ES2303363T3 - Dominios de union en proteina serrate. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA UN FRAGMENTO PRACTICAMENTE PURIFICADO DE UNA PROTEINA SERRATE, QUE SE CARACTERIZA POR SU CAPACIDAD DE UNIRSE IN VITRO, CUANDO SE EXPRESA SOBRE LA SUPERFICIE DE UNA PRIMERA CELULA, A UNA PROTEINA NOTCH, EXPRESADA SOBRE LA SUPERFICIE DE UNA SEGUNDA CELULA. SE DESCRIBEN ASIMISMO DERIVADOS Y ANALOGOS DE DICHO FRAGMENTO, CAPACES DE UNIRSE A UNA SEGUNDA PROTEINA SELECCIONADA A PARTIR DEL GRUPO QUE COMPRENDE PROTEINAS DE TIPO NOTCH, DELTA Y SERRATE. SE PRESENTAN TAMBIEN UNA SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICA PARA DICHA PROTEINA, ASI COMO VECTORES Y CELULAS RECOMBINANTES QUE LA CONTIENEN. POR ULTIMO, SE INCLUYE UN PROCEDIMIENTO DE PRODUCCION DE UN FRAGMENTO DE UNA PROTEINA SERRATE.

Description

Dominios de unión en proteína serrate.

Esta invención se hizo en parte con apoyo del gobierno, con los números de concesión GM 19093 y NS 26084, otorgados por el Departamento de Sanidad y Servicios Humanos. El gobierno tiene ciertos derechos sobre la invención.

1. Introducción

La presente invención se refiere a los genes humanos Notch y Delta y a sus productos codificados. La invención también se refiere a secuencias (denominadas de aquí en adelante "secuencias adhesivas") dentro de las proteínas codificadas por genes toporrítmicos que median en la unión homotípica o heterotípica a secuencias dentro de proteínas codificadas por genes toporrítmicos. Tales genes incluyen, pero no están limitados a Notch, Delta y
Serrate.

2. Antecedentes de la invención

Los análisis genéticos en Drosophila han sido extremadamente útiles para identificar la complejidad de las rutas de desarrollo y los loci interactuantes. Sin embargo, entender la naturaleza precisa de los procesos que sostienen las interacciones genéticas, requiere un conocimiento de las propiedades bioquímicas de los productos proteicos de los genes en cuestión.

Las mutaciones completas en uno cualquiera de los loci neurógenos cigóticos - Notch (N), Delta (Dl), mastermind (mam), Enhancer of Split (E(spl)), neuralized (neu) y big brain (bib) - dan como resultado una hipertrofia del sistema nervioso a expensas de las estructuras epidérmicas ventrales y laterales. Este efecto es debido a la desviación de la ruta de las células precursoras epidérmicas a una ruta neuronal, e implica que la función de los genes neurógenos es necesaria para diversificar células dentro de la región neurógena desde un destino neuronal a un destino epitelial. Estudios que determinaban los efectos de la ablación con láser de neuroblastos embrionarios específicos, en saltamontes (Doe y Goodman 1985, Dev. Biol. 111, 206-219) han mostrado que interacciones celulares entre neuroblastos y las células accesorias circundantes, sirven para inhibir que estas células accesorias adopten un destino de neuroblasto. Estas observaciones genéticas y embriológicas han conducido ambas a la hipótesis de que los productos proteicos de los loci neurógenos funcionan como componentes de un mecanismo de interacción celular necesario para el correcto desarrollo epidérmico (Artavanis-Tsakonas, 1988, Trends Genet. 4, 95-100).

Los análisis de secuencias (Wharton y col., 1985, Cell 43, 567-581; Kidd y col., 1986, Mol. Cell. Biol. 6, 3094-3108; Vassin y col., 1987, EMBO J. 6, 3431-3440; Kopczynski y col., 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735) han mostrado que dos de los loci neurógenos, Notch y Delta, parecen codificar proteínas transmembranales que abarcan la membrana de una sola vez. El gen Notch codifica una proteína de \sim300 kd (empleamos "Notch" para denominar esta proteína) con un dominio extracelular N-terminal extenso, que incluye 36 repeticiones en tándem similares al factor de crecimiento epidérmico (EGF), seguidas de otras tres repeticiones ricas en cisteína, denominadas repeticiones Notch/lin-12 (Wharton y col., 1985, Cell 43, 567-581; Kidd y col., 1986, Mol. Cell Biol. 6, 3094-3108; Yochem y col., 1988, Nature 335, 547-550). Delta codifica una proteína de \sim100 kd (empleamos "Delta" para denominar DLZM, el producto proteico de los transcritos cigóticos y maternos predominantes; Kopczynski y col., 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735) que tiene nueve repeticiones similares a EGF en su dominio extracelular (Vassin y col., 1987, EMBO J. 6, 3431-3440; Kopczynski y col., 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735). Aunque se conoce poco sobre la importancia funcional de estas repeticiones, el motivo similar a EGF se ha encontrado en una variedad de proteínas, incluyendo las implicadas en la cascada de la coagulación sanguínea (Furie y Furie, 1988, Cell 53, 505-518). En particular, este motivo se ha encontrado en proteínas extracelulares tales como los factores IX y X de la coagulación sanguínea (Rees y col., 1988, EMBO J. 7, 2053-2061; Furie y Furie, 1988, Cell 53, 505-518), en otros genes de Drosophila (Knust y col., 1987, EMBO J. 761-766; Rothberg y col., 1988, Cell 55, 1047-1059), y en algunas proteínas de receptores de la superficie celular, tales como el receptor de la trombomodulina (Suzuki y col., 1987, EMBO J. 6, 1891-1897) y el receptor de LDL (Sudhof y col., 1985, Science 228, 815-822). Se ha cartografiado un sitio de unión de proteína para el dominio de las repeticiones EGF en la trombomodulina y la uroquinasa (Kurosawa y col., 1988, J. Biol. Chem. 263, 5993-5996; Appella y col., 1987, J. Biol. Chem. 262, 4437-4440).

Se ha sido descrito un conjunto intrigante de interacciones entre las mutaciones de Notch y Delta (Vassin y col., 1985, J. Neurogenet. 2, 292-308; Shepard y col., 1989, Genetics 122, 429-438; Xu y col., 1990, Genes Dev., 4, 464-475). Numerosos estudios genéticos (resumidos en Alton y col., 1989, Dev. Genet. 10, 261-272) han indicado que las dosis génicas de Notch y Delta en relación la una con la otra, son cruciales para el desarrollo normal. Una reducción del 50% de la dosis de Delta en un fondo Notch de tipo silvestre, provoca una extensión de las venas de las alas creando un "delta" en la base (Lindsley y Grell, 1968, Publication Number 627, Washington, D.C., Carnegie Institute of Washington). Un fenotipo similar es causado por un incremento del 50% de la dosis de Notch en un fondo Delta de tipo silvestre (un fenotipo de "confluencia"; Welshons, 1965, Science, 150, 1122-1129). Este fenotipo Delta se suprime parcialmente mediante una reducción de la dosis de Notch. Un trabajo reciente en nuestros laboratorios, ha mostrado que interacciones letales entre alelos que se correlacionan con alteraciones en las repeticiones similares a EGF en Notch, se pueden recuperar reduciendo las dosis de Delta (Xu y col., 1990, Genes Dev. 4, 464-475). Xu y col., (1990, Genes Dev. 4, 464-475) encontraron que mutaciones completas en Delta o mam suprimen las interacciones letales entre combinaciones heterocigotas de ciertos alelos Notch, conocidas como las mutaciones Abruptex (Ax). Los alelos Ax están asociados con mutaciones sin sentido dentro de las repeticiones similares a EGF del dominio extracelular de Notch (Kelley y col., 1987, Cell 51, 539-548; Hartley y col., 1987, EMBO J. 6, 3407-3417).

Notch se expresa en los procesos axonales durante el crecimiento de neuronas embrionarias (Johansen y col., 1989, J. Cell Biol. 109, 2427-2440; Kidd y col., 1989, Genes Dev. 3, 1113-1129).

Un estudio ha mostrado que ciertos alelos Ax de Notch pueden alterar gravemente la determinación de la ruta axonal durante el crecimiento neuronal sensitivo en los discos imaginales, aunque no se conoce hasta la fecha si la expresión de Notch aberrante es la responsable de este defecto en el axón mismo o en el epitelio a lo largo del cual crece (Palka y col., 1990, Development 109, 167-175).

3. Sumario de la invención

La presente invención proporciona un fragmento sustancialmente purificado de una proteína serrate según la reivindicación 1 o la reivindicación 3, una proteína quimérica según la reivindicación 5 o la reivindicación 7, un derivado de un fragmento según la reivindicación 6, un ácido nucleico sustancialmente purificado según la reivindicación 8, un vector de ácido nucleico según la reivindicación 9, una células según la reivindicación 10, un anticuerpo según la reivindicación 11 y un método según la reivindicación 13.

La invención se refiere a secuencias de nucleótidos de los genes Notch y Delta humanos, y a secuencias de aminoácidos de sus proteínas codificadas, así como a fragmentos de las mismas que contienen un determinante antigénico o que son funcionalmente activos. La invención también se refiere a fragmentos (denominados en esta memoria "fragmentos adhesivos") y a secuencias de los mismos, de las proteínas ("proteínas toporrítmicas") codificadas por genes toporrítmicos que median en la unión homotípica o heterotípica a proteínas toporrítmicas. Los genes toporrítmicos, tal y como se emplean en esta memoria, se refieren a los genes Notch, Delta y Serrate, así como a otros miembros de la familia Delta/Serrate que se pueden identificar, por ejemplo, mediante métodos descritos en la Sección 5.3, más abajo. También se describen adicionalmente análogos y derivados de los fragmentos adhesivos que conservan actividad de unión. Se describen adicionalmente anticuerpos para Notch humana y para fragmentos adhesivos.

El fragmento adhesivo de Notch es el fragmento que comprende la secuencia de Notch más homóloga a las repeticiones similares a EGF 11 y 12 de Notch de Drosophila; el fragmento adhesivo de la unión heterotípica mediada por Delta, es el fragmento que comprende la secuencia más homóloga con los aminoácidos 1-230 de Delta de Drosophila; el fragmento adhesivo de la unión homotípica mediada por Delta, es el fragmento que comprende la secuencia más homóloga a los aminoácidos 32-230 de Delta de Drosophila; y el fragmento adhesivo de Serrate es el fragmento que comprende la secuencia más homóloga a los aminoácidos 85-283 o 79-282 de Serrate de Drosophila.

3.1 Definiciones

Tal y como se emplea en esta memoria, las siguientes expresiones deben tener los significados indicados:

AA

= aminoácido

EGF

= factor de crecimiento epidérmico

ELR

= repetición similar a EGF (homóloga)

IC

= intracelular

PCR

= reacción en cadena de la polimerasa

Tal y como se emplea en esta memoria, el subrayar el nombre de un gen debe indicar al gen, en contraposición con su producto proteico codificado, que se indica con el nombre del gen sin ningún subrayado. Por ejemplo, "Notch" debe significar el gen Notch, mientras que "Notch" debe indicar el producto proteico del gen Notch.

4. Descripción de las figuras

Figura 1. Estructuras Artificiales para la Expresión y Diseño Experimental para Examinar las Interacciones Notch-Delta. Se transfectaron de forma transitoria células S2 en la fase de crecimiento logarítmico con una de las tres estructuras artificiales mostradas. Notch codificada por el minigen MGlla (una estructura artificial quimérica de ADNc/genómico: secuencias obtenidas a partir de ADNc se representan con un punteado, secuencias obtenidas genómicamente se representan con un rayado diagonal (Ramos y col., 1989, Genetics 123, 337-348)) se expresó después de la inserción en el vector promotor de la metalotioneína pRmHa-3 (Bunch y col., 1988, Nucl. Acids Res. 16, 1043-1061). Delta codificada por el ADNc Dl1 (Kopczynski y col., 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735) se expresó después de insertar en el mismo vector. La variante de Notch extracelular (ECN1) se obtuvo a partir de un cósmido genómico que contenía el locus completo de Notch (Ramos y col., 1989, Genetics 123, 337-348) deleccionando la secuencia codificadora de los aminoácidos 1790-2625 del dominio intracelular (indicado por \delta; Wharton y col., 1985, Cell 43, 567-581), dejando 25 residuos proximales a la membrana de la secuencia de tipo silvestre, fusionados con una cola de 59 aminoácidos nuevos (véase, Procedimientos Experimentales, Sección 6.1, más abajo). Esta estructura artificial se expresó bajo control de la región promotora de Notch. Para las estructuras artificiales que implicaban el vector de la metalotioneína, la expresión se indujo con CuSO_{4}, seguida de transfección. Las células se mezclaron a continuación, se incubaron bajo condiciones de agregación y se marcaron por su capacidad de agregación, empleando antisueros específicos y microscopía de inmunofluorescencia para visualizar las células con expresión. MT, promotor de metalotioneína; ATG, sitio de inicio de la traducción; TM, dominio transmembranal; 3' N, señal de poliadenilación del gen Notch; 3' Adh, señal de poliadenilación del gen Adh, 5' N, región promotora del gen Notch.

Figura 2. Expresión de Notch y Delta en Células Cultivadas. (A) Material lisado de células no transfectadas (S2) y de células transfectadas con Notch (N), inducidas con CuSO_{4} 0,7 mM, durante 12-16 h, se prepararon para electroforesis en gel de dodecil-sulfato sódico y poliacrilamida (SDS-PAGE), realizada en geles con gradiente de 3%-15%, y se realizó la transferencia a nitrocelulosa. Notch se visualizó empleando un anticuerpo monoclonal (MAb C17.9C6) contra el dominio intracelular de Notch. Bandas múltiples por debajo de la banda principal de 300 kd, pueden representar productos de degradación de Notch. (B) Material lisado de células no transfectadas (S2) y células transfectadas con Delta (Dl) se visualizaron con un anticuerpo monoclonal (MAb 201) contra Delta. Se detecta una banda aislada de \sim105 kd. En ambos casos, no hay Notch o Delta endógeno detectable en la línea celular S2, ni son especies con reactividad cruzada. En cada pista, se cargaron 10 \mul de muestra (preparada según se describe en Procedimientos Experimentales).

Figura 3. Células S2 Que Expresan Notch y Delta Forman Agregados. En todos los paneles, Notch se muestra de color verde y Delta en rojo.

(A) Una célula aislada Notch^{+}. Nótese la tinción intracelular visible, que incluye estructuras vesiculares así como un núcleo evidentemente sin teñir.

(A) Micrografía sobre fondo claro del mismo fondo, que muestra especificidad de la tinción del anticuerpo.

(B) Una célula aislada Delta^{+}. La tinción está principalmente en la superficie celular.

(B) Micrografía de fondo claro del mismo fondo.

(C) Agregado de células Delta^{+} procedentes de un experimento de agregación de 24 h. Nótese de nuevo que la tinción está principalmente en la superficie celular.

(D)-(F) Un agregado de células Notch^{+} y Delta^{+} formado a partir de una mezcla 1:1 de poblaciones celulares transfectadas una vez, que se dejaron agregar durante una noche a temperatura ambiente. (D) muestra células Notch^{+} en este agregado; (E) muestra células Delta^{+} y (F) es una exposición doble que muestra ambos tipos de células. Las bandas de Notch y Delta son prominentes en los puntos de contacto entre las células Notch^{+} y Delta^{+} (flechas). En (F), estas bandas aparecen de color amarillo debido a la coincidencia de verde y rojo en estos puntos. La célula aislada aparentemente con tinción doble (^{\bullet}) es realmente dos células (una encima de la otra), una expresa Notch y la otra Delta.

(G) y (H) Micrografías confocales con seudocolor de agregados de células Notch^{+}-Delta^{+}. Nótese que en (G) las extensiones (flechas) formadas por al menos dos células Delta^{+}, circundan completamente la célula Notch^{+} en el centro del agregado. (H) muestra un agregado formado a partir de un experimento de agregación durante 2 h, realizado a 4ºC. Bandas intensas de Notch son evidentes dentro de regiones de contacto con células Delta^{+}.

(I) Un agregado compuesto por células Delta^{+} y células que expresan sólo el dominio extracelular de Notch (estructura artificial ECN1). Varilla graduada = 10 \mum. Figura 4. Notch y Delta están Asociadas en Células Cotransfectadas. La tinción de Notch se muestra en la columna izquierda (A, C y E) y la de Delta se muestra en la columna derecha (B, D y F).

(A) y (B) Célula S2 cotransfectada con ambas estructuras artificiales Notch y Delta. En general, había una buena correlación entre la localización de Notch y Delta en la superficie celular (flechas).

(C) y (D) Células cotransfectadas se expusieron a un antisuero policlonal anti-Notch (una dilución 1:250 de cada antisuero del dominio anti-extracelular) durante 1 h a temperatura ambiente antes de la fijación y la tinción con antisueros específicos. Nótese la tinción punteada de Notch y Delta y la correlación de su tinción respectiva (flechas).

(E) y (F) Células cotransfectadas con las estructuras artificiales de Notch (ECN1) y Delta, inducidas y después cultivadas en parches empleando antisueros policlonales anti-Notch. Había una estrecha correlación entre la tinción de ECN1 y Delta en la superficie, tal y como se observaba para Notch de longitud completa. Varilla graduada = 10 \mum.

Figura 5. La Coinmunoprecipitación Muestra que Delta y Notch están Asociadas en Material Lisado procedente de Células S2 Transfectadas y Células Embrionarias de Drosophila. En todos los experimentos, Delta se precipitó a partir del material lisado con NP-40/desoxicolato empleando un antisuero policlonal anti-Delta de rata, precipitado con células fijadas con Staph A, y se visualizaron proteínas en la fracción precipitada con transferencias de tipo Western (para detalles, véanse los Procedimientos Experimentales). Pistas 1, 2, 3 y 5: Notch visible con MAb C17.9C6; pistas 4 y 6: Delta visible empleando MAb 201.

En (A), las pistas 1 y 2 eran testigos para estos experimentos. La pista 1 muestra una inmunoprecipitación con anti-Delta policlonal de células que expresan Notch, sólo hecha visible para Notch. No se podía detectar Notch es esta muestra, indicando que el anti-Delta policlonal no tenía reacción cruzada con Notch. La pista 2 muestra células cotransfectadas con Notch/Delta, inmunoprecipitadas con Staph A sin tratamiento inicial con antisuero anti-Delta y hechas visibles para Notch, demostrando que Notch no precipita inespecíficamente con Staph A o con anticuerpo secundario. La pista 3 muestra proteína precipitada con antisuero anti-Delta hecha visible para Delta (Dl), y la pista 4 muestra la misma muestra hecha visible para Notch (N). La pista 4 muestra que Notch coprecipita con Delta inmunoprecipitada. Nótese que Notch aparece como un doblete, lo que es típico de Notch en inmunoprecipitados.

(B) muestra el mismo experimento empleando material lisado embrionario más que material lisado de células transfectadas. La pista 5 muestra proteína precipitada con antisuero anti-Delta hecho visible para Delta (Dl), y la pista 6 muestra la misma muestra hecha visible para Notch (N). Estas pistas demuestran que Notch y Delta están asociadas de forma estable en material lisado embrionario. Las bandas (en todas las pistas) por debajo de la banda de Delta son de Staph A (SA) y las cadenas pesada (H) y ligera (L) del antisuero anti-Delta.

Figura 6. Estructuras Artificiales para la Expresión de Notch y Cartografía de la Deleción del Dominio de Unión de Delta/Serrate. Células S2 en la fase de crecimiento logarítmico se transfectaron transitoriamente con la serie de estructuras artificiales de expresión mostradas; los dibujos representan los productos proteicos pronosticados de los distintos mutantes creados por deleción de Notch. Todas las estructuras artificiales de expresión se obtuvieron a partir de la estructura artificial nº 1 pMtNMg. Las células transfectadas de forma transitoria se mezclaron con células que expresaban Delta, procedentes de la línea transformada de forma estable L49-6-7 o con células que expresaban Serrate transfectadas de forma transitoria, se indujeron con CuSO_{4}, se incubaron bajo condiciones de agregación y a continuación se marcaron por su capacidad de agregarse empleando antisueros específicos y microscopía de inmunofluorescencia. Los agregados se definieron como agrupaciones de cuatro o más células que contenían ambas células que expresaban Notch y Delta/Serrate. Los valores dados para el % de agregación se refieren al porcentaje de todas las células que expresan Notch encontradas en tales agrupaciones tanto con Delta (D1) (columna izquierda) como con Serrate (Ser) (columna derecha). Las distintas estructuras artificiales de la deleción de Notch se representan en un diagrama con líneas de empalme que indican los puntos de unión de la ligación. Cada repetición EGF se representa por un rectángulo punteado y los números de las repeticiones EGF se marcan en cada lado de un punto de unión de ligación. En los puntos de unión de la ligación, las repeticiones EGF parciales producidas por distintas deleciones, se indican por rectángulos blancos y por corchetes negros (por ejemplo, véase nº 23 \DeltaCla+EGF(10-12)). Las estructuras artificiales nº 3-13 representan la serie de deleciones de ClaI. Tal y como se muestra en el diagrama, cuatro de los sitios ClaI, en las repeticiones 7, 9, 17 y 26, rompen la repetición en el centro, inmediatamente después de la tercera cisteína (indicada por repeticiones con un rectángulo blanco; véase Figura 7 para una mayor clarificación), mientras que la quinta y casi todo el sitio 3' se rompe limpiamente entre las repeticiones EGF 30 y 31 (indicadas por la repetición 31 con un rectángulo negro; véase de nuevo la Figura 7). En la estructura artificial nº 15 split, la repetición EGF 14 que es portadora de la mutación puntual split, se representa por un rectángulo rayado. En la estructura artificial nº 33 \DeltaCla+XEGF(10-13), las repeticiones EGF obtenidas a partir de Notch de Xenopus, se distinguen de las repeticiones de Drosophila por un patrón diferente de sombreado. SP, péptido señal; EGF, repetición del factor de crecimiento epidérmico; N, repetición Notch/lin-12; TM, dominio transmembranal; cdc10, repeticiones cdc10/anquirina; PA, secuencia de consenso de unión a nucleótido putativo; opa, extensión de poliglutamina denominada opa; Dl, Delta; Ser, Serrate.

Figura 7. Estructura Detallada de las Estructuras Artificiales de Deleción de Notch nº 19-24: Ambas Repeticiones EGF 11 y 12 son Necesarias para la Agregación de Notch-Delta. Las repeticiones EGF 10-13 se muestran en forma de diagrama en la parte superior, mostrando la separación regular de los seis residuos de cisteína (C). Productos de la PCR, generados para estas estructuras artificiales (los nombres y los números se proporcionan en la Figura 6) se representan por las líneas negras oscuras y los puntos finales exactos se indican en relación con las distintas repeticiones EGF. La capacidad para agregarse con Delta se registra como (+) o (-) para cada estructura artificial. Los fragmentos de PCR, o bien rompen las repeticiones EGF en el centro, justo después de la tercera cisteína, en el mismo lugar que cuatro de los cinco sitios de ClaI, o bien exactamente entre dos repeticiones en el mismo lugar que la mayoría del sitio de ClaI más C-terminal.

Figura 8. Comparación de la Secuencia de Aminoácidos de las Repeticiones EGF 11 y 12 procedentes de Notch de Drosophila y de Xenopus. La secuencia de aminoácidos de las repeticiones EGF 11 y 12 de Notch de Drosophila (Wharton y col., 1985, Cell 43:567-581; Kidd y col., 1986, Mol. Cell Biol. 6:3094-3108) se alinean con las de las dos mismas repeticiones EGF procedentes de Notch de Xenopus (Coffman y col., 1990, Science 249:1438-1441). Los aminoácidos idénticos están incluidos en rectángulos. Los seis residuos conservados de cisteína de cada repetición EGF y los residuos de consenso de unión a Ca^{++} (Rees y col., 1988, EMBO J. 7:2053-2061) se marcan con un asterisco (*). El cambio de leucina a prolina encontrado en el clon de PCR de Xenopus que fallaba en la agregación, se indica abajo.

Figura 9. Estructuras Artificiales Empleadas en este Estudio. Se muestran diagramas esquemáticos de las variantes de Delta definidas en la Tabla IV. El extremo amino-proximal, extracelular está en cada caso a la izquierda. S, péptido señal; "EGF", motivos similares a EGF; M, hélice que atraviesa la membrana; H, secuencia de transferencia de detención; líneas continuas, otras secuencias de Delta; líneas sombreadas, secuencias de neuroglía. Las puntas de flecha indican sitios de inserción de engarces traducibles. Sca, ScaI; Nae, NaeI; Bam, BamHI; Bgl, BglII; ERL, repetición similar a EGF; Bst, BstEII; Dde, DdeI; Stu, StuI; NG1-NG5, quimeras de Delta de neuroglía.

Figura 9A. Dependencia de la Agregación de las Cantidades Aportadas de ADN. A, Agregación heterotípica observada utilizando poblaciones de células S2 transfectadas transitoriamente, respectivamente, con cantidades variadas de ADN de pMTDl1 (2, 4, 10 o 20 \mug/placa) que se incubaron posteriormente bajo condiciones de agregación con poblaciones de células S2 transfectadas transitoriamente con una cantidad constante de ADN de pMtNMg (20 \mug/placa). Los datos presentados son la fracción media (%) de células Delta en agregados de cuatro o más células \pm error típico para cada cantidad de ADN aportada (N = 3 duplicados, excepto aportaciones de 2 \mug y 10 \mug para las cuales N = 2). Se contaron un mínimo de 100 células que expresan Delta para cada duplicado. B, Agregación homotípica observada utilizando poblaciones de células S2 transfectadas transitoriamente, respectivamente, con cantidades variadas de ADN de pMTDl1 (2, 4, 10 o 20 \mug/placa) que se incubaron a continuación bajo condiciones de agregación. Los datos presentados son la fracción media (%) de células Delta en agregados de cuatro o más células \pm error típico para cada cantidad de ADN aportada (N = 3 duplicados). Se contó un mínimo de 500 células que expresan Delta para cada duplicado.

