WO2020091513A1 - Tlr 억제 펩타이드를 포함하는 루푸스 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Tlr 억제 펩타이드를 포함하는 루푸스 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2020091513A1
WO2020091513A1 PCT/KR2019/014728 KR2019014728W WO2020091513A1 WO 2020091513 A1 WO2020091513 A1 WO 2020091513A1 KR 2019014728 W KR2019014728 W KR 2019014728W WO 2020091513 A1 WO2020091513 A1 WO 2020091513A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tip1
seq
peptide
lupus
lps
Prior art date
Application number
PCT/KR2019/014728
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
최상돈
권혁권
신현준
계향애
서창희
Original Assignee
주식회사 젠센
아주대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 젠센, 아주대학교 산학협력단 filed Critical 주식회사 젠센
Publication of WO2020091513A1 publication Critical patent/WO2020091513A1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/07—Tetrapeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/1013—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing O or S as heteroatoms, e.g. Cys, Ser
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22

Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing or treating lupus, comprising a peptide that inhibits a TLR (Toll-like receptor) signaling pathway.
  • TLR Toll-like receptor
  • Pattern recognition receptors such as toll-like receptors, are pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) or risk-associated molecular patterns (dangers). -associated molecular pattern (DAMP).
  • PAMPs pathogen-associated molecular patterns
  • DAMP risk-associated molecular pattern
  • TLRs play an important role in the innate immune response, and extracellular TLRs acting on the plasma membrane, including TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6 and TLR11, and cells such as endosomes including TLR3, TLR7, TLR8 and TLR9 It can be divided into intracellular TLRs that function within. Structurally, the TLR has a leucine-rich repeat (RRR) site recognized by a ligand or accessory molecule at the N-terminus of the extracellular domain, and signals to the C-terminus of the intracellular part. It has a Toll / interleukin 1 receptor (TIR) domain.
  • RRR leucine-rich repeat
  • TIR Toll / interleukin 1 receptor
  • TLR4 is the first identified receptor in the TLR family, which activates innate immune signals that are amplified through the myDoid (myeloid differentiation 88) -dependent signaling pathway and MyD88-independent signaling pathway.
  • TLR3 only activates the MyD88-independent signaling pathway. Due to this role of TLR, interest in research to utilize TLR as a target for treating various immune diseases is increasing.
  • TLR4 The MyD88-dependent signaling of TLR4 is initiated by LPS recognition through accessory molecules such as clusters of differentiation 14 (CDA14) and myeloid differentiation factor 2 (MD2). After LPS binding, TLR4 forms a dimer, and the TIR domain of TLR4 and the TIR domain of TIR domain adapter protein (TIRAP or MyD88 adapter-like, MAL) bind together and form a complex with MyD88 Thereby activating the signaling pathway. Activated TLR4 induces the initial activation of NF- ⁇ B, transfer to the nucleus, and activation of MAPK through the Myd88-dependent signaling process.
  • CDA14 clusters of differentiation 14
  • MD2 myeloid differentiation factor 2
  • TLR4 and TLR3 Activation of the NF- ⁇ B and MAPK secretes inflammatory cytokines such as tumor necrosis factor ⁇ (TNF- ⁇ ), interleukin 1 ⁇ (IL-1 ⁇ ) and IL-6.
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor ⁇
  • IL-1 ⁇ interleukin 1 ⁇
  • IL-6 interleukin 1 ⁇
  • TLR4 and TLR3 The MyD88-independent signaling process of TLR4 and TLR3 is initiated by binding between the TIR domain of each TLR and the TIR domain of the TIR domain-containing adapter-inducing interferon- ⁇ (TRIF) -related adaptor molecule (TRAM) complex of TRAM / TRIF. And secretes type 1 interferon by activation of an interferon-regulatory factor (IRF).
  • IRF interferon-regulatory factor
  • TLR4 activity produces oxidative stress substances such as NO and ROS in macrophages.
  • TLRs may be targets for treating various diseases such as autoimmune diseases, inflammatory diseases, and cancers, and thus, research on substances targeting TLRs and medical compositions for treating diseases related to TLRs has been conducted.
  • TLR4 accelerators and antagonists have been obtained by modifying the major skeletal structure of lipid A, and eritoran, lipid A and Rhodobacter sphaeroids lipid A (RsLA) interact with LPS and MD2. And inhibited LPS-induced shock in rats.
  • RsLA Rhodobacter sphaeroids lipid A
  • PAMPs pathogen-associated molecular patterns
  • Lupus is a systemic autoimmune disease involving several organs, characterized by tissue damage caused by the formation of various autoantibodies and immune complexes. Skeletal system and skin symptoms are the most common, but a wide variety of clinical findings can occur in various organs of the body, such as the skin, joints, blood, and kidneys, during the early or course of the disease. : Vol. 78, No. 4, 2010). There are several types of lupus. The most common type is Systemic lupus erythematosus (SLE), which affects many parts of the body.
  • SLE Systemic lupus erythematosus
  • discoid lupus erythematosus which causes skin rash that does not go away
  • subacute skin erythema lupus which causes skin ulcers on body parts exposed to the sun
  • drug-induced drug-induced lupus and newborns with rare but newborn babies Lupus and others.
  • the present inventors are SLE mice treated with a novel peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (decoy peptide 1) and a fusion peptide (Toll-like receptor inhibitory peptide 1, TIP1) in which the new peptide is linked to the N-terminus of the cell permeable peptide.
  • decoy peptide 1 decoy peptide 1
  • TIP1 fusion peptide
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating lupus comprising a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 as an active ingredient.
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating lupus comprising an fusion peptide linked to a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 at the N-terminus of a cell permeable peptide as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating lupus comprising; administering a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 to an individual in need thereof.
  • Another object of the present invention is to provide the use of a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 for the prevention or treatment of lupus.
  • Another object of the present invention is to provide the use of a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 for preparing a composition for preventing or treating lupus.
  • another object of the present invention is the step of administering a fusion peptide linked to a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 to the N-terminus of a cell permeable peptide to an individual in need thereof; prevention of lupus comprising Or to provide a method of treatment.
  • Another object of the present invention is to provide a use of a fusion peptide in which a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 is linked to the N-terminus of a cell permeable peptide for the prevention or treatment of lupus.
  • Another object of the present invention is to provide a use of a fusion peptide in which a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 is connected to the N-terminus of a cell permeable peptide for preparing a composition for preventing or treating lupus.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating lupus comprising a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating lupus comprising an fusion peptide comprising a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 connected to the N-terminus of a cell permeable peptide as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preventing or treating lupus comprising the step of administering a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 to an individual in need thereof.
  • the present invention provides the use of a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 for the prevention or treatment of lupus.
  • the present invention provides the use of a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 for preparing a composition for preventing or treating lupus.
  • the present invention comprises the steps of administering a fusion peptide linked to a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 to the N-terminus of a cell permeable peptide to an individual in need thereof.
  • the present invention provides the use of a fusion peptide in which a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 is linked to the N-terminus of a cell permeable peptide for the prevention or treatment of lupus.
  • the present invention provides the use of a fusion peptide in which a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 is connected to the N-terminus of a cell permeable peptide for preparing a composition for preventing or treating lupus.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention effectively regulates SLE symptom-related factors, such as inhibiting lymphocyte proliferation (lymphoproliferation) in the SLE mouse model, reducing albumin content in urine, and producing less anti-dsDNA antibodies and anti-nuclear antibodies. Therefore, it is useful for preventing or treating lupus.
  • SLE symptom-related factors such as inhibiting lymphocyte proliferation (lymphoproliferation) in the SLE mouse model, reducing albumin content in urine, and producing less anti-dsDNA antibodies and anti-nuclear antibodies. Therefore, it is useful for preventing or treating lupus.
  • FIG. 1 shows that HEK-Blue TM hTLR4 (human TLR4) cells have different concentrations of TIPs (TIP1, TIP2; TIP2 is used for control), and when treated with LPS, secreted alkaline phosphatase (SEAP) activity is obtained. It is a diagram showing the decrease by TIP1.
  • Figure 1 (b) is a diagram showing the results of measuring the SEAP activity of TIP1 (TIP1 W / O CPP) and TIP2 (TIP2 W / O CPP) to which the CPP sequence is not linked.
  • FIG. 2 (a) is a diagram showing the results of confirming NF- ⁇ B (p65) and IRF3 activity through Western blotting when TIP1 is treated with LPS on RAW 264.7 cells, which are rat macrophages.
  • Figure 2 (b) is a diagram showing the results of confirming the MAPK activity through the Western blotting under the same conditions.
  • Figure 3 shows the results of confirming the activity (p-p65) of NF- ⁇ B by confocal microscopy when TIP1 was treated with LPS on RAW 264.7 cells, rat macrophages, by TIP1. It is a diagram showing that the movement in the nucleus is blocked.
  • FIG. 4 is a diagram showing the result of confirming the cytokine secretion amount when TIP1 having different concentrations in rat macrophage RAW 264.7 cells was treated with LPS.
  • FIG. 4 (a) shows TNF- ⁇
  • FIG. 4 (c) shows IFN- ⁇ secretion, respectively.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of confirming the amount of NO and ROS generation when TIP1 is treated with LPS on RAW 264.7 cells, which are rat macrophages.
  • FIG. 5 (a) shows the amount of NO generated in the cytoplasm
  • FIG. 5 (b) shows the amount of ROS in the cytoplasm
  • FIG. 5 (c) shows the amount of NO released outside the cell.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of confirming cytokine and NO generation when TIP1 was treated with LPS on mouse bone marrow-derived macrophage mBMDM (mouse bone marrow derived macrophage) cells.
  • FIG. 6 (a) shows TNF- ⁇
  • FIG. 6 (d) shows IFN- ⁇ generation.
  • FIG. 7 shows p-ERK, ERK, p-JNK, JNK, pp38, p38, p-p65 and I ⁇ in cells when TIP1 is treated with LPS on human peripheral blood mononuclear cells (hPBMCs). It is a diagram showing that the expression level of -B ⁇ is inhibited by TIP1 as a result of Western blotting.
  • TLR8 is a mouse macrophage RAW 264.7 cells TIP1 to each TLR ligand corresponding to PAM 3 CSK 4 (TLR1 / 2), FSL-1 (TLR2 / 6), Poly (I: C) (TLR3), When treated with R848 (TLR7 / 8) or CpG-ODN (TLR9), this is a measure of the amount of TNF- ⁇ secretion in cells, showing that it is inhibited by TIP1.
  • FIG. 9 is a diagram showing that TIP1 is reduced by TIP1 as a result of confirming the secretion of IFN- ⁇ through ELISA when TIP1 is treated with Poly (I: C) in RAW 264.7 cells, which are rat macrophages.
  • FIG. 10 (a) shows that the molecules involved in the formation of NLRP3 (NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 3) -mediated inflamasome (inflammasome, inflammatory regulatory complex) induced by treatment with LPS and ATP are inhibited by TIP1.
  • NACHT NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 3
  • inflamasome inflammasome, inflammatory regulatory complex
  • FIG. 10 (b) is a diagram showing the results of the experiments under the same conditions in mBMDM cells.
  • FIG. 11 (a) is a diagram confirming in THP1 cells that IL-1 ⁇ secretion is inhibited when TIP1 is treated in the NLRP3-mediated inflammasome state induced by treatment of LPS and ATP.
  • FIG. 11 (b) is a diagram showing the results of the experiments performed under the same conditions in mBMDM cells.
  • FIG. 12 is a diagram showing the results of confirming the NF- ⁇ B activity and NO secretion of the peptide having the amino acid sequence of all or part of TIP1.
  • FIG. 12 (a) shows SEAP activity
  • FIG. 12 (b) shows NO secretion.
  • FIG. 13 shows the treatment between TIP1 (green) and TLR4 (red) and MyD88 (blue) when treated with TIP1 (TIP1-FITC) or TIP1-FITC combined with fluorescein isothiocyanate (FITC) in human monocyte THP1 cells.
  • TIP1 green
  • TLR4 red
  • MyD88 blue
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • FIG. 14 is a view showing the results of confirming the cytokine secretion amount through blood collected 1 hour or 2 hours after treatment with PBS (phosphate buffered saline) and LPS or TIP1 and LPS in C57BL / 6J mice.
  • 14 (a) shows TNF- ⁇
  • FIG. 14 (b) shows IL-12p40
  • FIG. 14 (c) shows IL-6 secretion, respectively.
  • FIG. 15 is a diagram showing the results of confirming the amount of cytokine secretion in liver tissue of rats when PBS and LPS or TIP1 and LPS were treated together in C57BL / 6J mice.
  • FIG. 15 (a) shows the result of confirming the secretion amount of TNF- ⁇ and IL-6 through Western blotting
  • FIG. 15 (b) shows the graph by quantifying the band intensity according to the Westin blotting. .
  • FIG. 16 is a diagram showing the results of confirming the effect of TIP1 on kidney and liver damage through blood collected after 24 hours when PBS and LPS or TIP1 and LPS were treated together in C57BL / 6J mice.
  • 16 (a) and (b) show the secretion amounts of TNF- ⁇ and IL-6, respectively.
  • 16 (c) and (d) show the secretion amounts of kidney damage markers BUN (blood urea nitrogen) and creatinine (Cr), respectively.
  • 16 (e) and (f) are diagrams showing secretion amounts of liver damage markers AST (aspartate aminotransferase) and ALT (alanine aminotransferase).
  • FIG. 17 shows TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end) using kidney tissue collected after 24 hours of the effect of TIP1 on kidney apoptosis when C57BL / 6J mice were treated with PBS and LPS or TIP1 and LPS.
  • TUNEL terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end
  • FIG. 18 is a diagram showing that the survival rate of LPS-induced sepsis model rats is increased when LPS or TIP1 and LPS are treated in BALB / c rats.
  • FIG. 19 (a) is a diagram showing an experimental scheme for confirming the therapeutic effect of TIP1 on rheumatoid arthritis using a CIA (collagen-induced arthritis) model of DAB-1J mice.
  • FIG. 19 (b) is a diagram visually observing the treatment effect when TIP1 was treated and showing that rheumatoid arthritis is being treated.
  • FIG. 20 is a diagram showing the results of confirming the treatment effect when treated with TIP1 in the CIA rheumatoid arthritis model of DAB-1J rats.
  • Fig. 20 (a) shows weight
  • Fig. 20 (d) shows arthritis index Each is shown.
  • FIG. 21 shows the treatment of arthritis by measuring 3D image and bone mineral density (BMD) using micro-computed tomography (Micro-CT) after TIP1 treatment on the CIA model of DAB-1J mice. to be.
  • BMD 3D image and bone mineral density
  • Micro-CT micro-computed tomography
  • TAB1 treated with CIA model of DAB-1J mice, and the knee joint site was stained with hematoxylin and eosin (H & E) staining to compare the treatment with prednisone, a conventional treatment, and TIP. It is a diagram showing the excellent therapeutic effect of.
  • FIG. 23 is a diagram schematically showing a signal transduction process induced by TLR4 and a region controlled by TIP1.
  • FIG. 24 is a photograph comparing the sizes of spleen, kidney, and lymph nodes in wild-type mice (C57BL / 6), vehicle-treated SLE mouse model, and TIP1-treated SLE mouse model, respectively.
  • 25A is a graph measuring the concentration of anti-dsDNA antibody in serum isolated from the SLE mouse model.
  • 25B is a graph measuring the concentration of antinuclear antibody (ANA) in serum isolated from wild-type mice and SLE mouse models.
  • ANA antinuclear antibody
  • 25C is a graph measuring the concentration of C3 complement in serum isolated from wild-type and SLE mouse models.
  • 25D is a graph measuring albumin concentration in urine isolated from wild-type and SLE mouse models.
  • the present invention provides a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • peptide refers to a linear molecule formed by amino acid residues being bonded to each other by peptide bonds.
  • the peptide may be prepared according to a chemical synthesis method known in the art, and preferably may be prepared according to a solid phase synthesis technique, but is not limited thereto.
  • TLR4 is a protein belonging to the family of toll-like receptors (TLLs), a family of transmembrane proteins that function as a monitor for pathogen infection, a protein encoded by the TLR4 gene. It is also called CD284 (cluster of differentiation 284).
  • TLR4 recognizes various pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), including LPS of Gram-negative bacteria, which is very important for the activation of the innate immune system.
  • PAMPs pathogen-associated molecular patterns
  • TLR3 is a protein belonging to the TLRs, a family of transmembrane protein that functions as a monitor for pathogen infection, and refers to a protein encoded by the TLR3 gene, named CD283 (cluster of differentiation 283) It also becomes.
  • CD283 cluster of differentiation 283
  • the TLR3 recognizes a variety of PAMPs, including viral double-strand RNA (dsRNA), which is very important for the activation of the innate immune system.
  • dsRNA viral double-strand RNA
  • NLRP3 inflammasome is a receptor and sensor of the intrinsic immune system that regulates the activation of caspase-1, and is a type of inflammasome that induces inflammation in response to microbial infection and the like. It is activated by reaction. NLRP3 requires priming, for example, the binding of LPS to TLR4. The TLR4 signaling pathway by LPS promotes NLRP3 inflammasome formation along with ATP. NLRP3 inflammasome, when activated abnormally, induces the development of various inflammatory diseases, particularly degenerative neurological diseases.
  • beta amyloid (amyloid ⁇ ), which is one of the main causes of Alzheimer's disease, and NLRP3 inflammasomes, and a relationship with Parkinson's disease was also reported.
  • TLR4 mediated signaling pathway refers to a signaling pathway through TLR4, which may be an LPS response dependent on the TLR4 / MD2 complex formed by TLR4 and MD2, through which the signal is transmitted. do. TLR4 is signaled by several adapter proteins, and works through Mal (also referred to as TIRAP) and MyD88 and TRAM and TRIF. Activated TLR4 activates NF- ⁇ B through the Myd88-dependent signaling process, moves to the nucleus, and induces the activation of MAPK.
  • inflammatory cytokines such as TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ and IL-6 are secreted, and nitrogen monoxide (hereinafter referred to as NO) and free radicals (hereinafter referred to as ROS) in macrophages. Oxidative stress).
  • NO nitrogen monoxide
  • ROS free radicals
  • MyD88-independent signaling process is induced by the activation of tram / TRIF, interferon-regulator (IRF) and NF- ⁇ B to secrete type 1 interferon.
  • TIR domain is a domain for intracellular signaling, which has three highly conserved regions and mediates the interaction between TLR and other signaling molecules.
  • the activated TIR domain induces the binding of MyD88 and activates the TLR signaling pathway.
  • the term “inhibition” refers to a phenomenon in which biological activity or signal activity is lowered due to deficiency, mismatch, and many other causes, partially or completely blocking, reducing, preventing, or activating TLR activity. It may be delayed, inactivated, or down-regulated.
  • the peptide or fusion peptide according to the present invention provides TLR4 and TLR3 signaling pathways and NLRP3 inflammasome inhibition. It also provides for partial inhibition of TLR1 / 2, TLR2 / 6, TLR7, TLR8 and TLR9.
  • the SHCR sequence of the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is characterized by specifically binding to the TIR (Toll / interleukin-1 receptor) domain of the Toll-like receptor (TLR). can do.
  • the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 according to the present invention has sequence specificity.
  • the present inventors searched the minimum amino acid region of TIP1 that binds the TIR domain of TLR4 and investigated whether this region can effectively inhibit the signaling pathway of TLR4.
  • a decoy peptide is selected from the TIR domain of TIRAP and SHCR (decoy peptide 1-2, SEQ ID NO: 2) and VLLI (decoy peptide 1-3, using amino acid sequence SHCRVLLI) SEQ ID NO: 7)
  • SHCR decoy peptide 1-2, SEQ ID NO: 2
  • VLLI decoy peptide 1-3, using amino acid sequence SHCRVLLI
  • the present invention provides a fusion peptide in which a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 is linked to the N-terminus of the cell permeable peptide.
  • the fusion peptide is capable of inhibiting a signaling pathway mediated by a toll-like receptor (TLR), and the toll-like receptor (TLL) is a toll-like receptor 1/2 (TLR1 / 2).
  • TLR2 / 6 Toll-like receptor 2
  • TLR3 Toll-like receptor 3
  • TLR4 Toll-like receptor 4
  • TLR7 Toll-like receptor 7
  • TLR8 Toll-like receptor 8
  • It may be any one selected from the group consisting of TLR9 (Toll-like receptor 9), preferably TLR4 (Toll-like receptor 4) or TLR3 (Toll-like receptor 3), more preferably TLR4 ( Toll-like receptor 4).
  • the expression of TNF- ⁇ , IL-6 or IFN- ⁇ is inhibited by blocking the TLR signaling pathway of the fusion peptide; Suppression of NO or ROS secretion;
  • the activity of NF- ⁇ B, MAPK or NLRP3 inflammasomes may be inhibited, and the fusion peptide may be characterized by inhibiting both MyD88-dependent and MyD88-independent TLR4 signaling pathways.
  • cell penetrating peptide is a kind of signal peptide (Signal Peptide), a kind of specific amino acid sequence used for the purpose of delivering a polymer material such as protein, DNA, RNA into the cell It is a combination peptide. To date, it has been used for intracellular delivery of various low-molecular compounds, proteins, peptides, RNA, DNA, and other high-molecular substances.
  • the fusion peptide of the present invention uses a cell-permeable peptide, and the cell-permeable peptide is not particularly limited as long as it has a feature that enters the cell by a mechanism of cell internalization (endocytosis), but is preferably cell permeability listed in Table 1 below. Peptides or variants thereof can be used.
  • Transportan includes those used in the form of the following variants: AGYLLGKINLKALAALAKKIL-NH 2 (TP10, PepFect 3, SEQ ID NO: 13), AGYLLGKINLKALAALAKKIL-NH 2 (TP10, PepFect 6, SEQ ID NO: No.
  • amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 37 in Table 1
  • r means d -Arginine
  • the 2nd and 6th amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37 correspond to this.
  • SEQ ID NO: 41 and 42 of Table 1 constitute one peptide (TATp-D) forming a side chain to each other
  • the 14th Lys residue (K) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41 is within the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42. It is characterized by forming a side chain in connection with the 13th Gln residue (Q).
  • r means d -Arginine
  • k means d- Lysine
  • 8th amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43 corresponds to this.
  • the SEQ ID NO: 43 is characterized by being a cyclic peptide.
  • an experiment was performed by selecting the Penetratin sequence (RQIKIWFQNRRMKWKK, SEQ ID NO: 9) among the cell permeable peptides in Table 1, and other cell permeable peptides other than the cell permeable peptides actually used were fused with the peptides of the present invention. It will be apparent to those skilled in the art that similar effects to the present invention are exhibited even in the case of prescribing.
  • the fusion peptide in which the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 is connected to the N-terminus of the cell permeable peptide is preferably composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 can do.
  • variants of the amino acid sequence may also be included within the scope of the present invention, specifically, the variants are SEQ ID NO: 3 or 4 and 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and more
  • all peptides having a sequence homology of 95% or more, even more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more may be included.
  • the term "homology" refers to the degree of similarity between wild type amino acid sequences and wild type nucleic acid sequences.
  • the fusion peptide according to the present invention is a cytokine (IL-6, TNF- ⁇ , IFN- ⁇ ) by inhibiting the TLR4 signaling pathway induced by lipopolysaccharide (LPS), Inhibition of NO and ROS secretion and activation of NF- ⁇ B and MAPK, as well as renal and liver damage caused by TLR4 hyperactivity in animals, relief of sepsis and rheumatoid arthritis and TLR3 signaling induced by Poly (I: C)
  • LPS lipopolysaccharide
  • I TLR3 signaling induced by Poly
  • the effect of inhibiting the formation of NLRP3 inflammasomes induced by pathways and LPS / ATP is excellent.
