JPH07503123A - Ｎｏｔｃｈタンパク質およびＤｅｌｔａタンパク質中の結合ドメイン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

Ｎｏｔｃｈタンパク質およびＤｅｌｔａタンパク質中の結合ドメイン本発明は、 ｔｈｅ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　５ ｅｒｖｉｃｅｓにより付与された許可番号ＧＭ１９６９３およびＮ５２６０８４ のもとに一部政府の支持でなされた。政府は本発明に成る種の権利を有する。 伝子並びにそれらの暗号化された生産物に関する。また、本発明は、トポリズミ ック（ｔｏｐｏｒｙｔｔ＋ｍ１ｃ）遺伝子により暗号化されたタンパク質中の配 列への同型結合または異型結合を媒介するトポリズミック遺伝子により暗号化さ れたタンパク質中の配列（本明細ショウジヨウバエの遺伝子分析は、発達経路の 複雑さを分析し、そして相互作用遺伝子座を同定するのに極めて有益であった。 しかしながら、遺伝子相互作用を生じるプロセスの正確な性質を理解することは 、酋該遺伝子のタンパク質生産物の生化学的性質の知識を必要とする。 接合神経遺伝子座−Ｎｏｔｃｈ（Ｎ）　、Ｄｅｌｔａ（Ｄｉ）　、？スターマイ ン下軸ａｓｔｅｒｍｉｎｄ）（ｍａｍ）　、分割のエンハンサ−（Ｅ（ｓｐｌ） 　、神経化（ｎｅｕ）　、および大脳（ｂｉｂ）−のいずれか一つ中のヌル突然 変異は腹側および外側の表皮構造を犠牲にして神経系の肥大をもたらす。 この作用は神経経路への表皮前駆体細胞のミスルーチングによるものであり、神 経遺伝子機能が神経領域内の細胞を神経細胞の宿命から上皮の宿命へとそらすの に必要であることを意味する。グラスホッパー中の特定の胚神経芽細胞のレーザ ー切除の効果を評価した研究（ＤｏｅおよびＧｏｏｄｍａｎ１９８５．　Ｄｅｖ 、　Ｂｉｏｌ、　１１１．２０６−２１９）は、神経芽細胞とその周囲の補助細 胞の間の細胞相互作用が神経芽細胞宿命を選ぶことからこれらの補助細胞を抑制 するのに利用できることを示した。これらの遺伝子的観察および発達の観察は、 −緒になって、神経遺伝子座のタンパク質生産物が適当な表皮の発達に必要な細 胞相互作用機構の成分として機能するという仮説へと導いた（Ａｒｔａｖａｎｉ ｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ、１９８８．Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ、４．９５−１０ ０）。 配列分析（Ｗｈａｒｔｏｎら、１９８５．Ｃｅ１ｌ　４３．５６７−５８１ＨＫ ｉｄｄら、　１９８６゜Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、６．　３０９４−３１０ ８ＨＶａｓｓｉｎ　ら、１９８７．ＥＭＢＯＪ、６．　３４３１−３４４０　； Ｋｏｐｃｚｙｎｓｋ　ｉ　ら、１９８８．Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ、２．１７２３− １７３５）は、神経遺伝子座の二種であるＮｏｔｃｈおよびＤｅｆｔａが単一時 間で膜をスパンする膜貫通タンパク質を暗号化することが明らかであることを示 した。Ｎｏｔｃｈ遺伝子は、３６の上皮増殖因子（ＥＧＦ）様タンデム繰返し、 続いてＮｏｔｃｈ／　ｌ１ｎ−１２繰返しくＷｈ−ａｒｔｏｎら、１９８５．Ｃ ｅ１ｌ　４３．５６７−５８１　ＨＫｉｄｄ　ら、１９８６．Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ 　Ｂｉｏｌ、６．　３０９４−３１０８；Ｙｏｃｈｅｍ　ら、　１９８８゜Ｎａ ｔｕｒｅ３３５．５４７−５５０）と称される三つのその他のシスティンに富む 繰返しを含む大きなＮ末端細胞外ドメインで約３００ｋｄタンパク質（本発明者 らは“Ｎｏｔｃｈ”を使用してこのタンパク質を表す）を暗号化する。Ｄｅｌ　 ｔａは、その細胞外ドメイン（Ｖａｓｓｉｎら、　１９８７゜ＥＭＢＯＪ、６． ３４３１−３４４０ＨＫｏｐｃｚｙｎｓｋｉら、１９８８．Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ 、２．　１７２３−１７３５）内に９のＥＧＦ様繰返しを有する約１００ｋｄタ ンパク質（本発明者らは“Ｄｅｌｔａ”を使用してＤＬＺＭ、即ち主たる接合代 謝産物および母性代謝産物のタンパク質生産物；ＫＯｐＣＺｙｎＳｋｉ　ら、　 １９８８．Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ、２．１７２３−１７３５を表す）を暗号化する 。これらの繰返しの機能上の重要性について殆ど知られていないが、ＥＧＦ様モ チーフは血液凝固カスケードに関与するタンパク質を含む種々のタンパク質中に 見られた（Ｆｕｒｉｅ　ａｎｄ　Ｆｕｒｉｅ、１９８Ｂ、ｃｅｌｌ　５３．５０ ５−５１８）　ｏ特に、このモチーフは、血液凝固因子ＩＸおよびＸ　（Ｒｅｅ ｓら、　１９８８．　ＥＭＢＯＪ、７．２０５３−２０６１；　Ｆｕｒｉｅ　ａ ｎｄ　Ｆｕｒｉｅ、１９８８．Ｃｅ１ｌ　５３．５０５−５１８）の如き細胞外 タンパク質、その他のショウジヨウバエ遺伝子（Ｋｎｕｓｔら、　１９８７．　 ＥＭＢＯＪ、　７６１−７６６；Ｒｏｔｈｂｅｒｇら、１９８８．Ｃｅ１ｌ　５ ５．　１０４７−１０５９）、並びにトロンボモジュリン（Ｓｕｚｕｋｉ　ら、 １９８７．ＥＭＢＯＪ、６．１８９１−１８９７）およびＬＤＬレセプター（Ｓ ｕｄｈｏｆら、１９８５，５ｃｉｅｎｃｅ２２８．８１５−８２２）の如き幾つ かの細胞表面レセプタータンパク質中に見られた。タンパク質結合部位はトロン ボモジュリンおよびウロキナーゼ中のＥＧＦ繰返しドメインにマツピングされた （Ｋｕｒｏｓａｗａら、　１９８８．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、２６３．　 ５９９３−　５９９６；Ａｐｐｅｌｌａら、　１９８７．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　 Ｃｈｅｍ、　２６２．４４３７−４４４０）。 独士」突然変異と匹上嶋突然変異の相互作用の魅力的なアレイが記載されていた （Ｖａｓｓｉｎら、１９８５．Ｊ、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｔ、２．２９１−３０８ ；　５ｈｅｐａｒｔｉ　ら、１９８９．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１２２．　４２９−４ ３８ＨＸｕ　ら、　１９９０．　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ、　。 ４、４６４−４７５）　。幾つかの遺伝子研究（Ａｌｔｏｎら、　１９８９．　 Ｄｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、　１０゜２６１−２７２に要約されている）は、互いに 関してゆ１時およびＤｅｆｔａの遺伝子供与が正常な発達に極めて重要であるこ とを示した。 野生型勲±帥バックグラウンド中のＤｅｌｔａの供与量の５０％の低下は、翼静 脈の拡張を生じてその基底で“Ｄｅｌｔａ″を形成させる（Ｌｉｎｄｓｌｅｙお よびＧｒｅｌｌ、　１９６Ｂ、　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒ６２７ ．　Ｗａｓｈｉｎｇｔ−ｏｎ、　Ｄ、　Ｃ，。 Ｃａｒｎｅｇｉｅ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）　ｏ同 様の表現型が野生型匹ｌｔａバックグラウンド中のＮｏｔｃｈの供与量の５０％ の増加により生じる（“コンフルエンス”表現型；Ｗｅｌｓｈｏｎｓ、１９６５ ，５ｃｉｅｎｃｅ１５０．１１２２−１１２９）。このＤｅｌｔａ表現型はＮｏ ｔｃｈ供与の低下により部分的に抑制される。本発明者らの研究室における最近 の研究は、Ｎｏ　ｔ　ａｈ中のＥＧＦ様繰返しの交互と相関関係がある対立遺伝 子間の致死相互作用がＤｅｌｔａの投与量を減少することにより救済し得ること を示した（Ｘｕ　ら、１９９０．Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ、４．４６４−４７５）　 、　Ｘｕら（１９９０，ＧｅｎｅｓＤｅｖ、４．４６４−４７５）は、Ｄｅｆｔ ａまたはｍａｍのいずれかのヌル突然変異がアブルブテックス（Ａｂｒｕｐｔｅ ｘ）（Ａｘ）突然変異として知られている成る種のＮｏｔｃｈ対立遺伝子の異型 接合の組み合わせ間の致死相互作用を抑制することを見出した。Ａｘ対立遺伝子 はＮｏ　ｔ　ｃｈ細胞外ドメインのＥＧＦ様繰返し内のミスセンス変異と関連す る（Ｋｅｌｌｅｙら、１９８７．ｃｅｌｌ　５１．　５３９−５４８；Ｈａｒｔ ｌｅｙら。 １９８７、ＥＭＢＯＪ、６．３４０７−３４１７）。 Ｎｏｔｃｈは胚神経細胞の外植中に軸索プロセスで発現される（Ｊｏｈａｎｓｅ ｎ　ら、１９８９．Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、１０９．　２４２７−２４４０Ｈ Ｋｉｄｄ　ら、　１９８９．　ＧｅｎｅｓＤｅｖ、３．１１１３−１１２９）。 研究は、す１帖の成る種の材対立遺伝子が成虫盤の知覚神経の外植中に軸索開通 をひどく変化し得ることを示したが、軸索それ自体またはその上皮（それに沿っ て軸索が成長する）中の異常なＮｏ　ｔ　ｃｈ発現がこの欠陥の原因であるか否 かは未だ知られていない（Ｐａｌｋａら、１９９０．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　 １０９．　１６７−１７５）。 本発明は、ヒトのり１帥遺伝子および響」遺伝子のヌクレオチド配列、およびそ れらの暗号化されたタンパク質のアミノ酸配列、並びに抗原決定基を含むこれら のフラグメントまたは機能的に活性であるこれらのフラグメントに関する。また 、本発明は、トポリズミックタンパク質への同型結合または異型結合を媒介する トポリズミック遺伝子により暗号化されたタンパク質（″′トポリズミックタン パク質”と称される）のフラグメント（本明細書中、“接着フラグメントと称さ れる）、およびこれらの配列に関すリーのその他の員を表す。結合活性を保持す る接着フラグメントの類縁体および誘導体がまた提供される。ヒトのＮｏｔｃｈ の抗体および接着フラグメントの抗体が更に提供される。 特別な実施態様において、Ｎｏｔｃｈの接着フラグメントは、ショウジヨウバエ のＮｏｔｃｈ　ＥＧＦ様繰返し１１および１２に最も相同のＮ０ｔＣｈ配列を含 むフラグメントである。異型結合を媒介するＤｅｌｔａの接着フラグメントは、 ショウジヨウバエのＤｅｌｔａアミノ酸１−２３０に最も相同の配列を含むフラ グメントである。同型結合を媒介するＤｅｌｔａの接着フラグメントは、ショウ ジヨウバエのＤｅｌｔａアミノ酸３２−２３０に最も相同の配列を含むフラグメ ントであり、そして５ｅｒｒａｔｅの接着フラグメントはショウジヨウバエの５ ｅｒｒａｔｅアミノ酸８５−２８３または７９−２８２に最も相同の配列を含む フラグメントである。 ３、１．　ｔａ 本明細書に使用される下記の用語は、示された意味を有する。 八人　−アミノ酸 ＥＧＦ　＝上皮増殖因子 ＥＬＲ＝ＥＧＦ様（相同の）繰返し ＩＣ＝細胞内 ＰＣＲ−ポリメラーゼ 本明細書に使用される遺伝子の名称の下線は、下線の不在下で遺伝子の名称によ り示されるその暗号化されたタンパク質生産物に対比して、その遺伝子を示す。 例えば、″ゆ±帥０は独±帥遺伝子を意味し、一方、“Ｎｏ　ｔ　ｃｈ”は囮遺 伝子のタンパク質生産物図１．　Ｎｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ相互作用を調べるため の発現構築物および実験デザイン。対数増殖期の３２細胞を、示された三つの構 築物の一つで一時的に移入した。ＭＧＩｌａ　ミニ遺伝子（ｃＤＮＡ／ゲノムキ メラ構築物：　ｃＤＮＡ誘導配列がステイップリングにより表され、ゲノム誘導 配列が斜めハツチングにより表される（Ｒａｍｏｓら、　１９８９．　Ｇｅｎｅ ｔｉｃｓ１２３．３３７−３４８））により暗号化されたＮｏｔｃｈを、メタロ チオネインプロモーターベクターｐＲｍＨａ−３（Ｂｕｎｃｈら、　１９８８． 　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ。 １６、１０４３−１０６１）への挿入後に発現した。Ｄｌｌ　ｃＤＮＡ（Ｋｏｐ ｃｚｙｎｓｋｉら。 １９８８、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ、２．１７２３−１７３５）により暗号化された Ｄｅｌｔａを、同ベクターへの挿入後に発現した。細胞外Ｎｏｔｃｈ（ＥＣＮＩ ）変異体を、完全Ｎｏｔｃｈ遺伝子座を含むゲノムコスミド（Ｒａｍｏｓら、　 １９８９．　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１２３．３３７−３４８）から、その細胞内ドメ イン（δにより表される；　Ｗｈａｒｔｏｎら、１９８５．Ｃｃｌ１４３．５６ ７−５８１）からアミノ酸１７９０−２６２５のコード配列を欠失腰野生型配列 からの２５の膜近位残基を新規な５９のアミノ酸テールに融合させることにより 誘導した（下記の実験方法、項６．１を参照のこと）。この構築物をＮｏｔｃｈ プロモーター領域の調節のもとに発現した。メタロチオネインベクターを含む構 築物に関して、トランスフェクション後に発現をＣｕ５Ｏ，で誘発した。次に、 細胞を混合し、凝集条件下でインキュベートし、そして特定の抗血清および発現 細胞を視覚化する免疫蛍光顕微鏡法を使用してそれらの凝集する能力につきスコ アをつけた。ＭＴ。 メタロチオネインプロモーター、ＡＴＧ、翻訳開始部位、ＴＭ、膜貫通ドメイン ；３’Ｎ、Ｎｏ工帥遺伝子ポリアデニル化シグナル：３’Ａｄｈ　、　Ａｄｈ遺 伝子からのポリアデニル化シグナル；５°Ｎ　、　Ｎｏｔｃｈ遺伝子プロモータ ー領域。 図２．培養細胞中のＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａの発現。（Ａ）０．７ミリモル のＣｕ５Ｏｔで１２〜１６時間にわたって誘導された移入されていない細胞（Ｓ ２）および梗±帥移入細胞（Ｎ）の溶解産物をナトリウムドデシル硫酸ポリアク リルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のために調製し、３％〜１５％勾 配ゲルで運転し、そしてニトロセルロースにプロットした。Ｎｏｔｃｈの細胞内 ドメインに対してモノクローナル抗体（ＭＡｂ　Ｃ１７，９Ｃ６）を使用してＮ ｏｔｃｈを視覚化した。３００ｋｄの主バンドの下の多重バンドはＮｏｔｃｈの 分解生産物に相当し得る。（Ｂ）移入されていない細胞（Ｓ２）および１）ｅｌ ｔａ移入細胞（Ｄｌ）の溶解産物をＤｅｌｔａのモノクローナル抗体（ＭＡｂ　 ２Ｑｌ）で視覚化した。約１０５ｋｄの単一バンドを検出する。両方の場合に、 Ｓ２細胞系には検出可能な内因性のＮｏｔｃｈまたはＤｅｌｔａがなく、また交 差反応性の種がない。それぞれのレーンにおいて、１０μｌの試料（実験方法に 記載されたようにして調製した）を装填した。 図３．Ｎｏｔｃｈ形凝集物およびＤｅｌｔａ形凝集物を発現するＳ２細胞。 全てのパネル中で、Ｎｏ　ｔ　ｃｈが緑で示され、Ｄｅｌｔａが赤で示される。 （八）単−Ｎｏｔｃｈ”細胞。胞状構造だけでなく、明らかに染色されていない 核を含む主要な細胞内染色に注目されたい。 （Ａ）抗体染色の特異性を示す同フィールドの明るいフィールドの顕微鏡写真。 （Ｂ）単−Ｄｅｌｔａ”細胞。染色が主として細胞表面にある。 （１１）同フィールドの明るいフィールドの顕微鏡写真。 （Ｃ）　２４時間の凝集実験からのＤｅ！ｔａ”細胞の凝集物。染色が主として 細胞表面にあることに反することに注目されたい。 （Ｄ）−（Ｆ）単独で移入された細胞集団の１．■の混合物から形成されたＮｏ ｔｃｈ＋細胞およびＤｅｌｔａ”細胞の凝集物（これは室温で一夜凝集させられ た）。（Ｄ）はこの凝集物中のＮｏｔｃｈ＋細胞を示す。 （Ｅ）はＤｅｌｔａ”細胞を示し、そして（Ｆ）は両方の細胞型を示す二重露出 である。Ｎｏ　ｔ　ＣｈおよびＤｅｌｔａのバンドはＮｏｔｃｈ＋細胞とＤｅ！ ｔａ＋細胞の接触点（矢印）で顕著である。（Ｆ）において、これらのバンドは 、これらの点て緑と赤の一致のために黄色に見える。 明らかに二重に染色された単一細胞（°）は実際には二種の細胞（他の細胞の上 に一種の細胞）であり、一方がＮｏ　ｔ　ｃｈを表し、他方がＤｅｌｔａを表す 。 （Ｇ）および（Ｈ）、Ｎｏｔｃｈ”−Ｄｅｌｔａ＋細胞凝集物のプソイドカラー 共焦顕微鏡写真。（Ｇ）において、少なくとも二つのＤｅｌ　ｔａ＋細胞により 形成された拡張部（矢印）が凝集物の中央でＮｏｔｃｈ′″細胞を完全に包囲す ることに注目されたい。（Ｈ）は４℃で行われた２時間の凝集実験から形成され た凝集物を示す。Ｎｏｔｃｈの濃いバンドがＤｅｌｔａ＋細胞と接触する領域内 で明らかである。 （１）、Ｄｅｌｔ’ａ＋細胞と、Ｎｏｔｃｈの細胞外ドメイン（ＥＣＮＩＣ第Ｉ ）のみを発現する細胞を含む凝集物。スケールパー−１０μｍ０図４．　Ｎｏｔ ｃｈおよびＤｅｌｔａが同時移入細胞中で会合される。ＮｏｔＣｈに関する染色 が左欄（Ａ、Ｃ１およびＥ）に示され、Ｄｅｌｔａに関する染色が右欄（Ｂ、Ｄ 、およびＦ）に示される。 （Ａ）および（Ｂ）、　Ｎｏｔｃｈ構築物および肋上嶋構築物の両方で同時移入 されたＳ２細胞。一般に、細胞表面（矢印）でＮｏｔｃｈとＤｅｌｔａの局在間 に良好な相関関係があった。 （Ｃ）および（Ｄ）、同時移入細胞を、特定の抗血清による定着および染色の前 に室温で１時間にわたってポリクローナル抗Ｎｏｔｃｈ抗血清（それぞれの抗細 胞外ドメイン抗血清の１：２５０希釈液）に露出した。Ｎｏ　ｔ　ｃｈおよびＤ ｅｌ　ｔａの小さな斑点のある染色およびそれらのそれぞれの染色（矢印）の相 関関係に注目されたい。 （Ｅ）および（Ｇ）、細胞外Ｎｏｔｃｈ（ＥＣＮＩ）構築物および肋上組構築物 で同時移入され、誘発され、次に抗Ｎｏ　ｔ　ｃｈポリクローナル抗血清を使用 してバッチされた細胞。全長Ｎｏｔｃｈについて観察された表面でＥＣＮＩ染色 とＤｅｌｔａ染色の間に密接な相関関係があった。スケールパー＝１０μｍ０ 図５．同時免疫沈殿は、Ｄｅｌ　ｔａおよびＮｏｔｃｈが移入細胞Ｓ２およびシ ョウジヨウバエ胚細胞からの溶解産物中で会合されていることを示す。全ての実 験において、Ｄｅｌｔａを、定着スタフ（Ｓｔａｐｈ）Ａ細胞で沈殿されたポリ クローナル抗Ｄｅｌｔａラット抗血清を使用してＮＰ−４０／デオキシコール酸 塩溶解産物から沈殿させ、そして沈殿分画中のタンパク質をウェスタンプロット で視覚化した（詳しくは、実験方法を参照のこと）。レーン１，２．３、および ５　：　ＭＡｂ　Ｃ１７，９Ｃ６で視覚化されたＮｏｔｃｈ　；レーン４および ６　：　ＭＡｂ　２０１で視覚化されたＤｅｌｔａｏ （Ａ）において、レーンｌおよび２はこれらの実験の対照である。 レーンｌは、Ｎｏｔｃｈについて視覚化されたＮｏｔｃｈ単独を発現する細胞か らのポリクローナル抗Ｄｅｌｔａ免疫沈殿を示す。Ｎｏｔｃｈはこの試料中で検 出できず、これはポリクローナル抗ＤｅｌｔａがＮｏｔｃｈと交差反応しないこ とを示す。レーン２は、抗Ｄｅｌｔａ抗血清による初期の処理を行わないでスタ フＡで免疫沈殿され、そしてＮｏｔｃｈについて視覚化されたＮｏｔｃｈ　−Ｄ ｅｌ　ｔａ同時移入細胞を示し、これはＮ０ｔＣｈがスタフＡまたは二次抗体に より非特異的に沈殿されないことを実証する。レーン３はＤｅｌ　ｔａ（ＤＩ） について視覚化された抗Ｄｅｌｔａ抗血清で沈殿されたタンパク質を示し、そし てレーン４はＮ０ｔＣｈ（Ｎ）について視覚化された同試料を示す。レーン４は 、Ｎｏｔｃｈが免疫沈殿されたＤｅｌｔａと共沈することを示す。Ｎｏｔｃｈが 免疫沈殿中のＮｏｔｃｈに典型的であるようにダブレットとして現れることに注 目されたい。 （Ｂ）は、移入細胞溶解産物ではなく胚溶解産物を使用する同実験を示す。レー ン５はＤｅｌｔａ（ＤＩ）について視覚化された抗Ｄｅｌｔａ抗血清で沈殿され たタンパク質を示し、そしてレーン６はＮｏｔｃｈ（Ｎ）について視覚化された 同試料を示す。これらのレーンは、Ｎ。 ｔｃｈおよびＤｅｌｔａが胚溶解産物中で安定に会合されることを実証する。Ｄ ｅｌｔａバンドの下のバンド（全てのレーン中）はスタフＡ（ＳＡ）並びに抗Ｄ ｅｌｔａ抗血清Ｈ鎖およびＬ鎖からのものである。 図６．　Ｎｏｔｃｈ発現構築物およびＤｅｌｔａ／　５ｅｒｒａｔｅ結合ドメイ ンの欠失マツピング。対数増殖期の３２細胞を、示された発現構築物の系列で一 時的に移入した。これらの図面は、生じた種々のＮｏｔｃｈ欠失変異体の予想タ ンパク質生産物を表す。全ての発現構築物を構築物＃１　ｐＭｔＮＭｇから誘導 した。一時的に移入した細胞を、安定に形質転換された系Ｌ４９−６−７からの Ｄｅｌｔａ発現細胞または一時的に移入した５ｅｒｒａｔｅ発現細胞と混合し、 Ｃｕ５Ｏ＋で誘発し、凝集条件下でインキュベートし、次に特異的抗血清および 免疫蛍光顕微鏡法を使用して凝集するそれらの能力につきスコアをつけた。凝集 物をＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａ／　５ｅｒｒａｔｅ発現細胞の両方を含む４個 以上の細胞のクラスターと定義した。凝集率（％）に関して示された値は、Ｄｅ ｌｔａ（ＤＩ）　（左欄）または５ｅｒｒａｔｅ（Ｓｅｔ）　（右欄）と共にこ のようなりラスター中に見られる全てのＮｏｔｃｈ発現細胞の％を表す。種々の Ｎｏｔｃｈ欠失構築物が、連結接合部を示す継線で図示される。それぞれのＥＧ Ｆ繰返しが、点描された矩形のボックスとして表され、そして連結接合部の両側 の［！ＧＦ繰返しの数が示される。 連結接合部で、種々の欠失により生じた部分ＥＧＦ繰返しがオープンボックスお よび閉じた括弧により表される（例えば、ΔＣＩａ＋ｔ！ＧＦ（１０−１２）を 参照のこと）。構築物＃　３−１３はＣ１ａｌ欠失系列に相当する。図示される ように、繰返し７．９．１７および２６中のＣｌａｌ部位の四つが、第三のシス ティンの直後で中央の繰返しを破断しくオーブンボックス繰返しにより表される ；更に明瞭にするために、図７を参照のこと）、一方、第五の殆どの３°部位が ＥＧＦ繰返し３０と３１の間できれいに分断する（密閉ボックス繰返し３１によ り表される：再度、図７を参照のこと）。構築物＃１５スプリットにおいスとし て示される。構築物＃３３ΔＣ１ａ＋ＸＥＧＦＩＯ−１３）において、アフリカ ッメガエルＮｏｔｃｈ誘導ＥＧＦ繰返しは、陰影の異なるパターンによりショウ ジヨウバエ繰返しから区別される。 ＳＰ、シグナルペプチド、　ＥＧＦ　、上皮増殖因子繰返し；Ｎ、Ｎｏ工帥／ｆ ｉｎ−１２繰返し、　ＴＭ、膜貫通ドメイン；　ｃｄｃ　１０、牛１０／アンキ リン繰返し、ＰＡ、推定のヌクレオチド結合共通配列；　ｏｐａ　、ｏｐａと称 されるポリグルタミン伸長：Ｄｌ、Ｄｅｌｔａ　；　Ｓｅｒ　、　５ｅｒｒａｔ ｅ。 図７．　Ｎｏｔｃｈ欠失構築物＃　１９−２４の詳しい構造。ＥＧＦ繰返し１１ および１２の両方がＮｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ凝集に必要とされる。ＥＧＦ繰返し １０−１３は上部に図示され、６個のシスティン残基（Ｃ）の規則的な間隔を示 す。これらの構築物に関して生じたＰＣＲ生産物（図６に示された名称および数 ）は太い黒線により示され、そして正確な終点が種々のＢＧＦ繰返しに関して示 される。Ｄｅｌｔａと凝集する能力がそれぞれの構造物に関して（＋）または（ −）として記録される。 ＰＣＲフラグメントは、５個のＣｌａｌ部位のうちの４個と同じ場所で第三シス ティンの直後で中央のＥＧＦ繰返しを破断し、または最もＣ末端のＣｌａｌ部位 と同じ場所で二つの繰返し間で正確に破断する。 図８．ショウジヨウバエおよびアフリカッメガエルのＮｏｔｃｈからのＥＧＦ繰 返し１１および１２のアミノ酸配列の比較。ショウジヨウバエのＮｏｔｃｈ（Ｗ ｈａｒｔｏｎ　ら、１９８５．Ｃｅ１ｌ　４３：５６７−５８１；Ｋｉｄｄら、 　１９８６．　Ｍ。 １、　Ｃｅ１ｌＢｉｏ１．６：３０９４−３１０８）のＥＧＦ繰返し１１および １２のアミノ酸配列が、アフリカッメガエルのＮｏｔｃｈ（Ｃｏｆｆｍａｎら、 　１９９０．５ｃｉｅｎｃｅ２４９：１４３８−１４４１）からの同じ二つのＥ ＧＦ繰返しのアミノ酸配列と並べられる。同一のアミノ酸が箱形にされる。それ ぞれのＥＧＦ繰返しの６個の保存システィン残基およびＣａ”結合共通残基（Ｒ ｅｅｓら、１９８８、ＥＭＢＯＪ、　７：２０５３−２０６１）がアステリスク （本）でマークされる。 凝集しなかったアフリカッメガエルＰＣＲクローン中で見られたロイシンからプ ロリンへの変化が下に示される。 図９．この研究に使用された構築物。表ＩＶ中に特定されたＤｅｌｔａ変異体の 略図が示される。細胞外のアミノ近位末端がそれぞれの場合に左にある。Ｓ、シ グナルペプチド；　“ＥＧＦ″、ＥＧＦ様モチーフ；Ｍ、膜をスパンするらせん ；Ｈ、ストップ−トランスファー配列；実線、その他のＤｅｌｔａ配列；陰影線 、神経膠配列。矢じりは、翻訳可能なリンカ−挿入の部位を示す。Ｓｃａ　、　 ５ｃａｌ　；　Ｎａｅ　。 Ｎａｅｌ；Ｂａｍ　、　ＢａｍＨＩ　；Ｂｇｌ　、　Ｂｇｌｌｌ　；ＥＬＲ、Ｅ ＧＦ様繰返し；　ｎｓｔ、ＢｓｔＢＩＩ　；　Ｄｄｅ　、　Ｄｄｅｌ　；　Ｓｔ ｕ　、　５ｔｕｌ　；　ＮＧＩ−ＮＧ５　、Ｄｅｌｔａ＝神経膠キメラ。 図９Ａ、インブッＩ−ＤＮＡ量に対する凝集の依存性。Ａ、それぞれ種々の量の ｐＭＴＤＩＩ　ＤＮＡ　（２，４、ｔｏまたは２０μｇ／プレート）で一時的に 移入されたＳ２細胞集団（これらは続いて一定量のｐＭｔＮＭｇ　ＤＮＡ　（２ ０μｇ／プレート）で一時的に移入されたＳ２細胞集団と凝集条件下でインキュ ベートされた）を使用して観察された異型凝集。 示されたデータは、それぞれのインプットＤＮＡ量に関する４以上の細胞の凝集 物中のＤｅｌｔａ細胞の平均分率（％）士標準誤差である（２μｇおよびＩＯμ ｇインプット（これらに関してＮ＝２）を除いて、Ｎ＝３反復）。最低１００の Ｄｅｌｔａ発現細胞を、それぞれの反復につきカウントした。Ｂ、それぞれ種々 の量のｐＭＴＤｌｌ　ＤＮＡ（２，４、ｌＯまたは２０μｇ／プレート）で一時 的に移入されたＳ２細胞集団（これらは続いて凝集条件下でインキュベートされ た）を使用して観察された同型凝集。データは、それぞれのインプットＤＮＡ量 に関する４以上の細胞の凝集物中のＤｅｌｔａ細胞の平均分率（％）士標準誤差 である（Ｎ＝３反復）。最低５００のＤｅｌｔａ発現細胞を、それぞれの反復に つきカウントした。 図１０．　Ｄｅｌｔａ−Ｓｅｒｒａｔｅアミノ末端配列の配列。残基はＤｅｌｔ ａ（ＤＩ。 上の配列（配列番号＝３）二アミノ酸２４で開始し、アミノ酸２２６で終了する ）暗号配列および５ｅｒｒａｔｅ（Ｓｅｔ、下の配列（配列番号：４）；アミノ 酸８５で開始し、アミノ酸２８３で終了する）暗号配列の概念上の翻訳に基いて 番号を付される。二つの配列の間の垂直の線は、並べられたＤｅｌｔａ配列およ び５ｅｒｒａｔｅ配列内で同一である残基を示す。ドツトは配列中の間隙を表す 。ボックスは並べられた領域内のシスティン残基を囲む。Ｎｌ、アミノ近位ドメ イン１；Ｎ２、アミノ近位ドメイン２：Ｎ３、アミノ近位ドメイン３゜それぞれ ＳＴＵ　Ｂ構築物［ＧＫＩＦＰによるＤｅｌｔａアミノ酸１３２（Ａ）の置換］ およびＮＡＥＢ構築物［Ｄｅｌｔａアミノ酸１９７とアミノ酸１９８の間のＲＫ ＩＦの挿入コと関連する翻訳可能な挿入が野生型Ｄｅｌｔａ配列の上に示される 。 図１１．　Ｄｅｌｔａ−Ｎｏｔｃｈ相互作用の潜在的な幾何学。Ａ１向かい合っ ている原形質膜の間で相互作用するＤｅｌｔａ　（左）とＮｏｔｃｈ　（右）分 子の潜在的なレジスタ。Ｂ、同じ原形質膜内で相互作用するＤｅｌ

【ａ（左）と Ｎｏｔｃｈ　（右）分子の潜在的なレジスタ。ＥＬＲ５ＥＧＦ様繰返し：オーブ ンボックス、ＥＧＦ様繰返し；ドツト付きボックス、ＬＮＲ繰返し；ソリッドボ ックス、膜をスパンするらせん。Ｄｅｌｔａアミノ末端ドメイン並びにＤｅｌｔ ａおよびＮｏｔｃｈ細胞内ドメインが長円体により表される。 図１２．　Ｄｅｌｔａ−Ｄｅｌｔａ相互作用の潜在的な幾何学。ＡおよびＢ、向 かい合っている原形質膜の間で相互作用するＤｅｌｔａ分子の潜在的なレジスタ 。Ｂ、同じ原形質膜内で相互作用するＤｅｌｔａ分子の潜在的なレジスタ。オー プンボックス、［！ＧＦ様繰返し；ソリッドボックス、膜をスパンするらせん。 Ｄｅｌｔａアミノ末端細胞外ドメインおよび細胞内ドメインが長円体により表さ れる。 図１３．咳±ｔａｃＤＮＡ　Ｄｌｌの一部ヌクレオチド配列（配列番号：５）お よびＤｅｌｔａアミノ酸配列（配列番号：　６　）　。Ｄｌｌ　ｃＤＮＡの５゜ −３′鎖のＤＮＡ配列が示され、これはＫｏｐｃｚｙｎｋｓ　ｉら（１９８８， Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ、　２．１７２３−１７３５）により示された配列と比較し て幾つかの修正を含む。 図１４．神経膠ｃＤＮＡ　ＩＢ７Ａ−２５０の一部ヌクレオチド配列（配列番号 ニア）。これはＩＢ７Ａ−２５０ｃＤＮＡ　（Ａ、　Ｊ、　Ｂｉｅｂｅｒ、　ｐ ｅｒｓ、　ｃｏｍｍ、　；Ｈｏｒｔｓｃｈら、１９９０．Ｎｅｕｒｏｎ４．６９ ７−７０９）の５゛−３°鎖の一部のＤＮＡ配列である。ヌクレオチド２８９０ は、概念上翻訳された神経膠−長い形態のタンパク質のアミノ酸９５２を暗号化 するイソロイシンコドンの第一ヌクレオチドに相当する。 図１５．５ｅｒｒａｔｅとＤｅｌｔａの間の核酸配列相同性。下に記載された暗 号化された５ｅｒｒａｔｅタンパク質配列（配列番号：　９）　（Ｆｌｅｍｉｎ ｇら、１９９０．Ｇｅｎｅｓ　＆Ｄｅｖ、４．２１８８−２２ＯＬ　２１９３− ９４）と共にショウジヨウバエ・５ｅｒｒａｔｅヌクレオチド配列（配列番号＝ ８）の一部が示される。ショウジヨウバエのＤｅｌｔａ配列との高い配列相同性 を示す四つの領域が線の上に番号を付され、括弧により示される。相同性の全体 の領域が、５ｅｒｒａｔｅヌクレオチド配列（Ｆｌｅｍｉｎｇら。 １９９０、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ、４．２１８８−２２０１の図４のようなナンバ リング）のヌクレオチド番号６２７〜１２９０をスパンする。 図１６．　ヒトＮｏｔｃｈのクローニングのＰＣＲに使用されるプライマー。ヒ ト胎児の脳ｃＤＮＡライブラリー中のＤＮＡを増幅するためにＰＣＲに使用され る三つのプライマーの配列が示される。三つのプライマー、ｃｄｃｌ　（配列番 号：　１０）　、ｃｄｃ２　（配列番号：１１）、およびｃｄｃ３　（配列番号 ：１２）を、それぞれ、プライマー対ｃｄｃｌ／ｃｄｃ２またはｃｄｃｌ／ｃｄ ｃ３として２００ｂｐまたは４００ｂｌ）のフラグメントを増幅するように設計 した。■：イノシン。 図１７．ヒト囮クローンの略図。ヒト独工帥の略図が示される。 その線図の下の太字体の線は、四つのｃＤＮＡクローンのそれぞれに含まれるＮ ｏ　ｔ　ｃｈ配列のその部分を示す。ＰＣＨに使用されたプライマーの位置、お よびそれらの配向が矢印により示される。 相当する。それぞれのマツプの下の水平の線は、クローンが配列の伸長（太い水 平の線）に対して置かれている場所を示す。 配列（配列番号＝１３）が示され、これは３°末端でＥｃｏＲ１部位で開始し、 ３゛から５゛への方向に進む。図１９Ｂ　：ヒトＮ０ｔＣｈインサートの一部の ＤＮＡ配列（配列番号：１４）が示され、これは５′末端でＥｃは図１９Ｂに示 された配列の３°から開始し、５′から３°への方向に進む。示された配列は暫 定的であり、オーバーラツプ配列の決定による確認を受ける。 図２０．プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮａＫ中に含まれるヒト独力功の配列（ 配列番号＝１６）が示され、これは３′末端でｔ！ｃｏＲ１部位で開始し、３′ から５°への方向に進む。図２０８：ヒト初復」インサートの一部のＤＮＡ配列 （配列番号＝１７）が示され、これは５′末端でＥｃｏＲ１部位で開始し、５′ から３′への方向に進む。図２０Ｃ：ヒトＮ。 ｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ配列（配列番号：１８）が示され、これは図２ ０Ｂに示された配列の３°から開始し、５°から３°への方向に進む。図２０Ｄ ＝ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ配列（配列番号＝１９）が示され、 これは図２０Ａに示された配列の５°から開始し、３°から５′への方向に進む 。示された配列は暫定的であり、オーバーラツプ配列の決定による確認を受ける 。 配列（配列番号：２０）が示され、これは５°末端でＥＣＯ旧部位で開始し、５ ゛から３゛への方向に進む。図２１８　：ヒト籾±帖インサートの一部のＤＮＡ 配列（配列番号；２１）が示され、これは３′末端付近で開始し、３°から５゛ への方向に進む。示された配列は暫定的であり、オーバーラツプ配列の決定によ る確認を受ける。 配列（配列番号＝２２）が示され、これは５°末端でＥｃｏＲ１部位で開始し、 ５°から３゛への方向に進む。図２２Ｂ＝ヒト％ｏｔｃｈインサートの一部のＤ ＮＡ配列（配列番号：２３）が示され、これは３′末端付近−トの一部のＤＮＡ 配列（配列番号：２４）が示され、これは図２２Ａに示された配列の３°から開 始し、５゛から３′への方向に進む。図２２Ｄ＝ヒトＮｏ　ｔ　ｃｈインサート の一部のＤＮＡ配列（配列番号＝２５）が示され、これは図２２Ｂに示された配 列の５′から開始し、３°から５゛への方向に進む。示された配列は暫定的であ り、オーバーラツプ配列の決定による確認を受ける。 図２３．プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮａＫ中に含まれるヒト独１的のＤＮＡ 配列（配列番号＝３１）およびアミノ酸配列（配列番号＝３４）。 図２４．プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮＳＫ中に含まれるヒト独±帥のＤＮＡ 配列（配列番号：３３）およびアミノ酸配列（配列番号：３４）。 図２５．　ｈＮ５にとその他のＮｏｔｃｈ相同体の比較。図２５Ａ、ショウジョ ＣＤＣｌ０繰返し、ＯＰＡ繰返し、および　ＰＥ５Ｔ　（プロリン、グルタミン 酸、セリン、スレオニン）に富む領域が示される。図２５８．　ｈＮ５にの演鐸 アミノ酸配列とその他のＮｏｔｃｈ相同体の配列の配列。アミノ酸が左側で番号 を付される。ｃｄｃｌｏ領域およびＰＩＥＳＴに富む領域が両方とも箱形にされ 、そして個々のｃｄｃｌＯ繰返しがマークされる。三つ以上の配列中で同一であ るアミノ酸が目立つように示される。ｈＮ５Ｋをクローン化するのに使用された プライマーが、それらが設計された配列の下に示される。核局在配列（ＮＬＳ） 　、カゼインキナーゼＩＩ（ＣＫ１１）、およびを椎動物のＮｏｔｃｈ相同体の 推定のＣｃ位のホスホリル化部位が箱形にされる。 ５、発明の詳細な説明 ド配列、およびそれらの暗号化されたタンパク質のアミノ酸配列に関する。更に 、本発明はトポリズミックタンパク質またはその接着フラグメントへの同型また は異型の結合を媒介するトポリスミック遺伝子により暗号化されたタンパク質の フラグメント（本明細書中、“接着フラグメント”と称される）に関する。本明 細書に使用されるトポリスミック遺伝子は、遺伝子Ｎｏｔｃｈ、　Ｄｅｌｔａ。 および５ｅｒｒａｔｅを意味するだけでなく、例えば、下記の項５．３に記載さ れた方法により同定し得るＤｅｌ　ｔａ／　５ｅｒｒａｔｅフアミリーのその他 の員を意味する。 本発明の核酸配列およびアミノ酸配列並びにその抗体は、ヒトのＮｏｔｃｈおよ びＤｅｌｔａ並びに接着分子のｍＲＮＡの検出および定量化、その発現の研究、 ヒトのＮｏ　ｔ　ｃｈおよびＤｅｌｔａ並びに接着配列の生産、分化プロセスの 研究および操作に使用し得る。 開示の明瞭化のために、そして限定のためでなく、本発明の詳細な説明は下記の 小区分の項に分けられる。 （ｉ）トポリズミックタンパク質ドメインへの結合を媒介するトポリズミックタ ンパク質ドメインの同定およびその配列；（ｉｖ）　トポリスミック遺伝子の発 現；（ｖ）発現された遺伝子生産物の同定および精製；並びに（ｖｉ）　トポリ ズミックタンパク質およびその接着配列の抗体の生産５．１トポリズミツク蛋白 領域への結合を仲介するトポリズミ本発明は、ホモタイプまたはへテロタイプの 結合（ここではこれを“接着性（ａｄｈｅ　ｓ　１ｖｅ）”と称する）を仲介す るトポリズミック蛋白フラグメント、およびそれらの類縁体または誘導体、そし てこれらに関連する核酸配列を提供する。 特定の実施例において、Ｎｏｔｃｈの接着性フラグメントは、ＥＬＲＩＩおよび １２、すなわちショウジヨウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈ　ｉ　ｌａ）のＮｏｔｃｈ配 列のアミノ酸４４７から５２７番目（配列番号＝１）にほとんど相同なＮｏｔｃ ｈの部分を含むもので　ある（図８参照）。他の特定の実施例において、ホモタ イプ結合を仲介する　Ｄｅｌｔａの接着性フラグメントは、ショウジヨウバエの Ｄｅｌｔａ配列のアミノ酸３２−２３０番目付近（配列番号：６）にほとんど相 同なりｅｌｔａの部分を含むものである。さらに別の特定の実施例において、Ｎ ｏｔｃｈへの結合を仲介するＤｅｌｔａの接着性フラグメントは、ショウジヨウ バエのＤｅｌｔａ配列のアミノ酸１−２３０番目付近（配列番号二〇）にほとん ど相同なりｅｌｔａの部分を含むものである。５ｅｒｒａｔｅの接着性フラグメ ントに関する特定の実施例において、このフラグメントは、ショウジヨウバエの ５ｅｒｒａｔｅ配列のアミノ酸８５−２８３または７９−２８２番目付近にほと んど相同な５ｅｒｒａｔｅの部分を含むものである（図１０（配列番号：４）お よび図１５（配列番号＝９）参照）。 トポクズミック接着性ドメインをコードする核酸配列は、霊長類を起源とする場 合と同様に、ブタ、ウシ、ネコ、鳥類、馬又は犬から単離され得る。また既知の トポリスミック遺伝子（以下の遺伝子を含むがこれに限定されるものではない（ カッコ内に配列４４０；　Ｋｏｐｃｚｙｎｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ、、１９８８．Ｇ ｅｎｅｓ　Ｄａｖ、２．１７２３−１７３５；Ｋｏｐｃｚｙｎｓｋｉらへの訂正 、本文図１３（配列番号＝５および配列番号＝６）の配列に留意すること、およ びＳ　ｅ　ｒ　ｒ　ａ　ｔ　ｅ　（Ｆｌｅｍｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、。 １９９０、Ｇｅｎｅｓ　＆　Ｄｅｖ、４．２１８８−２２０１）を有する他の種 が同定され得る。 これらの配列は、機能的に同等の（接着性）分子を提供する置換、付加または欠 失によって変更され得る。配列をコードするヌクレオチドの同義性により、この 接着性配列と実質的に同じアミノ酸配列をコードする、別のＤＮＡ配列も、本発 明の実施上使用することができる。これらの中に、サイレント変化を生ずる配列 中で機能的に等価なアミノ酸残基をコードする別のコドンの置換によこれに限定 されるものではない。同様に、本発明の接着性蛋白フラグメントまたはそれらの 誘導体は、アミノ酸の一次配列として、機能的に同等のアミノ酸残基がサイレン ト変化を起こす配列の範囲内で置換された変更配列を含む接着ドメインのアミノ 酸配列の全部又は一部を含む配列を含むが、これに限定されるものではない。例 えば、当該配列中の１又はそれ以上のアミノ酸残基は、サイレント変更に結びつ く機能的に同等の他のアミノ酸に置換され得る。配列中のアミノ酸の置換物とし て、そのアミノ酸が属するグループの別のものから選択することができる。例え ば　非極性（疎水性）アミノ酸にはアラニン、ロイシン、イソロイノン、バリン 、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンがある。極性 で中性のアミノ酸にはグリシン、セリン、スレオニン、システィン、チロシン、 アスパラギンおよびグルタミンがある。陽性荷電（塩基性）アミノ酸にはアルギ ニン、リジンおよびヒスチジンがある。陰性荷電（酸性）アミノ酸にはアスパラ ギン酸およびグルタミン酸がある。 トボリズミック蛋白の接着性フラグメント、および接着性トボリズミック蛋白配 列に関連する潜在的な誘導体、類似体、またはペプチドは、目的とする結合活性 等を、例えば実施例に記載されたｉｎ　ｖｉｔｒｏ凝集検定によって、測定され 得る。トポリズミック蛋白の接着性誘導体又は接着性類縁体は、その接着性フラ グメントに実質的に相同な当該ペプチド、あるいはそれをコードする核酸が接着 性フラグメントをコードする核酸配列に対してハイブリダイズすることができる 当該ペプチドを含むがこれに限定されるものではない。そして、当該ペプチド及 びペプチド類縁体は、例えば下記の実施例の節に述べるような凝集検定による１ ｎｖｉｔｒｏでの試験で陽性の結合活性等を示す。これらの誘導体および類縁体 は想像上のものであり、本発明の範囲に含まれる。 本発明の接着性蛋白に関連する誘導体、類縁体およびペプチドは、当分野で知ら れた種々の方法で調製し得る。これらを調製する操作は遺伝子または蛋白レベル で行なうことができる。例をあげると、クローン化された接着性蛋白をコードす る遺伝子配列は、当分野で知られた数多くの戦略のいずれによってでも修飾する ことができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、ｊ９９０．　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ ｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ　ｅｄ、、Ｃ ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓ ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）　ｏ配列は適当な位置で（１ま たはそれ以上の）制限酵素で切断され、所望によりさらに酵素的に修飾され、単 離され、±ｎ　ｖｉｔｒｏで連結される。接着性ドメインに関連する誘導体、類 縁体またはペプチドをコードする遺伝子の調製においては、修飾された遺伝子が 、目的とする接着性活性がコードされた遺伝子の範囲内で、翻訳停止シグナルに 阻止されずに、接着性蛋白と同じ翻訳読み取り枠内に確実にとどまるように、注 意が必要である。 さらに、接着性をコードする核酸配列は、配列の翻訳、開始および／または終決 の形成および／または破壊、あるいはコード領域の変更の形成および／または新 しい制限エンドヌクレアーゼ部位の形成またはそれまでの部位の破壊して、ｉｎ 　ｖｉｔｒｏでのそれ以上の修飾を促進させるために、ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたは ｉｎ　ｖｉｖｏでの突然変異を起こさせることもできる。当分野で既知の突然変 異誘発の技術のどれでも使用することができ、これらにはｉｎ　ｖｉｔｒｏでの 部位特異的突然変異（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ、Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、、１９７８． 　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５３．６５５１）　、ＴＡＢＲリンカ−（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ　）の使用、その他が含まれるが、これらに限定されるものでは ない。 接着性配列の操作は蛋白レベルで行なうこともできる。本発明の範囲には、例え ばグリコジル化、アセチル化、リン酸化、蛋白加水分解、抗体分子または他の細 胞リガンドへの連結その他によって、翻訳中又はその後に特異的に修飾されたト ポリズミック蛋白、類縁体または誘導体が含まれる。数多くの化学的修飾の中で 以下に示すどれでも既知の技術で実施することができるが、これらに限定される ものではない：臭化ノアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、■８プロ テアーゼ、Ｎ　ａ　Ｂ　Ｈ４による特異的化学的切断；アセチル化、ホルミル化 、酸化、還元；ツニカマイシン（Ｌｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ　）の存在下での代謝 合成；その他。 さらに、接着性フラグメントに関連する類縁体およびペプチドを化学的に合成す ることもできる。例えば、目的とする　ｊｎｖｉｔｒｏでの凝集活性を仲介する トポリズミック蛋白の部分に相当するペプチドがペプチド合成装置を用いること により合成され得る。 本発明の別の特定の実施例は、他のＤｅｌｔａ蛋白またはフラグメントあるいは それらの誘導体と結合する能力はあるが、Ｎ。 ｔｃｈには結合しない、あるＤｅｌｔａ蛋白のフラグメントまたは誘導体に関す るものである。これらの結合あるいはその欠失は８節で述べるようにｉｎ　ｖｉ ｔｒｏで検定することができる。 実施例に限定されるものではないが、これによれば、そのようなりｅｌｔａ誘導 体は、ショウジヨウバエ蛋白のＤｅｌｔａの残基１９８と１９９の間にテトラペ プチド、Ａｒｇ−Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｐｈｅが挿入されているものである。 本発明はさらに、抗原決定基を含む（すなわち、抗体によって認識され得る）又 は機能的に活性な、ヒトＮｃ＋ｔｃｈ及びヒトＤｅｌｔａのアミノ酸配列及びそ れらのフラグメント及び誘導体、並びにこれらをコードする核酸配列に関する。 ここで使用される、“機能的に活性な”物質とは、全長（野生型）蛋白生成物と 共通する既知の機能上の活性の１またはそれ以上を示す物質を称するものであり 、例えばＮｏｔｃｈの場合ならば、Ｄｅｌｔａへの結合、５ｅｒｒａｔｅへの結 合、抗原性（抗Ｎ。 ｔｃｈ抗体への結合）その他がある。 特定の実施例において、本発明は少なくとも４０アミノ酸、または少なくとも７ ７アミノ酸からなる、ヒトＮｏｔｃｈ蛋白のフラグメントを提供する。他の実施 例において、本発明の蛋白は、本質的に、ヒトＮｏｔｃｈ蛋白の細胞内領域、貫 膜部分、細胞外領域、ｃｄｃｌｏ部分、Ｎｏｔｃｈ／上土ｎ−１２の繰り返し、 またはＥＧＦ相同繰り返し、または上記のいずれかの組合せを含むか、あるいは 本質的にそれらからなっている。ヒトＮｏｔｃｈのＥＧＦ相同繰り返しのいくつ かまたはすべてを欠失しているフラグメント、あるいはそのフラグメントを含む 蛋白もまた提供される。 他の特定の実施例において、本発明はさらに、少なくとも２５ヌクレオチド、少 なくとも５０ヌクレオチド、または少なくとも蛋白フラグメントをコードする核 酸もまた提供される。並びに、これらの核酸に相補的で、これらにハイブリダイ ズし得る核酸が提供される。ある実施例において、このような相補的配列として 、少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも１２１ヌクレオチドのヒトＮｏ ｔｃｈ　ｃＤＮＡ配列に相補的なものであろう。好ましさという点で、本発明は ヒトＮｏｔｃｈまたはその一部をコ−ドするｃＤＮＡ配列に関連する。特定の実 施例において、本発明は、ヒトＮｏｔｃｈ遺伝子またはｃＤＮＡのヌクレオチド 配列、特に図１９．２０．２１および／または２２に示す配列（配列番号：１３ から配列番号：２５）、またはプラスミドｈＮ３に、ｈＮ４ｋまたはｈＮ５ｋに 含まれる配列（下記９節参照）、およびコードされたＮｏｔｃｈ蛋白配列に関す るものである。きわめて明らかなことであるが、ここで使用する“Ｎｏｔｃｈ蛋 白フラグメントまたはその一部分をコードする核酸１とは、Ｎｏｔｃｈ蛋白の中 の対象とするフラグメントまたはその一部分のみをコードし、Ｎｏｔｃｈ蛋白の その他の部分はコードしない核酸を示すものと解釈されなければならない。 限定するものではないが、本発明の好ましい態様として、ヒトＮｏｔｃｈ　ＤＮ Ａ配列が下記９節に述べる方法によって、クローン化され、配列決定され得る。 ヒトＤｅｌｔａのクローニングの好ましい実施例として、以下に具体的な例を示 すが、これに限定されるものではない：ヒト発現ライブラリーを、当分野で既知 の方法によって構築する。例えば、ヒトｍＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを生成させ 、続いて宿主細胞中に導入した場合に、この宿主細胞によって発現することので きる発現ベクター（例えばバクテリオファージ誘導体）に連結する。そして、こ の発現されたヒトＤｅｌｔａ生成物を選別するために、種々のスクリーニング検 定を使用することができる。ある例においては、ヒトＮｏｔｃｈの接着性領域（ すなわちショウジヨウバエＥＬＲＩＩおよび１２（配列番号＝１）にきわめて相 同なヒトＮｏｔｃｈの部分）への陽性結合を基準として、選別が行なわれ得る。 別の例では、選別のために抗Ｄｅｌｔａ抗体が使用され得る。 他の好ましい様相として、選別に先立ち、ＰＣＲにより、ライブラリー中の目的 とする配列を増幅させることができる。例えば、ＰＣＲにおけるプライマーとし て、目的とする遺伝子の相同体によってコードされた接着性領域の部分に相当す るオリゴヌクレオチドプライマーが使用され得る。 上記の方法は、ヒトＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａのクローンを得るための方法に ついての、以下の一般的記述を限定するために述べたものではない。 ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａ遺伝子の分子クローニングのための核酸源として、 どのようなヒト細胞でも使用することが可能である。当該ＤＮＡは、クローン化 されたＤＮＡ　（例えば、ＤＮＡ“ライブラリー”）からの当分野で既知の標準 的な操作法、化学合成、ｃＤＮＡクローニング、または目的とするヒト細胞から 精製されたゲノムＤＮＡまたはそのフラグメントのクローニング、のいずれかに よって、得ることができる（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔａｌ、、１９８２ ．　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａ ｎｕａｌ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：Ｇｌｏｖｅｒ、 　Ｄ、　Ｍ、　（ｅｄ、　）、　１９８５．　ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｐ ｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、　ＭqＬ Ｐｒｅｓｓ、　Ｌｔｄ、　、　０ｘｆｏｒｄ、　Ｕ、　Ｋ、　Ｖｏｌ、　１．　 Ｉｌ、参照）。ゲノムＤＮＡから誘導されるクローンはコード部分の他に調節お よびイントロンＤＮＡ部分を含んでもよい；ｃＤＮＡから誘導されるクローンは エクソン配列のみを含むはずである。由来が何であれ、その遺伝子を当該遺伝子 を増殖させるため、適当なベクター中に分子クローン化する必要がある。 ゲノムＤＮＡからの遺伝子の分子クローニングにおいて、ＤＮＡフラグメントが 生成し、それらの中のいくつかは目的とする遺伝子をコードする。ＤＮＡは種々 の制限酵素を使用することにより、特異的部位で切断してもよい。または、ＤＮ Ａをフラグメント化するため、マンガン存在下でＤＮＡアーゼを使用するか、又 は例えば超音波処理によって、ＤＮＡを物理的に切断することもできる。そして 、標準的な方法を用いて、線状ＤＮＡフラグメントが大きさによって分離され得 る。こうした方法にはアガロースおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動および カラムクロマトグラフィーがあるが、これらに限定されるものではない。 いったんＤＮＡフラグメントが生成すると、目的とする遺伝子を含んでいる特定 のＤＮＡフラグメントの同定を、さまざまの方法で実施することができる。例え ば、一定量のＮｏｔｃｈまたはＤｅｌｔａ遺伝子（種は限定されない）部分また はそれに特異的なＲＮＡの部分、あるいは例えば接着性ドメイン等の当該フラグ メントが入手でき、精製および標識ができるならば、生成したＤＮＡフラグメン トを、その標識プローブに核酸ハイブリダイズさせることによって、スクリーニ ングすることができる（Ｂｅｎｔｏｎ、　Ｗ。 ａｎｄ　Ｄａｖｉｓ、Ｒ，、１９７７，５ｃｉｅｎｃｅ　１９６．１８０；　Ｇ ｒｕｎｓｔｅｉｎ、Ｍ、ａｎｄ　Ｈｏｇｎｅｓｓ、Ｄ、、１９７５．　Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、７２．３９６１）　、プローブに 実質的に相同なりＮＡはハイブリダイズするはずである。既知の制限マツプがあ れば、（ｌまたは複数の）制限酵素による消化を行い、この既知の制限マツプを 使って、フラグメントの大きさを目的とするものと比較することによって、適切 なフラグメントを同定することも可能である。さらに、遺伝子の特性に基づいて 、選別を行なうこともできる。その他に、遺伝子の存在を、その発現生成物の物 理的、化学的または免疫学的特性に基づいた検定によって検出することも可能で ある。例えば、ＮｏｔｃｈまたはＤｅｌｔａに関して既知のものと類似または同 一の電気泳動、等電点電気泳動、蛋白加水分解マツプ、１旦　ｖｉｔｒｏ凝集活 性（“接着性″）あるいは抗原特性などを有する蛋白を生成する、ｃＤＮＡクロ ーンまたは対応するｍＲＮＡをハイブリッド選択するＤＮＡクローンを選別する ことができる。Ｎ□ｔｃｈまたはＤｅｌｔａの抗体が入手できる場合は、ＥＬＩ ＳＡ（酵素結合イムノソルベント検定法）型の操作法を使用して、標識抗体をＮ ｏｔｃｈまたはＤｅｌｔａ合成りローンと推定される物質に結合させることによ り、ＮｏｔｃｈまたはＤｅｌｔａ蛋白を同定することとができる。この方法にお いては、ハイブリダイズによって、相補的なｍＲＮＡを単離するために、フラグ メントが使用される。 このＤＮＡフラグメントは、入手可能な、精製された別の種（例えばショウジヨ ウバエ）のＮｏｔｃｈまたはＤｅｌｔａ　ＤＮＡのことであり得る。単離された ｍＲＮＡの生成物を単離し、そのｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳生成物の免疫沈降検定ま たは機能検定（例えばｉｎ　ｖｉｔｒｏ凝集活性；下記の例参照）を行なうこと によって、ｍＲＮＡが同定され、したがって目的とする配列を含む相補的なりＮ Ａフラグメントが同定される。さらに、ＮｏｔｃｈまたはＤｅｌｔａ蛋白質に対 して特異的な固定化抗体に、細胞から単離したポリソームを吸着させることによ って、特定のｍ　ＲＮＡを選別することができる。この（吸着したポリソームか ら）選別したｍＲＮＡを鋳型として使用して、放射性標識ＮｏｔｃｈまたはＤｅ ｌｔａのｃＤＮＡを合成することができる。この放射性標識ｍＲＮＡまたはｃＤ ＮＡは、つづいて、他のゲノムＤＮＡフラグメントを含むものの中から、Ｎｏｔ ｃｈまたはＤｅｌｔａＤ　’Ｎ　Ａフラグメントを同定するために使用され得る 。 Ｎｏｔｃｈ−またはＤｅｌｔａニゲツムＤＮＡを単離する変法として、既知の配 列からの遺伝子配列自体の化学合成、あるいはＮ０ｔｃｈまたはＤｅｌｔａ遺伝 子をコードするｍＲＮＡに対するＣＤＮＡの生成が含まれるが、これに限定され るものではない。例えば、ＮｏｔｃｈまたはＤｅｌｔａ遺伝子のｃＤＮＡクロー ニングのためのＲＮＡはＮ、ｏ　ｔ　ｃ　ｈまたはＤｅｌｔａを発現する細胞か ら単離され得る。他の方法も可能であり、本発明の範囲に含まれる。 同定され、単離された遺伝子は、つづいて、適当なりローニングベクター中に挿 入され得る。当分野で既知の数多くのベクター−宿主系が使用され得る。可能な ベクターとしては、プラスミドまたは改変ウィルスが含まれるがこれに限定され るわけてはない。 しかし、そのベクター系は、使用する宿主と適合しなければならない。こうした ベクターとして、限定するわけではないが、ラムダ誘導体等のバクテリオファー ジまたはＰＢＲ３２２若しくはｐＵＣプラスミド誘導体が含まれる。クローニン グベクター中への挿入は、例えば、相補的付着末端を有するクローニングベクタ ー中に、ＤＮＡフラグメントを連結させることによって、実施することができる 。しかし、ＤＮＡをフラグメント化したときに使用した制限部位がそのクローニ ングベクターに存在しない場合は、ＤＮＡ分子の末端を酵素によって修飾しても よい。その他、ＤＮＡ末端にヌクレオチド配列（リンカ−）を連結させることに よって、必要などんな部位でも作成することができる；こうした連結リンカ−と して、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特定の化学合成オリゴヌク レオチドが含まれる。他の方法において、切断されたベクターとＮｏｔｃｈまた はＤｅｌｔａ遺伝子をホモポリマー末端法によって修飾するものがある。遺伝子 配列の多数のコピーを生成させるために、形質転換、形質導入、感染、エレクト ロポーレーションその他により、組み換え体骨子を宿主細胞に導入することがで きる。 他の方法において、目的とする遺伝子を”ショットガン”法によって適当なりロ ーニングベクター中に挿入した後、同定し単離することもある。例えばサイズ分 画などによる、目的遺伝子の富化は、クローニングベクター中への挿入前に実施 することができる。 特定の実施例において、単離ＮｏｔｃｈまたはＤｅ４ｔａ遺伝子、ｃＤＮＡ、ま たは合成りＮＡ配列を組み入れた、組み換え体ＤＮＡ分子による宿主細胞の形質 転換によって、その遺伝子の多数のコピーの作成が可能である。こうして、形質 転換体を増殖させ、その形質転換細胞から組み換え体ＤＮＡ分子を単離し、必要 ならば、単離した組み換え体ＤＮＡから挿入遺伝子を回収することによって、大 量の遺伝子を得ることができる。 本発明によって提供されるヒトＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａ配列は、トポリズミ ック蛋白の接着性部分について、上記５．　１節に述へたように、ヒトＮｏｔｃ ｈおよびヒトＤｅｌｔａ中で発見されたアミノ酸配列と実質的に等しいアミノ酸 をコードするヌクレオチド配列、および機能的に同等なアミノ酸からなる、コー ドされたアミノ酸配列を含むものである。 （来貢以下余白） ５．３．　Ｄｅｌｔａ　／５ｅｒｒａｔｅファミリーのその他のメンバーの同定 な検索は、５ｅｒｒａｔｅとＤｅｌｔａとの間の顕著な相同を保存する部分が存 在すること（第１θ図、配列番号；３および：４参照）を利用する方法を用いて 、実施することができる。例えば、この遺伝子フよび第１５図（配列番号＝８） ）を選び、この選ばれた配列の中から、５ｅｒｒａｔｅおよびＤｅｌ　ｔａに相 同でない核酸配列をも含有するものを同定することによって、決定することがで きる。「相同でない」といる領域を意味するものと解されてよい。 例えば、本発明の好ましい特定の態様は、下記の方法を提供する。Ｄｅｌｔａと ５ｅｒｒａｔｅとの間の２つの保存された部分、即ちＤｅｌｔａＡＡ６３−７３ およびＤｅｌｔａＡＡ　１９５−２０６　（第１３図、配列番号＝６）に対応し て、約１０〜２０個のヌクレオチドの縮重オリゴヌクレオチドプローブの組を合 成することができ、この組は約３〜７個の連続したコドンについてのＤｅｌｔａ および５ｅｒｒａｔｅのいずれかに見出されるアミノ酸のすべての有り得るコー ド配列を表わしている。他の態様では、第１５図（配列番号＝８および＝９）に 示されたＤｅｌｔａと５ｅｒｒａｔｅとの間の４つの高度に保存された領域の部 分、即ち５ｅｒｒａｔｅＡＡ　１２４−１３４　、’１４９−１５８．２４４− ２１９、および２５０−２５９で表わされる部分に対応して、オリゴヌクレオチ ドを得ることができる。この合成オリゴヌクレオチドは、有望な源（ＲＮＡまた はＤＮＡ）からの配列をＰＣＲによって増幅するためのプライマーとして利用さ れうる（ＰＣＲは、例えばパーキン・エルマーシークスの熱循環器およびＴａｑ ポリメラーゼ（Ｇｅｎｅ　ＡｍｐＴＲ）の使用によって実施することができる） 。これには、５ｅｒｒａｔｅおよびＤｅｌｔａに密接に関連したポリペプチドを 発現しうるいずれかの真核生物の種からの、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤ ＮＡが含まれるだろう。このＰＣＲ反応を実施することによって、５ｅｒｒａｔ ｅとＤｅｌ　ｔａとの間の保存配列の上記セグメントを共有する遺伝子、または 遺伝子産物を検出することができる。数種の異なった縮重プライマーを合成する ことを選ぶ場合には、かなり少数のＰＣＲ反応で完全な検索を容するために、Ｐ ＣＲ反応の開始に用いられるハイブリッド形成条件のストリンジエンシー（緊縮 性）を変更することも可能である。もし５ｅｒｒａｔｅ　／Ｄｅｌｔａ遺伝子フ ァミリーのうちのそれまで未知のメンバーのセグメントが首尾よく増幅されるな らば、このセグメントは分子クローニングされ、配列決定され、そして完全なｃ ＤＮＡまたはゲノムクローンを単離するプローブとして利用されつる。その後、 これは未知の遺伝子の完全なヌクレオチド配列の決定、その発現の分析、および 機能分析用のタンパク質産物の生産を可能にするだろう。この方法で、「接着」 タンパク質をコード化するその他の遺伝子が同定されうる。 さらに本発明は、５ｅｒｒａｔｅ／　Ｄｅｌｔａ遺伝子ファミリーのメンバーで はあるが、自然には存在しないかも知れない新規な組換え分子例えば、制限を課 する意味ではないが、５ｅｒｒａｔ６とＤｅｌ　ｔａとの双方の遺伝子の部分よ り成る組換え分子を、本発明によって構築することかできる。このような分子は 、５ｅｒｒａｔｅおよびＤｅｌｔａの双方に関連する特性を示し、アゴニストお よびアンタゴニストを含む生物活性の新しい側面を表わしうる。５ｅｒｒａｔｅ およびＤｅｌｔａの一次配列は、コンピュータ・シミュレーション（ホップおよ びウッズ、１９８１年、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、 Ｓ、Ａ、　７８．３８２４−３８２８）を用いて分子の三次構造を推定する目的 に使用されうる。三次構造および生物学的機能間の相関を考慮して、５ｅｒｒａ ｔｅ／　Ｄｅｌｔａのキメラ組換え遺伝子を設計することができるであろう。同 様に、トポリズミック遺伝子ファミリー（例えばＮｏｔｃｈ）の一つ以上のメン バーの部分より成るキメラ遺伝子を、構築することができる。 たはヒトＮｏｔｃｈまたはＤｅｌｔａまたはその機能的に活性な断片または誘導 体をコードするヌクレオチド配列は、挿入されるタンパク質をコードする配列の 転写および翻訳に必要な要素を含有するベクターのような、適当な発現ベクター に、挿入できる。必要な転写および翻訳シグナルは、未然トポリズミック遺伝子 、および／またはそのフランキング領域によって、提供される。タンパク質コー ド配列を発現するために、多種の宿主・ベクター系を利用できる。これらにはウ ィルス（例えばワクシニア・ウィルス、アデノウィルス等）に感染する哺乳動物 の細胞系や、ウィルス（例えばバキュロウィルス）に感染する昆虫細胞系や、酵 母ベクターを含む酵母のような微生物や、バクテリオファージ、ＤＮＡ、プラス ミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡで転換されるバクテリアを含むが、これらに 限られない。ベクターの発現要素は、その強度および特異性が変化する。利用さ れる宿主・ベクター系に依って、多数の適当な転写および翻訳要素のいずれか一 つを使用してもよい。特定の態様において、例えばＥＧＦ一様繰返し１１および １２をコードするＮｏｔｃｈ遺伝子の接着部分が発現される。他の態様では、子 、またはヒトＮｏｔｃｈまたはＤｅｌｔａの機能的に活性な部分をコードする配 列が発現される。されらに別の態様では、５ｅｒｒａｔｅ遺伝子の接着部分が発 現される。 ベクターへのＤＮＡ断片の挿入に使用される上述の方法のいずれかを、適切な転 写／翻訳調節シグナルと、タンパク質コード配列とより成るキメラ遺伝子を含む 発現ベクターを構築するために用いてもよい。これらの方法には、ｉｎ　ｖｉｔ ｒｏ組換え体ＤＮＡおよび合成技術、さらにｉｎ　ｖｉｖｏ組換え体（遺伝子組 換え）を含むことがある。トポリズミックタンパク質またはペプチド断片をコー ドする核酸配列の発現は、このトポリズミックタンパク質またはペプチドが組換 えＤＮＡ分子で形質転換された宿主で発現されるように、第二の核酸配列によっ て調節されてもよい。例えば、トポリズミックタンパク質の発現を、当該分野で 周知のプロモーターまたはエンハンガー要素のいずれかによって制御してもよい 。 トポリズミック遺伝子発現を制御するために用いられうるプロモーターには、Ｓ Ｖ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔとＣｈａｍｂｏｎ、　１９８１ 、　Ｎａｔｕｒｅ、　２９０．３０４−３１０）、ラウス肉腫ウィルスの３′ロ ング・ターミナル・リピートに含まれるプロモーター（山水ら、　１９８０゜Ｃ ｅ１ｌ　２２．７８７−７９７）　、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（ ワグナ−ら、　１９８１．　ｒＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　Ｕ、Ｓ、Ａ、　Ｊ　７８゜１４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の 調節配列（プリンスターら、　１９Ｂ２．２９６．３９−４２）、β−ラクタマ ーゼプロモーターのような原核発現ベクター（ビラ・力ｖｏ）ら、　１９７８． 　ｒＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、Ｊ　７５．３７２７−３７３１）またはｔ ａｃプロモーター（Ｄ　ｅ、Ｂ　Ｏｅ　ｒ　ら、１９８３．　ｒＰｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、　Ａ、Ｊ　８０゜２ｌ−２５）、さらに「 サイエンティフィクアメリカン４１９８０．２４２．７４−９４掲載「組換えバ クテリアからの有用なタンパク質」参照、ツバリンシンセターゼプロモーター領 域（ヘレラ・エストレラら。 「ネイチアＪ　３０３．２０９−２１３）または、カリフラワーモザイクウィル ス３５ＳＲＮＡプロモーター（ガードナーら、　１９８１．　ｒＮｕｃｌ、　Ａ ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、」９．２８７１）、および光合成酵素リブロースビホスフェ ート・カルボキシラーゼ（ヘレラ・エストレラら、　１９８４．　ｒネイチアＪ 　３１０．１１５−１２０）を含む植物発現ベクター、および酵母またはＧａｌ 　４プロモーター、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧ Ｋ　（ホスホグリセロール・キナーゼ）プロモーター、アルカリ性ホスファター ゼプロモーター、および膵臓房状細胞内で活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域 （スイットら。 １９８４、　ｒ細胞Ｊ　３８．６３９−６４６；オーニッツら、　１９８６．　 ｒｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、　Ｑｕａｍｔ、　Ｂｉｏｌ 、　５０．３９９−４０９　；　マクドナルド、　１９８７、　「肝臓学Ｊ　７ ．