Figura 10. Alineación de la Secuencia Amino-Terminal de Delta-Serrate. Los residuos se numeran en base a la traducción conceptual de las secuencias que codifican Delta (Dl secuencia superior (SEQ ID NO:3); que comienza en el aminoácido 24, termina en el aminoácido 226) y Serrate (Ser, secuencia inferior (SEQ ID NO:4); que comienza en el aminoácido 85, termina en el aminoácido 283). Las líneas verticales entre las dos secuencias indican residuos que son idénticos dentro de las secuencias de Delta y Serrate, tal y como están alineadas. Los puntos representan intersticios en la alineación. Los rectángulos incluyen residuos de cisteína dentro de las regiones alineadas. N1, dominio 1 amino-proximal; N2, dominio 2 amino-proximal; N3, dominio 3 amino-proximal. Las inserciones traducibles asociadas con las estructuras artificiales STU B [sustitución del aminoácido 132 (A) de Delta por GKIFP] y NAE B [inserción de RKIF entre el aminoácido 197 de Delta y el aminoácido 198], respectivamente, se describen encima de la secuencia de Delta de tipo silvestre.

Figura 11. Geometrías Potenciales de las Interacciones Delta-Notch. A, Registro potencial de las moléculas Delta (izquierda) y Notch (derecha) que interaccionan entre membranas plasmáticas opuestas. B, Registro potencial de moléculas Delta (izquierda) y Notch (derecha) que interaccionan dentro de las mismas membranas plasmáticas. ELR, repetición similar a EGF; rectángulos blancos, repeticiones similares a EGF; rectángulos punteados, repeticiones LNR; rectángulos negros, hélices que atraviesan la membrana. El dominio amino-terminal de Delta y los dominios intracelulares de Delta y Notch están representados por óvalos.

Figura 12. Geometrías Potenciales de Interacciones Delta-Delta. A y B, Registro potencial de moléculas Delta que interaccionan entre membranas plasmáticas opuestas. B, Registro potencial de moléculas Delta que interaccionan dentro de las mismas membranas plasmáticas. Rectángulos blancos, repeticiones similares a EGF; rectángulos negros, hélices que atraviesan la membrana. Los dominios amino-terminales extracelulares e intracelulares de Delta están representados por óvalos.

Figura 13. Secuencia Primaria de Nucleótidos del ADNc de Dl1 de Delta (SEQ ID NO:5) y secuencia de aminoácidos de Delta (SEQ ID NO:6). Se muestra la secuencia de ADN de la hebra 5'-3' del ADNc de Dl1, que contiene una cantidad de correcciones en comparación con la presentada por Kopczynski y col. (1988, Genes Dev. 2, 1723-
1735).

Figura 14. Secuencia Primaria de Nucleótidos de ADNc de Neuroglía 1B7A-250 (SEQ ID NO:7). Esta es una secuencia de ADN de una parte de la hebra 5'-3' del ADNc de 1B7A-250 (A.J. Bieber, pers. com.; Hortsch y col., 1990, Neuron 4, 697-709). El nucleótido 2890 se corresponde con el primer nucleótido de un codón de isoleucina que codifica el aminoácido 952 de la proteína de forma larga de neuroglía, traducida conceptualmente.

Figura 15. Homologías de la Secuencia de Ácidos Nucleicos entre Serrate y Delta. Se muestra una parte de la secuencia de nucleótidos de Serrate de Drosophila (SEQ ID NO:8), con la secuencia codificada de la proteína Serrate (SEQ ID NO:9) escrita a continuación, (Fleming y col., 1990, Genes & Dev. 4, 2188-2201 en 2193-94). Las cuatro regiones que muestran una alta homología de secuencia con la secuencia de Delta de Drosophila, se numeran por encima de la línea y se indican entre corchetes. La región total de homología abarca los nucleótidos números 627 hasta 1290 de la secuencia de nucleótidos de Serrate (numeración como en la Figura 4 de Fleming y col., 1990, Genes & Dev. 4, 2188-2201).

Figura 16. Cebadores empleados para PCR en la Clonación de Notch Humana. Se muestra la secuencia de los tres cebadores empleados en la PCR para multiplicar el ADN en una genoteca de ADNc de cerebro fetal humano. Los tres cebadores, cdc1 (SEQ ID NO:10), cdc2 (SEQ ID NO:11) y cdc3 (SEQ ID NO:12), se diseñaron para multiplicar tanto un fragmento de 200 pb como un fragmento de 400 pb en forma de parejas de cebadores cdc1/cdc2 o cdc1/cdc3, respectivamente. I: inosina.

Figura 17. Diagrama Esquemático de los Clones de Notch Humana. Se muestra un diagrama esquemático de Notch humana. Líneas muy negras por debajo del diagrama muestran la parte de la secuencia de Notch contenida en cada uno de los cuatro clones de ADNc. La localización de los cebadores empleados en la PCR, y su orientación, se indica con flechas.

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Figura 18. Secuencias de Notch Humana Alineadas con la Secuencia de Notch de Drosophila. Las líneas verticales numeradas se corresponden con las coordenadas de Notch de Drosophila. Las líneas horizontales por debajo de cada mapa muestran donde se encuentran los clones en relación con extensiones de secuencia (líneas gruesas horizontales).

Figura 19. Secuencias de Nucleótidos de Notch Humana Contenidas en el Clon de ADNc Plasmídico hN2k. Figura 19A: La secuencia de ADN (SEQ ID NO:13) de una parte de la inserción de Notch humana se muestra, empezando por el sitio EcoRI en el extremo 3' y procediendo en la dirección 3' a 5'. Figura 19B: La secuencia de ADN (SEQ ID NO:14) de una parte de la inserción de Notch humana se muestra, comenzando por el sitio EcoRI en el extremo 5' y procediendo en la dirección 5' a 3'. Figura 19C: La secuencia de ADN (SEQ ID NO:15) de una parte de la inserción de Notch humana se muestra, comenzando en 3' de la secuencia mostrada en la Figura 19B y procediendo en la dirección 5' a 3'. Las secuencias mostradas son tentativas, están sujetas a confirmación por determinación de las secuencias de solapantes.

Figura 20. Secuencias de Nucleótidos de Notch Humana Contenidas en el Clon de ADNc de Plásmido hN3k. Figura 20A: La secuencia de ADN (SEQ ID NO:16) de una parte de la inserción de Notch humana se muestra, comenzando por el sitio EcoRI en el extremo 3' y procediendo en la dirección 3' a 5'. Figura 20B: La secuencia de ADN (SEQ ID NO:17) de una parte de la inserción de Notch humana se muestra, comenzando por el sitio EcoRI en el extremo 5' y procediendo en la dirección 5' a 3'. Figura 20C: La secuencia de ADN (SEQ ID NO:18) de una parte de la inserción de Notch humana se muestra, comenzando en 3' de la secuencia mostrada en la Figura 20B, y procediendo en la dirección 5' a 3'. Figura 20D: La secuencia de ADN (SEQ ID NO:19) de una parte de la inserción de Notch humana se muestra, comenzando 5' de la secuencia mostrada en la Figura 20A y procediendo en la dirección 3' a 5'. Las secuencias mostradas son tentativas, están sujetas a confirmación por determinación de las secuencias solapantes.

Figura 21. Secuencias de Nucleótidos de Notch Humana Contenidas en el Clon de ADNc Plasmídico hN4k. Figura 21A: La secuencia de ADN (SEQ ID NO:20) de una parte de la inserción de Notch humana se muestra, comenzando en el sitio EcoRI en el extremo 5' y procediendo en la dirección 5' a 3'. Figura 21B: La secuencia de ADN (SEQ ID NO:21) de una parte de la inserción de Notch humana se muestra, comenzando cerca del extremo 3', y procediendo en la dirección 3' a 5'. Las secuencias mostradas son tentativas y están sujetas a confirmación por determinación de las secuencias solapantes.

Figura 22. Secuencias de Nucleótidos de Notch Humana Contenidas en el Clon de ADNc de Plásmido hN5k. Figura 22A: La secuencia de ADN (SEQ ID NO:22) de una parte de la inserción de Notch humana se muestra, partiendo del sitio EcoRI en el extremo 5' y procediendo en la dirección 5' a 3'. Figura 22B: La secuencia de ADN (SEQ ID NO:23) de una parte de la inserción de Notch humana se muestra, partiendo cerca del extremo 3' y procediendo en la dirección 3' a 5'. Figura 22C: La secuencia de ADN (SEQ ID NO:24) de una parte de la inserción de Notch humana se muestra, partiendo en 3' de la secuencia mostrada en la Figura 22A, y procediendo en la dirección 5' a 3'. Figura 22D: La secuencia de ADN (SEQ ID NO:25) de una parte de la inserción de Notch humana se muestra, comenzando 5' de la secuencia mostrada en la Figura 22B y procediendo en la dirección 3' a 5'. Las secuencias mostradas son tentativas, están sujetas a confirmación por determinación de las secuencias solapantes.

Figura 23. Secuencias de ADN (SEQ ID NO:31) y Aminoácidos (SEQ ID NO:34) de Notch Humana Contenidas en el Clon de ADNc de Plásmido hN3k.

Figura 24. Secuencias de ADN (SEQ ID NO:33) y Aminoácidos (SEQ ID NO:34) de Notch Humana Contenidas en el Clon de ADNc de Plásmido hN5k.

Figura 25. Comparación de hN5k con otros Homólogos de Notch. Figura 25A. Representación esquemática de Notch de Drosophila. Se indican la secuencia señal (señal), las 36 repeticiones similares a EGF, las tres repeticiones Notch/lin-12, el dominio transmembranal (TM), las seis repeticiones cdc10, la repetición OPA y la región rica en PEST (prolina, ácido glutámico, serina, treonina). Figura 25B. Alineación de la secuencia de aminoácidos deducidos de hN5k con secuencias de otros homólogos de Notch. Los aminoácidos se numeran en el lado izquierdo. Las regiones cdc10 y las regiones ricas en PEST están ambas enmarcadas por rectángulos y las repeticiones individuales cdc10 están marcadas. Los aminoácidos que son iguales en tres o más secuencias, están iluminados. Los cebadores utilizados para clonar hN5k se indican debajo de las secuencias a partir de las cuales fueron diseñados. La secuencia de localización nuclear (NLS), los sitios de la quinasa de caseína II (CKII) y la quinasa cdc2 (cdc2) del motivo CcN putativo de los homólogos de Notch de vertebrados están enmarcados por rectángulos. La posible secuencia bipartita de dirección al núcleo (BNTS) y los sitios de fosforilación proximales de Notch de Drosophila, también están enmarcados por rectángulos.

5. Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a secuencias de nucleótidos de los genes Notch y Delta humanos, y a secuencias de aminoácidos de sus proteínas codificadas. La invención también se refiere adicionalmente a fragmentos (denominados en esta memoria "fragmentos adhesivos") de las proteínas codificadas por genes toporrítmicos que median en la unión homotípica o heterotípica a proteínas toporrítmicas o a sus fragmentos adhesivos. Los genes toporrítmicos, tal y como se emplean en esta memoria, deben significar los genes Notch, Delta y Serrate, así como otros miembros de la familia Delta/Serrate que se pueden identificar, por ejemplo, por los métodos descritos en la Sección 5.3, más abajo.

Las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos y los anticuerpos para las mismas de la invención, se pueden utilizar para detectar y cuantificar el ARNm de moléculas de Notch y Delta humanas y moléculas adhesivas, para estudiar su expresión, para producir secuencias de Notch y Delta humanas y secuencias adhesivas, en el estudio y en la manipulación de procesos de diferenciación.

Para mayor claridad en la descripción, y no a modo de limitación, la descripción detallada de la invención se dividirá en las subsecciones siguientes:

(i)

La identificación de dominios de proteínas toporrítmicas y las secuencias de dominios de proteínas toporrítmicas que median en la unión a dominios de proteínas toporrítmicas;

(ii)

La clonación y la secuenciación de Notch y Delta humanas;

(iii)

La identificación de miembros adicionales de la familia Delta/Serrate;

(iv)

La expresión de genes toporrítmicos;

(v)

La identificación y la purificación del producto génico expresado; y

(vi)

La generación de anticuerpos para proteínas toporrítmicas y sus secuencias adhesivas.

5.1 Identificación de los dominios de proteínas toporrítmicas y las secuencias de dominios de proteínas toporrítmicas que median en la unión a dominios de proteínas toporrítmicas

La invención describe fragmentos de proteínas toporrítmicas y sus análogos o sus derivados, que median en la unión homotípica o heterotípica (y que, por tanto, se denominan en esta memoria "adhesivos"), y las secuencias de ácidos nucleicos relacionadas con los anteriores.

El fragmento adhesivo de Notch es el que comprende la parte de Notch más homóloga con ELR 11 y 12, es decir, los aminoácidos número 447 hasta 527 (SEQ ID NO:1) de la secuencia de Notch de Drosophila (véase Figura 8). El fragmento adhesivo de Delta que media en la unión homotípica es el que comprende la parte de Delta más homóloga con aproximadamente los aminoácidos número 32-230 de la secuencia de Delta de Drosophila (SEQ ID NO:6). El fragmento adhesivo de Delta que media en la unión a Notch, es el que comprende la parte de Delta más homóloga con aproximadamente los aminoácidos número 1-230 de la secuencia de Delta de Drosophila (SEQ ID NO:6). En una realización específica relacionada con un fragmento adhesivo de Serrate, dicho fragmento es el que comprende la parte de Serrate más homóloga con aproximadamente los aminoácidos número 85-283 o 79-282 de la secuencia de Serrate de Drosophila (véanse, la Figura 10 (SEQ ID NO:4) y la Figura 15 (SEQ ID NO:9)).

Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican dominios adhesivos toporrítmicos se pueden aislar a partir de animales porcinos, bovinos, felinos, aviares, equinos o caninos, así como a partir de fuentes de primates y cualquier otra especie en la que se pueden identificar homólogos de genes toporrítmicos conocidos [que incluyen, pero no limitados a los mismos, los siguientes genes (con la publicación de las secuencias entre paréntesis): Notch (Wharton y col., 1985, Cell 43, 567-581), Delta (Vassin y col., 1987, EMBO J. 6, 3431-3440; Kopczynski y col., 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735; nótense las correcciones de la secuencia de Kopczynski y col. encontradas en la Figura 13 de esta memoria (SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:6)) y Serrate (Fleming y col., 1990, Genes & Dev. 4, 2188-2201)]. Tales secuencias se pueden alterar mediante sustituciones, adiciones o deleciones que proporcionan moléculas funcionalmente equivalentes (adhesivas). Debido a la degeneración de las secuencias que codifican nucleótidos, se pueden utilizar en la práctica de la presente invención, otras secuencias de ADN que codifican sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que las secuencias adhesivas. Estas incluyen, pero no están limitadas, a secuencias de nucleótidos que comprenden todas las partes de los genes Notch, Delta o Serrate que están alteradas por la sustitución de diferentes codones que codifican un residuo de aminoácidos funcionalmente equivalente, dentro de la secuencia, produciendo de este modo un cambio silencioso. De forma similar, los fragmentos de proteína adhesiva o sus derivados incluyen, pero no están limitados, a los que contienen, como secuencia de aminoácidos primaria, toda o parte de la secuencia de aminoácidos de los dominios adhesivos que incluyen secuencias alteradas en las que los residuos de aminoácidos funcionalmente equivalentes están sustituidos por residuos dentro de la secuencia, dando como resultado un cambio silencioso. Por ejemplo, uno o varios residuos de aminoácidos dentro de la secuencia pueden estar sustituidos por otro aminoácido con una polaridad similar, que actúa como un equivalente funcional, dando como resultado una alteración silenciosa. Los sustitutos de un aminoácido dentro de la secuencia se pueden seleccionar a partir de otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos polares neutros incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparragina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico.

Los fragmentos adhesivos de proteínas toporrítmicas y los derivados potenciales, los análogos o los péptidos relacionados con secuencias de proteínas toporrítmicas adhesivas, se pueden someter a ensayo para estudiar la actividad de unión deseada, por ejemplo, mediante ensayos de agregación in vitro, descritos en los ejemplos de esta memoria. Los derivados adhesivos o los análogos adhesivos de fragmentos adhesivos de proteínas toporrítmicas incluyen, pero no están limitados a los péptidos que son sustancialmente homólogos a los fragmentos adhesivos, o cuyo ácido nucleico codificado es capaz de hibridarse con la secuencia de ácidos nucleicos que codifica los fragmentos adhesivos, y cuyos péptidos y análogos peptídicos tienen una actividad de unión positiva, por ejemplo, cuando se someten a ensayo in vitro mediante un ensayo de agregación tal como el que se describe en las secciones de ejemplos, más abajo. Tales derivados y análogos se visualizan y están dentro del alcance de la presente
invención.

Los derivados, los análogos y los péptidos relacionados con proteínas las adhesivas, se pueden producir por distintos métodos conocidos en la técnica. Las manipulaciones que tienen lugar en su producción pueden ocurrir a nivel génico o proteico. Por ejemplo, la secuencia de genes que codifica la proteína adhesiva clonada se puede modificar mediante cualquiera de las numerosas estrategias conocidas en la técnica (Maniatis, T., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York). La secuencia se puede escindir en sitios apropiados con endonucleasa(s) de restricción, seguido de una modificación enzimática adicional, si se desea, aislamiento y ligación in vitro. En la producción del gen que codifica un derivado, un análogo o un péptido relacionado con un dominio adhesivo, se tiene que tener cuidado para asegurar que el gen modificado permanezca dentro del mismo marco de lectura en la traducción, que la proteína adhesiva, sin interrupciones con señales de detención de la traducción, en la región génica en donde se codifica la actividad adhesiva
deseada.

Adicionalmente, la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el adhesivo, se puede mutar in vitro o in vivo, para crear y/o destruir secuencias de traducción, iniciación y/o terminación, o para crear variaciones en regiones codificadoras y/o formar nuevos sitios para endonucleasas de restricción o destruir sitios preexistentes, para facilitar una modificación adicional in vitro. Cualquier técnica de mutagénesis conocida en la técnica, se puede utilizar, incluyendo pero no limitada a mutagénesis dirigida al sitio in vitro (Hutchinson, C., y col., 1978, J. Biol. Chem. 253, 6551), uso de engarzadores TAB® (Pharmacia), etc.

También se pueden realizar manipulaciones de la secuencia adhesiva a nivel de proteína. Los fragmentos de proteínas toporrítmicas, los análogos o los derivados están incluidos en el alcance de la invención, los cuales se pueden modificar diferencialmente durante o después de la traducción, por ejemplo, mediante glicosilación, acetilación, fosforilación, escisión proteolítica, enlace a una molécula de anticuerpo u otro ligando celular, etc. Cualquiera entre las numerosas modificaciones químicas se puede realizar mediante técnicas conocidas, que incluyen pero no están limitadas a la escisión química específica mediante bromuro de cianógeno, tripsina, quimotripsina, papaína, proteasa V8, NaBH_{4}; acetilación, formilación, oxidación, reducción; síntesis metabólica en presencia de tunicamicina;
etc.

Además, los análogos y los péptidos relacionados con fragmentos adhesivos se pueden sintetizar químicamente. Por ejemplo, un péptido correspondiente a una parte de una proteína toporrítmica, que media en la actividad de agregación deseada in vitro, se puede sintetizar empleando un sintetizador de péptidos.

Una descripción específica de la invención se refiere a fragmentos o derivados de una proteína Delta que tiene la capacidad de unirse a una segunda proteína Delta o a un fragmento o un derivado de la misma, pero que no se une a Notch. Una unión tal, o la falta de unión, se puede someter a ensayo in vitro, tal y como se describe en la Sección 8. A modo de ejemplo, pero no como limitación, un derivado tal de Delta es el que contiene una inserción del tetrapéptido Arg-Lys-Ile-Phe entre los residuos 198 y 199 de Delta de la proteína de Drosophila.

5.2 Clonación y secuenciación de Notch y Delta humanas

La invención se refiere adicionalmente a las secuencias de aminoácidos de Notch humana y de Delta humana y a fragmentos y derivados de las mismas que comprenden un determinante antigénico (es decir, que se pueden reconocer con un anticuerpo) o que son funcionalmente activas, así como a secuencias de ácidos nucleicos que codifican las anteriores. Material "funcionalmente activo", tal y como se emplea en esta memoria, se refiere a aquel material que manifiesta una o más de las actividades funcionales conocidas, asociadas con el producto de la proteína de longitud completa (tipo silvestre), por ejemplo, en el caso de Notch, unión con Delta, unión con Serrate, antigenicidad (unión a un anticuerpo anti-Notch), etc.

La invención describe fragmentos de una proteína Notch humana que consta al menos de 40 aminoácidos, o al menos de 77 aminoácidos. Las proteínas pueden comprender o constar esencialmente del dominio intracelular, la región transmembranal, el dominio extracelular, la región cdc10, las repeticiones Notch/lin-12 o las repeticiones homólogas a EGF, o cualquier combinación de los anteriores, de una proteína Notch humana. También se describen fragmentos, o proteínas que comprenden fragmentos, que carecen de alguna o de todas las repeticiones homólogas a EGF de Notch humana.

La invención se refiere a las secuencias y las subsecuencias de nucleótidos de Notch humana y Delta humana que constan al menos de 25 nucleótidos, al menos de 50 nucleótidos o al menos de 121 nucleótidos. Los ácidos nucleicos que codifican las proteínas y los fragmentos proteicos descritos anteriormente, también se proporcionan, así como los ácidos nucleicos complementarios a tales ácidos nucleicos y capaces de hibridarse con los mismos. Una secuencia complementaria tal, puede ser complementaria a una secuencia de ADNc de Notch humana de al menos 25 nucleótidos, o de al menos 121 nucleótidos. En un aspecto preferido, la invención se refiere a secuencias de ADNc que codifican Notch humana o una parte de la misma. En una descripción específica de la invención, la invención se refiere a la secuencia de nucleótidos del gen Notch humano o al ADNc, en particular, que comprende las secuencias descritas en las Figuras 19, 20, 21 y/o 22 (SEQ ID NO:13 hasta NO:25), o contenidas en los plásmidos hN3k, hN4k o hN5k (véase Sección 9, más abajo), y las secuencias codificadas de la proteína Notch. Tal y como es evidente, del modo en que se utiliza en esta memoria, un "ácido nucleico que codifica un fragmento o una parte de una proteína Notch", se debe interpretar como el que se refiere a un ácido nucleico que codifica sólo el fragmento mencionado o una parte de la proteína Notch y no otras partes de la proteína Notch.

Una secuencia de ADN de Notch humana se puede clonar y secuenciar por el método descrito en la Sección 9, más abajo.

Un método preferido para clonar Delta humana, que se presenta como un ejemplo particular, pero no a modo de limitación, es el siguiente:

Se construye una genoteca humana de expresión por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se aísla ARNm humano, se prepara ADNc y se liga en un vector de expresión tal (por ejemplo, un derivado de bacteriófago) que es capaz de ser expresado por la célula hospedadora en la que se introduce éste a continuación. Después, se pueden emplear distintos ensayos de rastreo para seleccionar el producto expresado de Delta humana. La selección se puede llevar a cabo en base a la unión positiva con el dominio adhesivo de Notch humana, (es decir, la parte de Notch humana más homóloga a ELR 11 y 12 de Drosophila (SEQ ID NO:1). Alternativamente, se pueden utilizar anticuerpos anti-Delta para la selección.

Se puede utilizar PCR para multiplicar la secuencia deseada en la genoteca, antes de la selección. Por ejemplo, cebadores de oligonucleótidos que representan parte de los dominios adhesivos codificados por un homólogo del gen deseado, se pueden utilizar como cebadores en la PCR.

Los métodos mencionados anteriormente no pretenden limitar la siguiente descripción general de los métodos, mediante los cuales se pueden obtener clones de Notch y Delta humanos.

Cualquier célula humana puede servir potencialmente como fuente de ácido nucleico para la clonación molecular del gen Notch y Delta. El ADN se puede obtener por procedimientos convencionales conocidos en la técnica a partir de ADN clonado (por ejemplo, una "genoteca" de ADN), mediante síntesis química, mediante clonación de ADNc o mediante la clonación de ADN genómico o de fragmentos del mismo, purificados a partir de la célula humana deseada. (Véase, por ejemplo, Maniatis y col., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York; Glover, D.M. (compilador), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, G.B. vol. I, II). Los clones obtenidos a partir de ADN genómico, pueden contener regiones de ADN reguladoras e intrones además de las regiones codificadoras; los clones obtenidos a partir de ADNc contendrán sólo secuencias de exones. Cualquiera que sea la fuente, el gen debe ser clonado molecularmente en un vector adecuado para la multiplicación del gen.

En la clonación molecular del gen procedente de ADN genómico, se generan fragmentos de ADN, alguno de los cuales codificará el gen deseado. El ADN se puede escindir en sitios específicos empleando distintas enzimas de restricción. Alternativamente, la ADNasa se puede usar en presencia de manganeso para fragmentar el ADN, o el ADN se puede cortar físicamente, como por ejemplo, mediante exposición a ultrasonidos. Los fragmentos de ADN lineales se pueden separar entonces, según el tamaño, mediante técnicas normalizadas, que incluyen, pero no están limitadas a electroforesis en gel de agarosa y poliacrilamida y cromatografía en columna.

