PT772632E - Proteina estimuladora de celulas t de pestivirus - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "Proteína estimuladora de células T, de pe6tivíru&" 0 presente invento refere-se a polipéptidos que compreendem proteínas estimuladoras de linfócitos T, de pestivírus, especialmente do vírus da febre suína clássica (CSFV), especificamente a proteína não estrutural p10, mais especificamente aos epítopos de célula T desta proteína e aos ácidos nucleicos que codificam para estes polipéptidos, vectores recombinantes com estes ácidos nucleicos e células hospedeiras transformadas com estes vectores, vacinas e diagnósticos com estes polipéptidos e processos para a sua preparação. O género pestivírus pertence à família Flaviviridae e consiste no vírus da febre suína clássica (ou vírus da cólera de porco), que é o agente causal da febre suína clássica, no vírus da diarreia virai bovina (BVDV), infeccioso para o gado vacum e no vírus da doença de fronteira (BDV), infeccioso para ovelhas. Os pestivírus são vírus de ARN com envelope, pequenos, com um diâmetro de 40-60 nm. Os viriões consistem numa cápside nuclear envolvida num envelope de camada lipídica, embebida com glicoproteínas. O genoma dos pestivírus consiste num ARN de cadeia simples de aproximadamente 12,5 kB. Este contém uma única estrutura de leitura aberta (ORF), que é flanqueada por partes que não são traduzidas. A extremidade 3' não é poliadenilada.

As proteínas virais são formadas por processamento co- e pós-tradução de uma poliproteína hipotética, enquanto que as proteínas estruturais são codificadas na extremidade 5’ do genoma. Ao contrário de outros flaviviridae, os pestivírus têm uma sequência que codifica para uma proteína não estrutural, p23, na extremidade 5'. Esta protease do terminal N (Npro) é processada ("spliced") da proteína seguinte por um processo autoproteolítico. No sentido 3', seguem-se uma sequência que codifica para uma cápside nuclear p14 e uma sequência sinal, que é responsável pela translocação das sequências subsequentes para as glicoproteínas E0, E1 e E2, no lúmen do retículo endoplasmático (ER). 0 processamento de glicoproteínas únicas é provavelmente causado por sinalases celulares no ER. As glicoproteínas podem formar estruturas complexas nas células infectadas, por dimensionamento 87 210 ΕΡ 0 772 632/ΡΤ 2

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através de pontes S-S. A função destas estruturas complexas não é" ainda conhecida.

Próximo das sequências para as proteínas estruturais, encontram-se, na poliproteína, as sequências para as proteínas não estruturais, p125, p10, p30 e p133. De forma análoga aos processos pós-tradução no vírus da diarreia virai de bovino, citopatogénico (BVDV, um outro pestivírus), pode-se detectar uma proteína 80p, após processamento da proteína p125 (Desport, M. e Brownlie J., Arch. Virol. SuppI. 3. 261-265, 1991). A proteína não estrutural p133, que é processada nas proteínas p58 e p75, contém motivos de sequência que se assemelham a sequências de ARN-polimerase. As sequências de aminoácidos das proteínas CSFV não estruturais, são consideradas, aproximadamente, como sendo: 3-1142 (p125), 1143-1206 (pi0), apresentadas aqui na SEQ ID NO:1 e 2. O terminal N putativo de p80 é o aminoácido no. 460 (SEQ ID NO:1 e 2). O início de p30 é também apresentado na SEQ ID N0.1 e 2, i.e. o aminoácido número 1207. A sequência completa de p30 para CSFV Alfort apresentada em Meyers et aí. (Virology 171. 555-567, 1989; Fig. 4, aminoácidos 2337-2683). As sequências de ADN que codificam para estas proteínas são também aqui apresentadas na SEQ ID No.1 e em Meyers et al. (supra).

Por infecção com CSFV podem ocorrer sintomas agudos, per-agudos, crónicos ou clinicamente invisíveis. A gravidade da doença depende, por um lado, da carga infecciosa e, por outro lado, da idade do animal, constituindo a competência imunitária e a constituição total do animal, factores importantes.

Na doença per-aguda, que resulta na morte do animal após três a cinco dias após a infecção com uma estirpe altamente virulenta (e.g. a estirpe CSFV-Brescia), apenas se observa febre. No estado agudo da doença, observa-se além de uma temperatura elevada, leucopenia, conjuntivite e perda de apetite. Na fase final da doença, ocorrem distúrbios no sistema nervoso central. Outras características são uma atrofia do timo, cianose da pele e hemorragias cutâneas, parcialmente causadas por uma trombocitopenia. A mortalidade da doença na fase aguda é de 30-100%. A forma de doença crónica é encontrada após infecção com estirpes de vírus mesogénicos. Esta forma é muito perigosa quando leitões são infectados no útero, por infecção diaplacentar. Após o nascimento, estes leitões apenas

87 216 ΕΡ Ο 772 632/ΡΤ 3 sobrevivem durante 6-8 semanas, período em que constituem uma fonte de infecção.

Os porcos que sobrevivem a uma infecção após o nascimento adquirem imunidade para toda a vida, o que resulta provavelmente de uma indução da resposta imunitária humoral. Os anticorpos neutralizantes são encontrados duas a três semanas após a infecção. Têm-se desenvolvido várias vacinas para esta doença de importância económica. As vacinas com vírus inactivados apenas fornecem uma protecção de curta duração e já não são utilizadas (Biront, P. e Leunen, J. in: Liess, B. (ed): Classical swine fever and related virai infections. Martinus Nijhoff Publ., Boston pp. 181-200, 1988). Conseguiu-se estabelecer uma melhor protecção com vírus atenuados, obtidos por passagens em série em coelhosfestirpes C), ou em culturas de células (e.g. estirpe Thiverval) (Launais, M. et al., Rev. Méd. Vét., 123, 1537-1554, 1972; Shimuzu Y., Jap J. Trop. Agr. Res. Sei., 13, 167-170, 1980).

No entanto, uma desvantagem destas vacinas é a de não discernirem entre animais vacinados e animais infectados com um vírus de campo. Na comunidade europeia, portanto, a utilização destas vacinas é actualmente proibida e o controlo da febre suína clássica é estabelecido por isolamento e morte do porco infectado.

Em anos recentes, obtiveram-se alguns resultados com vacinas vivas, baseadas em vírus recombinantes (van Zijl, M. et al., J. Virol. 65, 2761-2765, 1991; Rúmenapf T. et al., J. virol. 65, 589-597, 1991; Hulst, M.M. et al., J. Virol. 67, 5435-5442, 1993). Estas vacinas têm-se baseado todas na expressão de glicoproteínas estruturais em vírus vector recombinantes. 0 presente invento dirige-se agora a um polipéptido que compreende uma proteína estimuladora de linfócitos T, de pestivírus, ou uma sua parte, imunogenicamente activa.

Este polipéptido é essencialmente isento de outras proteínas de pestivírus, com as quais está usualmente associado. Especificamente, a proteína estimuladora de linfócitos T é uma proteína estimuladora de linfócitos

87 216 ΕΡ Ο 772 632/ΡΤ 4 Τ, do vírus de febre suína clássica, ou uma sua parte, imunogenicamente activa.

Mais especificamente, o polipéptido compreende a proteína não estrutural de CSFV, p10. Uma vez que as proteínas de CSFV são expressas pelo vírus como uma poliproteína, que é clivada subsequentemente à tradução, também estão aqui contemplados polipéptidos que compreendem a proteína p10 e a(s) sua(s) proteína(s) flanqueadora(s) p125 e/ou p30, ou suas partes.

Mais especificamente, o polipéptido compreende um epítopo de célula T com a sequência de aminoácidos S-T-A-E-N-A-L-L-V-A-L-F-G-Y-V, mais especificamente o polipéptido compreende um epítopo de célula T com a sequência de aminoácidos E-N-A-L-L-V-A-L-F.

Em geral, o termo "proteína" refere-se a uma cadeia molecular de aminoácidos, com actividade biológica. Uma proteína não tem um comprimento específico e pode, se necessário, ser modificada in vivo ou in vitro por, por exemplo, glicosilação, amidação, carboxilação ou fosforilação; incluindo-se assim, nesta definição, inter alia, péptidos, oligopéptidos e polipéptidos.

Mais particularmente, o presente invento proporciona polipéptidos que compreendem proteínas estimuladoras de linfócitos T, ou suas partes imunogenicamente activas, que compreendem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO.2 e seus equivalentes ou variantes biologicamente funcionais.

As partes imunogenicamente activas destes polipéptidos, são as partes da sequência de aminoácidos que são capazes de eliciar uma activação de células T.

Mais especificamente, o presente invento inclui polipéptidos que compreendem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:6 e ainda mais especificamente são polipéptidos que compreendem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:4.

Os equivalentes ou variantes biologicamente funcionais, das proteínas aqui especificamente descritas, são proteínas derivadas das sequências de

87 216 ΕΡ Ο 772 632/ΡΤ 5 aminoácidos acima referidas, por exemplo, por deleções, inserções e/ou substituições de um ou mais aminoácidos, mas retêm um ou mais determinantes imunogcnicoo de CSFV, i.e. as referidas variantes têm um ou mais epítopos capazes de eliciar uma resposta imunitária num animai hospedeiro.

Deve entender-se que, para as proteínas particulares aqui incluídas, podem existir variações naturais entre estirpes de vírus individuais. Estas variações podem ser demonstradas por (uma) diferença(s) de aminoácidos na sequência global, ou por deleções, substituições, inserções, inversões ou adições de (um) aminoácido(s) na referida sequência. As substituições de aminoácidos que não alteram de forma essencial as actividades biológica e imunológica, foram descritas, e.g. por Neurath et al em "The proteins" Academic Press New York (1979). As substituições de aminoácidos entre aminoácidos relacionados, ou substituições que ocorreram frequentemente na evolução são, inter alia, Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val (veja-se Dayhof, M.D., Atlas of protein sequence and structure, Nat. Biomed. Res. Found., Washington D.C., 1978, vol. 5, supl. 3). Outras substituições de aminoácidos incluem Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Leu/lle, Leu/Val e Ala/Glu. Com base nesta informação, Lipman e Pearson desenvolveram um método para a comparação rápida e sensível de proteínas (Science. 227. 1435-1441, 1985) e para a determinação de semelhanças funcionais entre proteínas homólogas. Estas substituições de aminoácidos das concretizações de exemplo, do presente invento, estão no âmbito do invento, desde que as proteínas resultantes retenham a sua imunorreactividade. A preparação das proteínas de acordo com o invento é efectuada por meio de um dos métodos de química orgânica conhecidos, para a síntese de péptidos ou com o auxílio de técnicas de ADN recombinante.

Considera-se que os métodos de química orgânica para a síntese de péptidos incluem o acoplamento dos aminoácidos necessários, por meio de uma reacção de condensação, quer em fase homogénea, quer com o auxílio de uma designada fase sólida.