  • Preventing and treating autoimmune diseases, inflammatory diseases or degenerative neurological diseases caused by NLRP3 inflammasomes caused by the signaling pathway It can be useful to do.
  • the fusion peptide according to the present invention can be used as TLR4, TLR3 and NLRP3 inflammasome inhibitors.
  • inhibitor refers to a molecule that, by any mechanism, partially or completely inhibits the influence of other molecules, such as receptors or intracellular mediators.
  • TLR4, TLR3 and NLRP3 inflammasome inhibitor refers to a substance capable of directly, indirectly or substantially impeding, reducing or inhibiting the biological activity of TLR4, TLR3 and NLRP3 inflammasomes, preferably Peptide reactive with TLR4 and TLR3 binds directly to the TIR domains of TLR4 and TLR3 and blocks the TLR4 and TLR3 signaling pathways by neutralizing the activity of TLR4 and TLR3, thereby NF- ⁇ B and MAPK and NLRP3 inflammasome activation It refers to substances that can reduce the secretion of inflammatory cytokines, NO and ROS by causing a decrease.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of lupus comprising a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of lupus comprising a fusion peptide linked to a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 to the N-terminus of a cell permeable peptide as an active ingredient.
  • the fusion peptide may be preferably made of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4, and variants of the amino acid sequence may also be included within the scope of the present invention.
  • the lupus may be systemic lupus erythematosus (SLE), discoid erythema lupus, subacute cutaneous lupus, drug-induced lupus, neonatal lupus.
  • SLE systemic lupus erythematosus
  • discoid erythema lupus subacute cutaneous lupus
  • drug-induced lupus neonatal lupus.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain a pharmaceutically effective amount of the peptide alone or may include one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents.
  • the pharmaceutically effective amount in the above refers to an amount sufficient to prevent, ameliorate and treat lupus symptoms.
  • pharmaceutically acceptable refers to a composition that is physiologically acceptable and does not cause an allergic reaction such as gastrointestinal disorder, dizziness or similar reaction when administered to humans.
  • carrier, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, Polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers and preservatives may be further included.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal.
  • the formulation may be in the form of a powder, granule, tablet, emulsion, syrup, aerosol, soft or hard gelatin capsule, sterile injectable solution, sterile powder.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered through various routes including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous, or intramuscular, and the dosage of the active ingredient may be administered in various ways, such as the route of administration, patient's age, gender, weight, and severity of the patient It may be appropriately selected depending on factors, and may be administered in combination with a known compound having an effect of preventing, improving or treating symptoms of lupus.
  • the present invention provides a method for preventing or treating lupus comprising the step of administering a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 to an individual in need thereof.
  • the present invention provides the use of a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 for the prevention or treatment of lupus.
  • the present invention provides the use of a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 for preparing a composition for preventing or treating lupus.
  • the present invention comprises the steps of administering a fusion peptide linked to a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 to the N-terminus of a cell permeable peptide to an individual in need thereof.
  • the individual is a mammal, including a human.
  • the present invention provides the use of a fusion peptide in which a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 is linked to the N-terminus of a cell permeable peptide for the prevention or treatment of lupus.
  • the present invention provides the use of a fusion peptide in which a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 is connected to the N-terminus of a cell permeable peptide for preparing a composition for preventing or treating lupus.
  • the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 of the present invention can be simultaneously / sequentially treated in combination with other drugs or treatments for the treatment of lupus.
  • the present inventors selected two sequences (Decoy peptide 1, 2) from the TIR domain of TIRAP to select a peptide that specifically binds to the TIR domain of TLR4, and derived from the Drosophila antennapedia homeodomain at the N-terminus of the sequence.
  • Cell-permeable peptides Cell-Penetrating Peptides, CPP
  • the sequences of all the peptides used in this example are shown in Table 2 below.
  • HEK-Blue TM -hTLR4 cells (InvivoGen, San Diego, CA, USA) with 1% penicillin / streptomycin, 10% fetal bovine serum (FBS) (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) and 0.2% Normocin (InvivoGen) was added and cultured in DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) (Thermo Fisher Scientific Inc.) medium.
  • Rat macrophage RAW 264.7 cells were added to low-glucose DMEM (DMEM) with 1% penicillin / streptomycin and 10% FBS (Thermo Fisher Scientific, Inc.). And cultured.
  • Human monocyte cells THP1 cells, were cultured in RPMI 1640 with 1% penicillin / streptomycin and 10% FBS (Thermo Fisher Scientific, Inc.), followed by 10 nM of phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) ( Sigma-Aldrich Co. LLC., St. Louis, MO, USA) was used to differentiate into macrophages for 24 hours.
  • PMA phorbol 12-myristate 13-acetate
  • Human peripheral blood mononuclear cells hPBMC cells (PromoCell, Heidelberg, Germany) were cultured in RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific Inc.) with 2.05 mM L-glutamine, 1% penicillin / streptomycin and 10% FBS.
  • DMEM Thermo Fisher Scientific Inc.
  • PAM 3 CSK 4 Poly (I: C), R848 and CpG-ODN from Thermo Fisher Scientific, Inc.
  • FSL-1 from InvivoGen
  • LPS Escherichia coli 0111: B4
  • ATP Sigma-Aldrich Co.
  • HEK-Blue TM -hTLR4 cells are dispensed into 96-well plates (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) to a cell number of 5 x 10 4 cells / well, and RAW264.7 cells are 2 x 10 5 cells / well The cells were dispensed to the number of cells and cultured overnight. Thereafter, MTT analysis was performed using a 1- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -3,5-diphenylformazan (MTT) solution (Sigma-Aldrich Co. LLC).
  • MTT 1- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -3,5-diphenylformazan
  • HEK-Blue TM -hTLR4 cells were dispensed into a 24-well plate (BD Biosciences) to a cell number of 2 x 10 5 cells / well and incubated overnight. The next day, after removing the culture medium and replacing the medium, a portion of the culture medium (200 ⁇ l) was transferred to a microcentrifuge tube and heated at 65 ° C. for 10 minutes using a heating block (FINEPCR. Co., Seoul, Korea). .
  • the culture was then transferred to a 96-well plate (BD Biosciences) and the absorbance was measured at 405 nm using a HEK-Blue TM detection kit (InvivoGen) and a microplate reader spectrophotometer (Molecular Devices Inc., Silicon Valley, CA, USA). SEAP (Secreted Alkaline phosphatase) expression was analyzed.
  • a pre-protein extraction solution (M-PER, Thermo Fisher Scientific Inc.) was mixed with a protease and phosphatase inhibitory mixture and added to RAW 264.7 cells or hPBMC cell pellets. After cooling the pellets for 10 minutes, the lysate was centrifuged at 16000 X g for 10 minutes. Then, the NE-PER nuclear and cytoplasmic extraction reagent (Thermo Fisher Scientific Inc.) was used to extract the cytoplasmic and nuclear proteins, respectively, and the concentration of the protein was measured using a BCA kit (Sigma-Alderich Co. LLC). Did.
  • the primary antibodies were p-p65, p-JNK, p-IRF3, ERK, p38 and human IL-1 ⁇ (Cell Signaling Technology) Inc., Danvers, MA, USA); p-ERK, p-p38, I ⁇ -B ⁇ , JNK, ATF3, COX2, caspase-1 and ⁇ -actin (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA); iNOS (BD Biosciences); IL-6 and mouse IL-1 ⁇ (R & D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA); TNF- ⁇ (Thermo Fisher Scientific, Inc.); NLRP3 (Adipogen, San Diego, CA, USA) Antibody).
  • the membrane was incubated with an anti-rat / rabbit HRP-conjugated secondary antibody (Thermo Fisher Scientific Inc.) for 2 hours, and SuperSignal West Pico ECL solution (Thermo Fisher Scientific Inc. .) And the detected protein was visualized using Fuji LAS-3000 system (Fujifilm, Tokyo, Japan).
  • RAW 264.7 cells and THP1 cells were aliquoted into 24-well plates to a cell count of 2 x 10 5 cells / well and grown in an incubator overnight. After 24 hours after treatment with TIP1 and LPS, the RAW 264.7 cells and THP1 cells were fixed with 3.7% formaldehyde (Sigma-Aldrich Co. LLC) for 15 minutes, and 0.2% Triton X-100 (AMRESCO) for 15 minutes. , Solon, OH, USA), washed 3 times with PBS and blocked with 2% BSA solution.
  • the blocked cells were TIP1-FITC (25 ⁇ M; Peptron, Inc., Daejeon, Korea), p-p65, TLR4, Myd88, TOM20 (1: 1000; Santa Cruz Biotechnology Inc.) and NLRP3 (Adipogen) antibodies and 2 After incubation for an hour, washed three times with PBS. The cells were then incubated for 1 hour with AlexaFluor 408 and / or 488 and / or 546-conjugated secondary antibody (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and washed 3 times with PBS.
  • AlexaFluor 408 and / or 488 and / or 546-conjugated secondary antibody Invitrogen, Carlsbad, CA, USA
  • RAW 264.7 cells, THP1 cells, and mBMDM cells were dispensed to a cell number of 2 x 10 5 cells / well in a 96-well plate or to a cell number of 5 x 10 5 cells / well in a 24-well plate and cultured overnight. .
  • the amount of IFN- ⁇ , IL-6 and TNF- ⁇ secretion was LEGEND MAX TM Mouse IL-6 pre-coated ELISA kit (BIoLegend), Mouse IL-6 Platinum ELISA (eBiosciences) And Mouse TNF alpha ELISA Ready SET-Go! It was measured using a kit (eBiosciences). Absorbance at 450 nm was measured using a microplate reader spectrophotometer (Molecular Devices) and the results were analyzed using Softmax Pro 5.3 software (Molecular Devices Inc.).
  • RAW 264.7 cells were dispensed in a 6-cm dish (SPL Life Sciences., Pochun, Korea) to a cell number of 1 x 10 6 cells / well and cultured overnight. Thereafter, TIP1 was treated and stained with DAF-FM and DCF-DA (Thermo Fisher Scientific, Inc.), respectively, and then incubated for 1 hour. Thereafter, centrifugation was performed at 200 X g / min for 5 minutes, and the mixture was transferred to a brown tube and stored in PBS at a temperature of 4 ° C. The intensity of DAF-FM and DCF-DA fluorescent materials was measured and quantified using FACSAria III with Diva software (BD Biosciences).
  • the NO value of the culture supernatant was detected in the NO detection kit (iNtRON Biotechnology Inc. , Seongnam, Korea). Absorbance was measured at 550 nm using a microplate reader spectrophotometer (Molecular Devices In.), And the results were analyzed using Softmax Pro 5.3 software (Molecular Devices Inc.).
  • Example 1-1 To confirm the TLR4-binding affinity of the TIPs (TIP1, TIP2) prepared in Example 1-1, the activity of NF- ⁇ B in HEK-Blue TM -hTLR4 cells cultured in Example 1-2 was measured.
  • the IL-12 p40 minimal promoter IL-12 p40 is a TLR4 stimulator
  • NF- ⁇ B and AP-1 activator protein 1
  • SEAP Inducible secreted embryonic alkaline phosphatase
  • TIP or CPP-unconnected TIP TIP W / O CPP
  • concentration of TIP or CPP-unconnected TIP TIP W / O CPP
  • concentration of TIP or CPP-unconnected TIP TIP W / O CPP
  • the TIP1 of the present invention once translocated into the cell as it is connected to the CPP, interferes with downstream adapter molecules of the signaling pathway and blocks the activation of the TLR4-mediated signaling pathway induced by LPS, thereby effectively blocking TLR4. It was confirmed that it can be used as an inhibitor.
  • the TLR4-mediated response induced by LPS induces a direct interaction between the TIR domain of TIRAP and MyD88 to activate the MyD88-dependent signaling pathway. It also induces the interaction between the TIR domain of TRAM and TRIF to activate the MyD88-independent signaling pathway.
  • the initial activity of NF- ⁇ B induces secretion of pro-inflammatory cytokines such as tumor necrosis factor alpha (TNF- ⁇ ) and interleukin 6 (IL-6).
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor alpha
  • IL-6 interleukin 6
  • the MyD88-independent signaling pathway induces late secretion responses of type I interferons (IFNs) such as IFN- ⁇ and IFN- ⁇ , as well as the activity of IRF3 and 7.
  • IFNs type I interferons
  • TIP1 inhibits MyD88-dependent signaling pathway as well as MyD88-dependent signaling pathway induced by LPS by binding to TIR domain of TLR4.
  • TNF- ⁇ , IL-6, and IFN- ⁇ levels of the culture supernatant of RAW 264.7 cells according to the method described in Example 2-5 are rat TNF- ⁇ , IL-6, and IFN- ⁇ ELISA kit Ready-SET-Go ! It measured using, and the results are shown in Figure 4.
  • TIP1 As shown in FIG. 4, when TIP1 and LPS were treated together, it was confirmed that secretion of TNF- ⁇ , IL-6, and IFN- ⁇ was decreased in a concentration-dependent manner. Through this, it was confirmed that TIP1 according to the present invention inhibits the secretion of cytokines induced by LPS.
  • TIP1 was treated with RAW 264.7 cells to determine the effect of TIP1 on the generation of NO and reactive oxygen species (ROS) in the cytoplasm, and DAF-FM (Invitrogen Corp., CA, respectively) , USA) and DCF-DA (Invitrogen Corp.) to quantify cytoplasmic NO and ROS, respectively.
  • ROS reactive oxygen species
  • Example 2-7 the NO value of the culture supernatant of RAW 264.7 cells was measured using the NO detection kit. The results are shown in FIG. 5.
  • TIP1 effectively reduces the amount of NO and ROS in the cytoplasm as well as the secretion of extracellular NO.
  • TIP1 according to the present invention inhibits oxidative stress induced by LPS.
  • Cytokines (TNF- ⁇ , IL-6, IFN- ⁇ ) when TIP1 prepared in Example 1 was treated with mBMDM, a mouse bone marrow-derived macrophage cultured in Example 2, and hPBMC cells, which are human peripheral blood mononuclear cells.
  • NO Nitric Oxide
  • TNF- ⁇ , IL-6, and IFN- ⁇ levels of the culture supernatant of mBMDM cells according to the method described in Example 2-5 were rat TNF- ⁇ , IL-6, IFN- ⁇ ELISA kit Ready-SET-Go! It was measured using a kit, and the NO value of the supernatant was measured according to the method described in Example 2-7, and the results are shown in FIG. 6.
  • TIP1 reduces the secretion of TNF- ⁇ , IL-6 and NO induced by LPS, and IFN- ⁇ induced by Poly (I: C) It was confirmed to inhibit the production of. Through this, it was confirmed that TIP1 according to the present invention inhibits the secretion of cytokines and NO induced by LPS or Poly (I: C) in mouse bone marrow-derived macrophages.
  • TIP1 according to the present invention inhibits the TLR4 signaling pathway not only in immortalized cell lines, but also in primary cells extracted directly from animals.
  • TLR4 in order to confirm the effect of TIP1 on the signaling pathways of other TLR families, the TNF- ⁇ levels induced by different TLR ligands in the culture supernatant of RAW 264.7 cells were measured in Examples 2-5. It measured using the method of, and the results are shown in Figure 8. In addition, the IFN- ⁇ level of the culture supernatant of RAW 264.7 cells was measured using the ELISA kit Ready-SET-Go! It measured using, and the results are shown in Figure 9.
  • TIP1 and PAM3CSK4 (TLR1 / 2) or FSL-1 (TLR2 / 6) or Poly (I: C) (TLR3) or R848 (TLR7 / 8) or CpG-ODN (TLR9) together
  • TLR3 TLR3 signaling
  • TLR7 / 8 TLR7 / 8
  • TLR9 TLR9
  • NF- ⁇ B Activation of the TLR4 signaling pathway induced by LPS results in the activity of NF- ⁇ B, which in turn is a NOD-like receptor (NLR), NLRP3 (NACHT, LRR and PYD-domains-containing) in macrophages. protein 3) and IL-1 ⁇ .
  • NLR NOD-like receptor
  • NLRP3 NACHT, LRR and PYD-domains-containing
  • the present inventors show that LPS / ATP or TIP1 and LPS / ATP are present in human monocyte cells THP1 cells and mouse bone marrow-derived macrophages mBMDM THP1 cells.
  • pro-caspase-1 45 kDa
  • active capase-1 10 kDa
  • pro-IL-1 ⁇ 35 kDa
  • mature IL Protein expression of -1 ⁇ (17 kDa) was visualized through Western blotting. The results are shown in FIG. 10.
  • TIP1 significantly reduced the intracellular expression level of NLRP3, active capase-1 (10 kDa) and mature IL-1 ⁇ (17 kDa), and ultimately inhibited IL-1 ⁇ secretion.
  • FIG. 11 when TIP1 and LPS / ATP were treated together, it was confirmed that the amount of IL-1 ⁇ secretion decreased.
  • TIP1 according to the present invention blocks the TLR4 signaling pathway, thereby inhibiting NLRP3 inflammasome activation.
  • NLRP3 inflammasomes when abnormally activated, cause various inflammatory diseases, especially degenerative neurological diseases. If NLRP3 inflammasome activity can be effectively suppressed, it can be used as a therapeutic agent for degenerative neurological diseases through suppression of an inflammatory response. I can expect. Therefore, the present inventors confirmed through the above results that TIP1 according to the present invention can have a prophylactic or therapeutic effect against degenerative neurological diseases.
  • the present inventors used the amino acid sequence of the decoy peptide prepared in Example 1-1, SHCRVLLI (SEQ ID NO: 1), to determine the minimum amino acid region of TIP1 binding to the TIR domain of TLR4. , SEQ ID NO: 2) and VLLI (decoy peptide 1-3, SEQ ID NO: 7) sequences were respectively bound to the N-terminus of the same CPP sequence used in Example 1-1. All peptides used in this example are listed in Table 3 below.
  • Example 2-7 HEK-Blue TM -hTLR4 cultured in Example 1-2 with TIP1 (CPP-SHCRVLLI), TIP1-1 (CPP), TIP1-2 (CPP-SHCR) and TIP1-3 (CPP-VLLI) of Table 3 above.
  • NF- ⁇ B activity was measured using the method of Experimental Example 1 above.
  • the hPBMC cells cultured in Example 1-2 were treated with TIP1 (CPP-SHCRVLLI), TIP1-1 (CPP), TIP1-2 (CPP-SHCR) and TIP1-3 (CPP-VLLI) with LPS. Then, the amount of NO secretion was measured using the method of Example 2-7. The results are shown in FIG. 12.
  • TIR4 TIR domain Protein-protein docking was performed to analyze the binding interface between the TIR4 TIR domain and TIP1. As a result, TIP1 was expected to bind to the BB loop, DD loop, and C-terminal tail in the TIR domain of TLR4, and to confirm this, surface plasmon resonance was performed according to the method described in Example 2-8. SPR) analysis was performed.
  • TIP1-FITC was prepared by binding fluorescein isothiocyanate (FITC) to the N-terminus of TIP1.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • the inhibitory effect of TIP1 on the TLR4 signaling pathway is due to binding to the C-terminal tail and BB loop among the TIR domains of TLR4, and at the same time, the interaction between TIP1 and MyD88 is inhibited, ultimately leading to the TLR4 signaling process. It was confirmed that it was inhibited.
  • KHNMC AP 2016-006 Institutional Animal Care and Use Committee
  • TIP1 when TIP1 and LPS were treated together, it was confirmed that the secretion of TNF- ⁇ , IL-12p40 and IL-6 was significantly reduced. Through this, it was confirmed that TIP1 according to the present invention inhibits TLR4 signaling pathway, thereby inhibiting cytokine secretion in vitro as well as in vitro .
  • liver tissue was extracted to include M-PER mammalian protein extraction reagent with Protease inhibitor cocktail (Thermo Fisher Scientific, Inc.). After homogenization using a Kontes Pellet Pestle Cordless Motor (Thermo Fisher Scientific, Inc.), proteins were extracted according to the manufacturer's protocol. Thereafter, according to the method described in Example 2-3, IL-6, TNF- ⁇ , and ⁇ -actin protein expression was visualized through Western blotting, and the intensity of the bands was graphed and the results are shown in FIG. 15. Shown.
  • TIP1 and LPS were treated together, it was confirmed that the secreted amounts of TNF- ⁇ and IL-6 and BUN, Cr, AST, and ALT were significantly reduced. Through this, it was confirmed that TIP1 according to the present invention can suppress TLR4 signaling pathway, thereby alleviating cytokine secretion as well as kidney and liver damage.
  • kidney tissue was separated and electronic balance (ER-180A, A & D Company, Tokyo, Japan), and then cut into sagittal slices. This was placed in a 10% formalin solution overnight, and then paraffin wax was poured to solidify it and fixed into a thin section of 4 ⁇ m using a microtome to fix it.
  • TIP1 terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling
  • LSM-700 confocal laser scanning microscope
  • arthritis was induced by applying a collagen-induced arthritis (CIA) model to 6-7 week old DBA / 1J (20-23g) male mice.
  • CIA collagen-induced arthritis
  • chicken collagen type II Sigma-Aldrich Co. LLC
  • complete Freund's adjuvant Sigma-Aldrich Co. LLC.
  • emulsify 1 100 ⁇ g of the emulsified collagen solution was injected intradermally into the tail of the mouse to induce primary immunity and designated as day 0.
  • the emulsified collagen solution was again injected intradermally into the tail of the mouse to induce secondary boosting.
  • TIP1 treatment schemes were designed: 1 After 2nd immunization (day 15), 30 days for TIP1 (2.5, 5 and 10 nmol / g) or positive control prednisolone 5 mg, which is well known as a conventional treatment for arthritis plan to inject / kg daily; And 2 After completely inducing arthritis (day 35), a plan to inject 10 nmol / g of TIP1 for 10 days.
  • arthritis-induced DAB-1J rats were injected once daily for 30 days with TIP1 and prednisolone through the CIA model, and then at day 45, the mice were sacrificed to sample the joint tissue. Thereafter, 3D images and bone mineral density (BMD) of the joint tissue were analyzed through micro-CT (micro-computed tomography). In addition, hematoxylin and eosin (H & E) staining was performed using the knee joint region of the rat, and the synovial membrane was excessive in cartilage, subchondral bone, femur, tibia, and meniscus. Changes in proliferative (synovial hyperplasia) were observed. The results are shown in FIGS. 21 and 22.
  • TIP1 when treated with TIP1, bones damaged by the CIA model are alleviated similarly to normal mice, and cartilage (C), subchondral bone (S), femur (F), tibia (T) , It was confirmed that histopathologic transformation of meniscus (M) also decreased. Through this, it was confirmed that TIP1 according to the present invention can be effectively used as a therapeutic agent for various acute or chronic inflammatory diseases, including rheumatoid arthritis, by effectively suppressing the TLR4 signaling pathway.
  • SLE Systemic lupus erythematosus
  • mice Three female wild-type mice (C57BL / 6) weighing an initial weight of 18-20 g and three lupus-prone mice (MRL / lpr) weighing an initial weight of 38-40 g were tested in Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). All animal experiments were conducted with the approval of the Ajou University Medical Center Animal Ethics Committee (Approval No. 2017-0022). According to the guidelines published in the animal laboratory at Ajou University School of Medicine, the mice were acclimatized for a week before the experiment while rearing them under pathogen-free conditions.
  • mice from the vehicle group were injected intraperitoneally with 1% DMSO, and mice from the TIP1 treated group were injected with TIP1 dissolved in 1% DMSO daily for 10 days at 10 nmol / g body weight for 20 days. During the treatment period, the body weight of the mice was measured.
  • mice were sacrificed and blood, urine and tissues were collected. After incubation for 1 hour, blood samples were collected in serum separation tubes and centrifuged at 20 ° C and 3000 rpm for 10 minutes. Then, serum samples were stored at -80 ° C. The collected urine samples were immediately stored at -80 ° C.
  • mice were quickly removed and washed thoroughly with PBS, then immersed in RNA stabilization solution (QIAGEN Sciences, Maryland, MD, USA).
  • RNA stabilization solution QIAGEN Sciences, Maryland, MD, USA.
  • concentrations of anti dsDNA antibody, antinuclear antibody (ANA) and C3 complement in mouse serum were analyzed by ELISA.
  • urine albumin levels of mice were analyzed according to the manufacturer's protocol with a mouse albumin ELISA kit (41-ALBMS-E01, Alpco Diagnostics, Salem, NH, USA). Measured 3 times per sample.
  • the size of the spleen, kidney and lymph nodes was smaller in the SLE mouse model treated with TIP1 compared to the vehicle-treated SLE mouse model.
  • lymphocyte proliferation was significantly inhibited in SLE mice treated with TIP1 compared to mice treated with vehicle.
  • the anti-dsDNA antibody and the anti-nuclear antibody were present in a lower concentration in the SLE mouse model treated with TIP1 than in the SLE mouse model not treated with TIP1 (vehicle group). (See Figures 25A and 25B).
  • the low concentration of complement components in serum is a common marker of SLE, and the SLE mouse model treated with TIP1 recovered the concentration of C3 complement components in serum (see FIG. 25C).
  • the albumin content in the urine acts as a marker of kidney pathology called glomerulonephritis.
  • the SLE mouse model treated with TIP1 significantly reduced the albumin content in urine than the SLE mouse model without TIP1 treatment.
  • TIP1 effectively regulates the factors related to lupus symptoms, and thus can be usefully used to prevent or treat lupus.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 TLR(Toll-like receptor) 신호전달 경로를 억제하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 루푸스 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 루푸스 마우스 모델에서 루푸스 증상 관련 인자들을 효과적으로 조절하므로, 루푸스를 예방 또는 치료하는데 유용하다.