Una vez generados los fragmentos de ADN, se puede realizar de diversos modos la identificación del fragmento de ADN específico que contiene el gen deseado. Por ejemplo, si una cantidad de una parte de unos genes Notch o Delta (de cualquier especie) o su ARN específico, o un fragmento del mismo, por ejemplo, el dominio adhesivo, está disponible y se puede purificar y marcar, los fragmentos de ADN generados se pueden escrutar mediante hibridación de los ácidos nucleicos con la sonda marcada (Benton, W. y Davis, R., 1977, Science 196, 180; Grunstein, M. y Hogness, D., 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3961). Aquellos fragmentos de ADN con una homología sustancial con la sonda se hibridarán. También es posible identificar el fragmento apropiado mediante digestión(es) con enzimas de restricción y comparar los tamaños de los fragmentos con los esperados, según un mapa de restricción conocido, si está disponible. Una selección adicional se puede realizar en base a las propiedades del gen. Alternativamente, la presencia del gen se puede detectar por ensayos basados en las propiedades físicas, químicas o inmunológicas de su producto expresado. Por ejemplo, de los clones de ADNc o los clones de ADN que se hibridan o seleccionan los ARNm adecuados, se pueden seleccionar los que producen una proteína que, por ejemplo, tiene una migración electroforética, comportamiento de enfoque isoeléctrico, mapas de digestión proteolítica, actividad de agregación in vitro ("adhesividad") o propiedades antigénicas, similares o idénticas, como las conocidas para Notch o Delta. Si un anticuerpo para Notch o Delta está disponible, la proteína Notch o Delta se puede identificar uniendo el anticuerpo marcado a los clones putativos que sintetizan Notch o Delta, en un procedimiento de tipo ELISA (ensayo inmunoenzi-
mático).

Los genes Notch o Delta también se pueden identificar por selección del ARNm mediante hibridación del ácido nucleico, seguido de traducción in vitro. En este procedimiento, los fragmentos se emplean para aislar ARNm complementarios por hibridación. Tales fragmentos de ADN pueden representar ADN purificado y disponible de Notch o de Delta de otra especie (por ejemplo, Drosophila). El análisis por inmunoprecipitación o los ensayos funcionales (por ejemplo, capacidad de agregación in vitro; véanse los ejemplos más abajo) de los productos de la traducción in vitro de los productos aislados de los ARNm aislados, identifica el ARNm y, por tanto, los fragmentos de ADN complementario que contienen las secuencias deseadas. Además, los ARNm específicos se pueden seleccionar por adsorción de polisomas aislados de células, para inmovilizar anticuerpos dirigidos específicamente contra la proteína Notch o Delta. Un ADNc radiomarcado de Notch o Delta se puede sintetizar empleando el ARNm seleccionado (procedente de los polisomas adsorbidos) como molde. El ARNm o ADNc marcado radiactivamente se puede utilizar a continuación como una sonda para identificar los fragmentos de ADN de Notch o Delta entre otros fragmentos de ADN
genómico.

Las alternativas para aislar el ADN genómico de Notch o Delta incluyen, pero no están limitadas a la síntesis química de la secuencia génica misma, a partir de una secuencia conocida o preparando un ADNc del ARNm que codifica el gen Notch o Delta. Por ejemplo, ARN para la clonación de ADNc del gen Notch o Delta, se puede aislar a partir de células que expresan Notch o Delta. Otros métodos son posibles y están dentro del alcance de la inven-
ción.

El gen identificado y aislado se puede insertar a continuación en un vector de clonación apropiado. Se pueden utilizar una gran cantidad de sistemas vector-hospedador conocidos en la técnica. Posibles vectores incluyen, pero no están limitados a plásmidos o virus modificados, pero el sistema del vector tiene que ser compatible con la célula hospedadora utilizada. Tales vectores incluyen, pero no están limitados a bacteriófagos tales como derivados de lambda, o plásmidos tales como pBR322 o derivados del plásmido pUC. La inserción en un vector de clonación se puede realizar, por ejemplo, ligando el fragmento de ADN en un vector de clonación que tiene extremos cohesivos complementarios. Sin embargo, si los sitios de restricción complementarios utilizados para fragmentar el ADN no están presentes en el vector de clonación, los extremos de las moléculas de ADN se pueden modificar enzimáticamente. Alternativamente, cualquier sitio deseado se puede producir ligando secuencias de nucleótidos (engarzadores) a los extremos del ADN; estos engarzadores ligados pueden comprender oligonucleótidos específicos sintetizados químicamente, que codifican secuencias de reconocimiento de las endonucleasas de restricción. En un método alternativo, el vector cortado y los genes Notch o Delta se pueden modificar adicionando una cola homopolímera. Las moléculas recombinantes se pueden introducir en las células hospedadoras mediante transformación, transfección, infección, electroporación, etc., de modo que se generan muchas copias de la secuencia génica.

En un método alternativo, el gen deseado se puede identificar y aislar después de la inserción en un vector de clonación adecuado, en un acercamiento de tipo "perdigonada" (del inglés, "shot gun"). El enriquecimiento del gen deseado, por ejemplo, mediante fraccionamiento por tamaño, se puede realizar antes de insertar en el vector de clona-
ción.

En ejemplos específicos, la transformación de las células hospedadoras con moléculas de ADN recombinante que incorporan el gen Notch o Delta aislado, ADNc o una secuencia de ADN sintetizada, permite la generación de copias múltiples del gen. Por tanto, se puede obtener el gen en grandes cantidades haciendo crecer los transformantes, aislando las moléculas de ADN recombinante de los transformantes y, si es necesario, recuperar el gen insertado a partir del ADN recombinante aislado.

Las secuencias de Notch humano proporcionadas por la presente invención, incluyen aquellas secuencias de nucleótidos que codifican sustancialmente las mismas secuencias de aminoácidos que las encontradas en Notch humana, y aquellas secuencias de aminoácidos codificadas por aminoácidos funcionalmente equivalentes, todas ellas descritas más arriba, en la Sección 5.1 para partes adhesivas de proteínas toporrítmicas.

5.3 Identificación de miembros adicionales de la familia Delta/Serrate

Una búsqueda racional de miembros adicionales de la familia de genes Delta/Serrate se puede realizar empleando un acercamiento que aproveche la existencia de segmentos conservados de alta homología entre Serrate y Delta (véase Figura 10, SEQ ID NO:3 y NO:4). Por ejemplo, miembros adicionales de esta familia génica se pueden identificar seleccionando, entre una diversidad de secuencias de ácidos nucleicos, las secuencias que son homólogas tanto con Serrate como con Delta (véase Figura 13 (SEQ ID NO:5) y Figura 15 (SEQ ID NO:8)), e identificando posteriormente, entre las secuencias seleccionadas, las que también contienen secuencias de ácidos nucleicos que no son homólogas con Serrate y con Delta. La expresión "no homóloga" se puede utilizar para indicar una región que contiene al menos aproximadamente 6 nucleótidos contiguos en los que al menos dos nucleótidos difieren de la secuencia de Serrate y Delta.

Por ejemplo, un método preferido es como sigue: se pueden sintetizar grupos de sondas de oligonucleótidos degenerados de aproximadamente 10-20 nucleótidos, que se corresponden con dos segmentos conservados entre Delta y Serrate, los AA 63-73 de Delta y los AA 195-206 de Delta (véase Figura 13, SEQ ID NO:6), que representan todas las secuencias codificadoras posibles para los aminoácidos encontrados en Delta y Serrate para aproximadamente tres a siete codones contiguos. Se pueden obtener oligonucleótidos que se corresponden con partes de las cuatro regiones altamente conservadas entre Delta y Serrate mostradas en la Figura 15 (SEQ ID NO:8 y NO:9), es decir, las representadas por los AA 124-134 de Serrate, 149-158, 214-219 y 250-259 de Serrate. Los oligonucleótidos sintéticos se pueden utilizar como cebadores para multiplicar secuencias con PCR a partir de una fuente (ARN o ADN) de potencial interés. (PCR se puede realizar, por ejemplo, empleando un variador térmico de Perkin-Elmer Cetus y polimerasa Taq (Gene Amp®)). Esta puede incluir ARNm o ADNc o ADN génomico procedente de especies eucariotas que podrían expresar un polipéptido estrechamente relacionado con Serrate y Delta. Al llevar a cabo las reacciones de la PCR, es posible detectar un gen o un producto génico que comparte los segmentos mencionados anteriormente de la secuencia conservada entre Serrate y Delta. Si se escoge sintetizar varios cebadores degenerados distintos, todavía puede ser posible realizar una búsqueda completa con un número razonablemente bajo de reacciones de PCR. También es posible variar la severidad de las condiciones de hibridación empleadas en el cebado de las reacciones de PCR, para permitir grados mayores o menores de similitud de la secuencia de nucleótidos entre el gen desconocido y Serrate o Delta. Si un segmento de un miembro previamente desconocido de la familia de genes Serrate/Delta se multiplica con éxito, este segmento se puede clonar molecularmente y secuenciar, y utilizar como sonda para aislar un ADNc completo o un clon genómico. Esto, a su vez, permitirá la determinación de la secuencia de nucleótidos completa del gen desconocido, el análisis de su expresión y la producción de su producto proteico para análisis funcionales. De este modo, se pueden identificar genes adicionales que codifican proteínas "adhesivas".

Además, la presente invención describe el uso de las homologías de la secuencia Serrate/Delta para el diseño de nuevas moléculas recombinantes que son miembros de la familia de genes Serrate/Delta pero que no están presentes en la naturaleza. Por ejemplo, y no a modo de limitación, una molécula recombinante se puede construir de acuerdo con la invención, comprendiendo partes de ambos genes Serrate y Delta. Una molécula tal podría mostrar propiedades asociadas con Serrate y Delta y retratar un nuevo perfil de actividades biológicas, incluyendo agonistas así como antagonistas. La secuencia primaria de Serrate y Delta también se puede utilizar para pronosticar la estructura terciaria de las moléculas utilizando simulación por ordenador (Hopp y Woods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 3824-3828); genes recombinantes quiméricos de Serrate/Delta se podrían diseñar a la luz de correlaciones entre la estructura terciaria y la función biológica. De forma similar, se pueden construir genes quiméricos que comprenden partes de uno cualquiera o de varios miembros de la familia de genes toporrítmicos (por ejemplo,
Notch).

5.4 La expresión de genes toporrítmicos

La secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento adhesivo de una proteína toporrítmica (preferentemente, Notch, Serrate o Delta), o un análogo adhesivo o un derivado de las mismas, o Notch o Delta humana o un fragmento funcionalmente activo o un derivado de las mismas, se puede insertar en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia que codifica la proteína insertada. Las señales necesarias para la transcripción y la traducción también pueden estar provistas por el gen toporrítmico natural y/o sus regiones flanqueantes. Se puede utilizar una variedad de sistemas hospedador-vector para expresar la secuencia que codifica la proteína. Estos incluyen, pero no están limitados a sistemas celulares de mamíferos infectados con virus (por ejemplo, virus vaccinia, adenovirus, etc.); sistemas celulares de insectos infectados con virus (por ejemplo, baculovirus); microorganismos tales como levadura que contiene vectores de levadura o bacterias transformadas con bacteriófago, ADN, ADN plasmídico o ADN de cósmido. Los elementos de expresión de vectores varían en sus intensidades y sus especificidades. Dependiendo del sistema de hospedador-vector utilizado, se puede emplear una cualquiera de una cantidad de elementos adecuados para la transcripción y la traducción. En un ejemplo específico, se expresa la parte adhesiva del gen Notch, por ejemplo, la que codifica las repeticiones similares a EGF 11 y 12. En otro ejemplo, se expresa la parte adhesiva del gen Delta, por ejemplo, la que codifica los aminoácidos 1-230. En otros ejemplos específicos, se expresa el gen Notch humano o Delta humano, o una secuencia que codifica una parte funcionalmente activa de Notch o Delta humana. En aún otro ejemplo, se expresa la parte adhesiva del gen
Serrate.

Cualquiera de los métodos descritos previamente para la inserción de fragmentos de ADN en un vector, se puede utilizar para construir vectores de expresión que contienen un gen quimérico que consta de señales de control de la transcripción/traducción apropiadas y las secuencias que codifican la proteína. Estos métodos pueden incluir ADN recombinante in vitro y técnicas sintéticas y recombinantes in vivo (recombinación genética). La expresión de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína toporrítmica o un fragmento peptídico, se puede regular con una segunda secuencia de ácidos nucleicos, de modo que la proteína o el péptido toporrítmico se expresa en un hospedador transformado con la molécula de ADN recombinante. Por ejemplo, la expresión de una proteína toporrítmica se puede controlar mediante cualquier elemento promotor/intensificador conocido en la técnica. Los promotores que se pueden utilizar para controlar la expresión de genes toporrítmicos incluyen, pero no están limitados a la región del promotor temprano de SV40 (Bernoist y Chambon, 1981, Nature 290, 304-310), el promotor contenido en la repetición 3' terminal larga del virus de sarcoma de Rous (Yamamoto y col., 1980, Cell 22, 787-797), el promotor de la quinasa de timidina de herpes (Wagner y col., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 1441-1445), las secuencias reguladoras del gen de la metalotioneína (Brinster y col., 1982, Nature 296, 39-42); los vectores de expresión procarióticos tales como el promotor de la \beta-lactamasa (Villa-Kamaroff y col., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75, 3727-3731), o el promotor tac (DeBoer y col., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 21-25); véase también "Useful proteins from recombinant bacteria" en Investigación y Ciencia, 1980, 242, 74-94; vectores de expresión vegetales que comprenden la región del promotor de la sintetasa de nopalina (Herrera-Estrella y col., Nature 303, 209-213) o el promotor del ARN 35S del virus del mosaico de la coliflor (Gardner y col., 1981, Nucl. Acids Res. 9, 2871) y el promotor de la enzima fotosintética ribulosa-bifosfato-carboxilasa (Herrera-Estrella y col., 1984, Nature 310, 115-120); elementos del promotor procedentes de levadura u otros hongos tales como el promotor Gal 4, el promotor ADC (deshidrogenasa de alcohol), el promotor PGK (quinasa de fosfoglicerol), el promotor de la fosfatasa alcalina y las siguientes regiones de control de la transcripción animal, que muestran especificidad de tejido y se han utilizado en animales transgénicos: región de control del gen de la elastasa I que es activa en células lobulares pancreáticas (Swift y col., 1984, Cell 38, 639-646; Ornitz y col., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50, 399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7, 425-515); región de control del gen de la insulina que es activa en células pancreáticas beta (Hanahan, 1985, Nature 315, 115-122), región de control del gen de la inmunoglobulina que es activa en células linfoides (Grosschedl y col., 1984, Cell 38, 647-658; Adames y col., 1985, Nature 318, 533-538; Alexander y col., 1987, Mol. Cell. Biol. 7, 1436-1444), región de control del virus de tumor mamario de ratón que es activa en células testiculares, mamarias, linfoides y mastocitos (Leder y col., 1986, Cell 45, 485-495), región de control del gen de la albúmina que es activa en el hígado (Pinkert y col., 1987, Genes and Devel. 1, 268-276), región de control del gen de la alfa-fetoproteína que es activa en el hígado (Krumlauf y col., 1985, Mol. Cell. Biol. 5, 1639-1648; Hammer y col., 1987, Science 235, 53-58); región de control del gen de la 1-antitripsina alfa que es activa en el hígado (Kelsey y col., 1987, Genes and Devel. 1, 161-171), región de control del gen de la beta-globina que es activa en células mieloides (Mogram y col., 1985, Nature 315, 338-340; Kollias y col., 1986, Cell 46, 89-94), región de control del gen de la proteína básica de mielina que es activa en oligodendrocitos en el cerebro (Readhead y col., 1987, Cell 48, 703-712), región de control del gen de la cadena-2 ligera de la miosina que es activa en músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314, 283-286) y región de control del gen de la hormona liberadora de gonadotropina que es activa en el hipotálamo (Mason y col., 1986, Science 234, 1372-1378).

Los vectores de expresión que contienen inserciones de genes toporrítmicos se pueden identificar mediante tres acercamientos generales: (a) hibridación de ácidos nucleicos, (b) presencia o ausencia de funciones génicas "marcadoras" y (c) expresión de secuencias insertadas. En el primer acercamiento, la presencia de un gen extraño insertado en un vector de expresión se puede detectar mediante hibridación de ácidos nucleicos empleando sondas que comprenden secuencias que son homólogas a un gen toporrítmico insertado. En el segundo acercamiento, el sistema recombinante vector/hospedador se puede identificar y seleccionar en base a la presencia o ausencia de ciertas funciones génicas "marcadoras" (por ejemplo, actividad de quinasa de timidina, resistencia a antibióticos, fenotipo de transformación, formación de cuerpos de oclusión en baculovirus, etc.) debidas a la inserción de genes extraños en el vector. Por ejemplo, si el gen toporrítmico está insertado dentro de la secuencia génica marcadora del vector, se pueden identificar los recombinantes que contienen la inserción toporrítmica mediante la ausencia de la función génica marcadora. En el tercer acercamiento, los vectores de expresión recombinantes se pueden identificar sometiendo a ensayo el producto génico extraño expresado por el recombinante. Tales ensayos se pueden basar, por ejemplo, en las propiedades físicas o funcionales del producto génico toporrítmico en sistemas de ensayo in vitro, por ejemplo, capacidad de agregación (adhesiva) (véanse las Secciones 6-8, más abajo).

Una vez que se identifica y se aísla una molécula particular de ADN recombinante, se pueden emplear diversos métodos conocidos para su multiplicación. Una vez establecidos un sistema de hospedador adecuado y unas condiciones de crecimiento, los vectores de expresión recombinantes se pueden multiplicar y preparar en cantidad. Tal y como se ha explicado previamente, los vectores de expresión que se pueden utilizar incluyen, pero no están limitados a los siguientes vectores o sus derivados: virus humanos o animales tales como el virus vaccinia o el adenovirus; virus de insectos tales como baculovirus; vectores de levaduras; vectores de bacteriófagos (por ejemplo, lambda) y vectores de ADN de plásmidos y cósmidos, por mencionar unos pocos.

Además, se puede escoger una cepa celular hospedadora que module la expresión de las secuencias insertadas o que modifique y procese el producto génico en la forma específica deseada. La expresión de ciertos promotores se puede elevar en presencia de ciertos inductores; por tanto, la expresión de la proteína toporrítmica generada por ingeniería genética se puede controlar. Además, diferentes células hospedadoras tienen características y mecanismos específicos para el procesamiento traduccional y post-traduccional y para la modificación (por ejemplo, glicosilación, escisión) de proteínas. Líneas celulares adecuadas o sistemas hospedadores se pueden escoger para asegurar la modificación deseada y el procesamiento de la proteína extraña expresada. Por ejemplo, la expresión en un sistema bacteriano se puede utilizar para producir un producto proteico con el centro no glicosilado. La expresión en levaduras producirá un producto glicosilado. La expresión en células de mamífero se puede utilizar para asegurar una glicosilación "natural" de una proteína toporrítmica heteróloga de mamífero. Además, diferentes sistemas de expresión de vector/hospedador pueden efectuar reacciones de procesamiento tales como escisiones proteolíticas con diferentes
grados.

La proteína adhesiva toporrítmica, el fragmento, el análogo o el derivado se pueden expresar como una fusión o como un producto proteico quimérico (que comprende la proteína, el fragmento, el análogo o el derivado unido a una secuencia de proteína heteróloga). Un producto quimérico tal se puede preparar ligando las secuencias de ácidos nucleicos adecuadas que codifican las secuencias de aminoácidos deseadas entre sí, por métodos conocidos en la técnica, en el marco de codificación adecuado y expresando el producto quimérico por métodos conocidos generalmente en la técnica. Alternativamente, dicho producto quimérico se puede preparar mediante técnicas de síntesis de proteínas, por ejemplo, empleando un sintetizador de péptidos.

Ambas secuencias de ADNc y genómica se pueden clonar y expresar.

Una secuencia de ADNc de Notch humana se puede integrar en el cromosoma y expresar. Se pueden emplear procedimientos de recombinación homóloga conocidos en la técnica.

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5.4.1 Identificación y purificación del producto génico expresado

Una vez identificado un recombinante que expresa la secuencia génica toporrítmica, se puede analizar el producto génico. Esto se puede conseguir con ensayos que se basan en las propiedades físicas o funcionales del producto, que incluyen la marcación radiactiva del producto, seguida de análisis mediante electroforesis en gel.

Una vez identificada la proteína toporrítmica, se puede aislar y purificar por métodos convencionales que incluyen la cromatografía (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, de afinidad y en columna por tamaños), la centrifugación, la solubilidad diferencial o mediante cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas. Las propiedades funcionales se pueden evaluar empleando cualquier ensayo adecuado, que incluyen, pero no están limitados a, ensayos de agregación (véanse las Secciones 6-8).

5.5 Generación de anticuerpos para proteínas toporrítmicas y sus secuencias adhesivas

Se pueden utilizar fragmentos de proteínas toporrítmicas o sus análogos o derivados que median en la unión homotípica o heterotípica, o proteínas Notch humanas o Delta humanas o sus fragmentos, como inmunógenos para generar anticuerpos anti-proteína toporrítmica. Tales anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales. En una realización específica, se pueden preparar anticuerpos específicos para las repeticiones 11 y 12 similares a EGF de Notch. Se pueden generar anticuerpos reactivos con la "parte adhesiva" de Delta. Un ejemplo de tales anticuerpos puede evitar la agregación en un ensayo in vitro. En otra realización, se producen anticuerpos específicos para Notch humana.

Se pueden emplear distintos procedimientos conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos policlonales para una proteína o un péptido toporrítmico. Se pueden obtener anticuerpos policlonales de conejo para un epítopo de la proteína Notch humana codificada por una secuencia descrita en las Figuras 19, 20, 21 o 22 (SEQ ID NO:13 hasta SEQ ID NO:25), o una subsecuencia de las mismas. Para la producción de anticuerpo, se pueden inmunizar varios animales hospedadores mediante inyección con la proteína toporrítmica natural, o una versión sintética, o un fragmento de la misma, que incluyen, pero no están limitados a conejos, ratones, ratas, etc. Se pueden utilizar distintos coadyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica, dependiendo de las especies hospedadoras, y que incluyen, pero no están limitados a, Freund (completo e incompleto), geles minerales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianinas de lapa bocallave, dinitrofenol y coadyuvantes humanos potencialmente útiles como BCG (bacilo Calmette-Guerin) y corynebacterium parvum.

Para la preparación de anticuerpos monoclonales dirigidos a una secuencia de proteína toporrítmica, se puede utilizar cualquier técnica que proporciona la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo. Por ejemplo, la técnica de hibridoma, desarrollada originalmente por Kohler y Milstein (1975, Nature 256, 495-497), así como la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de células B humanas (Kozbor y col., 1983, Immunology Today 4, 72) y la técnica de hibridoma de EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole y col., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96).

Los fragmentos de anticuerpo que contienen el idiotipo de la molécula se pueden generar mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen pero no están limitados a: el fragmento F(ab')_{2} que se puede producir mediante digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo; los fragmentos Fab' que se pueden generar reduciendo los puentes disulfuro del fragmento F(ab')_{2} y los fragmentos Fab que se pueden generar tratando la molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor.

En la producción de anticuerpos, se puede realizar un escrutinio en busca del anticuerpo deseado mediante técnicas conocidas, por ejemplo ELISA (ensayo inmunoenzimático). Por ejemplo, para seleccionar anticuerpos que reconocen el dominio adhesivo de una proteína toporrítmica, se pueden someter a ensayo hibridomas generados para un producto que se une a un fragmento de proteína que contiene dicho dominio. Para la selección de un anticuerpo específico de Notch humana, se puede seleccionar en base a la unión positiva con Notch humana y a una falta de unión con Notch de Drosophila.

Los anticuerpos anteriores se pueden utilizar en métodos conocidos en la técnica relacionados con la localización y la actividad de las secuencias proteicas de la invención. Por ejemplo, se pueden emplear diversos inmunoensayos conocidos en la técnica, que incluyen pero no están limitados a sistemas de ensayo competitivos y no competitivos que emplean técnicas tales como radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunoenzimático), inmunoensayos de tipo "sándwich", reacciones de precipitina, reacciones de precipitina con difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos con proteína A y ensayos de inmunoelectroforesis, por mencionar unos cuantos.

5.6 Entrega de agentes en células que expresan Notch

La invención también describe métodos para la entrega de agentes en células que expresan Notch. Como se expone en la Sección 8, más abajo, al unirse a una proteína Notch en la superficie de una célula que expresa Notch, la proteína Delta parece que se absorbe dentro de la célula que expresa Notch. La invención proporciona por tanto la entrega de agentes en una célula que expresa Notch, mediante la conjugación de un agente con una proteína Delta o un fragmento adhesivo o un derivado de la misma, capaz de unirse a Notch, y exponer una célula que expresa Notch al conjugado, de modo que el conjugado es absorbido por la célula. El agente conjugado puede ser, pero no está limitado a un marcador o un agente biológicamente activo. El agente biológicamente activo puede ser un agente terapéutico, una toxina, un agente quimioterapéutico, un factor de crecimiento, una enzima, una hormona, un fármaco, un ácido nucleico, (por ejemplo, ADN o ARN antisentido), etc. En una realización, el marcador puede ser un agente formador de imágenes, que incluye pero no está limitado a agentes de contraste de metales pesados para formación de imágenes por rayos X, agentes formadores de imagen por resonancia magnética y nucleidos radiactivos (es decir, isótopos) para gammagrafía. En un aspecto preferido, el agente se conjuga en un sitio en la mitad amino-terminal de la molécula
Delta.

El conjugado Delta-agente se puede entregar a la célula que expresa Notch, exponiendo la célula que expresa Notch a células que expresan el conjugado Delta-agente o exponiendo la célula que expresa Notch al conjugado Delta-agente en una solución, una suspensión u otro vehículo. Cuando la entrega es in vivo, el conjugado Delta-agente se puede formular en un vehículo farmacéuticamente aceptable o un excipiente, para incluir una composición farmacéutica. El vehículo farmacéuticamente aceptable puede comprender solución salina, solución salina tamponada con fosfato, etc. El conjugado Delta-agente se puede formular como un líquido, comprimido, píldora, polvo, en una forma de liberación lenta, en un liposoma, etc., y se puede administrar por vía oral, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, por mencionar algunas vías, siendo la selección preferida fácil, basándose en los conocimientos de una persona experta en la técnica.

