JPH07506486A - 免疫グロブリンＥの高アフィニティレセプタのヒトβサブユニットの分離，特性化および用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫グロブリンＥの高アフイニテイレセブタのヒトβサブユニットの分離、特性 化および用法発明の背景 １、発明の分野 本発明は免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）の高アフィニティレセプタのα、β、およ びγサブユニットを、特にヒトβサブユニットをコードしたＤＮＡセグメントに 関する。本発明はさらにそのα、β、およびγサブユニットをコードしたＤＮＡ をホスト細胞中で同時に発現させることによりレセプタを産生ずる方法に関する 。

２、関連技術 免疫グロブリンのＦｃ領域と結合したレセプタ（ｒＦｃレセプタ」）は、膜を遥 しての免疫輸送を媒介し、抗原−抗体複合体により誘起される種々の細胞活性を 刺激し、おそらく抗体の生合成を規制する。三種のレセプタ［ポリマー性免疫グ ロブリンニ対するレセプタ（Ｉｌｏｔｌｏｗ他　（１１８４１Ｎｓ１ｗｒ＠（Ｌ ＋５ｄｅｓｌ　３０Ｌ３７−４３　）　、マクロファージおよびリンパ球上のＦ ｃレセプタ（ｌｌ＊ｗ＊ｌｓｃ＆他　（１９０）　Ｓｃｉ＠＠ｃｅ　２３４ニア １ｇ−７２５　）　、及びマスト細胞および好塩基球上の高アファニテイレセプ ターＦ　Ｃ（Ｋｉａｓｌ他（１９＋１？）　ＢｉｏｃＴｈｓｍｉａｊＢ　２６： ４６０５−４６１０；　５ｂｉｓ■ｗ他　（１９８８）Ｆｒ＋＋ｃ、　ｌ１ｓｔ １．　Ａｃ１ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾８５：１９Ｇ？−１９１１ＨＫｏｃｂ■他 （１９８８１Ｎｓｃｌ＊ｉｃ　Ａｃ１ｄ＠ｌｅ１．　１６＋３５Ｎ　）　］は共 通の特徴があり、それらの免疫グロブリン結合部は二つ以上の免疫グロブリン類 似の領域を有している。

高アフィニティＩｇＥレセプタＦ　ｃ　ｈ　ＲＩはアレルギー反応を開始するの に寄与する。アレルゲンのレセプタ結合１ｇＥへの結合は細胞を活性化させアレ ルギーを発現する媒体（ヒスタミンのような）を放出する。このレセプタはテト ラマー複合体αβγ２でこれはマスト細胞および好塩基球の表面に見られる。

ＩｇＧ（Ｆｃ、Ｒ１１１）に対する低アフィニティレセブタと会合しであるいは Ｔ細胞抗原レセプタと会合してＦｃｅＲＩのγ鎮はマクロファージ、ＮＫ細胞お よびＴ細胞に見出されているが、ａおよびβサブユニットはその他の造血細胞に は検出されていない。

ａおよびγに対する遺伝子は、両者ともヒト（Ｌ＠Ｃｏａｉｓｌ。

１１９１１）およびマウスの染色体１に局在している。（Ｈｌｌｌｌｌｉ、　１ ９Ｎ。

Ｋｉｓ＠Ｉ他１９ｇ７；　Ｋｏｃｈｓａ他１り！Ｈ；　Ｓｈｉｍｉｓｗ他１９８ ８；　Ｉｇ他１９８９゜）マウスβに対する遺伝子は、マウスの染色体１９に局 在しており、単一遺伝子であると信じられている（Ｌｐｐｉ、１９８１１　）。

ラットのα遺伝子の構造（Ｔ＠１ｔｒ、Ｒ１１９）およびγ遺伝子の構造（Ｋｗ ｓｊｅｔ、１９９０）はヒトで特性化されているが、β遺伝子の構造はヒトで特 性化されていない。

ＩｇＥ　Ｆｃ、ＲＩに高アフィニティーを有するレセプタはマスト細胞、好塩基 球、ランゲルハンス細胞、および関連細胞にのみ見出される。ＩｇＨにより占有 されたＦ　ｃ　＊　Ｒ１の抗原による凝集は、ヒスタミンおよびセロトニンのよ うな予め生成した媒体を放出させ、またロイコトリエンの合成を刺激するきっか けとなる。これらの媒体の放出によりアレルギー状となる。

最も徹底的に特性化されたＦｃ、ＲＥは、ラット好塩基性白血病細胞系（Ｆ　Ｅ 　Ｌ）のものである。これは次の三つの異なるサブユニットから成る。（１）Ｉ ｇＥに対する結合部位を有する４０−５０キロダルトン（Ｋｄ）の糖蛋白アルフ ァ鎖、（２）単一の３３Ｋｄベータ鎖、および（３）二つの７−９Ｋｄジサルフ ァイド結合ガンマ鎖（Ｈ１Ｍ＠ｌｔｌ＊ｒ　ｓｌ　ｓｌ、Ａｓｓ、　ｌｌ＠マ。

ｌｍｍ５ｎｏ１．４：４１９−４７０　（１０６）　）。

ラットａサブユニットに対する相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）が分離されている（ Ｊ、　−Ｐ、　Ｉｉａ＠ｌ　＠ｌ　ｓｌ、、　１ｉｅｃｋｓｓｉ１ｒｙ　２６： ４６０５−４６１０１９８７）　）。しかしながら以前には、βおよびγサブユ ニットの分離および特性化が開示されたことはなく、また形質移入された細胞に よるＩｇＥ結合を発現することもできなかった（１．−Ｐ、　Ｋ１５ｅ＋　ｅｌ 　＊１．、１ｉｏｃｂｅｓｉｔｌｒｔ　Ｈ：４ＧＯ５−４６１０；　Ａ。

ｌｋｉ冒■ｉ　ｃｌ　ｓｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｌ目、　＾ｃｓｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　 Ｈ：１９０７−１９１１（１９８ｇ＋）。

げっ歯動物およびヒトのサブユニットのいくつかの分子クローニングにより、形 質移入により表面発現されたレセプタ複合体の再構成ができた。これらの研究に よる驚くべき発見の一つは、異なる種で表面発現のための条件が異なることであ った。

ラット（ＩＩＩｌｍＬ　Ｈｇ９　）あるいはマウス（Ｒ畠、（９Ｎ）レセプタの 効率的な表面発現を促進するには三つの鎖α、β、およびγのサブユニットの同 時形質移入が必要である。これと対照的に、ヒトαγ複合体の成る表面発現は繊 維芽細胞のαおよびγだけの同時形質移入により達成することができ、βは不必 要であろうことを示唆している（Ｍｉｌｌｅｒ、１９８９）。この結果および以 前にはヒトβサブユニットの遺伝子がクローン化できなかったことは、ヒトβが 存在していない可能性と、αγ複合体がヒトの細胞に天然に存在している可能性 を提起した。

高アフィニティＩｇＥレセプタＦｃ、ＲＴは、α鎖、β鎖、および二つのジサル ファイド結合γ鎖（鎖とサブユニットとは本明細書中では互換的に用いる）より 成るテトラマーヘテロオリゴマーである。β鎖は四つの膜トランスメンブレン（ ＴＭ）セグメントおよび長い細胞質領域を有し、これらは細胞内シグナル伝達に 重要な役割を果たすと考えられる。そもそもヒトベータサブユニットが存在する のかを決めることは大変困難で、仮に存在していてもその遺伝子を分離すること は非常に困難なことであった。本発明はこれらの困難を克服し、驚くべきことに Ｆｃ、ＲＩのヒトβサブユニットに対するｃＤＮＡクローンを提供するものであ る。

さらに本発明は、完全なヒトＦｃ、Ｒ１レセプタを産生ずる方法を提供し、βサ ブユニットを抑止することによりこのレセプタの生成あるいはその機能を抑止す る方法を提供するもので本発明の一態様は、Ｆｃ、ＲＩサブユニットをコードす る核酸セグメントを提供することにある。

本発明の一態様は、Ｆｃ、Ｒ１のα、β、およびγサブユニットをコードする核 酸配列を提供することにある。特に、本発明は、ＤＮＡ配列に関するものである 。本発明の一態様は、完全なヒトβ遺伝子およびｃＤＮＡの構造の特性化と配列 に関する。ヒトベータのクローニングの成功は期待されず、失敗続きだった。様 々なｃ　ＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために、単に、げっ歯動物の ベータプローブを用いて、ヒトベータ遺伝子をクローニングする試みでは、ヒト ベータ遺伝子をコードするｃＤＮＡクローンは単離できなかった。げっ歯動物の ベータに相同性のある非常に短いフラグメント（１５３ｂ　ｐ）のみが単離され た。しかし、このフラグメントは、該領域のベータと相同性があることで知られ ているＣＤ２０のようなベータ類似分子の一部であると思われるため、げっ歯動 物のベータ配列からの情報を用いることによって、ＰＣＲ技術により、ヒトベー タをクローニングしていた。しかし、ヒトとげっ歯動物のベータの相同性は、コ ード領域で、６９％の相同性があるが、ＰＣＲ反応には十分でない。この方法を 用いても、ヒトベータ遺伝子は単離できなかった。

ヒトベータがアルファーガンマ複合体の発現に必要でないと思われていたため、 ヒトベータの存在が疑問視された。遺伝子の転移の研究によって、アルファ、ベ ータおよびガンマの３つの遺伝子の形質移入による転移が、ラットとマウスのレ セプタの発現に必要であることが示された。しかし、ヒトアルファとガンマの形 質移入により、繊維芽細胞におけるヒトレセプタの表面発現を十分に促進できる ことから、ヒトレセプタの表面発現に、ヒトベータは必要でないことが示唆され た。そのような結果から、ヒトベータの存在に関して、興味ある疑問が生じた。

ヒトベータは、アルファーガンマ複合体の機能上は必要ではなかった。ガンマ遺 伝子の細胞質尾部の形質移入により、細胞が十分活性化される。いくつかのグル ープでは、ガンマ鎮の細胞質領域は、多数の生化学的シグナルを仲介できるため 、細胞を活性化するという見解をもった。これらのシグナルは、チロシンキナー ゼの活性化、ホスホイノシチドの加水分解、カルシウムの動態化、Ｔ細胞のＩＬ ２の産生、マスト細胞の脱顆粒化、および細胞破壊を含む。ガンマの細胞質領域 は、細胞を活性化すると考えられる１０−１２アミノ酸残基のモチーフをもって いることが証明された。このモチーフは、様々な細胞で、多（の異なるシグナル を引き起こすことができる。このモチーフは、転移ができ、交換できると考えら れる。これらの見解から、ヒトベータの存在に関する疑問が、再び生じた。ガン マ鎖により細胞の活性化が十分にできれば、ベータの必要性はないと思われた。

また、ヒトベータをクローニングできなかったり、（ラットやマウスのプローブ を用いて）ヒト細胞のヒトベータの転写物を検出できなかったので、ヒトベータ 遺伝子の存在が疑問視された。

クローニングには、発明的な方法と永続性が必要であった。

さらに、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために用いられた１５３ｂ ｐフラグメントは、役に立たなかりた。

しかし、たとえその相同性が約７０％しかなかったとしても、１ｓａｂｐがヒト ベータの一部であると想定することによって、２５ｋｂの遺伝子クローンが発見 された。ラットのベータ配列に相当するオリゴヌクレオチドプローブと特異的に ハイブリダイズすると思われる小さい挿入物が見つかった。ヒトベータをコード する挿入物を探す中で、すべてのこれら挿入物（全部で１１ｋｂ）は、異なるエ クソンを再構築するように配列されていた。推定されているヒトベータ遺伝子か ら７番目のエクソン上で、最初のエクソンの先端と、コード配列の末端が何であ るかを取り扱うことによって、推定されるｃＤＮＡのヒトベータ配列が、ＰＣＨ により（ＰＣＲ反応のために鋳型としてヒト好塩基球より得られた最初の鎖の逆 転写物を用いることによって）生じた。

単離された遺伝子およびｃ　Ｄ　Ｎ　Ａが、ヒトベータ遺伝子をコードしている ことが証明された。単離された遺伝子およびｃ　ＤＮＡは、げっ歯動物のベータ と相同性があるベータ様分子、あるいはＣＤ２０様分子に相当すると考えられる 。しかし、６９％の相同性では、これらの配列がヒトベータをコードしている証 明の基準にはならない。トランスフェクタントにおけるアルファ、ベータ、およ びガンマの同時発現は、生じたｃＤＮＡがヒトベータを本当にコードしているこ とをむしろ証明するのに望ましい。しかし、これらの実験は以下の理由により成 功しなかった。

１、ヒトアルファとヒトガンマ同時形質移入は、線維芽細胞上のレセプタの表面 発現および機能再構成に十分である。

２、ヒトベータｃＤＮＡをアルファおよびガンマと同時形質移入する場合、形質 移入効率が上昇しない。

第２０図には、Ｃ０８−７細胞中のヒトアルファおよびガンマの形質移入は、形 質移入物の表面にアルファーガンマ複合体を発現させるに充分であることが示さ れている。ラットＩｇＥレセプタの発現において、ヒトベータが、ラフトベータ に置換できないことも示されている。したがって、ヒトベータが完全な複合体の 発現を促進するかどうかを見るために、アルファおよびガンマの同時形質移入が 作用しない条件を用いた（第２０図）。これは、ヒトガンマの細胞室尾部の先端 切断により行なった。これらの条件下で、ヒトアルファの切断ヒトガンマとの同 時形質移入では、複合体の発現はなかった。しかしながら、ヒトベータ（しかし ＣＤ２０のものではない）と、アルファおよび切断ガンマとの同時形質移入では 、ＩｇＥを結合できる機能性複合体の発現があった。これらの条件下で、ヒトア ルファおよび先端切断ガンマサブユニットの発現には、ラットベータサブユニッ トはヒトベータサブユニットの代わりにはならなかった。この検定は、ヒトベー タがこの二つの他の鎖に特異的に会合することを示したものである。したがって 、これらの新しい結果は、ヒトベータはヒトＩｇＥレセプタの一部であり、単に ＣＤ２０類似の分子ではないことを示している。これらの結果は、以前には想像 できなかったヒトベータの重要性を示している。

第２１図には、ＫＵ８１２細胞中でのアルファーガンマの形質移入が、非常に僅 かのレセプタ発現であったことが示されている。発現のレベルは、ベータとガン マとの形質移入の後に得られたレベルと類似のものである。したがって、このレ ベルは内因性アルファ（ベータとガンマとの形質移入について）あるいは内因性 ベータ（アルファとガンマとの形質移入について）によるものであろう。これと 対照的に、三つのｃＤＮＡの同時形質移入後の発現のレベルは非常に実質的なも のである。

結論として、 １、マスト細胞および好塩基球では、レセプタの発現のレベルを規制するものは 繊維芽細胞におけるものとは異なるものであろう。

２、ヒトマスト細胞および好塩基球では、レセプタの発現にはアルファ、ベータ 遺伝子およびガンマの存在が必要であり、形質移入された繊維芽細胞にはヒトア ルファおよびガンマが充分にある。

ヒトベータサブユニット遺伝子は約１０ｋｂのスパンであり、七つのエクソンを 有する。ＴＡＴＡボックスが先行する単一の転写開始部位がある。第一のエクソ ンが５゛非転翻訳域およびＮ−末端細胞質テールの一部をコードする。トランス メンブレン（ＴＭ）１がエクソン２および３にコードされ、７Ｍ２がエクソン３ および４にコードされ、７Ｍ３がエクソン５に、１Ｍ４がエクソン６にコードさ れる。第７番目および最後のエクソンはＣ末端細胞質テール端および３°未未翻 訳列をコードする。

ヒトβ遺伝子は単独のコピー遺伝子のようである。

およそ３．９ｋｂのダブレットとして検知される二つの対応する転写物が、興な る個体からのマスト細胞および好塩基球り二−ジの中に存在するが、試験したそ の他の造血細胞には、存在しない。ヒトβ蛋白はげっ歯動物βと相同である。ヒ ト、マウス、およびラットβの共通アミノ酸配列は、６９％の同一残基を示す。

本発明のもう一つの態様として、本発明はＦｃ、ＲＩのα、β、およびγサブユ ニットに対応するポリペプチドを提供する。

より具体的には、天然の環境から分離されたヒトβサブユニットに相当するポリ ペプチドを提供する。これは、組換法により産生する又は当業に既知の装置によ り合成されるかいずれかの、あるいは蛋白の分離および精製法により分離精製さ れたポリペプチドのアミノ酸配列を含むものとして定義される。ポリペプチドは 、アミノ酸の全体配列、あるいはその中の選択された部分を含む。例えば、（１ ）レセプタのアセンブリ、（２）細胞活性化、及び／又は（３）アルファおよび ガンマサブユニットとの複合化、に必須のヒトベータサブユニットの部分（領域 ）を含む。「天然の環境」とは、蛋白の形で他のタイプの蛋白と共に天然に生じ る細胞中のサブユニット及び一般的にサブユニットと構造的にあるいは機能的に 関連する細胞成分として定義することができる。

本発明のもう一つの態様は、ベクターおよびＦｃ、Ｒｒのα、β、およびγサブ ユニットをコードするＤＮＡセグメントを含む組換えＤＮＡ分子を提供すること である。

本発明のもう一つの態様は、上述の組換えＤＮＡ分子を含む細胞を提供すること である。

本発明のもう一つの目的は、げっ歯動物およびヒトの両方の種において、Ｆｃ、 ＲＴのα、β、およびγサブユニットに対応するアミノ酸配列を有するポリペプ チドを産生ずる方法を提供することである。

繊維芽細胞状の細胞中の形質移入されたレセプタの表面発現を分析すると、ヒト αγ複合体およびαβγ複合体は同等な効率で発現されていることが分かる。予 期しなかったことに、アセンブリ規則は他のヒト細胞と異なっていた。さらに、 ヒトβはラットβより効率的にヒトαと相互作用する。対照的に、ラットβもマ ウスβも両者ともヒトβよりはるかに効率的に対応するα鎖と相互作用し、α− β相互作用の強い種特異性が示される。

本発明のもう一つの目的は、機能性Ｆｃ、Ｒｒレセプタを産生ずる方法を提供す ることである。

一つの例において、本発明はＦｃ、ＲＩのα、β、およびγサブユニットに対応 するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード化するＤＮＡセグメントに関す る。

もう一つの例において、本発明はＦＣＥＲＩのα、β、およびγサブユニットに 対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを産生ずる方法に関する。

さらにもう一つの具体例において、本発明はベクター、およびＦｃ、ＲＩのα、 β、およびγサブユニットに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー ドするＤＮＡセグメントを有する組換えＤＮＡ分子に関する。

他の例において、本発明は、上記の組換えＤＮＡ分子を含む細胞に関する。

更なる例において、本発明はＦＣ，ＲＩのα、βおよびγサブユニットに対応す るアミノ酸配列を有するポリペプチドの産生方法に関する。

他の具体例において、本発明は、ホスト細胞にＦＣ，ＲＩのα、β、およびγサ ブユニットをコードするＤＮＡセグメントを導入し、レセプタが生成するような 条件下で上記ＤＮＡセグメントを発現させる機能性ＦＣ，ＲＩレセプタを産生ず る方法に関する。細胞ｃＯ３−７あるいはＣＨＯの表面におけるレセプタの発現 は、ＦＣ，ＲＴの三つのサブユニットについてのｃＤＮＡすべてが同時に同時形 質移入された場合に行なわれる。

ＩｇＥ結合の発現のこの成功により、ＩｇＥレセプタ相互作用の詳細な分析を可 能にし、したがって治療に有効な抑制剤の開発を可能にする。

本発明の一態様では、ヒトベータサブユニットの本質的な関与を抑制することに より、ＴｇＥに対する高アフイニテイレセブタの凝集によるアレルギー反応のカ スケードを止める。ベータサブユニットは、レセプタ凝集及び／又は翻訳シグナ ルの機能を抑制する標的である。このような抑制はアレルギー疾患の予防および 治療に広範に応用できる。何故ならば、レセプタＩｇＥ相互作用からカスケード する望ましくない事象はアレルゲンとは無関係であり、マスト細胞、好塩基球、 ランゲルノ１ンス細胞などのような種々の細胞タイプから生じるからである。

ベータの抑制剤は、鎖、アンチセンス核酸配列、ベータサブユニットポリペプチ ドに結合し得るアミノ酸配列、およびサブユニットに対するモノクローン抗体の 構造あるいは機能を攻撃する化学製剤を有する。

ベータサブユニット抑制剤の有効量は試験管内細胞検定、動物モデル検定、およ び臨床試験により決めることになる。

抑制剤の有効量が、薬学的に許容できるキャリアと一緒になり得る。アレルギー 反応がＦｃ、Ｒ１に関連する細胞タイプが種々であり、反応はアレルゲンとは無 関係であり、そのため投与のルートは全身的でもアトピー性でもよい。

候補抑制剤物質は、本明細書に開示する方法で試験する。

抑制剤物質の試験管内細胞検定は、抑制剤と複合体になった又は抑制剤と一緒に 培養された、ヒトアルファ、ベータ、およびガンマサブユニットをコードする核 酸配列により形質移入されたホスト細胞により行なわれる。Ｆｃ、ＲＩレセプタ による細胞活性化は、ウィルスの存在下と抑制剤不在下とで開始し比較される。

多くの検定ができる。

本発明のその他の目的および長所は以下の記述と実施例により明らかとなろう。

図面の簡単な説明 第１図はヒトＦ　ｃ　、　ＲＩアルファｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列ＩＤ 番号１０）および予測したアミノ酸配列（配列ＩＤ番号１１）を示す。

第２図はラットＦｃ、ＲＩアルファサブユニット（Ｒ）（配列！Ｄ番号１２）、 ヒトＦｃ、ＲＩアルファサブユニット（Ａ）（配列ＩＤ番号１３）、およびマウ スＦｃ、Ｒ１アルファサブユニット（Ｍ）（配列ＩＤ番号１４）のアミノ酸配列 の相同性を示す。この三つが同一の領域をボックスで囲んである。第１番目の位 置が、各蛋白の予測した成熟Ｎ−末端の部位に対応する。

第３図は完全に生物学的に活性なＦｃ、Ｒ１アルファ鎖（ｐＨＡＩ、ｐＨＡｌ　 Ｉ）あるいは可溶性の分泌した生物学的に活性なＦｃ、ＲＩアルファ鎖（ｐＨＡ ｓＩ、ｐＨＡｓ　Ｉ　１）の合成を行なう真核発現ベクターの構築を示すフロー チャートである。この図に示された配列は配列ＩＤ番号２０にも示す。

第４図は可溶性の生物学的に活性なＦｃ、ＲＩアルファ鎮（アミノ酸残基２６− ２０４より成る）の合成を行なう原核発現ベクターの構築を示すフローチャート である。ｐＥＶＡ構造に示した配列は配列！Ｄ番号１５−１７にも示す。ｐＥＶ ＨＡ構築に示した配列は配列ＩＤ番号１８および１９にも示す。