Description

TLR 억제 펩타이드를 포함하는 루푸스 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 TLR(Toll-like receptor) 신호전달 경로를 억제하는 펩타이드를 포함하는 루푸스 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
선천 면역은 포유류의 면역 시스템에서 세균 감염에 대항하는 첫 번째 방어 작용으로 톨-유사 수용체와 같은 패턴 인식 수용체가 병원균-연관 분자 패턴(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)이나 위험-연관 분자 패턴(danger-associated molecular pattern, DAMP)을 인식함으로써 활성화된다.
TLR은 선천 면역 반응에서 중요한 역할을 하며, TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6 및 TLR11을 포함하는 원형질막에서 작용을 하는 세포 외 TLR과, TLR3, TLR7, TLR8 및 TLR9를 포함하는 엔도솜과 같은 세포 내에서 작용을 하는 세포 내 TLR로 나눌 수 있다. 구조적으로, TLR은 세포외 도메인의 N-말단에 리간드 또는 부속분자(accessory molecule)에 의해 인식되는 루신고반복(leucine-rich repeat, LRR) 부위를 가지고 있으며, 세포내 부분의 C-말단에 신호를 전달하는 톨/인터루킨 1 수용체(Toll/interleukin 1 receptor,TIR) 도메인을 가지고 있다.
특히, TLR4는 TLR 패밀리에서 처음으로 규명된 수용체로서, MyD88(myeloid differentiation 88)-의존적 신호전달 경로 및 MyD88-비의존적 신호전달 경로를 통해 증폭되는 선천 면역신호를 활성화시킨다. 이에 반해 TLR3은 MyD88-비의존적 신호전달 경로만을 활성화시킨다. 이러한 TLR의 역할로 인해 여러 면역 질병을 치료하기 위한 타겟으로 TLR을 활용하기 위한 연구에 대한 관심이 높아지고 있다.
TLR4의 MyD88-의존적 신호전달은 CD14(cluster of differentiation 14) 및 MD2 (myeloid differentiation factor 2)와 같은 부속 분자를 통한 LPS 인식에 의해 개시된다. LPS 결합 이후 TLR4는 이량체(dimer)를 형성하고 TLR4의 TIR 도메인과 TIR 도메인 어댑터 단백질(TIR domain adaptor protein, TIRAP 또는 MyD88 adapter-like, MAL)의 TIR 도메인끼리 결합하며, MyD88과 함께 복합체를 형성함으로써 신호전달 경로를 활성화시킨다. 활성화된 TLR4는 Myd88 의존 신호전달 과정을 통해 NF-κB의 초기 활성화 및 핵으로의 이동, MAPK의 활성화를 유도한다. 상기 NF-κB와 MAPK의 활성화는 TNF-α(tumor necrosis factor α), IL-1β(interleukin 1β) 및 IL-6와 같은 염증성 사이토카인을 분비시킨다. TLR4와 TLR3의 MyD88-비의존적 신호전달 과정은 각 TLR의 TIR 도메인과 TRAM/TRIF(TIR domain-containing adapter-inducing interferon-β(TRIF)-related adaptor molecule, TRAM) 복합체의 TIR 도메인간의 결합으로 개시되며, IRF(interferon-regulatory factor)의 활성화에 의해 타입 1 인터페론을 분비시킨다. 또한, TLR4 활성은 대식세포에서 NO와 ROS와 같은 산화 스트레스성 물질을 생성한다.
이와 같이 TLR은 자가면역 질환, 염증성 질환 및 암과 같은 다양한 질환을 치료하기 위한 타겟이 될 수 있으므로 TLR을 타겟으로 하는 물질과 TLR과 관련된 질병을 치료하기 위한 의학적 조성물에 대한 연구가 이루어지고 있다. 특히, 지질 A(lipid A)의 주요 골격 구조를 변형함으로써 많은 수의 TLR4 촉진제와 길항제를 얻은 바 있으며, 에리토란(eritoran), 지질 A 및 Rhodobacter sphaeroids 지질 A(RsLA)가 LPS와 MD2의 상호작용을 억제하고 쥐에서 LPS로 유도된 쇼크를 예방할 수 있음이 밝혀졌다. 또한, LPS에 의한 TLR4 신호전달 경로는 NLRP3 인플라마좀 형성에 관여하여 알츠하이머 병과 파킨슨 병 등 퇴행성 신경질환과도 밀접한 관련이 있다고 보고되었다.
한편, 단백질의 결합도메인 일부를 이용하여 본래 상호작용하는 단백질에 대신 결합함으로써 신호전달을 제어하는 decoy 펩타이드를 이용해 병원균-연관 분자 패턴(PAMP)과 유사하거나 반대되는 작용을 하는 펩타이드에 관해 연구가 활발히 진행되고 있다. 펩타이드들은 일반적인 저분자 (small molecule) 치료제에 비해 부작용이 적고, 변형 및 품질관리가 수월한 것으로 알려져 있으며, 세포 투과성 펩타이드(cell penetrating peptide, CPP)의 개발로 인해 낮은 세포 침투성 역시 개선되고 있다.
루푸스는 여러 기관을 침범하는 전신적인 자가면역 질환으로 다양한 자가 항체와 면역 복합체의 형성에 의해 조직이 손상되는 것이 특징이다. 골격계 및 피부 증상이 가장 흔하지만 질병 초기 또는 경과 중에 피부, 관절, 혈액, 신장과 같은 신체 여러 기관에서 매우 다양한 임상 소견이 나타날 수 있다(안중경, 전신 홍반 루푸스의 임상 소견과 진단, 대한내과학회지: 제 78 권 제 4 호 2010). 루푸스에는 여러 종류가 있다. 가장 흔한 유형은, 전신 홍반 루푸스(Systemic lupus erythematosus; SLE)로서 신체의 많은 부분에 영향을 준다. 다른 유형으로는, 사라지지 않는 피부 발진을 유발하는 원반모양 홍반 루푸스, 태양에 노출된 신체 부위에 피부 궤양을 유발하는 아급성 피부 홍반 루푸스, 약에 의해 유발되는 약물 유발 루푸스, 드물지만 신생아가 걸리는 신생아 루푸스 등이 있다.
본 발명자들은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 신규 펩타이드(decoy peptide 1) 및 상기 신규 펩타이드가 세포 투과성 펩타이드의 N-말단에 연결된 융합 펩타이드(Toll-like receptor inhibitory peptide 1, TIP1)를 처리한 SLE 마우스 모델에서 이들 펩타이드를 처리하지 않은 SLE 마우스 모델과 비교하여, 림프구 증식(lymphoproliferation)이 억제되고, 뇨에서의 알부민 함량이 감소하며, 항 dsDNA 항체 및 항핵항체(Anti-nuclear antibody; ANA)가 적게 생산되는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 루푸스 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 세포 투과성 펩타이드의 N-말단에 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 연결된 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 루푸스 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 루푸스의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 루푸스의 예방 또는 치료를 위한 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 용도를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 루푸스 예방 또는 치료용 조성물을 제조하기 위한 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 용도를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 세포 투과성 펩타이드의 N-말단에 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 연결된 융합 펩타이드를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 루푸스의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 루푸스의 예방 또는 치료를 위한 세포 투과성 펩타이드의 N-말단에 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 연결된 융합 펩타이드의 용도를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 루푸스 예방 또는 치료용 조성물을 제조하기 위한 세포 투과성 펩타이드의 N-말단에 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 연결된 융합 펩타이드의 용도를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 루푸스 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 세포 투과성 펩타이드의 N-말단에 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 연결된 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 루푸스 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 루푸스의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 루푸스의 예방 또는 치료를 위한 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 루푸스 예방 또는 치료용 조성물을 제조하기 위한 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 세포 투과성 펩타이드의 N-말단에 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 연결된 융합 펩타이드를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 루푸스의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 루푸스의 예방 또는 치료를 위한 세포 투과성 펩타이드의 N-말단에 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 연결된 융합 펩타이드의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 루푸스 예방 또는 치료용 조성물을 제조하기 위한 세포 투과성 펩타이드의 N-말단에 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 연결된 융합 펩타이드의 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 SLE 마우스 모델에서 림프구 증식(lymphoproliferation)을 억제하고, 뇨에서의 알부민 함량을 감소시키며, 항 dsDNA 항체 및 항핵항체가 적게 생산되도록 하는 등, SLE 증상 관련 인자들을 효과적으로 조절하므로 루푸스를 예방 또는 치료하는데 유용하다.
도 1의 (a)는 HEK-BlueTM hTLR4 (human TLR4) 세포에 TIPs(TIP1, TIP2; TIP2는 대조용으로 사용)의 농도를 달리하여 LPS와 함께 처리한 경우 SEAP (secreted alkaline phosphatase) 활성이 TIP1에 의해 감소하고 있음을 나타낸 도이다. 도 1의 (b)는 CPP 서열이 연결되지 않은 TIP1(TIP1 W/O CPP) 및 TIP2(TIP2 W/O CPP)의 SEAP 활성을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 2의 (a)는 쥐 대식세포인 RAW 264.7 세포에 TIP1을 LPS와 함께 처리한 경우 NF-κB(p65) 및 IRF3 활성을 웨스턴 블롯팅을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 2의 (b)는 동일 조건에서 MAPK 활성을 웨스턴 블롯팅을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 쥐 대식세포인 RAW 264.7 세포에 TIP1을 LPS와 함께 처리한 경우 NF-κB의 활성(p-p65)을 공초점 레이저 주사 현미경(Confocal microscopy)으로 확인한 결과로 TIP1에 의해 p-p65의 핵내 이동이 차단되고 있음을 나타낸 도이다.
도 4는 쥐 대식세포인 RAW 264.7 세포에 농도를 달리한 TIP1을 LPS와 함께 처리한 경우 사이토카인 분비량을 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 4의 (a)는 TNF-α, 도 4의 (b)는 IL-6, 도 4의 (c)는 IFN-β 분비량을 각각 나타낸 것이다.
도 5는 쥐 대식세포인 RAW 264.7 세포에 TIP1을 LPS와 함께 처리한 경우 NO 및 ROS 발생량을 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 5의 (a)는 세포질에서의 NO 발생량, 도 5의 (b)는 세포질 내 ROS의 발생량, 도 5의 (c)는 세포 밖으로의 NO 분비량을 각각 나타낸 것이다.
도 6은 쥐 골수유래 대식세포인 mBMDM (mouse bone marrow derived macrophage) 세포에 TIP1을 LPS와 함께 처리한 경우 사이토카인 및 NO 발생량을 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 6의 (a)는 TNF-α, 도 6의 (b) IL-6, 도 6의 (c)는 NO, 도 6의 (d)는 IFN-β 발생량을 나타낸 것이다.
도 7은 인간 말초혈액 단핵세포 (human peripheral blood mononuclear cells (hPBMCs)에 TIP1을 LPS와 함께 처리한 경우 세포에서의 p-ERK, ERK, p-JNK, JNK, pp38, p38, p-p65 및 Iκ-Bα 발현량을 웨스턴 블롯팅을 통해 확인한 결과로 TIP1에 의해 억제되고 있음을 보여주는 도이다.
도 8은 쥐 대식세포인 RAW 264.7 세포에 TIP1을 각각의 TLR에 해당하는 리간드인 PAM3CSK4 (TLR1/2), FSL-1 (TLR2/6), Poly(I:C) (TLR3), R848 (TLR7/8) 또는 CpG-ODN (TLR9) 과 함께 처리한 경우 세포에서의 TNF-α 분비량을 측정한 것으로 TIP1에 의해 억제되고 있음을 보여주는 도이다.
도 9는 쥐 대식세포인 RAW 264.7 세포에 TIP1을 Poly(I:C)와 함께 처리한 경우 IFN-β의 분비량을 ELISA를 통해 확인한 결과로 TIP1에 의해 감소하고 있음을 나타낸 도이다.
도 10의 (a)는 LPS와 ATP를 처리하여 유도시킨 NLRP3 (NACHT, LRR 및 PYD domains-containing protein 3)-매개 인플라마좀 (inflammasome, 염증조절복합체) 형성에 관여하는 분자들이 TIP1에 의해 억제됨을 THP1 세포에서 확인한 도이다. 도 10의 (b)는 동일 조건의 실험을 mBMDM 세포에서 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 11의 (a)는 LPS와 ATP를 처리하여 유도시킨 NLRP3-매개 인플라마좀 상태에서 TIP1을 처리할 경우 IL-1β 분비가 억제됨을 THP1 세포에서 확인한 도이다. 도 11의 (b)는 동일 조건의 실험을 mBMDM 세포에서 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 TIP1의 전체 또는 부분적인 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 NF-κB 활성 및 NO 분비량을 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 12의 (a)는 SEAP 활성, 도 12의 (b)는 NO 분비량을 각각 나타낸 것이다.
도 13은 인간 단핵구세포인 THP1 세포에 FITC(fluorescein isothiocyanate)가 결합된 TIP1(TIP1-FITC) 또는 TIP1-FITC와 LPS를 함께 처리한 경우 TIP1(녹색)과 TLR4(빨간색) 및 MyD88(파란색) 간의 상호작용을 공초점 레이저 주사 현미경으로 관찰하여 TIP1이 TRL4와 결합하고 있음을 확인한 도이다.
도 14는 C57BL/6J 쥐에 PBS(phosphate buffered saline)와 LPS 또는 TIP1과 LPS를 함께 처리한 후 1시간 또는 2시간 뒤 채취한 혈액을 통해 사이토카인 분비량을 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 14의 (a)는 TNF-α, 도 14의 (b)는 IL-12p40, 도 14의 (c)는 IL-6 분비량을 각각 나타낸 것이다.
도 15는 C57BL/6J 쥐에 PBS와 LPS 또는 TIP1과 LPS를 함께 처리한 경우 사이토카인 분비량을 쥐의 간조직에서 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 15의 (a)는 TNF-α 및 IL-6의 분비량을 웨스턴 블롯팅을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이고, 도 15의 (b)는 상기 웨스틴 블롯팅에 따른 밴드 강도를 정량화하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 16은 C57BL/6J 쥐에 PBS와 LPS 또는 TIP1과 LPS를 함께 처리한 경우 TIP1이 신장 및 간 손상에 미치는 영향을 24시간 뒤 채취한 혈액을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 16의 (a) 및 (b)는 각각 TNF-α 및 IL-6 분비량을 나타낸 것이다. 도 16의 (c) 및 (d)는 각각 신장 손상 마커인 BUN(blood urea nitrogen) 및 크레아틴(creatinine, Cr)의 분비량을 나타낸 것이다. 도 16의 (e) 및 (f)는 간 손상 마커인 AST(aspartate aminotransferase) 및 ALT(alanine aminotransferase)의 분비량을 나타낸 도이다.
도 17은 C57BL/6J 쥐에 PBS와 LPS 또는 TIP1과 LPS를 함께 처리한 경우 TIP1이 신장의 세포사멸(apoptosis)에 미치는 영향을 24시간 뒤 채취한 신장조직을 이용해 TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) 염색법으로 확인한 결과로 TIP1이 세포사멸을 감소시키고 있음을 나타낸 도이다.
도 18은 BALB/c 쥐에 LPS 또는 TIP1과 LPS를 함께 처리한 경우 LPS에 의한 패혈증 모델 쥐의 생존율이 증가하고 있음을 보여주는 도이다.
도 19의 (a)는 DAB-1J 쥐의 CIA(collagen-induced arthritis; 콜라겐에 의해 유도된 류마티스 관절염) 모델을 이용하여 류마티스 관절염에 대한 TIP1의 치료효과를 확인하기 위한 실험 계획을 나타낸 도이다. 도 19의 (b)는 TIP1을 처리한 경우 치료효과를 시각적으로 관찰한 것으로 류마티스 관절염이 치료되고 있음을 나타낸 도이다.
도 20은 DAB-1J 쥐의 CIA 류마티스 관절염 모델에 TIP1을 처리한 경우 치료효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 20의 (a)는 체중, 도 20의 (b)는 squeaking (쥐가 찍찍거리는 소리), 도 20의 (c)는 발 부푼 정도, 도 20의 (d)는 관절염 인덱스를 관찰한 결과를 각각 나타낸 것이다.
도 21은 DAB-1J 쥐의 CIA 모델에 TIP1을 처리한 후 Micro-CT(micro-computed tomography)를 이용해 3D 이미지 및 골밀도(born mineral density; BMD)를 측정한 것으로 관절염이 치료되고 있음을 나타낸 도이다.
도 22는 DAB-1J 쥐의 CIA 모델에 TIP1을 처리한 후 무릎관절 부위를 헤마톡실린과 에오신으로 염색(Hematoxylin and eosin(H&E) staining)하여 기존의 치료제인 프레드니솔론과 치료 정도를 비교한 것으로 TIP의 치료 효과가 우수함을 나타낸 도이다.
도 23은 TLR4에 의해 유도되는 신호전달 과정과 TIP1이 제어하고 있는 부위를 모식적으로 나타낸 도이다.
도 24는 야생형 마우스(C57BL/6), 비히클-처리된 SLE 마우스 모델 및 TIP1- 처리된 SLE 마우스 모델에서의 비장, 신장, 림프절의 크기를 각각 비교한 사진이다.
도 25a는 SLE 마우스 모델에서 분리한 혈청에서 항 dsDNA 항체의 농도를 측정한 그래프이다.
도 25b는 야생형 마우스 및 SLE 마우스 모델에서 분리한 혈청에서 항핵항체(ANA)의 농도를 측정한 그래프이다.
도 25c는 야생형 마우스 및 SLE 마우스 모델에서 분리한 혈청에서 C3 보체의 농도를 측정한 그래프이다.
도 25d는 야생형 마우스 및 SLE 마우스 모델에서 분리한 뇨에서 알부민의 농도를 측정한 그래프이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 제공한다.