４２５−５１５）；膵臓ベータ細胞内で活性なインシュリン遺伝子制御領域（ ハナハン、１９８５　ｒネイチアＪ　３１５．１１５−１２２）、リンパ細胞内 で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（グロスケトルら、１９８４．　ｒ細胞 Ｊ　３８．６４７−６５８；アダムスら、１９８５゜［ネイチアＪ　３］、８． ５３３−５３８．アレキサングーら、　１９８７．　ｒＭｏｌ。 Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　Ｊ　７．１４３６−１４４４）　、精巣、乳房、リン パ細胞およびマスト細胞内で活性なマウス乳房腫瘍ウィルス制御領域（レダーら 、　１９８６．　ｒ細胞Ｊ　４５．４８５−４９５）、肝臓内で活性なアルブミ ン遺伝子制御領域（ピンカートら、　１９７８．　ｒ遺伝子および開発Ｊ　１゜ ２６８−２７６）、肝臓内で活性なアルファ・フェトプロティン遺伝子制御領域 （クルムララフら、１９８５．　ｒＭｏｌ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、」５．１ ６３９−１６４８、ハンマーら、　１９８７．　ｒ科学Ｊ　２３５．５３−５８ ）、肝臓内で活性なアルファｌ−アンチトリプシン遺伝子制御領域（ケルセイら 。 １９８７、ｒ遺伝子および開発Ｊ　ｌ、　１６１−１７１）、骨髄細胞内で活性 なベータグロビン遺伝子制御領域（モグラムら、　１９８５．　ｒネイチア」３ １５、３３８−３４０．コリアズら１９８６．　ｒ細胞Ｊ　４６．８９−９４） 　、脳のオリゴデンドロサイト細胞内で活性なミニリン塩基性タンパク質遺伝子 制御領域（リードヘッドら、　１９８７．　ｒ細胞Ｊ　４８．７０３−７１２） 、骨格筋内で活性なミオシン軽鎖２遺伝子制御領域（サニ、　１９８５゜［ネイ チアＪ　、　３１４，２８３−２８６）、および視床下部内で活性な生殖腺刺激 性放出ホルモン遺伝子制御領域（メイソンら、　１９８６．　ｒ科学」２３４、 　１３７２−１．３７８）なとの、組織特異性を示しトランスジェニック動物に 利用された上記の動物転写制御領域などが含まれるが、これらに限られない。 トポリズミック遺伝子挿入体を含有する発現ベクターは、（ａｌ核酸ハイブリッ ド形成、（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存在または不在、および（Ｃ）挿入さ れた配列の発現という、３つの一般的な方法によって、同定することができる。 第一の方法では、発現ベクターに挿入された外来遺伝子の存在は、挿入されたト ポリズミック遺伝子と相同な配列より成るプローブを用いる核酸ハイブリッド形 成によって、検出することができる。第二の方法においては、組換え体ベクター または宿主系は、ベクターへの外来遺伝子の挿入によって生じる成る「マーカー 」遺伝子機能（例えばチミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、形質転換発現型、 バキュロウィルス内の封入体形成など）の存在または不在をもとにして、同定し 選択することができる。例えば、もしトポリズミック遺伝子がベクターのマーカ ー遺伝子配列内に挿入されると、トポリズミック挿入体を含む組換え体は、マー カー遺伝子機能の不在によって同定することができる。第三の方法では、組換え 体発現ベクターは、この組換え体によって発現された外来遺伝子産物を分析する ことによって同定することができる。これらの分析は、例えば凝集（接着）能力 （上記第６−８節参照）のような、試験管内分析系におけるトポリズミック遺伝 子産物の物理的または機能的特性にもとずいて行なうことができる。 特定の組換えＤＮＡ分子が同定され単離されると、それを増殖させるために、当 該分野で知られたいくつかの方法を用いることができる。適当な宿主系と増殖条 件が一旦決定されると、組換え体発現ベクターは多量に増殖され調製されること ができる。すでに説明されたように、使用できる発現ベクターは、ワクシニアウ ィルスまたはアデノウィルスのようなヒトまたは動物のウィルス、バキュロウィ ルスのような昆虫のウィルス、酵母ベクター、バクテリオファージベクター（例 えばラムダ）、およびプラスミドとコスミドＤＮＡベクターを、その少数例とす る上記のベクターとその誘導体を含むが、それに限られない。 さらに、所望の特定な方法で挿入された配列の発現を調整するか、または遺伝子 産物を修飾しプロセシングする宿主細胞株を選択することも可能である。ある種 のプロモーターからの発現は、ある種の誘導物質の存在下に向上させることがで きる。かくして遺伝子操作されたトポリズミックタンパク質の発現の制御が、可 能となる。その上、異なった宿主細胞は、タンパク質の翻訳および翻訳後プロセ シングや修飾（例えばグリコジル化や切断）のための、特徴的で特異な機構をも っている。発現された外来タンパク質の所望の修飾とプロセシングを確実にする ために、適切な細胞系または宿主系を選択することができる。例えばバクテリア 系での発現を用いて、グリコジル化されていないコアタンパク質産物を生産する ことができる。酵母での発現は、グリコジル化された産物を得ることとなる。異 種の哺乳類トポリズミックタンパク質の「天然」のグリコジル化を確実にするた めに、哺乳類細胞での発現を使用することができる。さらにさまざまのベクター ／宿主発現系が、タンパク質切断のようなプロセシング反応を、さまざまな程度 に実現することを可能とする。 他の具体的態様においては、接着性トポリズミックタンパク質、断片、類似体、 または誘導体を、融合またはキメラタンパク類産物（タンパク質、断片、類似物 または誘導物を異種タンパク質配列に結合したもの）として、発現させることが できる。このようなキメラ産物は、所望のアミノ酸配列をコードする適切な核酸 配列を、公知の方法で適当な読み枠内で相互に連結し、キメラ産物を当該分野で 広く知られた方法によって発現させることによって、製造することができる。ま た、このようなキメラ産物は、例えばペプチド合成機を使用するタンパク質合成 技術によって、製造することができる。 ｃＤＮＡならびにゲノム双方の配列をクローニングし、発現させることができる 。 他の態様では、ヒトのＮｏｔｃｈ　ｃＤＮＡ配列を、染色体をもとにして統合し かつ発現することが、可能である。公知の同種組換え手順が使用され得る。 ５、４．１．　発現された遺伝子産物の同定および精製トポリズミック遺伝子配 列を発現する組換え体が一旦同定されると、遺伝子産物の分析が可能となる。こ れは、生産物の放射性標識付けと、それに続くゲル電気泳動分析とを含めた、生 産物の物理的または機能的特性に基づく分析によってなしとげられる。 トポリズミックタンパク質が一旦同定されると、クロマトグラフ法（例えばイオ ン交換、アフィニティー、およびサイズカラムクロマトグラフ法）、遠心分離、 示差溶解度を含む標準方法によるか、タンパク質の精製を目的とする他の標準方 法によって、単離され精製されることが可能となる。機能的特性は、凝集分析（ 第６．８節参照）を含むがこれに限られない適当な分析を使用して、評価するこ とが可能である。 ５．５．　トポリズミックタンパク質に対する抗体の生成およびその接着性配列 本発明によると、ホモタイプまたはへテロタイプの結合を仲介するトポリズック タンパク断片、その類似体、またはその誘導体、つまりヒトＮｏｔｃｈまたはヒ トＤｅｌｔａタンパク質またはその断片を、抗トポリズミックタンパク質抗体を 生成するための免疫原として使うことが可能となる。これらの抗体はポリクロー ナルまたはモノクローナルであり得る。一つの具体的態様では、Ｎｏ　ｔ　ｃｈ のＥＧＦ様繰返し１１および１２に特異的な抗体の調製が可能となる。他の態様 においては、Ｄｅｌｔａの「接着部分」に反応する抗体を生成することができる 。これら抗体の一例は、試験管内分析での凝集を防ぐことができる。他の態様で は、ヒトのＮｏｔｃｈに特異的な抗体が生産される。 トポリズミックタンパク質またはペプチドに対するポリクローナル抗体の生産に は、公知の種々の手順を用いることが可能である。ある特別の態様では、第１９ ．２０．２１．または２２図（配列番号＋ｌ３−ＮＯ：２５）に示された配列に よりコードされたヒトＮｏｔｃｈタンパク質のエピトープに対するウサギポリク ローナル抗体、またはそのサブ配列を得ることができる。抗体の生産のためには 、ウサギ、マウス、ラットなどを含むが、これらに限られない種々の宿主動物を 、天然のトポリズミックタンパク質、またはその合成品を注射することによって 、免疫することができる。宿主の種に依っては、免疫学的な応答を増強するため に種々のマジュバントを用いることが可能であり、これらにはフロイント（完全 および不完全）、水酸化アルミニウムのような鉱物質ゲル、リゾレシチンのよう な表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン類、ペプチド、油エマ ルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびＢ ＣＧ　（カルメットーゲラン杆菌）やコリネバクテリウム・バルバムのような有 用なヒトアジュバントを含むが、これに限られない。 トポリズミックタンパク質の配列に向けられたモノクローナル抗体の調製の目的 で、連続細胞系による抗体分子の生産をもたらす技術が、使用可能である。例と しては、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（コズポーら、　１９ ８３　ｒ現代免疫学Ｊ　４゜７２）、およびヒトモノクローナル抗体を生産する ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（コールら、　１９８５　ｒモノクローナル抗体お よび癌治療」アランＲ，リス社、　ＰＰ７７−９６）、およびコーラ−とミルス タインにより初めて開発されたハイブリドーマ技術（１９７５ｒネイチアＪ２５ ６、４９５−４９７）があげられる。 分子のイディオタイプを含む抗体断片は、既知の技術によって生成される。例え ば、これら断片は、抗体分子のペプシン消化によって生産できる（ａｂ’）２断 片、Ｆ（ａｂ’　）２断片のジスルフィド橋を還元することによって生成できる Ｆａｂ’断片、およびパパインと還元剤とで抗体分子を処理することによって生 成できるＦａｂ断片を含むが、これらに限るものではない。 抗体の生産においては、所望の抗体のスクリーニングが、例えばＥＬＩＳＡ　（ 酵素結合イムノソルベント分析）のような公知の技術によって、なしとげられる 。例えば、トポリズミックタンパク質の接着性ドメインを認識する抗体を選ぶた めには、このドメインを含むタンパク質断片に結合する生産物について生成され たハイブリドーマを、分析してもよい。ヒトＮ０ｔＣｈに特異な抗体の選択には 、ヒトＮｏｔｃｈに対するポジティブ結合およびショウジヨウバエのＮｏｔｃｈ への結合の不在に基づいて選ぶことができる。 上述の抗体は、本発明のタンパク質配列の局在化および活性に関する、公知の方 法に用いることができる。例えば、種々の公知の免疫分析法が使用できる。はん の数例をあげると、ラジオイノムアッセイ、ＥＬＩＳＡ　（酵素結合イムノソル ベント分析）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応 、免疫拡散分析、凝集分析、蛍光イムノアッセイ、プロティンＡイムノアッセイ 、および免疫電気泳動分析があるが、これらに限られない。 ５．６．　Ｎｏｔｃｈ発現細胞への薬剤の運搬本発明はまた、Ｎｏｔｃｈ発現細 胞への作用薬剤の運搬の方法を提供する。以下の第８節に述べるように、Ｎｏｔ ｃｈ発現細胞の表面上のＮｏｔｃｈタンパクへ結合すると、Ｄｅｌｔａたんばく 質はＮｏｔｃｈ発現細胞に取り込まれるように見える。かくして本発明は、Ｄｅ ｌｔａタンパク質またはＮｏｔｃｈに結合することができるその接着性断片また は誘導体に薬剤を結合させ、そしてＮｏｔｃｈ発現細胞をこの結合体に露出し、 かくしてこの結合体を細胞に取り込ませることによって、Ｎｏｔｃｈ発現細胞へ の薬剤の運搬を可能にする。この結合された薬剤は、標識または生理活性物質で あってもよいが、これに限られない。生理活性物質は、治療剤、トキシン、化学 療法剤、成長因子、酵素、ホルモン、薬剤、核酸（例えば、アンチセンスＤＮＡ またはＲＮＡ）などであってよい。一つの態様においては、Ｘ線像影用の金属コ ントラスト剤、磁気共鳴イメージング剤、およびラジオイメージング用の放射性 核種（例えば、アイソトープ）を含むが、それらに限らないイメージング剤であ ってよい。好ましい側面では、この剤は、Ｄｅｌｔａ分子のアミノ末端の半分の 部位に結合される。 Ｄｅｌｔａと薬剤の結合体は、Ｎｏｔｃｈ発現細胞を、Ｄｅｌｔａと薬剤との結 合体を発現している細胞に露出するか、またはＮｏｔｃｈ発現細胞を溶液、懸濁 液、または他のキャリアー中でＤｅｌｔａと薬剤の結合体に露出することによっ て、Ｎｏｔｃｈ発現細胞に受け渡すことができる。この受け渡しが生物体中でな される場合は、Ｄｅｌｔａと薬剤の結合体は、製薬上許容される担体または賦形 剤の中に配合して薬剤組成物とすることができる。製薬的に許容される担体は、 塩水、リン酸緩衝溶液などを含有できる。ｏｅｔｔａと薬剤の結合体は、液体、 錠剤、火剤、粉末、徐放性形態、リポソームなどとして調合することができ、経 口、静脈注射、筋肉注射、皮下注射、腹膣内注射などにより、投薬される。これ らはほんの少数例にすぎない。好まし選択は、当業者の知識にもとづいて、容易 になされる。 ６、　ショウジヨウバエ中の２つのＥＧＦ−相同遺伝子である神経遺伝子座Ｎｏ ｔｃｈおよびＤｅｌ　ｔａのタンパク質産物間の分子相互すべく、我々はショウ ジヨウバエ・シュナイダーの２（Ｓ２）細胞（フェホンら、　１９９０．　ｒ細 胞Ｊ　６１．５２３−５３４）における凝集に対するそれらの発現の効果を研究 した。我々はここに、ＮｏｔｃｈとＤｅＩｔａの間の分子間相互作用の直接の証 拠を提示し、この相互作用の構成単位を切開する場合に用いられる分析系を説明 する。我々は、Ｎｏｔｃｈを発現する普通は接着性を示さないショウジヨウバエ Ｓ２の培養細胞が、Ｄｅｌｔａを発現する細胞に特異的に結合すること、および この凝集がカルシウムに依存することを示す。さらに、Ｎｏｔｃｈを発現する細 胞は相互に結合せず、Ｄｅｌｔａを発現する細胞は相互に結合するが、この事は ＮｏｔｃｈとＤｅｌｔａとが細胞の表面でＤｅｌｔａとの結合について競合する ことができることを示唆する。 さらに我々はＮｏｔｃｈとＤｅｌｔａとが培養細胞および胚細胞の双方で、洗剤 に可溶な複合体を形、伐することを示す証拠を示すが、この事はＮｏｔｃｈおよ びＤｅｌｔａが、試験管内および生体内で分子レベルで、直接に相互作用するこ とを暗示する。我々の分析結果は、Ｎｏ　ｔ　ｃｈとＤｅｌｔａのタンパク質が 、それらの細胞外ドメインを介して、細胞表面で相互作用することを示唆する。 の５′端からの６ｋｂのＨｐａ　Ｉ断片（ラモスら、　１９８９．　ｒゼネティ ックスＪ　１２３．３３７−３４８）を、メタロチオネインプロモーターベクタ ーｐＲｍＨａ−３（パンチら、１９８８．　ｒＮｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ ｌ　１６．　１０４３−１０６１）をＥｃｏＲｌて切断した後の該ベクターに平 滑末端で連続し１、その末端をＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウ断片で修復した （マニアチスら、　＋９８２．　ｒ分子クローニング」：研究所教本（コールド スプリングハーバ−、ニューヨーク、コールドスプリングラボラトリ−））。方 向が正しくなかった単一の形質転換体が単離された。 この形質転換体からのＤＮＡは次いで、５ａｃｌで消化され、ｐＲｍＨａ−３か らのポリリンカーに融合された■１帥コード配列の５°端を含む３ｋｂの断片が 単離された。この断片は正しい方向でｐＲｍＨａ−３の５ａｃｌ部位に連結され た。この構築物からのＤＮＡはＫｐｎ　ｌおよびｘｂニレ−ジョンシグナルのす べてを除去し、す±帥コード配列の残部およびポリアゾニレ・−ジョンに必要な ３゛配列を含むＭｇ１ｌａからの１ｌｋｂのＫｐｎｌ−Ｘｂａ！断片に連結され た。その結果得られた構築物をｐＭｔＮＭｇと名付け、ｐＲｍＨａ−３内のメタ ロチオネインプロモーターは、翻訳開始部位の２０ヌクレオチド上流で開始する Ｎｏｔｃｈ配列に融合される。 細胞外Ｎｏｔｃｈ構築物（ＥＣＮＩ）を得るために、体内での正常Ｎｏｔｃｈ機 能に必要なＮｏｔｃｈゲノム配列すべてを含むＣｏ５Ｐ４７９ＢＥ　Ｎ。 揃コスミド（ラモスら、　１９８９．　ｒ遺伝子学Ｊ　１２３．３３７−３４８ ）をＡａｔｌｌで部分的に消化した。断片の末端はＴ４　ＤＮＡポリメラーゼの エキソヌクリアーゼ活性を用いて平滑化しくマニアチスら。 １９８２、ｒ分子クローニング」；研究所教書（コールドスプリングハーバ−、 ニューヨーク：コールドスブリングハー”　＠　突所）　）、断片は次いで５ｔ ｕｌで完全に再消化した。得られた断片は、低融点アガロースゲル（Ｓｅａｐｌ ａｑｕｅ、　ＦＭＣバイオプロダクト）内で分離され、最大の断片が切り取られ た。この断片は次いで、鈍端側でそれ自体に平滑末端で連結された。結果として 、アミノ酸１７９０がら２６２５までのり１帥コード配列の内部欠失（ロートン ら、　１９８５゜［細胞４４３．５６７−５８１）と、新規な５９個のアミノ酸 カルボキシ末端を生産する予想されたフレームシフトとがもたらされた。　（こ の構築物の連結された接合点は、配列決定によるチェックが、まだなされてない 。） 贈上鴫発現構築物を得るために、Ｄｅｌｔａの完全なコード能を含むＤｌｌ　ｃ ＤＮＡ　（コブチンスキーら、　１９８８．　ｒ遺伝子開発」２，１７２３１７ ３５）が、ｐＲｍＨａ−３のＥｃｏＲ１部位に挿入された。この構築物はｐＭＴ Ｄｌｌと名つけられた。 ６、１．２．　抗体の調製 ハイブリドーマ細胞系Ｃ１７，９Ｃ６を、Ｎｏ　ｔ　ｃｈの細胞内ドメインの大 部分（７）Ｄ−ド配列（アミノ酸１７９１−２５０４　；　’７−トンら、１９ ８５゜「細胞Ｊ　４３．５６７−５８１）を八む２．ｔｋｂの５ａｌｌ−旧ｎｄ ｌｌｌ断片にもとづく融合タンパク質で免疫されたマウスから得た。この断片は 、ｐＵＲ２８９（ルーサおよびムラ−・ヒル、　１９８３．　ｒＥＭＢＯＪＪ　 ２．１７！：１ｌ−１７９４）にサブクローンされ、次いでＢｇｌ　ＩＩ　−Ｈ ｉｎｄｌｌ！断片として、ｐＡＴＨ１発現ベクター（デイクマンおよびツアゴロ フ、　１９８５．　ｒＪ。 Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６０．１５１３−１５２０）に移入された。可溶性 融合タンパク質が発現され、２５％（ＮＨ，）、ＳＯ，で沈澱され、６Ｍ尿素に 再懸濁され、Ｒｏｔｏｆｏｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）　（詳細については、Ｆｅｈｏ ｎ、　１９８９．　ｒＲ。 ｔｏｆｏｒ　Ｒｅｖｉｅｗ　Ｎｏ、７．　ｒプレチンＪ　１５］、８．　リソチ モンド、カリフォルニア　Ｂｉｏ−Ｒａｄ研究所）を使用した分離用等電点電気 泳動によって精製された。 マウスポリクローナル抗血清が、適切なｐＧＥＸ発現ベクター（スミスおよびジ ョンソン、　１９８８．　ｒ細胞Ｊ　６７、３ｌ−４０）に単独で枠内挿入され た第５ＥＧＦ様繰返しから、膜貫通ドメインを横切って延びた、０．８　ｋｂ　 （アミノ酸２３７−５０１　：ロートンら、　１９８５．　ｒ細胞」４３、　５ ６７−５８１）、１．１ｋｂ（アミノ酸５０１−８６８）、０．９９ｋｂ　（ア ミノ酸８６８−１２００）、および１．．１　ｋｂ　（アミノ酸　１４６５−１ ９３５）の長さのＢｓｔＹ１断片４つを使用して、Ｎｏｔｃｈの細胞外ドメイン に対して生起された。融合タンパク質は、グルタチオン−アガロースビーズ（Ｓ ＩＧＭＡ）上で精製された。マウスとラットの抗血清は、５０％の（ＮＨ＋）２ ＳＯ１て再沈澱され、０．０２％　ＮａＮ３を含むＰ　Ｂ　Ｓ　（１５０ｍＭ　 ＮａＣｌ、　１４ｍＭ　ＮａＪＰＯ＋、６　ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯｔ）中に再懸濁 された。 ハイブリドーマ細胞系２０１は、ｐＵＲ２８８のＩａｃＺ遺伝子（ルーサおよび ムーラ・ヒル、　１９８３　ｒＥＭＢＯＪ、Ｊ　２．１７９１−’１７９４）内 のＣｌａｌ部位にサブクローニングされたＤｅｌｔａ　（コブチンスキーら、　 １９８Ｂ。 「遺伝子開発Ｊ　２．　＋７２３−１７３５）の細胞外ドメインがらのコード配 列を含む０．５４ｋｂ　Ｃｌａｌ断片を土台とした融合タンパク質で免疫された マウスから得られた。この断片は、Ｄｅｌｔａ内の第４ないし第９０ＥＧＦ一様 繰返しに亘る配列（アミノ酸３５０−５２９）を含む。 融合タンパク質は、封入体の単離（ギルマーら、　１９８２．　ｒＰｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７９．２１５２−２１５６）によ って調製された。封入体は、免疫に使用する前に尿素中で可溶化された（キャロ ールおよびローホン、　１９８７．　ｒＤＮＡクローニング」第■巻、Ｄ、Ｍ、 グローバ（オックスフォード：ＩＲＬブレス）　、ＰＰ、８９−１１１）。 ラットポリクローナル抗血清は、同じ融合タンパク質構築物がら誘導された抗原 で免疫されることにより得られた。この場合、融合タンパク質は、ＳＤＳ−Ｌａ ｅｍｍｌ　ｉバッファー（キャロールおよびローン、　＋９８７．　ｒＤＮＡク ローニング」第■巻、　Ｄ、Ｍ、グローバ（オックスフォード：ＩＲＬブレス） 　ＰＰ、８９−１１１）中でのＩ　ＰＴＧ−誘導細胞の溶解、５ＤＳ−ＰＡＧＥ によるタンパク質の分離、ゲルからの適切なバンドの切り出し、および免疫に用 いるためにゲルスライスからの抗原の電気溶出（バーローおよびレイン、　１９ ８８、「抗体」研究所教本（コールドスプリングハーバ−、ニューヨーク：コー ルドスプリングハーバ研究所））によって調製した。 （来貢以下余白） ６、１．３．　細胞培養およびトランスフェクションＳ２細胞系統（Ｓｃｈｎｅ ｉｄｅｒ、　１９７２．　Ｊ、　Ｅｍｂｒｙｏｌ、　Ｅｘｐ、　Ｍｏｒｐｈ、　 ２７゜３５３−３６５　）を、２．５ｍｇ／ｍｌ　Ｂａｃｔｏ−ペプトン（Ｄｉ ｒｃｏ）、　１ｍｇ／ｍｌ　ＴＣＹｅａｓｔｏｌａｔｅ　（Ｄｉｒｃｏ）、１１ ％熱不活性化ウシつ児血清（ＥＣ３）　（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、および１００　Ｕ ／ｍｌペニシリン−１ｏｏｕｇ／ｍｌストレプトマイシン−０，２５ｕ　ｇ／ｍ ｌフンジゾン（Ｈａｚｌｅｔｏｎ）を添加したＭ３培地（ＨａｚｌｅｔｏｎＣｏ 、　、製）中で生育させた。−２Ｘ　１０’個／ｍｌで対数期生育中の細胞をＨ ＥＰＥＳ緩衝液（ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ、　１９８７．　Ｍｏ１．　Ｃ ｅ１１．　Ｂｉｏｌ。 ７、２７４５−２７５２）の代わりにＢＢＳ緩衝液（ＳＩＧＭＡ）を用いたほか は前記したとおり　（Ｗｉｇｌｅｒ等、、　１９７９．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７８．１３７３−１３７６）、培養液５ｍ ｌ当たり１ｍｌ中、ＤＮＡリン酸カルシウム共沈殿２０μｇでトランスフェクシ ョンした。１６〜１８時間後、細胞を円錐遠沈管に写し、臨床用遠心分離器で、 最大速度で３０秒間沈殿させ、新鮮な完全培地１／４容で一回洗浄し、初期容量 の完全培地中に再懸濁し、そして元のフラスコに戻した。次にトランスフェクシ ョンされた細胞を誘導前２４時間に回復させた。 ６、１．４凝集検定 ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａメタロチオネイン構築物の発現は、０．７ｍＭとな るまで硫酸銅を添加することにより誘導した。ＥＣＮＩ構築物でトランスフェク ションした細胞も同様に処理した。２種類の凝集検定を用いた。第１の検定では 、合計３ｎ＋１の細胞（５−１０ｘ　１ｏ’個／ｍｌ）を２５ｍ１容の三角フラ スコに入れ、室温で２４〜４８時間回転振とう器上で４０〜５０ｒｐｍで振とう した。これらの実験では、細胞は誘導開始後１〜４時間に混合し、誘導は凝集期 間を通じて継続した。 第２の検定では、細胞約０．６ｍｌを、室温で一夜（１２〜１６時間）誘導後０ ．６　ｍｌ容のエッペンドルフ試験管に入れ（微小気泡は残す）、そして４℃で １〜２時間穏やかに浸とうした。抗体抑制およびＣａ２＋依存性試験は、後者の 検定を用いて実施した。Ｃａ”依存性試験では、細胞をまず採取し、１１％　Ｅ Ｃ３添加平衡塩類溶液（ＢＳＳ）　（ＢＳＳ−Ｆｃｓ；　ＥＣ３は０，９％　Ｎ ａＣｌ、　５ｍＭトリス（ｐＨ７，５）で透析）中、または、１０ｍＭ　ＥＧＴ Ａ含有Ｃａ２＋非含有Ｂ５５−ＥＣ３（Ｓｎｏｗ等、、　１９８９．　Ｃｅ１１ ５９゜３１３−３２３）中で洗浄し、次に、初期容量の同じ培地中に再件だした 。抗体抑制実験では、Ｎｏｔｃｈ　トランスフェクション細胞を採取し、Ｍ３培 地で洗浄し、次に、凝集前にＮｏｔｃｈの細胞外ドメイン由来の断片を有する融 合蛋白で免疫化したマウス４匹の各々から得た免疫血清または前免疫血清の１　 ：　２５０希釈液で４℃で１時間Ｍ３培地中で処理したく前述の抗体調製参照） 。 ６、１．５．　免疫蛍光分析 細胞を遠心分離（エッペンドルフマイクロ遠心分離器中２０秒間３０００ｒｐｍ ）により採取し、室温で１０分間、新たに調製したＰＢＳ中２Ｘパラホルムアル デヒド０．５ｍｌで０．６ｍｌ容のエツペンドルフ試験管中、固定化した。固定 化後、細胞を遠心分離により採取し、ＰＳＢテ２回洗浄し、０．１％サポ＝　： ／　（Ｓ　ＩＧＭＡ）および１ｘ正常ヤギ血清（Ｐｏｃｏｎｏ　Ｒａｂｂｉｔ　 Ｆａｒｍ、　Ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、　ＰＡ）を添加したＰＢＳ中の一次抗体中 で１時間染色した。モノクローナル抗体上澄みを１：１０希釈し、マウスまたは ラットの血清をこの段階では１：１０００倍希釈した。次に細胞をＰＢＳ中で一 回洗浄し、ＰＢＳ−サポニン−正常ヤギ血清中の特異的二次抗体（二重標識等級 ヤギ抗マウスおよびヤギ抗ラット、Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒ ｃｈ）中で１時間染色した。このインキュベーションの後、細胞を２回ＰＢＳ中 で洗浄し、９０％グリセロール、１０％ＩＭトリス（ｐ１４８．０）、および０ ．５％ｎ−プロピルガレート中でスライドに搭載した。細胞はＬｅｉｔｚ　０ｒ ｔｈｏｐｌａｎ　２顕微鏡上で、表面蛍光下で観察した。 共通焦点の顕微鏡写真を、Ｚｅｉｓｓ　Ａｘｉｏｖｅｒｔ複合顕微鏡に連結した Ｂｉｏ−Ｒａｄ　ＭＲＣ５００システムを用いて撮影した。像はＢＩ３およびＧ ＨＳフィルターセットを用いて集め、ＡＬＩＧＮプログラムを用いて整列させ、 ＭＥＲＧＥを用いてマージさせた。グリーンからレッドのチャンネルへの蛍光の ブリードスルーは、ＢＬＥＥＤプログラムを用いて低減させた（全ソフトウェア は旧ｏ−Ｒａｄ製）。写真はＫｏｄａｋ［！ｋｔａｒ　１２６フイルムを用いて コンピューターモニターから直接得た。 ６、１．６細胞分解物、免疫沈降およびウェスタンプロット組織培養および野生 型Ｃａｎｔｏｎ−３胚の非変性洗剤分解物は、１ｍＭフェニルメチルスルホニル フロリド（ＰＭＳＦ）およびジイソプロピルフルオロホスフェ−）　２５００倍 希釈物をプロテアーゼ阻害剤として用いながら、約１０細胞容量の分解緩衝液（ ３００ｍＭ　ＮａＣｌ、　５０ｍＭトリス［ｐＨ８，０］、　０．５Ｘ　ＮＰ− ４０，０，５％デオキシコレート、ＩＯＩＭ　ＣａＣ１ｚ　、１ｍＭ　ＭｇＣ１ ｚ）中で、水上で調製した。分解物は、順次、ｌｃｃツベルクリンシリンジに連 結した１８Ｇ　、２１Ｇおよび２５Ｇの針を用いてトリチュレートし、次に４℃ で１０分間ミクロ遠心分離器中で最高速度で遠心分離して不溶性物質を除去した 。免疫沈降を行うために、細胞分解物２５０〜５００μｍに抗体的１μｇ（ポリ クローナル抗血清１−２μｇ）を添加し、攪拌しながら４℃で１時間インキュベ ートした。この混合物にヤギ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎ。 ｒｅｓｅａｒｃｈ；　これらの抗体はマウスおよびラットのＩｇＧの両方を認識 する）　１５μｇを添加し、攪拌しながら４℃で１時間インキユベートシた。次 に、予め採取し、分解緩衝液で５回洗浄し、更に１時間インキュベートしておい た固定スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈ　Ａ）菌（Ｚｙｓｏｒｂｉ ｎ、　Ｚｙｍｅｄ；　製造者の指示に従って再懸濁）１００μｌを添加した。次 に、５ｔａｐｈ　Ａ−抗体複合体を遠心分離により沈殿させ、分解緩衝液で３回 洗浄し、その後、分解緩衝液でそれぞれ１５分間２回洗浄した。新しい試験管に 移した後、沈殿した物質を５ＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液５０μｌ中に懸濁し、即 座に１０分間煮沸し、３Ｎ−１５％の勾配ゲル上を泳動させ、ニトロセルロース 上にプロットし、モノクローナル抗体およびＨＲＰ−結合ヤギ抗マウス二次抗体 を用いて前述したように（Ｊｏｈａｎｓｅｎ等、、　１９８９．　Ｊ、　Ｃｅ１ １　Ｂｉｏｌ、　１０９．２４２７−２４４０）検出した。ウェスタンプロット に使用する全細胞蛋白試料（図２）を得るため、細胞は遠心分離により収集し、 １ｍＭ　ＰＭＳＦ含有試料緩衝液１０細胞容量中で分解し、即座に煮沸した。 ＮｏｔｃｈとＤｅｌｔａの間の相互作用を検知するために、凝集検定を用いてそ の表面上にこれらの蛋白を発現する細胞の挙動を調べた。 いくつかの理由からこれらの試験のためにはＳ２細胞系統（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ 、　１９７２．　Ｊ、Ｅｍｂｒｙｏｌ、　Ｅｘｐ、　Ｍｏｒｐｈ、　２７．３５ ３−３６５）を選択した。 先ず、これらの細胞は比較的非付着性であり、懸濁液中で生育し、そして、ファ スシクリンＩ１１作用を調べるための同様の検定において過去に用いられている （Ｓｎｏｗ等、、　１９８９．　Ｃｅ１ｌ　５９．３１３−３２３）。 第２に、これらは容易にトランスフェクションでき、そして、Ｄｒｏｓｏｐｈｉ ｌａ培養細胞中の外来性遺伝子の発現のために設計されている誘導可能なメタロ チオネインプロモータベクターが人手できる（Ｂｕｎｃｈ等、、　１９８８．　 Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１６．１０４３−１０６１）。第３に、Ｓ２細 胞はＮｏｔｃｈコード配列の５゛末端の再配列のために、異常Ｎｏｔｅｈメツセ ージを発現し、検知可能なＮｏｔｃｈは発現しない（下記参照）。これらの細胞 はまた、検知可能なりｅｌｔａも発現しない（下記参照）。 使用した構築物の模式図を図１に示す（詳細はセクション６．１の実験方法参照 ）。培養細胞中でＮｏｔｃｈを発現するために、Ｒａｍｏｓ等（１９８９，Ｇｅ ｎｅｔｉｃｓ　１２３．３３７−３４８）の記載したＮｏｔｃｈミニ遺伝子ＭＧ ＩＩａをメタロチオネインプロモータベクターｐＲｍｔ（ａ−３（Ｂｕｎｃｈ等 、、　１９８８．　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１６．１０４３−１０６ １）に挿入した。Ｄｅｌｔａ発現構築物は、主要な胚Ｄｅｌｔａ転写物由来のＤ ｅｌｔａのための全コード配列を有するＤｌｌ　ｃＤＮＡ（５，４Ｚ；　Ｋｏｐ ｃｚｙｎｓｋｉ等、、　１９８８．　ＧｅｎｅｓＤｅｖ、２．１７２３−１７３ ５）を同じベクターに挿入することにより作成した。第３の構築物は、「細胞外 Ｎｏｔｃｈ　ｌ　ＪのためのＥＣＮＩと称し、これは５’Ｎｏｔｃｈプロモータ ー領域および３’Ｎｏｔｃｈポリアデニル化シグナルを含んでおり、また、ゲノ ム配列由来のＮｏｔｃｈ遺伝子の細胞外および膜間の領域のためのコード容量を 有しているが、約１０００アミノ酸の細胞内ドメインの８３５アミノ酸に対応す るコード配列は有していない。更に、予測されるフレームシフトのため、残りの ７８のＣ末端アミノ酸残基は新しい５９のアミノ酸Ｃ末端尾部により置き換えら れている（実験方法参照）。 本明細書に記載した実験の全てについて、発現構築物は、Ｓ２細胞にトランスフ ェクションし、安定な形質転換体中ではなくむしろ一過性の発現を行った。発現 細胞は典型的には、免疫蛍光染色で判断した場合、総細胞数の１〜５％を占める （データ示さず）。 トランスフェクション後に発現した蛋白のウェスタンプロットを図２に示す。非 トランスフェクション細胞は検知可能なレベルでＮｏｔｃｈやＤｅｌｔａを発現 しなかった。しかしながら、トランスフェクション後は、予測された見かけの分 子量の蛋白はそれぞれ、これらの蛋白の各々に特異的なモノクローナル抗体を用 いて容易に検知できる。Ｎｏｔｃｈの場合、トランスフェクション細胞中、約３ ００ｋｄの全長の産物より下に複数のバンドが認められた。これらのバンドが試 料調製中のＮｏｔｃｈの分解を示すものか、または、細胞内に存在するＮｏｔｃ ｈの合成またはプロセシングの中間体であるか不明であるが、トランスフェクシ ョン細胞および胚から得た試料中−貫してこれらを検出している。更に、これら の蛋白の細胞表面発現を試験するために、各蛋白の細胞外ドメインに特異的な抗 体を用いて生存トランスフェクション細胞の免疫蛍光染色を行った。 各々の場合において、表面抗原で予測されるとおりの表面染色結果を観察した。 即ち、これらの結果は、明らかに、ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａの構築物は予測 される大きさの蛋白の発現および細胞上局在化（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｉｏ ｃａｌｉｇａｔｉｏｎ）を支持することを示している。 ６．２．２．　ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａの凝集物を発現する細胞Ｎｏｔｃｈ とＤｅｌ　ｔａが相互作用するという予測を調べるために、我々は、簡単な凝集 検定を考案してＳ２細胞表面上に発現した蛋白の間のこれらの相互作用を検出し た。Ｎｏ　ｔ　ｃｈとＤｅｌ　ｔａが細胞表面上で安定なヘテロタイプの複合体 を形成することができる場合、これらの蛋白を発現する細胞は相互に結合し、適 切な条件下で凝集物を形成すると考えた。同様の検定系が最近、ファスシクリン １１１蛋白についても報告されている（Ｓｎｏｗ等、、　＋９８９．　Ｃｅ１ｌ 　５９．３１３−３２３）。 対数期生育中の３２細胞を個別に、ＮｏｔｃｈまたはＤｅｌｔａメタロチオネイ ンプロモーター構築物の何れかでトランスフェクションした。硫酸銅で誘導した 後、トランスフェクション細胞を同数混合し、室温で一夜凝集させた（詳細はセ クション６．１の実験方法参照）。また、代謝活性の低下を意図した一部の実験 では、細胞を１〜２時間４°Ｃで穏やかに混合した。凝集物が形成されたかどう かを判断するために、各遺伝子産物に特異的な抗体および異なるように標識され た蛍光二次抗体を用いて免疫蛍光顕微鏡用に処理した。前述したとおり、安定で はなく一過性の形質転換体を使用したため、発現細胞は通常は総細胞数の５％未 満に相当した。残りの細胞は所定の蛋白を発現しないか、または発現しても極め て低レベルであるため、免疫蛍光顕微鏡では検知できなかった。対照実験として 、単一の種類のトランスフェクション細胞のみを用いて凝集を行った。 図３は凝集実験で得た顕微鏡写真の代表的なものを示しており、表Ｉは結果を数 値で示したものである。図３０および表■から明らかな通り、Ｎｏｔｃｈ発現（ Ｎｏｔｃｈ”　）細胞単独では、我々の検定では凝集物が形成されず、Ｄｅｌｔ ａ発現（Ｄｅｌｔａ’　）細胞は凝集体を形成した。 （来貢以下余白） Ｄｅｌｔａ　”細胞が凝集する傾向は、非凝集対照試料においても明らかであり （表■）、この対照試料では、有糸分裂肺細胞間の付着により恐らくは生じる４ 〜８個の細胞の細胞集塊が共通して生じた。しかしながら、集塊は凝集条件下で のインキュベート後でより共通して観察され（例えば、インキュベート前の凝集 物中のＤｅｌｔａ”細胞１９％はｖｓインキュベート後の凝集物のＤｅｌｔａ＋ 細胞３７％−表Ｉの実験ｌ）、Ｄｅｌ　ｔａ＋細胞は本検定において安定した相 互接触が可能であることを示している。非染色細胞は我々の一過性トランスフェ クションでは細胞の９０％を超える部分を占めていたが、これらを凝集物中には みとめなかったことは注目に値する。 稀に、非染色細胞は凝集物の端縁に認められた。凝集物の端縁では弱く染色され た細胞が主に生じるため、これらの見かけ上は非発現の細胞は、トランスフェク ションされたが、発現したＤｅｌｔａのレベルは免疫蛍光で検知するには不十分 であったと考えられる。 Ｎ０ｔＣｈ＋細胞のみを用いた対照実験とは明らかに対照的に、Ｎｏｔｃｈ＋お よびＤｅｌｔａ＋細胞の混合物の凝集物は２０まであるいはそれ以上もの細胞の 集塊を形成した（図３Ｄ−３８，表１）。表１が示すとおり、凝集２４時間後に ４個以上の染色細胞の集塊中に認められた発現細胞の画分は、Ｎｏｔｃｈ＋およ びＤｅｌｔａ＋細胞の混合物中３２〜５４％の範囲であった。この範囲はＤｅｌ ｔａ＋細胞のみてみとめられたもの（３７〜４０％）と同様であったが、Ｎｏｔ ｃｈ＋細胞のみでみとめられたもの（僅か０〜５％）とは非常に異なっていた。 Ｄｅｌｔａ＋細胞のみよりなる集塊も数個みとめられたが、Ｎｏｔｃｈ＋細胞は 、Ｄｅｌｔａ”細胞も存在する場合でなければ、４〜５個の細胞より多い集塊中 にはみとめられなかった。ここでも、これらの集塊に含まれる全ての細胞は、ト ランスフェクション細胞が総細胞の僅かの部分しか占めなかったにもかかわらず 、Ｎｏ　ｔ　ｃｈまたはＤｅｌ　ｔａの何れかを発現した。４８時間（表１、実 験５及び６）では、凝集度はより高くなり（６３〜７１％）、これらの条件下で は２４時間後には凝集がまだ最大に達していないことを示唆している。また、Ｎ ｏｔｃｈ構築物およびＤｅｌｔａ構築物に同時トランスフェクションさせた細胞 （これにより全てのトランスフェクション細胞が両方の蛋白を発現）は、同じ実 験条件下で同様の挙動で凝集した。 これらの結果は、これらの実験で観察された凝集は、ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔ ａの発現を必要としており、非トランスフェクションＳ２細胞中の別の相互作用 蛋白の偶然の発現によるものではないことを示している。更に、非トランスフェ クションＳ２細胞でＮｏｔｃｈ４細胞およびＤｅｌｔａ＋細胞を１０倍希釈し、 これらを室温で２４時間凝集させることにより、この相互作用の特異性を試験し た。この実験において、発現細胞は、それらは全細胞数の０．１％未満であった ものの、その発現細胞の３９％が他の発現細胞とともに凝集物中にみとめられた 。しかしながら、これらの凝集物は標準凝集実験てみられるものよりも平均して 小型であった。更に、Ｎｏｔｃｈ＋細胞は、それらが細胞表面上の単一の種類の 蛋白を過剰発現するためＤｅｌｔａ＋凝集物に非特異的に取り込まれるという可 能性を制御するために、Ｄｅｌｔａ＋細胞をメタロチオネインプロモーターの制 御下にニューログリアン、即ち膜間細胞表面蛋白（Ｂｉｅｂｅｒ等、、１９８９ 、　Ｃｅ１ｌ　５９．４４７−４６０）を発現する細胞を混合した（このメタロ チオネイン−ニューログリカン構築物はＢｉｅｂｅｒおよびＣ，Ｇｏｏｄｍａｎ から提供された）。ニューログリカン“細胞がＤｅｌｔａ＋凝集物に付着する傾 向はみとめられず、Ｎｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ凝集物は単に細胞表面上の高レベル の蛋白発現の結果ではないことが示された。 さらにまた、凝集に対する、Ｎｏｔｃｈのほぼ全ての細胞外ドメインに広がって いる融合蛋白に対するポリクローナル抗血清の混合物の作用を調べることにより 凝集過程におけるＮｏｔｃｈの関与を直接調へた（セクション６．１の実験方法 玉章）。表面抗原のツク・ンチングへの代謝応答により生じる混乱要因を最小限 にするために、抗体処理および凝集検定はこの実験中は４℃で行った。Ｎｏｔｃ ｈ”細胞は１時間前免疫または免疫マウス血清の何れかとともにインキュベート し、Ｄｅｌｔａ＋細胞を添加し、そして凝集は１〜２時間行った。前免疫血清で 前処理されたＮｏｔｃｈ＋細胞はＤｅｌｔａ＋細胞と凝集した（３実験のうちの １つでは、Ｎｏｔｃｈ＋細胞の２３％がＮｏｔｃｈ”−Ｄｅｌｔａ＋細胞凝集物 中にみとめられた）が、免疫血清で処理されたものは凝集しなかった（　Ｎｏｔ ｃｈ　’細胞の僅か２％のみが凝集物中に有った）。凝集の低下が抗血清へのＮ ０ｔＣｈ＋細胞の暴露から生じる抑制的な立体的作用または膜構造作用によるも のであるという可能性を排除することはできないが、上記した結果は、Ｎｏｔｃ ｈの細胞外ドメインがＮｏｔｃｈ”　−Ｄｅｌｔａ＋細胞凝集に必要とされるこ とを示唆している。 その他の３つの重要な観察結果が図３に示されている。先ず、Ｄｅｌｔａは細胞 表面のみにほぼ常時認められた（図３および３Ｃ）が、Ｎｏｔｃｈ染色は細胞表 面を細胞内の両方に常時認められ、嚢胞構造を伴うことが多かった（図３Ａ）。 第２に、−夜インキユベートした混合凝集物中では、Ｄｅｌｔａ”およびＮｏｔ ｃｈ＋細胞の間に形態学的な差が一貫してみとめられた。Ｄｅｌｔａ＋細胞はし ばしばＮｏｔｃｈ＋細胞に隣接して完全に包囲するような伸びを示したが、Ｎｏ ｔｃｈ＋細胞はほぼ常時丸い外観を有し、細胞質の伸びは認められなかった（図 ３Ｇ）　。第３に、ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａはしばしばＮｏｔｃｈ＋細胞お よびＤｅｌｔａ＋細胞の間の接触領域内に集合するように観察され、免疫蛍光染 色の明確なバンドを形成していた（図３Ｏ−３Ｆ）。これらのバンドは共焦顕微 鏡上で見られる光学区画中で容易に観察でき（図３Ｈ）、これらは単にマウント 全体の混乱要因によるものではないことが示された。さらにまた、これらのバン ドは急速（細胞混合２時間以内）に、そして４°Ｃで形成され、その形成は恐ら くは細胞代謝とは無関係であることが示された。これらの観察結果は、細胞接触 領域内でＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａが相互に結合し、このため不動化されると 仮定すれば、予測されるものである。この発現様式はまた、細胞凝集を媒介する その他の蛋白で観察されるものと合致している（Ｔａｋｅｉｃｈｉ、　１９８８ ．　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１０２．６３９−６５５；５ｎｏｔｖ等、、　１ ９８９．　Ｃｅ１ｌ　５９．３１３−３２３）。 ６．２．３．　Ｎｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ媒介凝集はカルシウム依存性である以前 の試験により、特定のコンセンサス配列を有するＥＧＦ様繰返しはカルシウム（ Ｃｅ２ｌ結合ドメインとして作用することが示唆された（Ｍｏｒｉｔａ等、、　 １９８４．　Ｊ、口ｉｏ１．ｃｈｅｍ、２５９．５６９８−５７０４；　Ｓｕｇ 。 等、、　１９８４．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５９．５７０５−５７１０； 　Ｒｅｅｓ等、、　１９８８　ＥＭＢＯＪ、７．２０５３−２０６１；　ｔｌａ ｎｄｆｏｒｄ等、、　１９９０．　ＥＭＢＯＪ、９．４７５−４８０）　、これ らの蛋白のうち少なくとも２つについては、ＣおよびＣＩ、　Ｃａ”結合が、他 の蛋白との相互作用の必要要素であることが更に示されているｆ■１ｌｌｉｅｒ ｓ等、、　１９８０．　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　１１７．２８９−２９４；　Ｅ ｓｍｏｎ等、、１９８３．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５８．５５４８−５５ ５２；　Ｊｏｈｎｓｏｎ等１．　１９８３．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５８ ．５５５４−５５６０）。Ｎｏｔｃｈ内のＥＧＦ−相同繰返しの大部分およびＤ ｅｌｔａ内のこれらの殆どは、これらの蛋白がカル７ウムに実際に結合するかど うかはまだ決定されていないが、Ｃｅ２ｌ結合のための必要なコンセンサス配列 を含んでいる（Ｒｅｅｓ等、、　１９８８゜ＥＭＢＯＪ、２０５３−２０６１； 　５ｔｅｎｆｌｏ　等、、　１９８７．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ。 ＵＳＡ８４．３６８−３７２；　Ｋｏｐｃｚｙｎｓｋｉ　等、、　１９８８．　 Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ、　２．１７２３−１７３５；　Ｈａｎｄｆｏｒｄ　等、、 　１９９０．　ＥＭＢＯＪ、９．４７５−４８０）　。従って、発現細胞がＣａ ２“イオンの存在下または非存在下で凝集することができる能力を調べ、これに よりＮｏｔｃｈ−Ｄｅｌ　ｔａ凝集にＣａ２“イオンが必要であるかどうか決定 した。Ｃａ２４の除去への代謝応答により生じつる非特異的作用を最小限にする ために、これらの実験は４℃で行った。４℃でＣａ２＋含有培地中凝集条件下で インキュベートしたＮｏｔｃｈ＋細胞およびＤｅｌｔａ＋細胞の対照混合物は容 易に凝集物を形成した（平均３４％　±１３％、平均±ＳＤ、　ｎ＝３；　表Ｉ ＋）。対照的に、Ｃａ’“イオン欠乏ＥＧＴＡ含有培地中で混合した細胞は殆ど 凝集物を形成しなかった（５％±５％）。これらの結果は、Ｎｏｔｃｈ−Ｄｅｌ ｔａ−媒介凝集の外来性Ｃａ”″依存性を明らかに示し、ており、またＳ２細胞 中のＤｒｏｓｏｐｈｉ　ｌａファスンクリンＩｌｌ蛋白およびファスンクリンＩ 蛋白に関する最近の文献発表内容と対照的であり（Ｓｎｏｗ等、、　１９８９゜ Ｃｅ１ｌ　５９．３１３−３２３；　Ｅｌｋｉｎｓ等、、　１９９０．　Ｊ、Ｃ ｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、１１０．１８２５−１８３２）、これら文献では何れの蛋白 により媒介される凝集に対してもＣａ２′″イオン除去の影響は認められなかっ た。 （来貢以下余白） ６．２．４．　ＮｏｔｃｈとＤｅｌｔａは単一細胞内で相互作用するＮｏｔｃｈ とＤｅｌｔａが両方の蛋白を発現する１つの細胞の膜内で会合しているかとうか を、同時トランスフェクション細胞中のＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａの分布を調 べることにより検討した。図４Ａおよび４Ｂに示されるとおり、これらの２つの 蛋白は同時トランスフェクション細胞の表面で極めて似た分布を示す場合が多い 。観察される併存局在化（ｃｏｌｏｃａｌｉｚａ口ｏｎ）が偶然であるかまたは ＮｏｔｃｈとＤｅｌｔａの間の安定な相互作用を示しているかを調べるために、 過剰のポリクローナル抗Ｎｏｔｃｈ抗血清で生存細胞を処理した。免疫蛍光分析 で検知されたように、この処理により個々のパッチへの発現細胞表面上のＮｏｔ ｃｈの「パッチング」が起こった。この処理の後のこれらの細胞の表面上のＮｏ ｔｃｈおよびＤｅｌｔａの分布の間には明らかな相関があり　（図４０および４ Ｄ）、これらの蛋白が膜内で会合することを示していた。これらの実験は、この 会合か直接のものであるか、または細胞骨格のような別の成分により媒介されて いるかという問題に向けたものではないことに留意しなければならない。Ｄｅｌ ｔａは本実験で非特異的にパッチングされるという可能性を制御するために、Ｎ ｏｔｃｈおよび前述したニューログリアン構築物（Ａ、　ＢｉｅｂｅｒとＣ，Ｇ ｏｏｄｍａｎ、未発表データ）で細胞を同時トランスフェクションし、抗Ｎｏｔ ｃｈ抗血清とパッチングさせた。この場合、Ｎ０ｔｃｈとニューログリアンの間 には見かけの相関はなかった。 ６．２，５．　Ｄｅｌｔａとの相互作用はＮｏｔｃｈの細胞内ドメインを必要と しない ＥＧＦ様繰返しを含む大型の細胞外ドメインの外に、Ｎｏｔｃｈは約９４０アミ ノ酸の大型の細胞内（ＩＣ）　ドメインを有している。　ＩＣドメインはリン酸 化部位（Ｋｉｄｄ等、、１９８９．　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ、　３．　１１１３− １１２９）　、推測ヌクレオチド結合ドメイン、ポリグルタミン鎖（Ｗｈａｒｔ ｏｎ等、、１９８５．　Ｃｅ１ｌ　４３．５６７−５８１；　Ｋｉｄｄ等、、１ ９８６．　Ｍｏｌ。 Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　６．３０９４−３１０８）　、および酵母の細胞周期 制御に関与する酵母ｃｄｃｌｏ遺伝子と相同の配列を有する（Ｂｒｅｅｄｅｎと Ｎａｓｍｙｔｈ。 １９８７、　Ｎａｔｕｒｅ　３２９．６５１−６５４）。このドメインの大きさ および構造的複雑性を考えた場合、それがＮｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ相互作用に必 要であるか疑問である。従って、上記した全ての構造的特徴を含むＩＣドメイン の約８３５個のアミノ酸に対するコード配列を欠失させた変異体Ｎｏｔｃｈ構築 物を用いた（２５の膜隣接アミノ酸および新しい５９アミノ酸のＣ末端を残した ；詳細は実験方法および図１を参照）。 この構築物は、ＥＣＮＩと命名したが、これはメタロチオネインプロモーター構 築物で観察されるよりも低レベルでトランスフェクション細胞中の正常なＮｏｔ ｃｈプロモーターの制御下で、構造的に発現されるが、免疫蛍光分析で容易に検 知できる。 凝集検定において、ＥＣＮＩ構築物を発現する細胞は一貫してＤｅｌｔａ＋細胞 と凝集物を形成（３実験のうちの１つではＥＣＮ　１発現細胞の３１％が凝集物 中に有った；図３Ｉ参照）したが、それ等自身とは形成せず（凝集物中僅か４％ ）、これらは未損傷のＮｏ　ｔｃｈを発現した細胞で観察したとおりであった。 また、Ｄｅｌｔａ”細胞との接触領域内にＥＣＮ１染色の明確なバンドが観察さ れ、ここでも、細胞間の接触領域内のＥＣＮＩの局在化が示された。 膜内ての相互作用を調べるために、ＥＣＮＩおよびＤｅｌｔａ構築物で同時トラ ンスフェクトした細胞を用いて表面抗原同時パソチング実験を繰返しした。未損 傷のＮｏｔｃｈで観察したとおり、ＥＣＮ１をＮｏｔｃｈの細胞外ドメインに対 するポリクローナル抗血清を用いてパッチングする場合、ＥＣＮＩおよびＤｅｌ ｔａは細胞表面に併存局在化することが解った（図４Ｅおよび４Ｆ）。これらの 結果は、膜内におけるＮｏｔｃｈとＤｅｌｔａの間の観察された相互作用はＮｏ ｔｃｈのＩＣドメインの欠失部分を必要とせず、従って、恐らくは細胞外ドメイ ンにより媒介されることを示している。しかしながら、ＥＣＮＩ中の残りの膜貫 通ドメイン配列またはＩＣドメイン配列は単一の細胞内で相互作用を媒介するの に十分である可能性がある。 ６．２，６．　ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａは泡沫洗剤可溶性分子間複合体を形 成する 前記した結果は総合すると、同じ膜内に存在するＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａの 間および異なる細胞上で発現されるこれらの蛋白の間の分子相互作用を示してい ると解釈できる。このような相互作用に関する別の試験として、これらの蛋白が ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａを発現する細胞の非変性洗剤抽出物から同時沈降す るかとうか調べた。 ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａが細胞間または細胞内の何れかで安定な分子間複合 体を形成する場合、これらの蛋白の１つに対する特異的抗血清を用いて細胞抽出 物から両方の蛋白を沈降させることが可能である。この分析を、ＮＰ−４０由来 ポリクローナル抗血清／−夜凝集させであるＮｏ　ｔ　ｃｈ構築物およびＤｅｌ 　ｔａ構築物で同時トランスフェクションした細胞、または、０〜２４時間野生 型胚のデオキシコレート分解物（実験方法を参照）でＤｅｌｔａを免疫沈降させ ることにより行なった。逆免疫沈降は、５ｊａｐｈ　Ａバンドのバックグラウン ド上の弱いＤｅｌｔａバンドを明確に識別できなかったため実施できなかった。 このポリクローナル抗Ｄｅｌｔａ抗血清を、細胞分解物中のＮｏｔｃｈに対する 交叉反応性（図５Ａ、レーンｌ）について、そして免疫蛍光分析（例えば図３Ｄ と３Ｅを比較）を用いて調べたところなにも発見できなかった点が重要である。 非特異的に付着している蛋白を除去するために洗浄を繰返した後、ウェスタンプ ロット上のＮｏｔｃｈに対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ　Ｃ１７，９Ｃ６） を用いてＮｏ　ｔ　ｃｈの同時沈降を調べた。 図５に示すとおり、同時トランスフェクション細胞および胚から得たＤｅｌｔａ 免疫沈降中、Ｎｏｔｃｈの同時沈降は検知されなかった。 しかしながら、同時沈降したＮｏｔｃｈはＤｅｌｔａより遥かに少ない量で存在 するように観察され、従って検知は困難であった。この格差は手順中の細胞融解 および洗浄の工程の間のＮｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ複合体の破壊によるものである 可能性が大きい。しかしながら、この格差はＮｏｔｃｈとＤｅｌｔａの間の非等 モル相互作用、または、これらの蛋白を検出するために用いた抗血清の親和性が 極めて異なることを反映している可能性もある。Ｄｅｌｔａの免疫沈降がＮｏｔ ｃｈの同時沈降をもたらしたという事実は、これらの２つの蛋白が、トランスフ ェクションされたＳ２細胞中、および胚細胞中、安定な分子間複合体を形成する ことの直接的な証拠となる。 ６．３．考察 神経原性の座の２つの蛋白産物、即ちＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａの間の相互作 用を調べることにより、その細胞機能を更に解明した。 通常は非付着性の８２細胞を用いるｉｎ　ｖｉｔｒｏ凝集検定により、Ｎｏｔｃ ｈおよびＤｅｌｔａを発現する細胞は相互に特異的に付着することを示した。こ の相互作用の特異性は、これらの実験では総細胞数の大部分が非発現細胞で構成 されていたものの、Ｎｏｔｃｈ“−Ｄｅｌｔａ”細胞凝集物が殆と非発現細胞を 含まないという観察結果から明らかである。この凝集は発現細胞の表面上に存在 するＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａの細胞外ドメインの間のへテロタイプの結合に より媒介されると考える。この考え方を裏付けるものとして、Ｎｏｔｃｈの細胞 外ドメインに対する抗血清はＮｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ媒介凝集を抑制し、Ｎｏｔ ｃｈ細胞内ドメインのほぼ全てを欠失しているＥＣＮＩＮｏｔｃｈ変異体がＤｅ ｌｔａを発現する細胞の凝集を媒介できることを我々は発見している。さらにま た、Ｄｅｌｔａのみを発現する細胞は相互に凝集するが、Ｎｏｔｃｈのみを発現 する細胞は凝集しないことも発見した。 これらの所見は、Ｄｅｌｔａは近接する細胞の表面上に存在する際にホモタイプ の相互作用に関与するが、Ｎｏｔｃｈは我々の検定条件下ではそうではないこと を示唆している。 ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａが細胞表面で相互作用を示すという考え方は、次の ３点の証拠によっても裏付けられる。第Ｉに、Ｎｏｔｃｈ”細胞およびＤｅｌｔ ａ”細胞の接触領域内に両方の蛋白の緊密な局在化を観察したが、これは、Ｎｏ ｔｃｈおよびＤｅｌｔａは、異なる細胞内に発現された場合であっても直接相互 作用を示すことを示唆している。第２に、ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａは両方の 蛋白を発現する細胞の表面上に併存局在化しており、これは、これらの蛋白が細 胞膜内て相互作用を示すことを示唆している。第３に、ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌ ｔａは両方の蛋白を発現する培養細胞の非変性洗剤抽出物ならびに胚細胞抽出物 から同時沈降できる。これら３点を考えあわせると、ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔ ａは同じ細胞または異なる細胞の何れの表面に発現された場合もヘテロタイプの 相互作用を示すという仮説が強力に裏付けられる。 観察されたＮｏｔｃｈとＤｅｌｔａの間およびＮｏｔｃｈとｍａｔｎの間（Ｘｕ 等、。 １９９０、　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ、　４．４６４−４７５）の間の遺伝子相互作 用の根拠は、これらの遺伝子によりコードされる蛋白の間の用量感受性相互作用 であると考えられる。 次の２つの証拠は、ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａの蛋白はｉｎ　ｖｉｔｒｏおよ びｉｎ　ｖｉｖｏで同様に機能することを示唆している。第１に、遺伝子分析は ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａの化学量はその機能が現われるために必須であるこ とを示している。Ｎｏｔｃｈ−ＤｅｌｔａおよびＤｅｌｔａ−Ｄｅｌｔａの会合 の両方がｉ’ｎ　ｖｉｔｒｏで起こるという我々の観察結果は、Ｎｏ　ｔ　ｃｈ およびＤｅｌｔａがＤｅｌｔａへの結合において競合しているかもしれないこと を示唆する。即ち、ＮｏｔｃｈとＤｅｌ　ｔａの間の用量感受性遺伝子相互作用 はその蛋白産物の間の競合結合相互作用によるものであろう。第２に、我々は免 疫沈降を用いて培養細胞の分解物中およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ胚の分解物中に Ｎｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａの会合を検知することができた。総合すると、これらの 遺伝子的生物化学分析は、ＮｏｔａｈおよびＤｅｌｔａが実際に、我々の凝集検 定に基づいて我々が提案した様式と同様の様式でｉｎ　ｖｉｖｏで会合すること を示唆している。 Ｎｏｔｃｈの遺伝子的および分子的分析は、更に、個々のＮｏｔｃｈ蛋白の間に も相互作用がある可能性を与える（Ｐｏｒｔｉｎ、　１９７５．　Ｇｅｎｅｔｉ ｃｓ８１、　１２１−１３３；　Ｋｅｌｌｅｙ等、、１９８７．　Ｃｅ１ｌ　５ １．５３９−５４８；　Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ、　１９８８． 　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ、　４．９６−１００）　ｏ実際、Ｋｉｄｄ等（１ ９８９，Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ、　３．１１１３−１１２９）は、明確に証明され ているわけてはないが、この蛋白がジスルフィド交叉結合二量体を形成すること を提案している。共有結合性交叉結合の形成の有無に関わらず、このような相互 作用は恐らくは単一の細胞内、または細胞間の何れかで生じる。しかしながら、 Ｎｏｔｃｈ”細胞がホモタイプの凝集を示さないという我々の知見は、Ｎｏｔｃ ｈ−Ｎｏｔｃｈ会合は単一の細胞内では起こると考えられるが細胞間では起こら ないことを示唆している。あるいは、ホモタイプのＮｏｔｃｈ相互作用は、Ｓ２ 細胞内で発現されない遺伝子産物を必要とする可能性もある。 我々の分析で示されたＮｏｔｃｈ−Ｄｅｌ　ｔａ相互作用は、恐らくは、これら の蛋白の細胞外ドメインにより媒介される。この結論は、Ｎｏｔｃｈのほぼ全て の細胞内ドメインを欠失させているか、または、ｉｎ　ｖｉけ０突然変異により 変化させているＥＧＮＩ構築物を用いた凝集実験により確認された。同時パッチ ング能力に基づいた膜内のＢＣＮｌ−Ｄｅｌｔａ会合を実証する別の実験によれ ば、これらの相互作用はＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａの細胞外ドメインにより媒 介されるかもしれないことを示している。ただし、この場合、膜貫通ドメインま たはＮｏｔｃｈ細胞内ドメインの残りの部分の関与の可能性を排除できない。こ れらの結果は、Ｎｏ　ｔ　ｃｈおよびＤｅｌｔａの両方がその細胞外ドメイン内 にＥＧＦ様繰返しを有するという事実を考慮すると特に興味深い（Ｗｈａｒｔｏ ｎ等、、　１９８５．　Ｃｅ１ｌ　４３．５６７−５８１；　Ｋｉｄｄ等、、　 １９８６゜Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｔ、　６．３０り４−３］０８；　Ｖａ ｓｓｉｎ等、、　１９８７．　ＥＭＢＯＪ、　６゜３４３］−３４４０；　Ｋｏ ｐｃｚｙｎｓｋｉ等、、　１９８８．　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ、　２．１７２３− １７３５）。 ＥＧＦドメインに関する第２の論点は、それらがＥＧＦ様繰返し内の保存された 部位Ａｓｐ、　Ａｓｐ／Ａｓｎ、へｓｐ／へｓｎおよびＴｙｈ／Ｐｈｅ残基より なるコンセンサス配列を有する場合、それらはＣｅ２ｌ結合ドメインとして機能 することができるという考え方である（Ｒｅｅｓ等、、　１９８Ｂ、　ＥＭＢＯ Ｊ、　７．２０５３−２０６１；　Ｈａｎｄｆｏｒｄ等、、　１９９０．　ＥＭ ＢＯＪ。 ９、４７５−４８０）。Ｃａ２′結合のための考えられるコンセンサス配列との 比較により、同様の配列が多くのＮｏｔｃｈのＥＧＦ様繰返し内（Ｒｅｅｓ等、 、　１９８８．　ＥＭＢＯＪ、　７．２０５３−２０６１）および大部分のＤ［ ！ｌｔａのＥＧＦ様繰返し内（Ｋｏｐｃｚｙｎｓｋｉ等、、　１９８８．　Ｇｅ ｎｅｓ　Ｄｅｖ、　２．１７２３−１７３５）にみとめられたことが解った。更 に、Ｎｏｔｃｈ突然変異の配列分析によれば、特定のＡｘ対立遺伝子がこの推定 Ｃａ２＋結合ドメイン内のアミノ酸の変化に関与していることが示された（Ｋｅ ｌｌｅｙ等、、１９８７．　Ｃｅ１ｌ　５１．５３９−５４８；　Ｈａｒｔｌｅ ｙ等、、　１９８７．　ＥＭＢＯＪ、　６、３４０７−３４１７；　Ｒｅｅｓ等 、、　１９８８．　ＥＭＢＯＪ、　７．２０５３−２０６１）。例えば、ＡｘＥ ２突然変異は２９番目のＥＧＦ様繰返しにおける旧ＳからＴｙｒへの変化と相関 し、この繰返しをＣａ”＋結合のためのコンセンサスに向けて変化させるようで ある。逆に、Ａ　Ｘ　＊　Ｂ　２突然変異は、ＡｓｐからＶａｔへの変化の結果 として２４番目のＥＦＧ様繰返しをこのコンセンサスから離れるように変化させ るようである。即ち、Ａｘ対立遺伝子とＤｅｌｔａ突然変異の間の遺伝子相互作 用（Ｘｕ等、、　１９９０゜Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ、、　４．４６４−４７５）は Ｃａ”＋イオンがＮｏｔｃｈ−Ｄｅｌ　ｔａ相互作用におけるある役割りを果た すという可能性を生じさせる。外来性Ｃａ２＋はトランスフェクションされたＳ ２細胞のＮｏｔｃｈ−Ｄｅｌ　ｔａ媒介凝集に必要であるという我々の知見はこ の主張を支援するものである。 我々が議論したとおり（Ｊｏｈａｎｓｅｎ等、、　１９８９．　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ 　Ｂｉｏｌ。 １０９、２４２７−２４４０；　Ａｌｔｏｎ等、、　１９８９．　Ｄｅｖ、　Ｇ ｅｎｅｔ、　１０．２６１−２７２）、以前の分子分析および遺伝子分析に基づ けば、Ｎｏ　ｔ　ｃｈまたはＤｅｌ　ｔａの何れかの細胞機能が細胞−細胞相互 作用への関与を超えているということを、確信をもって予測することはできない 。しかしながら、ここに示した結果を考慮すると、Ｎｏ　ｔ　ｃｈおよびＤｅｌ ｔａは１ｎｖｉｖｏで細胞間の付着相互作用を媒介する機能を有することを示唆 するのは合理的と考えられる。同時に、観察されたＮｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａの相 互作用は単に付着機能を反映しているのみならず、ｉｎ　ｖｉｖ。 で起こる受容体−リガント結合相互作用も反映している可能性がかなりある。実 際、Ｎｏｔｃｈ内の構造的に複雑な１０００個のアミノ酸の細胞内ドメインの存 在は、付着相互作用のみよりはむしろ、シグナル形質導入における役割りに、よ り適合していると考えられる。ＮｏｔｃｈがＤｅｌｔａと協力して付着機能を有 すると考えれば、Ｎｏｔｃｈの軸策発現は軸策の導入においである役割りを果た していると考えられる。 ７、ＮｏｔｃｈのＥＧＦ繰返し１１および１２はＮｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔ、ａ−媒 介凝集に必要で十分である 本試験では、セクション６に記載した凝集検定ならびにＮｏｔｃｈの欠失変異体 を用いてＤｅｌｔａとの相互作用に必要なＮ０ｔｃｈの細胞外ドメイン内の領域 を同定した。ＮｏｔｃｈのＥＧＦ繰返しはこの相互作用に直接関与し、そして３ ６ＥＧＦ繰返しのうち僅か２つのみが必要であると考えられた証拠を示す。これ らの２つのＥＧＦ繰返しがＤｅｌｔａへの結合に十分てあり、そしてＮｏｔｃｈ −Ｄｅｌｔａ媒介凝集のカルシウム依存性もまたこれらの２つの繰返しに関連す ることを実証する。最後に、Ｎｏｔｃｈと相同のＸｅｎｏｐｕｓ由来の２つの相 当するＥＧＦ繰返しもまた、Ｄｅｌｔａとの凝集を媒介し、このことはＮｏｔｃ ｈの構造が進化論的に保存されるのみならず、その機能も保存されることを示し ている。これらの結果は、Ｎｏｔｃｈの細胞外ドメインが意外にもモジュール的 てあり、Ｄｅｌｔａ以外の種々の蛋白にも潜在的に結合可能であることを示唆し ている。 記載した構築物は全て全長のＮｏ　ｔ　ｃｈ発現構築物＃１　ｐＭｔＮＭｇの誘 導体である（上記セクション６参照。全ての連結は低融点アガロースゲル（Ｓｅ ａ　Ｐｌａｑｕｅ、　ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）から得たＤＮＡ断片を用 いて実施した。Ｎ０ＩＣｈの全細胞外ドメインを含むｐＭｔＮＭｇ由来の６　ｋ ｂ　ＥｃｏＲＩ−Ｘｈｏｌ断片を旧ＵｅＳＣｒｔｐｔベクター（Ｓ　ｔ　ｒａ　 ｔａｇｅｎｅ）のＨｅｏＲｌ−Ｘｈｏ１部位に挿入連結し、Ｒ［／ＸＢＳと命名 した。その後金てのＥＧＦ繰返しの欠失および挿入はこのサブクローンを用いて 実施した。次にこれらの旧／ＸＢＳ誘導体のＥｃｏＲＩ−Ｘｈｏ　Ｉ断片を含む Ｎｏｔｃｈ配列を細胞内ドメインを含むｐＭｔＮＭｇ由来の５．５ｋｂ　Ｘｈｏ ｌ−Ｘｂａｌ断片およびポリアデニル化のために必要な３°配列と混合し、そし て、３ピース連結でｐＲＭＨａ−３（Ｂｕｎｃｈ等、１９８８．　Ｎｕｃｌ、　 Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１６．　１０４３−１０６１）のＥｃｏＲｌ−Ｘｂａ１部 位に挿入した。以下に記載する全ての数はＷｈａｒｔｏｎ等（１９８５，Ｃｅ１ ｌ　４３．５６７−５８１）に従ったＮｏｔｃｈ配列のヌクレオチド配位を指す 。 構築物＃２ＤＳｐｈニツイテは、Ｒ１／ＸＢＳは５ｌ）ｈｌテ完全に消化し、次 に再環化し、５ｐｈｌ　（９９６）からｓｐｈ　＋　（４５４５）までの３．５ ｋｂのインフレーム欠失を行なった。 