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Os métodos mais usuais para as reacções de condensação acima mencionadas são: o método da carbodiimida, o método da azida, o método do anidrido misto e o método que utiliza ésteres activados, como o descrito em The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology Vol. 1-3 (Ed: Gross, E. e Meienhofer, J.) 1979, 1980, 1981 (Academic Press, Inc.). A preparação de fragmentos adequados dos péptidos acima mencionados de acordo com o invento, utilizando a "fase sólida" é descrita, por exemplo, em J. Amer. Chem. Soc. 85. 2149 (1963) e Int. J. Peptide Protein Res. 35. 161-214 (1990). O acoplamento dos aminoácidos do péptido a preparar começa normalmente a partir da extremidade carboxilo. Para este método, é necessária uma fase sólida em que existam grupos reactivos, ou em que estes grupos possam ser introduzidos. Esta pode ser, por exemplo, um copolímero de benzeno e divinilbenzeno com grupos clorometilo reactivos, ou uma fase sólida polimérica, tornada reactiva com uma função hidroximetilo ou amina.

Uma fase sólida particularmente adequada é, por exemplo, a resina de álcool p-alcoxibenzílico (resina 4-hidroximetilfenoximetil-copolistireno-1 % de divinilbenzeno), descrita por Wang, J. Am. Chem. Soc. 95, 1328 (1974). Após a síntese, os péptidos podem ser separados desta fase sólida, sob condições moderadas.

De modo a determinar se existe alguma proteína, e qual, responsável por um efeito mediado por células T, fez-se a cultura de células alvo infectadas com CSFV do seguinte modo: a partir de um porco miniatura ("NIH-Minipig"; haplótipo MHCd/d) removeu-se um rim e cortou-se em pedaços, sob condições estéreis. Os pedaços do órgão foram lavados com PBS e pipetaram-se pedaços para um frasco de cultura. Estes foram incubados em meio de cultura ao qual se adicionou uma solução de colagenase-dispase. As células foram lavadas do tecido com PBS, sedimentadas e lavadas e mais uma vez cultivadas.

Para se obter uma linha celular transformada, estável, as células foram transformadas com um piasmídeo com a sequência para o antigénio "T grande" de SV-40 (Southern, P. e Berg, P. J. Molec. Appl. Genetics. 1, 327-341, 1982; Fanning, E., J. Virol, 66. 1289-1293, 1992). As células MAX assim obtidas foram seleccionadas por cultura com um análogo de neomicina, G418 (Boehringer), e testadas quanto a contaminação com micoplasma (estojo de

87 216 ΕΡ Ο 772 632/ΡΤ 7 detecção de micoplasma, Boehringer Mannheim). As células MAX foram cultivadas em DMEM e infectadas com CSFV.

Para pesquisar o genoma de CSFV quanto a epítopos reconhecidos por linfócitos T específicos de vírus, infectaram-se células MAX autólogas com recombinantes de vírus da vacínia/CSFV, que expressam diferentes proteínas virais. O sucesso da infecção das células alvo com os recombinantes foi verificado rotineiramente pelo efeito citopatogénico do vírus da vacínia. Além disso, a expressão de proteínas CSFV foi demonstrada por estudos imunocitoquímicos e análise de transferência de Western, das células MAX infectadas.

As células efectoras, obtidas a partir de porcos miniatura imunizados foram co-cultivadas com alvos marcados radioactivamente, infectados com vírus da vacínia recombinante (ou alvos infectados com o vírus da vacínia do tipo selvagem, como controlo), a diferentes razões entre efector e alvo, durante 4 horas. Após centrifugação, recolheram-se 100 μΙ de cada sobrenadante e a libertação de crómio foi determinada como cpm, num contador de radiação gama. A percentagem de lise específica foi calculada pela fórmula: (cpm exp. - cpm espont.) * 100 % lise específica = _ (cpm total - cpm espont.)

Os controlos de células alvo foram incluídos do seguinte modo: de modo a medir a libertação espontânea de radio-isótopo (cpm espont.), as células alvo foram incubadas sem efectores. Além disso, determinou-se a incorporação total de crómio nas células alvo (cpm total).

Deste modo, identificaram-se CTL específicos de CSFV. Para uma posterior caracterização dos epítopos responsáveis pelos efeitos, sintetizou-se uma série de péptidos sobrepostos. Estes péptidos foram carregados em células alvu MAX, por incubação em poços de placas de fundo redondo, durante 1 hora. As células efectoras foram então adicionadas, para se obter uma razão entre efector e célula alvo de 100:1. As placas foram centrifugadas e incubadas e a lise específica foi determinada medindo a libertação de crómio, como descrito acima.

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De acordo com um segundo aspecto do invento, proporciona-se uma sequência de ácido nucleico que codifica para todo, ou uma parte substancial, em particular a parte imunologicamente activa, da uma proteína estimuladora de linfócitos T, de pestivírus, purificada, mais especificamente uma proteína estimuladora de células T de CSFV.

Pode-se isolar uma sequência de ácido nucleico de acordo com o presente invento, a partir de uma estirpe de CSFV particular e esta pode ser multiplicada por técnicas de ADN recombinante, incluindo tecnologia de reacção em cadeia com polimerase (PCR), ou pode ser sintetizada quimicamente in vitro, por técnicas conhecidas na arte. O invento proporciona ainda sequências de ácido nucleico isoladas e purificadas que codificam para as proteínas de CSFV acima mencionadas. Estas sequências de ácido nucleico são apresentadas em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 e SEQ ID N0:5. É bem conhecido na arte que a degenerescência do código genético permite a substituição de bases no codão, resultando noutro codão, mas que codifica ainda para o mesmo aminoácido, e.g. o codão para o aminoácido ácido glutâmico é tanto GAT, como GAA. Consequentemente, é claro que para a expressão de uma proteína com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:2, a sequência de ácido nucleico pode ter uma composição de codões diferente da sequência de ácido nucleico apresentada na SEQ ID NO:1.

Esta sequência de ácido nucleico pode ser operativamente ligada a várias sequências de replicação com as quais não está associada nem ligada na natureza, resultando num designado vector recombinante, que pode ser utilizado para a transfecção de um hospedeiro adequado. Os vectores recombinantes úteis são de preferência derivados de plasmídeos, bacteriófagos, cosmídeos ou vírus.

Os vectores ou veículos de clonagem específicos que podem ser utilizados para clonar sequências de ácido nucleico de acordo com o invento, são conhecidos na arte e incluem, inter alia, vectores plasmídeos como o pBR322, os vários plasmídeos pUC, pGEM e Bluescript; bacteriófagos, e.g. lambdagt-Wes, Charon 28 e os fagos derivados de M13 ou vectores virais como o SV40, adenovírus ou poliomavírus (veja-se também Rodriguez, R.L. e

07 216 ΕΡ 0 772 632/ΡΤ 9 D.T. Denhardt, ed., Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Butterworths, 1988; Lenstra, J.A. et a!., Arch. Virol.. 110. 1-24, 1990). Oc métodos a utilizar para a construção de um vector recombinante de acordo com o invento são conhecidos dos peritos na arte e são, inter alia, descritos em Maniatis, T. et al. (Molecular Cloning A Laboratory Manual, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).

Por exemplo, a inserção da sequência de ácido nucleico de acordo com o invento num vector de clonagem, pode ser facilmente conseguida quando ambos, os genes e o veículo de clonagem desejado, foram cortados com a(s) mesma(s) enzima(s) de restrição, dado que assim se produzem terminais de ADN complementares.

Alternativamente, pode ser necessário modificar os locais de restrição que são produzidos em extremidades lisas, quer por digestão do ADN de cadeia simples, quer preenchendo os terminais de cadeia simples com uma ADN-polimerase adequada. Subsequentemente, pode-se realizar a ligação de extremidades lisas com uma enzima como a ADN-ligase de T4.

Se desejado, qualquer local de restrição pode ser produzido por ligação de ligantes aos terminais de ADN. Estes ligantes podem compreender sequências oligonucleotídicas específicas, que codificam para sequências de locais de restrição. O vector e a sequência de ácido nucleico clivados com enzimas de restrição, podem também ser modificados por introdução de caudas homopoliméricas. O termo "transformação, tal como aqui utilizado, refere-se à introdução de uma sequência de ácido nucleico heteróloga numa célula hospedeira, independentemente do método utilizado, por exemplo absorção directa ou transdução. A sequência de ácido nucleico heteróloga pode ser mantida por replicação autónoma ou, alternativamente, pode ser integrada no genoma do hospedeiro. Se desejado, os vectores recombinantes são providos de sequências controlo adequadas, compatíveis com o hospedeiro designado. Estas sequências podem regular a expressão da sequência de ácido nucleico inserida. Além dos microorganismos, também se podem utilizar como hospedeiros, culturas de células derivadas de organismos multicelulares.

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Os vectores recombinantes de acordo com o invento contêm, de preferência, uma ou mais actividades de marcador, que podem ser utilizadas para seleccionar os transformantes desejados, tais como resistência a ampicilina e tetraciclina em pBR322, resistência a ampicilina e péptido A de β-galactosidase em pUC8.

Uma célula hospedeira adequada é um microorganismo, ou célula, que pode ser transformado por uma sequência de ácido nucleico que codifica para um polipéptido, ou por um vector recombinante compreendendo esta sequência de ácido nucleico e que pode, se desejado, ser utilizado para expressar o referido polipéptido codificado pela referida sequência de ácido nucleico. A célula hospedeira pode ser de origem procariótica, e.g. bactérias como Escherichia coli, Bacillus subtilis e espécies de Pseudomonas; ou de origem eucariótica, como leveduras, e.g. Saccharomyces cerevisiae ou células eucarióticas superiores, tais como células de insecto, de plantas ou de mamífero, incluindo células HeLa e células de ovário de hamster Chinês (CHO). As células de insecto incluem a linha celular Sf9 de Spodoptera frugiperda (Luckow et a!., Biotechnology 6, 47-55, 1988). A informação relativa à clonagem e expressão da sequência de ácido nucleico do presente invento, em sistemas de clonagem eucarióticos, pode ser encontrada em Esser, K. et al. (Plasmids of Eucaryotes, Springer-Verlag, 1986).

Como organismos hospedeiros também se podem utilizar outros vírus, que sejam capazes de expressar a sequência de pestivírus inserida. Estes vírus são vulgarmente designados por vírus vectores.

Em geral, preferem-se os procariotas para a construção dos vectores recombinantes úteis no presente invento. As estirpes K12 de E. coli são particularmente úteis, especialmente as estirpes DH5a ou MC1061.

Para expressão, as sequências de ácido nucleico do presente invento são introduzidas num vector de expressão, i.e. as referidas sequências são operativamente ligadas a sequências de controlo de expressão. Estas sequências controlo podem compreender promotores, potenciadores, operadores, indutores, locais de ligação a ribossomas, etc. Assim, o presente invento proporciona um vector recombinante que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica para uma proteína de CSFV, identificada acima,

07 216 ΕΡ 0 772 632/ΡΤ 11 operativamente ligada a sequências de controlo de expressão, que é capaz de expressar as sequências de ADN aí contidas numa(em) célula(s) ou organismo(s) hospedeiros transformados.

Deve entender-se, obviamente, que as sequências de nucleótidos inseridas no local seleccionado do vector de clonagem, podem incluir nucleótidos que não são parte do gene estrutural real para o polipéptido desejado ou podem incluir apenas um fragmento do gene estrutural completo para a proteína desejada, desde que o hospedeiro transformado produza um polipéptido com, pelo menos um, ou mais determinantes imunogénicos de um antigénio de proteína de CSFV.