본 발명에서 용어, "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 상기 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법에 따라 제조될 수 있으며, 바람직하게는 고체상 합성 기술에 따라 제조될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 용어, "TLR4"는 병원체 감염에 대한 감시자로서 기능하는 막관통(transmembrane) 단백질 패밀리인 톨-유사 수용체(Toll-like receptors, TLRs)에 속하는 단백질로서, TLR4 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 말하며, CD284(cluster of differentiation 284)로 명명되기도 한다. 상기 TLR4는 그람-음성 박테리아의 LPS를 비롯한 다양한 PAMPs(pathogen-associated molecular patterns)를 인지하기 때문에 선천성 면역 시스템의 활성화에 매우 중요하다.
본 발명에서 용어, "TLR3"은 병원체 감염에 대한 감시자로서 기능하는 막관통(transmembrane) 단백질 패밀리인 TLRs에 속하는 단백질로서, TLR3 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 말하며, CD283(cluster of differentiation 283)으로 명명되기도 한다. 상기 TLR3은 바이러스의 double-strand RNA(dsRNA)를 비롯한 다양한 PAMPs를 인지하기 때문에 선천 면역 시스템의 활성화에 매우 중요하다.
본 발명에서 용어, "NLRP3 인플라마좀"은 caspase-1의 활성화를 조절하는 내재 면역 체계의 수용체 및 센서이며, 미생물 감염 등에 반응하여 염증을 유발하는 인플라마좀의 한 종류로서, 다양한 자극들에 반응하여 활성화된다. NLRP3는 준비단계(priming)가 필요하며, 예시로 LPS의 TLR4로의 결합이 있다. LPS에 의한 TLR4 신호전달 경로는 ATP와 함께 NLRP3 인플라마좀 형성을 촉진한다. NLRP3 인플라마좀은 비정상적으로 활성화되면 다양한 염증성 질환의 발병을 유도하며, 특히 퇴행성 신경질환을 유발한다. 최근의 연구에 따르면, 알츠하이머 병의 주요 원인으로 꼽히는 베타아밀로이드(amyloid β)의 축적과 NLRP3 인플라마좀 사이에 직접적인 연관성이 있음이 밝혀졌고 파킨슨 병과의 관련성도 보고되었다.
본 발명에서 용어, "TLR4에 의해 매개되는 신호전달 경로"는 TLR4를 통한 신호전달 경로를 말하며, 이는 TLR4 및 MD2에 의해 형성된 TLR4/MD2 복합체에 의존하는 LPS 반응일 수 있고, 이를 통해 신호가 전달된다. TLR4는 여러 가지 어댑터 단백질에 의해 신호를 전달하며, Mal(TIRAP로도 지칭됨)과 MyD88 및 트램(TRAM)과 트리프(TRIF) 등을 통해 작동한다. 활성화된 TLR4는 Myd88-의존적 신호전달 과정을 통해 NF-κB를 활성화시켜 핵으로 이동시키며, MAPK의 활성화를 유도한다. 상기 NF-κB와 MAPK의 활성화로 인해 TNF-α, IL-1β 및 IL-6와 같은 염증성 사이토카인이 분비되고, 대식세포에서 일산화질소(이하, NO라 한다)와 활성산소(이하, ROS라 한다)와 같은 산화 스트레스성 물질을 생성한다. 또한, 트램/트리프(TRAM/TRIF), 인터페론-조절자(IRF) 및 NF-κB의 활성화에 의해 MyD88-비의존적 신호전달 과정이 유도되어 타입 1 인터페론이 분비된다.
본 발명에서 용어, "TIR 도메인"은 세포 내 신호전달을 위한 도메인으로, 3개의 고도로 보존된 영역(highly conserved region)을 가지고 있으며 TLR과 다른 신호전달 분자 사이의 상호작용을 매개한다. 활성화된 TIR 도메인은 MyD88의 결합을 유도하고 TLR 신호전달 경로를 활성화 시킨다.
본 발명에서 용어, "억제"는 결핍, 부조화, 그 밖의 많은 원인에 의하여 생물 활동이나 신호활성이 저하되는 현상을 말하며, TLR의 활성을 부분적으로 또는 완전히 블로킹하거나, 감소시키거나, 방지하거나, 활성화를 지연시키거나, 불활성화 시키거나 또는 하향 조절하는 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 펩타이드 또는 융합 펩타이드는 TLR4 및 TLR3 신호전달 경로와 NLRP3 인플라마좀 억제용도를 제공한다. 또한 부분적으로 TLR1/2, TLR2/6, TLR7, TLR8 및 TLR9의 억제용도도 제공한다.
본 발명에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 S-H-C-R 서열(서열번호 2)은 TLR(Toll-like receptor)의 TIR(Toll/interleukin-1 receptor) 도메인에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다.
TLR4의 TIR 도메인과 결합함에 있어서, 본 발명에 따른 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 서열 특이성을 가진다. 본 발명자들은 TLR4의 TIR 도메인과 결합하는 TIP1의 아미노산 최소부위를 탐색하고, 이 영역이 TLR4의 신호전달 경로를 효과적으로 억제할 수 있는지 알아보았다. 즉, 본 발명의 일실시예에 따르면, TIRAP의 TIR 도메인으로부터 decoy peptide를 선별하고 이의 아미노산 서열인 S-H-C-R-V-L-L-I를 이용하여 S-H-C-R(decoy peptide 1-2, 서열번호 2) 및 V-L-L-I(decoy peptide 1-3, 서열번호 7) 서열을 실시예 1-1에서 사용한 것과 동일한 CPP 서열의 N-말단에 각각 결합시켜 HEK-BlueTM-hTLR4 세포 및 hPBMC 세포에 LPS와 함께 처리한 후, 각각으로부터 NF-κB 활성 및 NO 분비량을 측정하였다. 그 결과, 상기 S-H-C-R(decoy peptide 1-2) 서열이 억제제 효과를 내는데 중요함을 확인하였다.
또한, 본 발명은 세포 투과성 펩타이드의 N-말단에 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 연결된 융합 펩타이드를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 펩타이드는 TLR(Toll-like receptor)에 의해 매개되는 신호전달 경로를 억제할 수 있고, 상기 TLR(Toll-like receptor)은 TLR1/2(Toll-like receptor 1/2), TLR2/6(Toll-like receptor 2/6), TLR3(Toll-like receptor 3), TLR4(Toll-like receptor 4), TLR7(Toll-like receptor 7), TLR8(Toll-like receptor 8) 및 TLR9(Toll-like receptor 9)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 TLR4(Toll-like receptor 4) 또는 TLR3(Toll-like receptor 3)일 수 있고, 보다 바람직하게는 TLR4(Toll-like receptor 4)인 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 융합 펩타이드의 TLR 신호전달경로 차단에 의해 TNF-α, IL-6 또는 IFN-β의 발현 억제; NO 또는 ROS의 분비 억제; 또는 NF-κB, MAPK 또는 NLRP3 인플라마좀의 활성이 억제될 수 있으며, 상기 융합 펩타이드는 MyD88-의존적 및 MyD88-비의존적 TLR4 신호전달 경로를 모두 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 용어, "세포 투과성 펩타이드(cell penetrating peptide, CPP)"는 일종의 신호 펩타이드(Signal Peptide) 로서 단백질, DNA, RNA 등과 같은 고분자 물질을 세포 내로 전달하고자 하는 목적으로 사용되는 일종의 특정 아미노산 서열의 조합인 펩타이드이다. 현재까지 다양한 저분자 화합물, 단백질, 펩타이드, RNA, DNA 등 고분자 물질의 세포 내 전달을 위해 이용되고 있다.
본 발명의 융합 펩타이드는 세포 투과성 펩타이드를 이용하고 있으며, 상기 세포 투과성 펩타이드는 세포 내재화(endocytosis) 기전에 의해 세포 내로 들어가는 특징을 가지고 있는 것이라면 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 하기 표 1에 나열된 세포 투과성 펩타이드 또는 이의 변이체 중에서 선택하여 사용할 수 있다.
[표 1]
Figure PCTKR2019014728-appb-I000001
Figure PCTKR2019014728-appb-I000002
Figure PCTKR2019014728-appb-I000003
Figure PCTKR2019014728-appb-I000004
한편, 상기 표 1의 세포 투과성 펩타이드 중 Transportan은 다음와 같은 변이체의 형태로 사용되는 것을 포함한다: AGYLLGKINLKALAALAKKIL-NH2(TP10, PepFect 3, 서열번호 13), AGYLLGKINLKALAALAKKIL-NH2(TP10, PepFect 6, 서열번호 14), AGYLLGKLLOOLAAAALOOLL-NH2(TP10, PepFect 14, 서열번호 15), AGYLLGKTNLKALAALAKKIL-NH2(NickFect 1, 서열번호 16), AGYLLGKTNLKALAALAKKIL-NH2(NickFect 2, 서열번호 17) 및 AGYLLGKTNLKALAALAKKIL-NH2(Nickfect 3, 서열번호 18).
또한, 상기 표 1의 서열번호 37로 이루어진 아미노산 서열(MPPs)에 있어서 r은 d-Arginine을 의미하며, 서열번호 37의 아미노산 서열 내 2, 6번째 아미노산이 이에 해당한다. 아울러, 상기 표 1의 서열번호 41 및 42는 서로 측쇄를 이루는 하나의 펩타이드(TATp-D)를 구성하며, 서열번호 41의 아미노산 서열 내 14번째 Lys 잔기(K)가 서열번호 42의 아미노산 서열 내 13번째 Gln 잔기(Q)와 연결되어 측쇄를 이루는 것을 특징으로 한다. 나아가, 상기 표 1의 서열번호 43으로 이루어진 아미노산 서열(Cyclic Tat)에 있어서, r은 d-Arginine을 의미하며, 서열번호 43의 아미노산 서열 내 2, 4, 6, 10번째 아미노산이 이에 해당한다. 마찬가지로, k는 d-Lysine을 의미하며, 서열번호 43의 아미노산 서열 내 8번째 아미노산이 이에 해당한다. 상기 서열번호 43은 고리형 펩타이드인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 표 1의 세포 투과성 펩타이드 중 Penetratin 서열(RQIKIWFQNRRMKWKK, 서열번호 9)을 선택하여 실험을 수행하였으며, 상기 실제로 사용한 세포 투과성 펩타이드 외에 다른 세포 투과성 펩타이드를 본 발명의 펩타이드와 융합시킨 경우에도 본 발명과 유사한 효과가 나타남은 당업자에게 자명할 것이다.
본 발명에 있어서, 세포 투과성 펩타이드의 N-말단에 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 연결된 상기 융합 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 아미노산 서열의 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있으며, 구체적으로 상기 변이체는 서열번호 3 또는 4와 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱더 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 펩타이드를 모두 포함할 수 있다. 상기 용어 "상동성" 이란 야생형(wild type) 아미노산 서열 및 야생형 핵산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것을 말한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 융합 펩타이드는 리포폴리사카라이드(LPS)에 의해 유도되는 TLR4 신호전달 경로를 억제함으로써 사이토카인(IL-6, TNF-α, IFN-β), NO 및 ROS의 분비와 NF-κB와 MAPK의 활성화를 억제함은 물론 동물에서 TLR4의 과활성에 의한 신장과 간 손상, 패혈증 및 류마티스 관절염 완화와 Poly(I:C)에 의해 유도된 TLR3 신호전달 경로 및 LPS/ATP에 의해 유도된 NLRP3 인플라마좀 형성을 억제하는 효과가 우수한바, 상기 신호전달 경로에 의해 발생하는 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 NLRP3 인플라마좀에 의한 퇴행성 신경질환을 예방 및 치료하는데 유용하게 활용할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 본 발명에 따른 융합 펩타이드는 TLR4, TLR3 및 NLRP3 인플라마좀 억제제로서 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "억제제"는 임의의 메커니즘에 의하여, 수용체 또는 세포 내 매개체와 같은 다른 분자의 영향을 부분적으로 또는 완전히 저해하는 분자를 의미한다.
본 발명에서 용어, "TLR4, TLR3 및 NLRP3 인플라마좀 억제제"는 TLR4, TLR3 및 NLRP3 인플라마좀의 생물학적 활성을 직간접적으로, 또는 실질적으로 방해, 감소 또는 저해할 수 있는 물질을 말하며, 바람직하게는 TLR4, TLR3와 반응성인 펩타이드는 TLR4, TLR3의 TIR 도메인에 직접 결합하고, TLR4, TLR3의 활성을 중화시킴으로써 TLR4, TLR3 신호전달 경로를 차단하여, NF-κB 및 MAPK 그리고 NLRP3 인플라마좀 활성화의 감소를 유발해 염증성 사이토카인, NO 및 ROS의 분비를 감소시킬 수 있는 물질을 말한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 루푸스의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 세포 투과성 펩타이드의 N-말단에 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 연결된 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 루푸스의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다. 상기 융합 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 아미노산 서열의 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있다.
상기 루푸스는 전신 홍반 루푸스(Systemic lupus erythematosus; SLE), 원반모양 홍반 루푸스(discoid erythema lupus), 아급성 피부 홍반 루푸스(Subacute cutaneous lupus), 약물 유발 루푸스, 신생아 루푸스일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 상기 펩타이드를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 루푸스 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.
상기 "약학적으로 허용되는" 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 루푸스의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 루푸스의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 루푸스의 예방 또는 치료를 위한 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 루푸스 예방 또는 치료용 조성물을 제조하기 위한 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 세포 투과성 펩타이드의 N-말단에 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 연결된 융합 펩타이드를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 루푸스의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 상기 개체는 인간을 포함한 포유류인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 루푸스의 예방 또는 치료를 위한 세포 투과성 펩타이드의 N-말단에 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 연결된 융합 펩타이드의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 루푸스 예방 또는 치료용 조성물을 제조하기 위한 세포 투과성 펩타이드의 N-말단에 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 연결된 융합 펩타이드의 용도를 제공한다.
또한 본 발명의 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드; 또는 세포 투과성 펩타이드의 N-말단에 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 연결된 융합 펩타이드는 이 외 기존의 루푸스 치료를 위한 약물 또는 치료방법과 병용하여 동시에/순차적으로 처리될 수 있다.
이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 시험 시료의 준비
1-1. TLR4의 TIR 도메인에 특이적으로 결합하는 펩타이드 선별
본 발명자들은 TLR4의 TIR 도메인에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 선별하기 위해 TIRAP의 TIR 도메인으로부터 2종의 서열(Decoy peptide 1, 2)을 선별하였고 상기 서열의 N 말단에 Drosophila antennapedia 호메오도메인 유래의 세포 투과성 펩타이드(Cell-Penetrating Peptides, CPP)를 연결하여 신규펩타이드 TIP1 및 TIP2를 합성하였다. 본 실시예에서 사용한 모든 펩타이드의 서열을 하기 표 2에 나타내었다.
[표 2]
Figure PCTKR2019014728-appb-I000005
* Decoy peptide의 서열을 밑줄로 표시하였다.
1-2. 세포 배양 및 준비
HEK-BlueTM-hTLR4 세포(InvivoGen, San Diego, CA, USA)를 1%의 페니실린/스트렙토마이신, 10%의 소 태아 혈청(FBS; fetal bovine serum)(Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) 및 0.2%의 노모신(normocin)(InvivoGen)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)(Thermo Fisher Scientific Inc.) 배지에 넣어 배양하였다. 쥐 대식세포인 RAW 264.7 세포(Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)는 1%의 페니실린/스트렙토마이신, 10%의 FBS(Thermo Fisher Scientific, Inc.)가 첨가된 저당 DMEM(Low-Glucose DMEM)에 넣어 배양하였다. 인간 단핵구 세포인 THP1 세포는 1%의 페니실린/스트렙토마이신, 10%의 FBS(Thermo Fisher Scientific, Inc.)가 첨가된 RPMI 1640에서 배양 후, 10 nM의 phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)(Sigma-Aldrich Co. LLC., St. Louis, MO, USA)를 이용하여 24시간 동안 대식세포로 분화 유도하였다. 인간 말초혈액 단핵구 세포인 hPBMC 세포(PromoCell, Heidelberg, Germany)는 2.05mM L-글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 10%의 FBS가 첨가된 RPMI 1640(Thermo Fisher Scientific Inc.)에서 배양하였다. 쥐 골수유래 대식세포인 mBMDM 세포는 1%의 페니실린/스트렙토마이신과 10%의 FBS가 첨가된 DMEM(Thermo Fisher Scientific Inc.)에서 배양하였다. 모든 세포들은 5% CO2, 37 ℃의 습한 조건의 배양 시스템(Thermo Fisher Scientific Inc.)에서 배양하였고, 배지는 16시간마다 교체하였다. PAM3CSK4, Poly(I:C), R848 및 CpG-ODN은 Thermo Fisher Scientific, Inc.에서, FSL-1은 InvivoGen에서, LPS(Escherichia coli 0111:B4)와 ATP는 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, 실험에 사용된 모든 펩타이드들은 Peptron, Inc.(Daejeon, Korea)에서 합성 및 구입하였다.
실시예 2. 분석 방법
2-1. MTT 분석