構築物＃３ΔＣ１ａについては、Ｒ１／ＸＢＳをＣ１ａｌで完全に消化し、次に 、再連結し、Ｃ１ａｎ（１６６８）からＣ１ａｌ（４４０７）までの２．７ｋｂ のインフレーム欠失を行な？た。連結部は５ｅｑｕｅｎａｓｅ　Ｋｉｔ（Ｕ、Ｓ 、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、、　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ）を用いて二重 鎖シーケンシング（Ｘｕ等の記載に従う、１９９０．　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ、　 ４．４６４−４７５）により確認した。４５６６位のＣｌａｌ部位は配列に従っ て存在していたが、これは我々の条件下ではＣ１ａｌ制限酵素では認識されなか ったことが解った。 構築物＃４−１２については、Ｒ１／ＸＢＳをＣ１ａｌで部分的に消化し、そし て再連結して以下に示すような全ての可能なインフレーム欠失の組合せを作成し た。構築物＃４ΔＥＧＦ７−１７はＣ１ａｌ（１６６８）とＣ１ａｌ（２８２９ ）の間の配列を除去した。構築物＃５ΔＥＧＦ９−２６はＣ１ａｌ（１９０５） とＣＩａ　ｌ　（３８５５）の間の配列を除去した。構築物＃６ΔＥ　Ｇ　Ｆ　 １７−３１はＣ１ａｌ（２８２０）とＣ１ａｌ（４４０７）の間の配列を除去し た。 構築物＃７ΔＥＧＦ７−９はＣ１ａｌ（１６６８）とＣ１ａｌ（１９０６）の間 の配列を除去した。構築物＃８ΔＥＧＦ９−１７はＣ１ａｌ（１９０５）とＣ１ ａｌ（２８２０）の間の配列を除去した。構築物＃９ΔＥ　Ｇ　Ｆ　１７−２６ はＣ１ａｌ（２８２０）とＣｌａ　ｌ　（３８５５）の間の配列を除去した。構 築物＃１０ΔＥＧＦ２６−３０はＣ１ａｌ（３８５５）とＣ１ａｌ（４４０７） の間の配列を除去した。構築物＃１１ΔＥＧＦ９−３０はＣ１ａｌ（１９０５） とＣ１ａｌ（４４０７）の間の配列を除去した。構築物＃１２ΔＥ　Ｇ　Ｆ　７ −２６はＣ１ａｌ（１６６８）とＣ１ａ＋（３８５５）の間の配列を除去した。 構築物＃１３ΔＣＩａ＋ＥＧＦ　９−１７および＃１４ΔＣＩａ＋ＥＧＦ１７− ２６については、Ｃ１ａｌ（１９０５）とＣ１ａｌ（２８２０）の間の約０．９ 　ｋｂの断片、およびＣ１ａｌ（２８２０）とＣ１ａｌ（３８５５）の間の約１ ．　Ｏｋｂの断片をそれぞれ、構築物＃３ΔＣ１ａの唯一のＣｌａｌ部位に挿入 した。 構築物＃１６スブリツトについては、ｐＭｔＮＭｇの１ｌｋｂのＫｐｎｌ／Ｘｂ ａｌ断片を、ＥＧＦ繰返し１４中のスプリット突然変異を有するＮｏｔｃｈミニ 遺伝子構築物由来の相当するＫｐｎｌ／Ｘｂａｌ断片で置換した。 構築物＃１７−２５については、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための合成 プライマーを、ＥＧＦ繰返しのストレッチを増幅し、かつ、繰返しの３番目のシ スティンのすぐ後の共通なＣｌａｌ部位と同じ場所の増幅された片の末端でＥＧ Ｆ繰返しを破壊するように設計した（図７参照）。ＰＣＲ生成物は通常通りゲル 精製し、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片で充填することにより平滑末 端とした構築物３＃ΔＣ１ａらのＣｌａｌ部位に連結した（Ｍａｎｉａｔｉｓ等 、、　１９９０．　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｔ（ａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ） 。挿入物の正しい配位は、挿入物のセンス鎖プライマー並びにＥＧＦ繰返し３５ 内のアンチセンス鎖プライマーを用いてＰＣＲにより決定した。全てのプライマ ーは２０量体であり、Ｗｈａｒｔｏｎ等（１９８５，ＣｅＩＩ　４３．５６７− ５８１）のＮｏｔｃｈ配列のヌクレオチド配位に従って、その５′末端のヌクレ オチドの番号で命名し、Ｓはセンス鎖プライマーを指し、Ａはアンチセンス鎖プ ライマーを指すものとした。構築物＃１６ΔＣ１ａ＋ＥＧＦ　（９−１３）はプ ライマー　Ｓ　Ｌ９１７およびＡ２３６７を使用した。構築物＃１７ΔＣＩａ＋ ＥＧＦ　（１１−１５）はプライ７−　Ｓ　２１４１およびＡ２５９１を使用し た。構築物９１８ΔＣ，ｌａ＋　Ｅ　Ｇ　Ｆ（１３−１７）はプライマーＳ　２ ３７５およびＡ　２８１９を使用した。構築物＃１９ΔＣａｌ＋　Ｅ　Ｇ　Ｆ　 （１０−１３）はプライ？　−Ｓ　２０１ＢおよびＡ　２３６７を使用した。構 築物＃２０ΔＣ１ａ＋　Ｅ　Ｇ　Ｆ　（１１−１３）はプライマーＳ　２１４１ およびＡ　２３６７を使用した。構築物＃２１ΔＣ１ａ＋ＥＦＧ　（１０−１２ ）はプライマー５２０１８およびＡ２０１５を使用した。構築物＃２２ΔＣ１ａ 　＋ＥＧＦ　（ｔｏ−１１）はプライ７−　Ｓ　２０１ＢおよびＡ　２３２２を 使用した。構築物＃２３ΔＣＩａ＋　Ｅ　Ｇ　Ｆ　（１０−１２）はプライ７− ３２０１８およびＡ　２３２２を使用した。構築物＃２４ΔＣ］ａ＋Ｅ　Ｇ　Ｆ 　（１１−１２）はプライマー３２０８１およびＡ　２３２２を使用した。 構築物＃２５ΔＥＧＦについては、構築物Ｒ１／ＸＢＳを５ｐｈｌ（９９６）で 完全に消化し、モしてＢａｍ１ｌｌ（５１３５）で部分的に消化した。得られた 非適合末端は、唯一のＣＩａＩ部位を形成するように設計された合成リンカ−を 用いて結合させた。これにより、繰返し１の前の半分を除いて全ての３６ＥＧＦ 繰返しを除去するインフレーム欠失を行なった。構築物＃　２６−２９について は、ＥＧＦ断片は、相当する構築物＃１３．１６．１９および２３で前記したと おり、このＣｌａｌ部位に挿入した。 構築物＃３０ΔＥＣＮについては構築物Ｒ１／ＸＢＳをＢｇｌｌ、　ＥｃｏＲＩ およびＸｈｏ　Ｉで完全に消化した。約０．２ＫｂのＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌ　１断 片（７２２−９４８）および約０．７　ｋｂ（７）Ｂｇｌ　１−Ｘｈｏｌ（５８ ７３−６６２７）断片は、ＥｃｏＲＩ−Ｘｈｏ　Ｉ切断ＢｌｕｅＳＣｒｉｐｔベ クターおよび唯一のＣｌａｌ部位を形成するように設計された合成リンカ−を用 いて連結し、繰返し１の最初の１７３ならびに３　Ｎｏｔｃｈ／ｆｉｎ−１２繰 返しを除いて全ての３６ＥＧＦ繰返しを除去したＢｇｌ　Ｉ（９４１）からＢｇ ｌ　Ｉ（５８７３）のインフレーム欠失を行なった。 構築物＃３１および３２については、ＥＧＦ断片は、構築物＃１９および２３に ついて前に記載したとおり、唯一のＣｌａｌ部位に挿入した。 構築物＃３３および３４については、Ｘｅｎｏｐｕｓ　Ｎｏｔｃｈ配列に基づい たＰＣＲプライマー５１５０８およびＡ１８５９　（Ｃｏｆｆｍａｎ等、、　１ ９９０゜５ｃｉｅｎｃｅ　２４９．１４３８−１４４１；数は本明細書で使用す るヌクレオチド配位を指す）を用いてＸｅロｏｐｕｓステージ１７　ｃＤＮＡラ イブラリからＥＧＦ繰返し１１および１２を増幅した（ライブラリはり９Ｍｅｌ ｔｏｎが作成し、Ｍ、　Ｄａｎｉｌｃｈｅｋにより提供された）。断片は構築物 ３＃ＤＣ１ａに連結し、配列決定した。 ７、１．２．　細胞培養およびトランスフェクションＤｒｏｓｐｈｉｌａ　Ｓ　 ２細胞系統を、セクション６に記載したとおり生育させトランスフェクションさ せた。Ｄｅｌｔａ発現安定形質転換Ｓ２細胞系統Ｌ−４９−６−７（Ｌ、　Ｃｈ ｅｒｂａｓ作成）を、１１％熱不活性化ウシつ児血清Ｆ　ＣＳ　（）ｌｙｃｌｏ ｎｅ）、　１００ＬＩ／ｍｌペニシリン−１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシン −〇、　２５ｕｇ／ｍｌフンジゾン（Ｈａｚｌｅｔｏｎ）　、２　Ｘｌ０−’Ｍ メトトレキセート、０．１　ｍＭヒポキサンチンおよび０．０１６ｍＭチミジン 添加Ｍ３培地（Ｈａｚｌｅｔｏｎ　Ｃｏ、製）中で生育させた。 ７、１．３．　凝集検定および免疫蛍光試験凝集検定およびＣａ２＋依存性実験 はセクション６に記載の通りである。細胞を抗Ｎｏｔｃｈモノクローナル抗体９ Ｃ６，ＣＩ？および抗Ｄｅｌｔａラットポリクローナル抗血清（詳細はセクショ ン６に記載）で染色した。非透過性にした細胞中のＮｏｔｃｈ構築物の表面発現 は、Ｎｏｔｃｈの細胞外ドメイン由来の０．８ｋｂ（アミノ酸２３７−５０１； 　ＷｈａｒｔＯｎ等、、１９８５．　ＣｅＩＩ　４３．５６７−５８１）　Ｂｓ ｔＹＩ断片に対して作成されたラットポリクローナル抗血清を用いて検定した。 細胞はＬｅｉｔｚ　０ｒｔｈｏｐｌａｎ　２顕微鏡上で表面蛍光下で観察した。 （来貢以下余白） ７．２．結論 ７．２．１．　ＮｏｔｃｈのＥＧＦ繰り返し１１及び１２はＮｏｔｃｈ−Ｄｅｌ ｔａ媒介凝集のために必要である 我々は、Ｎｏｔｃｈが媒介する相互作用の正確なドメインを同定するために、我 々がＮｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ相互作用に関連することを既に示している（上記、 第６節）　、Ｎｏｔｃｈ蛋白の細胞外領域の広範囲の欠失分析に着手した。我々 は第６節に記載されている凝集アッセイを使用して、Ｄｅｌｔａと相互作用させ るため種々の欠失構築物を移入した細胞の能力を試験した。簡単に述べると、Ｎ ｏｔｃｈ欠失構築物は経過的にドロソフィラＳ２細胞に移入され、ＣｕＳＯ４で 誘引し、次いでセルラインＬ４９−６−７（ｃｈｅｒｂａｓ）を発現する安定的 に移入されたＤｅｌｔａからの少量の細胞とともに室温で１晩凝集させ、〜１％ Ｎ０１Ｃｈ発現細胞及び〜５％Ｄｅｌｔａ発現細胞から典型的に成る集団をいず れの蛋白をも発現しない残存細胞で収穫した。凝集の度合をアッセイするために 、細胞を各遺伝子生成物に特異的な抗血清で染色し、免疫蛍光顕微鏡で試験した （詳細については実験方法を参照）。凝集体はＮｏｔｃｈ及びＤｅｌｔａ発現細 胞の両方を含む４個以上の細胞のクラスターとして定義され、そして第６図に示 される値はこのようなりラスターに見い出されるＮｏｔｃｈを発現する全ての細 胞のパーセントを表わす。すべての数は、少なくとも１００個のＮｏｔｃｈ発現 細胞単位（単−細胞又はクラスター）が計測された少なくとも２個の別個のトラ ンスフェクション実験からの平均的結論を、表わしている。 試験された構築物の模式図及び凝集実験の結果は第６図に示されている（詳細に ついては実験的方法を参照）。すべての発現構築物は、全長のＮｏｔｃｈ発現構 築物＃１　ｐＭｔＮＭｇ　（上述の第６節）の″誘導体であった。 最初の構築物（＃２　ＤＳｐｈ及び＃３ΔＣ１ａ）はＥＧＦ繰り返しの大部分を 欠失していた。Ｎｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ凝集を促進することが不可能なことは、 ＮｏｔｃｈのＥＧＦ繰り返しがＤｅｌｔａとの相互作用に関連していたことを示 していた。我々はＥＧＦ繰り返し７及び３０の間でさらに領域を切断するため、 一連の６個のイン−フレームＣ１ａｌ制限部位を利用した。繰り返しの間の配列 相同性のため、Ｃｌａｌ部位の５個は３番目のシスティンのすぐ後の、ＥＧＦ繰 り返しの同一の相対的場所で生じ、一方第６の部位はＥＧＦ繰り返し３１の最初 のシスティンの直前で生ずる（第７図）。こうして、Ｃ１ａｌの部分的消化を行 い、次に再結合することにより、我々はＮｏｔｃｈ蛋白の読み取り枠（ｏｐｅｎ 　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ）を保存しているのみならず、さらに、構造上の 完全さを維持し、再結合により生成されたキメラＥＧＦ繰り返しにおける３個の ジスルフィド結合の空間を少なくとも理論的に保持した（第６図、構築物＃４− １４）。残念なことに、いちばん多くの３’　Ｃｌａｌ部位は消化に抵抗性であ ったが、次に多い３°Ｃ１ａ１部位はＥＧＦ繰り返し３０と３１の間で切断した 。それゆえ、種々のＣ１ａｌ消化物の断片は完全なＣ１ａｌ消化物（構築体＃３ ΔＣ１ａ）のフレームワーク内に再び挿入されると、ＥＧＦ繰り返しの全体の構 造は明らかに３°結合で中断された。 このシリーズの構築物についての幾つかの点は、何の価値もない。第１に、ＥＧ Ｆ繰り返し９及び１７において切断したＣ１ａｌ制限断片の除去は（構築物＃８ ΔＥ　Ｇ　Ｆ　９−１７）　Ｄｅｌｔａとの凝集を放棄し、一方、ＥＧＦ繰り返 し７−３０を欠いている、構築物＃３ΔＣ１ａにこの部分を再挿入す°るとほぼ 野性型のレベル（構築物＃１３ΔＣ１ａ＋ＥＧＦ９−１７）まで凝集を回復した が、これはＥＧＦ繰り返し９から１７まではＤｅｌｔａに結合するために重要な 配列を含んでいることを示唆している。第２に、このシリーズ（＃４’−１４） 中のすべての構築物は、ＥＧＦ繰り返し９から１７までに対する結合部位マツピ ングに合致した。これらの繰り返しく＃６．　７゜９、１０．１３）を含有する 発現構造体はＮｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ相互作用を促進するが、これらの繰り返し く＃４．　５．　８．１１．１２．１４）を欠く構築物は促進しなかった。Ｄｅ ｌｔａ細胞とは凝集できないことは、単に細胞表面に到達するのに変異が誘発さ れたＮｏｔｃｈ蛋白が失敗したことによるのみならず、実際に必要な結合部位が 欠けているということを確認するために、我々はＮｏｔｃｈの細胞外領域に特異 的な抗体でトランスフェクトされた生細胞を免疫蛍光学的に染色することにより 、すべての構築物の細胞表面発現を試験した。 Ｎｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ相互作用を媒介することに失敗したすべての構築物は、 細胞表面において通常発現されるように思われる蛋白を生成した。第３に、凝集 アッセイは定量的ではないが、ＥＧＦ繰り返し９−１７．＃９ΔＥ　Ｇ　Ｆ　１ ７−２６又は最も認識しうる＃ｌＯΔＥＧＦ２６−３０を含む２個の構築物は、 表面上低いレベルで凝集した。固定され、かつ浸透された細胞は普通に染色され た同一の抗体と反応するが、構築物＃９ΔＥ　Ｇ　Ｆ　１７−２６及び１０ΔＥ ＧＦ２６−３０でトランスフェクトされた細胞は通常よりかなり低い表面染色を 示していることは、我々が抗血清により認識されるエピトープを単に欠失させた のではないことを示している。浸透した又は生細胞集団のいずれかにおいてトラ ンスフェクトされた細胞のパーセントを比較する・ことにより、我々は構築物＃ ９ΔＥ　Ｇ　Ｆ　１７−２６のためにトランスフェクトされた細胞の約５０％及 び構築物＃１０ΔＥＧＦ２６−３０のための１０％が細胞表面において検出可能 な蛋白を生成することを見い出した。このようにこれらの２個の構築物は細胞表 面にしばしば到達し損なった蛋白を生成したが、これは誤って折りたたまれ、そ のことにより衰えているのであって、Ｄｅｔｔａ発現細胞と凝集するためのトラ ンスフェクトされた細胞の能力を放棄したからではない。 ＥＧＦ繰り返し９から１７までの結合部位をマツプした後で、我々は分子の損傷 が確認されたいずれかのＮｏｔｃｈ変異体をこの領域にマツプできるか否かチェ ックした。唯一のこのような変異体はスプリット、即ちＥＧＦ繰り返し１４にお けるポイント突然変異に相関する半優性のＮｏｔｃｈ対立遺伝子であった（ハー トレーら、　１９８７、ＥＭＢＯＪ、　６．３４０７−３４１７．ケーレーら、 １９８７．　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ。 ６、３０９４−３１０８）。事実、スプリットの第２部位の修飾因子に対する遺 伝子スクリーンはＤｅｌｔａの数個の対立遺伝子を示しており、これはＮｏｔｃ ｈのスプリットした対立遺伝子とＤｅｌｔａの間の特別の関係を示している（ブ ランド及びカンバスーオルテガ、１９９０．　Ｒ。 ｕｘ’ｓ　Ａｒｃｈ、　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　１９８（５）、　２７５−２８ ５）。Ｎｏｔｃｈ−ｏｅｔｔａ媒介構築物にクローンさせた（＃１５スプリット ）。しかしながら、ＤｅＩｔａ−発現細胞との凝集はこの構築物においては起こ らず、このことは、次の構築物により確認されたように、ＮｏｔｃｈのＥＧＦ繰 り返し１４は我々の組織培養アッセイによりモデル化されたＤｅｌｔａとは相互 作用を起こさないことを示唆している。 このため、ＥＧＦ繰り返し９−１７内のＤｅ　ｌ　ｔａ結合ドメインを位置決め するため、我々はこの領域の数個のサブフラグメントを製造するための特異的な オリゴヌクレオチドプライマー及びＰＣＲ法を使用した。Ｄｅｌｔａと相互作用 可能であった蛋白を生成した構築物＃４−１４と合致させるため、我々は共通の Ｃｌａｌ部位と同じ場所において、第３番目のシスティンの直後のＥＧＦ繰り返 しをスプライスするプライマーをデザインした（第７図）。得られたＰＣＲ生成 物は構築体＃３ΔＣ１ａのＣｌａｌ部位へ結合させた。３個の重複する構築物、 ＃１６．１７及び１８が生成され、このうちの唯一の＃１６ΔＣ１ａ　＋ＥＧＦ 　９−１３はＳ２細胞にトランスフェクトされた時、Ｄｅｌｔａ細胞と凝集可能 であった。ＥＧＦ繰り返し９を欠いている構築物＃１９ΔＣＩａ＋Ｅ　Ｇ　Ｆ　 （１０−１３）は、さらにＥＧＦ繰り返し１０−１３をＮｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ 相互作用に必要な領域として定義した。 構築物＃２０−２４は、さらに同一のＰＣＲストラドジーを使用するこの領域の 分析の試みを代表した（第７図）。我々は最初にＥＧＦ繰り返し１１及び１２の 両方が必要であるかどうか、次に、ＥＧＦ繰り返し１０及び１３からのフランキ ング配列がＤｅｌｔａへの結合に直接関連したかどうか調べた。構築物＃２ｏΔ Ｃ１ａ＋　Ｅ　Ｇ　Ｆ　（１１−１３）、ここにおいてＥＧＦ繰り返し１２が添 加された唯一の完全繰り返し部分であり、及び＃２１ΔＣ１ａ＋ＥＧＦ　（１０ −１２）　、ここにおいてＥＧＦ繰り返し１１が添加された唯一の完全繰り返し 部分である、は凝集を媒介できなかったが、これはＥＧＦ繰り返し１１又は１２ のいずれか１個の存在はＮｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ相互作用にとり十分ではないこ とを示唆している。しかしながら、これらの構築物の３°結合の連結はＥＧＦ繰 り返しの全体の構造を妨害するから、短い“バッファー”ゾーンが重要な繰り返 しを正常に機能させるのに必要とされることはありうる。こうして、例えば、＃ １９Δｃｌａ＋　Ｅ　Ｇ　Ｆ　（１０−１３）構築物において、ＥＧＦ繰り返し １２はｏｅｔｔａへの結合には直接には関連しないかもしれないが、ＥＧＦ繰り 返し１１の構造を保護するために必要とされる最少量のバッファー配列に寄与し うるちのであり、そのことによりＤｅｌｔａとの相互作用が可能となる。構築物 ＃２２−２４はこの問題を解決する。我々は、ＥＧＦ繰り返しの末端で切断、そ れゆえ、３°結合の連結においてＥＧＦジスルフィド形成を中断することはあり えないようなＰｃＲプライマーをデザインした。構築物＃２２ΔＣ１ａ＋　Ｅ　 Ｇ　Ｆ　（１０−１１）　、これは凝集を仲介しなかった、及び＃２３ΔＣ１ａ ＋　Ｅ　ＧＦ　（１０−１２）　、これは仲介した、再び繰り返し１１及び１２ の両方を必要とし、繰り返し１３からのフランキング配列は明らかにそうでない ことを示唆していた。最後に、今や、５°結合で構造的に中断されることがあり うるであろうが、構築物＃２４ΔＣＩａ＋　Ｅ　Ｇ　Ｆ（１１−１２）は、確実 にＥＧＦ繰り返し１０からの配列は重要でないことを示していた。このように２ ４個の構築物からの完全に一致したデータに基づいて、我々は、ＮｏｔｃｈのＥ ＧＦ繰り返し１１及び１２が伴にトランスフェクトされたＳ２細胞においてＤｅ ｌｔａへの結合のために必要な部位を含む、この分析から得られる最小の機能的 単位を定義するということを提唱する。 ７．２．２．　ＮｏｔｃｈのＥＧＦ繰り返し１１及び１２は、Ｎｏｔｃｈ−Ｄｅ ｌｔａ介ＰＣＲ断片が挿入された大きなＣ１ａｌ欠失（＃３　Ｃ１ａ）は、オリ ジナルの３６のＥＧＦ繰り返し並びに３個のＮｏｔｃｈ　／　ｌ１ｎ−１２繰り 返しの約１７３を保持している。これらは凝集を促進するには明らかに十分では ないが、特定のＥＧＦ繰り返しがＤｅｌｔａと相互作用可能であるために必要な フレームワークをそれらが形成することは可能である。たった二、三のＥＧＦ繰 り返しが実際に凝集を促進させるのに十分であるか否かを試験するため、我々は ２個の構築物、繰り返しｌの最初の３分の２を除いて３６個のＥＧＦ繰り返しす べてを欠いている＃２５ΔＥＧＦ、及びＥＧＦ繰り返しｌの最初の３個及び膜貫 通ドメインの直前の一３５アミノ酸を除いてＮｏｔｃｈの完全な細胞外部分を欠 失している＃３０ΔＥＣＮをデザインした。構築物＃２５ΔＥＧＦに挿入された とき、構築物＃３ΔＣ１ａのバックグラウンドにおいてＮｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ 凝集を媒介した断片はＤｅｌｔａとの相互作用を再び促進することができた（構 築物＃２６−３０）。 Ｎｏｔｃｈ　／　ｌ１ｎ−１２繰り返しも存在していない類似の構築物（＃３１ ゜３２）は、再度Ｎｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ凝集を成功裏に仲介した。こうして、 ＥＧＦ繰り返し１１及び１２は、Ｎｏｔｃｈの大部分の細胞外領域が存在しない 場合においてさえ、Ｓ２細胞においてＮｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ相互作用を仲介す るのに十分である独立の分子単位として機能するように思われる。 ７．２．３．　ＮｏｔｃｈのＥＧＦ繰り返し１１及び１２は、Ｎｏｔｃｈ−Ｄｅ ｌｔａ介在凝集のカルシウム依存性を維持する 上述の第６節に記載したように（フエホンら、　１９９０．　Ｃｅ１ｌ　６１゜ ５２３−５２４）、我々はＮｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ−介在Ｓ２細胞凝集はカルシ ウム依存性であることを示した。それゆえ、我々は成る欠失構築物を発現する細 胞のＣａ＋＋イオンの存在下又は非存在下における細胞発現Ｄｅｌｔａによる凝 集能力を試験した。 我々は、コントロールとしての＃ｌ　ｐＭｔＮＭｇ構築物、及び＃１３゜１６、 １９．２３．２４．２６．２７及び２８を試験し、そして、Ｃａ”＋を含有する 媒質において混合された細胞は４℃で容易に凝集物を形成するのに対し、Ｃａ” ＋を含有しないＥＧＴＡ媒質で混合された細胞は凝集しないことを見い出した（ 第■表）。 （来貢以下余白） 第■表 １．　ｐＭｔＮＭｇ　０　３７ １３、ΔＣ１ａ　＋　ＥＧＦ（９−１７）　０　３１１６、ΔＣ１ａ　＋　ＥＧ Ｆ（９−１３）　０　３８１９、ΔＣ１ａ　＋　Ｅ　Ｇ　Ｆ　（１０−１３）　 ０　４２２３、ΔＣ１ａ　＋　Ｅ　Ｇ　Ｆ　（１０−１２）　０　４８２９、Δ Ｅ　Ｇ　Ｆ　＋　Ｅ　Ｇ　Ｆ　（ｔｏ−１２）　０　４４３２、ΔＥ　ＣＮ　＋ 　Ｅ　Ｇ　Ｆ　（１０−１２）　０　３９３３、ΔＣ１ａ　＋　ＸＥＧＦ（１０ −１３）　０　３４＆　データは、凝集物中に見い出されるＮｏｔｃｈ−発現細 胞のパーセントとして表わされる（第６図のとおり）明らかに、最小の構築物に おいてさえ、相互作用のカルシウム依存性が保持されており、このことはＥＧＦ 繰り返し１１及び１２を含む最少の構築物は全長のＮｏｔｃｈのそれと同様の態 様によりＤｅｌｔａに結合するという概念と合致している。この結果は、また、 特定のコンセンサス配列を有するＥＧＦ一様の繰り返しはＣａ”＋結合領域とし て作用するかもしれないということを示唆する最近の研究に照らして興味がある （モリタら、　１９８４．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５９゜５６９８ −５７０４　、スゴら、　１９８４．　Ｊ、　Ｒｉａｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５９ ．５７０５−５７１０　；リーズら、１９８８．　ＥＭＢＯＪ、７．　２０５３ −２０６１；　ハンド７ｔ−’ｔ”う、１９９０、　ＥＭＢＯＪ、　９．４７５ −４８０）　。繰り返し１１及び１２を含め、ＮｏｔｃｈにおけるＥＧＦ繰り返 しの半分以上はこのコンセンサスに合致し、さらに、ＥＧＦ繰り返し１１及び１ ２がＮｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ相互作用を促進するために関係するという議論を強 化している。 ７．２．４．　ＮｏｔｃｈのＥＧＦ繰り返し１１及び１２のＤｅｌｔａ結合機能 はＮｏｔｃｈのアフリカッメガエル（ｘｅｎｏｐｕｓ）同族体において保存され る。 ＮｏｔｃｈのＥＧＦ繰り返し１１及び１２へのＤｅｌｔａ結合部位を位置決めし てから、我々はアフリカッメガエルで確認されたＮｏｔｃｈ同族体の中にこの機 能が保存されているが否が調べることに興味をもった（コツマンら、　１９９０ ．５ｃｉｅｎｃｅ　２４９．１４３８−１４４１）　ｏこの蛋白は全体構造及び 組織においてショウジヨウバエのＮｏｔｃｈに驚く程の類似性を示す。例えば、 ＥＧＦ繰り返しの内部で繰り返しの数及び線形機能の両方が保存されていたが、 同様に可能な機能保存を示唆している。これを試験するため、我々はアフリカッ メガエルのＮｏｔｃｈ配列に基づいたＰＣＲプライマーを製造しくコツマンら、 　１９９０．５ｃｉｅｎｃｅ　２４９．１４３８−１４４１）　、いずれかの側 において繰り返しｌＯ及び１３が半分隣接したＥＧＦ繰り返し１１及び１２を含 むアフリカッメガエルステージ１７ｃＤＮＡライブラリーから〜３５０ｂｐフラ グメントを得るためにこれらを使用した。このフラグメントは構築物＃３ΔＣ１ ａにクローンされ、そして３個の独立したクローンにつき細胞培養凝集アッセイ においてＤｅｌｔａと相互作用しうるか否か試験した。クローンのうちの２個、 ＃３３ａ＆ｂ　ΔＣ１ａ＋ＸＥＧＦ　（１０−１３）　、はＳ２細胞へトランス フェクトされるとき、類似のショウジヨウバエのＮｏｔｃｈ構築物＃１９ΔＣＩ ａ＋　Ｅ　Ｇ　Ｆ（１０−１３）とほぼ同等のレベルで、そして、再カルシウム 依存性の態様でＮｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ相互作用を媒介できた（第■表）。しか しながら、非透過性の生細胞を染色して判断したとき蛋白は細胞表面で通常発現 されるが、第３番目のクローン＃３３ｃ　ΔＣＩａ十ＸＥＧＦ　（１０−１３） はＮｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ相互作用を介在することはできなかった。構築物＃３ ３ａ及び３３ｃにおけるアフリカッメガエルのＰＣＲ生成物の配列比較によれば 、構築物＃３３ｃのＥＧＦ繰り返し１１においてロイシンをプロリンに変化させ るミスセンス変異が明らかであった（アミノ酸＃　４５３．　コツマンら、　１ ９９０゜５ｃｉｅｎｃｅ　２４９．１４３８−１４４１）　ｏこの残基はショウ ジヨウバエ及びアフリカッメガエルのＮｏｔｃｈの間で保存されないが（第８図 ）、プロリン残基の導入はＥＧＦ繰り返しの構造を容易に中断し、これによりＤ ｅｌｔａによる適切な相互作用からそれを保護することができる。 ショウジヨウバエ及びアフリカッメガエルのＮｏｔｃｈのＥＧＦ繰り返し１１及 び１２のアミノ酸配列の比較は、カルシウム結合コンセンサス配列を含め、高度 のアミノ酸の同一性を示した（第８図。 配列番号＝１及びＮＯ：２）。しかしながら、相同性のレベルは、他のＥＧＦ繰 り返しの多くの間で共有されているものとは著しくは異なっておらず、全体とし てアミノ酸レベルで約５０％の同一性を示している。個々のＥＧＦ繰り返しの間 のこの１：ｌ対応は、恐らくそれらはまた保存された機能単位を含むことを示唆 している。 Ｄｅｌｔａ相互作用は、再びカルシウムイオン−依存性の態様である。 ７．３．結論 我々は、上述の第６節に記載したインビトロＳ２細胞凝集アツセイを使用して、 遺伝子Ｎｏｔｃｈ及びＤｅｌｔａの蛋白質生成物の間の相互作用の研究を続けた 。Ｎｏｔｃｈの細胞外ドメインの広範な欠失分析に基づいて、我々はＥＧＦ−相 同性の繰り返し１１及び１２を含むＮｏｔｃｈのドメインはＮｏｔｃｈ−Ｄｅｌ ｔａ−媒介凝集にとって必要であり、かつ十分であること、及び、このＤｅｌｔ ａ結合能力はアフリカッメガエルのＮｏｔｃｈの同一の２個のＥＧＦ繰り返しに おいて保存されていることを示している。凝集はＮｏｔｃｈのＥＧＦ繰り返し１ １及び１２を写像しているということの我々の発見は、ＮｏｔｃｈのＥＧＦ繰り 返しはまた特定の蛋白結合ドメインとして機能するということを示している。 最近の研究によれば、特定のコンセンサス配列を含むＥＧＦ領域はＣａ”＋イオ ンを結合しつることが示されている（モリタら、　１９８４、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ 、　Ｃｅｈｍ、　２５９．５６９８−５７０４　；スゴら、　１９８４．　Ｊ、 　Ｂｉｏｌ。 Ｃｈｅｍ、２５９．　５７０５−５７１０；　リーら、１９８８．　ＥＭＢＯＪ 、７．　２０５３−２０６１゜ハンドフォルトら、　１９９０．　ＥＭＢＯＪ、 　９．４７５−４８０）。実際に繰り返し１１及び１２を含め、Ｎｏ　ｔ　ｃｈ におけるＥＧＦ繰り返しの約半分はこのコンセンサスに従っている。我々はトラ ンスフェクトされたＳ２細胞のＮｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ介在凝集のために外因性 のｃａ＋＋が必要であることを示した（第６節；フエーホンら、　１９９０．　 Ｃｅ１１．６１．５２３−５３４）。我々は我々の欠失構築物のサブセットを試 験し、そして、ＥＧＦ繰り返し１１及び１２（７）みが（＃３２　ΔＥＣＮ＋Ｅ ＧＦ　（１１−１２））Ｎｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ相互作用のＣａ”＋依存性を維 持するノニ十分であることを見い出した。 ＮｏｔｃｈとＤｅｌｔａの間の遺伝子相互作用はそれらの蛋白生成物の間で用量 感受性相互作用を反映しうるということを多くの研究が示唆している。遺伝子研 究によればＮｏｔｃｈ及びＤｅｌ　ｔａの相対的遺伝子用量は通常の成長にとり 重要であることが示されている。例えば、キュ（Ｘｕ）らは、　（１９９０，Ｇ ｅｎｅｓ　Ｄｅｖ、　４．４６４−４７５）、Ｄｅｌｔａニオケルヌル（ｎｕｌ ｌ）変異はＥＧＦ繰り返し内のミスセンス変異と相関する一層のＮｏｔｃｈ変異 である、アブラブテックス（Ａｂｒｕｐｔｅｘ　：　Ａｘ）対立遺伝子のへテロ 接合性（ｈｅｔｅｒｏ−ｚｙｇｏｕｓ）の組み合わせの間で致死相互作用を抑制 しうろことを見い出している（ハートレーら、１９８７．　ＥＭＢＯＪ、　６． ３４０７−３１４７．ケーツーら、１９８７．　Ｍ。 １、　Ｃｅ１ｌ　８ｉｏ＋、　６．３０９４−３１０８）　。我々がＮｏｔｃｈ −Ｄｅｌｔａ及びｏｅｔｔａ−Ｄｅｌｔａ会合の両方を観察していることを記載 したインビトロ相互作用（第６節参照）は、Ｄｅｌｔａへの結合に対するＮｏｔ ｃｈとＤｅＩｔａの間の競争的相互作用は、観察された遺伝的相互作用に対する 根元的な基礎を反映し得ることを意味する。さらに、我々は組織培養及び胚細胞 抽出物の両方からＮｏｔｃｈ及びＤｅｌｔａを共免疫沈澱（ｃｏｉｍｍｕｎｏｐ ｒｅｃｉｐｉ　ｔａｔｅ）させることができた（第６節参照）が、これはこの２ 個の蛋白がインビボで会合する可能性を示している。加えて、胚におけるＮｏｔ ｃｈ及びＤｅｌｔａ発現パターンのｍＲＮＡＲＮＡインシラｎ　５ｉｔｕ）分析 は、この２つの発現は重複するが、同一ではないことを示唆している　（コブジ ンスキー及びムスカビッチ、１９８９．　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１０７．６ ２３−６３６；　ハートレーら、　１９８７、　ＥＭＢＯＪ、　６．３４０７− ３４１７）　、最近になって、Ｎｏｔｃｈ蛋白発現の詳細な抗体分析は、Ｎｏ　 ｔ　ｃｈ発現は従前の研究が示していたよりは、組織及び細胞下レベルにおいて 一層限定的であることを明らかにしている（ジョナサンら、１９８９．　Ｊ、　 Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１０９．２４２７−２４４０　；　キッドら、１９８９ ．　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｗ、３．　１１１３−１１２９）。 アフリカッメガエルのＮｏｔｃｈ相同体からの同一の２個のＥＧＦ繰り返しが組 織培養細胞においてＤｅｌｔａとの相互作用を介在しうるという我々の発見は、 類似の機能がインビボで保存されるであろうことを強く示している。これらの２ 個のＥＧＦ繰り返しはインビトロにおいては十分であるが、もちろんインビボで はより多くのＮｏｔｃｈ分子がＮｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ相互作用を促進するため に必要であるかもしれないことはありうる。事実、我々は、Ｄｅｌｔａ結合部位 が幾つかのＡＸ変異が落ち着くことが示されていたＥＧＦ繰り返しの位置決めを しないことを知るための２つの理由によりやや驚かされたが、その第１の理由は Ａｘ対立遺伝子とＤｅｌｔａ変異の間の相互作用を示している遺伝子スクリーン のためであり（Ｘｕら、。 １９９０、　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ、４．４６４−４７５）、第二には、成る種の Ａｘ対立遺伝子がＥＧＦ繰り返しの推定上のＣａ″“結合コンセンサス内におい て一個のアミノ酸と会合することを示した配列分析のためである。 例えば、ＡＸ”変異はＥＧＦ繰り返し２９をＣａ”＋結合コンセンサスに変えた が、ＡｘＱｅ２変異はＥＧＦ繰り返し２４をコンセンサスから離れたものとした 。インビボにおいてＮｏｔｃｈ蛋白のこれらの領域はＤｅｌｔａ及び／又は他の 蛋白のいずれかとの相互作用に関連するかもしれないことはありうるが、このこ とは我々の細胞培養アッセイによっては正確にはモデル化できなかった。 