6. Interacciones moleculares entre los productos proteicos de los loci neurógenos Notch y Delta, dos genes homólogos a EGF en Drosophila

Para examinar la posibilidad de asociación intermolecular entre los productos de los genes Notch y Delta, estudiamos los efectos de su expresión sobre la agregación en células Schneider's 2 (S2) de Drosophila (Fehon y col., 1990, Cell 61, 523-534). En esta memoria ofrecemos una prueba directa de interacciones intermoleculares entre Notch y Delta y describimos un sistema de ensayo que se puede utilizar en la disección de los componentes de esta interacción. Mostramos que células cultivadas S2 de Drosophila que normalmente no son adhesivas, que expresan Notch, se unen específicamente a células que expresan Delta, y que esta agregación es dependiente de calcio. Además, aun cuando las células que expresan Notch no se unen entre sí, las células que expresan Delta se unen entre sí, lo que sugiere que Notch y Delta pueden competir por la unión a Delta en la superficie celular. También presentamos pruebas que indican que Notch y Delta forman complejos solubles en detergente, ambos en células cultivadas y en células embrionarias, sugiriendo que Notch y Delta interaccionan directamente a nivel molecular in vitro e in vivo. Nuestros análisis sugieren que las proteínas Notch y Delta interaccionan en la superficie celular mediante sus dominios extracelulares. Algunos de los ejemplos siguientes describen el objeto en cuestión que queda fuera del alcance de las reivindicaciones y éstos se describen en esta memoria como ejemplos de referencia.

6.1 Procedimientos experimentales 6.1.1 Estructuras artificiales de expresión

Para la estructura artificial de expresión de Notch, se ligó con extremos romos el fragmento HpaI de 6 kb procedente del extremo 5' de la secuencia codificadora de Notch en MgIIa (Ramos y col., 1898, Genetics 123, 337-348) en el vector del promotor de la metalotioneína pRmHa-3 (Bunch y col., 1988, Nucl. Acids Res. 16, 1043-1061), después el vector se cortó con EcoRI y los extremos se rellenaron con el fragmento Klenow de la polimerasa I de ADN (Maniatis y col., 1982, Molecular Cloning; A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory)). Se aisló un único transformante, orientado incorrectamente. El ADN de este transformante se digirió a continuación con SacI y se aisló un fragmento resultante de 3 kb que contenía el extremo 5' de la secuencia codificadora de Notch fusionada con el poliengarzador procedente de pRmHa-3. Este fragmento se ligó entonces en el sitio SacI de pRmHa-3 con la orientación correcta. El ADN procedente de esta estructura artificial se digirió con KpnI y XbaI para eliminar la mayoría de la secuencia de Notch y toda la secuencia de la señal de poliadenilación Adh en pRmHa-3 y se ligó con un fragmento KpnI-XbaI de 11 kb, procedente de MgIIa que contenía el resto de la secuencia codificadora de Notch y las secuencias 3' necesarias para la poliadenilación. En la estructura artificial resultante, denominada pMtNMg, el promotor de la metalotioneína en pRmHa-3 se fusiona con secuencias de Notch, que comienzan 20 nucleótidos aguas arriba del sitio de inicio de la traducción.

Para la estructura artificial de Notch extracelular (ECN1), el cósmido de Notch CosP479BE (Ramos y col., 1989, Genetics 123, 337-348), que contiene todas las secuencias genómicas de Notch necesarias para una función normal de Notch in vivo, se digirió parcialmente con AatII. Los extremos del fragmento se hicieron romos empleando la actividad exonucleasa de la polimerasa T4 de ADN (Maniatis y col., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory)), y los fragmentos se digirieron de nuevo entonces completamente con StuI. Los fragmentos resultantes se separaron en un gel de agarosa con baja temperatura de fusión (SeaPlaque, FMC BioProducts), y el fragmento mayor se escindió. Este fragmento se ligó después con extremos romos consigo mismo. Esto dio como resultado una deleción interna de las secuencias codificadoras de Notch desde el aminoácido 1790 hasta 2625 inclusive (Wharton y col., 1985, Cell 43, 567-581), y un cambio del marco de lectura pronosticado que produce un nuevo extremo carboxilo de 59 aminoácidos. (La unión ligada de esta estructura artificial no se ha comprobado por secuenciación).

Para la estructura artificial de expresión de Delta, el ADNc de Dl1 (Kopczynski y col., 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735) que incluye la capacidad codificadora completa de Delta, se insertó en el sitio EcoRI de pRmHa-3. Esta estructura artificial se denominó pMTDl1.

6.1.2 Preparación de anticuerpos

La línea celular de hibridoma C17.9C6 se obtuvo a partir de un ratón inmunizado con una proteína de fusión basada en un fragmento SalI-HindIII de 2,1 kb que incluye las secuencias codificadoras de la mayoría del dominio intracelular de Notch (aminoácidos 1791-2504; Wharton y col., 1985, Cell 43, 567-581). El fragmento se subclonó en pUR289 (Ruther y Muller-Hill, 1983, EMBO J. 2, 1791-1794), y después se transfirió en el vector de expresión pATH 1 (Dieckmann y Tzagoloff, 1985, J. Biol. Chem. 260, 1513-1520) como un fragmento BglII-HindIII. La proteína de fusión soluble se expresó, se precipitó con (NH_{4})_{2}SO_{4} al 25%, se resuspendió en urea 6 M y se purificó mediante enfoque isoeléctrico preparativo, empleando un Rotofor (BioRad) (para más detalles, véase Fehon, 1989, Rotofor Review Nº 7, Boletín 1518, Richmond, California: Bio-Rad Laboratories).

Se produjeron antisueros policlonales de ratón contra el dominio extracelular de Notch, empleando cuatro fragmentos BstY1 de 0,8 kb (aminoácidos 237-501: Wharton y col., 1985, Cell 43, 567-581), 1,1 kb (aminoácidos 501-868), 0,99 kb (aminoácidos 868-1200) y 1,4 kb (aminoácidos 1465-1935) de longitud, que abarcaban desde la quinta repetición similar a EGF a través del dominio transmembranal, se insertaron individualmente en marco en el vector de expresión adecuado pGEX (Smith y Johnson, 1988, Gene 67, 31-40). Las proteínas de fusión se purificaron en lechos de glutatión-agarosa (SIGMA). Antisueros de ratón y rata se precipitaron con (NH_{4})_{2}SO_{4} al 50% y se resuspendieron en PBS (NaCl 150 mM, Na_{2}HPO_{4} 14 mM, NaH_{2}PO_{4} 6 mM) con NaN_{3} al 0,02%.

La línea celular de hibridoma 201 se obtuvo a partir de un ratón inmunizado con una proteína de fusión basada en un fragmento ClaI de 0,54 kb que incluye secuencias codificadoras procedentes del dominio extracelular de Delta (Kopczynski y col., 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735) se subclonó en el sitio ClaI dentro del gen lacZ de pUR 288 (Ruther y Muller-Hill, 1983, EMBO J. 2, 1791-1794). Este fragmento incluye secuencias que se extienden desde la cuarta hasta la novena repetición similar a EGF en Delta (aminoácidos 350-529). La proteína de fusión se preparó aislando cuerpos de inclusión (Gilmer y col., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 2152-2156); los cuerpos de inclusión se solubilizaron en urea (Carroll y Laughon, 1987, en DNA Cloning, Volumen III, D.M. Glover, compilador (Oxford: IRL Press), págs. 89-111) antes del uso en la inmunización.

Antisueros policlonales de rata se obtuvieron después de inmunizar con antígeno, obtenido a partir de la misma estructura artificial de proteína de fusión. En este caso, la proteína de fusión se preparó por lisis de células inducidas con IPTG en tampón SDS-Laemmli (Carroll y Laughon, 1987, en DNA Cloning, Volumen III, D.M. Glover, compilador (Oxford: IRL Press), págs. 89-111), separación de proteínas mediante SDS-PAGE, escisión de la banda apropiada del gel y electroelución del antígeno a partir del trozo cortado de gel para uso en inmunización (Harlow y Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor
Laboratory)).

6.1.3. Cultivo celular y transfección

La línea celular S2 (Schneider, 1972, J. Embryol. Exp. Morph. 27, 353-365) se hizo crecer en medio M3 (preparado por Hazleton Co.) suplementado con 2,5 mg/ml de Bacto-Peptona (Difco), 1 mg/ml de TC Yeastolate (Difco), suero de ternera fetal inactivado con calor al 11% (FCS) (Hyclone) y 100 U/ml de penicilina-100 \mug/ml de estreptomicina-0,25 \mug/ml de fungizona (Hazleton). Las células que crecían en fase logarítmica hasta \sim2 x 10^{6} células/ml se transfectaron con 20 \mug de coprecipitado de ADN-fosfato cálcico en 1 ml por 5 ml de cultivo tal y como se ha descrito previamente (Wigler y col., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 1373-1376) con la excepción de que se utilizó el tampón BES (SIGMA) en lugar de tampón HEPES (Chen y Okayama, 1987, Mol. Cell. Biol. 7, 2745-2572). Después de 16-18 h, las células se transfirieron a tubos de centrífuga cónicos, se sedimentaron en una centrífuga clínica a velocidad completa durante 30 segundos, se lavaron una vez con 1/4 del volumen de medio completo de nuevo aporte, se resuspendieron en su volumen original de medio completo y se llevaron de nuevo al frasco original. A las células transfectadas se les permitió recuperarse a continuación durante 24 h antes de la inducción.

6.1.4. Ensayos de agregación

La expresión de las estructuras artificiales de metalotioneína de Notch y Delta fue inducida por la adición de CuSO_{4} hasta 0,7 mM. Las células transfectadas con la estructura artificial ECN1, se trataron de forma similar. Se emplearon dos tipos de ensayos de agregación. En el primer ensayo, se colocó un total de 3 ml de células (5-10 x 10^{6} células/ml) en un matraz Erlenmeyer de 25 ml y se hizo rotar a 40-50 rpm en un agitador con rotación durante 24-48 horas a temperatura ambiente. Para estos experimentos, las células se mezclaron 1-4 h después de que comenzara la inducción y la inducción continuó a lo largo del periodo de agregación. En el segundo ensayo, se colocaron \sim0,6 ml de células en un tubo Eppendorf de 0,6 ml (dejando una pequeña burbuja) después de inducir durante una noche (12-16 h) a temperatura ambiente y balancear suavemente durante 1-2 h a 4ºC. Los experimentos de inhibición del anticuerpo y los experimentos de dependencia de Ca^{2+}, se realizaron empleando el último ensayo. Para los experimentos de dependencia de Ca^{2+} se recolectaron primero las células y se lavaron en solución salina equilibrada (BSS) con FCS al 11% (BSS-FCS; FCS se dializó contra NaCl al 0,9%, Tris 5 mM [pH 7,5]) o en BSS-FCS exento de Ca^{2+} que contenía EGTA 10 mM (Snow y col., 1989, Cell 59, 313-323) y después se resuspendieron en el mismo medio con el volumen original. Para los experimentos de inhibición del anticuerpo se recogieron células transfectadas con Notch y se lavaron en medio M3 y a continuación se trataron antes de la agregación en medio M3 durante 1 h a 4ºC, con una dilución 1:250 de sueros inmunes o preinmunes de cada uno de los cuatro ratones inmunizados con proteínas de fusión que contenían segmentos procedentes del dominio extracelular de Notch (véase, Preparación de Anticuerpos,
arriba).

6.1.5. Inmunofluorescencia

Las células se recogieron por centrifugación (3000 rpm durante 20 segundos en una microcentrífuga de Eppendorf) y se fijaron en tubos Eppendorf de 0,6 ml con 0,5 ml de paraformaldehído al 2% preparado recientemente, en PBS durante 10 min a temperatura ambiente. Después de la fijación, se recogieron las células por centrifugación, se lavaron dos veces en PBS y se tiñeron durante 1 h con anticuerpo primario en PBS, con saponina al 0,1% (SIGMA) y suero de cabra normal al 1% (Pocono Rabbit Farm, Canadensis, PA). El material sobrenadante del anticuerpo monoclonal se diluyó 1:10 y los sueros de ratón o rata se diluyeron 1:1000 para esta etapa. Las células se lavaron a continuación una vez en PBS y se tiñeron durante 1 h con anticuerpos secundarios específicos (doble grado de marcación de cabra anti-ratón y cabra anti-rata, Jackson Immunoresearch) en suero de cabra normal y PBS-saponina. Después de esta incubación, las células se lavaron dos veces en PBS y se montaron en portaobjetos con 90% de glicerol, 10% de Tris 1 M (pH 8,0) y 0,5% de galato de n-propilo. Las células se visionaron bajo epifluorescencia en un microscopio Orthoplan 2 de Leitz.

Se tomaron micrografías confocales empleando el sistema de Bio-Rad MRC 500 conectado a un microscopio Axiovert compuesto de Zeiss. Las imágenes se recogieron empleando grupos de filtros BHS y GHS, se alinearon empleando el programa ALIGN, y se fusionaron empleando MERGE. La extracción fluorescente desde el canal verde hasta el canal rojo, se redujo empleando el programa BLEED (todos los programas fueron proporcionados por Bio-Rad). Las fotografías se obtuvieron directamente de la pantalla del ordenador empleando una película Ectar 125 de Kodak.

6.1.6. Materiales lisados celulares, inmunoprecipitaciones y transferencias de tipo Western

El material lisado no desnaturalizado con detergente de cultivo de tejido y de embriones de tipo silvestre Canton-S, se preparó en hielo con un volumen de tampón de lisis (NaCl 300 mM, Tris 50 mM [pH 8,0], 0,5% de NP-40, 0,5% de desoxicolato, CaCl_{2} 1 mM, MgCl_{2} 1 mM) de \sim10 células con fluoruro de fenilmetisulfonilo 1 mM (PMSF) y fluorofosfato de diisopropilo diluido 1:2500 como inhibidores de proteasas. El material lisado se trituró secuencialmente empleando agujas de 18G, 21G y 25G fijadas a jeringas de tuberculina de 1 cc y después se centrifugaron a velocidad máxima en una microfuga, 10 min a 4ºC para separar el material insoluble. La inmunoprecipitación se realizó añadiendo \sim1 \mug de anticuerpo (1-2 \mul de antisuero policlonal) a 250-500 \mul de material lisado de células y se incubó durante 1 h a 4ºC con agitación. A esta mezcla se añadieron 15 \mug de anticuerpos de cabra anti-ratón (Jackson Immunoresearch; estos anticuerpos reconocen las IgG tanto de ratón como de rata) y se dejó incubar durante 1 h a 4ºC con agitación. Esto fue seguido de la adición de 100 \mul de bacterias Staphylococcus aureus (Staph A) fijadas (Zysorbin, Zymed; resuspendidas según las instrucciones del fabricante), que se recolectaron, se lavaron cinco veces en tampón de lisis y se incubaron durante una hora más. Los complejos de Staph A-anticuerpo se sedimentaron a continuación por centrifugación y se lavaron tres veces en tampón de lisis seguido de dos lavados de 15 min en tampón de lisis. Después de transferir a un tubo nuevo, el material precipitado se suspendió en 50 \mul de tampón de muestra SDS-PAGE, se hirvió inmediatamente durante 10 min, se dejó correr en geles con gradiente 3%-15% y se transfirió a nitrocelulosa y se detectó empleando anticuerpos monoclonales y anticuerpos secundarios de cabra anti-ratón conjugados con HRP, tal y como se ha descrito previamente (Johansen y col., 1989, J. Cell Biol. 109, 2427-2440). Para las muestras de proteína celular total empleadas en las transferencias de tipo Western, (Figura 2), se recogieron células por centrifugación, se lisaron en un volumen de 10 células de tampón por muestra que contenía PMSF 1 mM y se hirvió
inmediatamente.

6.2 Resultados 6.2.1 La Expresión de Notch y Delta en células cultivadas

Para detectar interacciones entre Notch y Delta, examinamos el comportamiento de células que expresaban estas proteínas en su superficie, empleando un ensayo de agregación. Escogimos la línea celular S2 (Schneider, 1972, J. Embryol. Exp. Morph. 27, 353-365) para estos estudios por distintas razones. Primera, estas células son relativamente no adhesivas, crecen en suspensión y se han utilizado previamente en un ensayo similar para estudiar la función de la fasciclina III (Snow y col., 1989, Cell 59, 313-323). Segunda, son fácilmente transfectables y está disponible un vector de promotor de metalotioneína inducible que se ha diseñado para la expresión de genes exógenos en células cultivadas de Drosophila (Bunch y col., 1988, Nucl. Acids Res. 16, 1043-1061). Tercera, las células S2 expresan un mensaje de Notch aberrante y Notch no detectable debido a una reorganización del extremo 5' de la secuencia codificadora de Notch (véase a continuación). Estas células también expresan Delta no detectable (véase a
continuación).

Dibujos esquemáticos de las estructuras artificiales empleadas, se muestran en la Figura 1 (véase la Sección 6.1 de Procedimientos Experimentales, para más detalles). Para expresar Notch en células cultivadas, el minigen MG11a de Notch, descrito por Ramos y col. (1989, Genetics 123, 337-348) se insertó en el vector promotor de metalotioneína pRmHa-3 (Bunch y col., 1988, Nucl. Acids Res. 16, 1043-1061). La estructura artificial de expresión de Delta se preparó insertando ADNc de Dl1, que contiene la secuencia codificadora completa para Delta, procedente del transcrito de Delta embrionario principal (5.4Z; Kopczynski y col., 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735) en el mismo vector. Una tercera estructura artificial, denominada ECN1 para "Notch 1 extracelular", contiene la región promotora 5' de Notch y la señal de poliadenilación 3' de Notch, junto con una capacidad codificadora de las regiones extracelulares y transmembranales del gen Notch procedente de secuencias genómicas, pero carece de secuencias codificadoras de 835 aminoácidos del dominio intracelular de \sim1000 aminoácidos. Además, debido a un cambio del marco de lectura pronosticado, los 78 residuos de aminoácidos carboxi-terminales restantes son reemplazados por una nueva cola carboxiterminal de 59 aminoácidos (véase, Procedimientos Experimentales).

Para todos los experimentos descritos en esta memoria, las estructuras artificiales de expresión se transfectaron en células S2 y se expresaron más transitoriamente que en transformantes estables. Las células con expresión estaban compuestas típicamente por 1%-5% del total de la población celular, como se deduce por la tinción inmunofluorescente (datos no mostrados). Una transferencia de tipo Western de proteínas expresadas después de la transfección, se muestra en la Figura 2. Las células no transfectadas no expresan niveles detectables de Notch o de Delta. Sin embargo, después de la transfección, proteínas con los pesos moleculares evidentes pronosticados, son fácilmente detectables empleando anticuerpos monoclonales específicos para cada una de estas proteínas, respectivamente. En el caso de Notch, múltiples bandas eran evidentes en células transfectadas por debajo del producto de longitud completa de \sim300 kd. No sabemos hasta ahora si estas bandas representan una degradación de Notch durante la preparación de la muestra o quizás en la síntesis o en el procesamiento de los intermediarios de Notch, que están presentes dentro de células, pero las detectamos de forma estable en muestras procedentes de células transfectadas y de embriones. Además, realizamos una tinción inmunofluorescente de células transfectadas vivas con anticuerpos específicos de los dominios extracelulares de cada proteína, para someter a ensayo la expresión de la superficie celular de estas proteínas. En cada caso encontramos una tinción de superficie, tal y como se esperaba para un antígeno de superficie. Resumiendo, estos resultados muestran claramente que las estructuras artificiales de Notch y Delta mantienen la expresión de proteínas de los tamaños esperados y la localización subcelular.

6.2.2. Células que expresan agregado de Notch y Delta

Para someter a ensayo la predicción de que Notch y Delta interaccionan, diseñamos un ensayo de agregación sencillo para detectar estas interacciones entre proteínas expresadas en la superficie de células S2. Pensamos que si Notch y Delta eran capaces de formar complejos heterotípicos estables en la superficie celular, entonces células que expresan estas proteínas se podrían unir entre sí y formar agregados bajo condiciones adecuadas. Un sistema de ensayo similar se ha descrito recientemente para la proteína fasciclina III (Snow y col., 1989, Cell 59, 313-323).

Las células S2 en crecimiento en fase logarítmica se transfectaron separadamente con la estructura artificial del promotor de metalotioneína tanto de Notch como de Delta. Después de inducir con CuSO_{4}, las células transfectadas se mezclaron en cantidades iguales y se dejaron agregar durante una noche a temperatura ambiente (para más detalles, véase la Sección 6.1 de Procedimientos Experimentales). Alternativamente, en algunos experimentos que pretendían reducir la actividad metabólica, las células se mezclaron cuidadosamente a 4ºC durante 1-2 h. Para determinar si se han formado los agregados, las células se procesaron para microscopía inmunofluorescente empleando anticuerpos específicos para cada producto génico y anticuerpos secundarios marcados diferentemente con fluorescencia. Como se ha mencionado previamente, las células con expresión constituyen normalmente menos del 5% del total de la población celular debido a que empleamos transformantes transitorios más que transformantes estables. Las células restantes no expresaron una proteína dada o la expresaron a niveles demasiado bajos para la detección con microscopía inmunofluorescente. Como testigos, realizamos agregaciones con un solo tipo de célula transfectada.

La Figura 3 muestra fotomicrografías representativas de experimentos de agregación y la Tabla I presenta los resultados en forma numérica. Tal y como es evidente por la Figura 3C y la Tabla I, aunque las células que expresan Notch (Notch^{+}) solas no forman agregados en nuestro ensayo, las células que expresan Delta (Delta^{+}) si que los forman.

1

La tendencia de las células Delta^{+} a agregarse era evidente incluso en muestras de testigos no agregados (Tabla I), en donde agrupaciones celulares de 4-8 células que probablemente se originaron por la adherencia entre células mitóticas hermanas se presentaban comúnmente. Sin embargo, las agrupaciones eran más comunes después de incubación bajo condiciones de agregación (por ejemplo, 19% de células Delta^{+} en agregados antes de la incubación, frente a 37% de células Delta^{+} en agregados después de la incubación; Experimento 1 en la Tabla I), indicando que las células Delta^{+} son capaces de formar contactos estables entre sí en este ensayo. Es importante tener en cuenta que, aunque las células sin teñir constituyen sobre 90% de las células en nuestras transfecciones transitorias, no las encontramos nunca dentro de los agregados. En raras ocasiones, se encontraron células sin teñir en el borde de un agregado. Debido a la presencia común de células que se tiñen débilmente en los bordes de agregados, es probable que estas células aparentemente sin expresión, estuvieran transfectadas pero expresaran niveles de Delta insuficientes para ser detectadas por inmunofluorescencia.

Como un contraste notable con experimentos testigos con células Notch^{+} aisladas, la agregación de mezclas de células Notch^{+} y Delta^{+} daba como resultado la formación de agrupaciones de hasta 20 células o más (Figuras 3D-3H, Tabla I). Como muestra la Tabla I, la fracción de células con expresión encontradas en agrupaciones de cuatro o más células teñidas después de 24 h de agregación, fluctúa desde 32%-54% en mezclas de células Notch^{+} y Delta^{+}. Esta fluctuación era similar a la observada en células Delta^{+} aisladas (37%-40%) pero muy diferente a la de células Notch^{+} aisladas (sólo 0%-5%). Aunque se encontraron unas pocas agrupaciones que constaban sólo de células Delta^{+}, las células Notch^{+} no se encontraron nunca en agrupaciones mayores de cuatro a cinco células, a no ser que también estuvieran presentes células Delta^{+}. De nuevo, ninguna de las células dentro de estas agrupaciones expresaban Notch ni Delta, aunque las células transfectadas estaban compuestas sólo por una pequeña fracción de la población celular total. A las 48 h (Tabla I, experimentos 5 y 6), el grado de agregación parecía mayor (63%-71%), sugiriendo que después de 24 h, la agregación no ha alcanzado todavía un máximo bajo esas condiciones. También, células cotransfectadas con estructuras artificiales de Notch y Delta (de modo que todas las células transfectadas expresan ambas proteínas) se agregaron de forma similar bajo las mismas condiciones experimen-
tales.

Estos resultados indican que la agregación observada en estos experimentos requiere la expresión de Notch y Delta y que no es debida a la expresión fortuita de otra proteína interaccionante en células S2 no transfectadas. Sometimos posteriormente a ensayo la especificidad de esta interacción, diluyendo células Notch^{+} y Delta^{+} 10 veces con células S2 no transfectadas y permitiéndolas después agregarse durante 24 h a temperatura ambiente. En este experimento, 39% de las células con expresión se encontraron en agregados con otras células con expresión, aunque formaban menos de 0,1% del total de la población celular. Sin embargo no era sorprendente, que estos agregados fueran menores por término medio que los encontrados en experimentos de agregación convencionales. Además, para vigilar la posibilidad de que células Notch^{+} fueran reclutadas de forma no específica en los agregados Delta^{+}, debido a que sobreexpresan un tipo único de proteína en la superficie celular, mezclamos células Delta^{+} con células que expresaban neuroglía, una proteína transmembranal de la superficie celular (Bieber y col., 1989, Cell 59, 447-460), bajo el control del promotor de metalotioneína (esta estructura artificial de metalotioneína-neuroglía la proporcionó amablemente A. Bieber y C. Goodman). No observamos ninguna tendencia de las células de neuroglía^{+} a adherirse a agregados Delta^{+}, indicando que la agregación Notch-Delta no es únicamente el resultado de altos niveles de expresión proteica sobre la superficie celular.

También sometimos a ensayo directamente la implicación de Notch en el proceso de agregación examinando, el efecto de una mezcla de antisueros policlonales dirigidos contra proteínas de fusión que abarcaban casi todo el dominio extracelular de Notch en agregación (véase la Sección 6.1 de Procedimientos Experimentales). Para minimizar los artefactos que pudieran surgir debido a la respuesta metabólica para arreglar los antígenos de superficie, se realizó un tratamiento con anticuerpos y el ensayo de agregación a 4ºC en estos experimentos. Las células Notch^{+} se incubaron con sueros de ratón preinmunes o inmunes durante 1 h, se añadieron las células Delta^{+} y se realizó la agregación durante 1-2 h. Aunque las células Notch^{+} tratadas previamente con sueros preinmunes se agregaban con células Delta^{+} (en uno de los tres experimentos, 23% de las células Notch^{+} estaban en agregados de células Notch^{+}-Delta^{+}), las tratadas con sueros inmunes no se agregaban (sólo 2% de las células Notch^{+} estaban en agregados). Este resultado sugiere que el dominio extracelular de Notch es necesario para la agregación de células Notch^{+}-Delta^{+}, aunque no podemos excluir la posibilidad de que la reducida agregación se debiera a efectos estéricos inhibitorios o de estructura de membrana resultantes de la exposición de células Notch^{+} al antisuero.