Quando as células hospedeiras são bactérias, podem-se utilizar sequências de controlo de expressão úteis, incluindo o promotor e operador Trp (Goeddel, et a!., Nucl. Acid Res.. 8, 4057, 1980); o promotor e operador lac (Chang et al., Nature 275. 615, 1978); o promotor de proteína de membrana exterior (Nakamura, K. e Inouge, Μ. EMBO J.. 1_, 771-775, 1982); os promotores e operadores do bacteriófago lambda (Remaut, E. et al., Nucl. Acids Res.. H, 4677-4688, 1983); promotor e operador de A-amilase (B. subtilis), sequências de terminação e outras sequências de potenciação e controlo da expressão, compatíveis com a célula hospedeira seleccionada. Quando a célula hospedeira é uma levedura, exemplos de sequências de controlo da expressão, úteis, incluem, e.g., factor A de emparelhamento. Para células de insecto, pode-se utilizar a poli-hedrina ou os promotores p10 de baculovírus (Smith, G.E. et a!., Mol. Cell. Biol. 3, 2156-65, 1983). Quando a célula hospedeira é de origem mamífera, exemplos de sequências de controlo de expressão úteis incluem o promotor de SV-40 (Berman, P.W. et al., Science. 222. 524-527, 1983) ou o promotor de metalotioneína (Brinster, R.L., Nature. 296. 39-42, 1982) ou um promotor de choque térmico (Voellmy et a!., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82. 4949-53, 1985). Alternativamente, podem-se também aplicar as sequências de controlo de expressão presentes em CSFV. Para maximizar a expressão de genes, veja-se também Roberts e Lauer (Methods in Enzvmoloav. 68, 473, 1979).

Deste modo, o invento compreende também uma célula(s) ou organismo(s) hospedeiro(s) com uma sequência de ácido nucleico ou uma molécula de ácido nucleico recombinante, ou um vector recombinante acima

07 216 ΕΡ 0 772 632/ΡΤ 12 descrito, capaz de produzir a proteína de pestivírus, por expressão da sequência de ácido nucleico. A imunização de animais contra a infecção por pestivírus, especialmente de porcos contra CSFV, pode ser conseguida administrando aos animais um polipéptido de acordo com o invento, num contexto imunologicamente relevante, tal como uma designada vacina de subunidade. A vacina de subunidade de acordo com o invento pode compreender um polipéptido numa forma pura, opcionalmente na presença de um transportador farmaceuticamente aceitável. O polipéptido pode ser opcionalmente ligado de forma covalente a uma proteína não relacionada, que pode ter vantagem na purificação do produto de fusão. Exemplos são a β-galactosidase, proteína A, proquimiosina, factor Xa da coagulação do sangue, etc.

Nalguns casos, a capacidade de desencadear uma imunidade protectora utilizando estes polipéptidos per se, pode ser baixa. Os fragmentos pequenos são preferencialmente conjugados com moléculas transportadoras, de modo a criar a sua imunogenicidade. Exemplos de transportadores adequados para este fim são macromoléculas, tais como polímeros naturais (proteínas como a hemocianina de lapa Fissurella, albumina, toxinas), polímeros sintéticos como poliaminoácidos (polilisina, polialanina), ou micelas de compostos anfifílicos, como saponinas e ácido palmítico. Alternativamente, estes fragmentos podem ser proporcionados na forma de seus polímeros, de preferência polímeros lineares.

Se desejado, as proteínas de acordo com o invento que serão utilizadas numa vacina podem ser modificadas in vitro ou in vivo, por exemplo por glicosilação, amidação, carboxilação ou fosforilação. O sistema imunológico será ainda mais eficazmente desencadeado quando a vacina compreende os polipéptidos como apresentados numa molécula do MHC por uma célula que apresenta antigénios (APC). A apresentação de antigénios pode ser conseguida utilizando monócitos, macrófagos, células de interdigitação, células de Langerhans e especialmente células dendríticas, carregadas com um dos péptidos do invento. O carregamento das APC pode ser realizado levando os polipéptidos do invento para a, ou para a vizinhança da APC, mas é preferível deixar a APC processar o 87 216 ΕΡ Ο 772 632/ΡΤ 13

'Sm«!j5S antigénio completo. Deste modo, é conseguida uma apresentação que mimetiza a situação in vivo, do modo mais realista. Além disso, o MHC utilizado pela célula é do tipo que é adequado para apresentar o epítopo.

Uma vantagem geral de utilizar APC para a apresentação dos epítopos é a escolha da célula APC que é utilizada para o efeito. É conhecido de diferentes tipos de APC que há APC estimulantes e APC inibidoras.

Preferem-se os tipos de células enumerados que são designadas por células que apresentam antigénios, "profissionais", caracterizadas por terem moléculas co-estimuladoras, que têm uma função importante no processo da apresentação de antigénios. Estas moléculas co-estimuladoras são, por exemplo, B7, CTLA-4, CD70 ou um antigénio estável ao calor.

Os fibroblastos, que se verificou serem também capazes de actuar como células que apresentam antigénios, não possuem estas moléculas co-estimuladoras.

Também é possível utilizar células já transfectadas com um veículo de clonagem contendo informação para os polipéptidos do invento e que são co-transfectadas com um veículo de clonagem, que compreende a sequência nucleotídica para uma molécula do MHC. Estas células irão actuar como uma célula que apresenta antigénios e irão apresentar epítopos de pestivírus nas moléculas do MHC, que são expressos na sua superfície. Prevê-se que esta apresentação seja potenciada, quando a célula também é capaz de expressar uma das moléculas co-estimuladoras acima mencionadas, ou uma molécula com uma função semelhante. Esta expressão pode ser o resultado da transformação ou transfecção da célula, com um terceiro veículo de clonagem contendo a informação de sequência que codifica para uma molécula co-estimuladora deste tipo, mas também pode acontecer que a célula já fosse capaz de produzir moléculas co-estimuladoras.

Em vez de uma vacina com estas células, que além dos produtos de expressão desejados também contêm muitos elementos que também são expressos e que podem afectar negativamente a reacção imunogénica desejada da célula, também é possível que uma vacina seja constituída com lipossomas, que expõem moléculas do MHC carregadas com péptidos e que, por exemplo, 14 ΕΡ Ο 772 632/ΡΤ estão cheios de linfóquinas. Estes iipossomas irão desencadear uma reacção imunológica de células T.

Ao apresentar o péptido do mesmo modo em que este é também apresentado in vivo, será desencadeada uma resposta aumentada de células T. Além disso, através do trabalho adjuvante, natural, das células que apresentam antigénio, relativamente grandes, também será desencadeada uma resposta de células B. Esta resposta de células B irá conduzir a.o. à formação de anticorpos dirigidos contra o complexo péptido-MHC. É este fenómeno que ocorre naturalmente que é aumentado pela vacinação com APC que já apresentam os péptidos do invento. Com este aumento, não só será desencadeada uma resposta dc células T aumentada, como será também iniciada uma resposta de células B, que conduz a anticorpos dirigidos contra o complexo MHC-péptido.

Uma alternativa a vacinas de subunidade são as vacinas vivas. Uma sequência de ácido nucleico de acordo com o invento é introduzida, por técnicas de ADN recombinante, numa célula ou organismo hospedeiro (e.g. uma bactéria ou vírus), de um modo tal que o hospedeiro recombinante ainda é capaz de se replicar, expressando deste modo um polipéptido codificado pela sequência de ácido nucleico inserida e eliciando uma resposta imunitária no porco hospedeiro infectado.

Uma concretização preferida do presente invento é um vírus vector recombinante que compreende uma sequência de ácido nucleico heteróloga acima descrita, capaz de expressar a sequência de ADN numa (em) célula(s) hospedeira(s), ou suíno hospedeiro infectados com o vírus vector recombinante. O termo "heterólogo" indica que a sequência de ácido nucleico de acordo com o invento não está normalmente presente na natureza, no vírus vector.

Além disso, o invento também compreende uma célula(s) hospedeira(s) ou cultura de células infectada(s) com o vírus vector recombinante, capaz de produzir a proteína CSFV por expressão da sequência de ácido nucleico.

Por exemplo, a técnica bem conhecida de recombinação homóloga in vivo pode ser utilizada para introduzir uma sequência de ácido nucleico heteróloga de acordo com o invento, no genoma do vírus vector.

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Primeiro, um fragmento de ADN que corresponde a uma região de inserção do genoma vector, i.e. uma região que pode ser utilizada para a incorporação de uma sequência heteróloga, sem danificar as funções essenciais do vector, tais como as necessárias para a infecção ou replicação, é inserida num vector de clonagem de acordo com técnicas de ADNrec, convencionais. Têm sido referidas regiões de inserção para um grande número de microorganismos (e.g. EP 80 806, EP 110 385, EP 83 286, EP 314 569, WO 88/02022, WO 88/07088, US 4 769 330 e US 4 722 848.

Segundo, se desejado, pode-se introduzir uma deleção na região de inserção presente na molécula de vector recombinante, obtida no primeiro passo. Isto pode ser conseguido, por exemplo, por digestão com uma exonuclease III adequada, ou tratamento com enzimas de restrição, da molécula de vector recombinante do primeiro passo.

Terceiro, a sequência de ácido nucleico heteróloga é inserida na região de inserção presente no vector recombinante do primeiro passo, ou no local do ADN delecionado do referido vector recombinante. A sequência de ADN da região de inserção deverá ter o comprimento adequado, para permitir que ocorra a recombinação homóloga com o genoma do vector. Em seguida, podem-se infectar as células adequadas com vírus vector do tipo selvagem, ou estas podem ser transformadas com ADN genómico do vector, na presença do vector recombinante, contendo a inserção flanqueada pelas sequências de ADN do vector, adequadas, pelo que a recombinação ocorre entre as regiões correspondentes no vector recombinante e no genoma do vector. A descendência do vector recombinante pode agora ser produzida em cultura de células e pode ser seleccionada, por exemplo, genotípica ou fenotipicamente, e.g., por hibridação, detectando a actividade enzimática codificada por um gene co-integrado juntamente com a sequência de ácido nucleico heteróloga, ou detectando o polipéptido heterólogo antigénico, expresso pelo vector recombinante, imunologicamente.

Em seguida, estes microorganismos recombinantes podem ser administrados a porcos para imunização, mantendo-se durante algum tempo, ou chegando mesmo a replicar-se no corpo do animal inoculado, expressando, in vivo, um polipéptido codificado pela sequência de ácido nucleico inserida, de acordo com o invento, resultando na estimulação do sistema imunitário do

87 216 ΕΡ Ο 772 632/ΡΤ 16 animal inoculado. Os vectores adequados para a incorporação de uma sequência de ácido nucleico de acordo com o invento podem ser derivados de vírus, como o poxvírus, e.g. vírus da vacínia (EP 110 385, EP 83 286, US 4 769 330 e US 4 722 848), vírus do herpes, como o vírus de Aujeszky (van Zijl, M. et a/., J. Virol. 62(6). 2191-2195, 1988), vírus de sincícios respiratórios de porcino, adenovírus ou vírus da influenza, ou bactérias como E. co/i, Streptococcus suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, ou espécies de Salmonella específicas. Com microorganismos recombinantes deste tipo, o polipéptido sintetizado no animal hospedeiro pode ser exposto como um antigénio de superfície. Neste contexto, são concebíveis, a fusão do polipéptido com proteínas OMP, ou proteínas pilosas de, por exemplo, E. coli ou o fornecimento sintético de sequências sinal e âncora, que são reconhecidas pelo organismo. Também é possível que o polipéptido de pestivírus, se desejado como parte de um todo maior, seja libertado dentro do animal a ser imunizado. Em todos estes casos, também é possível que um ou mais produtos imunogénicos encontrem expressão, o que gera protecção contra vários patogénios e/ou contra vários antigénios de um dado patogénio.

