar anticorpos, e do grau de protecçao desejado. Quantidades precisas do ingrediente activo, requeridas para ser administradas, podem depender do julgamento do aplicador e podem ser caracteristicos para cada individuo. A vacina pode ser dada num horário de dose simples ou, preferencialmente, num horário de doses múltiplo. Um horário de doses múltiplo é um horário no qual uma primeira fase de vacinação pode ser feita com um a dez doses separadas, seguidas por outras doses dadas a intervalos de tempo subsequentes, requeridos para manter e/ou reforçar a resposta imunitária, por exemplo, a 1-4 meses para a segunda dose e, se necessário, uma dose subsequente após vários meses. 0 regime de dosagem será também, pelo menos em parte, determinado pela necessidade do individuo e dependente do julgamento do aplicador.

Adicionalmente, a vacina contendo o polipeptideo, constituído por um epitopo de gH de CMV imunogénico, pode ser administrada conjuntamente com outros agentes imunoregulatórios, por exemplo, imunoglobulinas.

Tais composiçCes são úteis para o tratamento de sujeitos com CMV. Os sujeitos serão geralmente mamíferos, incluindo, sem limite, os seres humanos, animais domésticos, animais de estimação e animais de desporto. 28

III. Exemplos

Exemplo 1- Expressão do qH de comprimento total de CMV

Humano A fim de investigar a possibilidade de usar o sistema de baculovirus como um meio de expressão de niveis úteis de gH de CMV, um vector de transferência de baculovirus-gH, codificando o gH de comprimento total (gH2), foi preparado para uso no sistema de expressão celular baculovirus-insecto, acima descrito. 0 vector baculovirus pAc373 (Fig. 4, Summers et al.) foi cortado ^ com BamHI, e o fragmento de gH de 2495 bp, Notl a Xbal, do plasmideo pSVgH2 (descrito na patente Norte Americana com o No. de Série 367.363), foi preenchido e ligado a este sitio BamHI. 0 plasmideo resultante, designado pACgH2 (veja-se Fig. 5A), codifica um constructo gH, em que a transcrição é conduzida pelo promotor do gene da poliedrina do baculovirus. Este DNA plasmidico foi misturado com o DNA virai de baculovirus de estirpe selvagem, a mistura foi transfectada para células derivadas de Spodoptera fruqiperda (células Sf9), e placas recombinantes foram isoladas e as placas purificadas. Vários ) clones de virus recombinantes, foram usados para infectar células e nos 4 a 6 dias após a infecção, lisados de células e o meio condicionado foram analisados por ELISA e Western blot. Não foi detectada nenhuma expressão de gH de comprimento total (pACgH2). A expressão do gH nas células Sf9 infectadas com o baculovirus recombinante, contendo pACgH2 foi também analisada por radioimunoprecipitação (RIP), usando o IG6 monoclonal ou soros humanos. Nenhumas bandas gH especificas foram detectadas a partir de RIPs de células ou meio infectados por baculovirus- 29

pACgH2 (comprimento total de gH)

Exemplo 2- Expressão de gH de CMV Humano Truncado

Foi preparado um vector de transferência baculovirus-gH codificando um fragmento de gH, faltando um dominio C-terminal. 0 vector baculovirus pAc373 (Fig. 4, Smith, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (1985) 82:8404-8408), foi cortado com BamHI, e o fragmento de 2178 bp, de Notl a Sall, a partir de pCM6-H6 (ver Patente Norte Americana com o No. de Série 367.363) foi preenchido e ligado no sitio do BamHI. 0 plasmideo resultante, designado pACgH6 (No. de acesso na ATCC 68373, ver Fig. 5B) codifica um constructo de gH em que a transcrição é conduzida pelo gene promotor da poliedrina de baculovirus. Neste segmento de gH truncado, a maior região transmembranal de gH foi deletada por remoção dos últimos 22 aminoácidos do terminal-C do gH. 0 fragmento retém apenas os primeiros três aminoácidos do dominio transmembranal de gH (Leu7i8-Leu720-Met720 - Fig. 2). 0 plasmideo foi misturado com o DNA de baculovirus virai de estirpe selvagem, usado para co-transfectar células de Spodoptera fruqiperda, e placas recombinantes foram isoladas e as placas foram purificadas. Vários clones de virus recombinantes foram usados para infectar células, e 4 a 6 dias após a infecçao, células lisadas e o meio condicionado foram analisados por ELISA e Western blot.

Para todos os clones contendo pACgH6 , as análises ELISA mostraram a reactividade de gH para o meio de cultura (Fig. 6), indicando que o gH truncado foi expresso neste sistema. Enquanto a análise ELISA dos células lisadas foi insuficiente 30

para detectar a presença intracelular do gH truncado, a análise RIP foi positiva para o gH truncado, indicando uma baixa mas detectável presença intracelular do gH truncado.