HEK-BlueTM-hTLR4 세포를 96-웰 플레이트(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)에 5 x 104 cells/웰의 세포수가 되도록 분주하고, RAW264.7 세포는 2 x 105 cells/웰의 세포수가 되도록 분주하여 하룻밤 동안 배양하였다. 이후 1-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-3,5-diphenylformazan(MTT) 용액(Sigma-Aldrich Co. LLC)을 사용하여 MTT 분석을 수행하였다.
2-2. SEAP 활성 분석
HEK-BlueTM-hTLR4 세포를 24-웰 플레이트(BD Biosciences)에 2 x 105 cells/웰의 세포수가 되도록 분주하고 하룻밤 동안 배양하였다. 다음날, 배양액을 제거하고 배지를 교체한 후, 배양액 일부(200㎕)를 미세원심분리(microcentrifuge) 튜브에 옮겨 heating block(FINEPCR. Co., Seoul, Korea)을 사용하여 65℃에서 10분간 가열시켰다. 이후 배양액을 96-웰 플레이트(BD Biosciences)에 옮기고 HEK-BlueTM detection 키트(InvivoGen) 및 마이크로플레이트 리더 분광 광도계(Molecular Devices Inc., Silicon Valley, CA, USA)를 사용하여 405nm에서 흡광도를 측정하여 SEAP(Secreted Alkaline phosphatase) 발현량을 분석하였다.
2-3. 웨스턴 블롯
웨스턴 블롯팅을 수행하기 위해 전-단백질 추출 용액(M-PER, Thermo Fisher Scientific Inc.)을 프로테아제 및 포스파타아제 억제 혼합물과 섞어 RAW 264.7 세포 또는 hPBMC 세포 펠릿(pellet)에 첨가하였다. 상기 펠릿을 10분간 냉각시킨 후 10분 동안 16000 X g에서 상기 용해물을 원심 분리하였다. 그런 다음, NE-PER 핵 및 세포질 추출 시약(Thermo Fisher Scientific Inc.)을 사용하여 세포질과 핵의 단백질을 각각 추출하고, BCA 키트(Sigma-Alderich Co. LLC)를 사용하여 상기 단백질의 농도를 측정하였다. 이후, 동일한 양의 단백질을 SDS-폴리아크릴아마이드 겔에 전개하고, Mini-PROTEAN Tetra Cell 이차원 전기영동 시스템(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)을 이용하여 전기영동을 수행하였다. 상기 막을 1차 항체로 4℃의 온도에서 하룻밤 동안 가볍게 쉐이킹하여 면역블롯팅하였다(상기 1차 항체는 p-p65, p-JNK, p-IRF3, ERK, p38 및 인간 IL-1β(Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA); p-ERK, p-p38, Iκ-Bα, JNK, ATF3, COX2, caspase-1 및 β-액틴(Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA); iNOS(BD Biosciences); IL-6 및 마우스 IL-1β(R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA); TNF-α(Thermo Fisher Scientific, Inc.); NLRP3(Adipogen, San Diego, CA, USA)에 대한 항체이다). 그런 다음, PBST로 철저히 쉐이킹한 후 상기 막을 항-쥐/-토끼 HRP-컨쥬게이티드 2차 항체(Thermo Fisher Scientific Inc.)와 함께 2시간 동안 배양하고, SuperSignal West Pico ECL 용액(Thermo Fisher Scientific Inc.)으로 단백질을 검출하고 Fuji LAS-3000 시스템(Fujifilm, Tokyo, Japan)을 사용하여 검출된 단백질을 시각화하였다.
2-4. 공초점 현미경 분석(Confocal microscopy)
RAW 264.7 세포 및 THP1 세포를 24-웰 플레이트에 2 x 105 cells/웰의 세포수가 되도록 분주한 후 하룻밤 동안 인큐베이터에서 키웠다. 이후 TIP1 및 LPS를 함께 처리하고 24시간 뒤, 상기 RAW 264.7 세포 및 THP1 세포를 15분 동안 3.7% 포름알데히드(Sigma-Aldrich Co. LLC)로 고정하고, 15분 동안 0.2% 트리톤 X-100(AMRESCO, Solon, OH, USA)에 침지한 후 PBS로 3회 세척하고 2% BSA 용액으로 블로킹하였다. 상기 블로킹된 세포들을 TIP1-FITC(25μM; Peptron, Inc., Daejeon, Korea), p-p65, TLR4, Myd88, TOM20(1:1000; Santa Cruz Biotechnology Inc.) 및 NLRP3(Adipogen) 항체들과 2시간 동안 배양한 다음, PBS로 3회 세척하였다. 이후, 상기 세포들을 AlexaFluor 408 및/또는 488 및/또는 546-컨쥬게이션된 2차 항체(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 함께 1시간 동안 배양하고 PBS로 3회 세척하였다. 이후, 5μM의 Hoechst 33258(Sigma-Aldrich Co.)을 이용하여 상온에서 15분간 염색하고, 공초점 레이저 주사 현미경(LSM-700, Carl Zeiss MicroImaging GmbH)을 사용하여 상기 형광 염색된 세포의 수를 세었으며, Zen 2009 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석하였다.
2-5. TNF-α, IL-6, IFN-β 및 IL-1β 분석
RAW 264.7 세포, THP1 세포 및 mBMDM 세포를 96-웰 플레이트에 2 x 105 cells/웰의 세포수가 되도록 분주 또는 24-웰 플레이트에 5 x 105 cells/웰의 세포수가 되도록 분주하고 하룻밤 동안 배양하였다. 이후 TIP1 및 LPS를 함께 처리하고 24시간 뒤, IFN-β, IL-6 및 TNF-α 분비량을 LEGEND MAXTM Mouse IL-6 pre-coated ELISA 키트(BIoLegend), Mouse IL-6 Platinum ELISA(eBiosciences) 및 Mouse TNF alpha ELISA Ready SET-Go! 키트(eBiosciences)를 사용하여 측정하였다. 마이크로플레이트 리더 분광 광도계(Molecular Devices)를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하고, 그 결과를 소프트맥스 프로 5.3 소프트웨어(Molecular Devices Inc.)를 사용하여 분석하였다.
2-6. 세포질 내 NO 및 ROS 분석
*RAW 264.7 세포를 6-cm 디쉬(SPL Life Sciences., Pochun, Korea)에 1 x 106 cells/웰의 세포수가 되도록 분주하고 하룻밤 동안 배양하였다. 이후 TIP1을 처리하고 각각 DAF-FM 및 DCF-DA(Thermo Fisher Scientific, Inc.)로 염색한 후, 1시간 동안 배양하였다. 그 후, 5분당 200 X g으로 원심 분리하여 수거하고 갈색 튜브에 옮겨 4℃의 온도에서 PBS에 보관하였다. 디바 소프트웨어(BD Biosciences)로 FACSAria III를 사용하여 DAF-FM, DCF-DA 형광물질의 강도를 측정하여 정량화하였다.
2-7. NO 분비량 분석
RAW 264.7 세포 및 mBMDM 세포를 96-웰 플레이트(BD Biosciences)에 2 x 105 cells/웰의 세포수가 되도록 분주하고 하룻밤 동안 배양한 뒤, 배양 상층액의 NO 수치를 NO 검출 키트(iNtRON Biotechnology Inc., Seongnam, Korea)를 사용하여 측정하였다. 마이크로플레이트 리더 분광 광도계(Molecular Devices In.)를 사용하여 550nm에서 흡광도를 측정하고, 그 결과를 소프트맥스 프로 5.3 소프트웨어(Molecular Devices Inc.)를 사용하여 분석하였다.
2-8. 표면 플라즈몬 공명 분석(surface plasmon resonance; SPR)
ProteOn NLC 센서 칩과 함께 ProteOn XPR36 instrument(Bio-Rad Laboratories, Inc.)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명 분석을 수행하였다. 구체적으로, GLC polymer layer에 결합된 NeutrAvidin을 이용하여 TIR 도메인의 BB-loop(RDFIPGVAIAA) 및 C-말단 부위(EGTVGTGCNWQEATSI)를 코딩하는 합성 펩타이드를 NLC 센서 칩의 표면에 고정시키고, 대조군으로는 러닝 버퍼인 0.05% Tween 20으로 보충된 PBS를 흘려주었다. 다양한 종류의 TIP1, TIP1-1, TIP1-2 및 Tip1-3(50μM) 및 서로 다른 농도의 TIP1(12.5, 25 및 50 μM)를 칩에 흘려 고정된 펩타이드와의 결합 친화도를 확인하였다. 측정 후에 센서 칩의 표면은 0.85% 인산(phosphoric acid) 또는 PBST를 사용하여 재생되었다. 해리(dissociation) 상수는 ProteOn managerTM 소프트웨어(버전 2.0)를 사용하여 계산하였고, 다양한 투여량의 TIP1로부터 얻은 데이터를 운동 속도 상수(Ka 및 Kd)에 맞추기 위해 그룹화 하였으며, 평형 해리상수 KD는 KD=Kd/Ka 식을 사용하여 계산하였다.
실험예 1. TIPs의 TLR4-결합 친화도 확인
실시예 1-1에서 제조한 TIPs(TIP1, TIP2)의 TLR4-결합 친화도를 확인하기 위해 상기 실시예 1-2에서 배양한 HEK-BlueTM-hTLR4 세포에서 NF-κB의 활성을 측정하였다. 이를 위해, NF-κB와 AP-1(activator protein 1)의 DNA가 결합하는 부위를 포함하는 IL-12 p40 미니멀 프로모터(IL-12 p40은 TLR4의 자극 후 NF-κB와 AP-1의 활성화에 의해 생성된다)의 조절 부분 아래에 유도성 SEAP(secreted embryonic alkaline phosphatase) 리포터 유전자를 위치시켰다. 그 후, TIP 또는 CPP가 연결되지 않은 TIP(TIP W/O CPP)의 농도를 12.5, 25, 50 μM로 다양하게 하여 HEK-BlueTM-hTLR4 세포에 처리한 다음, SEAP 활성의 평균값을 계산하여 TLR4의 활성을 측정하고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1의 (a)에 나타낸 바와 같이, 오직 TIP만을 첨가한 경우 SEAP의 활성은 큰 변화가 없으나, TIP를 처리한 후 LPS로 TLR4를 자극하였을 때, TIP1은 TIP2과 달리 LPS에 의해 유도된 SEAP 활성을 농도 의존적으로 감소시킴을 확인하였다. 또한, 도 1의 (b)에 나타낸 바와 같이, CPP 서열이 연결되지 않은 경우에는 TIP1(TIP1 W/O CPP) 및 TIP2(TIP2 W/O CPP) 모두 SEAP 활성에 변화가 없음을 확인하였다. 이를 통해 본 발명의 TIP1은 CPP와 연결됨에 따라 일단 세포 내부로 전위되면(translocated) 신호전달 경로의 하류 어댑터 분자들을 방해하고, LPS에 의해 유도되는 TLR4-매개 신호전달 경로의 활성화를 차단하여 효과적인 TLR4 억제제로 사용될 수 있음을 확인하였다.
실험예 2. In vitro 에서 TLR 신호전달 경로에 대한 TIP1의 억제적 효과
LPS에 의해 유도된 TLR4 매개 반응은 TIRAP의 TIR 도메인과 MyD88 간의 직접적인 상호작용을 유도하여 MyD88-의존적 신호전달경로를 활성화한다. 또한, TRAM의 TIR 도메인과 TRIF 간의 상호작용을 유도하여 MyD88-비의존적 신호전달경로를 활성화하기도 한다. 상기 MyD88-의존적 신호전달 경로에서, NF-κB의 초기 활성은 TNF-α(tumor necrosis factor alpha) 및 IL-6(interleukin 6)와 같은 염증 유발(pro-inflammatory) 사이토카인의 분비를 유도한다. 한편, MyD88-비의존적 신호전달 경로에서는 IRF3 및 7의 활성을 비롯하여 IFN-α 및 IFN-β와 같은 type I 인터페론(IFNs)의 후기 분비 반응이 유도된다. 본 발명자들은 TLR4 신호전달 경로에 대한 TIP1의 영향을 알아보기 위하여 RAW 264.7 세포에 LPS를 처리한 후, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
2-1. NF-κB 및 MAPK의 웨스턴 블롯팅
상기 실시예 1-1에서 제조한 TIP1이 NF-κB 및 MAPK의 활성에 미치는 영향을 확인하기 위해 실시예 2-3에 기재된 방법에 따라 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2의 (a)에 나타낸 바와 같이, 대조군인 쥐 대식세포인 RAW 264.7 세포에 오직 LPS만을 처리한 경우, NF-κB의 활성이 증가하여 Iκ-Bα가 분해되고 IRF3와 ATF3의 활성이 증가한 반면, TIP1을 함께 처리한 경우, NF-κB의 활성이 억제되어 Iκ-Bα가 분해되는 정도 및 IRF3와 ATF3의 활성이 감소함을 확인하였다. 또한, 도 2의 (b)에 나타낸 바와 같이, 오직 LPS만을 처리한 경우, MAPK의 활성이 증가하여 ERK, JNK, p38이 인산화되지만, TIP1을 함께 처리한 경우, MAPK의 활성이 억제되어 상기 효소들의 인산화된 정도가 감소함을 확인하였다. 이를 통해 본 발명에 따른 TIP1은 TLR4의 TIR 도메인에 결합하여 LPS에 의해 유도된 MyD88-의존적 신호전달 경로는 물론 MyD88-비의존적 신호전달 경로 역시 억제함을 확인하였다.
2-2. NF-κB의 활성화 확인
상기 실시예 1에서 제조한 TIP1이 NF-κB의 활성에 미치는 영향을 확인하기 위해 실시예 2-4에 기재된 방법에 따라 공초점 레이저 현미경으로 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, LPS만을 처리한 경우 활성화된 NF-κB(p-p65)가 핵 안에서 발현되고 있으나, TIP1을 함께 처리한 경우 핵에서 LPS에 의해 유도된 p65의 인산화 수준이 감소함을 통해 NF-κB의 활성도가 감소함을 확인하였다.
실험예 3. TIP1이 사이토카인과 NO 및 ROS 분비에 미치는 영향
상기 실시예 1-1에서 제조한 TIP1을 상기 실시예 1-2에서 배양한 쥐 대식세포인 RAW 264.7 세포에 처리하였을 때 사이토카인(TNF-α, IL-6, IFN-β)과 NO(Nitric Oxide)의 분비 및 세포질 내의 ROS(reactive oxygen species)의 발생이 억제되는지를 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
3-1. TIP1이 사이토카인 분비에 미치는 영향
실시예 2-5에 기재된 방법에 따라 RAW 264.7 세포의 배양 상층액의 TNF-α, IL-6, IFN-β 수치를 쥐 TNF-α, IL-6, IFN-β ELISA 키트 Ready-SET-Go! 를 사용하여 측정하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, TIP1과 LPS를 함께 처리하였을 경우 TNF-α, IL-6, IFN-β의 분비가 농도 의존적으로 감소함을 확인하였다. 이를 통해 본 발명에 따른 TIP1이 LPS에 의해 유도된 사이토카인의 분비를 억제함을 확인하였다.
3-2. TIP1이 NO 및 ROS 분비에 미치는 영향
실시예 2-6에 기재된 방법에 따라 TIP1이 세포질에서의 NO 및 ROS(reactive oxygen species) 발생에 미치는 영향을 확인하기 위해 RAW 264.7 세포에 TIP1을 처리하고, 각각 DAF-FM(Invitrogen Corp., CA, USA) 및 DCF-DA(Invitrogen Corp.)로 염색하여 세포질의 NO, ROS를 각각 정량화하였다. 또한, 실시예 2-7에 기재된 방법에 따라 RAW 264.7 세포의 배양 상층액의 NO 수치를 NO 검출 키트를 사용하여 측정하였다. 상기 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5의 (a) 내지 (c)에 나타낸 바와 같이, TIP1과 LPS를 함께 처리하였을 경우 TIP1은 세포 외 NO 분비뿐만 아니라 세포질에서의 NO 및 ROS 발생량 역시 효과적으로 감소시킴을 확인하였다. 이를 통해 본 발명에 따른 TIP1은 LPS에 의해 유도된 산화적 스트레스를 억제함을 확인하였다.
실험예 4. 일차세포(primary cells)에서 TIP1이 미치는 영향 확인
상기 실시예 1에서 제조한 TIP1을 상기 실시예 2에서 배양한 쥐 골수유래 대식세포인 mBMDM과 인간 말초혈액 단핵구 세포인 hPBMC 세포에 처리하였을 때 사이토카인(TNF-α, IL-6, IFN-β)과 NO(Nitric Oxide)의 분비 및 TLR 신호전달 단백질들의 활성화가 억제되는지를 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
4-1. TIP1이 mBMDM 세포에 미치는 영향
실시예 2-5에 기재된 방법에 따라 mBMDM 세포의 배양 상층액의 TNF-α, IL-6, IFN-β 수치를 쥐 TNF-α, IL-6, IFN-β ELISA 키트 Ready-SET-Go! 키트를 사용하여 측정하고, 실시예 2-7에 기재된 방법에 따라 상층액의 NO 수치를 측정하여 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6의 (a) 내지 (d)에 나타낸 바와 같이, TIP1은 LPS에 의해 유도된 TNF-α, IL-6 및 NO의 분비량을 감소시키고, Poly(I:C)에 의해 유도된 IFN-β의 생성을 억제시킴을 확인하였다. 이를 통해 본 발명에 따른 TIP1이 쥐 골수유래 대식세포에서 LPS 또는 Poly(I:C)에 의해 유도된 사이토카인과 NO의 분비를 억제함을 확인하였다.
4-2. TIP1이 hPBMC 세포에 미치는 영향
TIP1이 hPBMC 세포에서 NF-κB 및 MAPK의 활성에 미치는 영향을 확인하기 위해 실시예 2-3에 기재된 방법에 따라 웨스턴 블롯팅을 수행하였고, 단백질을 시각화하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 대조군인 인간 말초혈액 단핵구 세포인 hPBMC 세포에 오직 LPS만을 처리한 경우, NF-κB의 활성이 증가하여 Iκ-Bα가 분해되는 반면, TIP1을 함께 처리한 경우, NF-κB의 활성이 억제되어 Iκ-Bα가 분해되는 정도가 감소하였다. 또한, 오직 LPS만을 처리한 경우, MAPK의 활성이 증가하여 ERK, JNK, p38이 인산화되지만, TIP1을 함께 처리한 경우, MAPK의 활성이 억제되어 상기 효소들의 인산화된 정도가 감소함을 확인하였다.
이를 통해 본 발명에 따른 TIP1은 불멸화된 세포주(cell line) 뿐만 아니라 동물에서 직접 추출한 일차세포에서도 TLR4 신호전달경로를 억제함을 확인하였다.
실험예 5. TIP1이 다른 TLR 신호전달에 미치는 영향
TLR4 외에, 다른 TLR 패밀리의 신호전달 경로에 대한 TIP1의 효과를 확인하기 위하여, RAW 264.7 세포의 배양 상층액의 각기 다른 TLR 리간드(ligand)에 의해 유도된 TNF-α 수치를 상기 실시예 2-5의 방법을 이용하여 측정하고, 그 결과를 도 8에 나타내었다. 또한, RAW 264.7 세포의 배양 상층액의 IFN-β 수치를 ELISA 키트 Ready-SET-Go! 를 사용하여 측정하고, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, TIP1과 PAM3CSK4(TLR1/2) 또는 FSL-1(TLR2/6) 또는 Poly(I:C)(TLR3) 또는 R848(TLR7/8) 또는 CpG-ODN(TLR9)을 함께 처리하였을 경우, TNF-α 분비량이 감소하였고, 특히 TIP1은 TLR3 신호전달에 대한 억제 효과가 높음을 확인하였다(50μM에서 92% 감소). 또한, 도 9에 나타낸 바와 같이, TIP1과 Poly(I:C)를 함께 처리하였을 경우, IFN-β의 분비량이 감소함을 확인하였다. 이를 통해 본 발명에 따른 TIP1이 TLR4뿐만 아니라 TLR1/2, TLR2/6, TLR3, TLR7/8, TLR9에서도 사이토카인 분비 억제 효과가 있음을 확인하였다.
실험예 6. TIP1이 퇴행성 신경질환에 미치는 영향
LPS에 의해 유도되는 TLR4 신호전달 경로의 활성화는 NF-κB의 활성을 야기하고, 이는 곧 대식세포에서 NOD-유사 수용체(NOD-like receptor, NLR), NLRP3(NACHT, LRR 및 PYD-domains-containing protein 3) 및 IL-1β의 발현으로 이어진다. 이러한 조건 하에서, ATP와 칼륨 유출 물질(potassium efflux agent)은 세포 내부의 칼륨 농도를 감소시키고, NLRP3 인플라마좀(inflammasome)에 의한 성숙한 IL-1β의 생성을 유도한다.
이와 같은 TLR4 신호전달 경로의 활성과 NLRP3 인플라마좀 형성의 상관관계에 주목하여, 본 발명자들은 인간 단핵구 세포인 THP1 세포 및 쥐 골수유래 대식세포인 mBMDM THP1 세포에 LPS/ATP 또는 TIP1과 LPS/ATP를 함께 처리한 후, 실시예 2-3에 기재된 방법에 따라 NLRP3, pro-caspase-1 (45 kDa), 활성형 capase-1 (10 kDa), pro-IL-1β(35 kDa) 및 성숙한 IL-1β(17 kDa)의 단백질 발현을 웨스턴 블롯팅을 통해 시각화 하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.