ｐＥＶＨＡｓ構築Ｗ示した配列は配列！Ｄ番号２０および２１にも示す。

第５図はβ　ｃＤＮＡについての制限マツプおよびそれらが配列される方略（ｓ ＋ｔｒａｔｅｇｙ）。開いた矩形はβサブユニットに対するコード化を予知した 配列を示す。線は５°および３゛未翻訳領域を示す。上側のスキームはＰａｔ　 Ｉ　開裂部位を有する１、５キロベース（ｋ　ｂ）クローンを示す。下側のスキ ームはＣ１ａ　Ｉ　開裂部位を有する２、４−ｋｂクローンを示す。後者の３゛ 領域は斜線で示したように切断されている。その未翻訳部分はクローンの残りと 同様に完全に配列されている。制限部位は垂直な線で示す：Ｈｆ、Ｈｉｎｆｌ； Ｈｈ、Ｈｂａ　Ｉ；　Ａ１．ＡＩｕ　Ｉ；　Ｈｐ、Ｉ（ｐｈｌ；Ａｖ、Ａｖａ　 ＩＩ；　Ａｃ、Ａｃｃ　１；Ｅｃ、Ｅｃ。

Ｒ１；　Ｈｄ、Ｈｉｎｄｌｌｌ。水平方向の矢印はジデオキシヌクレオチド鎖− 末端法による配列の方向と程度を示す。

第６図は（Ａ）ヌクレオチド（配列ＩＤ番号２２）およびβサブユニットをコー ドするｃＤＮＡの推定（ｄｅｄｕｃｅｄ）アミノ酸（配列ＩＤ番号２３）配列。

逆矢印（マ）のところで始まり、別の配列（Ｂ）が六つのクローンで観測された 。想定されるトランスメンブラン領域にアンダーラインをした。βサブユニット のトリプシンペプチド（これによりアミノ酸配列が直接決まる）は括弧（＜〉） でくくった。末端近くの想定されるポリ（Ａ）信号にアンダーラインをした。（ Ｂ）β　ｃＤＮＡの欠失形のヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号２４）のつづき。

３°はＡ（マ）で示したところで結合。

第７図はβサブユニットをコードするｃＤＮＡの発現。（Ａ）生体内および生体 外の翻訳産物の比較。ＲＢＬ細胞は［３５３］システイン含有媒地中で成長。細 胞の洗剤抽出物をｍＡｂβ（ＪＲＫ）で沈殿させ、激しく洗った後、サンプルバ ッファーで抽出し、電気泳動にかけた（レーン１）。この実験では、レセプタを 完全に解離するように充分高濃度で洗剤を用いた。βｃ　ＤＮＡからの転写物を 生体外で［１９Ｓ］メチオニン含有媒地中で処理したくレーン２．３、および５ ）。

対照インキュベーションはｃ　ＤＮＡを含んでいなかった（レーン４）。混合物 を透明化イムノプレシビテーション（ｃｌｅ＊＋ｉＢ　ｉｍｍｗｍｏｐ＋ｅｃｉ ｐｌｓｌｉｏａ　）の後にβサブユニットへのモノクローナル抗体と反応させた 。特異的に洗浄した沈澱物をサンプル・バッファに溶かして電気泳動にかけた。

レーン２と４−ｍＡｂβ（ＪＲＫ）、レーン３−ｍＡｂ　ｆ　１　（ＮＢ）　、 レーン５−無関係のモノクローナル抗体［ｍＡｂβ（ＬＢ）］、１２．５％ポリ アクリルアシドゲル上で還元性条件で標本を解析したオートラジオグラフを示す 。（Ｂ）βサブユニットのＮＨ，末端ペプチドへの１つのエピドームの局在化。

β　ｃＤＮＡを含むベクターをＴ７ポリメラーゼを使って転写する前にＨｈａｌ で消化した。得られたｍＲＮＡを翻訳すると、［Ｓ５Ｓ］メチオニンで標識され たβサブユニットβ（アミノ酸１−２１）のＮＨ２末端ペプチドが生成した。こ の混合物をｍＡｂβ（ＪＲＫ）（レーン１）及び無関係のｍＡｂ　（ＬＢ）（レ ーン２）と反応させた。沈澱物を１７％ゲル上で非還元性条件で解析した。（Ｃ ）βサブユニットのＣ０ＯＨ末端断片のＥ、ｃｏｌｉ発現。ヌクレオチドを含む Ｈｉｎｆｌ断片をＥ、ｃｏｌｉ中（Ｃ＋ｏｖｌ他（１９Ｈ）　Ｇｅｅｔ３８：３ ｌ−３８）にサブクローン化し、抽出物を調製した。蛋白をＡと同様に電気泳動 し、ニトロセルロース紙に移した。後者を順次モノクロール抗体ｍＡｂβ（ＮＢ ）と反応させ、アルカリ性ホスファターゼ結合ヤギ・抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）と ともに展開し、通常の方法で現像した（ｌｔｉｙｅｒｓ他（夏９８８）　Ｍｏ１ ．　１ｓｓａｎｏ１．）　ｏイムツブａ−ｔトの下半部を拡大して示す。レーン １−挿入物なしの形質転換体からの抽出物、レーン２−誤った方向の挿入物を含 む形質転換体からの抽出物、レーン３−正しい向きの挿入物を含む形質転換体か らの抽出物。（Ｄ）Ｅ、Ｃｏ　Ｉ　ｉで発現されたＨｉｎｆｌ断片によって誘発 されたポリクローナル抗体に対するβサブユニットの反応性。精製したＩｇＥ− リセブタ複合体を電気泳動にかけ、ニトロセルロース紙に移し、抗体と反応させ 、続いて適当なアルカリ性ホスファターゼ結合抗イムノグロブリン抗体と反応さ せた。レーン１−ｍＡｂβ（ＪＲＫ）、レーン２−ｍＡｂβ（ＮＢ）、レーン３ −断片Ａに対する免疫血清、レーン５−断片Ｂに対する免疫血清、レーン４およ び６−それぞれレーン３および５の免疫血清に対応するプレ免疫（ｐ＋ｅｉｓｍ ａｎｅ）血清；レーン７および８、二次抗体のみ。このゲルは分子量標準なしで 行なった。

第８図は、βサブユニットの予知配列のハイドロパンシティ（ｂ７ｄ＋ｏｐｓｌ ｈｉｅ自Ｙ）プロット。Ｅｎｇｌｅｍａｎ等により推奨された処理とハイドロパ ンシティスケール（！１Ｂｅｌ鳳■他（１９８６）＾１１１１１．　Ｒｅｔ、Ｂ ｉｔｒｐｂＨ，Ｃｈｅｗ、Ｉｓ：　３Ｎ−３５３）を用いた。各連続した［窓（ ｗｉｎｄｏｗ）　Ｊに対して２０のアミノ酸に対するネットのハイドロパンシテ ィ値を、１０番目の残基に対応する位置にプロットした。水への移送についての ネットの自由エネルギー＞２０ｋｃａｌ　（１ｃａｌ＝４．１８Ｊ）であること はトランスメンブランセグメントを示唆している（ＥＢｅ１ｍｒｅ他　（１９８ ６１ＡＩｗ、　Ｒ１マ　Ｂｉｏｐｈｙ＋、Ｃｂｔ■、Ｉｓ：　３２１−３５３　 ）。

第９図はラットＦｃ、ＲＩのγサブユニットのヌクレオチド配列（ＳＥＱ　ＩＤ 　ＮＯ：２６）およびそれによって予測されるアミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ：２７）を示す図である。推定トランスメンブレン領域を下線で示す。アミノ 酸残基は、成熟蛋白の第一残基から順に番号を付けである。残基５゜から残基１ までは負の番号を付けてあり、Ｇ、フォノ・ノ１イネ（ｙｏｎ　Ｈｅ１ｉｎｅ） の判定基準（Ｎｏｃｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄ＋　Ｒｅｇ、Ｉイ　４６８３−４６９０ 　（１９８６１’Ｉによる推定シグナル・ペプチドをコードする残基を含んでい る。Ｎ末端およびＣ末端開裂部位を矢印で示しである。カバーされ配列された４ つのトリブチツク・ペプチドは括弧で包んである。最初のトリブチツク・ペプチ ド配列中のあいまいな残基は星印を付けである。

第１０図はＦｃ、Ｒ１のαサブユニット（パネルＡ）、βサブユニット（パネル Ｂ）、γサブユニット（パネル）の予測配列のハイドロパンシティプロットを示 すグラフである。ハイドロパンシティの尺度はエンゲルマン（ＥＢｓｌｍｓｎ） 他に基づく（＾ｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｐｈｙ＋、　Ｂｉｏｐｈｙ＋、　Ｃｂ ｅ＋＋、　１５：３２１−３５３　（１９！１６）　）。

連続する「ウィンドウ」内の２０個のアミノ酸の合計ハイドロパンシティ値を１ ０番目の残基に対応する位置にプロットしである。

第１１図は形質移入されたＣＯ３７細胞およびＲＢＬ細胞によるＩｇＥロゼツト の形成を示す図である。Ｃ０８７細胞は、α、β、γｃ　ＤＮＡのコード化部分 と同時形質移入し、ＴＮＰで誘導体化された赤血球にさらす前にマウスＩｇＥ抗 ＤＮＰで感作させた（パネルＡ）。正の対照として、ＲＢＬ細胞を同様にロゼツ ト形成に関してテストした（パネルＣ）。ロゼツト形成検定の特異性は、マウス の抗ＤＮＰ　ＩｇＥを加える前に、同時形質移入されたＣ０９７細胞（パネルＢ ）およびＲＢＬ細胞（パネルＤ）を（抗ＤＮＰ活性を欠く）ラットＩｇＥで前イ ンキュベートすることにより評価した。

第１２図はｒｇＥのテトラマー高アフィニティーレセプタのモデルを示す図であ る。ポリペプチド（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：２８−３０）は完全に処理済みの形で 示しである。このレセプタは、αサブユニットの大きな細胞外部分が上端にあり 、鎖の残りの部分が左側にくるように配向している。αサブユニット（ＳＥＱ　 ＩＤ　ＮＯ：２８）の右側にその４つのトランスメンブレンセグメントを含むβ サブユニット（ＳＥＱ　ＩＤＮ０：２９）があり、その右側にγ鎖のダイマー（ ＳＥＱＴＤ　ＮＯ＋３０）がある。α鎖のシスティン２６と６８およびシスティ ン１０７と１５１は、ジスルフィド結合されている可能性が高いので対になって おりＦｃアレセブタ中の相同システィンも同様である（Ｍ、トランス（）ｌｉｂ ｂｓ）他、１．　Ｉｍｍａｎｏｌ。

１４Ｇ＋５４４−５５０　（１９８８１）。推定トランスメンブレンセグメント はすべて、２１個の残基からなるように示してあり、αらせん構成になっている と予想される。アミノ酸に単文字コードを使用する（Ｍ、デイホッフ（ＤＢｈｏ ｌｌ　）他、Ａｌｌ■ｏｆ　ＰＩｏｔｅｉｎＳＥｑｕｅｎｅｅ　Ｉｎｄ　Ｓｌ＋ ａｃｌａ＋ｅ、５ａｐｐ１．　３、Ｍ、デイホツフ論、３６３−３７３　、Ｎ１ １．　Ｂｉｏｉｅｄ、Ｒｅｔ、Ｆｎｄｌｎｏ、ワシントンＤ、　Ｃ，（１９８８ ））。

（Ｎ端から順に）１０番目ごとの残基に陰影を付けである。

第１３図はヒトβ遺伝子の制限マツプ構造と構造配列、介在配列を示す図である 。７個のエクソンの位置を枠で示しである。

開始コドンと停止コドンの位置を示しである。

第１４図はヒトＦｃ、ＲＩ　β鎖遺伝子のヌクレオチド配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ：３１）を示す図である。７個のエクソンを太字で示しである。ヌクレオチド の番号は開始コドンを基準にして付けである。ＴＡＴＡＡボックス、翻訳開始コ ドン（ＡＴＧ）　、終了コドン（ＴＡＡ）および潜在的ポリアデニル化シグナル （ＡＡＴＡＡＡ）に下線を付けである。確実に決定されていない塩基はＮで示し である。

第１５図はヒトβ遣・転子とラットβ　ｃＤＮＡ配列をドツト・マトリックス・ プロットによって比較した図である。マックベクター・プログラムのブステルＤ ＮＡマトリックスをヌクレオチド３０個のウィンドウで最小スコア６３％で使用 した。左側に示したローマ数字は７個のエクソンに対応する。

第１６図は好塩基球中での転写物の存在を示す図である。好塩基球に富む白血球 および他の様々な細胞からの全ＲＮＡｌ０μｇを変性アガロース・ゲルで分画し た後、Ｎｙｔｒａｎ膜に写し、ヒトβ　ｃＤＮＡプローブ（パネルＡではヌクレ オチド＋３０６〜＋４５６、パネルＣではヌクレオチド−２〜＋７９０）でハイ ブリッド化した。パネルＡに示した膜ははがして、全長ヒトα　ｃＤＮＡプロー ブ（パネルＢ）で再ハイブリッド化した。

第１７図は転写開始部位の決定を示す図である。

パネルＡでは、好塩基球からのＲＮＡが逆転写され、ポリＡ４の両端にターミナ ル・トランスフェラーゼを付加し、ＰＣＲで増幅した。増幅生成物（ｃＤＮＡ） とゲノムＤＮＡ　（遺伝子）は、同じプライマーで配列決定し、それぞれの配列 決定反応は８％アクリルアミド・ゲル上で並行して行った。転写開始部位を矢印 で示す。パネルＢでは、好塩基球（レーン１）またはｔＲＮＡ（レーン２）から のＲＮＡをプライマー拡張に使用し、拡張生成物を５％ポリアクリルアミド尿素 ゲル上でゲノムＤＮＡの配列反応と並行して分析した。転写開始部位を矢印で示 す。

第１８図は異なる５つの個体から得たゲノムＤＮＡのサザン・プロット分析を示 す図である。ＤＮＡを異なる制限エンドヌクレアーゼ消化につけ、プロットし、 βサブユニットについてヒト全長ｃＤＮＡとハイブリッド化した。上端の番号は 異なる個体を示し、各パネルは異なる制限消化に対応する。寸法標準を右に示し である。

第１９図はＦｃ、ＲＴヒトβサブユニットのアミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ ：３２）とラット（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ＝３３）およびマウス（ＳＥＱ　ＴＤ　 ＮＯ：３４）βとの配列を示す図である。同じアミノ酸残基および異なるアミノ 酸残基をそれぞれ大文字と小文字で示す。同一性および密接に関係する交換には 疑問行の′印を付け、疎遠な関係の交換はドツトで示しである。相同でない交換 には疑問行に印を付けてない。ギャップはハイフンで示す。トランスメンブレン 領域は下線で示し、スプライス部位は縦線で示しである。

第２０図はＦｃ、ＲＩサブユニットの様々な組合せで形質移入したＣ０９７細胞 におけるＩｇＥ結合を示すＦＡＣ８ＡＣ８分析を示す図である。

第２１図はＦｃ　ｒ　ＲＩサブユニットの様々な組合せで形質移入した好塩基球 系統（ＫＵ８１２）の細胞におけるＩｇＥ結合を示すＦＡＣ３分析の結果を示す 図である。

発明の詳細な説明 本発明はその一部として、ヒトＦｃ、ＲＴのサブユニットに対応するポリペプチ ドをコードするＤＮＡ配列に関する。

より具体的には、Ｆｃ、Ｒ１のα、β、およびγサブユニットに対応するアミノ 酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡセグメント（例えばＤＮＡ分子 ）に関する。一つの具体例では、第１図、第６図、第９図あるいは第１４図（配 列１０番号１０．２２および２４．２６および３１）に示した配列を有するＤＮ Ａセグメント、その対立遺伝子あるいは種変種、あるいはそのような配列のユニ ークな部分（ユニークな部分とは少なくとも１５−１８塩基としてここでは定義 する）を有する。

他の具体例ではＤＮＡセグメント、は第１図（配列ＩＤ番号１１）、第６図（配 列ＩＤ番号２３および２４）、第９図（配列ＩＤ番号２７）、あるいは第１９図 （配列ＩＤ番号３２−３４）、あるいはその対立遺伝子あるいは種変種、あるい はそのような配列のユニークな部分（ユニークな部分とは少な（とも５−６のア ミノ酸としてここでは定義する）をコードする。

対立遺伝子あるいは種変種とは、ここで定義するサブユニットの機能を無くさな い核酸あるいはアミノ酸配列の置換、欠如、あるいはその他の変化として定義さ れる。成る用途には、ヌクレオチド配列は意図的に変更される。例えば、ベータ サブユニットをそのように変化したときの効果を試験するため、あるいは成る目 的のために不活性化されたサブユニットを産生するためなど。

他の具体例では、Ｆｃ、ＲＴのα、β、およびγサブユニットに対応するアミノ 酸配列を有するポリペプチドに関する。一つの好ましい具体例では、ポリペプチ ドは第１図、第６図、第９図および第１９図に示されたアミノ酸配列（各々配列 ＩＤ番号１１．２３および２４．２７および３２−３４）あるいはその対立遺伝 子あるいは種変種、あるいはそのような配列のユニークな部分（ユニークな部分 とは少な（とも５−６のアミノ酸としてここでは定義する）を有する。

他の具体例では本発明は、上述のようにベクター（例えば、プラスミドあるいは ウィルスベクター）とＦｃ、ＲＩのα、β、およびγサブユニットに対応するポ リペプチドをコードするＤＮＡセグメントとを有する。好ましい一興体例では、 コード化セグメントはプロモーターに操作可能なように結合されたベクター中に 存在する。

もう一つの具体例では、本発明は上述の組換えＤＮＡ分子を含有する細胞に関す る。適当なホスト細胞としては、原核生物（Ｅ、ｃｏｌｊなどを含む細菌のよう な）、低級真核生物（例えば酵母）および高級真核生物（例えば哺乳類の細胞） の両者が含まれる。組換え分子のホスト細胞への導入は、当業に知られている方 法により行なうことができる。

もう一つの具体例では、本発明は上述のポリペプチドが産生されるような条件下 で上述のホスト細胞を培養し該ポリペプチドを分離することを含む上述のポリペ プチドを産生ずる方法に関する。

もう一つの具体例では、本発明はＦｃ、ＲＴのα、β、およびγサブユニットを コードするＤＮＡセグメントをホスト細胞へ導入し、このセグメントをレセプタ が生成するような条件下で発現させることを含む機能性Ｆｃ、ＲＩレセプタを産 生ずる方法に関する。

本発明による核酸配列およびポリペプチドは次のような多くの用途がある。しか し用途はこれらに限定されるものではない。

１、ポリペプチドあるいはそのフラグメントを、アレルギー反応を防ぐアンタゴ ニスト、あるいは薬剤スクリーニング検定での試薬としての利用。

２、治療薬としてのポリペプチドの利用。

３、患者のＩｇＥレベルを監視するためのポリペプチドの利用。

４、上述の目的のために使用されるポリペプチドを合成するための核酸の利用。

５、診断検定に有用なりＮＡを構築するためのｃＤＮＡを合成するための核酸配 列の利用。

以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は説明のた めのものであり、本発明を限定するものと考えるべきではない。

Ｃｂｉｒｇｖｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｃ口ＩＢ、１８．５２９４　（１９７９）の グアニジウムイソチオシアネート法により、Ｋｉ＋ｈｉ、Ｌｅｉｋｅｍ目Ｒｅ＋ ｅ１＋ｃｈ。

９．３８１　（１９８５１により記載されるＦＵＢ　１２細胞からＲＮＡを抽出 し、＾マ１マら、ＰＮ、＾Ｓ、υＳ、＾４．６９，１４０８　（１９７２）の方 法に従って、ポリ（＾）ｍＲＮ＾をオリゴ−ｄ１クロマトグラフィーにより単離 した。ｅＤＮＡ合成は、Ｋ１０１１　ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｌｒｒｓ　２６． ２５６９（１９Ｂ？＋による先の報告に準じて行なった。生成したｅＤＮＡ分子 を、ＹｏｌＢ　ら、５ｃｉｅｎｃｅ、２２２．７７８（１９８３］の記載に準じ て、ＥｃｏＲＩリンカ−に連結し、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、サイズ分画し 、λＩｔｌｌ　ＥｅｏＲＩアームに連結した。λ１＋ＩＩ　ＤＮＡを含むｃＤＮ ＾ＤＮＡを、バクテリオファージラムダ粒子に封入し、Ｙ１０９０上で増幅した 。合計　１．２Ｘ１０６個の独立したｃ　ＤＮＡクローンを得た。

ｃＤＮＡライブラリーを、１５０■２プレート上のＹ１０９Ｇ上にブレーティン グしくプレート当たり１０５）、ニトロセルロースフィルターに移動させた。ｃ ＤＮＡライブラリーのフィルターは、Ｋｏｃｈｔｎら、Ｃｅ１ｌ、４４．６８９ 　（１，９Ｈ）と同様に、ニックトランスレージタンしたｃＤＮＡ断片を用いて その場でノ＼イブリダイゼーシジンすることによりスクリーニングした。ヌクレ オチド１１９〜７８１に対応するラットのＦｃ、　Ｒ１アルファｃ　ＤＮＡから 、ｃＤＮＡ断片を得た。陽性プラークを同定、精製し、標準的な方法を用いて、 ｐＧＥＭベクター（Ｐ＋ｏｍｅｇＩＢｉｏｌｅｃｈ、　Ｍｓｄ口ｏｎ。

Ｗ口ｅｏｎ＋ｉｎ　）内にｃＤＮＡ挿入物をサブクローン化した。制限酵素分析 によりｃＤＮＡ挿入物の制限地図を作成し、ｐＧＥ／Ｍの誘導体内にサブクロー ン化し、ＰｒｏｍＢｓ　Ｂｉｏｌｅｅｈ　（ｋｌＩｄ口ｏｎ。

Ｗ目ｃｏｎｓｉｎ　）から入手したＧｅｍ５ｅｑ二本鎖ＤＮＡ配列系プロトコー ルに従った、５ＩＢｅｒら、ＰＭ、＾Ｓ、、？４．５４６３　（１９７７）のジ デオキシヌクレオチド法を用いてｃ　ＤＮＡ挿入物の配列を決定した。

ＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡクローンｐＬＪ６６３　（ヌクレオチド　１〜１１５１ ）の両鏡およびクローンｐＬ］５８７　（ヌクレオチド６５８〜１１９８）の各 末端の３００ｂｐについて決定した。２個のｃＤＮＡクローンの間のＤＮＡ配列 の差異は認められなかった。

ヒトＦｃ、　ｉｌｌアルフｙ　ｃ　ＤＮＡの配列を、第１図およびＳＥＱ　Ｉ［ １Ｎｏ（配列番号）１０に示す。ヒトＦｃ、　Ｒ１アルファポリペプチドの推定 アミノ酸配列を、ヌクレオチド１０７〜１０９のメチオニンで始まりヌクレオチ ド８７５〜８７７のアスパラギンで終わるＳＥＱ　１ＯＮＯ：１１に示されるヌ クレオチド配列の下側に示す。推定された成熟Ｎ末端の部位は、ｗｏａ　Ｈｅ１ ｉ■、ＥＩｔ、　Ｊｏ＊ｒ＋＋ｓｌ　ｏｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

ｌ！フ、ｔｙおよびＮｗｃｌ＊ｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｔｓ■ｒｃＴｈ、１４．４６ １１３　（１９！１６）によって記載された規則に従って、ヌクレオチド１８２ 〜１８４のバリンと決定した。