Exemplo _3 Percurso do tempo para a Sintese de gH Truncado durante a Infecção do baculovirus

Foi analisado o tempo de curso da sintese de gH truncado, durante a infecçao do baculovirus, a fim de determinar as condições óptimas para a produção de gH. Como mostrado na ^ Figura 6, as células foram infectadas a baixa (0,5 MOI) e alta (10,0 MOI) multiplicidades, com recombinantes pACgH6 de baculovirus, e as amostras do meio condicionado tiradas a partir de 19 horas a 7 dias após a infecçao. Para essas infecçOes, usando meio elevado de proteina (meio de Grace mais 0,33% de extrato de levedura, 0,33% de hidrolisado de lactalbumina e 10% de FCS), a acumulação de gH no meio apresenta um patamar após 48 horas. Estes resultados indicam que a sintese de gH e/ou secreção se acaba 48 horas após a infecçao, e que niveis ligeiramente mais altos de produção de gH são detectados nas infecçOes de alto MOI. ._} InfecçOes idênticas são também feitas usando o meio com baixo teor de proteina EX-CELL 400 (J.R. Scientific) (Fig. 6). Sob estas condiçOes, o nivel máximo de gH no meio é similar ao das infecçOes, usando meio com elevada concentração de proteina, embora a sintese seja mais lenta e não atinja nenhum patamar, senão após 4 dias depois da infecção. 31

Exemplo 4 Radioinumoprecipitaçao do qH Truncado Recombinante

Baculovlrus recombinantes expressando gH truncado têm também sido analisados por radioimunoprecipitaçâo (RIP), usando IG6 monoclonal ou soro humano. Uma banda especifica de gH maioritário, de 85 kD, e uma banda menor de 74 kD, foram detectadas por RIP, de lisados de células, e meio de células infectadas de fruqiperda (Sf9) com um baculovlrus-pACgH6 recombinante (de gH truncado). A razão para as duas bandas de gH serem detectadas durante este pulso de 5 horas, nao ê conhecida, no entanto, é possivel que estas moléculas representem formas diferentes de glicosilaçao. A expressão de gH de comprimento total foi também examinado usando esta técnica, mas nao foi detectável.

Exemplo 5- Comparação da Expressão do qH de Comprimento total e Truncado no meio de Células de Insecto

Culturas de células de insecto foram infectadas com quer pACgH2 (codificando gH de comprimento total) ou pACgH6 (codificando gH truncado), e a secreção foi medida pelo ensaio ELISA. A Figura 7 mostra que, enquanto a secreção de gH de comprimento total nao foi detectável, a secreção de gH truncado foi prontamente detectável após 24 horas.

Exemplo 6- Comparação do Nível de Expressão de qH Truncado entre Células de Insectos e Células de Mamíferos

Foram isoladas linhas de células estáveis de CHO co-transfectadas com o plasmideo de expressão de gH pCMAdH6 (veja-se 32

a Patente Norte Americana com o No. de Série 367.363). Este plasmideo codifica o mesmo fragmento de gH truncado usado para pACgH6. Estas linhas de células foram sujeitas a duas sessões de amplificação MTX e muitos baixos niveis de gH foram detectados no meio condicionado destas linhas de células (linha 40 de CHO e linha 171, 0.1 μΜ de MTX). Quando o nivel de gH extracelular de infecçOes de baculovirus é comparado com a produção de CHO por ELISA, niveis de cerca de 10 vezes mais elevados de gH s3o produzidos pelos baculovirus recombinantes (Fig. 8). A linha CHO está de facto exprimindo algum gH truncado porque experiências de imunoprecipitaçêto mostram a presença de uma baixa quantidade de gH truncado intracelular, mas não gH truncado secretado. Estes resultados demonstram que surpreendentemente o sistema de baculovirus é pelo menos 10 vezes mais eficiente que as células de CHO para a produção de gH extracelular. ) 33

Claims (7)

1. REIVINDICAÇÕES 1- Um processo de produção de um polipéptido gH de CMV humano, caracterizado pelo facto de compreender: (a) o fornecimento de uma célula de insecto compreendendo DNA que codifica para um polipéptido de gH de CMV humano e que é capaz de expressar o referido polipéptido do gH de CMV humano, sendo o dito DNA regulado por meio de transcrição por um promotor derivado de um baculovirus; (b) incubação da célula sob condições nas quais o referido polipéptido gH de CMV humano é expresso; e (c) recuperação do referido polipéptido gH de CMV humano.
2. 2- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de ser produzido um análogo truncado do gH de CMV humano nativo.
3. 3- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido promotor ser o promotor polihedrina do baculovirus.
4. 4- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizado pelo facto do baculovirus ser a "Autographa californica".
5. 5- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto da referida célula hospedeira da célula do insecto ser derivada da "Spodoptera frugiperda".
6. 6- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o citomegalovirus ser da estirpe 1 Towne.
7. 7- Ura processo, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto do citomegalovirus ser o AD-169. Lisboa, 2 de Agosto de 1991 mo AGENTE OFICIAL DA PMEBABÊ IH&UUtRIAL

   ) 2