Uma vacina vector de acordo com o invento pode ser preparada por cultura de uma bactéria recombinante, ou de uma célula hospedeira infectada com um vector recombinante que compreende uma sequência de ácido nucleico de acordo com o invento, em que, em seguida, se podem recolher bactérias recombinantes ou células contendo vector e/ou vírus vectores recombinantes, crescidos nas células, opcionalmente na forma pura, e utilizá-los para formar uma vacina, opcionalmente na forma liofilizada.

As células hospedeiras transformadas com um vector recombinante de acordo com o invento, podem também ser cultivadas sob condições que são favoráveis à expressão de um polipéptido codificado pela referida sequência de ácido nucleico. As vacinas podem ser preparadas utilizando amostras da cultura bruta, lisados de células hospedeiras, ou extractos de células hospedeiras, embora noutra concretização se utilizem polipéptidos de acordo com o invento, mais purificados, para constituir uma vacina, dependendo do uso pretendido. De modo a purificar os polipéptidos produzidos, as células hospedeiras transformadas com um vector recombinante de acordo com o invento, são cultivadas num volume adequado e os polipéptidos produzidos são isolados destas células, ou do meio, no caso de a proteína ser excretada. Os

07 216 ΕΡ 0 772 632/ΡΤ polipéptidos excretados para o meio podem ser isolados e purificados por técnicas convencionais, e.g. fraccionamento de sais, centrifugação, ultrafiltração, cromatografia, filtração em gel, ou cromatografia de imunoafinidade, enquanto que os polipéptidos intracelulares podem ser isolados, recolhendo em primeiro lugar as referidas células, rompendo as células, por exemplo por aplicação de ultra-sons ou por outro meio de rompimento mecânico, tal como prensa francesa, seguindo-se a separação dos polipéptidos dos outros componentes intracelulares e constituição dos polipéptidos numa vacina. A ruptura de células também se pode conseguir por meios químicos (e.g. EDTA ou detergentes como o Triton X114), ou meios enzimáticos, como digestão com lisozima.

Também é possível vacinar os animais com o ADN "nu", i.e. os ácidos nucleicos como acima definido, sem quaisquer sequências reguladoras. Este ADN será então incorporado no genoma do animal vacinado, expressando assim o polipéptido do invento.

As vacinas de acordo com o invento podem ser enriquecidas com vários compostos que têm um efeito potenciador na iniciação e manutenção de ambas as respostas de células T e células B, após vacinação.

Deste modo, a adição de citóquinas à vacina irá potenciar a resposta de células T. Citóquinas adequadas são, por exemplo, as interleucinas, tais como IL-2, IL-4, IL-7 ou IL-12, GM-CSF, RANTES, factor de necrose tumoral e interferões, tais como IFN-gama.

Anticorpos ou anti-soro, dirigidos contra um polipéptido de acordo com o invento têm uma utilidade potencial em imunoterapia passiva, imunoensaios de diagnóstico e produção de anticorpos anti-idiotípicos. A vacina de acordo com o invento pode ser administrada num esquema de imunização activa, convencional: administração única ou repetida de um modo compatível com a formulação da dosagem e numa quantidade tal que seja profilacticamente eficaz, i.e. a quantidade de antigénio imunizante ou microorganismo recombinante capaz de expressar o referido antigénio que irá induzir imunidade em porcos, contra o desafio com CSFV virulento. Também pode ser dado em adição a uma vacinação convencional (dirigida para linfócitos

87 216 ΕΡ Ο 772 632/ΡΤ 18 Β), para potenciar a imunidade causada por esta vacinação. A imunidade é definida como a indução de um nível significativo de protecção numa população de animais, após vacinação, em comparação com um grupo não vacinado.

Para vacinas de vectores virais vivos, a dose por animal pode variar de 103-108 ufp. Uma vacina de subunidades típica, de acordo com o invento compreende 1 pg-1 mg de proteína de acordo com o invento. Estas vacinas podem ser administradas por via intradérmica, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, oral ou intranasal.

Adicionalmente, a vacina pode também conter um meio aquoso ou uma suspensão contendo água, muitas vezes misturada com outros constituintes, de modo a aumentar a actividade e/ou o tempo de armazenamento. Estes constituintes podem ser sais, tampões de pH, estabilizantes (tais como leite desnatado ou hidrolisado de caseína), emulsionantes, adjuvantes para melhorar a resposta imunitária (e.g. óleos, dipéptido de muramilo, hidróxido de alumínio, saponina, polianiões e substâncias anfipáticas) e conservantes. É claro que uma vacina de acordo com o invento pode também conter imunogénios relacionados com outros patogénios de porco, ou pode conter sequências de ácido nucleico que codificam para estes imunogénios, como antigénios de Actinobacillus pleuropneumoniae, vírus da pseudo-raiva, vírus da influenza de porcino, parvovírus de porcino, Streptococcus suis, vírus da gastrenterite transmissível, rotavírus, Escherichia coli, Erysipelothríx rhusiopathiae, Pasteurella multocida e Bordetella bronchiseptica. O invento refere-se também a um "reagente imunoquímico", que compreende uma proteína de acordo com o invento. O termo "reagente imunoquímico" significa que a proteína de acordo com o invento está ligada a um suporte adequado, ou é fornecida com uma substância marcadora.

Os suportes que podem ser utilizados são, por exemplo, a parede interna de um poço de microtítulo ou de uma cuvete, um tubo ou capilar, uma membrana, filtro, tira teste ou a superfície de uma partícula, tal como, por exemplo, uma partícula de látex, um eritrócito, um sol corante, um sol metálico ou um composto metálico como partícula do sol.

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JU

As substância marcadoras que podem ser utilizadas são, inter alia, um isótopo radioactivo, um composto fluorescente, uma enzima, um sol corante, um sol metálico ou um composto metálico como partícula do sol.

Uma sequência de ácido nucleico de acordo com o invento pode também ser utilizada para desenhar sondas específicas para experiências de hibridação, para a detecção ácidos nucleicos relacionados com pestivírus, em qualquer tipo de tecido. O presente invento pode também compreender um estojo de teste compreendendo a referida sequência de ácido nucleico útil para o diagnóstico de infecção por pestivírus, especificamente infecção por CSFV. O invento refere-se também a um estojo de teste a utilizar num imunoensaio, contendo este estojo de teste pelo menos um reagente imunoquímico de acordo com o invento. A reacção imunoquímica que ocorre utilizando este estojo de teste é de preferência uma reacção sanduíche, uma reacção de aglutinação, uma reacção de competição ou uma reacção de inibição.

Para realizar uma reacção sanduíche, o estojo de teste pode consistir, por exemplo, num polipéptido de acordo com o invento, ligado a um suporte sólido, por exemplo a parede interna de um poço de microtítulo e, ou um polipéptido marcado de acordo com o invento, ou um anti-anticorpo marcado. O invento é ilustrado pelos exemplos seguintes.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1: Identificação de linfócitos T citotóxicos específicos de CSFV

Isolaram-se leucócitos de sangue periférico de porcos miniatura, resultantes do cruzamento entre semelhantes, do haplótipo MHCd/d, após imunização com a estirpe Riems de CSFV (4x105 TCID50 i.m.), após desafios repetidos com 2x107 TCID50 da estirpe Alfort de CSFV e um desafio final com 3 ml, intranasal, de um soro (1x105 TCID50) obtido a partir de um porco infectado com a estirpe Brescia de CSFV. As células foram semeadas em placas

87 21 6 ΕΡ Ο 772 632/ΡΤ 20 de microtítulo de fundo redondo de 96 poços, a uma concentração de 1-2x105 células por microcultura, em meio RPMI (FCS a 10%) e simultaneamente re-estimuladas com vírus infecciosos (5x105 TCIDb0/ml de CSFV-Alfort) durante 3 a 5 dias. A cultura de células alvo infectadas foi realizada do seguinte modo: removeu-se um rim de um porco miniatura ("NIH-Minipig"; haplótipo MHCd/d) e cortou-se em pedaços, sob condições estéreis. Os pedaços de órgão foram lavados com PBS e pipetaram-se 30-100 pedaços para um frasco de cultura (25 cm2). Estes foram incubados em meio de cultura (FCS a 10%) ao qual se adicionou uma solução de colagenase-dispase (solução mãe de 2,5 mg/ml diluída 1:6 em meio). As células foram lavadas do tecido com PBS, sedimentadas (6 min, 750 g) e lavadas duas vezes em PBS. Foram cultivadas em DMEM (FCS a 10%), em frascos de cultura (25 e 75 cm2).

Para se obter uma linha celular transformada estável, de células alvo, as células de rim foram transformadas com um plasmídeo com a sequência para o antigénio "T grande" de SV-40 (Southern, P. e Berg, P., J. Molec. AppI. Genetics. _1_, 327-341, 1982; Fanning, E. J. Virol.. 66, 1289-1293, 1992). Para este plasmídeo de SV-40 purificado, misturou-se pSV-3 neo (do Dr. T.C. Mettenleiter, BFAV Tiibigen) com lipofectina, a uma razão entre ADN-lipofectina de 1:4 e incubou-se durante 15 minutos à temperatura ambiente. Removeu-se o meio de cultura de uma cultura de células de rim, grandemente confluente (80%) e adicionaram-se 2 ml de meio OptiMEM (Gibco). A suspensão de lipofectina/ADN foi então adicionada gota a gota, e a cultura foi inicialmente incubada durante 12 horas, a 37°C. Em seguida, o meio foi substituído por meio de clonagem (DMEM, F10 (Gibco) e F12 (Gibco) numa razão de 2:1:1) com FCS (soro fetal de vitela) a 10% e fez-se a cultura a 37°C. As células MAX assim obtidas foram seleccionadas por cultura com um análogo de neomicina G418 (Boehringer) e testadas quanto a contaminação com micoplasma (estojo Mycoplasma Detection Kit, Boehringer Mannheim).

Infectaram-se 1x106 células alvo com CSFV-Alfort a uma m.o.i. de 0,5. 48 horas após a infecção, as células foram tripsinizadas e recolhidas em 200 μΙ de um meio de teste de CTL (RPMI 1640 (Gibco), FCS a 3%). As células alvo foram marcadas com 100 pci de Na251Cr04 durante 90 minutos, lavadas três 87 216 ΕΡ Ο 772 632/ΡΤ 21

vezes e ressuspensas em meio de teste de CTL, a uma concentração final de 1x104 células/ml.