これらの結果から、２５アミノ酸のシグナルペプチドを予測した。残りのｃＤＮ Ａ配列から、ヒトＦｅ、　Ｒ１アルファ鎖には、２つの相同ドメインを有する約 １７９〜２２４の残基（２５残基のうち１４残基が同一である；残基８０〜＋０ ４および１６３〜＋９０　）　、２０残基の膜貫通セグメント（残基２０Ｓ〜２ ２４　）　、および８個の塩基性アミノ酸を含む３３残基の細胞質ドメインが含 まれていることが示唆される。全体として、ヒトおよびラットのＦｃ、　Ｒ１ア ルファ配列間には４７％の相同性があり、ヒトのＦＲＩアルファおよびマウスの ＦｃＧＲアルファの間には４６％の相同性がある（図２およびＳＥＱ　１０　Ｎ ｏ、　１２〜１４）。共通のアスパラギン酸残基を囲む９個のアミノ酸が同一で ある膜貫通領域内で、相同性のレベルが最大である。

実施例２ ヒトＦｃ、　Ｒ１アルファ鎖の組換えｃＤＮＡクローンを用いて、これらのコー ド配列を適当な真核細胞発現ベクター中に導入し、アルファ鎖の完全形および可 溶性形の大量合成を行なうことができる。表面発現の場合には、アルファサブユ ニットがベータまたはガンマサブユニットと複合体形成することが必要となるこ とがあるが、分泌形のアルファサブユニットの真核細胞発現の場合には、それが 必要ないことがある。この目的に適するベクターは、Ｃｓ１ｌｅａ、（１９ｇ７ ）　Ｍｅｌｈｏｄｔ　ｉ＋＋　Ｅ＋＋ｔ７＋＋＋＋Ｉｏ１７　１５１＾ｃｓｄｓ ｓｉｃ　Ｐｒｅｔｓ、　６８４で先に報告されたｐｌｃ１’２Ｂｌである。完全 アルファ鎖をコードする発現ベクターの構築物は、次のようにして単離すること ができる（図３）。単一のｌ１ｑｌｔｌ−８ｔｐｌ断片（ヌクレオチド６５〜８ ９８）をｐＬＪ６６３から単離し、ＢＩ目１末端をＤＮＡポリメラーゼ１クレノ ーｆＫｌｅａｏｖｌ断片で充填し、旧ｅｄｌｌｌ−ｈ■Ｈ１またはＨｉｅｄｌｌ ｌ−３■１１のいずれか一方で制限されているｐＢＣ１２８＋に連結する（この 末端は、ＩＩＮＡポリメラーゼ］クレノー断片で充填することによって平滑化さ れる）。２つの異なる構築物を試みる理由は、前者には３゛介介在列が含まれる が、後者には含まれないためである。介在配列の有無は、これらのベクターによ りトランスフエフシランされる細胞中で合成されるアルファ蛋白質の量に影響を 与えることがある。可溶性形のアルファ鎮をコードする発現ベクターの構築は、 上述の発現ベクターのアルファ鎖中のコード領域のヌクレオチド７１９〜７２１ に終止コドンを導入することにより達成される（ｐ）ＩＡＩ、ｐｉ（＾１１、第 ３図）。これにより、推定される膜貫通領域および細胞質領域が除去され、分泌 可溶性形のヒトアルファ鎖が合成される。

終止コドンノ導入は、Ｍｏ＋ｉ１ｇｔら、Ｂｉｏ、Ｔｅｃｈ、、２．　６３６（ １９８４）により概説されると同様に、オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異 の誘発により達成される。オリゴヌクレオチドの配列は、５′＾＾ＧＴＡＣＴＧ ＧＣＴＡＴＧＡＴＴＴＴＴＴＡＴＣＣＣＡＴＴＧ　３’である（ＳＥｏ　１０　 Ｎｏ・ｌ）。

生成した発現ベクターは、ｐＨＡｓ１１よびｐＨＡｓ１１であり（第３図）、こ れらは、アミノ酸１〜２０４に対応する切頭形のアルファ蛋白質の合成を行なう 。真核細胞中でこの蛋白質が発現すると、アミノ酸残基２６〜２０４を含む成熟 ］ｆε結合結合蛋白台成される。

次に、０４１８またはメトトレキセート耐性などの選択可能マーカーの存在下で 、Ｃｌ１ｌ！１１．　（１９８７）、１ｌｅｌｂａｄｓ　１ＩＩＥｎ！Ｙｓｏｌ ｏＢ　。

ＡｃＩｄｅｓｉｃ　Ｐ＋ｅ＋ｇｓ　ＮＹ１５２＋６１１４で詳述されたものなど の標準的な手法により、発現ベクターをＣｌｌ０またはＣＯ３などの適する真核 細胞中に導入する。発現量は、細胞に高薬量を導入することにより増幅すること ができるため、メトトレキセート耐性の選択可能マーカーは付加的利点をもつ。

蛋白質の合成は、これらの細胞へのヒト　ＩＩＥ　（またはラットＩｇＥ　）結 合能を示すことによりモニターされるしく完全アルファ鎖の場合）、または、可 溶性形のアルファ鎖の場合には、これらの細胞から分泌された蛋白質は、ベータ の有無によらずＩｇＥ結合能を有することを示すことによりモニターされる。

ヒトＦｃ、　Ｒ１アルファ鎖の組換えｃＤＮＡクローンを用いて、これらのコー ド配列を適当な原核発現ベクター中に導入し、アルファ鎖由来の大量の可溶性（ 非膜結合）　Ｉｇ！結合ポリペプチドの合成を行なうことができる。この目的に 適するベクターは、Ｃｒｏｖｌ　ら、　Ｇｅｎｅ、３８．　３１　（１９８５） によって記載されたｐＥＶ−１である。可溶性アルファ鎖をコードする発現ベク ターの構築物は、第４図に記載したようにして単離することができる。単一のＭ ＊ＨＩ−５ｔｐｌ断片（ヌクレオチド１９５〜８９８）をｐＬＩＨ３から単離し １．Ｍｔｌｌｌ末端を［ｌＮ＾ポリメラーゼ１クレノー断片で充填し、ＥｃａＲ Ｉで制限されるｐＥＢ−１に結合し、この末端を、クレノーで充填する（第４図 、ｐＥＶＡ）。成熟アルファ鎖のＮ末端は、オリゴヌクレオチド部位特異的突然 変異の誘発により再構築される。

オリゴヌクレオチドの配列は、５’　ＧＡＡＴＴＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＴＣＡ ＧＡＡＡＣＣＴ＾＾ＧＧＴＣＴＣＣＴＴＧ　３’　（ＳＥＱ　ＩＤに０．２）で ある。この配列を発現ベクターｐＥＶ＾に導入すると、バリン−２６（アルファ 鎖の推定成熟Ｎ末端）の隣にＥＶ−１ベクターのメチオニン残基が配列し、後方 にアミノ酸残基２７〜２０４が配列する（ｐＥＹＨ＾、第４図）。可溶性形Ｆｃ 、　Ｒ１アルファの再構築は、オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異の誘発に より達成される。オリゴヌクレオチドの配列は、５′−＾ＡＧＴＡＣＴＧＧＣＴ ＡＴにＡＴＴＴＴＴＴＡＴＣＣＣＡＴＴＧ−３’　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３） である。この配列を発現ベクターに導入すると、膜貫通領域の開始直前で、ポリ ペプチド合成が終結する。このように、発現ベクターＰＥＹＩＩＡＳによりコー ドされた蛋白質は、アミノ酸残基２６〜２０４に対応する可溶性形アルファ鎖の 合成を忠実に行なうはずである。その後、この発現ベクターを、適する宿主中に 形質転換させる。

無傷のβ鎖を配列決定する試みに繰り返し失敗したため、トリプシン消化物から ペプチドを単離した。ポリアクリルアミドゲルから電気的に溶出したβサブユニ ットを、報告のようにして調製した（Ａｌｅｓ目τら、　（１９ｇ７１　Ｂｉｏ ｅｈｅｓｉｓｌｒｒｓ　２６：２５６９−２５７５）。トリプシン消化ペプチド は、高速液体クロマトグラフィーで分離し、前述のように配列決定した（ＫｉＩ ｌｅｌ　ら、（１９８７１Ｂｉｏｃｂｅｓ目１ｒ７．２６：４６０５−４６１０ ）　、最初の消化物から単離したペプチド（ＩＩＱ、Ｉ）は、配列（ＳＥＱ　Ｉ Ｄ　ＮＯ：４　）　ＴＦ＋−Ｇｌｓ−Ｇｌｓ−Ｌ！ｗ−Ｈｉｓ−マｔｌ−Ｔｙｒ −Ｓｔｒ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｔｙｒ−３ｅ＋−ＡＩ＆−Ｌｅｗ−Ｇｌｓ−＾ｚｐ −Ｔｈ＋を有していた。後の消化物には、同じペプチドに、Ｎｉ１２末端でロイ シンの追加およびｃｏｏｎ末端でアルギニンの追加が認められた。それぞれかな りの収率で単離された、他の３個のペプチドの配列を、図面に示す。

グアニジウムイソチオシアネート法（ＣｂｉＢｖｉｉら　（１９７９）　Ｂｉｏ ｅｈｌｉ＋ｌＢ５１８：５２９４−５２９９）により、ラットの好塩基球性白血 病（ｌｌ［ｌＬ　）細胞から抽出したＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）−セルロースカ ラム上で分画しくＭ１ｎｉ＋ｌｉｔら　（１９８２）　Ｍｏｌｅｃｗ１ｇ＋　Ｃ １ｏｎｉ＋Ｂ＾Ｌｚｂｏ＋１ｏＢ　ＭＩｓ＊ｌ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐ＋ｉＢ　ＩＩ Ｉ＋ｂｏ＋　Ｌｔｂ、　Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉＢ１１ｓ＋ｂｏ＋、ＮＹＩ）　、ｐ ［１ｃ−９およびλｇｉｌｌライブラリーの構築に用いた（１ｍｉｒ＋ｉｓら　 （１９１１２］　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏａｉＢ：＾Ｌｓｂｏｒｓｌｏｔ１ Ｍｕ＋ｗｚｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐ＋ｉＢ　ＩＩｓ＋ｂｏ＋　Ｌｉｂ、、Ｃｏ１ｄ　 Ｓｐ口ａｌ　Ｈ１ｒｂｏ＋、ＮＹ）。

ＹｏｗＢおよびＤｘｙｉｓｔ　（＋９８３）、Ｐ「ＯＣ，８１１１，＾ｃｔｄ、 Ｓｅｉ、　ＵＳ＾８０；１１９４１１Ｎ）。ペプチド１について得られた最初の 配列を用いて、２種の２６ｖｅ＋のオリゴヌクレオチド（各々３２倍の縮重）す なわ５’−ＣＧＩＧＡ（Ａ／ＧＩ　Ｔ＾（Ｇ／Ｃ１ＡＣＡＴＧＩＡ（＾／Ｇ）　 （Ｃ／ＴＩ　ＴＣ（Ｃ／Ｔ）　ＴＣＡＴＡ−３’　（ＳＥＱ　１０　ＮＯ：Ｓ　 ）および５’　−ＧＧＩＣＴ　（＾／Ｇ）　Ｔ＾（Ｇ／ＣＩ　ＡＣＡＴＧＩＡ　 （＾／Ｇｌ　（Ｃ／ＴＩ　ＴＣ（Ｃ／Ｔ）　ＴＣＡＴＡ３’　（ＳＥＱ　ＩＤ　 Ｈｏ、６　）を構築した。ＲＢＬ細胞の−ＲＮ＾から構築したλｇ口１ライブラ リーを、これらの１５個のオリゴヌクレオチドの１・１混合物を用いてスクリー ニングした。コロニーは、モデル３８０＾自動ＤＮＡ合成装置（八ｐｐｌｉｅ＋ ＩＢｉｏ＋ｙ＋１ｅｓｓ、　ＦｏｓｔｅｒＣｉ１７　Ｃ＾）で調製したオリゴヌ クレオチドを用いて、Ｋｉｎｅｌ　ら、（１９８７）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ＋ｔ＋ ｒ、２６＋４６０５−４６１０のようにしてスクリーニングした。６個の陽性ク ローンには、同様な＠限パターンが認められた。ｃＤＮＡ挿入物を、ｐＧＥＭ− ４またはｐＧＥＭ−３２中にサブクローン化し、得られた二本鎖ＤＮＡを、供給 者（Ｐ「ｏｓｅ（＊　Ｂｉｏｌ＋ｃ、　Ｖｉｄｉｃｏｎ、　１１　）により推奨 された方法に従って、Ｇｅｓ＋ｅｑＲＴ配列決定系を用いて配列決定した。この 方法により先に配列決定された領域に対応する２０■ｅｒのオリゴヌクレオチド を１プライマーとして使用し、別の方法では得ることが困難な重複配列を生成し た。いくつかの例では、供給者（Ｕｎｉｌｅｄ　５ｔＩｌｅ＋　Ｂｉｏｃｂｒｓ ｉｃｘｌ、　Ｃ１ｅｙｅｌＩｏｄ）により推奨されたように、Ｓｅｑｗｅｎｌｓ ｃを用いてＤＮＡ配列決定を行なった。最長の挿入物を含むクローンは、第５図 の上部に示される戦略に従って配列決定した。この配列は、２４６または２４３ 残基のポリペプチドをそれぞれ生成するヌクレオチド４６〜４８および５５〜５ ７に開始コドンをおそらくもつことを予測させる（第６Ａ図およびＳＥＱ　１０ 　ＮＯ：２２）　、約２７．　Ｇｏｏと予測したＭｒは、ポリアクリルアミドゲ ルで分析すると、βサブユニットの見かけの分子量より約り０％小さい（Ｈｏｌ ｏｖｋｓおよびＭｅｌｔＢ＋　（１９ｇ２１　Ｍｏ１．　Ｉｓｍｍｃｏｌ。

１９：２＋９〜２２７）。さらに、フレーム内停止コドンは、明らかに開始コド ンの上流にはなかった。真の開始コドンがずっと５′側にある可能性を否定する ため、制限断片（ヌクレオチド７〜４７４）および合成オリゴヌクレオチドプロ ーブ（ヌクレオチド３〜３２）でｃＤＮＡライブラリーを再スクリーニングした 。さらに２８個のクローンを単離し、それらの制限パターンを調べた。

２０個は、元のクローンと同様であった。５′末端の６個のヌクレオチド（ヌク レオチド１〜６、第６Ａ図）のみを同定した。６個のクローンで早期の終結が認 められ、その他の点では、ヌクレオチド３７５を経る同一配列を有していた（第 ６Ｂ図およびＳＥＱ　ＩＤＮ０：２４）。１個の２．４ｋｂクローンは、アデニ ンで置換されたシチジン４７３を有していた。この置換により、Ｐｒｆ　１部位 が破壊され、ヌクレオチド４７０に新たにＣ１＊　１部位が生成される。またこ れにより、Ａｌｅ−１４０が＾ｓｐ〜１４０になる（第６Ａ図）。

最終的に、１個のクローンが、５′方向に約３５０塩基対（ｂｐ）を伸長した。

第６Ａ図に示す配列の接合部は、（ＳＥＱ　１０　ＮＯニア）ＡＡＴ＾＾ＡＡＣ Ａ＾＾Ａ＾＾ＡＡ＾＾＾ＡＡＴＧで、先の配列のヌクレオチド８および９に対応 する新たに生成したＡＴＧの最新の２個のヌクレオチドである。このクローンは 、単に２個の独立したｃＤＮＡが結合して生じたと考えられる。ｐＨｃ−９ライ ブラリーのスクリーニングにより、３個のクローンが認められた。しかし、これ らのどの配列も、ヌクレオチド８４以降で５′を伸長しなかった。

ＰＳＩ　１断片プローブ（ヌクレオチド１〜４７４）を用いて厳密さの高い条件 下で、ＩＩＮ＾　トランスファーブロッティングを行なった。３０マイクログラ ムの全ＲＮ＾を、２％ホルムアルデヒドを含むｌｊｌアガロースゲル上で泳動し 、ニトロセルロースフィルターにプロットした（Ｌａｉｓｌｉｚら　（＋９１１ ２）　Ｍｏ１ｔｃｓｌ＊ｔ　Ｃ１・ｗｉｌｆｆｉ：　Ａ１＊ｂｏ＋５ｌｏｒ２　 Ｍ■ｗ＊Ｉ　（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉａＭ　Ｈ＊＋ｂｅｔ　ＬＩｂ、、Ｃｏ１１　 ５ｐｒｉｓｌＨａｒｂｏｒ、ＮＹ））ｏこのフィルターを、報告のように（Ｍ＊ ＊ｉ−目ｓら（１９ｇ２）　Ｍｏ１ｔｃｓｌ＊ｔ　Ｃｌｏｍｉａ（：　Ａ　ｌｓ ｌ＋ｏ＋ｍｔｏＢ　Ｍｓｔｍｉｌ　（Ｃｏ目　５ＨｉＢ　Ｌｔｂ＋ｔ　ＬＩｂ、 、　Ｃｅ１ｌ　Ｓｐｒｉｇ　Ｌｔｂ＋＋、　Ｍマ）、βｃＤＮＡの制限断片（ヌ クレオチド１〜４７４）とハイブリダイズし、６５℃で１５ｍ１ｌ　Ｎ５Ｃ１／ １５１Ｍクエン酸ナトリウムで洗浄した。１１８Ｌ細胞から、上部バンドが下部 バンドの約２倍の強さを有する約１７ｋｂおよび１．７Ｓｋｂの２つの主なバン ドが得られた。１．２ｋｂの微量バンドも認められた。高親和性のＩｇＥレセプ タを発現しない種々の細胞では、陰性の結果が得られた。このような細胞は、ラ ットの下垂体細胞系ＧＨ３（Ａｍｅｒｉｃ＊＋＋　１１ｇｔ　Ｃｗ口ｉｔ＠Ｃｏ １１ｅｃｔｉｏｎｎｏ、　ＣＣＬ８２．　ｌ　）　、ラットのダリア細胞系ＣＧ 　（ｔｏ、　ＣＣＬｌｏｌ）　、？ウスのライディヒ細胞系１−１１１　（ｎｏ 、　ＣＣＬ１３　）　、および、特に、マウスの単球系１７７４　（ｎｏ、　Ｔ ＩＢ６７　）およびラットのリンパ腫’ＮＴＤ　”　（Ｒｉｒｃｒｓら、ｆ１９ ｇ８）　１Ｊｏ１．　ｌ＋ｅｓｗａｏ１．）である。

βサブユニットおよびその種々の突然変異形または切頭形に対応するｃ　ＤＮＡ を、ｐＧＥＮ−４またはｐＧＥト３！転写体イオンベクター（Ｐｒｏｓｅ’ｓ　 Ｂｉｏｊｅｃ）のいずれか一方中にサブクローン化した。Ｐｔｌ　１部位を含む βクローンは、Ｔ７１１１１Ａポリメラーゼで生体外転写した。無標識ＲＮＡは 、供給者により推奨されたようにしてＳＦ３またはＴ７ボリメラーゼのいずれか 一方を用いて合成した。キャッピング反応は、報告のように行なった（　Ｃｏｏ ｊｒｅｒｇｓら、（１９Ｈ）　Ｎｅｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｉ　Ｒｅ＋、ＩＯ：６ ３５３−６３６２）　、　ＲＮｓｓｅ非含有のＤＮｇｔｅｌで鋳型を消化した後 さらに、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで３回沈殿させて精製 した。次に、供給者（Ｐｒｏｓｃｇｓ　ＢｉｏＩｃｅ）により推奨されたように 、［３５Ｓ］メチオニンの存在下で、ウサギ網状赤血球の小球菌ヌクレアーゼ処 理溶解物でＩＩＩＩＡを翻訳した。翻訳生成物を、１１１当たりアプロチニン３ ０μｍ、１１当たりフェニルメチルスルホニルフルオライド１７５μｇ　ｓ　１ １当たりロイペプチン１０μｇ１および１１当たりペプスタチン５μｇを含むホ ウ酸塩緩衝塩水（ｐＨ８）中の洗剤　１３−［３１コラミドプロピル）ジメチル アンモニオ］−１プロパンスルホン酸塩２０ｄで１１希釈し、報告されているよ うに（Ｒｔｙｅｚら、（１９８ｇ）　Ｍｏ１．　Ｉ■ａｆｆｉｏ１．）モノクロ ーナル抗体を用いて免疫沈降した。分画されなかった翻訳物質では、ＲＮＡが除 かれたか又は代替■＾　（ｂｒｏｉｌモザイクウィルス）と置換された対照に比 べ、Ｍ＋　３２．００＋１で主要成分が認められた。

抗体の単離は、次のようにして行なった。所期の制限断片を含む発現ベクターで 形質転換したＥｓｃｈｅｒｉｅｈｉ畠ｃｏｌｉ　（Ｃｒｏｖｌら（１９８５）　 Ｇｅｎ５　３８：３１３８；　Ｐｏｒｌｏ７ら　（１９ｇ６１　１．　Ｂｉｏｌ 、　Ｃｈｅｗ。

２６１：１４６Ｎ−１４７０３）を培養、誘導し、組換え蛋白に富む両分を、報 告のように調製した（　ＰｏｒｊｎＢら　（＋９１１６）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃ ｈｓｍ。

２６＋＋　１４６９７１４７０３）　、硫酸ドデシルナトリウム（ＮｉＤｏｄＳ Ｏ＜　）中ポリアクリルアミドゲルで分離後、形質転換体特異的蛋白質を溶出し 、これを用いてウサギを免疫した。蛋白質的１００μ２を完全７０インドアジユ バントに加え、注射した。この後、不完全アジュバント中の蛋白質２５μｇをブ ースター注射した。モノクローナル抗β抗体−＾ｂβ（ＩＩＤＩ　および−＾ｂ β（ＮＢ）　（後者は、Ｄ１マｉｄ　Ｉｌｉｌｏｖｋｇ、コーネル大学から入手 した）の単離および特性については、報告されている（Ｒｉｗｅｔｓら（１９Ｂ ８）　Ｍｏ１．　１ｍｍ１ＩＩ＋ｏｌ。

２５：６４７−６６１　）。

モノクローナル抗β抗体ｓＡｂβ（ＪＩＩＫ）および■＾ｂβ（ＮＢ）（Ｒｉｒ ｃｒｓら　（１９８８）　Ｍｏ１．　Ｉｍｍ＊ｎｏ１．　）　（第７Ａ図、レー ン２および３）は、無関連な抗体（レーン５）ではないが、放射性物質を沈降さ せ、Ｎ５（ｌｏｄｓｏ４中ポリアクリポリアクリルアミドゲル上０Ｈの主要バン ドを示した。このバンドは、標識ＲＢＬ細胞の抽出物由来の碍＾ｂβ（ＩＲＫ） によって沈降する二重線の上部バンドと同じ移動度を有していた（レーンｌ）。

再形成を試みたときにはよく分からなかったが、オートラジオグラムから、ｉｎ ｉ目ｒｏ合成された物質はまた、ｉｓ　ｖｉｗｏ合成された０鎖で認められた低 分子量の成分を含むことも認められた。ＩＩｌマｉｔ＋ｏ合成蛋白質の移動度は 、βサブユニットで先に認められたように、還元によって不変であった。（最初 の＾ＴＧコドンを欠＜）Ｃ１１部位を含むクローンは、ゲル上での移動度がＰＨ １部位を含むクローンの移動度と区別のつかない蛋白質を合成した。一方、新た に生成したへ丁Ｇ（上述）を含む異常クローンは、見がけのＭ＋が３３．５００ のやや大きな蛋白質の合成を誘導した。βサブユニットのＮＨ２Ｈ２Ｏ２１個の アミノ酸をコードする転写体の　ｉｎ！１ｌｒｏ翻訳により、■＾ｂβ（Ｊｌｌ に）によって沈降可能な生成物が得られた（第７Ｂ図）。