Otras tres observaciones dignas de ser mencionadas son evidentes en la Figura 3. Primera, aunque Delta era casi siempre evidente sólo en la superficie celular (Figuras 3B y 3C), la tinción de Notch era siempre evidente tanto en la superficie celular como intracelularmente, frecuentemente asociada con estructuras vesiculares (Figura 3A). Segunda, observamos consistentemente una diferencia morfológica entre células Delta^{+} y Notch^{+} en agregados mezclados que se incubaron durante una noche. Las células Delta^{+} tenían frecuentemente amplias extensiones que rodeaban completamente las células Notch^{+} adyacentes, mientras que células Notch^{+} tenían casi siempre una apariencia redondeada sin extensiones citoplasmáticas observables (Figura 3G). Tercera, Notch y Delta aparecían frecuentemente agregadas dentro de regiones de contacto entre células Notch^{+} y Delta^{+}, produciendo una banda distinta de tinción inmunofluorescente (Figuras 3D-3F). Estas bandas eran fácilmente visibles en secciones ópticas visionadas con microscopio confocal (Figura 3H), indicando que no se debían únicamente a un artefacto del montaje íntegro. También observamos que estas bandas se formaban rápidamente (al cabo de 2 h de mezclar las células) y a 4ºC, indicando que su formación no dependía probablemente del metabolismo celular. Estas observaciones se habrían esperado si, dentro de las regiones de contacto celular, Notch y Delta se unen entre sí y por tanto se quedan inmovilizadas. Este patrón de expresión también es consistente con el observado para otras proteínas que median en la agregación celular (Takeichi, 1988, Development 102, 639-655; Snow y col., 1989, Cell 59, 313-323).

6.2.3. La agregación mediada por Notch-Delta es dependiente de calcio

Estudios previos han sugerido que repeticiones similares a EGF que contienen una secuencia de consenso particular pueden servir como dominios de unión a calcio (Ca^{2+}) (Morita y col., 1984, J. Biol. Chem. 259, 5698-5704; Sugo y col., 1984, J. Biol. Chem. 259, 5705-5710; Rees y col., 1988, EMBO J. 7, 2053-2061; Handford y col., 1990, EMBO J. 9, 475-480). Para al menos dos de estas proteínas, C y C1, la unión a Ca^{2+} ha demostrado ser adicionalmente un componente necesario para sus interacciones con otras proteínas (Villiers y col., 1980, FEBS Lett. 117, 289-294; Esmon y col., 1983, J. Biol. Chem. 258, 5548-5553; Johnson y col., 1983, J. Biol. Chem. 258, 5554-5560). Muchas de las repeticiones homólogas a EGF dentro de Notch y la mayoría de estas dentro de Delta, contienen la secuencia de consenso necesaria para la unión a Ca^{2+} (Rees y col., 1988, EMBO J. 7, 2053-2061; Stenflo y col., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 368-372; Kopczynski y col., 1988, Genes Dev. 2, 1723- 1735; Handford y col., 1990, EMBO J. 9, 475-480), aunque no se ha determinado todavía si estas proteínas se unen o no a calcio. Por tanto sometimos a ensayo la capacidad de células con expresión a agregarse en presencia o en ausencia de iones Ca^{2+}, para determinar si existe un requerimiento de ión Ca^{2+} para la agregación de Notch-Delta. Para minimizar posibles efectos inespecíficos debidos a respuestas metabólicas por la eliminación de Ca^{2+}, realizamos estos experimentos a 4ºC. Las mezclas testigos de células Notch^{+} y células Delta^{+} incubadas con condiciones de agregación en un medio que contenía Ca^{2+} a 4ºC, formaban rápidamente agregados (un promedio de 34% \pm 13%, media \pm SD, n = 3; Tabla II). Por el contrario, células mezcladas en medio que carecía de iones Ca^{2+} y que contenía EGTA formaban pocos agregados (5% \pm 5%). Estos resultados demuestran claramente una dependencia de Ca^{2+} en la agregación mediada por Notch-Delta, y contrastan marcadamente con los publicados recientemente para las proteínas fasciclina III y fasciclina I de Drosophila en células S2 (Snow y col., 1989, Cell 59, 313-323; Elkins y col., 1990 J. Cell Biol. 110, 1825-1832), en los que no se detectaba ningún efecto de la eliminación de iones Ca^{2+} sobre la agregación mediada por ambas proteínas.

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TABLA II Efecto de Ca^{2+} exógeno sobre la agregación^{a} de Notch^{+}-Delta^{+}

2

6.2.4. Notch y Delta interaccionan dentro de una sola célula

Nos preguntamos si Notch y Delta están asociadas dentro de la membrana de una célula que expresa ambas proteínas, examinando las distribuciones de Notch y Delta en células cotransfectadas. Como se muestra en las Figuras 4A y 4B, estas dos proteínas muestran frecuentemente distribuciones muy similares en la superficie de células cotransfectadas. Para someter a ensayo si la co-localización observada era una coincidencia o representaba una interacción estable entre Notch y Delta, tratamos células vivas con un exceso de antisuero policlonal anti-Notch. Este tratamiento daba como resultado la "formación de placas" de Notch en la superficie de células con expresión, en placas discretas detectadas por inmunofluorescencia. Había una correlación distinta entre las distribuciones de Notch y Delta en las superficies de estas células después de este tratamiento (Figuras 4C y 4D), indicando que estas proteínas están asociadas dentro de la membrana. Es importante tener en cuenta que estos experimentos no cuestionan si esta asociación es directa o está mediada por otros componentes, tales como el citoesqueleto. Para controlar la posibilidad de que Delta forme placas de forma no específica en este experimento, cotransfectamos células con Notch y con la estructura artificial de neuroglía mencionada anteriormente (A. Bieber y C. Goodman, datos no publicados) y se formaron parches con antisueros anti-Notch. En este caso, no había una correlación evidente entre Notch y neuroglía.

6.2.5. Las interacciones con Delta no requieren el dominio intracelular de Notch

Además de un dominio extracelular grande que contiene repeticiones similares a EGF, Notch tiene un dominio intracelular (IC) medible de \sim940 aminoácidos. El dominio IC incluye un sitio de fosforilación (Kidd y col., 1989, Genes Dev. 3, 1113-1129), un dominio de unión putativa a nucleótidos, una extensión de poliglutamina (Wharton y col., 1985, Cell 43, 567-581; Kidd y col., 1986, Mol. Cell. Biol. 6, 3094-3108) y secuencias homólogas al gen cdc10 de levadura, que está implicado en el control del ciclo celular en levaduras (Breeden y Nasmyth, 1987, Nature 329, 651-654). Una vez dado el tamaño y la complejidad estructural de este dominio, nos preguntamos si era necesario para las interacciones de Notch-Delta. Para ello usamos una variante de la estructura artificial de Notch, de la cual se han eliminado las secuencias codificadoras de \sim835 aminoácidos del dominio IC, incluyendo todas las características estructurales mencionadas antes, (dejando 25 aminoácidos proximales a la membrana y un nuevo extremo carboxi-terminal de 59 aminoácidos; véase Procedimientos Experimentales y la Figura 1 para más detalles). Esta estructura artificial, denominada ECN1, se expresaba constitutivamente bajo el control del promotor normal de Notch en células transfectadas a un nivel inferior que el observado para las estructuras artificiales del promotor de metalotioneína, pero todavía era detectable fácilmente con inmunofluorescencia.

En los ensayos de agregación, las células que expresaban la estructura artificial ECN1, formaban consistentemente agregados con células Delta^{+} (31% de células que expresaban ECN1 estaban en agregados en uno de tres experimentos; véase también la Figura 3I), pero no con ellas mismas (sólo 4% en agregados), lo mismo que cuando observamos células que expresaban Notch intacta. También observamos bandas intensas de tinción de ECN1 dentro de regiones de contacto con células Delta^{+}, indicando de nuevo una localización de ECN1 dentro de regiones de contacto entre células. Para someter a ensayo las interacciones dentro de la membrana, repetimos los experimentos de formación conjunta de placas con antígenos de superficie, empleando células cotransfectadas con las estructuras artificiales ECN1 y Delta. Tal y como se observó para Notch intacta, encontramos que cuando en ECN1 se formaban placas empleando antisueros policlonales contra el dominio extracelular de Notch, ECN1 y Delta se localizaban conjuntamente en la superficie celular (Figuras 4E y 4F). Estos resultados demostraban que las interacciones observadas entre Notch y Delta dentro de la membrana no requieren la parte delecionada del dominio IC de Notch y están mediadas probablemente por el dominio extracelular. Sin embargo, es posible que las secuencias de la transmembrana o del dominio IC restantes en ECN1 sean suficientes para intervenir en las interacciones dentro de una sola célula.

6.2.6. Notch y Delta forman complejos intermoleculares solubles en detergente

Simultáneamente, tomamos los resultados anteriores para indicar interacciones moleculares entre Notch y Delta presentes dentro de la misma membrana y entre estas proteínas expresadas en células diferentes. Como ensayo adicional para tales interacciones, nos preguntamos si estas proteínas coprecipitarían desde extractos de células que expresan Notch y Delta, sin desnaturalizar con detergente. Si Notch y Delta forman un complejo intermolecular estable entre o dentro de las células, debería ser posible precipitar ambas proteínas desde extractos celulares, empleando antisueros específicos dirigidos contra una de estas proteínas. Realizamos este análisis inmunoprecipitando Delta con antisueros policlonales procedentes de material lisado con NP-40/desoxicolato (véanse los Procedimientos Experimentales) de células cotransfectadas con las estructuras artificiales de Notch y Delta, a las que se había permitido agregarse durante una noche o de embriones de tipo silvestre de 0-24 h. No fuimos capaces de realizar los inmunoprecipitados inversos porque no era posible discernir sin ambigüedad una banda débil de Delta entre la señal de fondo de las bandas de Staph A. Es importante tener en cuenta que sometimos a ensayo este antisuero policlonal anti-Delta para estudiar la reactividad cruzada contra Notch en material lisado de células (Figura 5A, pista 1) y por inmunofluorescencia (por ejemplo, comparar las Figuras 3D y 3E) y no encontramos ninguna. Después de repetidos lavados para eliminar proteínas que se adherían inespecíficamente, sometimos a ensayo la coprecipitación de Notch empleando un anticuerpo monoclonal (MAb C17.9C6) contra Notch en transferencias tipo Western.

Como se muestra en la Figura 5, no detectamos coprecipitación de Notch en inmunoprecipitados con Delta procedentes de células cotransfectadas y embriones. Sin embargo, Notch coprecipitada parecía estar presente en cantidades mucho menores que Delta y por eso era difícil de detectar. Esta disparidad se debe lo más probable a la rotura de complejos Notch-Delta durante las etapas de lisis y de lavado del procedimiento. Sin embargo, también es posible que esta disparidad refleje una interacción no equimolar entre Notch y Delta o afinidades muy diferentes de los antisueros empleados para detectar estas proteínas. El hecho de que la inmunoprecipitación de Delta dé como resultado la coprecipitación de Notch, constituye una prueba directa de que estas dos proteínas forman complejos intermoleculares estables en células S2 transfectadas y en células embrionarias.

6.3. Discusión

Hemos estudiado las interacciones entre los productos proteicos de dos de los loci neurógenos, Notch y Delta, para entender mejor sus funciones celulares. Empleando un ensayo de agregación in vitro que utiliza normalmente células S2 no adhesivas, mostramos que células que expresan Notch y Delta se adhieren específicamente entre sí. La especificidad de esta interacción es evidente por la observación de que agregados de células Notch^{+}-Delta^{+} raramente contienen células sin expresión, aún cuando las células sin expresión componen la amplia mayoría de la población total celular en estos experimentos. Proponemos que esta agregación está mediada por la unión heterotípica entre los dominios extracelulares de Notch y Delta presentes en las superficies de células con expresión. De acuerdo con esta propuesta, encontramos que antisueros dirigidos contra el dominio extracelular de Notch, inhiben la agregación mediada por Notch-Delta, y que la variante de Notch ECN1, que carece de casi todo el dominio intracelular de Notch, puede mediar en la agregación con células que expresan Delta. También encontramos que células que expresan sólo Delta se agregan entre sí, aunque las que expresan sólo Notch no lo hacen. Estos resultados sugieren que Delta puede participar en una interacción homotípica cuando está presente en superficies celulares yuxtapuestas, pero que Notch no puede bajo nuestras condiciones de ensayo.

La propuesta de que Notch y Delta interaccionan en la superficie celular se apoya adicionalmente por tres líneas de prueba. Primera, encontramos una intensa localización de ambas proteínas dentro de regiones de contacto entre células Notch^{+} y Delta^{+}, lo que implica que Notch y Delta interaccionan directamente, incluso cuando se expresan en células diferentes. Segunda, Notch y Delta se localizan conjuntamente en la superficie de células que expresan ambas proteínas, lo que sugiere que estas proteínas pueden interaccionar dentro de la membrana celular. Tercera, Notch y Delta se pueden coprecipitar desde extractos no desnaturalizados con detergente no desnaturalizante de células cultivadas que expresan ambas proteínas, así como desde extractos de células embrionarias. Simultáneamente, estos resultados apoyan fuertemente la hipótesis de que Notch y Delta pueden interaccionar heterotípicamente cuando se expresan en las superficies de las mismas células o de células diferentes.

La base subyacente para las interacciones genéticas observadas entre Notch y Delta y entre Notch y mam (Xu y col., 1990, Genes Dev. 4, 464-475) puede ser una interacción sensible a la dosis entre las proteínas codificadas por estos genes.

Dos líneas de pruebas sugieren que las proteínas Notch y Delta funcionan similarmente in vitro e in vivo. Primera, los análisis genéticos han indicado que la estequiometría de Notch y Delta es crucial para su función en el desarrollo. Nuestras observaciones de que ambas asociaciones Notch-Delta y Delta-Delta pueden tener lugar in vitro, implican que Notch y Delta pueden competir por la unión a Delta. Por tanto, interacciones genéticas sensibles a la dosis entre Notch y Delta pueden ser el resultado de interacciones por unión competitiva entre sus productos proteicos. Segunda, hemos sido capaces de detectar asociación Notch-Delta en material lisado de células cultivadas y en material lisado de embriones de Drosophila, empleando inmunoprecipitación. Resumiendo, estos análisis genéticos y bioquímicos sugieren que Notch y Delta se asocian in vivo de una forma similar a la que proponemos basándonos en nuestros ensayos de agregación.

Los análisis genéticos y moleculares de Notch también han mostrado la posibilidad de que puede haber interacciones entre proteínas Notch individuales (Portin, 1975, Genetics 81, 121-133; Kelley y col., 1987, Cell 51, 539-548; Artavanis-Tsakonas, 1988, Trends Genet. 4, 95-100). Realmente, Kidd y col., (1989, Genes Dev. 3, 1113-1129) han propuesto que esta proteína forma dímeros con puentes disulfuro, aunque este punto no se ha probado todavía rigurosamente. Con o sin la formación de enlaces covalentes, tales interacciones podrían tener lugar presumiblemente dentro de una sola célula o entre células. Sin embargo, nuestro descubrimiento de que células Notch^{+} no se agregan homotípicamente, sugiere que las asociaciones Notch-Notch ocurren probablemente dentro de una sola célula y no entre células. Alternativamente, es posible que las interacciones homotípicas de Notch requieran productos génicos que no se expresan en células S2.

Las interacciones Notch-Delta indicadas por nuestros análisis están mediadas probablemente por los dominios extracelulares de estas proteínas. Los experimentos de agregación que emplean la estructura artificial ECN1, de la cual se ha eliminado casi todo el dominio intracelular de Notch o se ha alterado por mutagénesis in vitro, confirman esta conclusión. Experimentos adicionales que demuestran las asociaciones ECN1-Delta dentro de la membrana sobre la base de su capacidad de formar placas conjuntamente, indicaban que estas interacciones estaban mediadas también probablemente por los dominios extracelulares de Notch y Delta, aunque en este caso no podemos excluir una posible implicación del dominio transmembranal o de la parte restante del dominio intracelular de Notch. Estos resultados son especialmente interesantes de cara al hecho de que Notch y Delta tienen repeticiones similares a EGF dentro de sus dominios extracelulares (Wharton y col., 1985, Cell 43, 567-581; Kidd y col., 1986, Mol. Cell Biol. 6, 3094-3108; Vassin y col., 1987, EMBO J. 6, 3431-3440; Kopczynski y col., 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735).

Una segunda conclusión de interés en relación con los dominios de EGF es la propuesta de que pueden servir como dominios de unión a Ca^{2+} cuando contienen una secuencia de consenso que consta de los residuos Asp, Asp/Asn, Asp/Asn y Tyr/Phe en posiciones conservadas dentro de las repeticiones similares a EGF (Rees y col., 1988, EMBO J. 7, 2053-2061; Handford y col., 1990, EMBO J. 9, 475-480). Comparaciones con una secuencia de consenso propuesta para la unión a Ca^{2+}, han revelado que secuencias similares se encuentran dentro de la mayoría de las repeticiones similares a EGF de Notch (Rees y col., 1988, EMBO J. 7, 2053-2061) y dentro de las repeticiones similares a EGF de Delta (Kopczynski y col., 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735). Además, análisis de secuencias de mutaciones de Notch han mostrado que ciertos alelos de Ax están asociados con cambios en aminoácidos dentro de este dominio putativo de unión a Ca^{2+} (Kelley y col., 1987, Cell 51, 539-548; Hartley y col., 1987, EMBO J. 6, 3407-3417; Rees y col., 1988, EMBO J. 7, 2053-2061). Por ejemplo, la mutación Ax^{E2}, que se correlaciona con un cambio de His a Tyr en la 29ª repetición similar a EGF, parece mover esta repetición hacia la secuencia de consenso para la unión a Ca^{2+}. Recíprocamente, la mutación Ax^{9B2} parece mover la 24ª repetición similar a EGF lejos de esta secuencia de consenso como resultado de un cambio de Asp a Val. Por tanto, las interacciones genéticas entre los alelos Ax y las mutaciones de Delta (Xu y col., 1990, Genes Dev. 4, 464-475) muestran la posibilidad de que los iones Ca^{2+} tengan un papel en las interacciones Notch-Delta. Nuestro descubrimiento de que Ca^{2+} exógeno es necesario para la agregación mediada por Notch-Delta de células S2 transfectadas, apoya esta afirmación.

Tal y como hemos argumentado (Johansen y col., 1989, J. Cell Biol. 109, 2427-2440; Alton y col., 1989, Dev. Genet. 10, 261-272), sobre la base de análisis moleculares y genéticos previos, no se podría pronosticar con ninguna certeza la función celular de Notch o Delta más allá de su implicación en las interacciones célula-célula. Sin embargo, dados los resultados presentados en esta memoria, ahora parece razonable sugerir que Notch y Delta pueden funcionar in vivo, para mediar en interacciones adhesivas entre células. Al mismo tiempo, es totalmente posible que las interacciones Notch-Delta observadas no puedan reflejar sólo una función adhesiva y puedan reflejar además interacciones de la unión de receptor-ligando que tienen lugar in vivo. Realmente, la presencia de un complejo estructural de 1000 aminoácidos del dominio intracelular dentro de Notch, puede ser más consistente con un papel en la transducción de señales que con interacciones puramente adhesivas. Dado que Notch puede tener una función adhesiva en concierto con Delta, la expresión axonal de Notch puede tener algún papel en la guía de los axones.

7. Las repeticiones EGF 11 y 12 de Notch son necesarias y suficientes para la agregación mediada por Notch-Delta

En este estudio, utilizamos el mismo ensayo de agregación que el descrito en la Sección 6, junto con mutantes por deleción de Notch para identificar regiones dentro del dominio extracelular de Notch necesarias para las interacciones con Delta. Presentamos la prueba de que las repeticiones EGF de Notch están directamente implicadas en esta interacción y que sólo dos de las 36 repeticiones EGF parecen ser necesarias. Demostramos que estas dos repeticiones EGF son suficientes para la unión con Delta y que la dependencia de calcio de la agregación mediada por Notch-Delta, también está asociada con estas dos repeticiones. Finalmente, las dos repeticiones EGF procedentes del homólogo de Xenopus de Notch, también median en la agregación con Delta, implicando que no sólo la estructura de Notch se ha conservado evolutivamente, sino también su función. Estos resultados sugieren que el dominio extracelular de Notch es sorprendentemente modular y podría unirse potencialmente a una variedad de proteínas además de a Delta.

7.1. Procedimientos experimentales 7.1.1. Estructuras artificiales de expresión

Las estructuras artificiales descritas se obtienen todas a partir de la estructura artificial de expresión nº 1 de Notch de longitud completa, pMtNMg (véase Sección 6, más arriba). Todas las ligaciones se realizaron usando fragmentos de ADN cortados de geles de agarosa de bajo punto de fusión (Sea Plaque, FMC BioProducts). El fragmento EcoRI-XhoI de 6 kb procedente de pMtNMg que contenía el dominio extracelular completo de Notch, se ligó en los sitios EcoRI-XhoI del vector Bluescript (Stratagene), y se denominó RI/XBS. Todas las deleciones y las inserciones posteriores de las repeticiones EGF se realizaron en este subclon. La secuencia de Notch que contenía el fragmento EcoRI/XhoI de estos derivados de RI/XBS se mezcló a continuación con el fragmento XhoI-XbaI de 5,5 kb procedente de pMtNMg, que contenía el dominio intracelular y las secuencias 3' necesarias para la poliadenilación y después se insertó en el sitio EcoRI-XbaI de pRMHa-3 (Bunch y col., 1988, Nucl. Acids Res. 16, 1043-1061) en una ligación de tres trozos. Todos los números siguientes se refieren a las coordenadas de nucleótidos de la secuencia de Notch según Wharton y col. (1985, Cell 43, 567-581).

Para la estructura artificial nº 2 DSph, se digirió RI/XBS completamente con SphI y después se recircularizó, dando como resultado una deleción en marco de 3,5 kb desde SphI(996) hasta SphI(4545).

Para la estructura artificial nº 3 \DeltaCla, RI/XBS se digirió completamente con ClaI y después se ligó de nuevo, produciendo una deleción en marco de 2,7 kb desde ClaI(1668) hasta ClaI(4407). La unión por ligación se comprobó mediante secuenciación de la doble cadena (como describen Xu y col., 1990, Genes Dev. 4, 464-475) empleando el equipo de reactivos de Sequenase (U.S. Biochemical Corp., Cleveland). Encontramos que aunque existe el sitio ClaI en la posición 4566 de acuerdo con la secuencia, no era reconocido bajo nuestras condiciones por la enzima de restricción ClaI.

Para las estructuras artificiales nº 4-12, RI/XBS se digirió parcialmente con ClaI y después se ligó de nuevo para producir todas las combinaciones posibles de deleciones en marco: en la estructura artificial nº 4 \DeltaEFG7-17, se eliminaba la secuencia entre ClaI(1668) y ClaI(2820); en la estructura artificial nº 5 \DeltaEGF9-26 se eliminaba la secuencia entre ClaI(1905) y ClaI(3855); en la estructura artificial nº 6 \DeltaEGF17-31 se eliminaba la secuencia entre ClaI(2820) y ClaI(4407); en la estructura artificial nº 7 \DeltaEGF7-9 se eliminaba la secuencia entre ClaI(1668) y ClaI(1905); en la estructura artificial nº 8 \DeltaEGF9-17 se eliminaba la secuencia entre ClaI(1905) y ClaI(2820); en la estructura artificial nº 9 \DeltaEGF17-26 se eliminaba la secuencia entre ClaI(2820) y ClaI(3855); en la estructura artificial nº 10 \DeltaEGF 26-30 se eliminaba la secuencia entre ClaI(3855) y ClaI(4407); en la estructura artificial nº 11 \DeltaEGF9-30 se eliminaba la secuencia entre ClaI(1905) y ClaI(4407); en la estructura artificial nº 12 \DeltaEGF 7-26 se eliminaba la secuencia entre ClaI(1668) y ClaI(3855).

Para las estructuras artificiales nº 13 \DeltaCla+EGF9-17 y nº 14 \DeltaCla+EGF17-26, el fragmento de \sim0,9 kb entre ClaI(1905) y ClaI(2820), y el fragmento de \sim1,0 kb entre ClaI(2820) y ClaI(3855), respectivamente, se insertaron en el único sitio ClaI de la estructura artificial nº 3 \DeltaCla.

Para la estructura artificial nº 16 split, el fragmento KpnI/XbaI de 11 kb de pMtNMg se reemplazó por el fragmento correspondiente KpnI/XbaI procedente de una estructura artificial de un minigen de Notch, que contenía la mutación split en la repetición EGF 14.

Para las estructuras artificiales nº 17-25, se diseñaron cebadores sintéticos para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para multiplicar extensiones de repeticiones EGF mientras que se rompían las repeticiones EGF en los extremos del trozo multiplicado en el mismo lugar que los sitios comunes de ClaI, justo después de la tercera cisteína de la repetición (véase Figura 7). Los productos de la PCR se purificaron en gel de forma convencional y se ligaron en el sitio ClaI de la estructura artificial nº 3 \DeltaClaI, a la que se había puesto extremos romos, rellenando con el fragmento Klenow de la polimerasa I de ADN (Maniatis y col., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York). La orientación correcta de las inserciones se determinó con PCR, usando un cebador en la hebra transcrita dentro de la inserción junto con un cebador en la hebra complementaria en la repetición EGF 35. Todos los cebadores eran 20-meros, y se denominaron con el número del nucleótido de su extremo 5', según las coordenadas de nucleótidos de la secuencia de Notch en Wharton y col. (1985, Cell 43, 567-581), y S se refiere a un cebador de la hebra transcrita mientras que A se refiere a un cebador de la hebra complementaria. La estructura artificial nº 16 \DeltaCla+EGF(9-13) empleaba los cebadores S1917 y A2367. La estructura artificial nº 17 \DeltaCla+EGF(11-15) empleaba los cebadores S2141 y A2591. La estructura artificial nº 18 \DeltaCla+EGF(13-17) empleaba los cebadores S2375 y A2819. La estructura artificial nº 19 \DeltaCla+EGF(10-13) empleaba los cebadores S2018 y A2367. La estructura artificial nº 20 \DeltaCla+EGF(11-13) empleaba los cebadores S2141 y A2367. La estructura artificial nº 21 \DeltaCla+EGF(10-12) empleaba los cebadores S2018 y A2015. La estructura artificial nº 22 \DeltaCla+EGF(10-11) empleaba los cebadores S2018 y A2322. La estructura artificial nº 23 \DeltaCla+EGF(10-12) empleaba los cebadores S2018 y A2322. La estructura artificial nº 24 \DeltaCla+EGF(11-12) empleaba los cebadores S2018 y A2322.