As células efectoras foram diluídas para se obterem diferentes razões efector:alvo e foram adicionadas a poços em triplicado, em volumes de 100 μΙ. Adicionaram-se 1x103 células alvo/poço às células efectoras. As placas foram centrifugadas a 100 g durante 5 minutos e incubadas durante 4 horas, a 37°C. Após centrifugação a 600 g durante 10 minutos, recolheram-se 100 μΙ de cada sobrenadante e a libertação de crómio foi determinada como cpm, num contador de radiação gama. A percentagem de lise específica foi calculada pela fórmula (cpm exp. - cpm espont.) * 100 % lise específica = (cpm total - cpm espont.)

Foram incluídos controlos de células alvo, do seguinte modo: de modo a medir a libertação espontânea de radioisótopos (cpm espont.), as células alvo foram incubadas sem efectores. Além disso, determinou-se a incorporação total de crómio nas células alvo (cpm total).

Resultados A lise de células alvo infectadas com CSFV, por linfócitos T citotóxicos foi superior à do grupo de controlo (Figura 1). Atingiu-se uma lise específica superior em mais de 30%, com uma razão entre efector e células alvo relativamente baixa (12:1), o que indica uma taxa elevada de linfócitos T citotóxicos específicos de CSFV. EXEMPLO 2: Lise mediada por linfócitos T citotóxicos, de células alvo que expressam proteínas truncadas.

Infectaram-se 1x1 0R células MAX (obtidas como descrito no Exemplo 1), com diferentes recombinantes de vírus da vacínia/CSFV, a uma multiplicidade de infecção de 2,0, durante 16 horas. A Figura 2 mostra as posições relativas das proteínas de CSFV e a identificação dos recombinantes de vírus da vacínia/CSFV, obtidos.

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As células que mostraram um efeito citopático moderado foram tripsinizadas e recolhidas em 200 μΙ de meio de teste de CTL. As células alvo foram marcadas com 100 μα de Na^CrO* durante 90 minutos, lavadas três vezes e ressuspensas em meio de teste de CTL, a uma concentração de 1x104 células/ml, antes da utilização no teste. 0 teste foi realizado do mesmo modo que descrito no Exemplo 1.

Resultados

Os resultados dos testes de libertação do crómio indicaram que o CTL específico de CSFV apenas reconhece células alvo infectadas com o recombinante vírus da vacínia/p125S. De forma surpreendente, nem as células alvo que expressam proteínas estruturais virais, nem as células que expressam autoprotease foram lisadas pelos linfócitos T citotóxicos, específicos (figura 3). A partir dos produtos peptídicos produzidos pelo recombinante de vírus da vacínia/p125S, parece que a subunidade de 80 kD ou a proteína p10 são responsáveis pelo reconhecimento (figura 4, gráfico do meio, superior). Estreitando esta área, parece que o recombinante de vírus da vacínia/CSFV, p80/VZ, ainda apresenta lise específica, enquanto que o p80/VA e o p80/VX são ineficazes. Isto significa (veja-se figura 2; as posições de nucleótidos referem-se à sequência de CSFV Alfort apresentada por Meyers et al., Virology 171. 555-567, 1989) que o epítopo específico de células T se situa próximo do local de clivagem entre p125 e p10. Esta região, identificada como a região em que o epítopo está alojado (a região que ainda está presente no recombinante p80/VZ e não está presente em p80/VA e p80/VX) situa-se desde a posição de aminoácido 2223 a 2285 (de acordo com a sequência de CSFV Alfort (Meyers et al. supra), i.e., posições de aminoácidos 1093 a 1155 de SEQ ID NO:2). Os dados obtidos por sequenciação de proteínas do terminal N de p10 da estirpe cp7 de BVDV revelam que o local de clivagem entre p125 e p10 de CSFV-Alfort está localizado entre as posições de aminoácidos 2272 e 2273 de CSFV-Alfort, i.e. entre as posições de nucleótidos 3426 e 3427 de SEQ ID NO:1.

87 216 ΕΡ Ο 772 632/ΡΤ 23 EXEMPLO 3: Identificação de um epítopo de célula T reconhecido por CTL específico de CSFV.

Para determinar o epítopo reconhecido pelos CTL específicos do vírus, sintetizaram-se nonapéptidos e pentadecapéptidos com sobreposição em 8 e 12 aminoácidos, respectivamente, que cobrem a região de aminoácidos das posições 1093 a 11 55 de SEQ ID N0:2.

Marcaram-se 1x106 células alvo com 100 pci de Na251Cr04 durante 90 minutos, lavou-se três vezes e ressuspendeu-se em meio de teste de CTL, a uma concentração final de 2x104 células/ml. Adicionaram-se 50 μΙ de suspensão de células alvo a poços em triplicado, de placas de 96 poços, de fundo redondo. As células alvo foram carregadas com péptido por incubação com 100 μΙ de solução de péptido (5 mg/ml de solução-mãe em DMSO; diluída de 1:4000 a 1:5000 em meio RPMI, resultando em aproximadamente 50 a 125 ng/103 células alvo) durante 1 hora. Adicionaram-se 1x105 células efectoras a cada poço, em volumes de 50 μΙ, para se obter uma razão entre efector e célula alvo de 100:1. O teste de libertação de crómio foi realizado de um modo semelhante aos exemplos 1 e 2.

Resultados A lise específica de células alvo carregadas com diferentes péptidos é apresentada nas figuras 5 e 6. Na figura 5 mostra-se que o nonapéptido E-N-A-L-L-V-A-L-F origina a maior percentagem de lise específica, enquanto que na figura 6, o pentadecapéptido S-T-A-E-N-A-L-L-V-A-L-F-G-Y-V resultou numa lise significativamente maior de células alvo, em comparação com as células alvo incubadas com outros pentadecapéptidos. Este pentadecapéptido contém a sequência do nonapéptido já identificada na figura 5. Apesar disso, os CTL lisaram células alvo carregadas com o nonapéptido de um modo mais eficiente do que as células alvo carregadas com o pentadecâmero, sugerindo que os nonapéptidos têm uma afinidade maior para as moléculas do MHC-I de porcino, do que os pentadecapéptidos. 87 216 ΕΡ Ο 772 632/ΡΤ

24 EXEMPLO 4: Reactividade cruzada de CTL específicos de CSFV.

As experiências relacionadas com a reactividade cruzada de CTL específicos de CSFV foram realizadas utilizando células alvo infectadas com diferentes estirpes de CSFV, a uma m.o.i. de 0,5, durante 48 horas (realizada de acordo com o Exemplo 1), ou infectadas com recombinantes do vírus da vacínia, a uma m.o.i. de 2,0 durante 16 horas (realizado de acordo com o Exemplo 2). Os recombinantes de vírus da vacínia continham as sequências codificantes para as proteínas não estruturais p125, p10 e a parte do terminal N de p30 de CSFV-Alfort Tubigen (Vac-p125S), ou as proteínas correspondentes da estirpe cp7 de BVDV (Vac-p120S). A actividade de CTL de células efectoras sensibilizadas com CSFV foi determinada em testes de libertação de crómio, utilizando as células MAX infectadas como alvos.

Para controlo, utilizaram-se alvos não infectados e infectados com o vírus da vacínia do tipo selvagem (Vac-WR).

Resultados

Os resultados de ambas as experiências com estirpes de CSFV e com recombinantes de vírus da vacínia são apresentados na tabela I. A partir destes resultados, pode-se ver que os CTL específicos de CSFV foram capazes de lisar células alvo infectadas com diferentes estirpes de CSFV. Também se verificou que os CTL específicos de CSFV foram capazes de lisar células alvo que expressam proteínas não estruturais de uma estirpe de BVDV, sugerindo assim que estas proteínas não estruturais englobam um epítopo específico de células T, que poderá ser conservado nos pestivírus. 25 87 216 ΕΡ Ο 772 632/ΡΤ

Tabela I. Reactividade cruzada de CTL específicos de CSFV estirpes de CSFV razão E:A 50:1 25:1 Alfort Tíibigen 49% 24% Alfort 187 49% 38% Eystrup 52% 27% Riems 32% 16% Brescia 27% 14% Schweinfurt 42% 23% não infectado 1% 0% recombinantes do vírus da vacínia razão E:A 25:1 12:1 Vac-pl 25S (CSFV) 31% 19% Vac-p120S (BVDV) 35% 20% Vac-WR 18% 7%

LEGENDAS DAS FIGURAS

Fia. 1:

Resultados do teste de libertação do crómio que indicam uma lise específica de CSFV de células alvo, por células T citotóxicas. Os círculos a branco indicam células alvo de controlo, não infectadas, os círculos a cheio indicam células alvo infectadas com CSFV. A % de lise específica é indicada no eixo dos Y, enquanto que o eixo dos X mostra a razão entre efector e células alvo.

Fio. 2:

Recombinantes de vírus da vacínia/CSFV utilizados para infecção de células alvo autólogas. São indicadas as posições relativas da autoprotease do terminal N (Npro), o núcleo das proteínas estruturais (C), EO, E1, E2 e as proteínas não estruturais p125, p30 e p133 na poliproteína de CSFV, bem como os seus produtos de processamento. Além disso, também se apresentam as proteínas virais e as proteínas p125 truncadas, expressas como recombinantes de vírus 87 216 ΕΡ Ο 772 632/ΡΤ 26

da vacínia/CSFV. As posições de aminoácidos indicadas estão de acordo com a sequência de CSFV-Alfort.

Fiq. 3:

Lise mediada por CTL, de células alvo infectadas com diferentes recombinantes de vírus de vacínia/CSFV. As células MAX foram infectadas com vírus da vacínia do tipo selvagem (Vacc-WR, círculos a branco) e os recombinantes de vírus da vacínia/CSFV Vacc-Npr0C (quadrados a branco), Vacc-E012 (quadrados a cheio) ou Vacc-p125S (círculos a cheio) e utilizados como células alvo, num teste de libertação de crómio contra CTL específicos de CSFV. Os eixos são como na figura 1.

Fia. 4:

Lise, mediada por CTL, de células alvo que expressam proteínas não estruturais truncadas. A apresentação de dados é análoga à da figura 3.

Fiq.5:

Lise de células alvo peptídicas por CTL específicos de CSFV. Incubaram-se células MAX marcadas radioactivamente, com diferentes nonapéptidos. As barras indicam a percentagem de lise específica a uma razão entre efector e alvo de 100 para 1. Controlos: lise específica de células alvo infectadas com CSFV e não infectadas.

Fiq. 6:

Lise de células alvo carregadas com pentadecapéptido. As legendas são como para a figura 5.