２　（ｌ）ｔｉＩｌｎ　Ｎｉ片（＾ハタクレオチド＋０６−４９８．　Ｂｉｔ　 ヌクレｔチｌ’　４９９−０７）を、Ｅ、　Ｃｏ１１発現ベクター中に別個にサ ブクローン化し、誘導培養物から抽出物を調製した。１つのイムノブロッティン グ実験の結果を、第７ｃ図に示す。ＩＩ　ｉ　ｆｉｆ　Ｉ断片Ｂを含むベクター で形質転換したバクテリアがら抽出した物質には、謙＾ｂβ（ＮＢ）とは反応す るが■Ａｈβ（ＩＩＨ）　とは反応しないＭｒ１４、０００の成分が認められた （第７Ｃ図、レーン３）。Ｎｉ１２末端ｔ１ｉｉ１１断片＾　（残基１７〜１４ ８）を含む形質転換体からの抽出物は、どの抗体とも反応しなかった（上述と比 較）。断片＾により生成されたウサギ抗体は、２個のモノクローナル抗β抗体が 反応しく第７Ｄ図、レーン１〜３　）、ＲＢＬ細胞の分画されなかった洗剤抽出 物由来の無傷の１２５１標識１ｇＥレセプタ複合体を定量的に沈降させた位置で 、精製レセプタとイムノプロット上で反応した。

標識アミノ酸および単糖類の生合成的取込みを、報告のように行なった（　Ｐｅ ｒｅｇ−Ｍｏｎｔｌｏｒｔら　ｆ１９８３）　Ｂｉｏｅｈｅａ＋ｉ＋＋ｒ７２７ ＋５７２２−５７２８　）。ＩｇＥレセプタ複合体のゲル上およびイムノブロッ ティングによる精製および分析もまた、報告のように行なった（Ｒｉｗｅｚら　 （１９８８）　Ｍｏ１．　ｌｓ＋ｍ＋ｕｏ１．　）。

区別できるように標識した２個の異なるアミノ酸の生合成的取込み法を用いて、 レセプタのサブユニット中のそれらの比（表１１右側）を測定した。互いに異な る４個のアミノ酸の比は、βｃＤＮＡクローンから予測した比とうまく一致した （表１、右側、カラム　ｌ〜３）。βサブユニットのｃＤＮＡは、グリコジル化 部位が３か所考えられるため、　（Ｈ）マンノースおよび　（３５Ｓ）システィ ンを用いた二重標識実験も行なった。

αサブユニットについて報告された炭水化物比較データに基づき、かっｃＤＮＡ から予測したこの鎖のペプチド分子量に基づきこれらのデータを修正して、αサ ブユニットが、１モル当たりマンノース約２０モルを含むと計算した。したがっ て、二重標識実験からβサブユニツト中のマンノース／システィン比を決定する ことができた。この結果は単に、システィン０．０５モル１モルまたはβサブユ ニツト１３モル１モルを示した（表１、右側、カラム４）。

実施例１０ 単離したｃＤＮＡが、βサブユニットをコードする証拠は十分にある。（ｉ）ｃ ＤＮＡの１ＩｌｖＨｒｏ転写および誘導５ＲＮＡの翻訳により、ゲル電気泳動で の見かけの分子量が、真のβ鎖の分子量と区別できない蛋白質が得られる（第７ Ａ図）。（１１）ｃＤＮＡにより、β鎖のトリプシン消化物から単離した４個の ペプチドの配列（第６Ａ図およびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２）および直接分析や 生合成的取込みとうまく一致する組成（表１）が正確に予測される。（ｉ　ｉ　 ｉ）　βサブユニツト上に離散するエピトープと反応する２個のモノクローナル 抗体（１ＩＣ目ら　！１９８＋１）　Ｌｌ。

Ｉｓｇｕ＋＋ｏｌ、　）は、クローン化したｃＤＮＡからｉｎ　？自「Ｏ合成し た蛋白質を沈降させ（図７＾）、それらのうち１個は、Ｅ、　Ｃｏ１１中で発現 した蛋白質の断片と反応する（第７Ｃ図）。（＋りＥＣｏｌｉ形質転換体により 合成されたβサブユニットの断片に対するポリクロナール抗体は、イムノプロッ ト上のβ鎖（第７Ｄ図）および溶液中の１．Ｅ　レセプタ複合体と反応する。

クローン化したｃＤＮＡ（クローン１）の５′末端のヌクレオチド配列は、オー プンリーディングフレームの開始部位をそれ自体では明白には規定していない。

予定の開始コドンに先行するリーダー配列も“フレーム内（ｉｉ　ｆｕｓｓｓ） ”停止コードンもない。さらに、ｃＤＮＡから推定された分子量（Ｍｒ　２７． ＯＮ　）は、βサブユニットが糖鎖形成されていないにもかかわらず、ＮｇＤｏ ｄＳ０４ゲル上で認められた分子量（闘ｔ　３２，０００　）よりかなり低い。

したがって、開始コドンが失われたと考えることができる。にもかかわらず、デ ータを集約すると、βサブユニットの完全コード配列が回収されたという証拠が 強く示された。

（ｉｌ　さらに伸長した５′配列を用いて、２個の別々のライブラリーのいずれ か一方でｃＤＮＡを明らかにする多くの試みは失敗した。　（ｉｉ）　５’伸長 試験により生成した主な物質種は、我々のほとんどのクローンが開始した位置で 正確に終結した。　（１目）５″末端の２番目のＡＴＧコドンは、既知の開始部 位のコンセンサスな特性に合致する（Ｋｏ＋＊ｋ　（１９８７）　Ｎｗｃｌｃｉ ｃ　Ａｃ１ｄｓ　１．ｓ、１５：８１２５−８１４８　＞。このコドンの前に５ ′付近のＡＴＧコドンがあることはまれだが、全くないというわけではなく　（ Ｋｏ！＊ｋ　（１９１１７１Ｎｍｃｌｅｉｅ　１ｃｉｄｔ　Ｒｓｓ、＋５：　８ １２５−８１４８）　、ヒトαサブユニットで認められている（Ｓｈｉｉｉｓｓ ら　（１９ｇｇＪ　Ｐｔｏｔ、Ｎｓ口、Ａｃ５ｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　８５：１９Ｇ？−１９１１；　Ｋｏｔｈ＊ｎ　ら　ｆ１９ＨＩ　Ｎ１ｃ ｌｔｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

＋６＋　３５８４）。（１マ）すでに言及したように、２番目のＡＴＧコドンの みを含むｃＤＮＡから転写した１ＲＮＡを目！＋１ｒｏｌｉ訳すると、真のβ鎖 と長さにおいて区別できないポリペプチドが得られる。

予定の開始コドンに対し開始コドン４８ヌクレオチド５′を含む異常クローンは 、βサブユニットよりも適切に大きい見かけの分子量を持つポリペプチドをｉｎ マｉｌ＋ｏ合成した。したがって、真のβ鎖とクローンｌから１ｎマ目「Ｏ合成 された蛋白質との間の見かけの分子量を対応させることは、意味がある。ＲＮＡ 　）ランスファープロッティングデータから、約２．’ＩＫｂの１ＲＮＡが認め られ、これは約２００ヌクレオチドのポリ（＾）尾部を示す、配列決定（第６図 ）されたｃＤＮＡから正確に予想された。以下の議論では、β鎖が、２番目のＡ ＴＧによりコードされたメチオニン残基で始まり、したがって、残基長さ２４３ であると仮定する。

分析した３７個のクローンのうち、ＣＩ＊　Ｉ制限部位を含むクローンは１個の み認められた。このクローンは、クローニングの間に単一の塩基突然変異により 生じたと考えられ、通常生成する＠ＲＮＡとは考えられない。逆に、欠損配列を 示す６個のクローン（第６Ｂ図）が認められ、真のｍＲＮＡ種を反映すると考え られる。翻訳した場合には、単一の膜貫通セグメントのみを持つ１１４、０００ の蛋白質をコードすることになる。

βサブユニットの配列には、残基Ｓ、＋５１および１５４にＮ結合グリコジル化 する可能性のある部位が含まれる。しかし、過去および最新の取込みに関するデ ータによると、βサブユニツト中に炭水化物が存在する証拠は全く認められてい ない（Ｐｅｒξニー１ｉｏｎ口ａｒｔ　ら　（１９８３１Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ　２７：５７２２−５７２８；　Ｈｏ１ｏｖｋｉおよびＭ１！Ｈｅｒ　（１ ９ｇ２）　Ｍａｌ　Ｉｍｓｗｎｏｌ　１９２１９−２２７；および表１）。

この配列には、先に報告された配列、特にＦｃレセプタまたはＦｃ結合因子に関 連する配列と異なる特徴または相同性は認められない。

ヒトロバシー（ｈ７ｄｒｏｐ＊Ｉｈ１ｃｉ１７）分析により、βサブユニットが ４回形質膜を貫通していることが分かる（第８図）。したがって、親水性のＮ１ １２およびｃｏｏ昧端は、膜の同じ側にあることになる。βｃＤＮＡの断片の発 現により、ｓＡｂβ（Ｎｉｌ）はアミノ酸残基１４９〜２４３以内で反応しく第 ７Ｃ図）　、ｍＡｂβ（ＩＩＨＩは残基１〜２１を含む断片と反応する（第７Ｂ 図）ことがわかる。

どの抗体も無傷の細胞とあまり反応しないが、両者とも音波処理細胞と強く反応 するため、結果を合わせると、ＮＯ２およびｃｏｏＨ末端が形質膜の細胞質側に あることと一致する。

β鎖は、膜に結合していると蛋白分解に耐性である關「２０、　ＯＤＤの“β、 ′　ドメインを含むことが、初期の研究で示唆されていた（ｔｌｏｌｏｖｋ＊お よびＩｈ１１Ｈｅｔ　！１９８２）　Ｍｏｌ、　ｆ■ｔｕａｌ　１９：２１９− ２２７　’）。この部分はまた、二重層内標識試薬によって修飾されるそれら残 基を含み（Ｉ（ｏｌｏｖｋｓおよびＭｅｌｚ！２ｒ　［１９１１ＨＭｏｌ。

ｌ５ｍｗ＋ｏ１．　１９：２１９−２２７；　ｌＩｏｌｏｗｋ易　ら　（１９８ １）　Ｎｇｔｗｔｔ　（ＬｏＩｌｄｏｎｌ！８９：８０Ｇ−８０８）、化学架橋 試薬を使用するとβおよび／又はγサブユニットに結合しくＨｏ１ｏｖｋｓおよ びＭｅｔＢｓｒ　（１９ｇ２）　ＭｏｌＩｗｓｗａｏｌ、　１９・２１９−２２ ７　）　、βおよびγ　、サブユニット間の自発的ジスルフィド結合が起こると γサブユニットに結合する（Ｋｉｎｅｌ　ら　（１９８３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｔ ｌＩＴ２２＋５７２９−５７３２　）　、残りの“β　、”は、その場でリン酸 化されるセリン残基を含んでぃると考えられているが（Ｐｔｒｅｔ−鴎ｏａｌｆ ｏ＋ｌら　（１９８３）　ＢｉｏｃｈｅｍｉｔｌＩＴ　２２：５７３３−５７３ ７；　Ｑ＊ｓ＋ＩｏおよびＭｅｌｔＩｅｒ　（１９８６１Ｍｏｌ　１１１１１０ １１１、２３＋　１２１５−１２２３）　、別個の断片であるとは明確に同定さ れていない。βサブユニットのｃＤＮＡにより推定される配列から、ＮＨ２Ｈ２ Ｏ３９残基またはＣ０ＯＨ末端の４４残基のいずれが一方の一部もしくは全部、 または両者の一部もしくは全部が、切断され、β１断片を生成することが示唆さ れる。

一時的発現用のベクターを用いてＣｏＳ７　ｍ１ｌｌ胞中で、αおよびβサブユ ニットの完全長のコード配列を同時トランスフェクションした。１ｃε結合部位 は、トランスフェクションした細胞の表面で発現しなかった。

マクロファージ上の１１に低親和性のレセプタの研究から、ＩｇＥ結合部分に化 学的に架橋可能で、高親和性レセプタのβサブユニットと同様の見かけの分子量 を持つ成分が明らかとなった（Ｆｉｎｏｌｏｏｍおよび１１ｅｔＢｓ＋　（１９ ８３１１，Ｉ＋＋ｍｗｎｏ１．　＋３０：１４ｇ！−１４９１）。蛋白質分解酵 素消化によりこの成分から生成したペプチドは、βサブユニットから放出された ものとは異なると思われたが、他のＦｃレセプタにも、これまで検出されていな かったβ様サブユニットが含まれている可能性が高まった（ＲｉｖｅＮら（１９ ８８１Ｍｏ１．　Ｉｓｍａｎｏｌ、）　。これに関する証拠は、厳密さの高い条 件下で行なわれたＲＮ＾トランスファープロット実験からも得られなかった。特 に、ｌ７７４細胞には、Ｆｃγレセプタが含まれていることが知られているが、 このＦｅγレセプタの免疫グロブリン結合鎖は、ＩｇＥに高親和性のレセプタの α鎖との相同性がかなり認められるＱｉｎｅｔ　ら（［９８７１８ｉｏｃｂｅｍ ｉｓｌＢ　２６：４６０５−４６１０）。しかし、使用した方法により、β鎖の −ＲＮ＾を検出することは可能ではなかった。同様に、ＮＩＤ　リンパ腫細胞は 、たとえそれらの細胞がＦｅγレセプタを有しているとしても、否定的結果を与 えたし、また、イムノプロット上でｍＡｂβｆｌｌＨ）と反応する低分子量成分 を示した。

実施例１２ Ｇ、＾１ｅｒｒ＊ｔ　ら、１ｔｉｏｃｈｔ＊１ｓｌｒ７２６＋２５Ｎ−２５７５ （１９８１ンで報告のように、ＴＮＰ−リシンビーズを用いた親和性クロマトグ ラフィーにより、Ｆｔ、　Ｒ１を精製した。臭化シアンによりモノクロナール抗 β（ＪＲＫ）に結合した５ｅｐｂ＊ｒｏｔｅ　４Ｂビーズに、溶出液をアプライ した（　１．　ＲｉｙｅＩら、Ｍｏ１．　１ｍ＋＋＋＋ｎｏ１．２Ｓ：６４７− ６６１　（１９８８））。

ｐＨ８のホウ酸塩緩衝塩水中２■１１　Ｃ）ＩＡＰｓでビーズを洗浄後、０．１ ％ドデシル硫酸ナトリウム、リン酸塩緩衝塩水（ｐＨ６，５１で、６５℃で結合 物質を溶出した。次に、Ｆｔ、　Ｒ１由来のサブユニットをＨＰＬＣサイズクロ マトグラフィーで分離し、βおよびγ含有断片を回収し、還元し、アルキル化し およびトリプシンで消化した（　］、　−Ｐ、ｘｉｎｔｌ　ら、Ｂ＋ｏｃｈｅｍ 口＋４２６＋４６０Ｓ−４６１０（１９８７））　、生じたペプチドを、１．− Ｐ、　Ｋｉｎｅｌら、Ｂｉｏｃｈ！ｍｉ＋ｌｒｙ　２６：４６０５−４６１０　 Ｆ１９８７１　の報告のように、ＨＰＬＣ逆相クロマトグラフィーで分離した。

βおよびγ消化物のクロマトグラムを比較して、重複していないｑペプチドを配 列決定した（　］、　−ｐ、　Ｋｉｎｅｔ　ら、Ｂｉｏｃｂ１口ＩＢ　２６：４ ６０５−４６１０　（１９８７１）。

実施例１３ ペプチド３　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１の残基４１〜４７）およびペプチド４ （ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋２７の残基５４〜６２）の配列に従って、オリゴヌクレ オチドプローブを合成した。配列は、Ｇ＾（Ａ／Ｇｌ＾Ａ（＾／Ｇ）丁ＣＩＧ＾ ＩＴ／ＣＩＧＣＴＣＴＣＴＡ　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８　）および＾＾（Ｔ／ ＣＩ　ＣＡ　（＾／ＧＩ　Ｇ＾（＾／ＧｌＡｃｔＴ＾（Ｔ／Ｃ）Ｇ＾（Ａ／Ｇｌ ＾Ｃ１（Ｔ／ＣＩ　ＴＩＡ＾（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＧ：９　）である。陽性クロー ンを精製し、サブクローン化し、配列決定するため、１ｇｌｌｌライブラリーの スクリーニングに使用した方法は、当技術分野で周知である（　］、　−Ｐ、　 Ｋｉｎｅｌ　ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｌ＋７２６：４６０５−４６１０　（１９ ８７））。また、ペプチド３およびペプチド４は、ペプチド合成装置へＢ１４３ １人を用いて合成した。合成ペプチドの純度は、ＨＰＬＣ逆相クロマトグラフィ ー、アミノ酸組成および質量スペクトル分析により評価した。ペプチドは、Ｉ− マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いてオボア ルブミンに（Ｆ、Ｔ、Ｌｉｌ１ら、Ｂｉｏｅｂｌｉ＋ｔＢ　１８：６９Ｇ−６９ ７（１９７９））モル比５１で結合させるか、臭化シアンで５ｅｐｈｓ＋ｏ＋ｅ 　４Ｂに結合させるかのいずれか一方とした。ウサギを、オボアルブミン結合ペ プチドで免疫し、抗血清を収集し、抗ペプチド抗体をＬ！ｐｋｓ＋ｏｓ＊　４Ｂ 結合ペプチドを用いた親和性クロマトグラフィーにより精製した。抗ペプチド抗 体は、ウェスタンブロッティング法によりＦｃ、　Ｒ１のγサブユニットとの反 応性について、および１２５．、、Ｅレセプタ複合体を免疫沈降する能力につい て試験した（　＋、　Ｒ’ｉｗｅｔ畠ら、Ｍｏ１．　Ｉｓｍ■ｏｌ　２５６４） −６６１（１９８１１１１゜ラットのＦｃ、　ＩＩのγサブユニットのヌクレオ チド配列（ＳＥｏ　１０　Ｎｏ：２６）及びそれにより推定したアミノ酸配列（ ＳＥｏ　１０　ＮＯ二２７）は、本発明の方法を用いて得たが、これらを第９図 に示す。

γサブユニットのｃ　ＤＮＡを単離し特性を検討するために、Ｆｃ、　Ｒ１のサ ブユニットのｃＤＮＡを、オリゴヌクレオチドプローブを用いてラットの好塩基 球性白血病（ＲＢＬ）細胞（１，−Ｐ。

Ｋｉｎｅｌ　ら、ＢｉｏｃＴｈｅｍｉｓｌ「Ｙ２６：４６０５−４６１０　（１ ９１！７１）から調製したλｇ口１ライブラリーから単離した。Ｆｃ、　Ｒ１の γサブユニットのトリプシン消化物中で、４個のペプチド配列を同定し、このペ プチドのうち２個を用いて、２個のオリゴヌクレオチドプローブを合成した（第 ９図）。これらの２個のプローブで、ライブラリーを２回スクリーニングし、重 複するプラークを同定した。

３個の別個のプラークを精製し、サブクローン化し、０．６ないし０．７キロ塩 基（ｋｂ）の同様な挿入物が含有されることが分かった。

第９図に、γｃＤＮＡの完全ヌクレオチド配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ；２６）、 推定されたアミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７）および４個の先のトリプ シン処理ペプチドの配列内の位置を示す。配列の解析（第１０Ｃ図）から、１８ 残基のＮ末端疎水性シグナルペプチドおよび、細胞質内ドメイン由来の５残基の 短い細胞外部分を分離する推定の膜貫通ドメインが示された。初期の試験で予測 されたように、Ｎ末端がプロセシングを受けたサブユニットには、２個のシステ ィンが含まれるが、メチオニンおよびトリプトファンは含まれない（Ｇ、Ａｌｃ ｔ＋畠＋ら、Ｂｉｏｅｈ＊ｍ１ｓｌｒｙ　２６＋２５６９−２５７５　＋１９８ ７１１゜組成分析から、γサブユニットが１個のヒスチジン残基を含む可能性が あることが示唆された。（Ｇ。

Ａｌｃｓｒ１＋　ら、Ｂｉｏｃｂｅｍｉｓｊｒｔ　２６：２５６９−２５７５　 （１９ｇ？））　、　しかし、３５Ｓメチオニンおよび３Ｈヒスチジンを用いた レセプタの生合成二重標識試験により、ヒスチジンはレセプタ関連の７サブユニ ツトに取込まれた形跡がないことが明白に示唆された。それぞれＣ末端からのヒ スチジンの６個の残基を予測する、３個の独立するクローンに、オープンリーデ ィングフレームが由来したため、γサブユニットが、ヒスチジン含有セグメント を切るＣ末端プロセシングを受けると考えられる。さらに、このヒスチジンの直 前にあるペプチドが回収されたため（第９図およびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋２６） 　、Ｃ末端セグメントは、Ｌ７ｓ　６３の後ろで切断されなければならない。し たがって、完全にプロセシングを受けたγの推定分子量は７Ｈ９０ｓとなり、ド デシル硫酸ナトリウム−尿素ゲル上で還元された精製γに関して得られた値と良 く一致する（Ｇ、ＡＩｃｓｒ■ら、ｆｌｉｏｃｈｃｓｉｓｌＢ　２６：２５６９ −２５７５　（１９ｇ７）ｌ　。

γサブユニットのヘプタマーおよびノナマーペプチドに対するポリクロナール抗 ペプチド抗体を調製し、ＲＢＬ細胞のＩｇＥレセプタ複合体との反応性を試験し た。精製した抗ペプチド抗体は両方とも、ウェスタンプロットアッセイで、部分 精製したγサブユニットの非還元二量体および還元単量体と反応した。さらに、 両抗体とも、ＲＢＬ細胞の抽出物または部分精製したレセプタの調製物のいずれ かに由来するレセプタ結合１２５．山Ｅを定量的に沈降せさた。これらの結果を 合わせて考えると、本発明に従って単離したｃＤＮＡが、Ｆｅ、　Ｒ１のγサブ ユニットをコＣＯＳ　？細胞表面上のレセプタの発現を達成するために、Ｃ０８ ７細胞中にトランスフエフシランする前に、ＳＹ　４０プロモ一ター促進発現ベ クターｐｓｖｔ中に、初めにα、β、およびγのｃ　ＤＮＡコード領域を別々に サブクローン化した。一時的発現用ヘタ９−ｐｓＶＬノＳａｔ　１部位中に、ａ 　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｄ　８１０ｂｐ　Ｅｃｏｉｌｌ−３ＩＦ　ｌ制限断片、Ｉ Ｊ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｄ　９６５ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏｉｌＶ制限断片お よび７ｃＤＮＡの３００ｂｐ　ＥｅｏＲＩ−Ｄｄｅ　ｌ制限断片を、別々にサブ クローン化した（Ｐｂｓｒｓ＊ｃｉ＊、　Ｕｐｐ■ｌ畠、　５ｖｔｄｓ１１）　 。これらの制限断片には、個々に、適するサブユニットの完全コード配列および 非翻訳配列の可変部分が含まれていた。外来配列のみが、初期リンカ−に属する 開始ＥｃｏＲＩ認識配列であった。次に、培養したＣＯ５７サル腎細胞を、標準 リン酸カルシウム沈殿法により、ＤＮＡ　４０μｍでトランスフエフシランした （Ｌ、　ＤｓｖｉＩら、＋ｕ　［ｌ＊ｓ＋ｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　＋＋＋　ｍｏｌ ＊ｃｕｌｓｒ　Ｂ＋ｏｌｏＢ、ｃｄ、Ｌ　Ｄｓｖ■。