ＮｏｔｃｈのＥＧＦ繰り返し１１及び１２へＤｅｌｔａ結合領域をインビトロで マツピングすると、Ｎｏ　ｔ　ｃｈの構造領域に対して機能を最初に割り当てる ことが説明される。事実、種々の欠失構造物は、それらが置かれた状態とは独立 に、これらの２個のＥＧＦ繰り返しがモジュール単位として機能することを示唆 している。このため、残りの３４個のＥＧＦ繰り返し又は３個のＮｏｔｃｈ　／ 　ｆｉｎ−１２繰り返しは、いずれも機能するＥ　Ｇ　Ｆ　１１及び１２にとっ て必要な構造的フレームワークを確立するのに必要でないように思われる。興味 あることに、はとんど逆の効果が観察された。我々の凝集アッセイは相互作用の 力を測定するものではないが、結合部位をより小さなフラグメントに狭めれば狭 める程、Ｄｅｌｔａ発現細胞と凝集するトランスフェクトされた細胞の能力を増 大させることが発見されたが、これは正常の隣接するＥＧＦ配列は現実に蛋白の 間の会合を妨害することを示している。構築物＃３ΔＣ１ａのバックグランドに おける（＃９．１６．１９．２３を比較されたい）又は構築物＃２５ΔＥＧＦの バックグラウンドにおける（＃２６．２７．２８を比較されたい）、２個の分離 した系列の構築物について、我々は凝集力の増大を観察しており、その結果、最 小の構築物（＃１９．２３．２８゜２９）が、−貫して野性型（＃Ｉ　ｐＭｔＮ Ｍｇ）のレベル以上に凝集する。 これらの結果は、周囲のＥＧＦ繰り返しはＥＧＦ繰り返し１１及び１２がＤｅｌ ｔａにアクセスする能力を限定するように作用し、そのことにより恐らくインビ ボにおいてＮｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ相互作用を調節している。 Ｎｏｔｃｈは、ショウジヨウバエが成長する間、ブレオトロビック（ｐｌｅｏｔ ｒｏｐｉｃ）な役割を果たすと言われてきた構造的な複合トランスメンブラン蛋 白をコード化する。ＥＧＦ繰り返し１１及び１２が少なくとも細胞培養時にＤｅ ｌｔａと相互作用をするのに十分な独立したモジュール単位として機能するよう にみえるという事実は、直ちに、これらは成長の諸段階でＮｏｔｃｈと相互作用 する他の蛋白に対するモジュール結合領域をも形成しうるという仮説の役割に疑 問を与える。 アフリカッメガエルのＮｏｔｃｈに加えて、Ｃ，エレガンス（ｅｌｅｇａｎｓ） の成長の開成る細胞の死の特定化に関与する細胞−細胞相互作用に機能すると考 えられた２つの遺伝子、１ｉｎ−１２及びｇｌｐ−１は、ショウジヨウバエ及び アフリカッメガエルのＮｏｔｃｈに構造的に極めて類似するＥＧＦ相同のトラン スメンブラン蛋白をコード化する。 ４つの蛋白はすべてＥＧＦと相同の繰り返しをもち、１個のトランスメンブラン 領域の細胞外領域において他の３個のシスティンに富んだ繰り返しくＮｏｔｃｈ 　／　１ｉｎ−１２繰り返し）、及び細胞内ドメインで６個のｃｄｃｌｏ／アン キリン（ａｎｋｙｒｉｎ）繰り返しが続いている。配列比較及び我々のＤｅｌｔ ａ結合アッセイの両方によれば、ショウジヨウバエＮｏｔｃｈの直接の機能的対 照物をコード化するように思われるアフリカッメガエルのＮｏｔｃｈとは異なっ て、ｆｉｎ−１２及びｇｌｐ−１は多分同じ遺伝子ファミリーの明確なメンバー をコード化する。予想した蛋白生成物のｆｉｎ−１２及びｇｌｐ−１をＮｏｔｃ ｈと比較すると、構造上のモチーフの全体的に類似した組織にもかかわらず、特 別の差異が明らかである。最も明らかな差異は、アフリカッメガエル及びショウ ジヨウバエのＮｏｔｃｈの両方とも３６個のＥＧＦ繰り返しを有するのに比べて 、１ｉｎ−１２及びｇｌｐ−１蛋白はそれぞれ僅か１３及びｌＯのＥＧＦ繰り返 しを含むことである。加えて、線虫類の遺伝子においては、ＥＧＦ繰り返しの配 列は最初のＥＧＦ繰り返しの後で、Ｎｏｔｃｈにはない明らかに伸長した配列に より中断されている。さらに、我々がＮｏｔｃｈのＥＧＦ繰り返し１１及び１２ として定義したＤｅｌｔａ結合ドメインに関して、Ｃａ”＋結合コンセンサス配 列を示すｆｉｎ−１２又はｇｌｐ−１蛋白における２個の隣接するＥＧＦ繰り返 しが存在せず、さらに、ＮｏｔｃｈのＥＧＦ繰り返し１１及び１２に極めて類似 性を示す２個の隣接する繰り返しがないことは、再び、ｆｉｎ−１２及びｇｌｐ −１遺伝子生成物が恐ら＜　Ｎｏｔｃｈとは機能的に異なることを示唆する。 Ｎｏ　ｔ　ｃｈのＥＧＦ繰り返し１１及び１２は別個のＤｅｌｔａ結合単位を形 成するという我々の知見は、各々のＥＧＦ繰り返し又は繰り返しの小さなサブセ ットは、恐らく他の蛋白との直接相互作用を通じて、成長の間独特の役割を果た し得るという考えを支持する最初の具体的な証拠を示す。Ｄｅｌｔａ及び５ｅｒ ｒａｔｅ　（Ｓｅｒｒａｔｅ　：後述の第８．３．４節を参照）の粘着領域の間 に見られる相同性は、５ｅｒｒａｔｅの相同である部位はそれが他のトポリズミ ック蛋白への結合を媒介するという点において“粘着性”であることを示唆する 。加えて、スカブラス　（ｓｃａｂｒｏｕｓ）遺伝子、これはフィブリノーゲン に類似して分泌蛋白をコードするが、はＮｏｔｃｈと相互作用可能である。 ＥＧＦ繰り返しに加えて、他の構造上のモチーフの多数のコピーが一般に広範の 蛋白で生じる。その１つの例はｃｄｃｌＯ／アンキリンモチーフであり、これの ６個のコピーはＮｏｔｃｈの細胞内領域で見い出されている。アンキリンはこれ らの繰り返しの２２を含む。 恐らく、構造上のモチーフの反復する配列は、一般に、一連のモジュール蛋白結 合単位の線形アンセンブリ−を表わす。これらの結果をＮｏｔｃｈの既知の構造 的、遺伝的及び成長の複雑性と一緒にしてみると、Ｎｏｔｃｈは正確に制御され た時間的及び空間的パターンにより成長の間多くの異なるリガンドと相互作用す るのかもしれない。細胞骨格蛋白及び細胞質蛋白は細胞内ｃｄｃｌＯ／アンキリ ンモチーフにより介在されることができるのに対し、細胞外蛋白質との相互作用 はＥＧＦ及びＮｏｔｃｈ　／　ｆｉｎ−１２繰り返しにより介在されうる。 ８、Ｄｅｌｔａのアミノ末端はＮｏｔｃｈ及びＤｅｌｔａと相互作用するＥＧＦ −結合領域である。 Ｎｏｔｃｈとのへテロタイプの相互作用及びホモタイプのＤｅｌｔａ相互作用に 必要なりｅｌｌ＆の配列を詳述するために、野性型及び変異型Ｄｅｌｔａ蛋白を 発現するように企図された培養細胞の凝集が用いられた。我々は、Ｄｅｌｔａ細 胞外ドメインのアミン末端かへテロタイプ　（Ｄｅｌｔａ−Ｎｏｔｃｈ）及びホ モタイプ（Ｄｅｌｔａ　−Ｄｅｌｔａ）の相互作用にＤｅｌｔａが関与するため に必要かつ十分であることを見い出した。我々はＤｅｌｔａのアミノ末端はＥＧ Ｆモチーフ−結合ドメイン（ＥＢＤ）であると推測しており、ＮｏｔｃｈＥＧＦ 様配列がＤｅｌｔａとのへテロ型の相互作用を介在するのに十分であることが仮 定される。ＤｅｌｔａＥＢＤは明らかに２個の活性：　ＥＧＦ−関連配列を結合 する能力及び自己会合する能力を有する。我々は、また、ＤｅｌｔａはＮｏｔｃ ｈを発現する培養細胞により取り込まれることを見い出しているが、これはこれ らの蛋白がｉｎ　ｖｉｖｏで相互作用するメカニズムを反映しているかもしれな い。 これらの実験で使用されたＳ２ドロソフイーラセルラインは（シュナイダー、１ ９７２．　Ｊ、　Ｅｍｂｒｙｏｌ、　Ｅｘｐ、　Ｍｏｒｐｈ、　２７．３５３− ３６５）、第６節に記載されているようにして、増殖させた。 ８、１．２．　免疫プローブ 免疫組織化学は、上記第６節に記載されたようにして、又は、この方法を僅かに 変更して実施された。使用した抗血清及び抗体には、次のものが含まれる。第４ 番目から第９番目のＥＬＲｓまて広がるＤｅｌｔａ　Ｅ　Ｌ　Ｒ配列セグメント に対して産生されたマウスポリクローナルＤｅｌｔａ血清（上記第６節参照）： 同じＤｅｌｔａセグメントに対して産生されたラットポリクローナル抗Ｄｅｌｔ ａ血清（第６節参照）：第５番目から第１３番目のＥＬＲｓに広がるＮｏ　ｔ　 ｃｈＥＬＲ配列セグメントに対して産生されたラットポリクローナル抗−Ｎｏｔ ｃｈ血清；　Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインを認識するマウスモノクローナル抗体Ｃ Ｉ７．９Ｃ６（第６節参照）；及びショウジヨウバエ神経膠細胞の長い形態を認 識するマウスモノクローナル抗体ＢＰ−１０４（ホルシュら、　１９９０．　Ｎ ｅｕｒｏｎ　４．６９７−７０９）。 ８、１．３．　発現ベクター構築物 野性型Ｄｅｌｔａ　（ｐＭＴＤＩｌ）及び野性型Ｎｏｔｃｈ　（ｐＭＴＮＭｇ） を発現するプログラムに用いられる構築物は、上記第６節に記載されている。 変異型のＤｅｌｔａ蛋白の発現を指示する構築物は、ｐＭＴＤｌｌ、　Ｂｌｕｅ Ｓｃｒｉｐｔ＋にクローン化されたＤｌｌ　ｃＤＮＡ　（ｐＢｓＤＩｌ　：コブ ジンスキーら、、　１９８８．　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ、　２．１７２３−１７３ ５）　、及びメタロチオネインプロモーターベクターｐＲｍＨａ−３（ブンチら 、、　１９８８．　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、　１６．１０４３−１０６ １）にＩＢ？Ａ２５０　ｃＤＮＡが挿入されたものから成るｐＲｍＨａ　３−１ ０４　（Ａ、　Ｊ、ビーバー、個人的レター）、及びショウジヨウバエ神経膠細 胞の長い形態の発現を誘導できる支持体（ホルシュら、　１９９０．　Ｎｅｕｒ ｏｎ　４．６９７−７０９）を使用して産生された。 簡単に述べると、構築物は以下のようにして製造された：Ｄｅｌ（Ｓｃａ−Ｎａ ｅ）　−ｐＢｓＤｌｌを５ａｌｌ　（完全消化物）及び５ｃａｌ　（部分）で切 断し、ベクターを含有するフラグメントを分離する。 ｐＢｓＤｌｌをＮａｅｌ　（部分）と５ａｌｌ　（完全）で切断し、Ｄｅｌｔａ カルボキシル−末端コード化フラグメントを分離する。フラグメントを結合させ 、形質転換させ、そしてクローンを分離する。ＥｃｏＲＩ挿入断片を　ｐＲｍＨ ａ−３に転移させる。 Ｄｅｌ（Ｂａｍ−Ｂｇｌ）　−ｐＢｓＤｌｌをＢｇｌｌｌ　（完全）及び１１ａ ｍＨＩ　（部分）で切断し、末端をクレノーＤＮＡポリメラーゼで満たし、結合 させ、形質転換させ、クローンを分離する。ＥｃｏＲｌ挿入断片をｐＲｍＨａ− ３に転移させる。 Ｄｅｌ（ＥＬＲＩ−Ｅ！ＬＲ３）　−５−ＡＣＴＴＣＡＧＣＡＡＣＧＡＴＣＡＣ ＧＧＧ−３’（配列番号：２６）及び５°−ＴＴＧＧＧＴＡＴＧＴＧＡＣＡＧＴ ＡＡＴＣＧ−３’　（配列番号：２７）を用いてＤｌｌｃＤＮＡの塩基対２３６ −８３０をＰＣＲ−増幅させ、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼで処理し、５ｅａｌ　 （部分）及びＢａ１ｌｌ　（完全）で切断したｐＢｓＤＩ　１に結合させ、そし てフレノウＤＮＡポリメラーゼで末端をみたし、形質転換し、そしてクローンを 分離する。ＢａｍＨＩ−Ｓａｌ　ＩＤｅｌｔａカルボキシル−末端コード化フラ グメントをｐＲｍＨａ−３に転移させる。 Ｄｅｌ（ＥＬＲ４−ＥＬＲ５）　−ｐＢｓＤｌｌをＢｇｌｌｌで完全に、Ｐｓｔ ｌで部分的に消化した。５．６　ｋｂのベクターを含むフラグメントが分離され 、１００　Ｘモル過剰のオリゴヌクレオチド５′−ＧＡＴＣＴＧＣＡ−３′の存 在下Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼを使用して環状化し、形質転換してからクローンを分 離した。得られたＥｃｏＲ１挿入断片を次いでｐＲｍＨａ−３へ転移させた。 Ｔｅｒ（Ｄｄｅ）　−ｐＢｓＤｌｌをＤｄｅｌ　（部分）で切断し、フレノウＤ ＮＡポリメラーゼで末端をみたし、１００×モル過剰の５’　−ＴＴＡＡＧＴＴ ＡＡＣＴＴＡＡ−３’　（配列番号＝２８）と結合させ、形質転換させ、そして クローンを分離する。ＥＣｏＲｌ挿入断片をｐＲ＋＋＋Ｈａ−３に転移させる。 Ｉｎ５（Ｎａｅ）Ａ　−ｐＭＴＤｌｌをＮａｅｌ　（部分）で切断し、ベクター 含有フラグメントを分離し、　１００Ｘモル過剰の５’　−ＧＧＡＡＧＡＴＣＴ ＴＣＣ−３’（配列番号：２９）と結合させ、形質変換させ、そして、クローン を分離する。 ＮＡＥ　Ｂ　−ｐＭＥ！ＤｌｌをＮａｅｌで部分的に消化し、長さが約５．８　 ｋｂの一時的に直鎖状となった環状の集団を分離した。このフラグメントは、１ ００×モル過剰のオリゴヌクレオチド５’　−ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＣ−３゜ （配列番号：２９）の存在下でＴ４　ＤＮＡリガーゼを使用して再び環状化し、 形質転換し、リンカ−の多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）挿入断片を含むクローン（Ｎ ＡＥ　Ａ）を分離した。ＮＡＰ　ＡはＢｇｌｌｌで完全に消化し、生成した０、 　４　ｋｂ及び５．４　ｋｂのフラグメントを分離し、結合させ、形質転換し、 そして、クローンを分離した。 Ｉｎ５（Ｓｔｕ）　−ｐＭＴＤｌｌを５ｔｕｌで切断しく完全）、ベクター含有 フラグメントを分離し、　１００×モル過剰の５’　−ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣ Ｃ−３゜（配列番号：２９）と結合し、形質転換し、クローンを分離する。 ＳＴＵ　Ｂ　−ｐＭＴＤｌｌを５ｔｕｌで完全に消化し、生成した５、　８　ｋ ｂのフラグメントを分離した。このフラグメントは１００×モル過剰のオリゴヌ クレオチド５’−ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＣ−３°（配列番号＝２９）の存在下 でＴ４　ＤＮＡリガーゼを使用して再び環状化し、形質変換させ、そしてリンカ −の多重挿入断片を含むクローン（ＳＴＵ　Ａ）を分離した。ＳＴＵ　ＢはＢｇ ｌｌｌで完全に消化し、そして得られた０、６ｋｂ及び５．２ｋｂフラグメント を分離し、結合させ、形質変換させ、クローンを分離した。 ＮＧ　１　−　ｐＲｍＨａ　３−１０４をＢｇｌｌｌ　（完全）とＥｃｏＲｌ　 （完全）で切断し、ベクター含有フラグメントを分離する。Ｉｎ５（Ｎａｅ）Ａ をＥｃｏＲＩ　（完全）及びＢｇｌｌｌ　（完全）で切断し、ａｅｔｔａアミノ −末端コード化フラグメントを分離する。フラグメントを結合し、形質転換させ 、そしてクローンを分離する。 ＮＧ２　−　ｐＲａ＋Ｈａ　３−１０４をＢｇｌｌｌ　（完全）及びＥｃｏＲＩ 　（完全）で切断し、ベクター含有フラグメントを分離する。Ｄｅｌ（ＥＬＲＩ −ＥＬＲ３）をＥｃｏＲ［（完全）及びＢｇｌｌｌ　（完全）で切断し、Ｄｅｌ ｔａアミノ−末端コード化フラグメントを分離する。フラグメントを結合し、形 質転換し、そしてクローンを分離する。 ＮＧ３　−　ｐＲｍＨａ　３−１０４をＢｇｌｌｌ　（完全）及びＥｃｏＲＩ　 （完全）で切断し、ベクター含有フラグメントを分離する。ｐＭＴＤ　１１をＥ ｃｏＲＩ　（完全）及びＢｇｌｌｌ　（完全）で切断し、Ｄｅｌｔａアミノ−末 端コード化フラグメントを分離する。フラグメントを結合し、形質転換腰クロー ンを分離する。 ＮＧ４　−　ｐＲｍＨａ　３−１０４をＢｇｌ［ｌ　（完全）及びＥｃｏＲｌ　 （完全）で切断し、ベクター含有フラグメントを分離する。Ｄｅｌ　（Ｓｃａ− Ｎａｅ）をＩｌ！ｃｏＲＩ　（完全）及びＢｇｌｌｌ　（完全）で切断し、Ｄｅ ｌｔａアミノ−末端コード化フラグメントを分離する。フラグメントを結合させ 、形質転換し、そしてクローンを分離する。 ＮＧ５　−　次のようにしてＤｅｌ（Ｓｃａ−３ｔｕ）を生成する：　ｐＭＴＤ ｌｌを３ｃａｌ　（完全）及びＳｔｕ［（完全）で切断し、５ｃａｌ−８ｃａｌ アミノ−末端コード化フラグメント及び５ｔｕｌ−３ｅａｌカルボキシルド化フ ラグメントを分離し、結合させ、形質転換させ、そしてクローンを分離する。Ｄ ｅ　ｌ　（Ｓｅａ−Ｓ　ｔｕ）をＥｃｏＲｌ　（完全）及びＢｇｌｌｌ（完全） で切断し、Ｄｅｌｔａアミノ−末端コード化フラグメントを分離する。ｐＲｍｌ ＋ａ　３−１０４をＢｇｌｌｌ　（完全）及びＲｃｏＲＩ　（完全）で切断し、 ベクター含有フラグメントを分離する。フラグメントを結合させ、形質転換し、 そしてクローンを分離する。 種々のＤｅｌｔａ変異体の配列内容を第■表に示す。第■表（こ定義されたＤｅ ｌｔａ変異体の模式的一覧図は第９図（こ示されてＩ，）る。 （来貢以下余白） 第　■　表 野性型　１−２８９２Ａ１−８３３ Ｄｅｌ（Ｂａｎ−Ｂｇｌ）　１−７１コ／１１］４−２８９２　１−１９１／コ コ２−８コ３Ｄｅｌ（ＥＬＲＩ−ＥＬＲコ）　ｌ−８：１０／１１コ４−２８９ ２　１−２コＯｌココ２−８ココＤｅｌ（ＥＬＲ４−ＥＬＲ５）　１−１１コア ／１４０５−２８９２　Ｌ−３コ２／４２２−８ココエｎｓ（ＮａｅｌＡ　４− ７ココ／　（ＧＧＡＡＣ；ＡＴＣＴＴＣＣ）、ｌ’／　１（９７／　（ＲＫＩＦ ）。 ７〕４−２８９２”　１９Ｂ−８３３ Ａ　Ｄ１＋　ｃＤＮＡの順序（第１２図）に対応してＤｅｌｔａ配列を調整する 。 Ｂ　挿入されたリンカ−の正確な数は、この構築物のためには決定されていない 。 Ｃ神経膠細胞（ｎｅｕｒｏｇｌｉａｎ）を調整する（ビーバーら、　１９８９゜ Ｃｅ１１５９．４４７−４６０；　ホルッシュら、　１９９０．　Ｎｅｕｒｏｎ 　４．６９７−７０９）Ｄｅｌｔａ−神経膠細胞のキメラに存在するヌクレオチ ド配列はＩＢ７Ａ−２５０ｃＤＮＡの配列に相当しく第１３図、配列番号＝５） ボールドフェース型で示されている。 Ｄ　神経膠細胞アミノ酸配列は２Ｂ７Ａ−２５０ｃＤＮＡヌクレオチド配列の概 念的翻訳に由来しており（第１３図、配列番号：５）ボールドフェース型で示さ れている。 Ｅ　配列番号：２８ Ｆ　配列番号：２９ 細胞のトランスフェクション及び凝集は、上記第６節に示されるようにして、又 は、これを多少変更したものにより実施した。 ８．２．結果 ８．２，１．　Ｄｅｌｔａ細胞外領細胞外ノドメイン−末端配列は、Ｎｏｔｃｈ とのへテロ型の相互作用にとり必要かつ十分である。 我々は、あるＤｅｌｔａ変異体は細胞表面に効率的に局在しえないかもしれない と予想したので、我々は異なるトランスフェクションにおいてＤｅｌｔａ発現構 築物のインプット量を変えながら、野性型Ｄｅｌｔａの発現レベルとＮｏｔｃｈ −発現細胞との凝集の程度の間の関係を調査した。我々は、このアッセイにおい てへテロ型Ｄｅｌｔａ−Ｎｏｔｃｈの相互作用は１０倍レベルのＤｅｌｔａイン プットにのみ僅かに依存することを見い出した（第９Ａ図）。試験した範囲内で のへテロ型相互作用の確からしさ及び我々が用いたＤｅｌ　ｔａ変異体のそれぞ れがトランスフェクトされた細胞において実質的な表面蓄積を示すという我々の 観察を仮定すると、一定のＤｅｌｔａ変異体かへテロ型の凝集を支持できないこ とは、ヘテロ型凝集における表面発現の減少したレベルの影響とは全く異なって 、この変異体により示される機能の欠損を多分反映しているものと我々は推測す る。 Ｄｅｌｔａ変異体及び野性型Ｎｏｔｃｈにより介在されるヘテロ型凝集実験の結 果は、第Ｖ表に示されている。 （来貢以下余白） へ０ロ０ロロｏｒ＋１マロロロロ ヘ　−ヘへ ００ロロロロロさｕ″ｌへｎロロＯ ｎ　Ｉ＋１−マ Ａ　４個以上の細胞を含有する凝集物中の発現細胞の合計数Ｂ　神経膠細胞を基 にする構築物（ＮＧｎ）を発現する細胞は、神経膠細胞の細胞内領域を認識する モノクローナル抗体を使用して検出された（材料及び方法を参照） Ｃ（Ｈ）は２５ｍ１のエーレンマイヤーフラスコ中で細胞が凝集したことを示し ており、（Ｂ）は細胞が１２−ウェルのマイクロ滴定プレート中で凝集したこと を示す（材料及び方法を参照）。 Ｄ　凝集体及び非凝集体における個々の細胞型のデータ（即ち、Ｄｅｌｔａ＋及 びＮｏｔｃｈ　”　）は記録しなかった。 Ｄｅｌｔ＆アミノ酸（ＡＡ）　１−２３０は、Ｎｏｔｃｈとの相互作用にとって 十分であると定義されている、現在最小の配列間隔である。これは、ＮＧ２−Ｎ ｏｔｃｈ凝集の成功に基づく。この間隔内で、Ｄｅｌｔａ　ＡＡ１９８−２３０ は重要である。というのは、ＮＧＩ構築物におけるこれらの欠失がＮＧ２構築物 において観察されたＮｏｔｃｈ−結合活性を不活性化するからである。また、こ の間隔内において、Ｄｅｌｔａ　ＡＡ　３２−１９８が重要である。なぜならば ＮＧ４構築物内のこれらの欠失は、また、ＮＧ３構築物において観察されたＮｏ ｔｃｈ−結合活性を不活性化するからである。Ｄｅｌｔａ　ＡＡ　１９２−２３ ０の重要性は、また、ＡＡ　２３１−３３１を除いてすべてのＤｅｌｔａアミノ 酸を含むＤｅｌ（ＥＬＲＩ−ＥＬＲ３）変異体がＮｏｔｃｈ結合活性を有するの に対して、ＡＡ　１９２−３３１を除きすべてのＤｅｌｔａアミノ酸を含む、Ｄ ｅｌ　（Ｂａｍ−Ｂｇｌ）変異体がＮｏｔｃｈ−結合活性について、明らかに不 活性化されたという観察によっても支持される。 Ｄｅｌｔａ　ＡＡ　１９７／１９８の近傍におけるコンフォメーション及び／又 は−欠配列は明らかに重要である。なぜならばこれら２つの残基の間において、 Ｉｎ５（Ｎａｅ）Ａ構築物のようにテトラペプチドＡｒｇ−Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｐ ｈｅ　（−文字コードにおける（例えば、レーニンガーら。 １９７５、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、第７２頁）　、ＲＫＩＦ）　 （配列番号：３０）を多量体挿入すると、野性型Ｄｅｌｔａで観察されたＮｏｔ ｃｈ結合活性を不活性化したからである。 加えて、Ｄｅｌ（ＥＬＲＩ−ＥＬＲ３）構築物が凝集を支持したという観察は、 ＥＬＲＩ−ＥＬＲ３はＤｅｌｔａ−Ｎｏｔｃｈ相互作用にとり必要でないという ことを意味する。　Ｄｅｌ（ＥＬＲ４−Ｉ！ＬＲ５）構築物が凝集を支持したと いう観察は、ＥＬＲ４及びＥＬＲ５はＤｅｌｔａ−Ｎｏｔｃｈ相互作用にとって 必要でないことを意味し、そして、Ｔｅｒ（Ｄｄｅ）構築物が凝集を支持したと いう観察は、Ｄｅｌｔａ細胞内ドメインはＤｅｌｔａ−Ｎｏｔｃｈ相互作用にと り必要でないことを意味する。 ８．２．２．　Ｄｅｌｔａ細胞外領域におけるアミノ−末端配列は、ホモ型相互 作用にとって必要かつ十分である Ｄｅｌ　ｔａ変異体により介在されるホモ型凝集実験の結果は、第■表に示され ている。 （来貢以下余白） 第■表 Ａ　（Ｈ）は２５ｍ１エーレンマイヤーフラスコ中で凝集した細胞を示し；（Ｂ ）は細胞が１２−ウェルのマイクロ滴定プレート中で凝集したことを示す。 Ｂ　トランスフェクトされた細胞は凝集条件下で１晩培養され、次いで誘導物質 の存在下適当量の対数期Ｓ２細胞に希釈され、凝集条件下でさらに４から６時間 培養された。 Ｃ誘導物質が添加されたトランスフェクト化細胞は適当な容積の対数期Ｓ２細胞 に希釈され、これに誘導物質が添加され、そして細胞混合物は凝集条件下で１晩 培養された。 全長さのＤｅｌｔａ蛋白からＤｅｌｔａＡＡ　３２−１９８を削除したもの［Ｄ ｅｌ（Ｓｅａ−Ｎａｅ）　］又はＤｅｌｔａ　ＡＡ　１９２−３３１を削除した もの［Ｄｅｌ（Ｒａｍ−Ｂｇｌ）］は、Ｄｅｌｔａ−Ｄｅｌｔａ相互作用を消失 する。Ｄｅｌｔａ　ＡＡ　２３１−３３１の欠失［Ｄｅｌ（ＥＬＲＩ−ＥＬＲ３ ）コはＤｅｌｔａ−Ｄｅｌｔａ相互作用を消失しなかった。それゆえ、Ｄｅｌｔ ａ　ＡＡ　３２−２３０の間の配列はＤｅｌｔａ　−Ｄｅｌｔａ相互作用にとり 必要である。 Ｄｅｌｔａ　ＡＡ　１９７／１９８の近傍のコンフォメーション及び／又は第一 次配列はＤｅｌｔａ−Ｄｅｌｔ＆相互作用にとって明らかに重要である。 なぜならば、これらの２つの残基の間にＩｎ５（Ｎａｅ）Ａ構築物のようにテト ラペプチド−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｐｈｅ−（配列番号＝３０）を多重挿入 すると、Ｄｅｌｔａ−Ｄｅｌｔａ相互作用を不活性化したからである。 加えて、Ｄｅｌ（ＢＬＲＩ−ＥＬＲ３）構築物が凝集を支持できたという観察は 、ＥＬＲＩ−Ｅｌ、Ｒ３がＤｅｌｔａ−Ｄｅｌｔａ相互作用にとり必要でないこ とを意味する；　Ｄｅｌ（ＥＬＲ−ＥＬＲ５）構築物が凝集を支持したという観 察は、Ｄｅｌｔａ−Ｄｅｌｔａ相互作用にとってＥＬＲ４及びＥＬＲ５は必要で ないことを意味し、そして、Ｔｅｒ（Ｄｄｅ）構築物が凝集を支持したという観 察は、Ｄｅｌｔａ細胞内ドメインはＤｅｌｔａ−Ｄｅｌｔａ相互作用にとり必要 でないことを意味する。 種々の構築物によるヘテロ型及びホモ型のアッセイについての結果の概要を第Ｖ ｌ−Ａ表に示す。 第ＶＩ−Ａ表 Ｄｅｌｔａ　Ｎｏｔｃｈ　Ｄｅｌｔａ 野性型　３３±１２ｅ２６＋１１°　２７＋１０゜Ｄｅ　ｌ　（Ｓｃａ−Ｎａｅ ）　ＯＯＯＤｅｌ（Ｂａｎ−Ｂｇｌ）　０．４＋０．４　０．６±０．６　０Ｄ ｅｌ（ＥＬＲＩ−ＥＬＲ３）　２５±１１’　１５±３４３２±１５’Ｄｅｌ（ ＥＬＲ４−ＥＬＲ５）　１７±２　１８±２　１３±２Ｔｅｒ（Ｄｄｅ）　２２ ±１　１８±２　１８±３ＮＡＥ　Ｂ　２５＋　５　０　２７＋　７ＳＴＵ　Ｂ 　Ｏ００ ＮＧＩ　０　０　０ ＮＧ２　１３±１　２３±６　４±１６ＮＧ３　１６±　１　１３±　１　２７ ±１７ＮＧ　４　０　０　０．５±０．３ ａ：４個以上の細胞の凝集物におけるＤｅｌｔａ又はＮｏｔｃｈ細胞の平均分数 （％）（士標準誤差）。他に記載されていない場合、Ｎ：３複製である。 ｂ：４個以上の細胞の凝集物におけるＤｅｌｔａ細胞の平均分数（％）（士標準 誤差）。他に記載されていない場合、　Ｎ＝３複製である。 Ｃ：Ｎ・５複製。 ｄ：Ｎ＝４複製。 ８、２．３．　ヘテロ型及びホモ型相互作用に関連するＤｅｌ　ｔａ配列は定量 的に異なる ヘテロ型及びホモ型相互作用のための修復されたＤｅｌ　ｊａ配列のそれぞれの 特性は、さらに短い、イン−フレーム、翻訳可能なリンカ−挿入物がＤｅｌｔａ アミノ末端へ導入されたＤｅｌｔａ変異体（即ち、ＮＡＥ　Ｂ及びＳＴＵ　Ｂ　 、第９図、第ＶＩ−Ａ表）を使用して定義された。Ｄｅｌｔａ残基１３２（Ａ） をペンタペプチドＧＫＩＦＰ（ＳＴＵ　Ｂ変異体）で置き換えると、Ｄｅｌｔａ アミノ末端のへテロ型及びホモ型の相互作用活性が不活性化する。このことは、 これらの２個の異なる相互作用に必要な幾つかのＤｅｌｔａ配列は、残基１３２ の近傍に一致し、そこにあることを示唆している。一方、Ｄｅｌｔａ残基１９８ 及び１９９の間でテトラペプチドＲＫＩＦを挿入すると（ＮＡＥＢ変異体）　、 Ｎｏｔｃｈとへテロ型相互作用を介在するためのＤｅｌｔａアミノ末端の能力を 消失するが、ホモ型の相互作用を介在するための変更されたアミノ末端の能力に 対しては明らかな作用を有していない。ＮＡＥ　Ｂ挿入がＤｅｌｔａアミノ末端 の２つの活性のうちの１つに対してのみ影響するということは、ヘテロ型及びホ モ型相互作用を介在するＤｅＩｔａ配列は一致するものの、量的に異なることを 意味する。 ８．２．４．　ＤｅｌｔａはＮｏｔｃｈを発現する細胞により取り込まれる多く のへテロ型凝集実験の途中で、我々はときどき、Ｄｅｌｔａではなくて、Ｎｏｔ ｃｈを発現するようにプログラムされた細胞内でＤｅｌｔａ蛋白が見い出しうろ ことを知った。我々は、Ｄｅｌ　ｔａ又はＮｏｔｃｈのいずれかを発現するよう プログラムしている発現構築物で独立にトランスフェクトされた別個の８２細胞 の集団を最初に混合することにより、ヘテロ型凝集アッセイを行う。しかしなが ら、我々はしばしばヘテロ型凝集物中に見い出されたＮｏｔｃｈ発現細胞内でＤ ｅｌｔａ−特異的抗血清を使用するとＤｅｌｔａの小さい斑点の染色が生ずるの を知った。我々の観察は、Ｄｅｌｔａは細胞表面で直接Ｎｏ　ｔ　ａｂに結合し 、続いて、細胞表面からエンドサイト−シスによりＤｅｌｔａ−Ｎｏｔｃｈ複合 体が通過するということに合致している。 ８．３．議論 ８．３．１．　ＥＧＦに関連しないアミノ−末端配列は、Ｄｅｌｔａ及びＮｏｔ ｃｈの間の相互作用に関与している我々は、Ｄｅｌｔａ−Ｎｏｔｃｈ相互作用を 介在させるのに必要がっ十分である領域を、Ｄｅｌｔａ細胞外ドメインのアミノ 近傍の領域内において定義するため、細胞凝集アッセイを使用した。欠失及び十 分な構築物の組み合わせによる機能分析によれば、この領域は、最大の場合、Ａ ＡＩからＡＡ　２３０にあることが明らかになった。この領域はＤｅｌｔａ細胞 外ドメインにあるいずれのＥＧＦ一様配列も含んでいないことは驚きである。Ｎ ｏｔｃｈとの相互作用のために必要とされる十分な間隔内の特定のＤｅｌｔａ配 列はＡＡ　１９８−２３０を含む。 なぜならば、これらの残基を欠失させるとＮｏｔｃｈ−結合活性が消失するから である。ＡＡ　３２−１９８の欠失もまたＮｏｔｃｈ−結合活性を不活性化する という事実は、この欠失の有害なインパクトはＡＡ　１９８の直近における付加 的なアミノ酸の除去によっても生じうるちので、ＡＡ　１９８に最も隣接するア ミノ配列が必要であることを示唆している。 Ｎｏｔｃｈとの相互作用にとって十分なりｅｌ　ｔａ内の配列は、それぞれのシ スティン残基の含量において異なる３個のサブドメイン−Ｎｌ、Ｎ２及びＮ３− にグループ化され得る（第１０図、配列番号：３）。Ｎｌ及びＮ３領域はそれぞ れ６個のシスティン残基を有するのに対して、Ｎ２領域は有しない。Ｎｌ及びＮ ３に存在するシスティンの数がそれぞれ等しいということは、これらのサブドメ インのそれぞれの構造は部分的には、特定のジスルフィド結合の形成により指図 されるという可能性が考えられる。Ｄｅｌｔａアミノ末端の広範囲の組織パター ンは、又、一般的にを椎動物のＥＧＦ受容体の細胞外ドメインのそれに類似して おり　（ラックスら。 １９８８、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　８．１９７０−１９７８）、 ＥＧＦと相互作用すると信じられているその配列は２個のシスティンに富んだサ ブドメインにより結合されている。 ８、３．２．　ホモ型相互作用及びホモ型へテロ型相互作用のために必要なりｅ ｌｔａ配列は、一致しているようにみえる我々の結果は、ホモ型Ｄｅｌｔａ相互 作用のために必須の配列は間隔ＡＡ　３２−２３０の間にあることを示している 。このアミノ近傍ドメイン内で配列を欠失させるか、又は付加的にアミノ酸を挿 入させると、独立で細胞凝集を促進させるためのＤｅｌｔａ変異体の能力を消失 させる。この結果、Ｄｅｌｔａ−Ｄｅｌｔａ相互作用のために必要な配列は、Ｄ ｅｌｔａ−Ｎｏｔｃｈ相互作用のために必要な配列と同じ蛋白の領域内に位置付 けられる。 ８．３，３．　Ｄｅｌｔａアミノ末端はＥＧＦ−結合モチーフを構成する上述の 実施例に記載の研究は、細胞凝集アッセイにおけるＤｅｌｔａ−Ｎｏｔｃｈ相互 作用のために必要なＮｏｔｃｈ配列が、Ｎｏ　ｔ　ｃｈ細胞外ドメインのＥＧＦ 一様繰り返し配列内に位置決めされることを明らかにしている。この知見は、Ｄ ｅｌｔａとＮｏｔｃｈはＮｏｔｃｈ内のＥＧＦ一様配列にＤｅｌｔａアミノ末端 が結合することにより相互作用を生じ、それゆえ、Ｄｅｌｔａ細胞外ドメインの アミノ末端はＥＧＦ−結合領域を構成することを意味している（第１１図）。 これらの結果は、また、ホモ型Ｄｅｌｔａ相互作用はＤｅｌｔａの細胞外ドメイ ンでＤｅｌｔａアミノ末端がＥ　Ｇ　Ｆ一様配列に結合することを必要とする可 能性を提起する（第１２図）。しかしながら、Ｄｅｌｔａ細胞外ドメイン内のＥ ＧＦ一様繰り返しのいずれも、Ｎｏｔｃｈの細胞外ドメイン内のいずれのＥＧＦ 一様繰り返しとも同一でない（第１３図、配列番号＝６；　ウォートンら、　１ ９８５．　Ｃｅ１ｌ　４３．５６７−５８１）。 これが事実と仮定して、もしＤｅｌｔａホモ型相互作用がＤｅｌｔａアミノ−末 端とＤｅｌｔａＥＧＦ〜様繰り返しの間の相互作用によって実際に介在されるな らば、ＤｅｌｔａＥＧＦ−結合領域は、少なくとも２個の異なるＥＧＦ一様配列 と相互作用する能力を有する。 ８．３．４．　Ｄｅｌｔａ−Ｎｏｔｃｈ相互作用に関連するＤｅｌｔａ配列は、 ５ｅｒｒａｔｅ蛋白中に保存される Ｄｅｌｔａ　（第１３図、配列番号＝６．及び第１５図、配列番号＝９）及び５ ｅｒｒａｔｅ　（フレミングら、　１９９０．　Ｇｅｎｅｓ　＆　Ｄｅｖ、　４ ．２１８８−２２０１；トーマスら、　１９９１．　Ｄｅｖｅｌ、　１１１．７ ４９−７０１）のアミノ末端からアミノ酸配列を整合させると、構造上の特性及 び配列組成の驚く程の保存がみられる。５ｅｒｒａｔｅ蛋白のＤｅｌｔａ　Ｎ　 １＝及びＤｅｌｔａ　Ｎ　３−相同ドメイン内に６個のシスティン残基が特別に 生じているように、Ｄｅｌｔａアミノ残基の一般のＮ１−Ｎ２−Ｎ３サブドメイ ン構造は、５ｅｒｒａｔｅのアミノ末端内でも観察される。２個の顕著な保存ブ ロックは、Ｄｅｌｔａ　ＡＡ　６３−７３　（８／１１残基が同一）及びＤｅｌ ｔａ　ＡＡ　１９５−２０６　（１０／１１残基が同一）に相当する。この間隔 に付加的にアミノ酸を挿入すると、Ｎｏ　ｔ　ｃｈ又はＤｅｌｔａに結合するＤ ｅｌｔａの能力を消失させることができることから、後者のブロックは特に興味 がある。 ８．３，５．　ＤｅｌｔａとＮｏｔｃｈの間のシス及びトランス相互作用（よＮ ｏｔｃｈバニμ免立酊歿翌浅μ友五旦八蕉兄ｏへ一−−−−−−Ｄｅｌｔａ及び Ｎｏｔｃｈの全体的構造の検討によれＩｔ’、　Ｄｅｌｔａ　−Ｎｏｔｃｈ相互 作用は、相互作用が対向する膜にある分子の開力１、又（ま同一の膜内にある分 子の間でなされるのかに依存して、Ｎｏｔｃｈ内の二個の領域のいずれかを有す るＤｅｌｔａ−結合ドメインの間の接触を含むことができることを示唆する（第 １１図）。細胞証集ア・ソセイ、これは恐らくは向かい合った膜にある分子の相 互作用を検出するものであるが、これはＤｅｌｔａＥＧＦ−結合ドメイン力＜Ｎ ｏｔｃｈ　ＥＧＦ一様繰り返し１１及びＩ２と相互作用することを示す（上言己 伊１を参照）。もしＥＧＦ一様モチーフの一列に並んだ配列力＜Ｄｅｌｔａ及び Ｎｏｔｃｈ蛋白内でロッド状の構造を形成するならＣｉ′（エンゲル、１９８９ 、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　２５１．１−７）、細胞表面からのＤｅｌｔａＥＧ Ｆ−結合ドメインの予測される置換は、恐ら＜　Ｎｏｔｃｈ　Ｅ　Ｇ　Ｆ−結合 繰り返し１−１０の固定した配列を収容するのに十分であろう。細胞表面からの ＤｅｌｔａＥＧＦ−結合領域の置換は、Ａｂｒｕｐｔｅｘ　突然変異体により影 響されるＮｏｔｃｔｉＥＧＦ一様繰り返しく２５−２９）の近傍：ここの領域を 置くことが可能であること（／ｈ−トレーら、　１９８７．　