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

(1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTE: (A) NOME: AKZO NOBEL N.V. (B) RUA: Velperweg 76 (C) CIDADE: Arnhem (E) PAÍS: Holanda

(F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 6824 BM (G) TELEFONE: 04120-66204 (H) TELEFAX: 04120-50592 (I) TELEX: akpha n1 (ii) TITULO DO INVENTO: Proteína estimuladora de células T, de pestivírus (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 6 (v) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disquete

(B) COMPUTADOR: PC compatível com IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, versão # 1.30 (EPO) (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 3639 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO

87 216 ΕΡ Ο 772 632/ΡΤ 28 (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Vírus de febre suína clássica (B) ESTIRPE: Alfort (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: AIÍ125 (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..3639 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.1: AAG GGT GGT AAG ATA GAT GGT GGC Lys Glv Giy Lys lie Asp Glv Glv 1 c TTT GAC ATC CAA O * V- GCA CTG GCA Phe Asp lie Glr. Leu Ala Leu Ala 20 CTG GCA AAG AGA GAC CCG ACT Leu Ai a Lys Arg Asp Pr = T!"ir Thr 35 40 ACC CTG AGA ACG Gow AAG ATA ACC Thr Leu Arg ΤΪΊΓ Ai a Lys Ile Thr 50 55 ATA GCC ACA GTG TCG GCA GCT TTG Ile Ala Thr Vai Ser Ala Aiã Leu 65 7 C TAC TAC AAA TAC AAG ACT i, vava CTA Tyr Tvr Lys Tyr Lys 'Τ' ‘-- Trp Leu 85 TGG CAG AGA CAA CvG GTG ACC AGT 48 Trp Gin Arg Gin Pro Val Thr Ser 10 1'C GTC GTA GTA GTC GTT GTG ATG TTG 96 Vai Val Val Val Vai Val Me- Leu 25 30 CCT • · Ό o;A Λ m W ACA GTG GCA 144 Phe Pro Leu vai ' A Thr Vai ALâ 45 AAC ova x TTT AGC ACA GAT CTA GTC 7 ao Asn Glv Phe Ser 'Τ'ν. Asp Leu Val 60 TTA ACT TGG ACC TAT ATC AGC GAC 240 Leu Thr Trp Thr Tyr lie Ser Asp 7 5 80 CAG TAC CTC Gx C AGC no o GTG ACT 2se Gin Tyr Leu Vcl Ser Thr vai Thr 95 90 29 87 216 ΕΡ Ο 772 632/ΡΤ

GGA ATC TTC CTG ΑΤΑ Auu uiva CTu Αλο Gw/t ΑΤΑ GvC GAA TTG GAT CTG

Gly Xle Phe Leu lie Arg Vai Leu Lys Gly Ile Glv Glu Leu Asp Leu 100 105 110 CAC GCC CCA ACC TTG CCG TCT CAC AGA CCC CTC TTT TTAC ATC CTT GTA His Ala Pro Thr Leu Pro Ser His Arg Pro Leu Phe Tyr Ile Leu Vai 113 120 125 TAC CTT ATT TCC ACT GCC GTG GTA ACT AGA TGG AAT CTG GAC GTA GCC Tyr Leu Ile Ser Thr Ala Vai Vai Thr Arg Trp Asn Leu Asp Vai Ala 130 135 140 GGA TTG TTG CTG CAG TGC GTC CCA ACT CTT TTA ATG GTT TTT ACG ATG Gly Leu Leu Leu Gin Cys Vai Pro Thr Leu Leu Met Vai Phe Thr Met 145 150 155 160 TGG GCA GAC ATT CTC A*.w CTA ATT CTC ATA CTA CCT ACT ·«·««** 1.Λ* GAG TTA Trp Ala Asp. Ile Leu Thr Leu Ile Leu lie Leu Pro Thr T%r,r Giu Leu 165 170 175 ACA AAG TTA i n» :ny. ’— * r-r.G GAA GTG « » a» Ληυ ATT GGG GCA GAA. AGA GGT Thr Lvs Leu v m* te Leu Lys Giu Vai Lys Ile Gly Ala Giu Aro Gly 190 1S5 190 TGG CTG AAA ATT nÀC tat A*.j nviu GTA AAC GAC ATC *· *rvw sanu GTC Tr? Leu * Tr.^ Asr* Tyr Lys Arg Vai As n Asr T i e *r*. Vai 195 20C 205 GAC CAA ACT AGC GAA GGG GTT TAC CTT TTC CCT TCT AAA CAG AGG ACG Asp Glr. «T>W Ser Giu Gly Vai Tvr Leu Phe Pro Ser Lvs Gin Aro Thr 210 215 220 AGC GCT ATA . ACT AGT Λν» ATG TTG ; cca . TTA ATC AAA . GCC ATA CTC Ser A.J. 3 lie Tr.r Ser Tr.r Mer Leu Pr r Leu lie Lvs Aiâ lie Leu lie 41 30 87 216 ΕΡ Ο 772 632/ΡΤ AGC TGC ATC AGC AAC AAG TGG CAA Ser Cys Ile Ser Asn 245 Lys Trp Gin crc ATA TAC TTA CTG TAC TTG ATA Leu Ile Tyr Leu Leu Tyr Leu Ile 250 255 768 TTT GAA GTG TCT TAC TAC crc CAC AAG AAA GTT ATA GAT GAA ATA GCT 816 Phe Glu Vai Ser Tyr Tyr Leu His Lys Lys Val Ile Asp Glu Ile Ala 260 265 270 GGT GGG ACC AAC TTC GTT TCA AGG CTC GTG GCG GCT TTG ATT GAA GTC 864 Gly Gly Thr Asn Phe Val Ser Arg Leu Val Ala Ala Leu Ile Glu Val 275 280 285 AAT TGG GCC TTC GAC AAT GAA GAA GTC AAA GGC TTA AAG AAG TTC TTC 912 Asn Trp Ala Phe Asp Asn Glu Glu Val Lys Gly Leu Lys Lys Phe Phe 290 295. 300 TTG CTG TCT AGT AGG GTC AAA GAG TTG ATC ATC AAA CAC AAA U14 AGG 960 Leu Leu Ser Ser Arg Val Lys Glu Leu Ile Ile Lys His Lys Val Arg 305 310 315 320 AAT GAA GTA GTG GTC CGC TGG TTT GGA GAT GAA GAG ATT TAT GGG ATG 1008 Asn Glu Vai Vai Vai Arg Trp Phe Gly Asp Glu Glu Ile Tyr Gly Met 325 330 335 CCA AAG CTG .n;« Gu^ TTA V3. 4 AAG GCA GCA Ammm % AGT AGA AAC AAA 1056 Pro Lys Leu lie Gly Leu Vai Lys Ala Ara Τ'- - Leu Ser Arg Asn Lys 340 345 350 CAC • gi ATG 4 * W TGT ACC GTC TGT GAG Gnt~ AGA GAT 4 gg AGA GGv* GAA 1104 His Cys Mec Leu Cys Thr val Cys Glu Asp Arg Asp Trp Arg Gly Glu 355 360 365 ACT TGC CCT AAA TGT GGG CGT GGA CCA CCA GTG GTC TGC GGT ATG 1152 Thr Cys Pro Lys Cys Gly Arg Phe Gly Pro Pro Val Val Cys Gly Mec 370 375 380 87 216ΕΡ Ο 772 632/ΡΤ 31 ACC CTA GCC GAT. TTC GAA GAA AAA CAC TAT AAA AGG ATT TTC ATT AGA 1200 Thr Leu Ala Asp Phe Glu Glu Lys His Tyr Lys Arg Ile Phe Ile Arg 385 390 395 400 GAG GAC CAA TCA GGC GGG CCA CTT AGG GAG GAG CAT GCA GGG TAC TTG 1248 Glu Asp Gin Ser Gly Gly Pro Leu Arg Glu Glu His Ala Gly Tyr Leu 403 410 415 CAG TAC AAA GCC AGG GGT CAA CTG TTT TTG AGG AAC CTC CCA GTG TTA 1296 Gin Tyr Lys Ala Arg Gly Gin Leu Phe Leu Arg Asn Leu Pro Vai Leu 420 425 430 GCT ACA AAA /' <»·<· U1W AAG ATG CTC CTG GTT GGT AAC CTC GGG ACA GAG ATT 134.4 Ala Thr Lys Vai Lys Mec Leu Leu Vai Gly Asn Leu Gly Thr Glu Ile 435 440 445 GGG GAT CTG GAA CAC CTT GGC TGG GTG CTT AGA GGG CCA GCT GTT TGC 1392 Gly Asp Leu 'Glu His Leu Gly Tro Vai Leu Ara Gly Pro Ala Vai Cys 450 455 4 60 AAG AAG GTT ACT GAA CAC GAA AGA TGC ACC ACG ATA ATG GAT AAG 1440 Lys Lys Vai Thr Glu His Glu Arg CVS Thr Thr Ser lie Mec Asp Lys 465 470 475 480 TTG ACT GCT 4» * w TTT GiaA GTA ATG CCA AGG GGC ACT a CvW AGA GCT '48° Leu Thr Ala ?he Phe Giv Vai Mec Pro Arg Gly Thr Thr Pro Arg Ala 485 4 90 495 ccc GTA AGA CCT ACC TCC CTC CTA AAG ATA AGA AGA GGG s# a να « <—· Oí-íl; ; Pro Vai Arg Phe Pro Thr Ser Leu Leu Lys Ile Arg Arg Gly Leu Glu 500 505 510 ACT GGT TGG GCT TAC ACA CAC CAA GGT GGC ATC AGC TCA. GTA GAC CAT 12 5 4 Thr Gly Trp Ala Tyr Thr His Gin Gly Giy lie Ser Ser Vai Asp His 515 520 522

«*» c 32 87 216 ΕΡ Ο 772 632/ΡΤ

GTC ACT TGT GGG ΑΛΑ GAC ΤΤΑ CTG GTG

Vai Thr Cys Gly Lys Asp Leu Leu Vai S30 235 AGG GTT GTT TGC CAG TCA AAT AAT AAG Arg Vai Vai Cys Gin Ser Asn Asn Lys 545 550

GGA GTC AAA ACT GAC TCC GGG TGC CCA

Gly Vai Lys Thr Asp Ser Gly Cys Pro 565

TTT AAC CCG GAA GCA GTT AAC ATA TCA

Phe Asn Pro Glu Ala Vai Asn.Ile Ser 580 585 CAC TTA CAG AAA ACG GGT GGA GAA TTC His Leu Gin Lys Thr Gly Gly Glu Phe 595 600 ACC CCG GCC TTC TTT GAC CTC AAG AAC Thr Pro Ala Phe Phe Asp Leu Lys Asn 610 515 CCG ATA TTT GAA GCA. TCA AGT GGA AGG Pro Ile Pne Glu Ala Ser Ser Gly Arg 625 630 GGG AAG AAC GAG GAT TCC AAA CCA ACC Gly Lys Asn Glu Asp Ser Lys Pro Thr 645 ACG GTT TCT AAA AGC GCC ACA GAC TTG Thr Vai Ser Lys Ser Ala Thr Asp Leu 660 ' 655 GAC ACC ATG GGT CGG ACA 1632 Asp Thr Met Gly Arg Thr 540 ACC GAC GAG TCC GAA TAC 1680 Thr Asp Glu Ser Glu Tyr 555 560 GGA GCC AGG TGT TAC GTG 1728 Gly Ala Arg Cys Tyr Val 575 ACT AAA GGA GCC ATG GTC 1776 Thr Lvs Gly Ala Met val 590 TGT GTG ACA GCA TCA GGA 1824 CVS Vai Thr Ala Ser Gly 605 AAG GGC TGG GGG CTA 1872 Lys Gly Trp Ser Gly Leu 620 GTC GGA * ^ AVJU GTC AAG GTC 1920 Vai Gly Ara Val Lys Vai 535 640 CTC ATG AGT GGG ATA ^ ** 1965 Leu Met Ser Gly Ile Gin 655 GAG ATG GTG AAG AAG ATA 2016 Glu Met val Lvs Lys Ile 670 87 216ΕΡ Ο 772 632/ΡΤ 33