ＥＩｓｅｔｉｅ＋、　Ｎｅｗ　Ｔｏｌｋ　（１９８６））。４８時間後、ＩｇＥ ロゼツテイング（ｒｏｓｅＨｉＢ）分析により、トランスフエクシａンした細胞 （第１１図のパネルＡおよびａ）ならびにＲＢＬ細胞（第１１図のパネルＣおよ びＤ）をＩＩＥ結合の表面発現について調査した。これらの細胞（５ｒｌＯ’細 胞／−１）を、非特異的ラットＩｇＥとともに（パネルＢおよびＤ）または非特 異的ラットＩｇＥなしで（パネルＡおよびＣ）３０分間、次に、５μｍ／ｍｌの 抗ＤＩＰ−１１Ｅで、室温でインキュベートした（Ｆ、Ｔ、Ｌｉ−ら、Ｉ、ｌ■ ■ｗｏｏ１．　１２４：２）２８−２７３６　＋１９８０））。次に、周知の方 法によって、２．４．６−　トリニトロベンゼンスルホン駿で修飾した雄ウシの 赤血球で、細胞をロゼッティングした（Ｍ、Ｒ１１ｌｅｎｂｅＢ　ら、Ｐｒｏｃ 、Ｓｏｃ、Ｅｔｐ、Ｂｔｏｌ。

Ｗｅｄ、１３２：５７５−５８１１９６９＞）　、結果を第１１図に示す。第１ １Ａ図に、α、β、およびγサブユニットで同時トランスフェクションした細胞 により発現されたＩ！Ｅ結合活性を示す。陽性対照として使用される、事実上す べてのＲＢＬ細胞が、ロゼツトを形成した（第１１Ｃ図）。細胞を、ヒトＩｇＥ 　（図示せず）ではなくラットの１ｔε　（第１１Ｂｖ！Ｊおよび第１１Ｄ図） とプレインキュベージ儂ンすることにより、ロゼツトが完全に阻害された。これ は、ラットＦｃ、　Ｒ１に対する種特異性と一致した（Ａ、　ｌ：ａｌｅｇ７ｃ ｋｉら、１、　Ｅ１９．　Ｍｔｄ、Ｎ９・６０Ｇ−６１６（１９７４１１゜１１ 結合活性の表面発現に対する必要条件を調べるために、表２に示すように、３個 のサブユニットのｃＤＮＡの組み合わせを変えて、細胞をトランスフエフシラン した。

Ｆｅ、　Ｒ１の３！ｌのサブユニットのｃＤＮＡの組み合わせを変えて、ＣＯＳ 　７細飽をトランスフェクションした（第１１図）。表２に示す各トランスフエ フシランのために、ロゼッティング分析を行なった。ノーザンブロツティングに よる一ＲＮ＾の評価は、１回のみ行なった（２Ｘ１０７細胞上で）。表２中でア スタリスクの印で示した実験の細胞に、阻害剤を添加した（５０μｇ／ｌの非特 異的ラット１！Ｅを、特異的マウス抗ＤＩＰ　ＩｇＥを添加する３０分前に細胞 に添加した）。

表２ トランスフェクション実験 細　胞　トランス７エクン５ン　発現 ｃＤＮＡ　Ｎａ　レセプター　１ｔε結合ｍＲＮＡ　（ロゼツト形成胞数） ＣＯ３７０９０ＤＢ２．９４Ｂ α　２　α　０／４．０５０ αβ　２　αβ　Ｑ／　３，５０４ α　イ　α　（１／Ｉｔ、ＩＩＨＩ β　！　β　Ｇ／２，０６９ αβ　２９　αβ　９２０／４１．２３８αβ　４　αβ　Ｇ／　７．５４２’ ＲＢＬ　Ｏ−αβ　”１１１１１％” ゛阻害剤を添加した実験。

表２に、これまで述べたように行なったすべてのトランスフエフシラン実験から 得たデータをまとめる。トランスフェクション実験の成功率は、α、β、および γが同時に同時トランスフェクションされる場合、ＩｇＥ結合の５±２％発現を 日常的に達成するようにデータを収集したため、改善された。

ノーザンブロッティングにより評価されたように、すべての組み合わせで、トラ ンスフエフシランが成功したが、ロゼツト形成細胞は、完全な組合せのｃＤＮＡ を同時トランスフェクションした後でのみ検出された。これらの結果から、βお よびγサブユニットが、ＩｇＥ結合αサブユニットの表面発現に必要であること が示唆される。さらに、完全に集合したレセプタのみが、形質膜に到達すること が示唆される。この現象はまた、他の系でも認められ（Ｍ、　ＭｃＰｈｓｕｌら 、Ｐｌｏｔ、　Ｎｔｔｌ、　Ａｃｔｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　Ｈ：８８６３−１１８６７　（１９８６１；　Ｙ、Ｍｉｎｓｍｉら、Ｐ ｌｏｔ、Ｎ１１１．　＾ｅｘｄＳｃｉ、　ＵＳＡ８４：２６１１８−２６９２　 ＋１９８７））　、一般には、ポリマー性膜蛋白質に応用することができる。

αから、βおよびγが容易に解離することから（１１，１ｊｉｙＩｌｓｙら、Ｂ ｉｏｅｂｅｍｉｓｌｒ７２１：６９２２−６９２７　（１９８２））　、概念的 に、γ２、およびβがＦｃ、　Ｒ１のサブユニットまたは“レセプタ関連”蛋白 として考えられるかどうかについての不確かさが持続的に高まっている。（後者 の例は、胸腺由来リンパ球上の抗原レセプタに関連するＣＤ３複合体である（ｌ （、Ｃ１ｅｒｅｒｔら、Ａｎｎ、Ｒｅｔ。

ｌ５ｍ１ｎｏ１．６：６２９−６６２　（１９８Ｂ））。たとえば、α、β、お よびγの協調的生合成および異化作用に基づくと、Ｆｃ、　Ｒ１のサブユニット モデルが有利である（Ｒ，Ｑａｓｒｌｏら、Ｍｅｌｅｅ、Ｉｍｍ＋＋ｎｏ１．　 ２２：１０４５〜１０５２　Ｆ１９８５１）。本発明により得られたトランスフ ェクション細胞に関する新規データから、αβγ２がＦｃ、　Ｒ１の最小構造で あることの最も強力な証拠が提供される。

テトラマーｒｅ、　Ｒ１レセプタの本モデルを、第１２図およびＳＥＱ　１０　 Ｎｏ、２８〜３０に図示する。このモデルで、発現レセプタを構成する５８９ア ミノ酸残基のそれぞれが、円で示されている。図中、細胞の外側が上方になり、 レセプタが包埋される形質膜が中間になり、および細胞の内側が下方である。ポ リペプチド鎖のそれぞれに（αはＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・２８、左側の鎖、βはＳ ＥＱ　Ｉ［ｌ　Ｎ。

２９、真中の鎖および２本のγはＳＥＱ　１０　ＮＯ＋３０、右側の鎖）、１個 または複数の膜貫通セグメントが含まれている。

α鎖（Ｓｔ：Ｑ　ＩＤＮ０：２ｇ）には、２個の箔内ジスルフィドループが含ま れると考えられ、これらのループの配列は免疫グロブリンとかなりの相同性を示 している（　１．　Ｐ、　Ｋｉｎｅｉら、［１ｉｏｃｂｅｓｉｓｌＢ２５：１６ ０５　（１９８７１；　Ａ、Ｓｈｉｗｉ＋ｕら、Ｐｌｏｔ、Ｈｌｌｌ、Ａｃ１ｄ 、Ｓｃｉ、ｌｌ５ＡＳ：１９０７　ｌｌ９ＡＳ）：　１．　ｋｏｃｈｔｎら、Ｎ ａｃｌｅｉｃ　Ａｃｉ＋ｌ＋　Ｒｅ１．　１６＋３５ｆ１４（１９１１Ｈ）。こ のように、αサブユニットは、免疫グロブリンスーパーファミリーの別のメンバ ーである（人、　Ｗｉｌｌｉｌｔ　ら、Ａｎｎ、Ｒｅｔ、ｉｓｍＩＩｎｏｌ、６ ：３８１　ｆ１９Ｈ口。α鎖の細胞外および膜貫通セグメントは、ＩｇＧを結合 するＦｔレセプタの免疫グロブリン結合鎖とかなりの相同性を示すが（１，Ｒ＊ マｅｔｃｈら、５ｃｉｅｎｃｅ２３４１７８　（１９８６））　、細胞内細胞質 尾部は、全く異なっている。

α鎖の細胞外部分に共有結合する炭水化物の残基は、第１２図に示されていない 。Ｈ結合炭水化物については、７部位が考えられるが（Ｊ、　Ｐ、Ｋｉａｅｌら 、ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔＢ　２６：４６０５　ｆ１９ｇ？）；　Ａ。

ＳＴｈｉｍｉｘｍ　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎ＊口、Ａｃ５ｄ、Ｓｅｉ、ＵＳＡ　８５： １９０７　（１９８８））、そ９中のどれを細胞が実際に使用するのかは、まだ 決定されていない。研究から、炭水化物は、この鎖によるＩｇＨの結合に必須で はないことが分かる（Ｂ、　Ｈｅ＋ａｐ＋ｌｅ＊ｄら、１．　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ ｅｗ。

２Ｓ６＋１０７１７　＋１９８１１＋。　β鎖（ＳＥｏ　１０　ＮＯ：２９）に は、４個の膜貫通セグメントが含まれ（１，Ｐ、　Ｋｉａｅｌら、Ｐｌｏｃ、Ｎ ５１１．　＾ｃｏｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ８５：６４８３　（１９１１８））、モノクローナル抗体を用い た先行の研究（１，Ｐ、Ｋｉｎｅｌら、Ｐｌｏｃ、Ｎｓ口　＾ｃｒｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ８５：６４８３（１９８ｇ）　；　Ｊ、Ｒｉｗｅｒｓ　ら、Ｍｏｌ、Ｉａ ｍｕｃｏｌ、　２５＋６４７　ｆ１９８８））により、それぞれ５９および４３ 残基長を有するアミノおよびカルボキシル末端が、形質膜の細鉋質面から突出し ていることが分かった。

同様に、γ鎖（ＳＥＱ　１０　ＮＯ＋３０）は、かなりの細胞内伸長を有するが 、外側への露出は非常に限定されている。

一般モデルによれば、個々のサブユニットの推定される膜貫通ドメインは、それ らの個々のヒトロバシープロットから予測した（第１０図参照、図で、水への移 動のための、正味２０ｋｃｓｌ／ｓｏｌを越える自由エネルギーは、膜貫通セグ メントまたはリーダーペプチドを示唆している（Ｄ、　Ｅａ４ｓ１ｍｓ＋＋ら、 ＾■、　Ｒｅｙ、Ｂｉｏｐｔｙｓ、Ｃｈｅｗ、１５：３２１−３５３　（１９８ ６））　、これらのプロットから、α、β、および各７のそれぞれに対し、１． ４および１個の疎水性ドメインが示唆される（すなわち、完全レセプタに対し７ 個の膜貫通領域）。Ｇ蛋白質と相互作用するレセプタファミリーのメンバーも、 ７個の膜貫通ドメインを含んでいる（１゜８！＋ｓｋｏｗｉｌｔ　ら、Ｃ！ｌｌ 　５０：９９５−９９６　（１９１１７））　、このファミリーには、βおよび αアドレナリン作動性、ムスカリン様レセプタおよびロドプシンがある。Ｆｃ、 　Ｒ１とこれらのレセプタの間に、配列の相同性はないが、このレセプタにより 活性化される生化学的経路を少なくとも幾分か説明するために、Ｆｃ、　Ｒ１と Ｇ蛋白質の間の相互作用が仮定されていることは重要である（Ｓ。

ＣｏｃｋｃｒｏＮら、Ｎ＊ｌｓ＋ｅ　３１４＋５３４−５３６　（１９８５）ｌ 。αおよびβサブユニットのトポロジーは、特に、βサブユニットのＣおよびＮ 末端部分の細胞質内局在について、１．Ｐ、　Ｋｉａｅｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｓｌＢ　２６＋４６０５−４６１Ｏｆ１９ｇ？）およびＡ、　Ｓｈｉｍｉｔｗら 、Ｐｌｏｃ。

Ｎｓ目、＾ｃｏｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　１１５：１９０．７−１９１１　（１９ １１８１）で議論されている。

第１２図に示すように、γ二量体のトポロジーを支持する２つの証拠がある：無 傷の細胞上ではなく裏打ち（１０マｓ＋１ｅｄ）Ｌ、た小胞上でγを酸化的にヨ ウ素化することができ（Ｄ、ｂｏｌｏｗｋｌら、Ｊ、　Ｒｉｏｔ、Ｃｈｅｗ、２ ５９：３７２０−３７２８　（１９８４））、また生体内で、γはトレオニン残 基上でリン酸化される（Ｒ，ＱｕＩｒｌｏら、Ｍｏ　ｌ。

ｌｍ５ｓａａ１．２：ｂ１２１５−１２２３　（１９８６１）　、関連のある残 基は、γの推定した細胞質外小セグメントの中にいずれも存在しないが、推定し た細胞質尾部、すなわち、２個のチロシンと４個のトレオニン残基上にすべて存 在する。

レセプタのトポロジーを調べる別の手段としては、Ｇ、マ０ｆｉＨｅｉｉＩｌｅ 、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈ７ｓ、　Ａｃｔｓ　９４７：３０？−３３３ ｆ１９８８）により提案されたように、３個のサブユニットの推定した細胞外お よび細胞内セグメントについて塩基性残基の相対的含量を分析することである。

この著者は、塩基性残基数／縁桟基数の比が、試験したセグメント長の関数とし て変化することを見つけたが、一般に、膜蛋白が転座した（細胞質外）セグメン トよりも、未転座（細胞質内）のセグメントにおいて実質的に高い。以下の表３ に、本モデルから計算した比と“既知の”膜蛋白に基づき予測した比（Ｇ、ｗｏ ｎ　Ｈｔｉｉｎｅ、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｌｙｔ、Ａｃｔｓ　９４７：３Ｇ ７〜３３３　（１９８８１）がよく対応することを示すが、これにより、ここで 示すトポロジーモデルが独立して支持される。

表３ このモデルにより、サブユニットの組織化に関するいくつかの重要な特徴が明白 になる。βおよびγ二量体が、相互に作用し、洗剤溶液中では、相互に解離する 前に、αから１単位として解離しく　＋、Ｒｉｙｓｒｔ　ら、Ｍｏ１．　ｌ５ｓ ｓａｏ１．　２Ｓ：６４７−６６１　（１９０））、場合により、βおよびγ二 量体が互いにジスルフィド結合スルト認められる（　１．　Ｐ、　Ｋｉａ＠ｌ、 　１ｌｉｏｃｂ＊ｍ１ｓｊ４．　２２：５７２９−５？Ｂ（１９ｇ３＋１゜この 結合を最も起こすと考えられる候補残基は、トポロジー的に近いと予測されるγ −ｃｙｓ７およびβ−ζＹ［０である。

次に、少な（ともγ−ＣＦＩ２６残基が、γ二量体中でジスルフィド結合するこ とが必要になる。レセプタの生合成に関する予備的データから、αおよびβが相 互に作用することが示唆される。

Ｆｃ、　Ｒ１の機能的特性は、い（つかのＦｃ、　Ｒの特性とほぼ同様である。

Ｆｃ、　Ｒは、免疫グロブリンのＦｅ領域の相同セグメントに結合するように思 われ（Ｂ、　Ｌｌｌら、！１Ｉｌｉ＋ｅ　３Ｈ：１Ｈ−１８３ｆ１９８８）　； 　Ａ、　Ｄｗｎｃｓａら、Ｎ＊ｔ＊＋ｅ　３３２：５６３−５６４　（１９Ｂ８ １）、またレセプタ上の結合部位は、免疫グロブリン様ドメインを有する相同性 ポリペプチド上にあることが分かっている（＋、Ｐ　Ｋｉｎｅｌら、Ｂｉｏｅｈ ｌｉ＋ＩＢ　２６：４６０Ｓ−４６１０（１９８７）；　１．　Ｒｔｔｅｌｃｈ ら、５ｃｉｅｎｃｅ２３４＋７１８−７２５　（１９８６１）。両タイプのレセ プタを凝集して、細胞の活性化を開始することが必要であり、試験すると、後者 には、はぼ同様な第２メツセンジヤーの生成が含まれるようである（ｔｌ、Ｍｓ ｌＢｅｒら、　Ａａａ、Ｒｅｙ、Ｉｍｍａｎｏｌ、４：４１９−４７０　（１９ ８６１；　Ｎ。

Ｈｏｅ（、１ｍ５ａｎｏ１．　Ｔｏ＋ｌ＋７９＋ｌＢ５−１８７　（１９１１８ ））。したがって、驚くべきことに、　Ｆｃ、　Ｒ１が４個のポリペプチド鎖、 ７個の膜貫通セグメントおよび５個の細胞質セグメントから構成されるが、Ｆｃ 、　Ｒ１はさらに単純な構造、すなわち単独のα様サブユニットと同様な機能を 果たすように思われる。極端な場合は、Ｆｅ、　Ｒ１１１が膜貫通および細胞内 セグメントでさえ喪失しているらしいという場合である（Ｐ、５ｅｌｖｚｒＢ　 ら、Ｎ１１＋ｕ＋６７　（１９８８）；　Ｄ、５１ｍ５ｏｎｓ　ら、Ｎ＊１ａｒ ｅ　３３３：５６８−５７０　（１９８８１；　Ｔ。

Ｌｉｔｉｎ＋１ｗら、Ｎ＊１ｗ＋ｅ　３３３：６６７−６６９　（１９８８１） 、　Ｆｃｙレセプタの追加成分が、このように失われる可能性があることが示唆 された。

あるいは、このような成分が、ＦＲＩのβおよびγサブユニットであるよりも、 レセプタが可溶化してより容易に喪失されるとも考えられる（　１．　Ｐ、Ｋｉ ｎｅｌら、Ｂｉｏｅｈｅｍｉｔｌｒｙ２４＋４１１７−４１２４ｆ＋９８５）） 。合理的な解釈は、このような仮説的な成分が、βまたはγまたはその両方に相 同であるとすることである。後者の成分用の遺伝子プローブが入手できれば、こ の可能性を深く探求することができるだろう。

本発明に従って達成されるＩｇＥ結合の発現に成功することは、治療との関係に おいて重要性を有している。Ｆｃ、　Ｒ１によりトリガーされた肥満細胞および 好塩基球を脱顆粒すれば、多くのアレルギー症状を説明できる。この疾患の発生 率が高いことを考慮すると、ＩＣＥ結合の特異的阻害剤の発見により、多大な治 療的利益が得られると期待される。このような阻害剤の開発は、ヒトＩｇＥのヒ トレセプタへの結合に関する実用的な１０マ自１０アツセイ法がないことが障害 となっていた。たとえば、ＩｇＥ由来ペプチドのその阻害能力に関する評価は、 最近では、皮膚試験により決定しなければならないが（Ｂ、　Ｈｅ１ｍら、Ｎ１ １＋ｕ＋　３３１・１８Ｇ−１１１３（１９１１８）ｌ　、煩雑で潜在的な危険 性のある方法である。

本発明は、トランスフェクションした１歯動物レセプタの発現を達成するもので あり、これによりヒトＦｃ、　Ｒ１を同様に発現できることが分かった。あるい は、現在、ヒトαサブユニットをコードするｃＤＮＡのみが単離されているため （＾、Ｓｂ１ｍ１ｔＩｌら、ＰＩＯＣ，Ｎ１１１．　＾ｃｏｄ、Ｓｃｉ、ｌｌ５ Ａ　８Ｓ：１９Ｇ？−＋９［１（１９８８）；　Ｉ。

Ｋｏｃｈ＊ｏら、Ｎａｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１６：３５８４　（１９ ８ｇ））、薩歯動物βおよびγ鎖をコードするｃＤＮＡで同時トランスフェクシ ョンして発現され得ると予想される。

ヒトとラットのαサブユニットの比較を、以下の表４に示す。

表４ ヒトおよびラットのアルファ鎖の特性の比較ドメイン　種　相同性％ ヒ　ト　ラット 細胞外　１８０　１８１　４９ 膜貢通　２１　２１　６７” 細胞内　３１　２０　２３ 合計　２３２　２２２　４７’ ’ｗｔ平均 １ヒト　：　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３アミノ酸残基　１７１１〜２０４）Ｗ ＬＱＦＦＩＰＬＬＭＩＬＦＡＹＤＴＧＬＦＩＳＴＱＱＱラット＝　（アミノ酸残 基のｗｔ平均）ＷＬＱＬ　ＩＦラッＬＡＹＩＬＦＡＹＤＴＧＬＷＰＳＴＨＫＱ上 記表から、ヒトとラットのアルファ鎖の全体的な相同性は、約４７％であるが、 予測した膜貫通ドメインでは、約７０％の相同性を示した。実際に、膜貫通ドメ インを詳細に調べると、完全に同一の連続する１０残基の伸長（＋ｌ＋ｅｌｃｈ ）がある。この連続残基の伸長を、表４中に下線を引いて示した。

膜貫通セグメントは、β１およびγ鎖と最も相互作用しゃすいα鎖の領域である ため、トランスフェクションした場合には、ラットのβおよびγ鎖と共に、ヒト α鎖が発現されると予想された。このことから、本発明者は、ヒトαおよびラッ トのβおよびγサブユニットを用いて同時にトランスフェクションされたＣＯ８ 細胞によりヒトＩｇＥ結合を発現させることができることを証明した。もちろん 、永久的にトランスフェクションされた細胞系をもつことが有利であり、そのよ うな細胞系に関しては、ここで開示されるＩｇＥレセプタのサブユニットを組み 合わせて用いることが望まれるだろう。

第２０図および第２１図に、トランスフェクションされた細胞のＦＡＣ３分析（ ＩｇＥ結合）から得られた結果を示す。

第２０図は、ＣＯ５−７１−ランスフェクション細胞を示す。

第２１図は、ＫυＮ２細胞（好塩基球細胞系）を示す。

使用したＸυ８１２細胞のクローンは、３個のサブユニット、アルファ、ベータ 、ガンマのｍ１ｌＮＡを発現するが、レセプタは、細胞表面上で自然には発現し ない。

第２０図に、Ｃｏｇ−７細胞中へのヒトアルファおよびガンマのトランスフェク ションにより、トランスフェクシントの表面でのアルファーガンマ複合体の発現 に十分であることが確認された。また、これらの結果から、ヒトベータおよび非 ラットベータが効率的にヒトアルファと会合し、したがって、ラットベータがヒ トベータに置換できないことが分かった。

第２１図に、ＫＵ８１２中へのアルファーガンマのトランスフェクションにより 、レセプタがほとんど発現しないことを示している。発現の量は、ベータおよび ガンマのトランスフェクション後に得られた量と同等である。したがって、この 量は、内在性アルファ（ベータおよびガンマトランスフェクションに対し）また は内在性ベータ（アルファおよびガンマトランスフェクションに対し）に帰因さ せることができる。これに反し、３個のｃＤＮＡの同時トランスフェクション後 の発現量は、かなり多い。