ＥＭＢＯＪ、６． ３４０７−３４１７．ケーレーら、１９８７．　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏ ｌ、　６゜３０９４−３１０８）　、かつ同じ膜内にあるＤｅｌｔａとＮｏｔｃ ｈ蛋白の相互作用について考慮することができることに注意すること（よまｔこ 、興味をそそる。 ８、３．６．　を椎動物におけるＤｅｌｔａ−Ｎｏｔｃｈ相互作用に類似の相互 想定すると、Ｄｅｌ　ｔａの相同体（Ｈｅｌｔａ７）がを椎動物に存在すること は確実にありうることであり、我々がショウジヨウバエで定義したＤｅｌｔａ− Ｎｏｔｃｈ及びＤｅｌｔａ−Ｄｅｌｔａ相互作用の定量的かつ分子的な性質が、 ヒトを含むを推動物中に高度に保存されているであろうことは、確実にあり得る ことである。かかる相同体は第５゜２節で記載したようにしてクローン化及び配 列決定され得る。 ９、Ｎｏｔｃｈ−３ｅｒｒａｔｅ相互作用を介在する配列我々は、Ｎｏｔｃｈと ５ｅｒｒａｔｅの間の新規な分子間相互作用を報告し、かつ、Ｄｅｌｔａと相互 作用を介在するＮｏｔｃｈの２個のＥＧＦ繰り返し、即ちＥＧＦ繰り返し１１及 び１２、はまた５ｅｒｒａｔｅ結合ドメインを構成することを示す。 Ｎｏｔｃｈと５ｅｒｒａｔｅが直接に相互作用するか否か試験するため、Ｓ２細 胞を５ｅｒｒａｔｅ発現構築物で感染させ、我々の凝集検定法においてＮｏｔｃ ｈ発現細胞と混合した。５ｅｒｒａｔｅ発現構築物に対して、まず４４２番目の イニシェークーＡＵＧに対して５°側に人工的なりａｍＨＩサイトを含み（すべ ての配列番号はフレミングらによる、１９９０、　Ｇｅｎｅｓ　＆　Ｄｅｖ、　 ４：　２１８８−２２０１）　４６４番目までに対して相同のプライマーを、〜 ２６０塩基対のＤＮＡ断片を生じる６８１−６９８位からの第２プライマーと連 結せしめて使用した。このフラグメントをＢａｍ旧及びＫｐｎｌ　（５７１番目 ）で切断し、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ”　（ストラタジーン、　Ｓｔｒａｔ ａｇｅｎｅ）に結合させた。この構築物、ＢＴＳｅｒ５’ＰＣＲ１の配列をチェ ックし、Ｋｐｎｌで切断した。ＢＴＳｅｒ　５°ＰＣＲ−Ｋｐｎを産生させるた め、５ｅｒｒａｔｅＫｐｎｌフラグメント（５７１−２９８１）が挿入され、適 切な方向が選択された。ＢＴＳｅｒ　５°ＰＣＲ−Ｋｐｎの５°５ａｃＩＩフラ グメント（ＳａｃｌｌはＢｌｕｅＳＣｒｉｐｔポリリンカーに位置し、５ｅｒｒ ａｔｅにも位置する（１１９９））を分離し、これをｃＤＮＡ　Ｃ１の５’　Ｓ ａｃ目フラグメントを置換するために使用しくフレミングら。 １９９０、　Ｇｅｎｅｓ　＆　Ｄｅｖ、　４：　２１８８−２２０１）、こうし て、５゛末非翻訳領域のない全長の５ｅｒｒａｔｅ　ｃＤＮＡが産生した。この 挿入断片はＳａｌ　ｌ及び部分的ＢａｍＨＩ消化により分離され、最終の発現構 築物のＳｅｒ−ｍｔｎを産生させるため、Ｂａｍ旧及びｐＲｍＨａ−３のＳａｌ １部位に組み込んだ。 我々は、５ｅｒｒａｔｅ発現細胞はカルシウムに依存してＮｏｔｃｈ発現細胞に 粘着することを知った（図６及び表Ｖｌｌ）。しかしながら、Ｄｅｌｔａとは異 なって、試験した実験条件下では、３ｅｒｒａｔｅはホモ的に相互作用しないよ うにみえた。加えて、我々は５ｅｒｒａｔｅとＤｅＩｔａの間で相互作用を検出 していない。 （来貢以下余白） 第■表 Ｎｏｔｃｈ−８ｅｒｒａｔｅ凝集”に対する外因性Ｃａ”＋の作用Ｎｏｔｃｈ　 −３ｅｒｒａｔｅ Ｃａ”＋無し　Ｃａ”＋有 １、　ｐＭｔＮＭｇ　０　１５ ３２、ΔＥＣＮ＋ＥＧＦ　（１０−１２）　０　１３３３、ΔＣ１ａ　＋ＸＥＧ Ｆ　（１０−１３）　Ｏ１５ａ＝凝集体でみられるＮｏｔｃｈ発現細胞の％とし てデータを表わす（第６図のとおり）。すべての数は単一のトランスフェクショ ン実験からのものである（第６図に示されているように数個の別個の実験の平均 値ではない。） 我々は、５ｅｒｒａｔｅ結合ドメインをマツプするために我々のＮ０ｔＣｈ欠失 構築物のサブセットを試験し、Ｄｅｌｔａへの結合に加えて、ＥＧＦ繰り返し１ １及び１２は、又、５ｅｒｒａｔｅとの相互作用を介在することを見い出した（ 第６図；構築物＃１．７−１０．１３．１６．１？、　１９、２８．及び３２） 。加えて、これらの繰り返しの５ｅｒｒａｔｅ−結合機能はアフリカッメガエル のＮｏｔｃｈの相応の２個のＥＧＦ繰り返しく＃３３ΔＣ１ａ＋　Ｘ　Ｅ　Ｇ　 Ｆ　（１０−１３））の中に保存されていたように見える。これらの結果は、疑 いなく、ＮｏｔｃｈはＤｅｌｔａ及び５ｅｒｒａｔｅの両方と相互作用し、さら に、Ｎｏ　ｔ　ｃｈの同一の２個のＥＧＦ繰り返しは両方の相互作用を介在する ことを示している。我々はまた、Ｎｏｔｃｈ　／　５ｅｒｒａｔｅ凝集のために 必須の５ｅｒｒａｔｅ領域を規定することができた。ヌクレオチド６７６−１２ ８７を欠失させると（即ち、アミノ酸７９−２８２）　（第１５図参照）　、５ ｅｒｒａｔｅタンパク質がＮｏｔｃｈと凝集する能力が消失する。 Ｎｏｔｃｈと５ｅｒｒａｔｅは、ＮｏｔｃｈとＤｅｌｔａよりはやや非効率に凝 集するように見える。なぜならば、おそらく、Ｎ０ｔＣｈ−ｓｅｒｒａｔｅ間の 相互作用はより弱いからであろう。例えば、Ｎｏｔｃｈ−ＤｅＩｔａ間の凝集を 計測すると、すべてのＮｏ　ｔ　ａｂ発現細胞の〜４０％がＤｅｌｔａ発現細胞 とクラスターの状態にあり　（第６図、＃１　ｐＭｔＮＭｇ）　、そしてすべて のＤｅｌｔａ発現細胞の〜４０％はＮｏ’ｔｃｈ発現細胞と接触していることが わかった。Ｎｏｔｃｈ　−５ｅｒｒａｔｅについて、すべてのＮｏ　ｔ　ｃｈ発 現細胞のたった〜２０％が（第６図；　ｐＭｔＮＭｇ）及びすべての５ｅｒｒａ ｔｅ発現細胞の〜１５％が凝集状態にあることを知った。試験した種々のＮｏｔ ｃｈ欠失構築物に対して、我々は、Ｄｅｌ　ｔａとさえも著しく減少したレベル の凝集を示す構築物＃９及び１０の起こり得る例外と共に、Ｎｏｔｃｈと５ｅｒ ｒａｔｅの間の凝集の量は相応のＮｏｔＣｈ−Ｄｅｌｔａのレベル（第６図）に 比較して一貫して減少していることを見い出している。凝集のこの減少した量に 対する自明の説明は、我々の５ｅｒｒａｔｅ構築物は単に細胞表面においてＤｅ ｌ　ｔａ構築物はど多くの蛋白を発現せず、そのことにより相互作用の力を弱め ているということであろう。あるいは、相互作用の力の差異は、ｉｎ　ｖｉｖｏ で重要であるかもしれないＮｏｔｃｈ−ＤｅＩｔａ間とＮｏｔｃｈ−５ｅｒｒａ ｔｅ間の相互作用の基本的な機能上の差異を示しているのかもしれない。 １０、ヒトＮｏｔｃｈ配列のクローニング、配列決定、および発現（ＰＣＲ）を 使って、ラムダＺａｌ）ＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中の１７〜１８ 週齢のヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーからＤＮＡを増幅することにより得られ た。この反応に用いる縮重ブライとによりデザインされた。３種のプライマー（ ｃｄｃｌ（配列番号：１０）、ｃｄｃ２　（配列番号：１１）およびｃｄｃ３　 （配列番号：１２）；図１６）が、２００ｂｐまたは４００ｂｐフラグメントを それぞれプライマ一対ｃｄｃｌ／ｃｄｃ２またはｃｄｃｌ　／　ｃ　ｄ　ｃ　３ として増幅するためにデザインされた。 その後、この方法で得られた４００ｂｐフラグメントをプローブとして用いて、 ヒトＮｏｔｃｈクローンについて同一ライブラリーをスクリーニングした。最初 のスクリーンは３つの特異なりローン、ｈＮ３に、ｈＮ２におよびｈＮ５ｋをも たらし、これらすべてはその後の配列解析によりヒトＮｏｔｃｈの３′末端に入 ることがわかった（図１７）。ｈＮ３にの５′末端をプローブとして用いた２回 目のスクリーンは、ヒトＮｏｔｃｈ−の５′末端を含むクローンを探すために行 った。このスクリーンから１つの特異なりローンであるｈＮ４ｋが得られた。予 備配列決定データから、これが該遺伝子の５′末端の大部分を含むことがわかっ た（図１７）。−緒にすると、クローンｈＮ４に、ｈＮ３におよびｈＮ５には約 ｌで開始して該遺伝子の３′非翻訳領域に延びている。３つのクローンはすべて ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲ１部位中 のｃＤＮＡ挿入物である。宿主Ｅ、　ｃｏｌｉ株はＸＬＩ−Ｂｌｕｅである（Ｍ ａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、　１９９０．　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ 、　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、２ｄ　ｅｄ、、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａ −ｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐ、Ａ１２を参照されたい）。 ｃＤＮＡクローンに含まれる酸１堕−の種々の部分の配列が決定され（シークエ ナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ＠）　、Ｕ、Ｓ、口ｉｏｃｈｅｍｉｃａ１社製を使 用）、それらを図１９〜２２（配列番号：１３〜２５）に示なヌクレオチド配列 は、シークエナーゼキット（Ｕ、Ｓ。 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ１社製）を使ってジデオキシ・チェイン・ターミネーショ ン法により決定した。相応の読み枠中のヒトＮｏｔｃｈをコードするこれらのヌ クレオチド配列は、３つの可能な読み枠からただ１つの翻訳が、発表されたショ ウジヨウバエＮｏｔｃｈの推定アミノ酸配列と比較して、ショウジヨウバエＮｏ ｔｃｈの配列に対して実質的な相同度を有する配列をもたらすので、容易に同定 された。イントロンが存在しないので、３つすべての可能な読み枠の翻訳および ショウジヨウバエＮｏｔｃｈとの比較が簡単に達成され、コード領域の迅速な同 定をもたらした。ｈＮ３　ｋおよびｈＮＳｋ中のヒトＮｏｔｃｈ　ｃＤＮＡのＤ ＮＡ配列および推定タンパク質配列をそれぞれ図２３および２４に示す。クロー ンｈＮ３には、第３Ｎｏｔｃｈ／ｆｉｎ−１２繰返し付近で出発してカルボキシ 末端アミノ酸を欠く数個のアミノ酸までのＮｏｔｃｈポリペプチドの部分をコー ドする。クローンｈＮ５には、だいたいｃｄｃｌｏ領域の前で出発して該ポリペ プチドの末端までのＮｏ　ｔ　ｃｈポリペプチドの部分をコードし、３′非翻訳 領域をも含む。 図２３に示したＤＮＡおよびタンパク質配列（配列番号＝３１および３２）を図 ２４に示したもの（配列番号＝３３および３４）と比較すると、これらの配列間 の顕著な差異が明らかとなり、このことはｈＮ３におよびｈＮ５ｋが２つの異な るＮｏｔｃｈ相同遺伝子の部分を表すことを示唆する。かくして、我々のデータ は、ヒトゲノムが１より多い顯１帥相同遺伝子を保有することを示唆する。これ はショウジヨウバエと違っており、ショウジヨウバエの場合はり１帥が単一コピ ー遺伝子のように思われる。 （Ｗｈａｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５．　Ｃｅ１ｌ　４３：５６７−５ ８１に発表されたもの）および対応するアフリカッメガエルＮｏｔｃｈ配列（Ｃ ｏｆｆｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、。 １９９０、５ｃｉｅｎｃｅ　２４９：１４３８−１４４１に発表されたもの、ま たはＧｅｎｂａｎｋ■（受託番号Ｍ３３８７４）から入手できる）と、の比較も また差異を明らかにした。 図２３に示したアミノ酸配列（ｈＮ３ｋ）を、Ｅｌｌｉｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、。 Ａｕｇｕｓｔ　１９９１．　Ｃｅ１ｌ　６６：６４９−６６１の図２に示したＴ ＡＮ−１ポリペプチドの予測配列と比較した。推定アミノ酸配列間には若干の差 異が見られた。しかしながら、全体的なｈＮ３ｋ　Ｎｏｔｃｈポリペプチド配列 は対応するＴＡＮ−１領域（ＴＡＮ−１アミノ酸１４５５〜２５０６）と９９％ 同一である。４つの差異がわかった：間の領域には、Ｘ（ＴＡＮ−１アミノ酸１ ７６３）の代わりにアルギニン（ｈＮ３ｋ）がある；　（２）Ｘ　（ＴＡＮ−１ 、アミノ酸１７８７）の代わりにプロリン（ｈＮ３ｋ）がある：　（３）グルタ ミン酸残基（ＴＡＮ−１、アミノ酸２４９５）の代わりにアスパラギン酸残基（ ｈＮ３ｋ）の保存的変化がある；そして（４）カルボキン末端領域がＴＡＮ−１ アミノ酸２５０７〜２５３５間で実質的に相違する。 図２４に示したアミノ酸配列（ｈＮ５ｋ）を、Ｅｌｌｉｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、。 Ａｕｇｕｓｔ　１９９１．　Ｃｅ１ｌ　６６：６４９−６６１の図２に示したＴ ＡＮ−１ポリペプチドの予測配列と比較した。推定アミノ酸配列間には差異が見 られた。ｈＮ５にの推定Ｎｏｔｃｈポリペプチドは、ｃｄｃｌｏモチーフ（ＴＡ Ｎ−１アミノ酸１８６０〜２２１７）とよく保存されたフランキング領域の両方 を含むｃｄｃｌｏ領域においてＴＡＮ−１ポリペプチドと７９％同一（ショウジ ヨウバエＮｏｔｃｈと６４％同一）である（図２５）。ｃｄｃｌＯ領域はＴＡＮ −１配列のアミノ酸１８６０〜２２１７にわたっている。さらに、ｈＮ５　ｋコ ード化ポリペプチドは、ＰＥ５Ｔ　（プロリン、グルタミン酸、セリン、トレオ ニン）に富む領域（ＴＡＮ−１アミノ酸２４８２〜２５５１）を含む該分子のカ ルボキシ末端において、ＴＡＮ−１ポリペプチドと６５％同一（ショウジヨウバ エＮｏｔｃｈと４４％同一）である（図２５Ｂ）。前記領域間の２１５個のアミ ノ酸の広がりは、ｈＮ３に、ｈＮ５におよびＴＡＮ−１により表されるＮｏｔｃ ｈ相同クローンりであまり保存されていない。ｈＮ５にポリペプチドもショウジ ヨウバエＮｏｔｃｈも、この領域において、他のタンパク質と有意なレベルのア ミノ酸同一性を示さない（例えば、ｈＮ５　ｋ／ＴＡＮ−１＝２４％の同一性； ｈＮ５に／ショウジヨウバエＮｏｔｃｈ　＝　１１％の同一性、ＴＡＮ−１／シ ヨウジヨウバエＮｏｔｃｈ　＝　１７％の同一性）。対照的に、アフリカッメガ エルＮｏｔｃｈ　（Ｘｏｔｃｈ）　（配列番号：　３５）　、ラットＮｏｔｃｈ 　（配列番号：３６）、およびＴＡＮ−１（配列番号＝３７）は互いに有意なレ ベルの配列同一性を共有し続ける（例えば、ＴＡＮ−１／ラツトＮｏｔｃｈ　＝ 　７５％の同一性、ＴＡＮ−１／アフリカツメガエルＮｏｔｃｈ　＝　４５％の 同一性；ラットＮｏｔｃｈ　／アフリカッメガエルＮｏｔｃｈ　＝　５０％の同 一性）。 最後に、図２５Ｂに示したを椎動物Ｎｏｔｃｈ相同体の細胞内ドメインの配列の 検討は予期せぬ知見を明らかにした：すなわち、ｈＮ５ｋを含むこれらのタンパ ク質はすべて、６つのｃｄｃｌｏ繰返しの最後に続く保存領域に、核ターゲツテ ィング機能と関連した推定ＣｃＮモチーフを含んでいる（図２５Ｂ）。ショウジ ヨウバエＮｏｔｃｈはこのような規定モチーフを欠くが、その配列の徹底した検 討により、潜在的な、２つの部分から成る核局在化配列（Ｒｏｂｂｉｎｓ　ｅｔ 　ａｌ、、　１９９１．　Ｃｅ１１６４：６１５−６２３　）　、並びに潜在的 なＣＫＩＩおよびｃｄｃ２リン酸化部位の存在（すべて互いに比較的近接してい る）が明らかとなり、かくしてＣｃＮモチーフの別の型を規定している可能性が ある（図２５Ｂ）。 発現構築物を作製した。ｈＮ３　ｋとｈＮ２にの場合は、そのベクターから全ク ローンをＥｃｏＲＩ制限フラグメントとして切りだし、３つのｐＧＥＸベクター （グルタチオンｓ−トランスフエラ−ゼ発現ベクター；　Ｓａ＋ｉｔｈ　ａｎｄ 　Ｊｏｈｎｓｏｎ、　１９８８．　Ｇｅｎｅ　７．３ｌ−４０）のそれぞれのＥ ｃｏＲＩ制限部位にサブクローニングした。これにより、サブクローンから正し い読み枠でＮｏｔｃｈタンパク質産物が発現される。ｈＮ５にの場合は、クロー ンが２つの内部Ｅｃ。 ＲＩ制限部位を含み、２．６．１．５および０．６ｋｂのフラグメントを生成す る。２．６および１．５ｋｂのフラグメントが共にｐＧＥＸベクターのそれぞれ にサブクローニングされた。 下記の構築物からヒｈＮｏｔｃｈ融合（キメラ）タンパク質の発現を得るために 、ｐＧＥＸベクター系を用いた。それぞれの場合にクローン化Ｎｏｔｃｈ　ＤＮ Ａを相応のｐＧＥＸベクターに読み枠を合わせて（ｉｎ　ｐｈａｓｅ）挿入した 。その後、各構築物をエレクトロポレーションにより細菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）に 導入し、グルタチオンｓ−トランスフェラーゼタンパク質のカルボキシ末端に融 合されたＮｏｔｃｈタンパク質配列を含む融合タンパク質として発現させた。 融合タンパク質の発現は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による細胞タンパク 質抽出物の分析により確認し、ＮｏｔＣｈ　ＤＮＡが挿入されたｐＧＥＸプラス ミドおよび挿入されていないｐＧＥＸプラスミドを含む細胞から得られたタンパ ク質抽出物を比較した。 この融合タンパク質は水溶液中に可溶性で、（グルタチオンＳ−トランスフェラ ーゼのカルボキシ末端がグルタチオンに結合するので）グルタチオン被覆アガロ ースを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより細胞溶解液から精製され た。発現された融合タンパク質は、ウェスターンブロッティングにより検定して 、ショウジヨウバエＮｏｔｃｈに対す゛る抗体と結合した。 ヒトＮｏｔｃｈ−グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質をつくる ために用いた構築物は次のとおりである：ｈＮＦＰ＃２　−　ＰＣＲを使って、 ｈＮ５に挿入物のヌクレオチド１９２のｃｄｃｌｏ繰返しのすぐ前で出発してヌ クレオチド１６９４のＰＥ５Ｔに富む領域のすぐ前までのフラグメントを得た。 次いで、このＤＮＡをＢａｍＨＩとＳｍａ　Ｉで消化し、得られたフラグメント をｐＧＥＸ−３に連結させた。発現後、グルタチオンアガロースに結合させて融 合タンパク質を精製した。精製したポリペプチドは４−１５％勾配のポリアクリ ルアミドゲル上で定量化した。得られた融合タンパク質はおよその分子量が８ド １〜３２３５）をＥｃｏＲＩで消化してＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　（ＳＫ）ベクタ ーから切り出した。このＤＮＡをｐＧＥＸ−３に連結させた。 ｈＮ３ＦＰ＃２　−　ｈＮ３ｋ　ＤＮＡ（ヌクレオチド１８４７〜３２３５）の ３′セグメントおよびポリリンカーの一部を、ＸｍａＩで消化してＢｌｕｅｓｃ ｒｉｐｔ　（ＳＫ）ベクターから切り出した。 このフラグメントをｐＧＥＸ−１に連結させた。 精製した後、ヒトＮｏｔｃｈに対するポリクローナル抗体および／またはモノク ローナル抗体をつくるためにこれらの融合タンパク質が使用される。 １１、微生物の寄託 ヒトＮｏｔｃｈの部分をコードするプラスミドを保有する次の組換え細菌は、特 許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定のもとに、 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ７　（１２０１Ｐａｒｋｌａｗｎ 　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ２０８５２）に１９ ９１年５月２日に寄託された。 細菌　プラスミド　ＡＴＣＣ受託番号 Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ　ｈＮ４ｋ　６８６１０Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｘ ＬＩ−Ｂｌｕｅ　ｈＮ３ｋ　６８６０９Ｅ、ｃｏｌｉ　ＸＬＩ−１］１ｕｅ　ｈ Ｎ５ｋ　６８６１１本発明は寄託した微生物またはここに記載した特定の実施態 様によってその範囲を限定されるものではない。実際、ここに記載したもののほ かに本発明の種々の変更が、前述の説明および添付の図面から当業者には明らか であろう。このような変更も請求の範囲に入るものである。 種々の刊行物をここに引用したが、これらの開示内容は参照によりそのままここ に組み込まれるものとする。 配列表 （１）一般情報８ （Ｄ）州Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ （ｘｌ）配列の記載、配列番号、■ ＣＬｕ　Ａｓｐ　！ｉｓ　Ａｓｐ　Ｃ１ｕ　Ｃｙｍ　Ａｍｐ　Ｃ１ｎ　Ｇｌｙ　 ５ｅｒ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　ＧＬｕ　Ｈｈｍ　Ａ鴛ｎ　ＧＬｙｌ　Ｓ　１０　ｌ５ ｒｌ＊　Ｃｙｓ　ｖａｌ　八１ｎ　Ｔｈｅ　Ｐｒｏ　ＧＬｙ　５ａｒ　Ｔｙｒ　 Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ａｍｎ　Ｃｙｓ　５＊ｒ　Ｇｉｎ　ＧＬｙｌ０　２５　コＯ Ｐｈ＠　Ｔｈｅ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　入ｒｇ　Ｃｙｉ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ａｇｎ　 ＺＬｔａ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　にｌｕ　Ｓ酊　Ｈｉｌコ５　４０　４５ Ｐｒｏ　Ｃｙｍ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　ＧＬｕ　Ｇｌｙ　５ｅｒ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　 Ａｓｐ　Ａｍｐ　Ｐｒｏ　ＧＬｙ　Ｔｈｅ　Ｐｈ＊　ＡｒｇＬｙｅ５＊ｒＧｌｕ ５＊ｒ＋１ｎＴｙｒＴｈｆＳ＠ｒＬｖａＣＬｕτｙｒ入５ｐＰｈ書＾ｒｇＶａｌ τｈ【Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｌａｕ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　５ａｒ　Ｇ Ｌｙ　Ｃｙｌ　人Ｌａ　Ｌｙｔ　ＰＭ　Ｃｙｓ　Ａｒｑ　Ｐｒ。 ｘｒｑ　Ａ１ｐ　Ａｓｐ　５ｅｅｒ　Ｐｈ−Ｇｌｙ　Ｃ４ｙ　Ｍｅｔ　丁ｈｒ　 Ｃｙｓ　Ｓａｔ　ＧＬｕ　Ｔｈｅ　ＧＬｙ　ＧＬｕ　ＺＬ＊Ｉｎ　Ｃｙｓ　Ｌｓ ｕτｈｒ　Ｃ１ｙ　Ｔｒｐ　ＧＬｎ　Ｇｌｙ　Ａ虐ｐ　Ｔ２ＣＣｙ震１９５　ス ００ ＧＬｙ　Ａｍｎ　Ｐｈｓ　Ｇｈｕ　Ｌ＠ｕ　Ｇｌｕ　ＩＬｅ　Ｌｍｕ　Ｇｌｕ　 ｒｌｅ　５＠ｔ　Ａｍｎ　Ｔｈｒ　Ａｍｎ　５ｅｒ　Ｈｉｓｌ　Ｓ　１０　ｉｓ Ｌｇｕ　Ｌａｕ　Ａｓｎ　Ｃ１ｙ　Ｔｙｔ　Ｃｙｓ　Ｃｙｍ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　 Ｐｒｏ　ＡＬａ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　ＡＬＡ　Ｔｈｒ２０　２５　コ０ Ｌｙｓ　Ｔｈｅ　ＩＬｅ　Ｇｌｙ　Ｃｙｍ　Ｓ＠ｒ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｔｈｅ　 Ｔｈｒ　ＡＬａ　Ｐｈ−人Ｑ　Ｌｌｌｕ　Ｃｙｓ　Ｌ＊ｕＬｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｙ ｒ　Ｇｉｎ　Ｔｈｔ　Ｔｈｒ　ＧＬｕ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｓａｔ　ＩＬ ｅ　Ｓｉｒ　丁ｈｒ　Ｇｌｙ　ＣｙｍＳｏ　ＳＳ　６０ ｓｙ　ｐｈ＠Ｇｌｙ　Ａ＊ｎ＾１＆τｈ【Ｔｈｅ　Ｌｙｓ　ｉＬａ　ＬＩＩＩＪ 　ＧＬＹ　Ｃ１ｙ　Ｓｉｒ　ｓａｒ　Ｐｈ・シ龜１Ｌｓｕ　５ｅｒ　Ａｓｐ　Ｐ ｒｏ　ＧＬｙ　ＶａＩ　Ｃ１ｙ　Ａｌａ　工ｉｓ　Ｖａｌ　Ｌｓｕ　Ｐｒｏ　Ｐ ｈ−丁ｈｒ　Ｐｈｓ　＾ｒ９ＢＳ　９０　９５ τｔｐ　Ｔｈｅ　Ｌｙｓ　５ａｒ　Ｐｈｓ　Ｔｈｅ　ＩＪｕ　１１＊　Ｌａｕ　 Ｇｉｎ　ＡＬａ　Ｌｓｕ　＾Ｉｐ　Ｍｅｔ：　Ｔｙｒ　＾ａ■ ｌｏｏ　１０５　１１０ Ｔｈｒ　Ｓｓｒ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　八−ｐ　Ａｌａ　Ｃ１ｕ　Ａｒｑ　Ｌｓｕ　 Ｘｉｓ　ＧＬｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｅ　５１１ｒ　Ｔｙｒ　５ｉ■ １１ｓ　１２０　１２５ ＧｌｙＶａＬＸｉｓＬａｕＰｒｏＳｓｒＰｒｏＧｌｕＴｒｐＬＹＩＴｈｒＬ＊ｕ ＾＊ｐ）ＩｉｓＥｌｓＧｌｙ１３０　１３％　１４０ ＾ｒｑ　Ａｍｎ　＾１＆　＾ｘｑｒＬ−Ｔｈｅ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｖａｔ　Ａｒ ｑ　ＶｉＬ　ＧＬｎ　Ｃｙｓ　Ａｉｍ　ＶａＬ　τｈｒＴｙｒ　丁ｙｒ　Ａｍｎ 　Ｔｈｒ　Ｔｈｅ　Ｃｙｍ　Ｔｈｅ　Ｔｈｅ　ＰＩＴ＠　Ｃｙｗ　Ａｒｑ　Ｐｅ ａ　Ａｒｑ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　（ｉ■ １６５　１７０　、　１７５ Ｐｈ＠　（ｌｙ　Ｈｌｍ　Ｔｙｒ　ＡＬＡ　Ｃｙｗ　にＡｙ　Ｓａｔ　Ｇｌｕ　 ＧＬｙ　ＧＬｎ　Ｌｙｓ　Ｌ＠ｕ　Ｃｙｍ　Ｌ＠ｕ　Ａｓｒ■ ＬＩＩＯＬＩＩＳ　工９０ ＧＬｙ　丁ｒｐ　Ｇｉｎ　ＧＬＹ　ＶＪＬＬ　八−ｎ　ｌ：Ｙ＠９ｓ （Ｃ）鎖の数　二本鎖 り０）トボロノー４不明 ＴＯτ丁Ｔ　ＧＧＡ　ＣＡＣＴＣＧ　ＡＣ’Ｔ　丁ＯＣＴＣＧ　にＡＧ　ＡＣＧ 　ＧＧＣＧ入Ａ　＾：Ｔ　Ａ丁ＣτＣτ　ＴフＧ　７９５５＠ｒ　Ｐｌ’ｌｌｌ 　ＧＩＹ　Ｈｌｓ　Ｓａｔ　丁ｈｒ　Ｃｙｓ　Ｓａｔ　ＧＬｕ　Ｔｈｒ　Ｃ４ｙ 　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｈａ　Ｃｙｓ　Ｌiｕ ７６５　７７０　フ７５ （：Ｔ？　Ｔ？Ａ　ＧＧＣＧＡＧ　ＧＧＴ　Ｔｃｅ　ＴＡＣ？ＣＴ　ｋＧｃ　Ｃ ＡＧ　００丁　ＴＧＧ　ＣＣＣＴＣＧ　ＴＴＧ　ＧＣＧ　２T２３ ｖａｔ　Ｌｓｕ　Ｇｌｙ　ＧＬｕ　ＧＬｙ　Ｓｓｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｍ　Ｓ＠ｒ　 ＧＬｎ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ｓｅｅ　Ｌａｕ　ＡＬａ）ａＯフ８５　フ９ ０ ＧＣＧ　ＧＣＧ　ＣＧＡ　ＧＴＧ　ＧＣＣＣＧＡ　ＧＣＣτＣτ　τＣ入　τＣ ＣＣ入ｃｅＴ入　＾ＴＯＣｅＴ　ＧＣＡ　ｃｃ丁　２５７１ＡＬａ　ＡＬａ　に ＬＹ　ＶａＬ　ＡＬａ　ＧＬｙ　ＡＬＩＩ　ＣＹＩ　Ｓ＠ｔ　５＊ｒ　Ｇｉｎ　 Ｌａｕ　Ｍ＠ｔ　ＡＬａ　ＡＬａ　Ａｌ■ ｌミツ９　８ｏｏ　８０５　６１０ ＴＣＧ　ＧＣＡ　ＧＣＧ　ＧＧＣＡＧＣＧｃＡ　ＣＣＧ　（ＡＧ　ＡｃＧ　ＧＣ Ｇ　Ｃ入Ａ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＣＧＡ　ＴＣＣＧＴＧ　２６P９ ５＠ｒ　ＡＬａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　ｓ＠ｒ　Ｇｌｙ　ＡＬａ　ＧＬｙ　Ｔｈｒ　 ＡＬａ　Ｇｉｎ　Ｃ１ｎ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　ｓｉｒ　ＶａＬＩｌｌｓ　８２０　 ８２５ Ｍｅｔ　ＨＬｍ　Ｔｒｐ　ＡＬａ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｌｓｕ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　 ＡＬａ　Ｐｈｅ　ＡＬａ　Ｃｙｗ　Ｐｈｅ　Ｔｈｅ　ＶａＬＩ　Ｓ　１０　１５ Ｘ１＠ｖａｌ　Ｇｉｎ　ＶａＬ　）Ｉｔｓ　５ＩＩｒ　５ａｒ　Ｇｌｙ　Ｓ＠ｔ 　Ｐｈａ　ＧＬｕ　Ｌ＠ｕ＾ｒｇ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ２０　２５　コＯ Ｐｈ＠　ｓｉｒ　Ａｍｎ　Ａｓｐ　）Ｉｉｍ　ＧＬｙ　Ａｒｇ　Ａｍｐ　Ａｍｎ 　ＧＬｕ　にｉｌｙ　入ｒｑ　Ｃｙｍ　Ｃｙｓ　５ａｒ　Ｇ撃■ Ｇｌｕ　Ｓａｔ　Ａｍｐ　ＧＬｙ　八１１１　Ｔｈｅ　Ｃ１ｙ　Ｌｙｍ　Ｃｙｍ 　Ｌａｕ　ＧＬｙ　Ｓｅｒ　Ｃｙｍ　Ｌｙｍ　Ｔｈｅ　ｘｒ■ ｓｏ　ｓｓ　ｂ。 Ｐｈａ　ｋＸｑ　Ｖａｔ　Ｃｙｍ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｈｌｓ　ＴＹｒ　ＧＬｎ　 ＡＬａ　丁ｈｒ　Ｈｌｍ　Ａｍｐ　丁ｈｒ　Ｔｈｅ　５ａｔＧＬｎ　Ｃｙｓτｈ １：　ＴＹｒ　ＧＬｙ　Ａｓｐ　ＶａＬ工Ｌ−Ｔｈｅ　Ｐｒｏ　ＨＬｍ　Ｌｅｕ 　ＧＬｙ　Ｃ１ｕ　Ａｓｎ　ｓ＠ｒａｓ　９０　９Ｓ ＶａＬ　Ｍｎ　Ｌａｕ　？ｈｒ＾叩＾Ｌａ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｐｈｓ　ｃｌｎ　 Ａｓｎ　Ｌｙｓ　ＧＬｙ　Ｐｈ−Ｔｈｅ　Ａｓｎ１００　１０ｓ　１１０ Ｐｒｏ　Ｚｌｓ　Ｇｉｎ　Ｐｈａ　ｉ’ｒｏ　ｉ’ｈ＊　Ｓ＠ｒ　Ｐ？ｌ＠　Ｓ ＠ｅ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　ＧＬｙ　Ｔｈｒ　Ｐｈａ　Ｓ・ｒ　kａｕ ＬＬＳ　Ｌ２０　１２５ Ｚｌ＊　ＶａＬ　ＧＬｕ　Ａｉａ　丁ｒｐ　ＨＬｍ　Ａｓｐ　Ｔｈｅ　Ａｓｎ　 Ａｓｎ　５ｓｒ　ＧＬｙ　Ａｍｎ　ＡＬａ　Ａｒｇ　τｈｒ１コ０１３５１４０ Ａｍｎ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｅｌｍ　Ｇｉｎ　ｋｒｑ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　 Ｖａｌ　Ｇｉｎ　にｉｎ　Ｖａｎ　Ｌａｕ　ＧＬｕ　Ｖａ１１４５　１５０　Ａ ｓｓ　１６０ ５＠ｒ　Ｓａｒ　Ｃ４ｕ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓτｈｒ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇ ｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒτｈｒ　Ｓｉｒ　ＬａｕＧｌｕ　ＴＹｒ　＾−ｐ Ｐｈ−人ｒｇ　ＶａＬ　Ｔｈｅ　Ｃｙ−＾＠Ｐ　Ｌｓｕ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｔｙ ｒ　ＣＬｙ　Ｓａｙ：　Ｇｌｙｌａｏ　１８５　１９０ ＣＹＩ　ＡＬａ　Ｌｙ■　Ｐｈａ　Ｃｙ−Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｒ９　Ａｍｐ　Ａ ｓｐ　Ｓ＠ｔ　Ｐｈａ　ＧＬｙ　１４ｉｓ　Ｓａｒ　Ｔｈｒ１９５　ス００　２ ０５ ｃｙｍ　Ｓａ【　ＧＬｕ　Ｔｈｒ　ｃｌｙ　ＧＬｕ　Ｉｉｅ　ｒｌｅ　Ｃｙｍ　 Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　ＧＬｒ＋　Ｇｌｙ　Ａｓ■ τｙｒ　ｃｙｍ　Ｈｉｓ　ＩＬｓ　Ｐｒｏ　ＣＹＩ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　 ＧＬｙ　Ｃｙｓ　ｃｌｕ　Ｈｈｓ　ｃｌｙ　ＨＬｍ　ｃｙｓ２２５　２コ０　２ コ５　２４゜ 八−ｐ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｍｎ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　ＶａＬ　ｃｙｍ　ｃａｎ　 Ｌａｕ　Ｃ４ｙ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　ＣＬｙ　ＡＬａ　ＬａｕＣＹｌ　八−ｎ　Ｇ Ｌｕ　Ｃｙｓ　ＶａＬ　Ｌｓｕ　ＧＬｕ　Ｐｒｏ　Ａｍｎ　Ｃｙｍ　ＩＬａ　Ｈ Ｌｓ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｃｙｍ　ＡｇｎＬｙｓ　Ｐｒｏτｒｐ　Ｔｈｅ　（：ｙ ｓ　ＩＬａ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　ＧＬｕ　Ｇｌｙτｒｐ　Ｃ１ｙ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ τｙｒ　Ｃｙｇ２）Ｓ　２８０　２１１５ ＡＩＩｆｔＧＩＩ′Ｉ　入ｓｐ　Ｌａｕ　八ｓｎ　Ｔｙｒ　Ｃｙ−Ｔｈｅ　Ａｍ ｎ　ＨＬｍ　八ｒｇ　Ｐｒｏ　Ｃｙｇ　Ｌｙｅ　八ｓｎ　Ｇ撃■ ２９０２９Ｓ３００ ＣＬｙτｈｒ　ＣＹＩ　Ｐｈｓ＾ｓｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｉｕ　（ｉｌｙ　Ｌ ａｕ　Ｔｙｒ　Ｔｈｅ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｌａ３０５　コ１０　コ１ ５　コ２０ Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　５値ｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　 Ａｓｎ　ＧＬｕ　ＸＬｔｓτｙｒ　Ｓａｔ　Ｃｙｍ　Ａｍｐ３２５　３３０　コ コ５ ＾１直　Ａｍｐ　Ｖａｌ　＾＠ｎ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　ＧＬｙ　 ＧＬｙ　Ｔｈｅ　Ｃｙｓ　ＨＬｍ　Ａｍｐ　Ｏｌｕ　Ｐｒ。 