ACG ACC ATG AAC AGG GGA GAG TTC AGA CAA ATA ACC CTG GCC ACA GGT 2064 Thr Thr Met Asn Arg Gly Glu Phe Arg Gin Ile Thr Leu Ala Thr Gly 675 680 685 GCC GGA AAA ACT ACA GAG CTC CCT AGA TCA GTT ATA GAA GAG ATA GGG 2112 Ala Gly Lys Thr Thr Glu Leu Pro Arg Ser Vai Ile Glu Glu Ile Gly 690 695 700 AGG CAT AAG AGG GTG TTG GTC TTA ATC CCC TTG AGG GCG GCA GCA GAA 2160 Arg His Lys Arg Vai Leu Vai Leu Ile Pro Leu Arg Ala Ala Ala Glu 705 710 715 720 TCA GTA TAC CAA TAC ATG AGA CAG AAA CAT CCG AGT ATA GCA TTC AAT 2208 Ser Vai Tyr Gin Tyr Met Arg Gin Lys His Pro Ser Ile Ala Phe Asn 725 730 735 CTA AGG ATA GGT GAG ATG AAG GAA GGT GAT ATG GCC ACG GGA ATA ACC 2256 Leu Arg Ile Gly Glu Mec Lys Glu Gly Asp Mec t^lâ Thr Gly Ile 'Thr 740 745 750 TAT GCC TCT TAC GGT TAC TTT TGC CAG ATG TCA CAA CCC AAG CTG AGA 2304 Tyr Ala Ser Tyr Gly Tvr Phe Cys Gin Met Ser Gin Pro Lys Leu Arg 755 760 765 GCC GCA ATG GTA GAA TAT TCC TTT ATA TTC CTA υηι GAG *** l.*il CAT TGT 2252 Ala Ala Met V e i. Glu Tyr Ser Phe 7*0 Phe Leu Asp G-u His Cys 770 775 780 GCT ACC CCA GAA CAA CTG GCA ATC ATG Gúu AAG ATC C.-.C AGA TCA 2400 Ala Thr Pro Glu Gin Leu Ala Ile Mec Gly Lys Ile His Arg Phe Ser 785 790 795 900 GAA AAC CTG CGG GTG GTA GCT ATG ACA GCG ACA CCG GCA GGC ACA , GTA 2448 Glu Asn Leu Arg Vai Vai Ala Mec Thr Ala Thr Pro Alâ Gly Thr vai 815 805 810 87 216 ΕΡ Ο 772 632/ΡΤ 34

ACA ACC ACT GGG CAG AAA CAC CCT ATA GAG GAA J£0*M£» ATA GCC CCG GAA 2496 Thr Thr Thr Gly Gin Lys HÍS Pro Ile Glu Glu Phe Ile Ala Pro Glu 820 825 830 GTG ATG AAA GGA GAA GAC TTG GGT TCT GAG TAC TTA GAT ATT GCC GGA 2544 Vai MeC Lys Gly Glu Asp Leu Gly Ser Glu Tvr Leu Asp Ile Ala Gly 335 840 845 CTG AAG ATA CCA GTA GAG GAG ATG AAG AAT AAC ATG CTA GTT TTT GTG 2592 Leu Lys Ile Pro Vai Glu Glu Met Lys Asn Asn Met Leu Val Phe Val 850 855 860 CCC ACC AGG AAC ATG GCG GTA GAG GCG GCA AAG AAA TTG AAG GCC AAA 2640 Pro Thr Arg Asn Met Ala Vai Glu Ala Ala Lys Lys Leu Lys Ala Lys 865 870 875 380 GGA TAC AAC TCG GGC TAC TAC TAC AGC GGA GAG GAC CuA TCT AAC CTG 2688 Gly Tyr Asn Ser Gly Tyr Tyr Ser Gly Glu Asp Pro Ser Asn Leu 885 890 895 AGG GTG GTG ACG TCG CAG TCC CCA TAC GTG GTG GTA GCA ACC AAC GCA 2736 Arg Vai Vai Thr Ser Gin Ser Pro ‘y- Vai Val Vai Thr Asn Ala 900 905 910 ATA GAA TCG GGC GTT ACC CTC wCG GAC V· 1 GAC GTG GTT GTC GAC ACG 2784 Ile Glu Ser Giy Vai u. _ Leu Pro Asp Leu Asp Val Val Vai Asp Thr 915 920 925 GGA CTC AAG *— GAA AAA AGA ATC CG A CTG trnjm « i s-.n —w AAG ATG CCT 2922 Gly Leu Lvs Cys Glu Lys Arg lie Arg Leu Ser Pro Lys Met Pro Phe 930 935 940 ATA GTG ACG GGC CTG AAA AGA ATG GCC GTC ACT ATT GGG GAA CAA GCC 2880 Ile Vai Thr Giy Leu Lys Arg Met Ala Vai Thr Ile Gly Glu Gin Ala 945 950 960 955

07 216 ΕΡ 0 772 632/ΡΤ 35

CAG AGA AGA GGG AGG GTT GGA AGA GTG AAG GGG AGA TAC TAC AGG 2928 Gin Arg Arg Gly Arg Vai Gly Arg Vai Lys Pro Gly Arg Tyr Tyr Arg 965 970 975 AGT CAA GAA ACA CCT GTC GGC TCT AAA GAC TAC CAT TAT GAC TTA TTG 2976 Ser Gin Glu Thr Pro Vai Gly Ser Lys Asp Tyr His Tyr Asp Leu Leu 980 98S 990 CAA GCC CAG AGG TAC GGC ATA GAA GAT GGG ATA AAT ATC ACC AAA TCC 3024 Gin Ala Gin Arg Gly Ile Glu Asp Gly Ile Asn Ile Thr Lys Ser 995 1000 1005 TTC AGA GAG ATG AAC TAC GAC TGG AGC CTT TAT GAG GAA GAT AGC CTG 3072 Phe Arg Glu Met Asn Tyr Asp Trp Ser Leu Tyr Glu Glu Asp Ser Leu 1010 1015 1020 ATG ATC ACA CAA CTG GAA ATC CTC AAC AAC CTG TTG ATA TCA GAA GAG 3120 Met Ile Thr -Gin Leu Glu Ile Leu Asn Asn Leu Leu Ile Ser Glu Glu 1025 1030 1035 1040 CTG CCG ATG GCA GTA AAA AAT ATA ATG GCC AGG ACC GAC CAC CCA GAA 3168 Leu Pro Met Ala Vai Lys Asn lie Met Ala Arg Thr Asp His Pro Glu 1045 1050 1055 CCA ATT CAA I— GCG TAT AAC AGC TAC GAG ACA CAG GTG CCG GTA TTA 2216 Pro Ile Gin Leu Ala Tyr Asn Ser Tyr Glu Thr Gin Vai Pro Vai Leu 1060 1065 1070 TTC CCA AAA ATA AGA AAT GGA GAG GTG ACT GAT ACT .AW Í3À1 * w m ΛΛ* TAC 3254 Phe Pro Lys Ile Arg Asn Gly Glu Vai Thr Asp Thr Tyr Asp Asn Tyr 1075 1080 1085 ACC TTC CTC AAT GwA AGA AAA TTG GGA GAT GAC GTA CCG CCC TAC GTG 2312 Thr Phe Leu Asn Ala Arg Lys Leu Gly Asp Asp Vai Pro Pro Tyr Vai 1090 1095 1100 TAT GCT ACA GAG GAT GAvj VJAW * 1 V* GCA GTG GAA CTG TTG GCC CTA . GAT 2360 Tyr Ala Thr Glu Asp Glu Asp Leu Ala Vai Glu Leu Leu Gly Leu Asp 1103 111 w 111 5 112C

TGG CCG GAC CCA GGA AAC CAA GGC ACC GTG GAA GCT GGC AGA GCA CTA 3408 Trp Pro Asp Pro Gly Asn Gin Gly Thr Vai Glu Ala Gly Arg Ala Leu 1125 1130 1135 AAA CAG GTG GTT GGT CTA TCA ACA GCA GAG AAC GCC ''CTG CTA GTC GCC 3456 Lys Gin Vai Vai Gly Leu Ser Thr Ala Glu Asn Ala Leu Leu Vai Ala 1140 1145 1150 CTG TTC GGC TAC GTG GGG TAC CAG GCG CTT TCA AAG AGA CAT ATA CCA 3504 Leu Phe Gly Tyr Vai Gly Tyr Gin Ala Leu Ser Lys Arg His Ile Pro 1155 1160 1165 CTG GTC ACA GAT ATA TAT TCA GTA GAA GAT CAC AGG CTA GAG GAC ACT 3552 Leu Vai Thr Asp lie' Tyr Ser Vai Glu Asp His Arg Leu Glu Asp Thr 1170 1175 1180 ACG CAC CTA CAG TAT GCT CCG AAT GCC ATC AAG ACG GAG GGG AAG GAA 3600 Thr His Leu Gin Tyr Ala Pro Asn Ala Ile Lys Thr Glu Giy Lys Glu 1185 1190 1195 1200 AC7 GAA l AAG GAG CTG GCT CAG GGG GAT GTG CAG AGA 2639 Thr Giu Leu Lys Giu Leu Aiâ Gin GIv Asp Vai Gin Arg 12C5 1210

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 1213 aminóácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.2:

Lys Gly Gly Lys lie Asp Gly Giy Trp Gin Ara Gin ?ro Vai Thr Ser 1 5 10 1 07 216 ΕΡ 0 772 632/ΡΤ 37

Phe Asp Zle Gin Leu 20 Leu Ala Lys Arg Asp 35 Thr L«mi Arg Thr Ala 50 Ile Ala Thr Vai Ser 65 Tyr Tyr Lys Tyr Lys 85 Gly Ile Phe Leu lie 100 His Ala Pro Thr Leu 115 Tyr Leu Ile Ser Thr 130 Gly Leu Leu Leu Gin 145 Trp Ala Asç Ile Lee 16: Thr Lys Leu Tvr Tv: 180 Trp Leu Trp Lvs Tr.: 195 Asp Gin Thr Ser Gi: 210