これらの結果から、結論として以下のことがわかる。

ｌ、　肥満細胞および好塩基球において、レセプタの発現量の調節は、線維芽細 胞におけるものとは異なるようである。

２、　ヒト肥満細胞および好塩基球において、レセプタの発現には、アルファ、 ベータおよびガンマの存在が必要であるが、トランスフェクションした線維芽細 胞には、ヒトアルファおよびガンマが十分にある。

ヒトβｃＤＮＡクローンを単離する初期の試みは、完全長のラットおよびマウス のｃＤＮＡプローブでヒト肥満細胞ｃ　ＤＮＡライブラリーをスクリーニングす ることによるものであった。これらのプローブを放射標識して用い、７１１０５ 個のコロニーをスクリーニングした。４個のクローンを単離し、そのすべてに、 ラットβｃＤＮＡと７３％相同性の１５３ｂｐ挿入物が含まれていた。この挿入 物の配列は、細胞内ループおよび第３の膜貫通ドメインを含むβの一部分に対応 していた。これら４個の同一の、クローンは、組換えにより生成された単一のク ローンのライブラリー増幅の結果生じたと考えられる。さらに２個のライブラリ ーをスクリーニングした。すなわち、別の肥満細胞ｃＤＮＡライブラリーおよび 、好塩基球に富む白血球に由来するｃ　ＤＮＡライブラリーである。後者のライ ブラリーは、ヒトγｃ　ＤＮＡクローンを単離するのにも使用された。合計１０ ７個・　の独立したｃ　ＤＮＡクローンを、マウスのプローブとオリゴヌクレオ チドのパネルおよび１５３ｂｐのヒトβプローブを用いてスクリーニングした。

しかし、さらなるクローンは、単離されなかった。

放射性標識した＋５３ｂｐのヒトプローブを用いて、ヒトゲノム白血球ライブラ リーからの６ａ１０５個の独立したゲノムクローンを引き続きスクリーニングし 、平均サイズ２Ｓｂｐの挿入物を含有する１１１個のクローンを単離した。これ らのクローンはすべて、ラットβをコードするγ配列の初めと終りに対応する２ 個の２０ｓｅｔオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズした。４個の異な る制限パターンを、１０個のクローンから得ることができた。しかし、ラットの βコード配列の異なる領域を走査する種々のオリゴヌクレオチドプローブを用い てサザンプロットを行ない、この４個の制限パターンは、異なる遺伝子の生成物 ではないことが分かった。むしろ、そのクローンから、β遺伝子にフランキング する配列の長さが異なることが分かった。

さらにマツピングおよび配列決定して特性を検討するため、２Ｓｋｂの挿入物を 含む１個のクローンを選択した。第１３図に示す制限マツプは、制限エンドヌク レアーゼＨｉＩｄ　ＩＩＩ、　Ｐｓｌ　Ｉ。

Ｂｕｎ　ｌ、　Ｈ＋＊　Ｉ、　５ａ１１およびＫｐ１１１テ完全および不完全消 化して作成した。３Ｊｋｂの１ｌｉａｄ　ＩＩＩ断片は、開始コドン、およびラ ットβの膜貫通領域１および１■に対応するオリゴヌクレオチドプローブとハイ ブリダイズすることが分かった。２０口すのＳｓｓ　Ｉ断片は、膜貫通ドメイン １１１および１ｖのラットβプローブとハイブリダイズし、４．５ｋｂのＳａｔ 　Ｉ断片は、停止コドン領域のプローブとハイブリダイズした。ｐＧＥｌ　３！ ｌ（＋１または（−）中に、３個の断片をサブクローン化し、完全に配列決定し た（第１４図およびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１）　、　１ｌｉｓｄ　ＩＩＩと２ ．８Ｎ＋　ｇａｓ　１断片の間の０．９ｋｌ＋ギヤツプに対応する断片は、ＰＣ ＩＩにより生成され、配列決定された。ＰＣＩを用いた分析から、２個のＳｓｓ 　Ｉ断片が互いに隣接することを確認した。

ヒトβ遺伝子とラットβｃＤＮＡの配列を比較すると（第１５図）、７個の相同 領域が、７個の異なるエキソンに対応するように局在していると考えられる。

実施例１７ エキソンの配列を確認し、イントロンーエキソンの境界を規定するために、好塩 基球に富む白血球から精製したＩ＾の逆転写によりヒトβｃＤＮＡを合成し、そ の後にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲＩ　を用いて逆転写体を増幅した（本明細 書の材料および方法で述べた）。これには、開始コドンの前の２個のヌクレオチ ドから停止コドンの後ろの３２個のヌクレオチドまで伸長した生成物を使用した 。ｃ　ＤＮＡ配列は、ヒトβ遺伝子に対応する配列と同一であることが分かった 。これにより、ヒトβのコード配列は、７個のエキソン内に含まれることを確認 した。さらに、ｃＤＮＡと遺伝子配列を比較し、イントロンーエキソンの境界の コンセンサス配列を検出することにより、これらの境界を正確に決定することが できた。６個の介在イントロンの５′境界は、常にＧＴで始まり、３′境界は＾ Ｇで終わる。

５°及び３′非翻訳配列の長さを評価するため、ヒトβ転写体の大きさを分析し た。異なる個体より得られた好塩基球に富む白血球からのＲＮＡを、放射性標識 された１５３ｂｐヒトβプローブと、ノーザンブロツテイング法によりハイブリ ダイズさせた（第１６Ａ図）。約３，９ｋｂの２つの転写体が、Ｃ０８−７細胞 中ではな（ヒト好塩基球中で見出された。ヒト転写体は、クロスハイブリダイゼ ーションによりＲＢＬ細胞中に検出された１歯動物の対応物（２，７及び１．　 ７５　ｋ　ｂ）（Ｒｚ、　＋９８９．　Ｋｉｎｅｌ、　１９８ｇ　）より実質的 に長い。オリゴｄ　Ｔ　Ｅよりプライミングされた３種のライブラリーからのヒ トβｃＤＮＡＡプローブの単離を最初に失敗したことは、この長ｔ）サイズのた めと説明づけることができる。同様な結果が完全長のヒトβｃＤＮを用いて得ら れた。ヒトαｃＤＮＡプローブと、同じＲＮＡとのハイブリダイゼーションによ って、期待される大きさく１．１ｋｂ）のα転写体が明示された（第１６Ｂ図） 。

異なった細胞系から得られたＲＮＡもまた完全長のヒトβｍＲＮＡプローブとハ イブリダイズした（第１６Ｃ図）。ヒトβのメツセージは、Ｕ９３７、Ｄ＊ａｄ ｉ及びＨｅｌ＊細胞中で（よなく好塩基球細胞系ＫＵ８１２中においてのみ検出 された。スプライシングされていない転写体に対応すると考えられる他の）くン ドがＫＵ８１２中に見られる。

７３２ｂｐのオープンリーディングフレームと２００ｂｐと推定されるポリ八尾 部とともに、ヒトβ転写体は＋！　＋ｆ　３　Ｋ　ｂの非翻訳配列を含んでいる はずである。第１５図は、第７番目のエキソンにほとんどの非翻訳配列があるこ とを示している。３゜または５゛非翻訳配列にまだ同定されてはいないが更なる エキソンが存在する可能性についても探求した。

実施例１９ Ａ、（Ａ）５’末端と転写開始部位の特性化“実験操作法”において説明したよ うに、転写開始部位は、逆転写されたＲＮＡのＰＣＲ増幅産物を直接配列決定す ることにより決定された。好塩基球に富む白血球からのＲＮＡは、ヒトβコード 配列のプライマーへから逆転写された。ポリ八尾部が、ターミナルトランスフェ ラーゼで処理することによって逆転写体に付加され、そしてその結果得られたｃ ＤＮＡはＰＣＲによって増幅された。次に、−重鎖ＤＮＡ　（ポリｄＴ尾部をも つ（１）鎖）が、非対称ＰＣＲにより作製され、直接配列決定された。ＲＮＡの ５°末端に対応する（−）鎖のｃＤＮＡ配列を第５Ａ図に示し、β遺伝子の関連 配列と比較した。２つの配列間で、ＧＧＧＴＴの後の末端は完全に一致している 。その後のｃＤＮＡ配列は、遺伝子中には存在しないＣを再現的に示し、その後 に予想されたポリ八尾部が続いている。この付加的なＣはキャップ構造のＧに対 応し、開始部位の位置を示していると考えられる。

５°伸長の実験（第１７Ｂ図）により、この領域に主要な開始部位があることが 確認された（上述した位置の約１１ヌクレオチド３゛）。しかし、主要開始部位 の上下に見られるかすかなバンドが、マイナーな開始部位に相当するという可能 性を排除することは難しい。しかしながら、５°配列に見出されたＴＡＴＡＡＡ ボックスの存在は、単一の開始部位の存在を示している。さらに、ＴＡＴＡＡＡ ボックスの位置（通常開始部位の２５ヌクレオチド５°）は、示されるような開 始部位の明確な位置づけと更に矛盾がない。

実際、ＴＡＴＡＡＡボックスは第１７Ａ図に示したようにこの開始部位の上流の ヌクレオチド２９と２４との間に位置している。これとともに得られたデータは 、ヒトβｍＲＮＡ力（配列ＡＡＣＣＣで始まることを示しており（第１４図、５ ＥＱＩＤ　Ｎｏ、３１．及び第１７Ａ図参照）、１０２ｂｐの５゛非翻訳配列を 有している。

Ｂ、３°末端の特性化 ラットβｃＤＮＡとヒトβ細胞配列を比較（第１５図）すると、β遺伝子の第７ エキソンが少なくともヌクレオチド６７７３から少なくともヌクレオチド８９１ ０まで延びて０る事が示される。しかし不用的な３°非翻訳配列（約８００ｂｐ ）は３．９ｋｂ転写体を充分に説明するものと考えれるべきであった。消失した 配列が第７エキソンの一部であったのかまたは他の見つけられていないエキソン の一部であったのかを分析するために、β遺伝子由来の３種のプローブを調製し て、それらとベータ転写体との反応性を試験した。これらの転写体はノーザンプ ロット法でＮｔｉｌ−Ｂ＊ｍ旧断片（ヌクレオチド８４６０−９２５０）および Ｂ＊５ＨＩ−５ｐｈｌ断片（ヌクレオチド９２５０−９７１４）の両者とハイブ リッドしたが、５ｐｂｌ側のフラグメント３′　とはハイブリッドしなかった。

興味深いことに、２つのポリアデニル化シグナルＡＡＴＡＡＡはヌクレオチド９ ６６３ちと９７５８で認められた（第１４図及び５ＥＱＩＤ　Ｎｏ：３１）。そ れゆえ、この領域はエキソン７の末端に相当すると考えられる。両者のポリアデ ニル化シグナルは約３．９ｋｂの明らかに二本鎖の転写体を作るために使用可能 なようである（第１６図参照）。

全て合わせると、ここに示したデータは、ヒトβ遺伝子は７つのエキソンと６つ のイントロン及び約１０ｋｂのスパンを含むことを示している。エキソン１は、 １０２ｂｐの５°非非翻訳列とＮ末端細胞質尾部の最初の１８アミノ酸残基とを コードする。エキソン２は細胞質尾部の残りとＴＭＩの最初の３残基とをコード する。エキソン３はＴＭＩの残りと、最初の細胞外ループと、１Ｍ２の最初の半 分をコードする。エキソン４は１Ｍ２の後の半分と細胞質ループの一部とをコー ドする。エキソン５は細胞質ループの最後の３つの残基と、７Ｍ３と、第２の細 胞外ループのほとんどをコードする。エキソン６は細胞外ループの最後の２つの 残基と、７Ｍ４と、Ｃ末端細胞質尾部の最初の４分の１をコードする。最後に、 エキソン７は細胞質尾部の残りと長い非翻訳３′配列をコードする。

ヒトβ蛋白質は２４４アミノ酸（ａ　ａ）残基から成り、分子量は２６．５３２ ダルトンである（第１８図）。ラット（２４３ａａ）及びマウスβ（２３６ａａ ）と同様に、ヒトβは膜貫通ドメイン（ＴＭ）を暗示させる４つの疎水性セグメ ントを含んでおり、リーダーペプチドは含んでいない。第１９図はラット配列（ ＳＥＱ　１０　ＮＯ＋３３）及びマウス（ＳＥＱ　ｌ［ｌ　１１０：３４）配列 とともにヒト配列（ＳＥＱ　１０　Ｎｏ；３２）を示している。３種（ラット、 マウス及びヒト）からのβのコンセンサス配列は、６８．７％が同一であるけれ ども、アミノ酸残基の９１．４％が相同であることを示している。

表５ 種々のサブユニットの組み合わせのトランスフエフシラン１１のヒトα　−−Ｉ 　Ｇ、２ ヒトα　ヒトβ　−１０，２ ヒトα　−ヒト７　７　１０．４±　８．７ヒトα　ヒトβ　ヒトγ　７　ｌ、 ３±　５．０ヒトａ　ラットβ　ヒトγ　４　５４４±　３．４ラツトａ　ラッ トβ　ラットγ　Ｉ　ＩＩＪ±１７．８ラツトａ　ヒトβ　ラットγ　Ｉｌｌ　 ！、４±　２．０ラツトａ　ヒトβ　ヒトγ　５　１．ｌ±　１．３マウスα　 マウスβ　マウスγ　４　８，２±　５．６−マウスａ　ヒトβ　マウス７６１ ．６±　１．２マウスａ　ヒトβ　ヒトγ　２　１．ｓ±　０．８ヒトａ　−ラ ット７１．−−−　１　１．４±　ＩＪヒトａ　ラットθ　ラットγ、、、、、 　５　３．２±　２．８ヒトａ　ヒトβ　ラットγ、、、、、　７　７．４±　 ７．９ラツトａ　ラットβ　ラットγ、、、、、　２　９．３±　Ｏ」ラットａ 　ヒトβ　ラット？＋、、、、　２　０．４±　１１．５’　ＦＡＣ８：蛍光物 質活性化細胞選別；　ｔ　ｒｕｎｃ　：切頭型α、β及びγｃＤＮＡの同時トラ ンスフェクシａンは、トランスフェクトされたＣ０８−７細胞表面上においてラ ットまたはマウスのＦｃｈＲ１発現の促進のために必要なことが分かった。対照 的に、ヒトα及びβｃＤＮＡの同時トランスフエフシランは、γを明らかに必要 とせずにαγ複合体を表面上に発現する。ヒト７ｃＤＮＡの入手容易性と共に、 ヒトβがヒトレセプタ複合体の表面発現の効率に何らかの形で影響を及ぼすかど うかという疑問が生じる。表５は、Ｃ０８−７細胞中へのヒトα及びγｃＤＮＡ の同時トランスフエフシランの結果、フルオレセイン結合１ｇＥの結合後にＦＡ Ｃ８により分析すると、細胞の１０．４％±８．７が蛍光を発するということを 示している。このレベルの発現は、ヒトβｃＤＮＡがヒトα及びγｃＤＮＡで同 時トランスフエフシランされる時には、さほど改変されない（８，３％±５．０ ）。それゆえ、ヒトβはトランスフェクトされたＣ０８−７細胞中でヒトＦｃ、 Ｒ１の表面発現レベルに影響を与えるとは思われない。ラブドβまたはヒトβを 置換すると、発現レベルは減少する（５．４％±３．４）。

ラットβをヒトβと置換する効果を分析した。ラットα、β、γｃ　ＤＮＡの同 時トランスフェクシヨンの結果、ラットα、γとヒトγとの同時トランスフェク ション（２，５％±２．０）より発現レベルがはるかに高くなる（１８．０％± １７．８）（統計的スチューデントｔ＝２．７５；ｐ≦０．０１４）。同様にマ ウスα、β、γｃＤＮＡの同時トランスフェクション（８，２％±５．６）は、 マウスα、γとヒトβとの同時トランスフェクション（１，６％±１．２）より も効果的である（統計的スチューデントｔ＝２．９１；ｐ≦０．０１９）。ラッ トγまたはマウスγをヒトγで置換しても発現が回復されないために（２，４％ と１．８％との比較及び１．６％と１．５％の比較）、ヒトβ−ラットα相互作 用またはヒトβ−マウスａ相互作用に発現のｒｊｉ題が存在するように思われる 。

ラットγの細胞質尾部の先端を切除すると、トランスフェクシントにおけるヒト αの表面発現が妨げられることが知られている（Ｖｓ＋ｎ１−Ｂｌｓ＋に、１９ ９Ｇ　）。これらの条件下ヒトβがヒトαの表面発現を完全に補うかどうかとい う疑問があった。ヒトαと切頭型ラットγとの同時トランスフェクションは、は んのわずかしかαγ複合体の表面発現を可能にしないことが確認された（１．４ ％±１．０）。ヒトβが後者の組み合わせで同時トランスフェクションされた時 、発現の増加がある（７．４％土？、３．ｎ＝７）。しかしながら、７回の実験 中異常な一点を除くと、この増加が重要であるとはいえない（ｐ≦０．０３５） 。同様な増加は、ヒトβをラットβで置換しても見られない（３，２％±２．８ ）が、これは、ヒトαとβとの間の相互作用に特別の点があり得ることを示唆し ている。切頭型ラットγを用いた他の実験において、ヒトβはラットαとの相互 作用においてラットβと置換されることはできないことが見いだされた（９．３ ％±０．６と０．４％±０．４を比較、ｔ＝Ｌ３．０；ｐ≦０．００６）。全て をまとめると、これらのデータは、ヒトβがラットβとよりもヒトαとより効果 的に相互作用する傾向にあることを示している。対照的に、ラットβとラットα 間またはマウスβとマウスα間の相互作用において強い種特異性がある。

ヒトαγ複合体はトランスフェクトされた細胞表面上で発現され得る。更に、ヒ トα、γとラットβとの同時トランスフェクションでは、レセプタの２０％だけ がαβγ複合体となり、残りの８０％はαγ複合体となる。それゆえ、αγ複合 体が自然に生じることは理論上可能である。しかしながら、ヒトβとαとの間の 相互作用の種特異性（上記参照）の点で、ヒトα及びγとラットβとの同時トラ ンスフェクシヨンから得られた先述の結果は、ｉｎ　ｖｉマＯ状態が異なってい る可能性のあることを示唆している。

勿論、これらの遺伝学的結果は分析以上に後者が同様に重要であることを提供し ている。加えて、特異的変異を通して、重要な結合領域に関して更なる情報が得 られるであろう。この情報を使うことにより、合理的なドラッグデザインが可能 になっていくものと期待される。更に、レセプタ自身の機能を遮断することが可 能になることも期待され、このことは即ち、レセプタの活性化を引き起こす初期 の生化学的シグナルを妨げることができるようになるだろう。

更なる実施態様において、本発明は“候補物質”と呼ばれる新規Ｆｃ、Ｒｒ阻害 性化合物を同定する方法に関するものである。このスクリーニング技術は種々の 細胞活性化アッセイによって測定されたＦｃ、ＲＩの形成を阻害することを目的 とするいくつかの化合物を同定するのに一般的に有用であると考えられている（ Ｍｏｗｓｃ　Ｉｎ１ｔ＋１ｅｎｋｉｎ−２εＬＩＳＡ　ｋｉｔ、＾ｌｂ！Ｎｓら 、ｐｐ＋７９−１８０．　＾ｄ＋ｍｔ＋ｅｖ＋ｋｉら（印刷中）　、Ｂｓｒｏｎ ｅｓ　ら、１９９１）。

したがって、これらの実施態様において、本発明はヒトＦｃ、Ｒｒ複合体の形成 を阻害する候補物質の能力を測定する方法に関するものであり、この方法は一般 的に次の段階を含んでいる： （畠）機能的及び／または発現されるレセプタを形成するように複合体形成可能 であるＦｃ、ＲＴのヒトα、β及びγサブユニットを含む組成物を得、 （ｂｌ　候補阻害物質と該結成物を混合し、（ｃｌ　混合物の機能的または発現 する能力を測定する。

ここにおける候補物質のスクリーニングアッセイの重要な特徴は、例えばここで 示した方法において、比較的精製された形でα、β及びγサブユニットの組成物 を調製する能力があることである。候補物質スクリーニングアッセイの特徴は、 少なくとも比較的精製された調製物なしには、Ｆｃ、ＲＩ阻害について特異的に アッセイすることはできないということであり、これは対立的に、レセプタに影 響を及ぼす抽出物中の他の物質に対しこの阻害が影響を及ぼすためである。とに かく、ベータサブユニットのクローニングと単離が成功したことにより、特異な 方法でＦｃ、ＲＩを阻害し、それによってＴｇＥと結合した時ＦｃＲＩの影響を 阻害するのに用いることができる新規の化合物を同定することをはじめて可能に した。

候補物質のスクリーニングアッセイは極めて簡単であり、また多くの点てＦｃ、 ＲＩ活性を測定するために上記で議論したアッセイと関連している。α、β及び γサブユニットの比較的精製した調製物を得た後は、好ましくはレセプターが阻 害物質を含むように形成する条件下で、候補物質と該調製物とを単純に混合する ことが望まれるであろう。それゆえ、例えば、機能的レセプタの存在を間接的に 測定するような細胞活性化アッセイ、またはレセプタ発現、またはその両者を用 いることが一般的に望まれるであろう。

従って、候補物質の相対的な阻害能力を評価するため、分析された候補物質の非 存在下、比較的精製されたレセプタの活性を測定又は決定することが望まれる。

更なる実施態様において、本発明は、候補物質スクリーニングアッセイ態様によ って同定された有効濃度の候補物質にサブユニットを付与することを含むレセプ タの形成及び／または機能を阻害する方法に関する。勿論、この方法は、レセプ タを阻害することによって種々の特性のアレルギー反応を治療又は予防すること を可能にすると思われる点で、本発明の重要な態様の１つである。ＩｇＥのＦｃ 、ＲＩへの結合によるヒスタミンの放出をブロックするような阻害剤を使用し、 アレルギー反応の症状を処置または柔らげることができると思われる。阻害剤は それ自身だけで有効であるが、他の療法と併用してもよい。

もしＩｇＥのレセプタの作用が阻害されれば、アレルギー反応は進行しないであ ろう。この阻害は転写、翻訳または蛋白質作用の段階の何れかで起こるものと思 われる。転写の妨害は、必然的にＤＮＡ鋳型上でのｍＲＮＡ形成を妨害するだろ う。

好ましくは、翻訳の妨害は、必然的にｍＲＮＡ鋳型上での蛋白質合成を妨害する だろう。あるいはレセプターの作用自体は、レセプタの構造を破壊するか、その 形成を禁止するか、または阻害剤へ非可逆的にレセプタまたはその成分を結合す るかの何れかによって崩壊されると考えられる。特に、受容体の機能をブロック するデザインされたペプチドはアレルギー性疾患を予防し、治療するのに極めて 有用である。これらのブロッカ−（アンタゴニスト）の具体例は、例えば、Ｉｇ Ｅ結合部位のアミノ酸配列を含むオリゴヌクレオチドまたはそれらの誘導体など 、あらゆる基質類似体または阻害剤を含む。適当な阻害剤の候補物質を同定する 方法は実施例２３に示しである。

本発明における更なる目的は、阻害剤を見いだすのに使用するヒトβサブユニッ トを製造するための容品な方法を提供すること、サブユニットの検出のための抗 体を開発すること、またヒトβサブユニットの不活性変異体を開発することであ り、これらはＦｃ、Ｒ１の生成を阻害するのに使用することもできる。