コ４０　コ４５　コ５０ ＨＬｍ　Ｔｈｒ　Ｌｙ−Ｔｈｅ　Ｃ１ｙ　Ｔｙｒ　Ｌｙｅ　Ｃｙｇ　Ｈｌｓ　Ｃ ｙｓ　ＡＬａ　Ｊｖｎ　Ｇｌｙ　Ｔｔｐ　Ｓｙ　Ｇｌｙ３５５　３６０　コロ５ Ｌｙｓ　Ｍａｔ　Ｃｙｓ　にＬｕ　ＧＬｕ　Ｌｙｓ　ＶａＬ　Ｌａｕ　Ｔｈｅ　 Ｃｙｍ　５ｅｒ　Ａｍｐ　ＬＹ［Ｐｔｏ　Ｃｙｍ　１（ｉｓココア　３７５　３ １１０ Ｇｉｎ　ＧＬｙ　Ｈｌｍ　Ｃｙ−Ａｒ９　Ａｍｎ　ＶａＬ　八ｒｑ　Ｐｒｏ　Ｇ Ｌｙ　Ｌｓｕ　ＧＬｙ　５＠ｒ　Ｌｙｍ　ＧＬｙ　Ｇｉｎコ８５　コ９ｏ　コ９ ５　４００ にｉｌｙ　Ｔｙｒ　（ｉｎ　ｃｙｓ　ＣＬｕ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｈｌｍ　Ｇｌｙ τｙｒ　５＠ｒ　ＧＬｙ　Ｐｒｏ＾−ｎｃｙ−＾１ｐＬ＠ｕ　ＧＬｎ　Ｌａｕ　 Ａｓｐ　八ａｎ　Ｃｙｓ　Ｓ＠ｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　１１ｍ　 Ａｍｎ　ＧＬｙ　ＧＬｙ　Ｓｇａ■ ４２０　４２５　４コＯ ＣＹ＠　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　！＠ｒ　ＣＬｙ　Ｌｙｍ　Ｃｙｓ　Ｈｌｍ　Ｃｙｓ　 Ｐｒｏ　ＡＬａ　にｉｌｙ　Ｐｈｓ　Ｓａｔ　ＧＬｙ　Ｔｈ■ ４コＳ　４４０　４４５ ＾ｒｇ　ｃｙｍ　ＧＬｕ　Ｔｈｔ　Ａａｎ　ｆｅｅ　＾＠Ｐ　Ａｍｐ　Ｃｙｍ　 Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　ＧＬｕ　＾１ｎＧｌｙ　Ｇｌｙτｈ ｒ　ｃｙｍ　Ｋｌ−Ａｍｐ　Ｍｓｔ　ＶａＬ＾Ｉｎ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　Ａｒ９　 Ｃ７ｆｉ　ＧＬｎ　Ｃｙｓ　Ｖａ１Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｐｈａ　ＨＬｍ　Ｇｌｙ　 Ｔｈｒ　Ｈｌｍ　Ｃｙｓ　Ｓａｔ　Ｓａｒ：　Ｌｙｓ　Ｖａｔ　入ａｐ　Ｌａｕ 　Ｃｙｇ　Ｌｌ撃■ ４１１％　４９０　４９５ 工１−　人ｒｇ　Ｐｒｏ　Ｃｙ−＾１昌　Ａｍｎ　Ｇｌｙ　ＧＬｙ　Ｔｈｒ　Ｃ ＹＩ　ＬａＩ３　Ａｍｎ　Ｌｓｕ　Ａｍｎ　Ａｓｎ　Ａ寥ｐＳ００　ＳＯ５５１ ０ Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｔｈｅ　Ｃｙ雪　Ａｒｇ　ＡＬａ　Ｇｌｙ　Ｐｈａ　 Ｔｈｅ　ＣＬｙ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｃｙｍ　Ｓａｔ　Ｖａｌ５１Ｓ　５２０　５ ２５ Ａｍｐ　Ｘｉｓ　Ａｍｐ　ＣＬｕ　Ｃｙｓ　Ｓ＠ｒ　５ＩＩｒ　ＧＬｙ　Ｐｒｏ 　Ｃｙｍ　ＨＬｓ　Ａｍｎ　ＧＬｙ　ＧＬｙ　Ｔｈｅ　Ｃｙ■ ５コ０５コ５５４０ Ｍｅｔ　Ａｓｎ　入ｒｇ　Ｖａｌ　＾＠ＩＩ　Ｓａｒ　Ｐｈａ　ＧＬＩＪ　Ｃｙ ｇ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　＾１晶　Ａｍｎ　Ｇｌｙ　Ｐｈ・　Ａ窒X Ｇｌｙ　ＬＹＩ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ａｍｐ　ＧＬｕ　ＧＬｕ　５＊ｒ　Ｔｙｔ　 Ａ叩５＠ｒ　ＶａＬτｈｒ　Ｐｈｅ　Ａｍｐ＾１ａ５６Ｓ　５］Ｏ５７５ Ｈｉｓ　Ｃ４ｎ　Ｔｙｒ　Ｃ１ｙ　＾１蟲　Ｔｈｅ　Ｔｈｅ　ＧＬｎ　ＡＬａ　 Ａｒｇ　ＡＬム　Ａｍｐ　Ｃ１ｙ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ａｍｎ５ａＯ５１１５５９ ０ ＾Ｌａ　にｉｎ　Ｖａｔ　ＶａＬ　Ｌａｕ　Ｈｌｍ　Ａｌａ　ＶａＬ　ＰＭ　Ｓ ａｔ　ＶａＩ　ＡＬａ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　ＶａＬ＾Ｌａ　Ｖａｌ　工１ ・　＾１蟲　ＡＬａ　Ｃｙｍ　ＶａＬ　ＶａＬ　Ｐｈａ　Ｃｙｍ　Ｍａｔ　Ｌｙ ｓ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　八ｒｇ　ＣＹＩ＾τ９　人Ｌ＆　（、ｉｎ　ＧＬｕ　Ｌ、 Ｙｌ　Ａｍｐ　Ａｍｐ　入Ｌａ　（Ｌ＋ａ　入１亀入ｒｑ　Ｌｙｅ　（＋Ｌｎ　 入ａｎ　Ｇｌｕ　bＬｎ ６２５　６３０　６コ５　６４０ ＾ｓｎ　ＡＬａ　ＶａＩ　へ１蟲　Ｔｈｅ　Ｍａｔ　Ｈｌｍ　Ｈｌｓ　Ａｍｎ　 ＧＬｙ　ｍａｒ　ＧＬｙ　Ｖａｎ　Ｇｌｙ　ＶａＬ　入１ａ６４５　６Ｓ０　６ ５５ ＬａｕＡＬａ５ｅｒＡＬａＳ＠ｒＬａｕＣＬｙＧｌｙＬｙ嘗？ｈｒＧＬｙＢａｒ ＾ｍｎ！ａｔＧｌｙＬｅａ６６０　６６％　６１０ τｈｒ　Ｐｈａ　Ａｓｐ　ＧＬｙ　ＧＬｙ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｍｎ　ＩＩｓ　 ＩＬａ　Ｌｙｍ　＾１ｎ　Ｔｈｅ　Ｔｒｐ　Ａｍｐ　Ｌｙｅ６］５　６ａＯ６ａ ５ Ｓａｔ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　ＩＬａ　Ｃｙｓ　ＡＬａ　Ｓａｔ　＾１＆　 入Ｌａ　ＡＬ轟　＾１１　＾１蟲　ＡＬａ　ＡＬａ　入１皐６９０６９５フＯ０ ＾Ｌａ　ＡＬａ　Ａｉｍ　Ａｍｐ　６１ｕ　ｅｙｓ　Ｌａｕ　Ｎ＋１ｔ　Ｔｙｒ 　ＧＬｙ　Ｃ１ｙτｙｒ　ＶａＬ　ＡＬａ　５ｔａｒ　Ｖａk ７０５　７１０　フｉｓ　７２０ Ａｒｇ　（Ｌｙ　Ｓ＠ｒ　Ｐｒｏ　Ａｉａ　Ｇｌｙ　Ｓｉｒ　Ｓａｒ　ＡＬａ　 Ｌｙｓ　Ｃ４ｙ＾Ｌａ　５ｅｒ　ＣＬｙ　Ｏｌｙ　Ｃ１ｙ７５Ｓ　７６０　）６ ５ Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　入１ａ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　ＧＬｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　）ｉｌｌ 　５＠ｒ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　ＧＬｙ　Ｇｌｕ　ＧＬｙ　Ｓａ■ フ７０　フッ５　７８０ Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｓａｔ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｌａｕ　 ＾１１１　＾ＬａＡλａ　ＧＬｙ　ＶａＬ　ＡＬａ　Ｃ１ｙＡＬａ　Ｃｙｓ　Ｓ ｇａｒ　Ｓｓｒ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ　Ｍａｔ　＾１畠　＾Ｌ＆　ＡＬａ　５＠ｒ　 Ａｌａ　ＡＬａ　Ｇｌｙ　５１１ｒ　Ｇ撃■ ＳＯ５ｌ１ｌＬＯ８１５ 人Ｌａ　ＧＬｙ　Ｔｈｅ　ＡＬａ　ＧＬｎ　ＧＬｎ　ＧＬｒ＋　Ａｒｇ　Ｓｅｅ 　ＶａＬ　ＶａＬ　ｅｙｓ　ＧＬｙ　Ｔｈｅ　Ｐｒｏ　ｌｔkｍ ８２０　８ス５　８コ０ （ｘｌ）配列の記載＝配列番号　７゜ （ｘｌ）配列の記載、配列番号　８ λ１１　Ｔｈｒ　ＬＹ＠　入ｒｇ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　ＨＬａ　 Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｉｌ＠　ＡＬａ　τｈｒコＳ　’　４０　４ ５ Ｌｓｕ　Ｐｒｏ　ｓ＠ｒ　Ｔｈｒ　工Ｉ＠　入ｒ９　＾ｓｐ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　 Ｓ＠ｒ　Ｌ＊ｕ　Ｌｙｓ　５ａｒ　ＡＬａ　Ｃｙｓ　＾ａｎＬｙｓＴｈｒ工Ｌａ ＧｌｙＣｙｓＳａｒＰｒｏＣｙｍτｈｒτｈｒ＾１ｌｌＰｈｓ＾ｒｑＬ＊ｕＣｙ ｓＬａｕＬｙｍＧＬｕＴｙｒＧＬｎτｈ【τｈｒＧｌｕＧｉｎＧｌｙＡＬａ５＊ ｒＸｉ＠５＠ｒＴｈｒＧｌｙＣＹ＠１コ０　１コ５　１４゜ τｒｐＴｈｒＬｙｓＳ＠ｒＰｈ＊τｈｒＬａｕ工１＠Ｌ自ｕＧｉｎ＾ＬａＬ＊ｕ ＡｓｐＭｅｔＴｙｒ＾ａｎｌａｏ　１８５　１９０ ＾ｓｐ　Ｐｒｏ　Ｖ龜Ｌ　ＨＬａ　ＧＬｙ（ｘｌ〉配列の記載　配列番号：ｌｏ ・（２）配列番号　１１の情報。 （！１１１００記載、配列番号　ｌｌ。 （２）配列番号　１２の情報 （＋）配列の特徴 （ｘｌ）配列の記載　配列番号　１２ τＣｃＡ丁罠τＧＲＴ　ＣＮＧ丁Ｄ＾τＮＴＣＮＣＫ只ＴＴ　２６（ｘｌ）配列 の記載、配列番号　１３ （ｘｌ）配列の記載　配列番号　１４ ＧｋｋＴＴＣＣττＣＣＡＴτλτ＾ｃｃτ　Ｇ入Ｃτττ丁ＣτＧ　入入入Ｃ τＧτ＾ａｃｃ入ＣＣＣτｘａτＧ　丁ＣτＣτ入ＡＣτＣU０ （ｘｉ）配列の記載・配列番号・１５：（ｘｌ）配列の記載：配列番号　１６・ 入＾ＧｃＴＣｃＧｃＣｃｅｘｃｃｒｃａｃｃ　ｃｃＴｃＧｃｒｃ；ＣＴ　ＧＡ（ ：　３３１（ｘｌ）配列の記載、配列番号　１７ ＧＴＧＣＣＣＣＩＪＡ　Ｇ（ＡＣＴＧＧＧＣＣＣＣＡＣＣ？ＣＡＣＣＣＣＴＧＣ ＴＧＧＧＣＣ入　５８２（２）配列番号　１８の情報 （ｘｌ）配列の記載　配列番号、１８：ＧＣＴＧＧＣＣＣＧＣｋｃｃ’ｒＧｋｃ Ｇｃｃ　ＴＧＣ’ｒＧＧＧＣＣ＾　１５０（ｘｌ）配列の記載−配列番号　】９ ＴＴＡＣＣ＾ＴτＡＣＡＧＧＡＡＣＡＧにＣＡｃｅτＧτｘｃｃｒ　ｃｃｔｃｃ ｃτＧＧＧ　ＣＣＴＣＴ？ＣＴＣＣ＾ＣＡＧＧｅＧ八〇〇　■@６０ ＡＣ？ＡＧｃｒＧ丁Ｇ　ｃｒａｃａａｃｃｃｃ　ｃｃｃｃｉｃｘｃｃＡ　ＡＣτ 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デパートメント　オブ　バイオロジー−ケイビーティー （７２）発明者　リベイ、イラリア アメリカ合衆国　０６５１１　コネチカット州ニュー　ヘイブン、プロスペクト 　ストリート２１９　エール　ユニバージティー。 デパートメント　オブ　バイオロジー−ケイビーティー （７２）発明者　ブローミューラー、クリステイン　マリ−アメリカ合衆国　０ ６５１１　コネチカット州ニュー　ヘイブン、プロスペクト　ストリート２１９ 　エール　ユニバージティー。 デパートメント　オブ　バイオロジー−ケイビーティー （７２）発明者　シェパード、スコツト　プロ・ツクウェルアメリカ合衆国　０ ２１６７　マサチューセ・ソツ州　チェスナツト　ヒル、カットラ−レーン　５ ０

Claims (132)

【特許請求の範囲】
1. １．実質的に精製されたヒトＮｏｔｃｈタンパク質。
2. ２．図１９Ａ（配列番号：１３）、１９Ｂ（配列番号：１４）または１９Ｃ（配 列番号：１５）に示したＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列を含む実質 的に精製されたタンパク質。
3. ３．図２０Ａ（配列番号：１６）、２０Ｂ（配列番号：１７）、２０Ｃ（配列番 号：１８）または２０Ｄ（配列番号：１９）に示したＤＮＡ配列によりコードさ れるアミノ酸配列を含む実質的に精製されたタンパク質。
4. ４．図２１Ａ（配列番号：２０）または２１Ｂ（配列番号：２１）に示したＤＮ Ａ配列によりコードされるアミノ酸配列を含む実質的に精製されたタンパク質。
5. ５．図２２Ａ（配列番号：２２）、２２Ｂ（配列番号：２３）、２２Ｃ（配列番 号：２４）または２２Ｄ（配列番号：２５）に示したＤＮＡ配列によりコードさ れるアミノ酸配列を含む実質的に精製されたタンパク質。
6. ６．ヒトＮｏｔｃｈタンパク質に対する抗体によって結合され得る、図１９Ａ（ 配列番号：１３）、１９Ｂ（配列番号：１４）、１９Ｃ（配列番号：１５）、２ ０Ａ（配列番号：１６）、２０Ｂ（配列番号：１７）、２０Ｃ（配列番号：１８ ）、２０Ｄ（配列番号：１９）、２１Ａ（配列番号：２０）、２１Ｂ（配列番号 ：２１）、２２Ａ（配列番号：２２）、２２Ｂ（配列番号：２３）、２２Ｃ（配 列番号：２４）または２２Ｄ（配列番号：２５）に示したＤＮＡ配列によりコー ドされるアミノ酸配列を含む実質的に精製されたタンパク質。
7. ７．全長Ｎｏｔｏｈタンパク質と関連した１またはそれ以上の機能活性を示す、 図１９Ａ（配列番号：１３）、１９Ｂ（配列番号：１４）、１９Ｃ（配列番号： １５）、２０Ａ（配列番号：１６）、２０Ｂ（配列番号：１７）、２０Ｃ（配列 番号：１８）、２０Ｄ（配列番号：１９）、２１Ａ（配列番号：２０）、２１Ｂ （配列番号：２１）、２２Ａ（配列番号：２２）、２２Ｂ（配列番号：２３）、 ２２Ｃ（配列番号：２４）または２２Ｄ（配列番号：２５）に示したＤＮＡ配列 によりコードされるＮｏｔｃｈアミノ酸配列を含む実質的に精製されたタンパク 質。
8. ８．少なくとも７７個のアミノ酸から成るヒトＮｏｔｃｈタンパク質のフラグメ ントを含む実質的に精製されたタンパク質。
9. ９．本質的にヒトＮｏｔｃｈタンパク質の細胞外ドメインから成る該タンパク質 のフラグメントを含む実質的に精製されたタンパク質。
10. １０．本質的にヒトＮｏｔｃｈタンパク質の細胞内ドメインから成る該タンパク 質のフラグメントを含む実質的に精製されたタンパク質。
11. １１．本質的にヒトＮｏｔｃｈタンパク質の細胞外および膜貫通ドメインから成 る該タンパク質のフラグメントを含む実質的に精製されたタンパク質。
12. １２．ＡＴＣＣに寄託されて受託番号６８６０９を指定されたプラスミドｈＮ３ ｋの一部によりコードされるか、またはＡＴＣＣに寄託されて受託番号６８６１ １を指定されたプラスミドｈＮ５ｋの一部によりコードされる、本質的にヒトＮ ｏｔｃｈタンパク質の細胞内ドメインから成る該タンパク質のフラグメントを含 む実質的に精製されたタンパク質。
13. １３．本質的にヒトＮｏｔｃｈタンパク質のｃｄｃ１０繰返しを含む領域から成 る該タンパク質のフラグメントを含む実質的に精製されたタンパク質。
14. １４．ＡＴＣＣに寄託されて受託番号６８６０９を指定されたプラスミドｈＮ３ ｋの一部によりコードされるか、またはＡＴＣＣに寄託されて受託番号６８６１ １を指定されたプラスミドｈＮ５ｋの一部によりコードされる、本質的にヒトＮ ｏｔｃｈタンパク質のｃｄｃｌ０繰返しを含む領域から成る該タンパク質のフラ グメントを含む実質的に精製されたタンパク質。
15. １５．ヒトＮｏｔｃｈタンパク質のＥＧＦ相同繰返しを含む該タンパク質の領域 を含む実質的に精製されたタンパク質。
16. １６．ヒトＮｏｔｃｈタンパク質のＮｏｔｃｈ／ｉｉｎ−１２繰返しを含む該タ ンハク質の領域を含む実質的に精製されたタンパク質。
17. １７．ヒトＮｏｔｃｈタンパク質のＥＧＦ相同繰返しを実質的に欠失している該 タンパク質の実質的に精製されたフラグメントであって、Ｎｏｔｃｈタンパク質 に対する抗体によって結合され得る上記フラグメント。
18. １８．ヒトＮｏｔｃｈタンパク質のＥＧＦ相同繰返しの一部を欠失している該タ ンパク質の実質的に精製されたフラグメントであって、Ｎｏｔｃｈタンパク質に 対する抗体によって結合され得る上記フラグメント。
19. １９．ＡＴＣＣに寄託されて受託番号６８６０９を指定されたプラスミドｈＮ３ ｋ中に含まれるヒトｃＤＮＡ配列の少なくとも１２１個のヌクレオチドによりコ ードされるアミノ酸配列を含む実質的に精製されたタンパク質。
20. ２０．ＡＴＣＣに寄託されて受託番号６８６１０を指定されたプラスミドｈＮ４ ｋ中に含まれるヒトｃＤＮＡ配列の少なくとも１２１個のヌクレオチドによりコ ードされるアミノ酸配列を含む実質的に精製されたタンパク質。
21. ２１．ＡＴＣＣに寄託されて受託番号６８６１１を指定されたプラスミドｈＮ５ ｋ中に含まれるヒトｃＤＮＡ配列の少なくとも１２１個のヌクレオチドによりコ ードされるアミノ酸配列を含む実質的に精製されたタンパク質。
22. ２２．本質的にヒトＮｏｔｃｈタンパク質の細胞内ドメインから成る該タンパク 質の実質的に精製されたフラグメント。
23. ２３．本質的にヒトＮｏｔｃｈタンパク質の細胞外ドメインから成る該タンパク 質の実質的に精製されたフラグメント。
24. ２４．本質的にヒトＮｏｔｃｈタンパク質の細胞外および膜貫通ドメインから成 る該タンパク質の実質的に精製されたフラグメント。
25. ２５．異種タンパク質配列に結合された請求項８のフラグメントから成るキメラ タンパク質。
26. ２６．異種タンパク質配列に結合された請求項９のフラグメントから成るキメラ タンパク質。
27. ２７．ヒトＮｏｔｃｈタンパク質の機能的に活性な部分を含む実質的に精製され たタンパク質。
28. ２８．ＡＴＣＣに寄託されて受託番号６８６０９を指定されたプラスミドｈＮ３ ｋ中に含まれるヒトｃＤＮＡ配列によりコードされるか、またはＡＴＣＣに寄託 されて受託番号６８６１１を指定されたプラスミドｈＮ５ｋ中に含まれるヒトｃ ＤＮＡ配列によりコードされる、ＮＯｔｃｈタンパク質配列の機能的に活性な部 分を含む実質的に精製されたタンパク質。
29. ２９．ＡＴＣＣに寄託されて受託番号６８６１０を指定されたプラスミドｈＮ４ ｋ中に含まれるヒトｃＤＮＡ配列によりコードされるＮｏｔｃｈタンパク質配列 の機能的に活性な部分を含む実質的に精製されたタンパク質。
30. ３０．図２３に示したアミノ酸配列を含む実質的に精製されたタンパク質。
31. ３１．図２４に示したアミノ酸配列を含む実質的に精製されたタンパク質。
32. ３２．ＡＴＣＣに寄託されて受託番号６８６０９を指定されたプラスミドｈＮ３ ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈＤＮＡ配列によりコードされるＮｏｔｃｈアミノ 酸配列を含む実質的に精製されたタンパク質。
33. ３３．ＡＴＣＣに寄託されて受託番号６８６１１を指定されたプラスミドｈＮ５ ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈＤＮＡ配列によりコードされるＮｏｔｃｈアミノ 酸配列を含む実質的に精製されたタンパク質。
34. ３４．第１細胞の表面上に発現されるとき、第２細胞の表面上に発現されたＤｅ ｌｔａタンパク質とｉｎｖｉｔｒｏで結合できることにより特徴づけられる、請 求項３０記載のタンパク質のフラグメント。
35. ３５．第１細胞の表面上に発現されるとき、第２細胞の表面上に発現されたＤｅ ｌｔａタンパク質とｉｎｖｉｔｒｏで結合できることにより特徴づけられる、請 求項３１記載のタンパク質のフラグメント。
36. ３６．図８（配列番号：１）に示したショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｉａ ）Ｎｏｔｃｈ配列の上皮増殖因子様繰返し１１および１２に最大の相同性を有す るヒトＮｏｔｃｈタンパク質の部分を含む実質的に精製されたタンパク質。
37. ３７．第１細胞の表面上に発現されるとき、第２細胞の表面上に発現されたＤｅ ｉｔａタンパク質とｉｎｖｉｔｒｏで結合できることにより特徴づけられる、請 求項１記載のタンパク質の誘導体または類縁体。
38. ３８．異種タンパク質配列に結合された請求項１のタンパク質から成るキメラタ ンパク質。
39. ３９．異種タンパク質配列に結合された請求項６のタンパク質から成るキメラタ ンパク質。
40. ４０．異種タンパク質配列に結合された請求項７のタンパク質から成るキメラタ ンパク質。
41. ４１．第１細胞の表面上に発現されるとき、第２細胞の表面上に発現されたＤｅ ｉｔａタンパク質とｉｎｖｉｔｒｏで結合できることにより特徴づけられる、Ｎ ｏｔｃｈタンパク質の実質的に精製されたフラグメント。
42. ４２．ショウジョウバエＮｏｔｃｈタンパク質の上皮増殖因子様繰返し１１およ び１２に最大の相同性を有するＮｏｔｃｈタンパク質の部分から本質的に成る、 請求項４１記載のフラグメント。
43. ４３．前記Ｎｏｔｏｈタンパク質がショウジョウバエＮｏｔｃｈタンパク質であ る、請求項４１記載のフラグメント。
44. ４４．前記Ｎｏｔｃｈタンパク質がアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）Ｎｏ ｔｃｈタンパク質である、請求項４１記載のフラグメント。
45. ４５．前記Ｎｏｔｃｈタンパク質がヒトＮｏｔｃｈタンパク質である、請求項４ １記載のフラグメント。
46. ４６．異種タンパク質配列に結合された請求項４５のフラグメントから成るキメ ラタンパク質。
47. ４７．ショウジョウバエＮｏｔｃｈタンパク質の上皮増殖因子様繰返し１１およ び１２から本質的に成る該タンパク質の実質的に精製されたフラグメント。
48. ４８．異種タンパク質配列に結合された請求項４１または４７のフラグメントか ら成るキメラタンパク質。
49. ４９．第１細胞の表面上に発現されるとき、第２細胞の表面上に発現されたＮｏ ｔｃｈタンパク質とｉｎｖｉｔｒｏで結合できることにより特徴づけられる、Ｄ ｅｌｔａタンパク質の実質的に精製されたフラグメント。
50. ５０．図１３（配列番号：６）に示したアミノ酸番号１〜２３０に最大の相同性 を有するＤｅｉｔａタンパク質の部分である、請求項４９記載のブラグメント。
51. ５１．異種タンパク質配列に結合された請求項４９のフラグメントから成るキメ ラタンパク質。
52. ５２．第１細胞の表面上に発現されるとき、第２細胞の表面上に発現された第２ Ｄｅｌｔａタンパク質またはフラグメントとｉｎｖｉｔｒｏで結合できることに より特徴づけられる、Ｄｅｉｔａタンパク質の実質的に精製されたフラグメント 。
53. ５３．図１３（配列番号：６）に示したおよそアミノ酸番号３２〜２３０に最大 の相同性を有するＤｅｌｔａタンパク質の部分である、請求項５２記載のフラグ メント。
54. ５４．異種タンパク質配列に結合された請求項５２のフラグメントから成るキメ ラタンパク質。
55. ５５．第１細胞の表面上に発現されるとき、第２細胞の表面上に発現されたＮｏ ｔｃｈタンパク質とｉｎｖｉｔｒｏで結合できることにより特徴づけられる、Ｓ ｅｒｒａｔｅタンパク質の実質的に精製されたフラグメント。
56. ５６．図１５（配列番号：９）に示したおよそアミノ酸番号８５〜２８３のアミ ノ酸配列に最大の相同性を有するＳｅｒｒａｔｅタンパク質の部分である、Ｓｅ ｒｒａｔｅタンパク質の実質的に精製されたフラグメント。
57. ５７．異種タンパク質配列に結合された請求項５６のフラグメントから成るキメ ラタンパク質。
58. ５８．第１細胞の表面上に発現されるとき、第２細胞の表面上に発現されたＤｅ ｌｔａタンパク質とｉｎｖｉｔｒｏで結合できることにより特徴づけられる、請 求項４１のフラグメントの誘導体または類縁体。
59. ５９．第１細胞の表面上に発現されるとき、第２細胞の表面上に発現されたＮｏ ｔｃｈタンパク質とｉｎｖｉｔｒｏで結合できることにより特徴づけられる、請 求項４９のフラグメントの誘導体または類縁体。
60. ６０．第１細胞の表面上に発現されるとき、第２細胞の表面上に発現．された第 ２Ｄｅｉｔａタンパク質とｉｎｖｉｔｒｏで結合できることにより特徴づけられ る、請求項５２のフラグメントの誘導体または類縁体。
61. ６１．第１細胞の表面上に発現されるとき、第２細胞の表面上に発現された第２ タンパク質とｉｎｖｉｔｒｏで結合できることにより特徴づけられ、該第２タン パク質がＮｏｔｃｈタンパク質、Ｄｅｌｔａタンパク質および第２Ｓｅｒｒａｔ ｅタンパク質より成る群から選ばれる、請求項５５のフラグメントの誘導体また は類縁体。
62. ６２．少なくとも４０個のアミノ酸から成るヒトＮｏｔｃｈタンパク質の実質的 に精製されたタンパク質。
63. ６３．ヒトＮｏｔｃｈタンパク質をコードする実質的に精製された核酸。
64. ６４．ヒトＮｏｔｃｈタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を含む実質的に精製 された核酸。
65. ６５．請求項６４のｃＤＮＡ配列に相補的で、それにハイブリダイズし得るヌク レオチド配列を含む実質的に精製された核酸。
66. ６６．ヒトＮｏｔｃｈタンパク質の機能的に活性な部分をコードする実質的に精 製されたｃＤＮＡ配列。
67. ６７．請求項６６のｃＤＮＡ配列に相補的で、それにハイブリダイズし得るヌク レオチド配列を含む実質的に精製された核酸。
68. ６８．図１９Ａ（配列番号：１３）、１９Ｂ（配列番号：１４）、１９Ｃ（配列 番号：１５）、２０Ａ（配列番号：１６）、２０Ｂ（配列番号：１７）、２０Ｃ （配列番号：１８）、２０Ｄ（配列番号：１９）、２１Ａ（配列番号：２０）、 ２１Ｂ（配列番号：２１）、２２Ａ（配列番号：２２）、２２Ｂ（配列番号：２ ３）、２２Ｃ（配列番号：２４）、または２２Ｄ（配列番号：２５）に示したＤ ＮＡ配列を含む実質的に精製されたｃＤＮＡ分子。
69. ６９．前記Ｎｏｔｃｈタンパク質が図１９Ａ（配列番号：１３）、１９Ｂ（配列 番号：１４）、１９Ｃ（配列番号：１５）、２０Ａ（配列番号：１６）、２０Ｂ （配列番号：１７）、２０Ｃ（配列番号：１８）、２０Ｄ（配列番号：１９）、 ２１Ａ（配列番号：２０）、２１Ｂ（配列番号：２１）、２２Ａ（配列番号：２ ２）、２２Ｂ（配列番号：２３）、２２Ｃ（配列番号：２４）、または２２Ｄ（ 配列番号：２５）に示したＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、 請求項６３記載の核酸。
70. ７０．図８（配列番号：１）に示したショウジョウバエＮｏｔｃｈ配列の上皮増 殖因子様繰返し１１および１２に最大の相同性を有するヒトＮｏｔｃｈタンパク 質の少なくとも７７個のアミノ酸部分をコードするＤＮＡ配列を含む実質的に精 製された核酸。
71. ７１．ＡＴＣＣに寄託されて受託番号６８６１０を指定されたプラスミドｈＮ４ ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈｃＤＮＡを含む実質的に精製された核酸。
72. ７２．ＡＴＣＣに寄託されて受託番号６８６０９を指定されたプラスミトｈＮ３ ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈｃＤＮＡを含む実質的に精製された核酸。
73. ７３．ＡＴＣＣに寄託されて受託番号６８６１１を指定されたプラスミドｈＮｓ ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈｃＤＮＡを含む実質的に精製された核酸。
74. ７４．図２３に示したＤＮＡコード配列を含む実質的に精製された核酸。
75. ７５．図２４に示したＤＮＡコード配列を含む実質的に精製された核酸。
76. ７６．ヒトＮｏｔｃｈタンパク質の細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ配列を 含む実質的に精製された核酸。
77. ７７．ヒトＮｏｔｃｈタンパク質の細胞内ドメインをコードするｃＤＮＡ配列を 含む実質的に精製された核酸。
78. ７８．ヒトＮｏｔｃｈタンパク質の細胞外および膜貫通ドメインをコードするｃ ＤＮＡ配列を含む実質的に精製された核酸。
79. ７９．ヒトＮｏｔｃｈタンパク質のＥＧＦ相同繰返しをコードするｃＤＮＡ配列 を含む実質的に精製された核酸。
80. ８０．ヒトＮｏｔｃｈタンパク質のＮｏｔｃｈ／ｉｎ−１２繰返しをコードする ｃＤＮＡ配列を含む実質的に精製された核酸。
81. ８１．少なくとも７７個のアミノ酸のヒトＮｏｔｃｈタンパク質のフラグメント をコードする実質的に精製されたｃＤＮＡ分子。
82. ８２．少なくとも４０個のアミノ酸のヒトＮｏｔｃｈタンパク質のフラグメント をコードする実質的に精製されたｃＤＮＡ分子。
83. ８３．図２３に示したアミノ酸配列をコードする実質的に精製された核酸。
84. ８４．図２４に示したアミノ酸配列をコードする実質的に精製された核酸。
85. ８５．請求項３６のタンパク質をコードする実質的に精製された核酸。
86. ８６．請求項４１のフラグメントをコードする実質的に精製された核酸。
87. ８７．請求項４５のフラグメントをコードする実質的に精製された核酸。
88. ８８．請求項４７のフラグメントをコードする実質的に精製された核酸。
89. ８９．請求項４９のフラグメントをコードする実質的に精製された核酸。
90. ９０．請求項５２のフラグメントをコードする実質的に精製された核酸。
91. ９１．請求項５５のフラグメントをコードする実質的に精製された核酸。
92. ９２．請求項４８のキメラタンパク質をコードする核酸。
93. ９３．請求項５１のキメラタンパク質をコードする核酸。
94. ９４．請求項５４のキメラタンパク質をコードする核酸。
95. ９５．請求項６３の核酸を含む核酸ベクター。
96. ９６．請求項６６のｃＤＮＡ分子を含む核酸ベクター。
97. ９７．請求項８５の核酸を含む核酸ベクター。
98. ９８．請求項８６の核酸を含む核酸ベクター。
99. ９９．請求項８７の核酸を含む核酸ベクター。
100. １００．請求項８８の核酸を含む核酸ベクター。
101. １０１．請求項８９の核酸を含む核酸ベクター。
102. １０２．請求項９１の核酸を含む核酸ベクター。
103. １０３．請求項９５の核酸ベクターを含む組換え細胞。
104. １０４．請求項９６の核酸ベクターを含む組換え細胞。
105. １０５．請求項９７の核酸ベクターを含む組換え細胞。
106. １０６．請求項９８の核酸ベクターを含む組換え細胞。
107. １０７．請求項９９の核酸ベクターを含む組換え細胞。
108. １０８．請求項１００の核酸ベクターを含む組換え細胞。
109. １０９．請求項１０１の核酸ベクターを含む組換え細胞。
110. １１０．請求項１０２の核酸ベクターを含む組換え細胞。
111. １１１．請求項１０３の組換え細胞を生育させ、これにより核細胞からヒトＮｏ ｔｃｈタンパク質を発現させ、そして発現されたヒトＮｏｔｃｈタンパク質を単 離することを含む、ヒトＮｏｔｃｈタンパク質の生産方法。
112. １１２．請求項１０４の組換え細胞を生育させ、これにより該細胞からヒトＮｏ ｔｃｈの一部分を発現させ、そして発現されたヒトＮｏｔｃｈ部分を単離するこ とを含む、ヒトＮｏｔｃｈタンパク質の一部分の生産方法。
113. １１３．請求項１０５の組換え細胞を生育させ、これにより該細胞からタンパク 質を発現させ、そして発現されたタンパク質を単離することを含む、タンパク質 の一部分の生産方法。
114. １１４．請求項１０６の組換え細胞を生育させ、これにより該細胞からＮｏｔｃ ｈタンパク質のフラグメントを発現させ、そして発現されたＮｏｔｃｈタンパク 質のフラグメントを単離することを含む、Ｎｏｔｃｈタンパク質のフラグメント の生産方法。
115. １１５．請求項１０７の組換え細胞を生育させ、これにより該細胞からヒトＮｏ ｔｃｈタンパク質のフラグメントを発現させ、そして発現されたヒトＮｏｔｃｈ タンパク質のフラグメントを単離することを含む、ヒトＮｏｔｃｈタンパク質の フラグメントの生産方法。
116. １１６．請求項１０８の組換え細胞を生育させ、これにより該細胞からショウジ ョウバエＮｏｔｃｈタンパク質のフラグメントを発現させ、そして発現されたシ ョウジョウバエＮｏｔｃｈタンパク質のフラグメントを単離することを含む、シ ョウジョウバエＮｏｔｃｈタンパク質のフラグメントの生産方法。
117. １１７．請求項１０９の組換え細胞を生育させ、これにより該細胞からＤｅｉｔ ａタンパク質のフラグメントを発現させ、そして発現されたＤｅｌｔａタンパク 質のフラグメントを単離することを含む、Ｄｅｉｔａタンパク質のフラグメント の生産方法。
118. １１８．請求項１１０の組換え細胞を生育させ、これにより該細胞からＳｅｒｒ ａｔｅタンパク質のフラグメントを発現させ、そして発現されたＳｅｒｒａｔｅ タンパク質のフラグメントを単離することを含む、Ｓｅｒｒａｔｅタンパク質の フラグメントの生産方法。
119. １１９．ヒトＮｏｔｃｈタンパク質と結合し、ショウジョウバエＮＯｔｃｈタン パク質とは結合しない抗体。
120. １２０．請求項４１のフラグメントと結合する抗体。
121. １２１．請求項４９のフラグメントと結合する抗体。
122. １２２．請求項５２のフラグメントと結合する抗体。
123. １２３．請求項５５のフラグメントと結合する抗体。
124. １２４．請求項１１９の抗体のイディオタイプを含む該抗体のフラグメントまた は誘導体。
125. １２５．請求項１２０の抗体のイディオタイプを含む該抗体のフラグメントまた は誘導体。
126. １２６．ＡＴＣＣに寄託されて受託番号６８６０９を指定されたプラスミドｈＮ ３ｋによりコードされるＮｏｔｃｈタンパク質配列、またはＡＴＣＣに寄託され て受託番号６８６１１を指定されたプラスミドｈＮ５ｋによりコードされるＮｏ ｔｃｈタンパク質配列と結合し、ショウジョウバエＮｏｔｃｈタンパク質とは結 合しない抗体。
127. １２７．（ａ）Ｓｅｒｒａｔｅタンパク質とＤｅｉｔａタンパク質の両方に相同 な第１のアミノ酸配列、および（ｂ）Ｓｅｒｒａｔｅタンパク質かＤｅｉｔａタ ンパク質のいずれか一方に相同でない第２のアミノ酸配列、を含むタンパク質ま たはペプチドをコードする実質的に精製された核酸。
128. １２８．第１細胞の表面上に発現されるとき、第２細胞の表面上に発現されたＳ ｅｒｒａｔｅタンパク質とｉｎｖｉｔｒｏで結合できることにより特徴づけられ る、ＮＯｔｃｈタンパク質の実質的に精製されたフラグメント。
129. １２９．図１５（配列番号：９）に示したおよそアミノ酸番号７９〜２８２のア ミノ酸配列に最大の相同性を有するＳｅｒｒａｔｅタンパク質の部分である、Ｓ ｅｒｒａｔｅタンパク質の実質的に精製されたフラグメント。
130. １３０．（ａ）第１細胞の表面上に発現されるとき、第２細胞の表面上に発現さ れた第２Ｄｅｉｔａタンパク質またはフラグメントもしくは誘導体とｉｎｖｉｔ ｒｏで結合できること、および（ｂ）第３細胞の表面上に発現されるとき、第４ 細胞の表面上に発現されたＮｏｔｏｈタンパク質とｉｎｖｉｔｒｏで結合できな いこと、により特徴づけられる、Ｄｅｉｔａタンパク質の実質的に精製されたフ ラグメントまたは誘導体。
131. １３１．Ｎｏｔｃｈタンパク質を発現する細胞に薬剤を運搬する方法であって、 該Ｎｏｔｃｈ発現細胞を分子にさらして該分子が該細胞中に運搬されるようにす ることから成り、該分子は薬剤に結合されたＤｅｉｔａタンパク質またはＤｅｉ ｔａフラグメントもしくは誘導体から成り、該Ｄｅｉｔａタンパク質、フラグメ ントまたは誘導体が、第１細胞の表面上に発現されるとき、第２細胞の表面上に 発現されたＮｏｔｃｈタンパク質とｉｎｖｉｔｒｏで結合できることにより特徴 づけられる、上記の運搬方法。
132. １３２．図２３または２４に示したＤＮＡコード配列の少なくとも２５個のヌク レオチドを含む単離された核酸発明の詳細な説明