또한, TIP1이 NLRP3 인플라마좀이 유도되었을 때 사이토카인 분비에 미치는 영향을 확인하기 위해 THP1 세포 및 mBMDM 세포에 LPS/ATP 또는 TIP1과 LPS/ATP를 함께 처리한 후, 배양 상층액의 IL-1β 수치를 실시예 2-5에 기재된 방법에 따라 인간 및 쥐 IL-1β ELISA 키트 Ready-SET-Go! 를 사용하여 측정하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 10의 (a) 내지 (b)에 나타낸 바와 같이, THP1과 mBMDM 세포에서 LPS와 ATP에 의해 유도된 NLRP3, Caspase-1, IL-1β의 발현이 TIP1에 의해 억제됨을 확인하였다. 구체적으로, TIP1은 NLRP3, 활성형 capase-1 (10 kDa) 및 성숙한 IL-1β(17 kDa)의 세포 내 발현량을 현저히 감소시키고, 궁극적으로 IL-1β분비를 억제시킴을 확인하였다. 또한, 도 11에 나타낸 바와 같이, TIP1과 LPS/ATP를 함께 처리하였을 경우, IL-1β의 분비량이 감소함을 확인하였다. 이를 통해 본 발명에 따른 TIP1이 TLR4 신호전달 경로를 차단하여 NLRP3 인플라마좀 활성화를 억제함을 확인하였다.
NLRP3 인플라마좀은 비정상적으로 활성화되면 다양한 염증성 질환, 그 중에서도 퇴행성 신경질환을 유발하여, NLRP3 인플라마좀의 활성을 효과적으로 억제할 수 있다면 염증 반응의 억제를 통해 퇴행성 신경질환의 치료제로 사용될 수 있음을 기대할 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 상기 결과를 통해 본 발명에 따른 TIP1이 퇴행성 신경질환에 대하여 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.
실험예 7. TIP1 서열 특이성 확인
본 발명자들은 TLR4의 TIR 도메인과 결합하는 TIP1의 아미노산 최소부위를 확인하기 위해, 실시예 1-1에서 제조한 decoy peptide의 아미노산 서열인 S-H-C-R-V-L-L-I(서열번호 1)를 이용하여 S-H-C-R(decoy peptide 1-2, 서열번호 2) 및 V-L-L-I(decoy peptide 1-3, 서열번호 7) 서열을 실시예 1-1에서 사용한 것과 동일한 CPP 서열의 N-말단에 각각 결합하였다. 본 실험예에서 사용한 모든 펩타이드를 하기 표 3에 기재하였다.
[표 3]
Figure PCTKR2019014728-appb-I000006
상기 표 3의 TIP1(CPP-SHCRVLLI), TIP1-1(CPP), TIP1-2(CPP-SHCR) 및 TIP1-3(CPP-VLLI)을 실시예 1-2에서 배양한 HEK-BlueTM-hTLR4 세포에 LPS와 함께 처리한 후, 상기 실험예 1의 방법을 이용하여 NF-κB 활성을 측정하였다. 또한, 상기 실시예 1-2에서 배양한 hPBMC 세포에 LPS와 함께 TIP1(CPP-SHCRVLLI), TIP1-1(CPP), TIP1-2(CPP-SHCR) 및 TIP1-3(CPP-VLLI)를 처리한 후, 상기 실시예 2-7의 방법을 사용하여 NO 분비량을 측정하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12의 (a)에 나타낸 바와 같이, TIP1의 NF-κB 활성 억제 효과가 가장 높았고 TIP1-2 역시 NF-κB 활성을 감소시킨 반면, TIP1-1과 TIP1-3를 처리한 경우 변화가 없거나 미미함을 확인하였다. 또한, 도 12의 (b)에 나타낸 바와 같이, TIP1의 NO 분비량 감소 효과가 가장 높았고 TIP1-2 역시 NO 분비를 억제시킨 반면, TIP1-1과 TIP1-3를 처리한 경우 변화가 없거나 미미함을 확인하였다. 이를 통해 본 발명에 따른 TIP1의 서열 중 S-H-C-R 서열이 억제제 효과를 내는데 중요함을 확인하였다.
실험예 8. TIP1과 TLR4 및 MyD88 간의 상호작용 확인
단백질-단백질 도킹(protein-protein docking)을 수행하여 TLR4의 TIR 도메인과 TIP1 간의 결합 인터페이스(binding interface)를 분석하였다. 그 결과, TIP1이 TLR4의 TIR 도메인에서 BB loop, DD loop 및 C-말단 꼬리에 결합하는 것으로 예상되었으며, 이를 확인하기 위하여 실시예 2-8에 기재한 방법에 따라 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance; SPR) 분석을 수행하였다.
또한, TLR4에 대한 TIP1의 결합을 확인하기 위해 TIP1의 N-말단에 FITC(fluorescein isothiocyanate)를 결합시켜 TIP1-FITC를 제조하였다. 상기 실시예 1-2의 THP1 세포에 TIP1(TIP1-FITC) 또는 LPS와 TIP1을 함께 처리한 후, 실시예 2-4에 기재한 방법에 따라 면역형광 염색 및 공초점 현미경을 이용하여 형광 염색된 세포의 수를 세어 단백질 간의 상호작용을 분석하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타낸 바와 같이, TIP1-FITC와 LPS를 함께 처리하였을 경우, TIP1-FITC(녹색)와 TLR4(빨간색)가 결합하여 복합체를 형성하는 반면, 복합체 부위에 MyD88(파란색)이 결합하지 못함을 확인하였다. 한편, LPS의 부존재 시 TLR4는 원형질막에서 발현되는 반면 MyD88은 세포 내에 퍼져있는데, 세포에 LPS를 처리하는 경우 TLR4 및 TIP1-FITC 모두 세포 내재화(endocytosis) 과정을 통해 세포 내부로 유입되며, MyD88은 세포 내부에 퍼져있는 것이 아니라 원형질막 상에서 응집됨을 확인하였다. 또한, TIP1-FITC-TLR4가 강력하게 결합하는 반면에, MyD88은 TIP1-FITC에 대하여 약한 결합을 형성함을 확인하였다. 이를 통해 TLR4 신호전달 경로에 대한 TIP1의 억제적 효과는 TLR4의 TIR 도메인 중에서도 C-말단 꼬리와 BB loop에 결합함에 따른 것이며, 동시에 TIP1과 MyD88과의 상호작용은 억제되어 궁극적으로 TLR4 신호전달 과정이 저해됨을 확인하였다.
실험예 9. In vivo 에서 TIP1이 쥐의 사이토카인 분비에 미치는 영향
모든 동물 실험은 실험동물 운영위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받아 진행하였다(KHNMC AP 2016-006). TIP1의 in vivo 효과를 확인하기 위해 8주령 C56BL/6 (20-25g, n=8) 마우스를 Orient Bio, Inc.(Seoul, Korea)로부터 구매하여 실험에 사용하였다. 상기 마우스에 TIP1(동물 체중 g당 10nmol)을 복강 내 주사하고 1시간 후 LPS(동물 체중 g당 5㎍)를 2시간 동안 주사하였다. 대조군에는 동일 부피의 PBS를 주사하였다. 이후 쥐 혈액으로부터 원심분리를 통해 혈장을 분리하여 분비량 분석 전까지 -80℃에서 보관하였다. 혈장 안의 TNF-α, IL-12p40(1:100으로 희석) 및 IL-6(1:100으로 희석) 수치를 쥐 TNF-α, IL-12p40, IL-6 ELISA 키트 ELISA MAX Deluxe (BioLegend, San Diego, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. 마이크로플레이트 리더 분광 광도계(Molecular Devices In.)를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하고, 그 결과를 소프트맥스 프로 5.3 소프트웨어(Molecular Devices Inc.)를 사용하여 분석하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었다.
도 14의 (a) 내지 (c)에 나타낸 바와 같이, TIP1과 LPS를 함께 처리하였을 경우 TNF-α, IL-12p40 및 IL-6의 분비량이 현저히 감소함을 확인하였다. 이를 통해 본 발명에 따른 TIP1이 TLR4 신호전달 경로를 억제하여 in vitro 뿐만 아니라 in vivo에서도 사이토카인 분비를 억제함을 확인하였다.
실험예 10. TIP1이 패혈증에 미치는 영향
TIP1이 패혈증에 미치는 영향을 확인하기 위해 C57BL/6J 및 BALB/c 쥐에 PBS와 LPS 또는 TIP1과 LPS를 함께 처리한 후, 신장 및 간 손상과 생존율 변화를 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
10-1. TIP1이 간에서 사이토카인 분비에 미치는 영향
C57BL/6J 쥐에 PBS와 LPS 또는 TIP1과 LPS를 함께 처리한 후(2시간), 간 조직은 적출하여 Protease inhibitor cocktail(Thermo Fisher Scientific, Inc.)과 함께 M-PER 포유동물 단백질 추출 시약을 포함하는 Kontes Pellet Pestle Cordless Motor(Thermo Fisher Scientific, Inc.)를 이용하여 균질화시킨 후 제조사의 프로토콜에 따라 단백질을 추출하였다. 이후, 실시예 2-3에 기재한 방법에 따라 IL-6, TNF-α, β-actin의 단백질 발현을 웨스턴 블롯팅을 통해 시각화 하였으며, 밴드의 강도를 그래프로 나타내었고 그 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15의 (a) 및 (b)에 나타낸 바와 같이, LPS와 TIP1을 함께 처리하였을 경우 쥐의 간 조직에서 LPS에 의해 유도된 TNF-α 및 IL-6의 발현량이 현저히 감소함을 확인하였다.
10-2. TIP1이 신장 및 간 손상에 미치는 영향
마우스 패혈증 모델에서 TIP1의 항염증 효과를 보다 정확하게 확인하기 위하여, 상기와 동일한 방법으로 실험을 수행하였다. 구체적으로, C57BL/6J 쥐에 PBS와 LPS 또는 TIP1과 LPS를 함께 처리한 후 (24시간), 쥐 혈액으로부터 원심분리를 통해 혈장을 분리하였다. 분리한 혈장을 이용하여, 상기 실험예 9의 방법에 의해 TNF-α와 IL-6의 분비량을 측정하였고, 신장 손상 마커인 BUN(blood urea nitrogen) 및 크레아틴(creatinine; Cr)과 간 손상 마커인 AST(aspartate aminotransferase) 및 ALT(alanine aminotransferase)의 분비량 변화를 VETTEST-8008-system (IDEXX)을 통해 분석하였다. 그 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16의 (a) 내지 (f)에 나타낸 바와 같이, TIP1과 LPS를 함께 처리하였을 경우 TNF-α와 IL-6 및 BUN, Cr, AST, ALT의 분비량이 현저히 감소하였음을 확인하였다. 이를 통해 본 발명에 따른 TIP1이 TLR4 신호전달 경로를 억제하여 사이토카인 분비는 물론 신장 및 간 손상을 완화 시킬 수 있음을 확인하였다.
10-3. TIP1이 신장의 세포사멸(apoptosis)에 미치는 영향
8주령 C56BL/6 (20-25g, n=8) 마우스에 TIP1과 LPS 또는 PBS와 LPS를 함께 처리한 후(24시간), 신장조직을 분리하고 electronic balance(ER-180A, A&D Company, Tokyo, Japan)를 사용하여 무게를 측정한 후, 시상면으로 절단하여 슬라이스로 만들었다. 이를 10% 포르말린(formalin) 용액에 하룻밤 동안 둔 뒤 파라핀 왁스를 부어 고체화시키고 미세박절기(microtome)를 이용하여 4㎛의 얇은 절편으로 만들어 고정(fixation)하였다. 고정한 신장조직에서 TIP1이 세포사멸에 미치는 영향을 확인하기 위해 TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) (Merck Millipore, Billerica, MA, USA) 염색을 하고 공초점 레이저 주사 현미경(LSM-700, Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Jena, Germany)을 사용하여 상기 형광 염색된 세포의 수를 세었으며, Zen 2009 소프트웨어(Carl Zeiss MicroImaging GmbH.)를 사용하여 이미지를 분석하였다. 그 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17에 나타낸 바와 같이, LPS만을 처리한 경우 TUNEL-양성 신장세포가 현저히 증가, 즉 신장조직에서의 세포사멸(녹색점)이 증가한 반면, TIP1과 LPS를 함께 처리하였을 경우, LPS에 의해 증가한 신장조직에서의 세포사멸(녹색점)이 감소함을 확인하였다.
10-4. TIP1이 생존율에 미치는 영향
TIP1이 LPS에 의해 유도된 패혈증에 미치는 영향을 알아보기 위해 8주령 BALB/c (20-25g, n=8) 수컷 마우스에 LPS(동물 체중 g당 5 또는 10㎍)와 TIP1(동물 체중 g당 10nmol)과 LPS를 함께 처리한 후 5일 동안 생존율을 측정하였다. 대조군에는 동일 부피의 PBS를 주사하였다. 그 결과를 도 18에 나타내었다.
도 18에 나타낸 바와 같이, TIP1과 LPS를 함께 처리하였을 경우, LPS만 처리하였을 경우에 비해 생존율이 증가함을 확인하였다. 구체적으로, LPS를 5㎍/g으로 처리한 온화한 패혈증 모델의 경우 3일만에 생존율이 100% 감소하였고, TIP1을 함께 처리하였을 경우 30%의 생존율을 5일 동안 유지하였다. 또한, LPS를 10㎍/g으로 처리한 중증 패혈증 모델의 경우 하루 만에 생존율이 70% 감소하였고, 이틀 후 모든 마우스가 사망하였으며, TIP1을 함께 처리하였을 경우 중증 패혈증을 유발시켰음에도 하루 동안 생존율이 100% 유지되었고, 이틀 후 생존율이 90% 감소하였다. 이를 통해 본 발명에 따른 TIP1이 TLR4 신호전달 경로를 억제하여 염증의 초기 단계를 완화시킴으로써 사이토카인 분비와 신장 및 간 손상을 감소시키고 결국 패혈증을 완화 시킴을 확인하였다.
실험예 11. TIP1이 류마티스 관절염에 미치는 영향
TIP1이 류마티스 관절염에 미치는 영향을 확인하기 위해 6 내지 7주령 DBA/1J (20-23g) 수컷 마우스에 콜라겐 유도 관절염(Collagen-induced arthritis, CIA) 모델을 적용시켜 관절염을 유도하였다. 구체적으로, 닭의 제2형 콜라겐(chicken collagen type II, Sigma-Aldrich Co. LLC)과 완전 프로인트 보조제(complete Freund's adjuvant, Sigma-Aldrich Co. LLC.)를 1:1로 혼합하여 에멀젼화한 후, 상기 에멀젼화된 콜라겐 용액 100㎍을 마우스 꼬리에 피내 주사하여 1차 면역을 유도하고 이를 day 0으로 지정하였다. 1차 면역 14일 후에 상기 에멀젼화된 콜라겐 용액을 재차 마우스 꼬리에 피내 주사하여 2차 면역(boosting)을 유도하였다.
이후 다음의 두 종류의 TIP1 처리 계획을 설계하였다: ① 2차 면역 후(day 15), 30일 동안 TIP1(2.5, 5 및 10nmol/g) 또는 기존 관절염 치료제로 잘 알려진 양성 대조군 프레드니솔론(prednisolone) 5mg/kg을 매일 주사하는 계획; 및 ② 관절염을 완전히 유발시킨 후(day 35), 10일 동안 TIP1 10nmol/g을 주사하는 계획. 이는 총 7개 실험군(n=8)으로, 다음과 같이 명명하였다: (1) 무처리 정상군(Normal); (2) 대조군(vehicle-treated)(CIA, n=8); (3) 2.5nmol/g TIP1 처리군(CIA-TIP1(2.5nmol/g)); (4) 5nmol/g TIP1 처리군(CIA-TIP1(5nmol/g)); (5) 10nmol/g TIP1 처리군(CIA-TIP1(10nmol/g)); (6) 5㎍/g 프레드니솔론(prednisolone, 기존 관절염 치료제) 처리군(CIA-prednisolone(5㎍/g); (7) post-arthritis phase(PAP)에서 10nmol/g TIP1 처리군(PAP CIA-TIP1(10nmol/g). TIP1과 프레드니솔론은 식염수에 용해시켜 복강 내 주사하였고, 이와 함께 외관상 보이는 증상과 체중, 쥐의 울음소리, 발의 부피, 관절염 인덱스 등 행동발달 및 장애의 변화를 분석하였다. 그 결과를 도 19 및 도 20에 나타내었다.
도 19에 나타낸 바와 같이, TIP1을 처리하였을 경우 CIA 모델에 의해 심하게 부었던 발이 정상 쥐와 유사하게 완화됨을 육안으로 확인하였다. 또한, 도 20에 나타낸 바와 같이, TIP1가 관절염 유도에 의한 체중감소, 울음소리와 발의 부피 및 관절염 인덱스 증가를 기존 관절염 치료제인 프레드니솔론과 유사한 수준으로 억제함을 확인하였다.
또한, CIA 모델을 통해 관절염이 유도된 DAB-1J 쥐에 30일간 TIP1 및 프레드니솔론을 매일 1회 주사한 후 day 45에 마우스를 희생시켜 관절 조직을 샘플링하였다. 이후, Micro-CT(micro-computed tomography)를 통해 관절 조직의 3D 이미지 및 골밀도(BMD; born mineral density)를 분석하였다. 또한, 쥐의 무릎관절 부위를 이용하여 Hematoxylin and eosin(H&E) 염색을 하고 연골(cartilage), 연골 하골(subchondral bone), 대퇴골(femur), 경골(tibia), 메니스커스(meniscus)에서 활막 과다 증식증(synovial hyperplasia)의 변화를 관찰하였다. 그 결과를 도 21 및 도 22에 나타내었다.
도 21과 도 22에 나타낸 바와 같이, TIP1을 처리하였을 경우, CIA 모델에 의해 손상된 뼈가 정상 쥐와 유사하게 완화되고 연골(C), 연골 하골(S), 대퇴골(F), 경골(T), 메니스커스(M)의 조직병리학적 변형 역시 감소함을 확인하였다. 이를 통해 본 발명에 따른 TIP1은 TLR4 신호전달경로를 효과적으로 억제함에 따라 류마티스 관절염을 비롯한 다양한 급성 또는 만성 염증성 질환의 치료제로서 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
실험예 12. TIP1에 의한 루푸스 마우스 모델에서의 치료 효과
전신 홍반 루푸스(Systemic lupus erythematosus; SLE) 마우스 모델을 이용하여 전신 자가면역에서의 TIP1의 치료 효능을 평가하였다.
초기 체중이 18-20g인 세 마리의 암컷 야생형 마우스(C57BL/6)와 초기 체중이 38-40g인 세 마리의 루푸스에 걸린(lupus-prone) 마우스(MRL/lpr)를 Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME, USA)로부터 구입하였다. 모든 동물 실험은 아주대학교 메디컬 센터 동물윤리위원회의 승인을 받아 진행하였다(Approval No. 2017-0022). 아주대학교 의과대학 동물실험실에서 발간된 가이드라인에 따라 마우스를 병원균이 없는 조건에서 사육시키면서 실험 전 일주일간 적응시켰다. 비히클(vehicle) 그룹의 마우스들은 1% DMSO를 복강 내 주사하였고, TIP1 처리 그룹의 마우스들은 1% DMSO에 용해된 TIP1을 매일 체중 g당 10nmol씩 20일간 복강 내 주사하였다. 처리기간 동안, 마우스의 체중을 측정하였다. 실험 종료 시점에, 마우스를 희생시키고, 혈액, 뇨 및 조직을 채집하였다. 1시간 동안 인큐베이션한 후에, 혈액 샘플을 혈청 분리 튜브에 채집하여 20℃, 3000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 그리고 나서, 혈청 샘플을 -80℃에 저장하였다. 채집된 뇨 샘플은 즉시 -80℃에 저장하였다. 조직을 신속하게 제거하고 PBS로 철저하게 세척한 후, RNA 안정화 용액(QIAGEN Sciences, Maryland, MD, USA)에 담갔다. 마우스 혈청에서 항 dsDNA 항체, 항핵항체(ANA) 및 C3 보체의 농도를 ELISA로 분석하였다. 구체적으로, 마우스의 뇨 알부민 수준을 마우스 알부민 ELISA 키트(41-ALBMS-E01, Alpco Diagnostics, Salem, NH, USA)로 제조자의 프로토콜에 따라 분석하였다. 샘플당 3회 측정하였다.
도 24에서 보는 바와 같이, 비히클-처리된 SLE 마우스 모델과 비교하여, TIP1을 처리한 SLE 마우스 모델에서 비장, 신장 및 림프절의 크기가 더 작았다. 또한, 비히클을 처리한 마우스와 비교하여 TIP1을 처리한 SLE 마우스에서 림프구 증식(lymphoproliferation)이 현저하게 억제되었다.
항 dsDNA 항체 및 항핵항체(ANA)의 농도를 분석한 결과, 항 dsDNA 항체 및 항핵항체가 TIP1을 처리하지 않은 SLE 마우스 모델(비히클 그룹)에서보다 TIP1을 처리한 SLE 마우스 모델에서 낮은 농도로 존재하였다(도 25a 및 도 25b 참조).
혈청에서 보체 성분의 농도가 낮은 것은 SLE의 흔한 마커인데, TIP1을 처리한 SLE 마우스 모델은 혈청에서 C3 보체 성분의 농도가 회복되었다(도 25c 참조).
뇨에서의 알부민 함량은 사구체 신염(glomerulonephritis)으로 불리우는 신장 병리학의 마커로서 작용한다. 도 25d에서 보는 바와 같이, TIP1을 처리한 SLE 마우스 모델은 뇨에서의 알부민 함량이 TIP1을 처리하지 않은 SLE 마우스 모델에서보다 상당히 감소하였다.
이상 살펴 본 바와 같이, TIP1은 루푸스 증상 관련 인자들을 효과적으로 조절하므로 루푸스를 예방 또는 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (10)