そのような変異体は、例えばβアッセイに有用な動物を作製するために、トラン スジェニック動物中に導入され得る。

ベータサブユニット蛋白質を調製するための具体例は、望む蛋白質またはポリペ プチドをコードし得る核酸配列を含む核酸セグメントを調製することである。こ のセグメントは、サブユニット全体か又は、例えばサブユニットのαまたはγ結 合ドメインのようなサブユニットのある部分のみをコードするものであってもよ い。セグメントは、抗体により正のシグナルをトリガーし、これによりβサブユ ニットの存在を同定することの可能なものと同等に小さいものであってもよい。

第１４図に示したものと機能的に同等のセグメントもまた製造されるべき望まし いポリペプチドに依存して選別され得る。機能的同等性は、セグメントが候補物 質の中から阻害剤を検出するためここに示した技術を用いて細胞の活性化を行う かどうかを試験することにより決定される。

選択された核酸セグメントはポリペプチドとしてセグメントの発現に適する環境 中に移される。この環境は発現を生じさせることが可能な混合物を含む容器であ ってもよい。あるいは、セグメントは組換え発現ベクター、エレクトロポレーシ 傍ンまたは“遺伝子銃０によるトランスホーメーシッン、トランスフェクシヨン によって宿主細胞に移入され得る。宿主細胞は、例えばＣＨＯ細胞、Ｔ細胞、Ｋ Ｕ８１２細胞、Ｐ８１５細胞または同等のものから選ばれる。

組換え発現ベクターは一般的にプロモーターを含んでいる。

プロモーターの具体例はα４プロモーターまたは、他の任意の適当な原核生物ま たは真核生物プロモーターである。

他の実施態様において、本発明はＦｃ、Ｒ１のβサブユニットに対する抗体の調 製、及び組換え体であれ鼻部換え的に調製されたものであれ、それから誘導され る種（ｓｐｅｃｉ■）の調製に関する。

本発明のモナクロール抗体を含む組成物は同一の誓歯頚種由来の骨髄腫細胞と翳 歯頚の肺臓細胞を最初に融合させる事により調製され得る。ここで肺臓細胞を提 供する■歯頚はβサブユニットペプチド、前駆体、または関連するペプチドで免 疫されている。使用される薩歯頚は一般的にはマウスである。勿論、本明細書中 に記載したものに構造的変化を組み入れたβサブユニットを調製する場合には、 問題の種に準するハイブリドーマ系を首尾よ（使用することができるものと考え られる。

さらに、本発明は、ヒトまたは１歯類サブユニツトのものと抗原的に交差反応性 であることが見いだされ得る他の種からベータサブユニットを単離するための方 法を提供する。この方法はサブユニットに対する抗体を結合した免疫結合物質の 調製を含んでいる。数多くの免疫結合物質が当業者には知られており、その中に は、例えば、ＡＩ＋１−Ｇｅｌ、Ｃｎ−５ｔｐｈｓ＋ｏｓｅ　、Ｐｒｏｔ＠１ｎ Ａ−９すｈｓ＋ｏｓｅ及び数多くの他のよく知られた免疫吸着剤技術が含まれる 。免疫交差反応性種のこのような全ての技術（より詳しいリストについては、１ １ｏｎｏｃｌ＋＋Ｌｌｓｌ　１１７ｂｒｉｄｏｓ＊　Ａ＋１ｉｂｏｄｉｅｓＴｃ ｅｂｎｉｑａｅｓ　ｓａｄ　Ａｐｐｌｉｃｌｉｏａｓ、Ｊｏｈｎ　Ｇ、ｌ１ｉｒ ｔｅｌｌ、ｔｄ、ＣＲＣＰｔｅ■、１９Ｂ、参照；参考としてこの文献を本明細 書に取り入れｃ　ＤＮＡおよびゲノムライブラリーのスクリーニングヒト好塩基 球ｃＤＮＡライブラリーおよびヒト白血球ゲノムライブラリーについては以前に 発表されており入手可能である（Ｋｗｓｌｓ＋、１９９Ｇ）　ｏ　ヒトの肺のｃ ＤＮＡライブラリー（Ｍｉｌｌｅｒ。

１９８９）およびヒトの皮膚のｃＤＮＡライブラリーはり、Ｂ、Ｓｃ　ｈ　ｗ　 ａｒｔ　ｚ　（Ｍｃｄｉｃｔｌ　Ｃｏ１１ｅＢ　Ｏｌ　Ｖｉｒｌｉａｉｓ、Ｒｉ ｃｈｍｏＩｌｄ　）から提供された。

種々のライブラリーのスクリーニングのために、次のプローブ：ラットβのＥｃ ｏＲＩ−ＥｃｏＲＶフラグメント（Ｋｉｅｅｌ。

１９８８　）およびマウスβのＥｃｏＲＩフラグメント（Ｒｓ、１１１８９）を 調製したが、そのどちらもβの完全コード配列および３゜非翻訳領域の一部を含 む。ラットβ　ｃＤＮＡ（ｂｐｌ−３０４）およびマウスβ　ｃＤＮＡ　（ｂｐ 　４３３−７０８）のコード領域の７ラグメントはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ Ｒ）により作製された。ラット、マウスおよびヒトβの種々の領域に相当する多 数のオリゴヌクレオチドは、モデル３８０Ａ自動ＤＮＡシンセサイザー（Ａｐｐ ｌｉｅｄ　Ｂｉｏ＋７ｔｌｔ＊＠、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１１７゜Ｃ＾）により合 成した。既述されているように（Ｄ１マ目、１９８６　’）、二本１１ｍＤＮＡ プローブのすべてはランダムプライマーラベリングにより、またオリゴヌクレオ チドは末端ラベリングによりそれぞれ放射性標識された。

ハイブリッド形成および洗浄条件およびプラーク精製サブクローニング法、シー フェンシングおよびＤＮＡ分析は、既述されているように（に１ｓｌｅ【、１９ ９Ｇ）行なった。

サザーンプロット分析 五つの異なる個体からのゲノムＤＮＡのＢａｍＨ，Ｂｇｌ　ＩＩＩ、Ｅｃｏ　Ｒ １、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ、Ｍｓｐ　ｒ、およびＰｖｕ　ＩＩによる消化、およびこ れらの消化物とヒトｃＤＮＡプローブ（開始から停止コドンまで）とのハイブリ ッド形成により、ユニークな遺伝子の存在が支持される（第１８図）。さらに、 サザーンプロット上で検知される制限フラグメントの長さは、遺伝子配列から予 測される長さと完全に一致した。三つのＢａｍＴ（１部位（ヌクレオチド１５６ ．６９０８．９２５０）が遺伝子に存在した。予期されたように、唯一のフラグ メント（１５６−９２５０）がここに認められるが、これは、他のフラグメント はｃＤＮＡプローブとハイブリッド形成をしないからである。二つの予知された Ｂｇｒ　ＩＩフラグメント（＋３３４から＋１７６６および＋１７６６から＋７ ４１９）および二つの予知されたＨｉｎｄ　ＩＩＩフラグメント（−４５４から ＋２７２４および＋２７２４から＋１０００４２）が容易に検出される。Ｅｃｏ ＲＩおよびＰｖｕ　ｒ　Ｔ消化後に得られた結果は、遺伝子の配列にこれらの部 位が見出されないという事実と一致する。最後に、Ｍｓｐ■消化後に観察された パターンも、予知された２０６７ｂｐフラグメント、３８７０ｂｐフラグメント 、およびヌクレオチド３６２２から遺伝子の上流の未決定のＭｓｐ！部位まで延 びている大きな５゛フラグメントと一致している。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用によるｃ　ＤＮＡ合成２４０ｍ１の血液 からの好塩基球を、既述されているように（Ｗ＊＋ｎｓ＋、１９８７）ダブルパ ーコール（Ｐｅｒｃａｌｌ）グラジェントにより精製し、グアニジウムイソチオ シアネート法（Ｄ麿マロ、　１９８６　）により好塩基球ＲＮＡを抽出した。２ μｇの全ＲＮＡを、メーカー（Ｂｅｌｈｅ＋ｄｓ　Ｒｅ＋ｅｔ＋ｃｈ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏ「ｉｅｓ。

Ｇ１１１ｈｅ＋ｔｂ＋ｕｇ　ＭＤ　）の推奨通りランダム９−ｍａｒプライマー を用いて５ｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素により逆転写した。

反応産物の１／２０を次のプライマー：ヒトβコード配列の−２から＋２１まで のヌクレオチド配列と相補的な２３−ｍｅｒ、および停止コドンの後方の３２ヌ クレオチドのところから始まるマウスおよびラットβ配列の、逆方向プライマー としての縮重化２１−ｍｅｒ、を用いて増幅した。温度サイクルは次の通りであ った７２分間、９５°／２分間、９４’１５分間、３７°／４０分間、７２°を １サイクル、４０秒、９４゜７１分間、３７°／４分間、７２°を４サイクル、 ４０秒、９４°／１分間、５０°／４分間、７２°を３６サイクル、続いて１５ 分の延長。サイクル２乃至５を省略してこの反応の１μＩを再増幅し、増幅産物 をＴＡクローニングキット（Ｉａｗｉｌ＋ｏＨｓｍ、　５ｅｌｌ　ＤｉＢｏ、　 Ｃ＾）を用いてｐＣＲｌｏｏＯにサブクローン化した。

ＰＣＨにより得られた遺伝子フラグメントの直接的配列決定白血球ゲノムライブ ラリーからの精製された挿入物を含むファージＤＮＡはＮｏｔｌにより線状にさ れ、配列決定される領域にフランキングするプライマーにより１１００ｎ増幅さ れた。

ＤＮＡ増幅は、以下のサイクルを４０回行って官僚される７９４℃で１分間変性 させ、４５〜５０℃で２分間アニールし、７２℃で３〜６分間伸長させる。その 後、１μｌの増幅材料が３つの個別の反応（５０μｍ）で再び増幅された。同一 の条件下で２つのプライマーから１つを省き、１本鎖ＤＮＡを生成した。３つの 反応生成物をプールし、ＵｌｔｒａｆｒｅｅＭＣ３０，０００スピンカラム（１ １ｉｌｌｉｐｏ＋＊、Ｂｔｄｌｏｒｄ　ＭＡ　）にアプライし、４回洗浄してか ら真空蒸発させた。１本鎖ＤＮＡは省かれたプライマーまたは内部プライマーを 用いて配列決定された。この方法により得られた配列と、２６８Ｍベクター内に サブクローニングされている増幅されないフラグメントを配列決定して得られた 配列との比較により、何ら相違は見られなかった。

転写開始部位の配列決定 ＰＣＲを使用して、転写開始部位を規定した。公表済の手順（Ｆｒｏｌｌｓｓｓ 、１９ｇ７　）を以下の通り改良した。５ｕｇのＲＮＡを、コード領域のヌクレ オチド＋４５１〜４２９に対応するプライマーを用いて上述の通り逆転写した。

これによる生成物をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ　１００カラム（八ｓ＋ｃｏｍ、　Ｂｓ ｖｓｒｌｙ　ＭＡ）上で洗浄し、ターミナルトランスフェラーゼを用いてメーカ ー（Ｂｓｌｈｅｔｄｓ　Ｒｅ５ｓｓｒｃｈ　Ｌｓｂｏ＋＊ｊｏ＋ｉｅ３　０ｇ１ Ｈｅｒｚｌ＋ｗｒｌ　ＭＤ　）　の推奨通り、ポリＡテールを両末端に付加した 。この反応生成物の６分の１を以下の２つのプライマーによって増幅した。すな わち、プライマーは、１７個のＴが後方に続くＭ１３プライマー配列から成る３ ３−ｍｅｒ、および３“末端用の、ヒトβコード領域配列のヌクレオチド３３１ 〜３０８から誘導されたプライマーである。その後、内部増幅を実施し、３′プ ライマーを、ヌクレオチド＋１８９〜１６９の等漬物と交換した。最後に、唯一 のプライマーとしてヌクレオチド５４〜３３に対応するオリゴヌクレオチドを用 いて、配列決定のために１本鎖ＤＮＡを生成した。全てのＰＣＲで、アニーリン グ温度は４５℃、伸長時間は３分であった。

５°伸長による転写開始部位の分析 開始コドンの後方のヌクレオチド５４〜３３のところの（−）鎖に対応する、末 端を標識化したオリゴヌクレオチドを、好塩基球（このものに富む）由来の全Ｒ ＮＡ　１０μｇ又はｔＲＮＡ１０μｇのいずれかに、４２℃で一晩ハイブリッド 形成し、その後Ｓｍｐ！＋ｓｃ＋ｉｐｌ逆転写酵素（Ｂｓｌｈｅｔｄｓ　Ｒｅ５ ｓｓｒｃｈＬｇｂｏｒｓ＋ｏｒｉｅ＋、　Ｇｓ自ｂｅ＋ｔｂ＋＋ｒｌ　ＭＤ　） によって、４５℃で９０分間伸長した。プライマー伸長した生成物は、５％のポ リアクリルアミド尿素ゲルにより分離し、これと並行してゲノムＤＮＡの配列決 定反応を行った。

縮約系　ＫＵ８１２ 新規の骨髄細胞系（ＫＵ８１２）が、慢性骨髄性白血病の急性転化患者から樹立 された。この男性患者の芽細胞は、未成熟の好塩基球の形態学的特性を持ち、好 塩基球のコロニーを血液単核球の寒天培地で成長させた。この患者の血液細胞の 懸濁培養は２年半以上継続された。このＫＵ８１２細胞は形態学的に、核小体を 持つ微細な網状核を示しており、これらの細胞のいくつかはトルイジンブルー（ ＴＢ）染色による異染性の顆粒を含んでいた。これらの顆粒は、アストラブルー （Ａ　Ｂ）染色に対して陽性であった。免疫学的マーカー調査により、Ｆｃレセ プタを除きリンパ球特性はないことが明らかになった。

ＫＵ８１２細鉋は、１Ｉｌｉ目Ｎｌでの寒天培養でコロニーが成長した。つまり 、ＴＢ染色およびＡＢ染色により、この細胞な好塩基球によって構成されること が証明された。細胞遺伝学的分析により、著しい異数性が見られ、Ｐｈ１ｌａｄ ｅｌｐｈｉａ染色体（Ｐｈ’）に対して陽性であった。細胞溶解物はヒスタミン を含むことが証明された。これらのデータは、ＫＵ８１２が、白血病性の好塩基 球先駆物質に由来する縮約系であることを示唆している。これはヒト好塩基球細 胞系の最初ものもである。

ＫＵ８１２は幹細胞の好塩基球への分化の機構を明らかにするうえで有用である 。（ＫｉＩｂｉ、■■１社ｓ、１９１１５．　息：　３８１−３９０　）。

その他の方法 既に発表された方法に従って、ノザーンおよびゲノムサザーンプロットを行なっ た（Ｄｓマ目、１９１１６　）。さまざまなｃ　ＤＮＡが真核生物発現ベクター ｐＣＤＬ−８Ｒ（α）にサブクロー二１９８８）　、　ＣＯ３−７細胞は、標準 ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ法によりトランスフェクシタンが行われた（ｌｉｓａ ｉ＊Ｉｉｓ、１９８２）。

ただし、トランスフェクトされた細胞を、クロロキン処理後に添加し、培地中の １０％ＤＭＳＯ内で、３分間インキニーページタンした。

本発明をある特定の具体例に関して記述したが、本発明の思想から外れることな く、当業者は多くの修正及び変更を行ない得ることが理解されよう。従って、そ のような修正及び変更は添付の請求の範囲によりカバーされるものであり、かつ 本発明の真の思想および範囲内である。

足、説明、背景提供又は教示する意図で下ｌ己文献を参考資料として本明細書の 一部ｌこ加える。

８、　Ｈｕｐｐｉ、　Ｊ、、　Ｍｏｃｋ、　Ｂ、Ａ、、　Ｈｉｌｇｅｒｓ、　Ｊ 、　Ｋｏｃｈａｎ、　Ｊ、、　ａｎｄＫ工ｎｅｔ、　Ｊ、Ｐ、　（１９８８１Ｊ 、工ｍｍｕｎｏ１．１４１．２８０７−２８１０゜配列表 配列番号＝１ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー；直鎖状 配列 へ人ＧＴＡＣＴ（４Ｃ？ＡＴＧＡ丁丁ｆｆ丁子　Ｔｋ丁ＣＣＣ入τＴＧ　”配列 番号：２ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー、直鎖状 配列 ＧｕＴＴ品ＴＡ？　ＧＧτＣＣＣＴＣＡＧ黒Ｃ−晶ＱτローＴＯ３Ｂ配列番号： ３ 配列の長さ＝３０ 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー：直鎖状 配列 入＾ＧＴＡＣＴＧＯＣＴｋＴＧｋｍＴＴ　ＴｋＴＣＣＣｋＴＴＧ　３０配列番号 ＝４ 配列の長さ：１７ 配列の型二アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列 Ｔｙｒ　ＧＬｕ　（ＬＬＩＬ＠ｕ　ｌｕｓ　Ｖａｌ〒ｙｒ　Ｓ＠ｒ　Ｐｒｏ工Ｌ ｍ　Ｔｙｒ　Ｓａｔ　Ａｌａ　Ｌ＊ｕ　Ｇｌｕ＾−ｐｌ　Ｓ　１０　ｉｓ 配列番号：５ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍ１ｓｃ　ｆｅａｔｕｒｅ存在位置＝３ 他の情報：注＝「この配列中のＮはイノシンを表す」特徴を表す記号：ｍ１ｓｃ 　ｆｅａｔｕｒｅ存在位置：１５ 他の情報：注＝「この配列中のＮはイノシンを表す」配列 ＧＣ，ＮＧｈＸＴｈｍｋ　（ＪＴＧＮ＾ＲＹＴＣＹＴＩＪＴ入　ス６配列番号二 ６ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎮 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍ１ｓｃ　ｆｅａｔｕｒｅ存在位置：３ 他の情報：注＝「この配列中のＮはイノシンを表す」特徴を表す記号：ｍ１ｓｃ 　ｆｅａｔｕｒｅ存在位置：１５ 他の情報：注＝［この配列中のＮはイノシンを表す」配列 ＧＣＮｃ丁Ｒτ入Ｓ入　ＣＡＴＣＨ入ＲτテＣＹＴＣ＾τ＾　２６配列番号ニア 配列の長さ＝２３ 配列の型：核酸 鏑の数ニー重鎖 トポロジー二直鎮状 配列 λ＾τ入Ａ＾＾Ｃλ＾　Ａ＾＾λＦＩＡλＡ＾Ａ　ＡＴＧ　２コ配列番号＝８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎮 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍ１ＳＣｆｅａｔｕｒｅ存在位置：９ 他の情報：注＝「この配列中のＮはイノシンを表す」配列 ＧＡ夙Ａ＾ＲＴＣＮＯＡ！ＧＣ↑ＣＩＣテＡ配列番号＝９ 配列の長さ＝２６ 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍ１ＳＣｆｅａｔｕｒｅ存在位置＝１２ 他の情報：注＝「この配列中のＮはイノシンを表す」特徴を表す記号＋ｍ１ｓｃ 　ｆｅａｔｕｒｅ存在位置＝２１ 他の情報：注＝「この配列中のＮはイノシンを表す」特徴を表す記号：ｍ１ｓｃ 　ｆｅａｔｕｒｅ存在位置：２４ 他の情報、注＝「この配列中のＮはイノシンを表す」配列 配列番号：１０ 配列の長さ：１１７４ 配列の型：核酸 鏑の数、二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置＋１０７．．８８０ 配列 ＣＪＡＴＡＡＡＡＴｋ　ＡＡＴＡＴＡＡＡＡＣＣＡＴ（ｉτυ人ｌ−ｋ　υλ１ ＭＮ惺ＡＡＡＡＡＡＡ　１１７４配列番号：１１ 配列の長さ：２５７ 配列の型・アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Ｍｅｔ　入Ｌａ　Ｐｒｏ　＾ｌａ　Ｍａｔ　Ｇｌｕ　５ｅｒ　Ｐｒｏ　τｈｒ　 Ｌ＠ｕ　Ｌａｕ　Ｃｙｓ　Ｖａｎ　＾ｌａ　Ｌａｕ　Ｌａｕ１５　１０　ｉｓ ＾虐ｎ 配列番号：１２ 配列の長さ；２２２ 配列の型二アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンノくり質 起源 生物名：ラット 株名：ＦｃＲ１ａサブユニット 配列 Ａｉｍ　ｔｈｅ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　５＠ｒ　Ｖａｔ　ＶａＬ　Ｓｏｒ　Ｌｓｕ　 Ａｓｐ　ｉ’ｒｏ　Ｐｒｏ　丁ｒｐ　ｎｏ　入ｒｇ　工１＊Ｉ　Ｓ　１０　１５ Ｌｙｓ　５ｓｉｒ　Ｓａｆ　１４Ｌｓ　Ｔｒｐ　ＶａＬ　ＸＬｘｈ　ＶａＬ　Ｓ ｅｒ　Ａｈａ　ｔｈｅ　Ｇｌａ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｓａｔ　fｌｙ ｓｏ　ｓｓ　ｓ。

Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌａ　ＣＹ＠　Ｃ１ｎ、Ｌｙｓ　ＣＬｎ　ＧＬｙ　ｔｈｅ　 Ｔｙｒ　Ｌｙ＠　Ｓｏｒ　Ｌｙｅ　Ｐｔｏ　ＶａＬ　テＹ【配列番号＝１３ 配列の長さ：２３２ 配列の型二アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ヒト 株名：ＦｃＲＩαサブユニット 配列 Ｖａｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌａ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｙｅ　Ｖａｌ　ｊａｒ　Ｌａｕ　 Ａｍｎ　ｐｒｏ　ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ａｍｎ　Ａｒｇ　ｚｘ＝ｌ　Ｓ　１０　１ｓ ９ｈ＠　Ｌｙｅ　ＧＬｙ　（Ｌｕ＾ａｎ　Ｖａ１丁−Ｌ＊ｕ　Ｔｈｒ　ＣＹｓ　 Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｊｋｎａ　Ａｊｎ　ｔｈｅ　Ｐｈａ２０　！５　３Ｇ Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｓｉｒ　Ｓｓｒ　Ｔｈｒ　Ｌｙ−Ｔｒｐ　ｔｈｅ　ＨＬ−Ａｍ ｎ　ＧＬｙ　ｊａｒ　Ｌａｕ　５＊ｒ　（ｉｌｕ　０１ｕτｈｔ　Ａｓｎ　Ｓａ ｔ　Ｓａｔ　Ｌａｕ　Ａｍｎ　Ｉｌｍ　ＶａＬ　Ａｓｎ　ＡＬａ　ＬＹ＠　ｆｌ ｈ＊　ＧＬｕ　Ａｓｐ　Ｓａｔ　ＧＬ■ ｓｏ　ｓｓ　ａ。

ＣＬｕ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　ＨＬ・ａｌｎ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ａ ｍｎ　ＧＬｕ　５ｅｒ　Ｇｌｖ　Ｐｒｏ　Ｖａｔ　Ｔｙｔ６％　７０　７５　ａ 。