Ala Leu Ala Vai Vai Vai Vai Vai Vai Mec Leu 25 30

Pro Thr Thr Phe Pro Leu Vai Ile Thr Vai Ala 40 45

Lys Ile Thr Asn Gly Phe Ser Thr Asp Leu Vai 55 60

Ala Ala Leu Leu Thr Trp Thr Tyr Ile Ser Asp 70 75 80

Thr Trp Leu Gin Tyr Leu Vai Ser Thr Vai Thr 90 95

Arg Vai Leu Lys Gly Ile Gly Glu Leu Asp Leu 105 110

Pro Ser His Arg Pro Leu Phe Tyr Ile Leu Vai 120 125

Ala Vai Vai Thr Aro Trp Asn Leu Asp Vai Ala 135 140

Cys Vai Pro Thr Leu Leu Mec Vai Pr.e Thr Mec 150 155 ISC

Thr Leu Ile Leu Ile Leu Pro Thr Tyr Glu Leu 170 1-5

Leu Lys Glu Vai Lys lie Gly Ala Glu Arg Gly 185 190

Asn Tyr Lys Arg Vai Asn Asp Ile Tyr Glu Vai 200 205

Gly Vai Tyr Leu Phe Pro Ser Lys Gin Arg Thr 215 220 87 216 ΕΡ Ο 772 632/ΡΤ 38

Ser Ala Ile Thr Ser Thr Met Leu Pro Leu Ile Lys Ala Ile Leu Ile 225 230 235 240

Ser Cys Ile Ser Asn Lys Trp Gin Leu Ile Tyr Leu tLeu Tyr Leu Ile 245 250 255

Phe Glu Vai Ser Tyr Tyr Leu His Lys Lys vai Ile Asp eiu Ile Ala 260 265 270

Gly Gly Thr Asn Phe Vai Ser Arg Leu Vai Ala Ala Leu Ile Glu Vai 275 280 285

Asn Trp Ala Phe Asp Asn Glu Glu Vai Lys Gly Leu Lys Lys Phe Phe 290 295 300

Leu Leu Ser Ser Arg Vai Lys Glu Leu Ile Ile Lys His Lys Vai Arg 305 310 315 320

Asn Glu Vai Vai Vai Arg Trp Phe Gly Asp Glu Glu Ile Tyr Gly Met 325 330 335

Pro Lys Leu Ile Gly Leu Vai Lys Ala Ala Thr Leu Ser Arg Asn Lys 340 345 350

His Cys Met Leu Cvs Thr Vai Cys Glu Asp Ara Asp Trp Arg Gly Glu 355 360 365

Thr Cys Pro Lys Cys 370 Thr Leu Ala Asp Phe 385 Glu Asp Gin Ser Gly 405 Gin Tyr Lys Ala Arg

Gly Arg Phe Gly Pro Pro 375 Glu Glu Lys His Tyr Lys 390 395 Giv Pro Leu Arg Glu Glu 410 Gly Gin Leu Phe Leu Arg 420 425

Val Vai Cys Gly Met 380 Arg lie Phe Ile Arg 400 His Ala Gly Tyr Leu 415 Asn Leu Pro Val Leu 430

87 216 ΕΡ Ο 772 632/ΡΤ

Ala Thr Lys Vai Lys Met Leu Leu Vai Gly Asn Leu Gly Thr Glu Ile 435 440 44S

Gly Asp Leu Glu His Leu Gly Trp Vai Leu Arg Gly 9το Ala Vai Cys 450 455 460

Lys Lys Vai Thr Glu His Glu Arg Cys Thr Thr Ser Ile Met Asp Lys 465 470 475 480

Leu Thr Ala Phe Phe Gly Vai Met Pro Arg Gly Thr Thr Pro Arg Ala 485 490 495

Pro Vai Arg Phe Pro Thr Ser Leu Leu Lys Ile Arg Arg Gly Leu Glu 500 505 510

Thr Gly Trp Ala Tyr Thr His Gin Gly Gly Ile Ser Ser Vai Asp His 515 520 525

Vai Thr Cys Gly Lys Asp Leu Leu Vai Cys Asp Thr Met Gly Arg Thr 530 535 540

Arg Vai Vai Cys Gin Ser Asn Asn Lys Met Thr Asp Glu Ser Glu Tyr 545 550 555 560

y Vai Lys

Asp Ser Gly Cys Pro Glu Gly Ala Arg Cys Tyr Vai 565 57C 575

Phe Asn Pro Glu Ala Vai Asn Ile 580

His Leu Gin Lys Thr Gly Gly Glu 595 600

Thr Pro Ala Phe Phe Aso Leu Lys 610 615

Pro Ile Phe Glu Ala Ser Ser Gly 625 630

Ser Gly Thr Lys Gly Ala Met Vai 585 590 Phe Thr Cys Vai Thr Ala Ser Gly 605 Asn Leu Lys Gly Trp Ser Gly Leu 620 Arg Vai Vai Giv Arg Vai Lys Vai 635 640 87 216 ΕΡ Ο 772 632/ΡΤ 40

Gly Lys Asn Giu Asp Ser Lys Pro Thr 6.4 5 Thr Vai Ser Lys Ser Ala Thr Asp Leu 660 665 Thr Thr Met Asn Arg Cly Glu Phe Arg 675 680 Ala Gly Lys Thr Thr Glu Leu Pro Arg 690 695 Arg His Lys Arg Vai Leu Vai Leu lie 705 710 Ser Vai Tyr Gin Tyr Mec Arg Gin Lys 725 Leu Arg Ile Gly Glu Mec Lys Giu Gly 740 745 Tyr Ala Ser Tyr Gly Tyir Phe Cys Gin 755 760 Ala Ala Mec Vai Giu Tv_ Ser Phe lie 770 —-Ϊ s • 1 -» Ala Thr Pro Giu Gin Leu Ala Xle Mec 785 790 Glu Asn Leu Arg Vai Vai Ala Met Thr 905 Thr ΤΪ**" Thr Gly Gin Lys Hrs Pro lie 820 825 Vai Met Lys Giv Glu Asp Leu Giv Ser 835 840

Leu Met Ser Gly He Gin 6S5

Glu Mec. Vai Lys Lys Ile 670

Ile Thr Leu Ale Thr Cly 685

Vai Ile Glu Glu Ile Gly 700

Leu Arg Ala Ala Ala Glu 715 720

Pro Ser Ile Ala Phe Asn 735

Mec Ala Thr Gly Ile Thr 750

Ser Gin Pro Lys Leu Arg 765

Leu Asp Glu Tvr His Cys 7SG

Lys Ile Hrs Arg Phe Ser 795 300

Thr Pro Ala Gly Thr Vai 815

Giu Phe Ile Ala Pro Glu 830

Tyr Leu Asp Ile Ala Gly 845 07 216 ΕΡ 0 772 632/ΡΤ 41

Leu Lys Ile Pro Vai Glu Glu Met Lys Asn Asn Met Leu Vai Phe Vai 8S0 855 860

Pro Thr Arg Asn Met Ala Vai Glu Ala Ala Lys Lys Leu Lys Ala Lys 865 870 875 880

Gly Tyr Asn Ser Gly Tyr Tyr Tyr Ser Gly Glu Asp Pro Ser Asn Leu 885 890 895

Arg Vai Vai Thr Ser Gin Ser Pro Tyr Vai Vai Vai Ala Thr Asn Ala 900 905 910

Ile Glu Ser Gly Vai Thr Leu Pro Asp Leu Asp Vai Vai Vai Asp Thr 91S 920 92 S

Gly Leu Lys Cys Glu Lys Arg Ile Arg Leu Ser Pro Lys Met Pro Phe 930 935 940

Ile Vai Thr Gly Leu Lys Arg Met Ala Vai Thr Ile Gly Glu Gin Ala 945 950 955 960

Gin Arg Arg Gly Arg Vai Gly Arg Vai Lys Pro Gly Arg Tyr Tyr Arg 965 970 975

Ser Gin Glu Thr Pro Vai Gly Ser Lys Asp Tyr Hrs Tyr Asp Leu Leu 980 985 990

Gin Ala Gin A.rg Tyr Gly Ile Glu Asp Gly lie Asn lie Thr Lys Ser 995 1000 1005

Phe Arg Glu Met Asn Tyr Asp Trp Ser Leu Tyr Glu Glu Asp Ser Leu 1010 1015 1020

Met Ile Thr Gin Leu Glu Ile Leu Asn Asn Leu Leu Ile Ser Giu Glu 1025 1030 1035 1040 Leu Pro Met Ala Vai Lys Asn lie Met Ala Arg Thr Asp His Pro Glu 1045 1050 1055

87 216 ΕΡ Ο 772 632/ΡΤ

Pro Ile Gin Leu Ala Tyr Asn Ser Tyr Glu Thr Gin Vai Pro Vai Leu 1060 1065 1070

Phe Pro Lys Ile Arg Asn Gly Glu Vai Thr Asp Thr Tyr Asp Asn Tyr 1075 1080 1085

Thr Phe Leu Asn Ala Arg Lys Leu Gly Asp Asp Vai Pro Pro Tyr Vai 1090 1095 1100

Tyr Ala Thr Glu Asp Glu Asp Leu Ala Vai Glu Leu Leu Gly Leu Asp 1105 1110 1H5 1120

Trp Pro Asp Pro Gly Asn Gin Gly Thr Vai Glu Ala Gly Arg Ala Leu 1125 1130 1135

Lys Gin Vai Vai Gly Leu Ser Thr Ala Glu Asn Ala Leu Leu Vai Ala 1140 1145 1150

Leu Phe Gly Tyr Vai Gly Tyr Gin Ala Leu Ser Lys Arg His Ile Pro 1155 1160 H65

Leu Vai Thr Asp Ile Tyr Ser Vai Glu Asp His Arg.Leu Glu As? Thr 1170 1175 1180

Thr His Leu Glr. Tyr Ala Pro Asn Ala Ile Lys Thr Glu Gly Lys Glu 1185 1190 1195 1200

Thr Glu Leu Lys Glu Leu Ala Gin Gly Asp Vai Gin Arg 1205 1210 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 45 pares de bases (B) TIPO: ácidu nucleicu (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc 87 216 ΕΡ Ο 772 632/ΡΤ 43

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Vírus de febre suína clássica (B) ESTIRPE. Alfort (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..45 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.3:

TCA ACA GCA GAG AAC GCC CTG CTA GTC GCC C7G TTC GGC TAC GTG

Ser Thr Ala'-GIu Asn Ala Leu Leu Vai Ala Leu Phe Gly Tyr Vai 1215 1220 1225 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.4:

Ser Thr Ala Glu Asn Ala Leu Leu Vai Ala Leu Phe Gly Tyr Vai 1 5 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 5

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico

87 216 ΕΡ Ο 772 632/ΡΤ 44 (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Vírus de febre suína clássica (B) ESTIRPE. Alfort (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..27 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.5: GAG AAC GCC CTG CTA GTC GCC CTG TTC 27

Glu Asn Ala Leu Leu Vai Ala Leu Phe 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.6:

Glu Asn Ala Leu Leu Vai Ala Leu Phe 1 c 45 87 216 ΕΡ Ο 772 632/ΡΤ dUUi

Lisboa,

Por ΑΚΖΟ NOBEL N.V. - O AGENTE OFICIAL -

flng.° ANTÓNIO JOÃO I da cunha ferreirà I Ag. Of. Pr. lnd. I Rua da§ Fiéf®s> 74--4/ 120© I _______

Claims (4)

1. 87 21 G EP 0 772 632/PT 1/1 REIVINDICAÇÕES 1. Vacina para a protecção de suínos contra a febre suína clássica (CSF), caracterizada por compreender o polipéptido p10 do vírus CSF, ou uma sua parte imunogenicamente activa, juntamente com um transportador farmaceuticamente aceitável.
2. 2. Vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o polipéptido p10 ter a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:2.
3. 3. Vacina para protecção de suínos contra CSF, caracterizada por compreender um microorganismo recombinante que contém uma sequência de ADN que codifica para o polipéptido definido na reivindicação 1 ou 2, juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável.
4. 4. Vacina de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por o microorganismo recombinante ser um vírus vector recombinante, de preferência o vírus da pseudo-raiva recombinante.

   Por AKZO NOBEL N.V. - O AGENTE OFICIAL -

   Eng.° ANTÓNIO JOÃO DA CUNHA FERREIRA Ag. 0{. Pr. Ind. Dne /4a<* Cl AKAQ 74> .