  1. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 루푸스 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 세포 투과성 펩타이드의 N-말단에 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 연결된 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 루푸스 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 융합 펩타이드는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 루푸스 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 루푸스는 전신 홍반 루푸스(Systemic lupus erythematosus; SLE), 원반모양 홍반 루푸스(discoid erythema lupus), 아급성 피부 홍반 루푸스(Subacute cutaneous lupus), 약물 유발 루푸스 또는 신생아 루푸스인, 루푸스 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 루푸스의 예방 또는 치료 방법.
  6. 루푸스의 예방 또는 치료를 위한 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 용도.
  7. 루푸스 예방 또는 치료용 조성물을 제조하기 위한 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 용도.
  8. 세포 투과성 펩타이드의 N-말단에 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 연결된 융합 펩타이드를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 루푸스의 예방 또는 치료 방법.
  9. 루푸스의 예방 또는 치료를 위한 세포 투과성 펩타이드의 N-말단에 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 연결된 융합 펩타이드의 용도.
  10. 루푸스 예방 또는 치료용 조성물을 제조하기 위한 세포 투과성 펩타이드의 N-말단에 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 연결된 융합 펩타이드의 용도.
PCT/KR2019/014728 2018-11-02 2019-11-01 Tlr 억제 펩타이드를 포함하는 루푸스 예방 또는 치료용 조성물 WO2020091513A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2018-0133679 2018-11-02
KR1020180133679A KR20200050715A (ko) 2018-11-02 2018-11-02 Tlr 억제 펩타이드를 포함하는 루푸스 예방 또는 치료용 조성물