Para la estructura artificial nº 25 \DeltaEGF, la estructura artificial R1/XBS se digirió completamente con SphI(996) y se digirió parcialmente con BamHI(5135). Los extremos resultantes incompatibles se unieron utilizando un engarzador sintético diseñado para crear un único sitio ClaI. Esto producía una deleción en marco que eliminaba las 36 repeticiones EGF con excepción de la primera mitad de la repetición 1. Para las estructuras artificiales nº 26-29, los fragmentos EGF se insertaron en este sitio ClaI tal y como se ha descrito previamente para las estructuras artificiales correspondientes nº 13, 16, 19 y 23.

Para la estructura artificial nº 30 \DeltaECN, la estructura artificial R1/XBS se digirió completamente con BglI, EcoRI y XhoI. El fragmento EcoRI-BglI de \sim0,2 kb (722-948) y los fragmentos BglI-XhoI de \sim0,7 kb (5873-6627) se ligaron con el vector Bluescript cortado con EcoRI-XhoI y un engarzador sintético diseñado para crear un único sitio ClaI, dando como resultado una deleción en marco desde BglI(941) hasta BglI(5873) que eliminaba las 36 repeticiones EGF, excepto el primer tercio de la repetición 1 así como las 3 repeticiones Notch/lin-12. Para las estructuras artificiales nº 31 y 32, los fragmentos EGF se insertaron en el único sitio ClaI, tal y como se ha descrito previamente para las estructuras artificiales nº 19 y 23.

Para las estructuras artificiales nº 33 y 34, cebadores de PCR S1508 y A1859, basados en la secuencia de Notch de Xenopus (Coffman y col., 1990, Science 249, 1438-1441; los números se refieren a las coordenadas de nucleótidos empleadas en este artículo), se usaron para multiplicar las repeticiones EGF 11 y 12, fuera de una genoteca de ADNc de Xenopus en el estado 17 (la genoteca fue preparada por D. Melton y amablemente suministrada por M. Danilchek). El fragmento se ligó en la estructura artificial nº 3 \DeltaCla y se secuenció.

7.1.2. Cultivo celular y transfección

La línea celular S2 de Drosophila se hizo crecer y se transfectó tal y como se ha descrito en la Sección 6, más arriba. La línea celular S2 transformada de forma estable y que expresa Delta, L-49-6-7 (establecida amablemente por L. Cherbas) se hizo crecer en medio M3 (preparado por Hazleton Co.) suplementado con 11% de suero de ternera fetal (FCS) inactivado con calor (Hyclone), 100 U/ml de penicilina-100 \mug/ml de estreptomicina-0,25 \mug/ml de fungizona (Hazleton), metotrexato 2 x 10^{-7} M, hipoxantina 0,1 mM y timidina 0,016 mM.

7.1.3. Ensayos de agregación e inmunofluorescencia

Los ensayos de agregación y los experimentos de dependencia de Ca^{++} fueron como se ha descrito más arriba, Sección 6. las células se tiñeron con el anticuerpo monoclonal anti-Notch 9C6.C17 y con antisueros policlonales de rata anti-Delta (detalles descritos en la Sección 6, más arriba). La expresión en superficie de las estructuras artificiales de Notch en células impermeabilizadas se sometió a ensayo empleando antisueros policlonales de rata, producidos contra el fragmento BstYI de 0,8 kb (aminoácidos 237-501; Wharton y col., 1985, Cell 43, 567-581) procedente del dominio extracelular de Notch. Las células se visionaron bajo epifluorescencia en un microscopio Orthoplan 2 de Leitz.

7.2. Resultados 7.2.1. Las repeticiones EGF 11 y 12 de Notch son necesarias para la agregación mediada por Notch-Delta

Realizamos un análisis a fondo de la deleción del dominio extracelular de la proteína Notch, que hemos mostrado (más arriba, Sección 6) que está implicada en las interacciones Notch-Delta, para identificar el dominio preciso de Notch que media en estas interacciones. Sometimos a ensayo la capacidad de las células transfectadas con distintas estructuras artificiales de deleción, de interaccionar con Delta, empleando el ensayo de agregación descrito en la Sección 6. Brevemente, las estructuras artificiales de deleción de Notch se transfectaron de forma transitoria en células S2 de Drosophila, se indujeron con CuSO_{4}, y luego se agregaron durante una noche a temperatura ambiente con una pequeña cantidad de células de la línea celular que expresa Delta, transformadas de forma estable, L49-6-7 (Cherbas), consiguiendo una población compuesta típicamente por \sim1% de células que expresan Notch y \sim5% de células que expresan Delta, y el resto de las células no expresan ninguna proteína. Para someter a ensayo el grado de agregación, se tiñeron las células con antisueros específicos para cada producto génico y se examinaron con microscopía inmunofluorescente (véase Procedimientos Experimentales para más detalles). Los agregados se definieron como agrupaciones de cuatro o más células que contenían células que expresan Notch y Delta, y los valores mostrados en la Figura 6 representan el porcentaje de todas las células que expresan Notch encontradas en dichas agrupaciones. Todos los números reflejan el resultado promedio de al menos dos experimentos de transfección distintos, en los que al menos se marcaron 100 unidades celulares que expresan Notch (tanto células aisladas como agrupaciones).

Dibujos esquemáticos de las estructuras artificiales sometidas a ensayo y los resultados de los experimentos de agregación se muestran en la Figura 6 (véase Procedimientos Experimentales para más detalles). Todas las estructuras artificiales de expresión eran derivadas de la estructura artificial de expresión de Notch de longitud completa, nº 1 pMtNMg (descrita en la Sección 6, más arriba).

Las estructuras artificiales iniciales (nº 2 DSph y nº 3 \DeltaCla) delecionaban partes grandes de las repeticiones EGF. Su incapacidad para favorecer la agregación de Notch-Delta sugería que las repeticiones EGF de Notch estaban implicadas en la interacción con Delta. Nos aprovechamos de una serie de seis sitios de restricción de ClaI en marco, para diseccionar adicionalmente la región entre las repeticiones EGF 7 y 30. Debido a la homología de secuencias entre las repeticiones, cinco de los sitios ClaI estaban en el mismo lugar relativo dentro de la repetición EGF, justo después de la tercera cisteína, mientras que el sexto sitio estaba justo antes de la tercera cisteína de la repetición EGF 31 (Figura 7). Por tanto, al realizar una digestión parcial con ClaI y después ligar de nuevo, obtuvimos deleciones que no sólo conservaban el marco de lectura abierto de la proteína Notch, pero que además mantenían frecuentemente la integridad estructural y conservaban los espaciadores, al menos teóricamente, de tres enlaces disulfuro en las repeticiones EGF quiméricas producidas por la religación (Figura 6, estructuras artificiales nº 4-14). Desgraciadamente, el sitio ClaI más 3' era resistente a la digestión, mientras que el siguiente sitio ClaI más 3' se rompía entre las repeticiones EGF 30 y 31. Por tanto, cuando se insertaban de nuevo varios fragmentos de digestión con ClaI en el esqueleto de la digestión completa con ClaI (estructura artificial nº 3 \DeltaCla), la estructura global de las repeticiones EGF se interrumpía aparentemente en la unión 3'.

Varios puntos sobre esta serie de estructuras artificiales son dignos de mención. Primero, la eliminación del fragmento de restricción ClaI que rompe las repeticiones EGF 9 y 17 (estructura artificial nº 8 \DeltaEGF9-17) suprime la agregación con Delta, mientras que la reinserción de este trozo en la estructura artificial nº 3 \DeltaCla, que carece de las repeticiones EGF 7-30, restaura la agregación hasta aproximadamente los niveles del tipo silvestre (estructura artificial nº 13 \DeltaCla+EGF9-17), sugiriendo que las repeticiones EGF 9 a 17 contienen secuencias importantes para la unión a Delta. Segundo, todas las estructuras artificiales en esta serie (nº 4-14) eran compatibles con el sitio de unión cartografiado en las repeticiones EGF 9 a 17. Las estructuras artificiales de expresión que contienen estas repeticiones (nº 6, 7, 9, 10, 13) favorecen las interacciones Notch-Delta, mientras que las estructuras artificiales que carecen de estas repeticiones (nº 4, 5, 8, 11, 12, 14) no las favorecen. Para confirmar que la incapacidad de agregación con células Delta no se debía simplemente a un fallo de la proteína Notch mutagenizada para alcanzar la superficie celular, pero que realmente reflejaba la deleción del sitio de unión necesario, sometimos a ensayo la expresión en la superficie celular de todas las estructuras artificiales mediante tinción inmunofluorescente de células vivas transfectadas con anticuerpos específicos del dominio extracelular de Notch. Todas las estructuras artificiales que fallaban en la mediación de las interacciones Notch-Delta, producían una proteína que parecía que se expresaba normalmente en la superficie celular. Tercero, aunque el ensayo de agregación no es cuantitativo, dos estructuras artificiales que contenían las repeticiones EGF 9-17, nº 9 \DeltaEGF17-26 o la más visible nº 10 \DeltaEGF26-30, se agregaban a un nivel aparentemente inferior. Las células transfectadas con las estructuras artificiales nº 9 \DeltaEGF17-26 y 10 \DeltaEGF26-30, mostraban una tinción de superficie considerablemente menor que la normal, aunque las células fijadas y permeabilizadas reaccionaban con el mismo anticuerpo teñido normalmente, indicando que no se habían delecionado simplemente los epítopos reconocidos por los antisueros. Comparando el porcentaje de células transfectadas en las poblaciones de células permeabilizadas o vivas, encontramos que aproximadamente 50% de las células transfectadas con la estructura artificial nº 9 \DeltaEGF17-26 y 10% con la estructura artificial nº 10 \DeltaEGF26-30 producían una proteína detectable en la superficie celular. Por tanto, estas dos estructuras artificiales producían proteínas que fallaban frecuentemente en alcanzar la superficie celular, quizás debido a un plegamiento defectuoso, reduciendo de este modo, pero no suprimiendo, la capacidad de agregación de las células transfectadas con células que expresan Delta.

Habiendo cartografiado el sitio de unión para las repeticiones EGF 9 a 17, comprobamos si se había cartografiado en esta región alguna mutación de Notch cuya lesión molecular estuviera determinada. La única de tales mutaciones era split, un alelo semidominante de Notch que se correlaciona con una mutación puntual en la repetición EGF 14 (Hartley y col., 1987, EMBO J. 6, 3407-3417; Kelley y col., 1987, Mol. Cell. Biol. 6, 3094-3108). De hecho, un rastreo genético en busca de modificadores secundarios del sitio de split, reveló varios alelos de Delta, sugiriendo una especial relación entre el alelo split de Notch, y Delta (Brand y Campus-Ortega, 1990, Roux's Arch. Dev. Biol. 198(5), 275-285). Para estudiar los posibles efectos de la mutación split sobre la agregación mediada por Notch-Delta, un fragmento de 11 kb que contenía la mutación sin sentido asociada con split se clonó en la estructura artificial de expresión de Notch (nº 15 split). Sin embargo, la agregación con células que expresan Delta no estaba afectada en esta estructura artificial, lo que sugiere, como se confirmó con las siguientes estructuras artificiales, que la repetición EGF 14 de Notch no estaba implicada en las interacciones con Delta ejemplificadas con nuestro ensayo de cultivo de tejidos.

Por tanto, para cartografiar adicionalmente el dominio de unión a Delta dentro de las repeticiones EGF 9-17, empleamos cebadores específicos de oligonucleótidos y la técnica de PCR para generar varios subfragmentos de esta región. Para ser compatible con las estructuras artificiales nº 4-14 que producían proteínas que eran capaces de interaccionar con Delta, diseñamos los cebadores para cortar y empalmar las repeticiones EGF justo después de la tercera cisteína, en el mismo lugar que el sitio común de ClaI (Figura 7). Los productos resultantes de la PCR se ligaron en el sitio ClaI de la estructura artificial nº 3 \DeltaCla. Se produjeron tres estructuras artificiales solapantes, nº 16, 17 y 18, de las cuales, sólo una la nº 16 \DeltaCla+EGF9-13, permitía la agregación con células Delta cuando se transfectaba en las células S2. La estructura artificial nº 19 \DeltaCla+EGF(10-13), que carece de la repetición EGF 9, definía adicionalmente las repeticiones EGF 10-13 como la región necesaria para las interacciones Notch-Delta.

Las estructuras artificiales nº 20-24 representaban intentos de romper este dominio, empleando adicionalmente incluso la misma estrategia de PCR (véase Figura 7). Nos preguntamos primero si ambas repeticiones EGF 11 y 12 eran necesarias, y segundo, si las secuencias flanqueantes de las repeticiones EGF 10 y 13 estaban implicadas directamente en la unión a Delta. Las estructuras artificiales nº 20 \DeltaCla+EGF(11-13), en la que la repetición EGF 12 es la única repetición completa añadida, y la nº 21 \DeltaCla+EGF(10-12), en la que la repetición EGF 11 es la única repetición completa añadida, fallaban en la mediación de la agregación, sugiriendo que la presencia de la repetición EGF 11 o 12 aislada no era suficiente para las interacciones Notch-Delta. Sin embargo, puesto que la unión 3' de la ligación de estas estructuras artificiales interrumpía la estructura global de las repeticiones EGF, era posible que una pequeña zona "tampón" fuera necesaria para permitir que la repetición crucial funcionara normalmente. Así, por ejemplo, en la estructura artificial nº 19 \DeltaCla+EGF(10-13), la repetición EGF 12 podría no estar implicada directamente en la unión a Delta, pero en su lugar, podría contribuir con la cantidad mínima necesaria de secuencia tampón para proteger la estructura de la repetición EGF 11, permitiendo de este modo las interacciones con Delta. Las estructuras artificiales nº 22-24 se dedicaban a este fin. Diseñamos cebadores de PCR que rompían en el extremo de la repetición EGF y por tanto eran menos idóneos para romper la formación disulfuro de EGF en la unión de ligación 3'. Las estructuras artificiales nº 22 \DeltaCla+EGF(10-11), que no mediaba en la agregación, y la nº 23 \DeltaCla+EGF(10-12), que si mediaba, sugerían de nuevo que ambas repeticiones 11 y 12 eran necesarias, mientras que la secuencia flanqueante de la repetición 13 claramente no lo era. Finalmente, la estructura artificial nº 24 \DeltaCla+EGF(11-12), aunque ahora rompía potencial y estructuralmente en la unión 5', demostraba convincentemente que las secuencias procedentes de la repetición EGF 10 no son cruciales. Por tanto, basándose en los datos totalmente consecuentes de las 24 estructuras artificiales, proponemos que las repeticiones EGF 11 y 12 de Notch juntas, definen la unidad funcional más pequeña obtenible a partir de este análisis que contiene los sitios necesarios para unirse a Delta en células S2 transfectadas.

7.2.2. Las repeticiones EGF 11 y 12 De Notch son suficientes para la agregación mediada por Notch-Delta

La deleción extensa con ClaI en la que se insertaron fragmentos de PCR (nº 3 \DeltaCla), retiene aproximadamente 1/3 de las 36 repeticiones EGF originales, así como las tres repeticiones Notch/lin-12. Aunque estas no son claramente suficientes para favorecer la agregación, es posible que formen una esqueleto necesario dentro del cual repeticiones EGF específicas puedan interaccionar con Delta. Para someter a ensayo si sólo unas pocas repeticiones EGF eran de hecho suficientes para favorecer la agregación, diseñamos dos estructuras artificiales, la nº 25 \DeltaEGF que delecionaba las 36 repeticiones EGF excepto los dos tercios primeros de la repetición EGF 1, y la nº 30 \DeltaECN que delecionaba la parte extracelular completa de Notch, excepto el primer tercio de la repetición 1 y \sim35 aminoácidos justo antes del dominio transmembranal. Los fragmentos que habían mediado en la agregación Notch-Delta en el fondo de la estructura artificial nº 3 \DeltaCla, cuando se insertaba en la estructura artificial nº 25 \DeltaEGF, eran capaces de nuevo de favorecer las interacciones con Delta (estructuras artificiales nº 26-30). Estructuras artificiales análogas (nº 31, 32) en las que las repeticiones Notch/lin-12 también estaban ausentes, también mediaban con éxito en la agregación de Notch-Delta. Por tanto, las repeticiones EGF 11 y 12 parecen funcionar como unidades modulares independientes que son suficientes para mediar en las interacciones entre Notch-Delta en células S2, incluso en ausencia de la mayoría del dominio extracelular de Notch.

7.2.3. Las repeticiones EGF 11 y 12 de Notch mantienen la dependencia de calcio de la agregación mediada por Notch-Delta

Tal y como se describe en la Sección 6, más arriba, (Fehon y col., 1990, Cell 61, 523-534), mostramos que la agregación de células S2, mediada por Notch-Delta, es dependiente de calcio. Por tanto examinamos la capacidad de las células que expresan ciertas estructuras artificiales con deleciones, de agregarse con células que expresan Delta, en presencia o en ausencia de iones Ca^{++}. Sometimos a ensayo las estructuras artificiales nº 1 pMtNMg como testigo, y las nº 13, 16, 19, 23, 24, 26, 27 y 28, y encontramos que células mezcladas en medio que contenía Ca^{++}, a 4ºC, formaban fácilmente agregados, mientras que células mezcladas en medio exento de Ca^{++} que contenía EGTA, fallaban en la agregación (Tabla III).

TABLA III Efecto de Ca^{++} exógeno sobre la agregación^{a} de Notch-Delta

3

Evidentemente, la dependencia de calcio de la interacción se ha conservado incluso en la estructura artificial más pequeña, de acuerdo con la idea de que las estructuras artificiales mínimas que contienen las repeticiones EGF 11 y 12, se unen a Delta de una forma similar a la de Notch de longitud completa. Este resultado también es interesante desde el punto de vista de estudios recientes que sugieren que repeticiones similares a EGF con una secuencia de consenso particular, pueden actuar como dominios de unión a Ca^{++} (Morita y col., 1984, J. Biol. Chem. 259, 5698-5704; Sugo y col., 1984, J. Biol. Chem. 259, 5705-5710; Rees y col., 1988, EMBO J. 7, 2053-2061; Handford y col., 1990, EMBO J. 9, 475-480). Sobre la mitad de las repeticiones EGF en Notch, incluyendo las repeticiones 11 y 12, se ajustan a este consenso, confirmando adicionalmente el argumento de que las repeticiones EGF 11 y 12 son responsables de favorecer las interacciones entre Notch-Delta.

7.2.4. La función de unión a Delta de las repeticiones EGF 11 y 12 de Notch está conservada en el homólogo de Notch de Xenopus

Habiendo cartografiado el sitio de unión a Delta de las repeticiones EGF 11 y 12 de Notch, estábamos interesados en saber si esta función estaba conservada en el homólogo de Notch que se había identificado en Xenopus (Coffman y col., 1990, Science 249, 1438-1441). Esta proteína muestra una notable similitud con Notch de Drosophila en toda la estructura y la organización. Por ejemplo, dentro de la región de las repeticiones EGF, tanto el número como la organización lineal de las repeticiones están conservados, sugiriendo una posible conservación también funcional. Para someter esto a ensayo, preparamos cebadores con PCR en base a la secuencia de Notch de Xenopus (Coffman y col., 1990, Science 249, 1438-1441) y empleamos éstos para obtener un fragmento de \sim350 pb a partir de una genoteca de ADNc de Xenopus en el estado 17, que incluye las repeticiones EGF 11 y 12 flanqueadas por la mitad de las repeticiones 10 y 13 en ambos lados. Este fragmento se clonó en la estructura artificial nº 3 \DeltaCla y se sometieron a ensayo tres clones independientes para estudiar la capacidad de interaccionar con Delta en el ensayo de agregación de cultivo celular. Dos de los clones, nº 33a&b\DeltaCla+XEGF(10-13), cuando se transfectaron en células S2, eran capaces de mediar en las interacciones Notch-Delta a un nivel aproximadamente equivalente al de la estructura artificial de Notch análoga de Drosophila, nº 19\DeltaCla+EGF(10-13), y de nuevo en forma dependiente de calcio (Tabla III). Sin embargo, el tercer clon nº 33c\DeltaCla+XEGF(10-13), fallaba en la mediación de las interacciones Notch-Delta aunque la proteína se expresaba normalmente en la superficie celular, como se estimaba por la tinción de células vivas impermeabilizadas. La comparación de secuencias del producto de la PCR de Xenopus en las estructuras artificiales nº 33a y 33c, revelaba una mutación sin sentido originada en un cambio de leucina a prolina (aminoácido nº 453, Coffman y col., 1990, Science 249, 1438-1441) en la repetición EGF 11 de la estructura artificial nº 33c. Aunque este residuo no está conservado entre la Notch de Drosophila y de Xenopus (Figura 8), la introducción de un residuo de prolina podría romper fácilmente la estructura de la repetición EGF, y por tanto evitar interacciones adecuadas con Delta.

La comparación de la secuencia de aminoácidos de las repeticiones EGF 11 y 12 de Notch de Drosophila y de Xenopus, revela un alto grado de identidad de aminoácidos, incluyendo la secuencia de consenso de unión a calcio (Figura 8, SEQ ID NO:1 y NO:2). Sin embargo, el nivel de homología no es notablemente diferente del compartido entre la mayoría de las otras repeticiones EGF, que muestran globalmente aproximadamente 50% de identidad a nivel de aminoácidos. La correspondencia de uno a uno entre las repeticiones EGF individuales sugiere que quizá pueden comprender también unidades funcionales conservadas. Las interacciones con Delta, de nuevo en una forma dependiente del ión calcio.

7.3. Discusión

Hemos continuado nuestro estudio de las interacciones entre los productos proteicos de los genes Notch y Delta, empleando el ensayo de agregación de células S2 in vitro, descrito en la Sección 6, más arriba. Sobre la base del análisis de una extensa deleción del dominio extracelular de Notch, mostramos que las regiones de Notch que contienen repeticiones homólogas a EGF 11 y 12 son ambas necesarias y suficientes para la agregación mediada por Notch-Delta, y que esta capacidad de unión a Delta se ha conservado en las dos mismas repeticiones EGF de Notch de Xenopus. Nuestro hallazgo de que la agregación se cartografiaba en las repeticiones EGF 11 y 12, demuestra que las repeticiones EGF de Notch también funcionan como dominios de unión a proteínas específicos.

Estudios recientes han demostrado que los dominios de EGF que contienen una secuencia de consenso específica se pueden unir a iones Ca^{++} (Morita y col., 1984, J. Biol. Chem. 259, 5698-5704; Sugo y col., 1984, J. Biol. Chem. 259, 5705-5710; Rees y col., 1988, EMBO J. 7, 2053-2061; Handford y col., 1990, EMBO J. 9, 475-480). De hecho, aproximadamente la mitad de las repeticiones EGF en Notch, que incluyen las repeticiones 11 y 12, están de acuerdo con este consenso. Hemos mostrado que es necesario Ca^{++} exógeno para la agregación mediada por Notch-Delta de células S2 transfectadas (véase Sección 6; Fehon y col., 1990, Cell 61, 523-534). Sometimos a ensayo una subpoblación de nuestras estructuras artificiales de deleción y encontramos que las repeticiones EGF 11 y 12 aisladas (nº 32\DeltaECN+EGF(11-12)) eran suficientes para mantener la dependencia de Ca^{++} de las interacciones Notch-
Delta.

Una cantidad de estudios han sugerido que las interacciones genéticas entre Notch y Delta pueden reflejar una interacción sensible a la dosis entre sus productos proteicos. Estudios genéticos han indicado que las dosificaciones génicas relativas de Notch y Delta son cruciales para el desarrollo normal. Por ejemplo, Xu y col., (1990, Genes Dev. 4, 464-475) encontraron que mutaciones completas en Delta, podían suprimir interacciones letales entre combinaciones heterocigotas de alelos Abruptex (Ax), una clase de mutaciones de Notch que se correlacionan con mutaciones sin sentido dentro de las repeticiones EGF (Hartley y col., 1987, EMBO J. 6, 3407-3417; Kelley y col., 1987, Mol. Cell Biol. 6, 3094-3108). Las interacciones in vitro que hemos descrito en las que observamos asociaciones Notch-Delta y Delta-Delta (véase Sección 6) implican que una interacción competitiva entre Notch y Delta para unirse a Delta, puede reflejar la base que sostiene las interacciones genéticas observadas. Además, fuimos capaces de coinmunoprecipitar Notch y Delta a partir de cultivo de tejidos y de extractos celulares embrionarios (véase Sección 6), indicando una posible asociación in vivo de las dos proteínas. Además, análisis in situ del ARNm de los patrones de expresión de Notch y Delta en embriones, sugieren que la expresión de los dos es solapante pero no idéntica (Kopczynski y Muskavitch, 1989, Development 107, 623-636; Hartley y col., 1987, EMBO J. 6, 3407-3417). Análisis detallados de anticuerpos de la expresión de la proteína Notch durante el desarrollo, han revelado recientemente que la expresión de Notch está más restringida a niveles de tejido y subcelulares que lo que habían indicado estudios previos (Johansen y col., 1989, J. Cell Biol. 109, 2427-2440; Kidd y col., 1989, Genes Dev. 3, 1113-
1129).