Ｌａｕ　ＧＬ＋ａ　Ｖａｌ　ｔｈｅ　５ｅｒ　Ａｓｐ　丁ｒｐ　Ｌ＠ＩＪ　Ｌｅ ｕ　Ｌｅｕ　ＧＬｎ　ＡＬａ　！ｉｓｒ　ＡＬＪＩ　Ｇｌａ@Ｖａｌ Ｂ５　９０　９％ Ｖａｔ　ＨｏＦ、（ＬＩＪ　ＧＬｙ　ＧＬｎ　Ｐｒｏ　Ｌ、１１１３　ｔｈｅ　 Ｌ自Ｕ　入ｒｑ　ＣＹ＠　ＨＬＩＩ　Ｇｌｙ　丁ｔｐ　入ｒX　Ａｓｎ １００　ｌｏｇ　１１０ Ｔｒｐ　Ａｓｐ　ＶａＩ　Ｔｙｒ　ＬＹ＃　Ｖａｌ　Ｚｌ＠　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　 Ｌｙ−人−ｐ　ＧＬｙ　ＧＬｕ　ＡＬａ　Ｌａｕ　Ｉ、ｙｓ１’３１’ｒ　Ｔｒ ｐ　Ｔｙｔ　Ｇｌｕ　Ａｍｎ　Ｈｌｓ　＾−ｎｉｌ・　Ｓ・ｒ　Ｘｌ・　ｔｈｅ 　Ａｍｎ　ＡＬａ　丁ｈｒ　Ｖａｌ　Ｇ撃■ ＡＩＩＰ　ｓｅｘ　Ｏｌｙ　’ｒｈｒ　テｙｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙ−ｔｈｅ　Ｏｌｙ 　Ｌｙｅ　ＶａＬ　Ｔｒｐ　Ｇｉｎ　ＴＡｕ　Ａｓｐ　丁ｙ■ １４５　１５０　Ａｓｓ　１６０ ＧＬ＊　Ｓａｒ　ＧＬｕ　Ｐｔｏ　Ｌａｕ　Ａｍｎ　Ｘｉｓ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　 ＨＬｓ　Ｌｙ−人１ａ　Ｐｔｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｌｙ春１６５　１７０　Ｌ” ｌＳ τｙｔ　Ｔｒｐ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ｐｈ・ｔｈｅＩＬ＊　Ｐｆ（１Ｔａｕ　Ｌａ ｕ　ＶａＬ　ｖａｌＨｅ　Ｌ・ｕ　Ｐｈ＊＾１ａ１８０　１ｌｌｓ　工９Ｇ Ｖａｌ＾−ｐ　Ｔｈｒ　Ｇｉｙ　Ｌｓｕ　Ｐｈ＠ＩＩ＠　Ｓ＠ｔτｈｒ　ＧＬｎ 　ＧＬｎ　Ｇｌｎ　ＶａＬでｈｒ　ｔｈｅ　でｕ１９％　２００　２０５ Ｌ＠ＩＪ　Ｌｙ＠　工Ｌｍ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　入ｒｇ　Ｌｙｅ　Ｇｌｙ 　ｔｈｅ　入ｘｑ　Ｌａｕ　Ｌｓｕ　Ａｍｎ　Ｐｒｏ　ＩＬ■ 配列番号：１４ 配列の長さ：２２７ 配列の型二アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンノくり質 起源 生物色：マウス 株名：ＦｃＲ１αサブユニ・ノド 配列 Ｇｉｎ　Ｍ＠ｔ　ｊｌｓｎ　ｋｒ　Ｔａｕ−丁ｂｒ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　ｎｏ　Ｈ Ａｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　ｔｈｅ　ＶａＬ　Ｓｉｒ　Ｇｌｕ１５　４０　４！！ Ｖａｌ　Ｍｎ　Ｓａｒ　５ｅａｔ　ｆｌｉｓ　Ｌｓｕ　’Ｖａｌ　ＨＬ参　Ｖａ ｎ　Ｓｅｒ　ＡＬａ　ｔｈｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　入ｍｐ　５翌i” Ｓｏ　５％　６０ Ｇｌｙ　ＬＹ口　丁ｙｒ　ＨＬｓ　Ｃｙｗ　Ｇｉｎ　Ｌｙｅ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　 Ｌａｕ　ＰＭ　ＬＹ＠　Ｓａｔ　Ｌｙｍ　Ｐｒｏ　Ｖａ１６５Ｔ０　７５　ＥＩ Ｏ τｙｒ　Ｌｇｕ　Ａｓｎ　ＶａＬ　丁ｈｔ　ＧＬｎ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｌａｕ　 Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　ｊａｒ　Ａｌａ　＾５ｐＭ＠ｔ　Ｇｌａ　ｌ ＋＠ｕ　ＶａＬ　Ｈｉｓ　ＧＬｙ　Ｓａｔ　Ｐｈ會　Ａｓｐ　Ｘｉｓ　入ｔｑ　 Ｃｙｓ　ＨＬｓ　ＧＬｙ　テｒｐ　Ｌｙ■ ｌｏｏ　１０５　１１０ ＾＠ｎ　Ｔｒｐ　Ａｍｎ　ｖａｌ　ｘｒｇ　Ｌｙｓ　ＶａＩ　Ｘｌ命　Ｔ”ｆｔ 　Ｔｙｒ　入ｒ９　Ａｍｎ　入ｓｐ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｉ’■■ Ｊｖｎ　Ｔｙｒ　Ｓｏｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｓｉｒ　 ＨＬｓ　Ａｒｇ　ＧＬｕ　ＡＬａ　ｔｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ１３０　、　１３５ 　１４０ 八ｓｐ　５ｅｒ　ＧＬｙ　Ｔ？、ｒ　丁ｙｒ　Ｈｉｓ　（：ｙｓ　ＬＹ＠　Ｇｌ ｙ　Ｔｙｒ　Ｌａ＋ａ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　■凾■ １４５　１５０　Ａｓｓ　１６０ 配列番号；１５ 配列の長さ：３２ 配列の型二核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー二直輪状 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：９１．１１ 特徴を表す記号：　ＣＤＳ 存在位置：２１．．３２ 配列 配列番号：１６ 配列の長さ：１ 配列の型二アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンノくり質 配列 配列番号＝１７ 配列の長さ＝４ 配列の型二アミノ酸 トポロジー、直鎖状 配列の種類・タンパク質 配列 ＬＹ＠　ＶａＬ　Ｓｅｒ　Ｌａｕ 配列番号・１８ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 鎖の数・二本鎖 トポロジー　直鎮状 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：９．．３８ 配列 配列番号：１９ 配列め長さ　１０ 配列の型二アミノ酸 トポロンー：直鎖状 配列の種類　タンパク質 配列 配列番号、２０ 配列の長さ・３０ 配列の型・核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 丁ＴＴＣＣｋＣＣＣＴ　Ｃ）ＡＴｋｋＴｈｋ丁　ＧＱＯＴＴＴＴＴＣｋ　ＧＡＧ ＡＣＡＴＡＡＡ　ＧＣ？ＴＴＡＴＧＡＡ　ｋＡＧｋｃＩｋｃ泣■O　ｌコ０３ 丁ＴｋＴＣＴｋｈＴ？　ＣＪτＧＧＧＴ＾丁Ａ　ＴＴＣＡＣτλ＾τ入　ＣｋＧ ＴＴＧｍＣ丁（ＪＯτＧＧτＧτ　丁子ＡＣτλＣ’ｒ丁０@１３６３ 配列番号：２３ 配列の長さ二２４６ 配列の型二アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 １４＠ｔ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ　Ａａｐ　Ｔｈｔ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　ＬＹ８ 　Ｍａｒ　＾ｘｑ　＾１ｍ　Ａ−ｐＬ・Ｕ　Ａｌａ　Ｌ・Ｕ−３１Ｓ　工０ Ｐｒｏ　Ａ＠ｎ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　ＧＬｕ　Ｓ＠ｒ　Ｐｒｏ　Ｓａｔ　λＬｍ　 Ｐｒｏ　＾−ｐ　Ｘｉｓ　Ｇｌｎ　Ｘａ＊ｕ　Ｌ・ｕ　Ｇｌ■ ｉｓ　２０　２５ 人１ａ　Ｓ＠ｔ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　ＬＹ＠　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　 Ｇｌｕ　ＬＹ＠　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｓａｔ　Ｐｒｏ　Ｐｒ。

３０３％４０４５ Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　τｒｐ　Ｇｉｎ　ｍ＠ｒ　Ｐｈａ　ｔａｕ　 Ｌｙｅ　Ｌｙｅ　ＧＬｕ　Ｌａｕ　ＯＬｕ　Ｐｈ・　１＜ａｓｏ　ｓｓ　ｓ。

ＧＬｙ　Ｖａｌ　Ｔｈｔ　Ｇｉｎ　ｖａＬ　Ｌ＠＋ａ　ＶａＬ　Ｏｌｙ　Ｌａｕ 　Ｘｉｓ　Ｃｙｓ　！ＪＩＪ　ＣＹ＠　Ｐｈａ　ＧＬｙ　７l ６Ｓ）６７％ ＶａＬ　ＶａＬ　Ｃｙｍ　ｍａｒ　Ｔｈｒ　Ｌｓｕ　ＯＬｎ　Ｔｈｒ　Ｓａｔ　 ＡＳＰ　ｔｈｅ　＾−ｐ　八−ｐ　ＧＬｕ　ＶａＬ　ＴＪａ■ Ｌ＊ＩＪ　Ｌｓｕ　Ｔｙｒ　入ｔ９　人１ａ　ＧＬｙ　Ｔｙｒ　ｔｗｏ　Ｐｈ− τｒｐ　ｄｌｙ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｐｈａ　ＶａＬ９５　１００　１０ ％ ＬＩＩＳＩ　Ｓｅｒ　ＧＬｙ　ｉ’ｈ＊　Ｌａｕ　Ｓｅｒ　ＸＬ−にａｔ　ｍａ ｒ　ＧＬｕ　Ａｒｇ　ＬＹ−＾ｇｎ　テｈｒ　ＬＪｕ　丁ｙ■ Ｔｙｒ　Ｍｇ　＾−ｎ　Ｔｙｒ　ａｙ＠　Ｌｙ−ＡＳＰ　Ｘｉ・　丁ｈｒ　Ｇｌ ｕ　＾−ｐ　＾−ｐ　ａｎｙ　ｃｙ・　Ｉｌｈ＠　ＶａＬｌＧｏ　１６％ Ｌｅｕ　入Ｌａ　ｔｈｅ　Ｃｙｓ　Ｓａｔ　Ａｌａ　ｖａＩ　Ｌ＠ｕ　Ｌａｕ　 工Ｌｍ　Ｘｉｓ　Ｔｙｒ　＾ｘｑ　Ｉｌｓ　Ｇｌｙ　ＧｉｎＬ９Ｑ　１９５　Ｚ ｏｏ　１０％ 配列番号：２４ 配列の長さ：２８６ 配列の型：核酸 鎖の数二二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号　ＣＤＳ 存在位置：１．．１８ 配列 入Ｃ丁Ａτへｅｒｒ丁　ＴＡ丁ＴＯＡＣ丁Ｃ入　ＡＡＡＣＣＴテＣ入Ｇ　＾ｃ’ ｒｃτ為Ｃ入Ａ入　へ人Ａへ＾＾入入入入　八　２８６配列番号・２５ 配列の長さ：５ 配列の型・アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Ｖａｌ　入ｒｇ　Ｔｈｒ　フｙｒ　Ｌａｕ配列番号＝２６ 配列の長さ：５８６ 配列の型、核酸 鎖の数二二本鎖 トポロン−・直鎖状 起源 生物色：ラット 株名：ＦｃＲＩγサブユニット 配列の特徴 特徴を表す記号−５１ｇ　ｐｅｐｔｉｄｅ存在位置・２３．．７６ 特徴を表す記号：ｍａｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ存在位置・７７、　２８３ 特徴を表す記号：　ＣＤＳ 存在位置・２３．．２８３ 配列 ＣＣｋＴＣＣ７ＣＣ７ＴＴＣＣ７τＣ０ＬＴ丁　ＣＣτ０τττＣＣτ　τＣＣ ＣＴＧＡＴＣＣτＣτＣτＣＣτＣ入　ＣＴ八へＡＣＡ＾Ｔf　５３０ ＧＧ入ＡＧＧ（ｉ＾ττ　入ＣＣＣＣＣＣ入Ａτ　へ人入ＧＣＴＧＣＣＡ　にＡ ＧＡ？ＣＡＣＣＣＴＣ入へ人入入入Ａλ　入ＡＡへ人Ａ　ｓ≠U 配列番号、２７ 配列の長さ：８６ 配列の型；アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類、タンパク質 配列 ＋４ｅｔ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　八ｌｘ　Ｖａｔ　工ｌｅ　Ｌａｕ　Ｐｈｓ　Ｌｅｕ 　Ｌａｕ　Ｌｓｕ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　入１■ ＾１ａ　Ａｌａ　Ｌｓｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｌ＠ｕ　Ｃｙ−丁 ｙｒ　工ｌ＠　Ｌ＠ｕ　入ａｐ　入１ａ　Ｉｌｅ　ＬｓｕＰｍ　Ｌｓｕτｙｒ　 Ｇｌｙ　Ｉｌ＠Ｖａｌ　ｆ、ａｕ　Ｔｈｒ　Ｌ＠ｕ　Ｌ＊ｕτｙｒ　ａｙｓ　Ａ ｊｇ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｚｌｅｉｓ　２０　２５　３０ Ｇｉｎ　Ｖａｌ　八ｘｑ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｍｐ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｓ＠ｒ　入 ｒｇ　Ｃ１ｕ　ＬＹＩ　Ｓａｔ　入ｓｐ　Ａｌａ　Ｖａｌコ５　４０　４５ Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｃ１ｙ　Ｌｓｕ　入ｓｎ　Ｔｈｒ　入ｒｇ　Ａｓｎ　にｉｎ　 ＧＬｕ　Ｔｈｘ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｌｙｓｓｏ　ｓｓ　ａ。

Ｈｌｓ　Ｇｌｕ　ＬＹＩ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ配列番号＝２８ 配列の長さ：２２２ 配列の型、アミノ酸 トポロジー二直鎮状 配列の種類、タンパク質 起源 株名：αサブユニット 配列 Ａｌｌ　丁ｈｒ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　５ｅｒ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｓａｔ　Ｌａｙ　 ＭＰ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　τｒＰ　Ｘ１＊　Ａｒｇ　Ｘｉ＠工　Ｓ　１０　ｉｓ Ｔ、ａＩＩＴｋｓｒ　ＧＬｙ　ＡＬＰ　ＬＹ＠　Ｖｌｌｌ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｘ １＊　Ｃｙｍ　＾ｓｎＧ工Ｙ　ｋ＠ｎ　Ａｓｎ　ｓｅｒ　Ｓ翌■ ＬＹ・Ｔｙｒ　Ｉｌｓ　ＩＪ＠　Ｇｉｎ　ＬＹ＠　ＧＬｎ　Ｇｌｙ　ｆ’ｈ＊τ ｙｒ　ＬＹ曝釦ｒ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｖａｌテｙｒ６Ｓフ０７５ａ。

Ｌ＠ｕｌｋｌｎＶａｌＨ＠ｔＧｉｎＣＬｕＴＩ：ｐｌ−＠ｕＬｅｕＬｅｕＧｉｎ Ｓ＠ｔｓｉｒ＾１ａ＾５ｐＶａ１８５　９０　４Ｓ Ｖａｌ　Ｌａｕ　＾−ｐ　ｊｖｓｎ　Ｇｌｙ　Ｓａｔ　Ｐｈｓ　Ａｓｐ　！１４ 　Ａｒｇ　Ｃｙ−＾ｒ９　≦・ｒ　Ｔｒｐ　Ｌｙｉ　Ｌｙｓｌｏｏ　１０５　１ １０ 丁ｒｐ　Ｌｙｉ　Ｖｉｌ　Ｈｉｓ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｉｌｓ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　 Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｐｈ壷　Ｌｙｓ丁ｙｒ　Ｓａｔ　Ｔ ｙｒ　＾−ｐ　Ｓａｔ　Ａ＠ｎ　ｋｓｎ　！Ｌ＠　Ｓａｔ　Ｉｌｓ　Ａｒｇ　Ｌ ｙｓ　入Ｌａ　Ｔｈｒ　Ｐｈ−＾ｓｎ１コ０　１コＳ　１４０ ＾１ｐ　ｓｉｒ　Ｇｌｙ　Ｓａｔ　Ｔｙｒ　Ｘ１＊　ＣＹ−Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔ ｙｒ　Ｌａｕ　Ａｓｎ　Ｌｙｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ１４５　１５０　１ｓ ｓ　１６０ Ｌｙｓ　Ｓａｔ　Ｍｐ　Ｌｙｅ　Ｐｈｅ　Ｓａｔ　１１ｍ　入Ｌａ　ＶａＬ　Ｖ ａＬ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｉｌｓ　０Ｌｕ１６Ｓ　Ｌ７０　１７ ％ 配列番号；２９ 配列の長さ＝２４３ 配列の型二アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 株名：βサブユニット 配列 ｒａｔ　＾−ｐ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　ｋｅｎ　Ｌｙｓ　ｓｉｒ　Ａｒｇ　Ａｌａ　 ＡＬＰ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　ｋｅｎ　Ｐｒ。

Ｇｉｎ　ＧＬｕ　５＠ｒ　Ｐｒｏ　Ｂ＠ｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　 Ｏｌｕ　ｔ、ｍｕ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｓａｔ　ＰｒB ２０　２ｓ　コ０ Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｌｙ−Ａｌａ　ＬｅＩＪ、Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌｙｅ　Ｐｒｏ　 Ａｌａ　Ｓｅｔ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｅａ　Ｇｉｎ　ＧｉｎコＳ　４０　４５ 丁ｈｔ　テｒｐ　Ｇｉｎ　ｊａｒ　ｔｈ＠　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　 Ｉｚｕ　Ｏｌｕ　Ｐｈａ　ＬｅＩＪ　ＧＡＹ　ＶＪＬＩ　Ｔ■■ ｓｏ　ｓｓ　ｓ。

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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Ｆｃ．ＲＩのヒトβサブユニットに対応するアミノ酸配列を有するポリペプ チドをコードすることが可能な核酸配列。 ２．更にＤＮＡ配列として定義される請求項１に記載の核酸配列。 ３．前記ＤＮＡ配列が図１４に示すＤＮＡ配列（配列番号３１）、又はその対立 遺伝子もしくは種変異体に対応する請求項２に記載のＤＮＡ配列。 ４．前記ＤＮＡセグメントが図１９に示すヒトアミノ酸配列（配列番号３２）、 又はその対立遺伝子もしくは種変異体をコードする請求項２に記載のＤＮＡ配列 。 ５．自然界から単離したＦｃ．ＲＩのヒトβサブユニットに対応するアミノ酸配 列を有するポリペプチド。 ６．前記ポリペプチドが図１９に示すヒトアミノ酸配列（配列番号３２）、又は その対立遺伝子もしくは種変異体を有する請求項５に記載のポリペプチド。 ７．ベクターと請求項２又は３に記載のＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子。 ８．請求項７に記載の組換えＤＮＡ分子を含む細胞。 ９．Ｆｃ．ＲＩのヒトβサブユニットに対応するアミノ酸配列を有するポリペプ チドの製造方法であって、前記ＤＮＡ分子が発現されるような条件下で請求項８ に記載の細胞を培養し、前記ポリペプチドを産生させることからなる方法。 １０．更に前記ポリペプチドを細胞から単離する段階を含む請求項９に記載の方 法。 １１．肥満細胞中で特徴付けられる完全機能的ヒトＦｃ．ＲＩレセプターの発現 方法であって、Ｆｃ．ＲＩのヒトα、β及びγサブユニットをコードすることが 可能な核酸セグメントを宿主細胞に導入し、前記レセプターが形成されるような 条件下で前記セグメントを発現させることからなる方法。 １２．核酸セグメントがＤＮＡセグメントである請求項１１に記載の方法。 １３．ヒトβサブユニットが翻訳されるｍＲＮＡのセグメントとハイブリダイズ することが可能であり、こうしてハイブリダイズすると、前記翻訳を阻害するこ とが可能な核酸セグメント。 １４．請求項５に記載のβサブユニットポリペプチド又は請求項４に記載のアミ ノ酸配列と結合し、サブユニットのＦｃ．ＲＩ関連機能を中和することが可能な 抗体。 １５．モノクローナル抗体である請求項１４に記載の抗体。 １６．ストリンジェント条件下でヒトβサブユニットの集合機能を含む少なくと も１個のアミノ酸配列をコードすることが可能な核酸セグメントにハイブリダイ ズすることが可能な少なくとも約１４個のヌクレオチドのハイブリダイジングセ グメントからなる核酸セグメント。 １７．ヒトβサブユニットのアミノ酸配列に結合し、サブユニットの集合機能を 阻害することが可能なアミノ酸配列。 １８．βサブユニットの少なくとも１個のフラグメントを転写することが可能な ｍＲＮＡにハイブリダイズすることが可能であるとして更に定義される請求項１ ６に記載の核酸セグメント。 １９．ヒトβサブユニットをコードし、ベクターが宿主細胞中にあるときに前記 サブユニットがこの配列から発現されることが可能な核酸配列を含む組換え発現 ベクター。 ２０．請求項１、１３、１６及び２９のいずれか一項に記載の核酸から選択され る核酸配列を含む組換え発現ベクタ２１．請求項１、１３、１６及び２９のいず れか一項に記載の核酸セグメントでトランスフェクトした細胞。 ２２．トランスフェクション前の細胞が、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＫＵ８１２、Ｐ８１ ５、Ｊｕｒｋｅｔｔ、２Ｍ２及び２Ｂ４細胞からなる群から選択された請求項２ １に記載のトランスフェクト細胞。 ２３．ヒトＦｃ．ＲＩの形成又は機能を阻害する候補物質の能力を決定するため の方法であって、（ａ）ヒトＦｃ．ＲＩのα、β及びγサブユニットを発現する 能力を宿主細胞に与える段階と、 （ｂ）ステップ（ａ）後の宿主細胞を候補阻害剤物質に結合する段階と、 （ｃ）前記結合体をＦｃ．ＲＩの発現に適切な条件下に置く段階と、 （ｄ）機能的ヒトＦｃ．ＲＩを必要とするタイプの細胞発現又は細胞活性化アッ セイをステップｃの宿主細胞一候補阻害剤結合体で実施する段階と、 （ｅ）候補物質が細胞活性化又はレセプタ−発現を阻害したか否かを決定する段 階とを含む方法。 ２４．宿主細胞が、ＣＨＯ細胞、Ｔ細胞、ＫＵ８１８及びＰ８１５細胞からなる 群から選択され、細胞活性化アッセイがＰ３２ラベル取り込みによるＦｃ．ＲＩ レセプター又はＰＬＣ−γ（ホスホリパーゼｃ−γ）のリン酸化を測定すること からなる請求項２３に記載の方法。 ２５．宿主細胞がＴ細胞、ＫＵ８１２細胞及びＰ８１５細胞からなる群から選択 され、細胞活性化アッセイがカルシウム取り込み応答を測定することからなる請 求項２３に記載の方法。 ２６．宿主細胞がＴ細胞、ＫＵ８１２細胞及びＰ８１５細胞からなる群から選択 され、細胞活性化アッセイがホスファチジルイノシトール代謝である請求項２３ に記載の方法。 ２７．医薬的に許容可能なキャリヤ−中にヒトβサブユニット阻害剤を含む、ア レルギ−疾患の治療用組成物。 ２８．アレルギ−疾患患者の治療方法であって、ＩｇＥとＦｃ．ＲＩの結合を間 接的に阻害し且つレセプターの集合機能又はアレルギ−応答に関連するシグナル 導入機能を阻害するために有効な量のヒトβサブユニット阻害剤を前記患者に投 与することからなる方法。 ２９．請求項１７に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列。