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020091513A1 true WO2020091513A1 (ko) 2020-05-07

Family

ID=70462691

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2019/014728 WO2020091513A1 (ko) 2018-11-02 2019-11-01 Tlr 억제 펩타이드를 포함하는 루푸스 예방 또는 치료용 조성물

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR20200050715A (ko)
WO (1) WO2020091513A1 (ko)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120075457A (ko) * 2009-07-06 2012-07-06 옵소나 테라퓨틱스 리미티드 톨-유사 수용체 2에 대한 인간화 항체 및 이의 용도
US20130203649A1 (en) * 2012-02-07 2013-08-08 University Of Maryland, Baltimore Inhibitors of tlr signaling by targeting tir domain interfaces
US20140045759A1 (en) * 2010-11-04 2014-02-13 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Peptide compositions that downregulate tlr-4 signaling pathway and methods of producing and using same
KR20180122940A (ko) * 2017-05-04 2018-11-14 주식회사 젠센 톨-유사 수용체(tlr) 억제를 위한 펩타이드 및 이를 포함하는 약학적 조성물

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120075457A (ko) * 2009-07-06 2012-07-06 옵소나 테라퓨틱스 리미티드 톨-유사 수용체 2에 대한 인간화 항체 및 이의 용도
US20140045759A1 (en) * 2010-11-04 2014-02-13 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Peptide compositions that downregulate tlr-4 signaling pathway and methods of producing and using same
US20130203649A1 (en) * 2012-02-07 2013-08-08 University Of Maryland, Baltimore Inhibitors of tlr signaling by targeting tir domain interfaces
KR20180122940A (ko) * 2017-05-04 2018-11-14 주식회사 젠센 톨-유사 수용체(tlr) 억제를 위한 펩타이드 및 이를 포함하는 약학적 조성물

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DEVARAPU, S. K. ET AL: "Toll-like receptors in lupus nephritis", JOURNAL OF BIOMEDICAL SCIENCE, vol. 25, no. 35, 12 April 2018 (2018-04-12), XP055705412, DOI: 05570 10.1186/s12929-018-0436-2 *
LOIARRO, M. ET AL: "Targeting TLR/IL-1R Signalling in Human Diseases", MEDIATORS OF INFLAMMATION, vol. 2010, 2010, pages 674363, XP055401730 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20200050715A (ko) 2020-05-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2021010621A1 (ko) 자가면역질환 및 염증성질환 펩타이드 치료제
WO2015156649A1 (ko) 섬유증 억제 활성을 가지는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물
WO2018101708A1 (ko) 미토콘드리아를 포함하는 약학 조성물
WO2017078440A1 (ko) 신경세포 손실 예방 및 재생 효능을 가지는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물
WO2013169077A1 (ko) 악액질 예방 또는 치료용 조성물
CN111094321B (zh) 用于抑制Toll样受体(TLR)的肽和包含该多肽的药物组合物
WO2019212324A1 (ko) 멜리틴-기반 세포사멸 유발 펩타이드로 m2 유사 종앙관련 대식세포의 표적화
WO2018056706A1 (ko) 티오레독신 결합단백질 유래 펩타이드 또는 이를 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 함유하는 노화 줄기세포의 역노화용 조성물 및 이의 용도
WO2022191431A1 (ko) Kras 및 p53 유전자의 편집 기능이 있는 나노 리포좀 전달체 조성물
WO2011052883A2 (ko) Ｓｏｃｓ２ 유전자의 발현을 조절하여 자연 살해 세포를 활성화시키는 방법
WO2019147036A1 (ko) 뇌유래-신경영양인자를 발현하는 중간엽줄기세포 및 이의 용도
WO2021096275A1 (ko) 변형된 인터루킨-7 및 tgf 베타 수용체 ii를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도
WO2022220632A1 (ko) 세포 투과 펩티드, 항암 펩티드 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2018203613A1 (ko) 톨-유사 수용체(tlr) 억제를 위한 펩타이드 및 이를 포함하는 약학적 조성물
WO2017034244A1 (ko) 중추신경계 질환에 대한 예방 또는 치료효과를 갖는 펩타이드 및 이를 유효성분으로 하는 중추신경계 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물
WO2021177518A1 (ko) 혈중 콜레스테롤 저하용, 심혈관 대사질환의 예방 또는 치료용 및 항염용 약학적 조성물
WO2020159191A1 (ko) Mls-stat3를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2020091513A1 (ko) Tlr 억제 펩타이드를 포함하는 루푸스 예방 또는 치료용 조성물
WO2013176503A1 (ko) 타우 단백질 매개 신경 퇴행성 질환 치료제
WO2016027990A1 (ko) Ｄｕｓｐ５를 유효성분으로 모두 포함하는 골대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2019235876A1 (ko) C-src의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 시누클레인병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물
WO2020141704A1 (ko) Tlr4 신호전달 경로를 억제하는 펩타이드 및 그 용도
WO2010137770A1 (ko) 신규한 ｇｐｃｒ 단백질 및 이의 용도
WO2014109617A1 (ko) HtrA2 단백질을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2010021516A9 (ko) 뇌 손상 치료를 위한 리포칼린 2의 신규한 용도

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19880369

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

32PN Ep: public notification in the ep bulletin as address of the adressee cannot be established

Free format text: NOTING OF LOSS OF RIGHTS PURSUANT TO RULE 112(1) EPC

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 19880369

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1