Nuestro descubrimiento de que las dos mismas repeticiones EGF procedentes de Notch homóloga de Xenopus eran también capaces de mediar en interacciones con Delta en células en cultivo de tejidos indica firmemente que una función similar se debe haber conservado in vivo. Aunque estas dos repeticiones EGF son suficientes in vitro, por supuesto que es posible que in vivo sea necesario algo más que la molécula de Notch, para facilitar las interacciones Notch-Delta. De hecho, estábamos algo sorprendidos por dos razones al encontrar que el sitio de unión a Delta no se cartografiaba en las repeticiones EGF en donde se había mostrado que se encontraban varias de las mutaciones Ax, primero, debido al rastreo genético (Xu y col., 1990, Genes Dev. 4, 464-475) que demostraba interacciones entre alelos Ax y mutaciones Delta, y segundo, porque análisis de secuencias han mostrado que ciertos alelos Ax están asociados con cambios aislados de aminoácidos dentro del consenso putativo de unión a Ca^{++} de las repeticiones EGF. Por ejemplo, la mutación AX^{E2} cambia la repetición EGF 29 hacia la secuencia de consenso de unión a Ca^{++}, mientras que la mutación AX^{9B2} mueve la repetición EGF 24 fuera del consenso. Es posible que estas regiones in vivo de la proteína Notch puedan estar implicadas en interacciones, con Delta y/o con otras proteínas, pero que no se pueden ejemplificar correctamente con nuestro ensayo de cultivo de células.

Nuestro cartografiado in vitro del dominio de unión a Delta para las repeticiones EGF 11 y 12 de Notch representa la primera asignación de función a un dominio estructural de Notch. De hecho, las distintas estructuras artificiales de deleción sugieren que estas dos repeticiones EGF funcionan como una unidad modular, independientemente del contexto inmediato en el que están situadas. Por tanto, ni las 34 repeticiones EGF restantes ni las tres repeticiones Notch/lin-12 parecen necesarias para establecer un esqueleto estructural necesario para que funcionen las repeticiones EGF 11 y 12. De forma interesante, se observó casi el efecto opuesto: aunque nuestro ensayo de agregación no mide la fuerza de la interacción, cuando fuimos limitando el sitio de unión a fragmentos cada vez más pequeños, observamos un incremento de la capacidad de las células transfectadas para agregarse con células que expresan Delta, sugiriendo que las secuencias EGF normales flanqueantes realmente impiden la asociación entre las proteínas. En dos series separadas de estructuras artificiales, tanto en el fondo de la estructura artificial nº 3 \DeltaCla (compárese con nº 9, 16, 19, 23) como en el fondo de la estructura artificial nº 25 \DeltaEGF (compárese con nº 26, 27, 28), observamos un incremento de la capacidad de agregación tal, que las estructuras artificiales más pequeñas (nº 19, 23, 28, 29) se agregaban consistentemente por encima de los niveles del tipo silvestre (nº 1 pMtNMg). Estos resultados implican que las repeticiones EGF del contorno pueden servir para limitar la capacidad de las repeticiones EGF 11 y 12 para acceder a Delta, modulando quizá de este modo las interacciones Notch-Delta in vivo.

Notch codifica una proteína transmembranal, estructuralmente compleja que se ha propuesto que tiene un papel pleotrópico en todo el desarrollo de Drosophila. El hecho de que las repeticiones EGF 11 y 12 parezcan funcionar como una unidad modular independiente, que es suficiente, al menos en cultivos celulares, para las interacciones con Delta, presenta inmediatamente la cuestión del papel de la hipótesis de si éstas también pueden formar dominios de unión modulares para otras proteínas que interaccionan con Notch en distintas etapas durante el desarrollo.

Además de Notch de Xenopus, lin-12 y glp-1, dos genes que se pensaba que funcionaban en las interacciones célula-célula implicadas en la especificación de ciertos destinos celulares durante el desarrollo de C. elegans, codifican proteínas transmembranales homólogas a EGF que son estructuralmente totalmente similares a Notch de Drosophila y de Xenopus. Las cuatro proteínas contienen repeticiones homólogas a EGF seguidas de otras tres repeticiones ricas en cisteína (repeticiones Notch/lin-12) en el dominio extracelular, un dominio transmembranal sencillo y seis repeticiones cdc10/anquirina En la región intracelular. A diferencia de Notch de Xenopus, que en base a la comparación de ambas secuencias como en los resultados de nuestro ensayo de unión a Delta, parece probable que codifica la parte que corresponde a Notch de Drosophila, lin-12 y glp-1 codifican probablemente miembros distintos de la misma familia génica. La comparación de los productos proteicos pronosticados de lin-12 y glp-1 con Notch, revela diferencias específicas a pesar de una organización global similar de los motivos estructurales. La diferencia más obvia es que las proteínas de lin-12 y glp-1 contienen sólo 13 y 10 repeticiones EGF, respectivamente, comparando con las 36 de Notch de Xenopus y de Drosophila. Además, en los genes del nematodo el conjunto de repeticiones EGF está interrumpido después de la primera repetición EGF por una extensión diferente de la secuencia, ausente en Notch. Adicionalmente, en relación con el dominio de unión a Delta que hemos definido como las repeticiones EGF 11 y 12 de Notch, no hay dos repeticiones EGF contiguas en las proteínas lin-12 o glp-1 que muestren la secuencia de consenso de unión a Ca^{++}, ni cualquiera de las dos repeticiones contiguas que muestran una similitud notable con las repeticiones EGF 11 y 12, sugiriendo de nuevo que los productos génicos de lin-12 y glp-1 son probablemente funcionalmente distintos de Notch.

Nuestro descubrimiento de que las repeticiones EGF 11 y 12 de Notch forman una unidad de unión a Delta discreta representa la primera prueba concreta que apoya la idea de que cada repetición EGF o una subpoblación pequeña de repeticiones, puede tener un papel único durante el desarrollo, posiblemente a través de interacciones directas con otras proteínas. Las homologías vistas entre el dominio adhesivo de Delta y Serrate (véase la Sección 8.3.4, más abajo) sugieren que la parte homóloga de Serrate es "adhesiva" porque media en la unión de otras proteínas toporrítmicas. Además, el gen scabrous, que codifica una proteína secretada con similitud al fibrinógeno, puede interaccionar con Notch.

Además de la repetición EGF, múltiples copias de otros motivos estructurales están presentes habitualmente en una variedad de proteínas. Un ejemplo relevante es el motivo cdc10/anquirina, seis copias del mismo se encuentran en el dominio intracelular de Notch. La anquirina contiene 22 de estas repeticiones. Quizá conjuntos ordenados repetidos de motivos estructurales pueden representar en general un conjunto lineal de una serie de unidades modulares de unión a proteínas. Resumiendo estos resultados junto con la complejidad estructural, genética y del desarrollo conocida de Notch, Notch puede interaccionar con una cantidad de ligandos diferentes en un patrón regulado temporal y espacialmente durante todo el desarrollo. Tales interacciones específicas del contexto con proteínas extracelulares podrían estar mediadas por las repeticiones EGF y Notch/lin-12, mientras que las interacciones con las proteínas del citoesqueleto y citoplásmicas podrían estar mediadas por los motivos cdc10/anquirina intra-
celulares.

8. El extremo amino terminal de Delta es un dominio de unión a EGF que interacciona con Notch y Delta

La agregación de células cultivadas programadas para expresar proteínas Delta de tipo silvestre y variantes, se ha empleado para delinear secuencias de Delta necesarias para la interacción heterotípica con Notch y la interacción homotípica con Delta. Hemos encontrado que el extremo amino del dominio extracelular de Delta es necesario y suficiente para la participación de Delta en las interacciones heterotípicas (Delta-Notch) y las homotípicas (Delta-Delta). Deducimos que el extremo amino de Delta es un dominio de unión a un motivo de Delta (EBD), dado que las secuencias similares a EGF de Notch son suficientes para mediar en la interacción heterotípica con Delta. El EBD de Delta posee aparentemente dos actividades: la capacidad de unirse a secuencias relacionadas con EGF y la capacidad de autoasociarse. También encontramos que Delta es absorbida por las células cultivadas que expresan Notch, lo que puede ser un reflejo de un mecanismo por el que estas proteínas interaccionan in vivo.

8.1. Materiales y métodos 8.1.1 Líneas celulares

La línea celular S2 de Drosophila (Schneider y col., 1972, J. Embryol. Exp. Morph. 27, 353-365) empleada en estos experimentos, se hizo crecer tal y como se ha descrito en la Sección 6.

8.1.2. Muestras inmunológicas

La inmunohistoquímica se realizó tal y como se ha descrito en la Sección 6, más arriba, o a veces con ligeras modificaciones de este procedimiento. Los antisueros y los anticuerpos empleados incluyen sueros policlonales anti-Delta de ratón, producidos contra un segmento del conjunto ELR de Delta que se extiende desde la cuarta hasta la novena ELR (véase la Sección 6); sueros policlonales de rata anti-Delta producidos contra el mismo segmento de Delta (véase la Sección 6); sueros policlonales anti-Notch de rata producidos contra un segmento del conjunto de ELR de Notch que se extiende desde la quinta hasta la treceava ELR; anticuerpo monoclonal de ratón C17.9C6 (véase la Sección 6), que reconoce el dominio intracelular de Notch; y anticuerpo monoclonal de ratón EP-104 (Hortsch y col., 1990, Neuron 4, 697-709), que reconoce la forma larga de neuroglía de Drosophila.

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8.1.3. Estructuras artificiales de vector de expresión

Las estructuras artificiales empleadas para programar la expresión de Delta de tipo silvestre (pMTDl1) y Notch de tipo silvestre (pMTNMg) se describen en la Sección 6, más arriba. Las estructuras artificiales que dirigen la expresión de proteínas de Delta variantes se generaron empleando pMTDl1, el ADNc Dl1 clonado en Bluescript+ (pBSDl1; Kopczynski y col., 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735) y pRmHa3-104 (A.J. Bieber, pers. comm.), que consta de la inserción del ADNc 1B7A-250 en el vector promotor de la metalotioneína pRmHa-3 (Bunch y col., 1988, Nucl. Acids Res. 16, 1043-1061) y favorece la expresión inducible de la forma larga de neuroglía de Drosophila (Hortsch y col., 1990, Neuron 4, 697-709).

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Brevemente, las estructuras artificiales se prepararon del modo siguiente:

Del(Sca-Nae) - Se corta pBSDl1 con SalI (digestión completa) y con ScaI (parcial), se aísla el fragmento que contiene el vector. Se corta pBSDl1 con NaeI (parcial) y con SalI (completa), se aísla el fragmento que codifica el carboxilo-terminal de Delta. Se ligan los fragmentos, se transforman y se aíslan los clones. Se transfiere la inserción EcoRI a pRmHa-3.

Del(Bam-Bgl) - Se corta pBSDl1 con BglII (completa) y con BamHI (parcial), se rellenan los extremos con polimerasa Klenow de ADN, se ligan, se transforman y se aíslan los clones. Se transfiere la inserción EcoRI a pRmHa-3.

Del(ELR1-ELR3) - Se multiplican con PCR los pares de bases 236-830 del ADNc Dl1 empleando 5-ACTTCAGCAACGATCACGGG-3' (SEQ ID NO:26) y 5'-TTGGGTATGTGACAGTAATCG-3' (SEQ ID NO:27), se tratan con polimerasa T4 de ADN, se ligan en pBSDl1 cortado con ScaI (parcial) y BglII (completa) y se rellenan los extremos con polimerasa Klenow de ADN, se transforma y se aíslan los clones. Se transfiere el fragmento BamHI-SalI que codifica el carboxilo terminal de Delta a pRmHa-3.

Del(ELR4-ELR5) - pBSDl1 se digirió completamente con BglII y parcialmente con PstI. Se aisló el fragmento que contenía el vector de 5,6 kb, se circularizó empleando la ligasa T4 de ADN en presencia de un exceso molar de 100x del oligonucleótido 5'-GATCTGCA-3' y se transformó y los clones se aislaron. La inserción EcoRI resultante se transfirió después a pRmHa-3.

Ter(Dde) - Se cortó pBSDl1 con DdeI (parcialmente), y se rellenaron los extremos con la polimerasa Klenow de ADN, se ligó con exceso molar de 100x de 5'-TTAAGTTAACTTAA-3' (SEQ ID NO:28), se transformó y se aislaron los clones. Se transfirió la inserción EcoRI a pRmHa-3.

Ins(Nae)A - pMTDl1 se cortó con NaeI (parcialmente), se aisló el fragmento que contenía el vector, se ligó con un exceso molar de 100x de 5'-GGAAGATCTTCC-3' (SEQ ID NO:29), se transformó y se aislaron los clones.

NAE B - pMTDl1 se digirió parcialmente con NaeI y se aisló la población de círculos tentativamente linealizados de aproximadamente 5,8 kb de longitud. Los fragmentos se circularizaron de nuevo empleando la ligasa T4 de ADN en presencia de un exceso molar de 100x del oligonucleótido 5'-GGAAGATCTTCC-3' (SEQ ID NO:29) y se transformaron, y se aisló un clon (NAE A) que contenía inserciones múltiples del engarzador. NAE A se digirió completamente con BglII y se aislaron los fragmentos resultantes de 0,4 kb y 5,4 kb, se ligaron y se transformaron, y los clones se aislaron.

Ins(Stu) - Se cortó pMTDl1 con StuI (completamente), se aisló el fragmento que contenía el vector, se ligó con un exceso molar de 100x de 5'-GGAAGATCTTCC-3' (SEQ ID NO:29), se transformó y se aislaron los clones.

STU B - pMTDl1 se digirió completamente con StuI, y se aisló el fragmento resultante de 5,8 kb. El fragmento se circularizó de nuevo empleando la ligasa T4 de ADN en presencia de un exceso molar de 100x del oligonucleótido 5'-GGAAGATCTTCC-3' (SEQ ID NO:29) y se transformó, y se aisló un clon (STU B) que contenía inserciones múltiples del engarzador. STU B se digirió completamente con BglII y se aislaron los fragmentos resultantes de 0,6 kb y 5,2 kb, se ligaron y se transformaron, y se aislaron los clones.

NG1 - pRmHa3-104 se cortó con BglII (completamente) y EcoRI (completamente), se aisló el fragmento que contenía el vector. Se cortó Ins(Nae)A con EcoRI (completamente) y con BglII (completamente), se aisló el fragmento que codificaba el amino-terminal de Delta. Se ligaron los fragmentos, se transformaron y se aislaron los clones.

\newpage

NG2 - Se cortó pRmHa3-104 con BglII (completamente) y con EcoRI (completamente), se aisló el fragmento que contenía el vector. Se cortó Del(ELR1-ELR3) con EcoRI (completamente) y con BglII (completamente), se aisló el fragmento que codificaba el amino-terminal de Delta. Se ligaron los fragmentos, se transformaron y se aislaron los clones.

NG3 - pRmHa3-104 se cortó con BglII (completamente) y con EcoRI (completamente), se aisló el fragmento que contiene el vector. Se cortó pMTDl1 con EcoRI (completamente) y con BglII (completamente), se aisló el fragmento que codificaba el amino-terminal de Delta. Se ligaron los fragmentos, se transformaron y se aislaron los clones.

NG4 - pRmHa3-104 se cortó con BglII (completamente) y con EcoRI (completamente), se aisló el fragmento que contenía el vector. Se cortó Del(Sca-Nae) con EcoRI (completamente) y con BglII (completamente), se aisló el fragmento que codificaba el amino-terminal de Delta. Se ligaron los fragmentos, se transformaron y se aislaron los clones.

NG5 - Se generó Del(Sca-Stu) del modo siguiente: se cortó pMTDl1 con ScaI (completamente) y con StuI (completamente), se aisló el fragmento ScaI-ScaI que codificaba el amino-terminal y el fragmento StuI-ScaI que codificaba el carboxilo-terminal, se ligaron, se transformaron y se aislaron los clones. Se cortó Del(Sca-Stu) con EcoRI (completamente) y con BglII (completamente), se aisló el fragmento que codificaba el amino-terminal de Delta. Se cortó pRmHa3-104 con BglII (completamente) y con EcoRI (completamente), se aisló el fragmento que contenía el vector. Se ligaron los fragmentos, se transformaron y se aislaron los clones.

Los contenidos de las secuencias de las distintas variantes de Delta se muestran en la Tabla IV. Los diagramas esquemáticos de las variantes de Delta definidas en la Tabla IV, se muestran en la Figura 9.

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TABLA IV Contenidos de las secuencias de las variantes de delta empleadas en este estudio

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8.1.4. Protocolos de la agregación

La transfección y la agregación celulares se realizaron tal y como se ha descrito en la Sección 6, más arriba, o con ligeras modificaciones de las mismas.

8.2. Resultados 8.2.1. Las secuencias amino-terminales dentro del dominio extracelular de Delta son necesarias y suficientes para la interacción heterotípica con Notch

Ya que anticipamos que algunas variantes de Delta no se podían localizar eficazmente en la superficie celular, investigamos la relación entre el nivel de expresión de Delta de tipo silvestre y el grado de agregación con células que expresan Notch, haciendo variar la cantidad aportada de estructura artificial de expresión de Delta en diferentes transfecciones. Encontramos que la interacción heterotípica Delta-Notch mostraba sólo una ligera dependencia del nivel de aportación de Delta sobre 10 veces un margen en este ensayo (Figura 9A). Dada la solidez de la interacción heterotípica sobre el margen sometido a ensayo y nuestras observaciones de que cada una de las variantes de Delta que empleamos, mostraba una acumulación sustancial en la superficie en células transfectadas, deducimos que la incapacidad de una variante de Delta dada para favorecer la agregación heterotípica, refleja lo más probable una deficiencia funcional mostrada por esa variante, como contrapunto con el impacto de niveles reducidos de expresión en la superficie en la agregación heterotípica.

Los resultados de los experimentos de agregación heterotípica mediada por variantes de Delta y de Notch de tipo silvestre, se muestran en la Tabla V.

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Los aminoácidos Delta (AA) 1-230 son el intervalo de secuencia mínima actual, definido como suficiente para la interacción con Notch. Esto se basa en el éxito de la agregación de NG2-Notch. Dentro de este intervalo, los AA198-230 de Delta son decisivos porque su deleción en la estructura artificial NG1 inactivaba la actividad de unión a Notch observada para la estructura artificial NG2. También dentro de este intervalo, los AA32-198 de Delta son decisivos porque su deleción en la estructura artificial NG4, también inactivaba la actividad de unión a Notch, observada para la estructura artificial NG3. La importancia de los AA192-230 de Delta también se apoya en la observación de que la variante Del(ELR1-ELR3), que contiene todos los aminoácidos de Delta, excepto los AA231-331, posea actividad de unión a Notch, mientras que la variante Del(Bam-Bgl), que contiene todos los aminoácidos de Delta excepto los AA192-331, tenía inactivada aparentemente la actividad de unión a Notch.

La configuración y/o la secuencia primaria en la proximidad de los AA197-198 de Delta es aparentemente decisiva, debido a que una inserción multimérica del tetrapéptido - Arg-Lys-Ile-Phe [en código de una sola letra (véase, por ejemplo, Lehninger y col., 1975, Biochemistry, 2ª ed., pág. 72), RKIF] (SEQ ID NO:30) - entre estos dos residuos, como en la estructura artificial Ins(Nae)A, inactivaba la actividad de unión a Notch, observada en Delta de tipo silvestre.

Además, la observación de que la estructura artificial Del(ELR1-ELR3) favorecía la agregación, implica que ELR1-ELR3 no es necesaria para la interacción Delta-Notch; la observación de que la estructura artificial Del(ELR4-ELR5) favorecía la agregación, implica que ELR4 y ELR5 no son necesaria para la interacción Delta-Notch, y la observación de que la estructura artificial Ter(Dde) favorece la agregación, implica que el dominio intracelular de Delta no es necesario para la interacción Delta-Notch.

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8.2.2. Las secuencias amino-terminales dentro del dominio extracelular de Delta son necesarias y suficientes para la interacción homotípica

Los resultados de los experimentos de agregación homotípica mediada por variantes de Delta, se muestran en la Tabla VI

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TABLA VI Agregación homotípica mediada por variantes de Delta

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La deleción de los AA32-198 de Delta [Del(Sca-Nae)] o los AA192-331 de Delta [Del(Bam-Bgl)] de la proteína Delta de longitud completa, eliminaba la interacción Delta-Delta. La deleción de los AA231-331 de Delta [Del(ELR1-ELR3)] no eliminaba la interacción Delta-Delta. Por tanto, las secuencias dentro de los AA32-230 de Delta son necesarias para la interacción Delta-Delta.

La configuración y/o la secuencia primaria en la proximidad de los AA197/198 de Delta son evidentemente decisivas para la interacción Delta-Delta, porque una inserción multímera del tetrapéptido -Arg-Lys-Ile-Phe- (SEQ ID NO:30) entre estos dos residuos, como en la estructura artificial Ins(Nae)A, inactivaba la interacción Delta-Delta.

Además, la observación de que la estructura artificial Del(ELR1-ELR3) podía favorecer la agregación, implica que ELR1-ELR3 no son necesarias para la interacción Delta-Delta; la observación de que la estructura artificial Del(ELR4-ELR5) favorecía la agregación, implica que ELR4 y ELR5 no son necesarias para la interacción Delta-Delta, y la observación de que la estructura artificial Ter(Dde) favorece la agregación, implica que el dominio intracelular de Delta no es necesario para la interacción Delta-Delta.

Un resumen de los resultados de los ensayos para la agregación heterotípica y homotípica con distintas estructuras artificiales, se muestra en la Tabla VI A.

TABLA VI A

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8.2.3 Las secuencias de Delta implicadas en las interacciones heterotípicas y homotípicas son cualitativamente distintas

Las características respectivas de las secuencias de Delta restañadas para la interacción heterotípica y homotípica se definieron adicionalmente empleando variantes de Delta, en las que se introdujeron inserciones cortas, en marco, con engarzador traducible, dentro del extremo amino de Delta (es decir, NAE B y STU B; Figura 9, Tabla VI A). La sustitución del residuo de Delta 132 (A) por el pentapéptido GKIFP (variante STU B) conduce a la inactivación de las actividades de la interacción heterotípica y homotípica del extremo amino de Delta. Esto sugiere que algunas secuencias de Delta necesarias para estas dos interacciones distintas, coinciden y residen en la proximidad del residuo 132. Por otro lado, la inserción del tetrapéptido RKIF entre los residuos de Delta 198 y 199 (variante NAE B) elimina la capacidad del extremo amino de Delta de mediar en la interacción heterotípica con Notch, pero no tiene un efecto evidente sobre la capacidad del extremo amino alterado para mediar en la interacción homotípica. El descubrimiento de que la inserción NAE B afecta sólo a una de las dos actividades del extremo amino de Delta, implica que las secuencias de Delta median en las interacciones heterotípicas y homotípicas, aunque coinciden, son cualitativamente distintas.

8.2.4. Delta es absorbida por las células que expresan Notch

En el transcurso de muchos experimentos de agregación heterotípica, hemos observado que la proteína Delta se puede encontrar a veces dentro de células que han sido programadas para expresar Notch, pero no Delta. Realizamos ensayos de agregación heterotípica mezclando poblaciones inicialmente separadas de células S2 que se habían transfectado independientemente con estructuras artificiales de expresión que programan la expresión de Delta o de Notch. Entonces, detectamos frecuentemente una tinción punteada de Delta dentro de células que expresan Notch en agregados heterotípicos, empleando antisueros específicos de Delta. Nuestras observaciones son compatibles con la unión de Delta directamente a Notch en la superficie celular y una eliminación posterior de este complejo Delta-Notch de la superficie celular, mediante endocitosis.

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8.3. Discusión 8.3.1. Las secuencias amino-terminales no relacionadas con EGF están implicadas en la interacción entre Delta y Notch

Hemos empleado ensayos de agregación celular para definir una región dentro de la región amino-proximal del dominio extracelular de Delta que es necesaria y suficiente para mediar en la interacción Delta-Notch. Análisis funcionales de una combinación de deleciones y estructuras artificiales suficientes revelaron que esta región se extiende, como máximo, desde el AA1 hasta el AA230. Es sorprendente que esta región no incluya ninguna de las secuencias similares a EGF que residen dentro del dominio extracelular de Delta. Es probable que las secuencias particulares de Delta dentro del intervalo suficiente necesario para la interacción con Notch, incluyan los AA198-230, porque la deleción de estos residuos elimina la actividad de unión a Notch. El hecho de que la deleción de los AA32-198 también inactive la actividad de unión a Notch, sugiere que secuencias amino-proximales del AA198, también son necesarias, aunque el impacto nocivo-deletéreo de esta deleción podría dar como resultado la eliminación de aminoácidos adicionales en estrecha proximidad al AA198.

Las secuencias dentro de Delta suficientes para la interacción con Notch se pueden agrupar en tres subdominios - N1, N2 y N3 - que difieren en sus contenidos respectivos de residuos de cisteína (Figura 10, SEQ ID NO:3). Los dominios N1 y N3 contienen cada uno seis residuos de cisteína, mientras que el dominio N2 contiene uno. El número par de cisteínas presentes en N1 y N3, respectivamente, permite la posibilidad de que las estructuras respectivas de estos subdominios estén dictadas, en parte, por la formación de enlaces disulfuro particulares. El amplio patrón de organización de los extremos amino-terminales de Delta es generalmente también análogo al del dominio extracelular del receptor de EGF de vertebrados (Lax y col., 1988, Mol. Cell. Biol. 8, 1970-1978), en el que secuencias que se piensa que interaccionan con EGF, están unidas por dos subdominios ricos en cisteína.

8.3.2. Las secuencias de Delta necesarias para interacciones homotípicas y para interacciones homotípicas heterotípicas parecen coincidir

Nuestros resultados indican que secuencias esenciales para la interacción homotípica de Delta, residen dentro del intervalo AA32-230. La deleción de secuencias o la inserción de aminoácidos adicionales dentro de este dominio amino-proximal, eliminan la capacidad de tales variantes de Delta de favorecer aisladamente la agregación celular. Por tanto, las secuencias necesarias para la interacción Delta-Delta se cartografían dentro del mismo dominio de la proteína que las necesarias para la interacción Delta-Notch.

8.3.3. El extremo amino terminal de Delta constituye un motivo de unión a EGF

El trabajo descrito en los ejemplos más arriba, ha revelado que las secuencias de Notch necesarias para la interacción Delta-Notch en el ensayo de agregación celular, se cartografían dentro del conjunto de repeticiones similares a EGF del dominio extracelular de Notch. Este resultado implica que Delta y Notch interaccionan en virtud de la unión del extremo amino de Delta a las secuencias similares a EGF dentro de Notch, y de este modo, el extremo amino del dominio extracelular de Delta constituye un dominio de unión a EGF (Figura 11).

Estos resultados aumentan la posibilidad de que la interacción homotípica de Delta implique la unión del extremo amino de Delta a secuencias similares a EGF dentro del dominio extracelular de Delta (Figura 12). Sin embargo, ninguna de las repeticiones similares a EGF dentro del dominio extracelular de Delta es idéntica a cualquiera de las repeticiones similares a EGF dentro del dominio extracelular de Notch (Figuras 13, SEQ ID NO:6; Wharton y col., 1985, Cell 43, 567-581). En base a esto, si las interacciones homotípicas de Delta están mediadas realmente por la interacción entre el extremo amino de Delta y las repeticiones similares a EGF de Delta, entonces el dominio de unión a EGF de Delta tiene la capacidad de interaccionar con al menos dos secuencias distintas similares a
EGF.

8.3.4. Las secuencias de Delta implicadas en la interacción Delta-Notch están conservadas en la proteína Serrate

La alineación de las secuencias de aminoácidos desde los extremos amino-terminales de Delta (Figura 13, SEQ ID NO:6, y Figura 15, SEQ ID NO:9) y Serrate (Fleming y col., 1990, Genes Dev. 4, 2188-2201; Thomas y col., 1991, Devel. 111, 749-761) revela una conservación sorprendente del carácter estructural y de la composición de las secuencias. La estructura general de los subdominios N1-N2-N3 del extremo amino-terminal de Delta, también se observa dentro del extremo amino-terminal de Serrate, como es el caso específico de seis residuos de cisteína dentro de los dominios homólogos a N1 de Delta y homólogo a N3 de Delta, de la proteína Serrate. Dos bloques de conservación notables se corresponden con los AA63-73 de Delta (residuos 8/11 idénticos) y los AA195-206 de Delta (residuos 10/11 idénticos). El último bloque tiene un interés particular debido a que la inserción de aminoácidos adicionales en este intervalo, puede eliminar la capacidad de Delta de unirse a Notch o a Delta.

8.3.5. Las interacciones cis y trans entre Delta y Notch pueden implicar secuencias diferentes dentro de Notch

La inspección de todas las estructuras de Delta y Notch, sugiere que la interacción Delta-Notch podría implicar contactos entre el dominio de unión a EGF de Delta con las dos regiones dentro de Notch, dependiendo de si la interacción era entre moléculas que residen en membranas opuestas o dentro de la misma membrana (Figura 11). Los ensayos de agregación celular, que detectan presumiblemente la interacción de moléculas en membranas opuestas, implican que el dominio de unión a EGF de Delta interacciona con las repeticiones similares a EGF 11 y 12 (véanse los ejemplos más arriba). Si las agrupaciones en tándem de motivos similares a EGF forman estructuras similares a varillas (Engel, 1989, FEBS Lett. 251, 1-7) dentro de las proteínas Delta y Notch, entonces el desplazamiento estimado del dominio de unión a EGF de Delta desde la superficie celular sería presumiblemente suficiente para acomodar el conjunto rígido de las repeticiones similares a EGF de Notch 1-10. También es curioso indicar que el desplazamiento del dominio de unión a EGF de Delta desde la superficie celular, podría colocar este dominio en la proximidad de las repeticiones similares a EGF (25-29) de Notch que están afectadas por mutaciones Abruptex (Hartley y col., 1987, EMBO J. 6, 3407-3417; Kelley y col., 1987, Mol. Cell. Biol. 6, 3094-3108) y podría permitir la interacción de las proteínas de Delta y Notch presentes en la misma membrana.

8.3.6. Interacciones análogas a la interacción Delta-Notch en vertebrados

Dada la interacción entre Delta y Notch en Drosophila, es bastante probable que un homólogo de Delta (¿Helta?) exista en vertebrados y que los aspectos cualitativos y moleculares de las interacciones Delta-Notch y Delta-Delta que hemos definido en Drosophila, estén altamente conservados en vertebrados, incluyendo los seres humanos. Tales homólogos se pueden clonar y secuenciar tal y como se ha descrito más arriba, Sección 5.2.

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9. Secuencias que median en las interacciones Notch-Serrate

Hemos descrito una nueva interacción molecular entre Notch y Serrate, y hemos mostrado que las dos repeticiones EGF de Notch que median en las interacciones con Delta, a saber, las repeticiones EGF 11 y 12, también constituyen un dominio de unión a Serrate.

Para someter a ensayo si Notch y Serrate interaccionan directamente, se transfectaron células S2 con una estructura artificial de expresión de Serrate y se mezclaron con células que expresan Notch en nuestro ensayo de agregación. Para la estructura artificial de expresión de Serrate, se empleó un cebador sintético que contenía un sitio BamHI artificial, inmediatamente 5' del iniciador AUG en la posición 442 (todos los números de secuencias están de acuerdo con Fleming y col., 1990, Genes & Dev. 4:2188-2201) y era homólogo hasta la posición 464, junto con un segundo cebador desde la posición 681-698 para generar un fragmento de ADN de \sim260 pares de bases. Este fragmento se cortó con BamHI y KpnI (posición 571) y se ligó en Bluescript KS+ (Stratagene). Esta estructura artificial, BTSer5'PCR, se examinó por secuenciación y luego se cortó con KpnI. El fragmento KpnI de Serrate (571-2981) se insertó y se seleccionó la orientación adecuada, para generar BTSer5'PCR-Kpn. El fragmento 5' SacII de BTSer5'PCR-Kpn (sitios SacII en el poliengarzador Bluescript y en Serrate (1199)) se aisló y se empleó para reemplazar el fragmento SacII 5' del ADNc C1 (Fleming y col., 1990, Genes & Dev. 4:2188-2201), regenerando de este modo el ADNc de Serrate de longitud completa, menos las regiones 5' no traducidas. Esta inserción se aisló mediante digestión con SalI y digestión parcial con BamHI y se transportó a los sitios BamHI y SalI de pRmHa-3, para generar la estructura artificial de expresión final, Ser-mtn.

Encontramos que las células que expresan Serrate se adhieren a células que expresan Notch en un modo dependiente de calcio (Figura 6 y Tabla VII). Sin embargo, al contrario que Delta, bajo las condiciones experimentales sometidas a ensayo, Serrate no parece que interaccione homotípicamente. Además, no detectamos interacciones entre Serrate y Delta.

TABLA VII Efecto de Ca^{++} Exógeno sobre la Agregación^{a} de Notch-Serrate

12

Hemos sometido a ensayo una subpoblación de nuestras estructuras artificiales de deleción de Notch para cartografiar el dominio de unión a Serrate y hemos encontrado que las repeticiones EGF 11 y 12, además de unirse a Delta, también median en las interacciones con Serrate (Figura 6; estructuras artificiales nº 1, 7-10, 13, 16, 17, 19, 28 y 32). Además, la función de unión a Serrate de estas repeticiones parece también que se ha conservado en las dos repeticiones EGF correspondientes a Notch de Xenopus (nº 33\DeltaCla+XEGF(10-13)). Estos resultados muestran sin ambigüedad que Notch interacciona con Delta y con Serrate, y que las dos mismas repeticiones EGF de Notch median en ambas interacciones. También fuimos capaces de definir la región de Serrate que es esencial para la agregación de Notch/Serrate. La deleción de los nucleótidos 676-1287 (es decir, los aminoácidos 79-282) (véase Figura 15), elimina la capacidad de la proteína Serrate para agregarse con Notch.

Notch y Serrate parece que se agregan menos eficazmente que Notch y Delta, quizá debido a que la interacción Notch-Serrate es más débil. Por ejemplo, cuando marcamos los agregados Notch-Delta, detectamos \sim40% de todas las células que expresan Notch en agrupaciones con células que expresan Delta (Figura 6, nº 1 pMtNMg) y \sim40% de todas las células que expresan Delta en contacto con células que expresan Notch. Para Notch-Serrate, sólo encontramos \sim20% de todas las células que expresan Notch (Figura 6; pMtNMg) y \sim15% de todas las células que expresan Serrate en agregados. Para las distintas estructuras artificiales de deleción de Notch que sometimos a ensayo, detectamos consistentemente una reducción en la cantidad de agregación entre Notch y Serrate al compararlas con los niveles correspondientes de Notch-Delta (Figura 6), con la posible excepción de las estructuras artificiales nº 9 y 10 que muestran niveles de agregación muy reducidos, incluso con Delta. Una explicación trivial para esta cantidad reducida de agregación podría ser que nuestra estructura artificial de Serrate simplemente no exprese tanta proteína en la superficie celular como la estructura artificial de Delta, disminuyendo de este modo la fuerza de la interacción. Alternativamente, la diferencia en la fuerza de la interacción puede indicar una diferencia funcional fundamental entre las interacciones Notch-Delta y Notch-Serrate que puede ser significativa in vivo.

10. La clonación, secuenciación y expresión de Notch de ser humano 10.1. Aislamiento y secuenciación de Notch humana

Los clones para la secuencia de Notch humana se obtuvieron originalmente empleando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), para multiplicar el ADN de una genoteca de ADNc de cerebro de feto humano de 17-18 semanas, en el vector Lambda Zap II (Stratagene). Los cebadores degenerados que se iban a emplear en esta reacción, se diseñaron comparando las secuencias de aminoácidos del homólogo de Notch de Xenopus con Notch de Drosophila. Se diseñaron tres cebadores (cdc1 (SEQ ID NO:10), cdc2 (SEQ ID NO:11) y cdc3 (SEQ ID NO:12); Figura 16) para multiplicar un fragmento de 200 pb o un fragmento de 400 pb, como parejas de cebadores cdc1/cdc2, o cdc1/cdc3, respectivamente.

El fragmento de 400 pb obtenido de este modo, se empleó a continuación como una sonda con la que rastrear la misma genoteca en busca de clones Notch humanos. El rastreo original produjo tres únicos clones, hN3k, hN2k y hN5k, todos ellos mostraron, por un análisis posterior de la secuencia, que se encontraban en el extremo 3' de Notch humana (Figura 17). Un segundo rastreo que empleaba el extremo 5' de hN3k como sonda, se realizó para buscar clones que rodeaban el extremo 5' de Notch humana. Se obtuvo un único clon, hN4k, a partir de este rastreo, y datos de una secuenciación preliminar indican que contiene la mayoría del extremo 5' del gen (Figura 17). Resumiendo, los clones hN4k, hN3k y hN5k abarcan aproximadamente 10 kb del homólogo de Notch humana, comenzando al principio en las repeticiones EGF y extendiéndose en la región 3' no traducida del gen. Los tres clones son inserciones de ADNc en el sitio EcoRI de pBluescript SK (Stratagene). La cepa hospedadora de E. coli es XL1-Blue (véase Maniatis, T., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, pág. A12).

La secuencia de las distintas partes de Notch contenidas en los clones de ADNc, se determinó (empleando
Sequenase®, U.S. Biochemical Corp.) y se muestra en las Figuras 19-22 (SEQ ID NO:13 hasta NO:25).

Las secuencias de nucleótidos completas del ADNc de Notch humana contenidas en hN3k y hN5k, se determinaron mediante el método de terminación de cadena didesoxi empleando el equipo de reactivos de Sequenase® (U.S. Biochemical Corp.). Las secuencias de nucleótidos que codifican Notch humana, en el marco de lectura adecuado, se identificaron fácilmente puesto que la traducción en sólo uno de los tres marcos de lectura posibles, produce una secuencia que, después de comparar con la secuencia publicada de aminoácidos, deducidos de Notch de Drosophila, produce una secuencia con un grado sustancial de homología con la secuencia de Notch de Drosophila. Puesto que no hay intrones, la traducción de los tres marcos de lectura posibles y la comparación con Notch de Drosophila se realizó fácilmente, conduciendo a la identificación terminada de la región codificadora. El ADN y las secuencias de proteínas deducidas del ADNc de Notch humana en hN3k y hN5k, se presentan en las Figuras 23 y 24, respectivamente. El clon hN3k codifica una parte de un polipéptido de Notch que comienza aproximadamente en la tercera repetición Notch/lin-12 hasta varios aminoácidos, cerca del aminoácido carboxi-terminal. El clon hN5k codifica una parte de un polipéptido de Notch que comienza aproximadamente antes de la región cdc10 hasta el final del polipéptido, y también contiene una región 3' sin traducir.

Comparando el ADN y las secuencias de proteínas presentadas en la Figura 23 (SEQ ID NO:31 y NO:32) con las de la Figura 23 (SEQ ID NO:33 y NO:34) se revelan diferencias importantes entre las secuencias, sugiriendo que hN3k y hN5k representan parte de dos genes distintos homólogos a Notch. Nuestros datos sugieren por tanto que el genoma humano contiene más de un gen homólogo a Notch. Esto es improbable en Drosophila, en donde Notch parece ser un gen con una única copia.

La comparación del ADN y de las secuencias de aminoácidos de los homólogos de Notch humano contenidos en hN3k y hN5k con las secuencias correspondientes de Notch de Drosophila (tal y como han publicado Wharton y col., 1985, Cell 43:567-581) y con las secuencias correspondientes de Notch de Xenopus (tal y como han publicado Coffman y col., 1990, Science 249:1438-1441 o disponibles a través de Genbank® (número de orden M33874)), también revelan diferencias.

La secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 23 (hN3k) se comparó con la secuencia pronosticada del polipéptido TAN-1 mostrado en la Figura 2 de Ellisen y col., Agosto 1991, Cell 66:649-661. Se encontraron algunas diferencias entre las secuencias de aminoácidos deducidas; sin embargo, toda la secuencia del polipéptido de Notch de hN3k es idéntica en 99% a la región TAN-1 correspondiente (aminoácidos TAN-1 1455 hasta 2506). Se observaron cuatro diferencias; en la región entre la tercera repetición Notch/lin-12 y el primer motivo cdc10, hay una arginina (hN3k) en lugar de un X (TAN-1, aminoácido 1763); (2) hay una prolina (hN3k) en lugar de un X (TAN-1, aminoácido 1787); (3) hay un cambio conservador de un residuo de ácido aspártico (hN3k) en lugar de un residuo de ácido glutámico (TAN-1, aminoácido 2495); y (4) la región carboxilo-terminal difiere sustancialmente entre los aminoácidos TAN-1 2507 y 2535.

La secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 24 (hN5k) se comparó con la secuencia pronosticada del polipéptido TAN-1 mostrado en la Figura 2 de Ellisen y col., Agosto 1991, Cell 66:649-661. Se encontraron diferencias entre las secuencias de aminoácidos deducidas. El polipéptido de Notch deducido de hN5k es idéntico en 79% al polipéptido de TAN-1 (idéntico en 64% con Notch de Drosophila) en la región cdc10 que abarca el motivo cdc10 (aminoácidos TAN-1 1860 hasta 2217) y las regiones flanqueantes bien conservadas (Fig. 25). La región cdc10 cubre los aminoácidos 1860 hasta 2217 de la secuencia TAN-1. Además, el polipéptido codificado de hN5k es idéntico en 65% al polipéptido de TAN-1 (idéntico en 44% a Notch de Drosophila) en el extremo carboxi-terminal de la molécula que contiene una región (aminoácidos TAN-1 2482 hasta 2551) rica en PEST (prolina, ácido glutámico, serina, treonina) (Fig. 25B). La extensión de 215 aminoácidos que se encuentra entre las regiones anteriormente mencionadas no está bien conservada en ninguno de los clones homólogos de Notch, representados por hN3k, hN5k y TAN-1. Ni el polipéptido hN5k ni Notch de Drosophila muestran niveles significativos de identidad de aminoácidos con las otras proteínas en esta región (por ejemplo, hN5k/TAN-1 = 24% de identidad; hN5k/Notch de Drosophila = 11% de identidad; TAN-1/Notch de Drosophila = 17% de identidad). Por el contrario, Notch de Xenopus (Xotch) (SEQ ID NO:35), Notch de rata (SEQ ID NO:36) y TAN-1 (SEQ ID NO:37) continúan compartiendo niveles significativos de identidad de secuencia con otra (por ejemplo, TAN-1/Notch de rata = 75% de identidad, TAN-1/Notch de Xenopus = 45% de identidad, Notch de rata/Notch de Xenopus = 50% de identidad).

Finalmente, el examen de la secuencia de los dominios intracelulares de los homólogos de Notch en vertebrados mostrados en la Figura 25B, revelaba un descubrimiento inesperado: todas esas proteínas, incluyendo hN5k, contienen un motivo CcN putativo, asociado con una función de dirección a la diana nuclear, en la región conservada después de la última de las seis repeticiones cdc10 (Fig. 25B). Aunque Notch de Drosophila carece de un motivo tal definido, un estudio más a fondo de su secuencia reveló la presencia de una posible secuencia de localización nuclear bipartita (Robbins y col., 1991, Cell 64:615-623), así como de posibles sitios de fosforilación de CK II y cdc2, todos en proximidad relativa entre sí, definiendo posiblemente de este modo un tipo alternativo de motivo CcN (Fig. 25B).

10.2. Expresión de Notch humana

Las estructuras artificiales de expresión se prepararon empleando clones de ADNc de Notch humana, descritos en la Sección 10.1, anterior. En los casos de hN3k y hN2k, el clon completo se escindió de su vector como un fragmento de restricción EcoRI y se subclonó en el sitio de restricción EcoRI de cada uno de los tres vectores pGEX (vectores de expresión de la S-transferasa de glutatión; Smith y Johnson, 1988, Gene 7, 31-40). Esto permite la expresión del producto de la proteína Notch desde el subclon en el marco de lectura correcto. En el caso de hN5k, el clon contiene dos sitios de restricción internos de EcoRI, que producen fragmentos de 2,6, 1,5 y 0,6 kb. Los dos fragmentos de 2,6 kb y 1,5 kb también se han subclonado en cada uno de los vectores pGEX.

El sistema del vector pGEX se empleó para obtener la expresión de proteínas de fusión (quiméricas) de Notch humana desde las estructuras artificiales descritas anteriormente. El ADN de Notch clonado en cada caso se insertó, en fase, en el vector pGEX apropiado. Cada estructura artificial se electroporó a continuación en bacterias (E. coli), y se expresó como una proteína de fusión que contenía las secuencias de la proteína Notch fusionadas con el extremo carboxilo de la proteína S-transferasa de glutatión. La expresión de las proteínas de fusión se confirmó por análisis de extractos proteicos bacterianos mediante electroforesis en gel de poliacrilamida, comparando los extractos proteicos obtenidos de las bacterias que contenían los plásmidos pGEX con y sin el ADN de Notch insertado. Las proteínas de fusión eran solubles en solución acuosa, y se purificaron a partir de material lisado bacteriano mediante cromatografía de afinidad, empleando agarosa revestida con glutatión (puesto que el extremo carboxilo de la S-transferasa de glutatión se une a glutationina). Las proteínas de fusión expresadas se unieron a un anticuerpo de Notch de Drosophila, tal y como se sometió a ensayo por transferencia de tipo Western.

Las estructuras artificiales empleadas para preparar proteínas de fusión de Notch/S-transferasa de glutatión, eran del modo siguiente:

hNFPnº2 - Se empleó PCR para obtener un fragmento que empezaba justo antes de las repeticiones cdc10 en el nucleótido 192 de la inserción hN5k, hasta justo antes de la región rica en PEST, en el nucleótido 1694. El ADN se digirió a continuación con BamHI y SmaI y el fragmento resultante se ligó en pGEX-3. Después de la expresión, la proteína de fusión se purificó por unión a agarosa de glutatión. El polipéptido purificado se cuantificó en un gel de poliacrilamida con un gradiente de 4-15%. La proteína de fusión resultante tenía un peso molecular aproximado de 83 kD.

hN3FPnº1 - La inserción de ADN de hN3k completa (nucleótidos 1 hasta 3235) se escindió del vector Bluescript (SK) digiriendo con EcoRI. El ADN se ligó en pGEX-3.

hN3FPnº2 - Se cortó del vector Bluescript (SK) un segmento 3' de ADN de hN3k (nucleótidos 1847 hasta 3235) más alguno de los poliengarzadores, digiriendo con XmaI. El fragmento se ligó en pGEX-1.

Después de la purificación, estas proteínas de fusión se emplearon para preparar anticuerpos policlonales y/o monoclonales de Notch humana.

11. Depósito de microorganismos

Las siguientes bacterias recombinantes, siendo portadora cada una de un plásmido que codifica una parte de Notch humana, se depositaron el 2 de Mayo de 1991 en la "American Type Culture Collection", 1201 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, bajo las condiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento en Materia de Patentes.

13

En la presente invención no se debe limitar el alcance por los microorganismos depositados o las realizaciones específicas descritas en esta memoria. Claro está que diversas modificaciones de la invención, además de las descritas en esta memoria, serán evidentes para los expertos en la técnica, a partir de la descripción anterior y de las figuras acompañantes. Tales modificaciones pretenden entrar dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: Artavanis-Tsakonas, Spyridon et al.

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Notch y Delta Humanas, Dominios de Unión en Proteínas Toporrítmicas y Métodos Basados en las Mismas

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 37

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Pennie & Edmonds

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 1155 Avenue of the Americas

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Nueva York

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Nueva York

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

C.P.: 10036

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: Compatible con PC IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERADOR: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA: PatentIn Release nº 1.0, Version nº 1.25

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN SOBRE EL APODERADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Misrock, S. Leslie

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE INSCRIPCIÓN: 18,872

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

REFERENCIA/NÚMERO DE ORDEN: 7326-009

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 212 790-9090

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 212 8698864/9741

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TELEX: 66141 PENNIE

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 77 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 78 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

\vskip1.000000\baselineskip

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 203 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

16

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 199 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2892 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: bicatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 142..2640

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

19

20

21

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 833 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

23

24

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1067 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: bicatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1320 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: bicatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 442..1320

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

27

28

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 293 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

\vskip1.000000\baselineskip

30

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: modified_base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 6

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /mod_base= i /label= N

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: modified_base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 12

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /mod_base= i /label= N

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: modified_base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 3

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /mod_base= i /label= N

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: modified_base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 12

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /mod_base= i /label= N

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: modified_base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 18

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /mod_base= i /label= N

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: modified_base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 12

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /mod_base= i /label= N

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: modified_base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 18

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /mod_base= i /label= N

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: modified_base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 21

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /mod_base= i /label= N

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 267 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: bicatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 574 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: bicatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 295 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: bicatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 333 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: bicatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 582 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: bicatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 150 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: bicatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 247 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: bicatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 248 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: bicatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20:

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 323 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: bicatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:21:

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 330 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: bicatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:22:

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 167 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: bicatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23:

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 225 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: bicatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:24:

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 121 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: bicatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:25:

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:26:

47

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:27:

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 14 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:28:

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:29:

50

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:30:

\hskip1cm

51

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3234 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: bicatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..3234

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:31:

52

53

54

55

56

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1078 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:32:

57

58

59

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4268 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: bicatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 2..1972

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:33:

\vskip1.000000\baselineskip

61

62

63

64

65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUDS 657 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:34:

\vskip1.000000\baselineskip

66

67

68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 654 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:35:

\vskip1.000000\baselineskip

69

70

71

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 666 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:36:

72

73

74

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 681 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:37:

75

76

77

Claims (13)

1. Un fragmento sustancialmente purificado de una proteína Serrate que es la porción de la proteína Serrate con mayor homología con la secuencia de aminoácidos, tal y como se describe en la Figura 15 (SEQ ID NO: 9) desde aproximadamente los aminoácidos 79-282, en donde el fragmento se caracteriza por la capacidad de unirse in vitro, cuando se expresa en la superficie de una primera célula, a una proteína Notch expresada en la superficie de una segunda célula.

2. Un fragmento según la reivindicación 1, el cual consiste en los aminoácidos 79-282 descritos en la Figura 15 (SEQ ID NO: 9).

3. Un fragmento sustancialmente purificado de una proteína Serrate que es la porción de la proteína Serrate con mayor homología con la secuencia de aminoácidos, tal y como se ha descrito en la Figura 15 (SEQ ID NO: 9) desde los aminoácidos 85-283, en donde el fragmento se caracteriza por la capacidad de unirse in vitro, cuando se expresa sobre la superficie de una primera célula, a una proteína Notch expresada en la superficie de una segunda célula.

4. Un fragmento según la reivindicación 3, en donde el fragmento consiste en los aminoácidos 85-283 descritos en la Figura 15 (SEQ ID NO: 9).

5. Una proteína quimérica que comprende un fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, unida a una secuencia de una proteína heteróloga.

6. Un derivado de un fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el cual uno o varios residuos de aminoácidos de la secuencia están sustituidos por otro aminoácido con una polaridad semejante que actúa como un equivalente funcional, y dicho derivado, cuando se expresa en la superficie de una primera célula, tiene la capacidad in vitro de unirse a una proteína Notch expresada en la superficie de una segunda célula.

7. Una proteína quimérica que comprende un derivado según la reivindicación 6, unido a una secuencia de una proteína heteróloga.

8. Un ácido nucleico sustancialmente purificado que codifica un fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una proteína quimérica según la reivindicación 5 o la reivindicación 7.

9. Un vector de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 8.

10. Una célula transformada con un vector de ácido nucleico según la reivindicación 9.

11. Un anticuerpo que se une a un fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

12. Un anticuerpo según la reivindicación 11, que es un anticuerpo monoclonal.

13. Un método para producir un fragmento de una proteína Serrate que comprende hacer crecer una célula según la reivindicación 10, de modo que el fragmento sea expresado por la célula; y aislar el fragmento expresado de una proteína Serrate.