JPWO2004108929A1 - 高親和性ＩｇＥ受容体β鎖発現調節 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ヒト高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）β鎖遺伝子の転写を調節する、配列番号１で記載される塩基配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチド、及び配列番号１で記載される塩基配列を含むＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写調節領域と、ＭＺＦ−１との結合を促進する工程を含む、ＦｃεＲＩＩβ鎖遺伝子の転写調節方法を提供する。また、本発明は、配列番号１で記載される塩基配列を含むＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写調節領域と、ＭＺＦ−１との結合を促進する工程を含む、ＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写調節方法を利用するスクリーニング方法及びそのキットを提供され、新しいアレルギー疾患の予防・治療剤の開発が可能となる。
Description
本発明は、高親和性ＩｇＥ受容体β鎖発現調節に係り、より詳細には、高親和性ＩｇＥ受容体β鎖遺伝子転写抑制及びその利用に関する。
近年、花粉症、アトピー性皮膚炎及びアトピー性喘息等のアレルギー症状を持つ人が増加しており、社会的に問題となっている。これらのアレルギーは、ＩｇＥによって媒介されるＩ型アレルギーに分類される。
肥満細胞や好塩基球の細胞膜上に発現する高親和性ＩｇＥ受容体（以下「ＦｃεＲＩ」という。）はＩ型アレルギー反応において、鍵を握る糖蛋白質であることが知られている。ＦｃεＲＩに結合した抗原特異的ＩｇＥが、対応する多価抗原（たとえば、杉花粉症の患者では杉花粉抗原、ダニアレルギー患者ではダニ抗原）によって架橋されると、ＦｃεＲＩは凝集し、シグナル伝達機構が作動し、肥満細胞が初めて活性化される。その結果、アレルギー性炎症を惹起する種々の化学伝達物質、すなわち予め細胞内顆粒に蓄えられているヒスタミンの放出をはじめとして、細胞内代謝産物であるロイコトリエン、プロスタグランジンなどの新たな合成と放出が爆発的に誘導され、Ｉ型アレルギー反応が惹起される。
さらに、肥満細胞上のＦｃεＲＩの凝集により、肥満細胞からのサイトカインの分泌が促進され、近接する血管内皮細胞に種々の接着分子の発現を誘導する。血液中の好酸球並びにリンパ球がこれらの接着分子を介して炎症局所の血管内皮細胞に結合し、集積する。結果として、遅発性喘息反応が惹起される。さらにまた、皮膚のランゲルハンス細胞に発現するＦｃεＲＩは、抗原提示、サイトカイン産出などにより、アトピー性皮膚炎の病態形成に寄与していると推定されている。
これらのことから、Ｉ型アレルギーを特異的に支配するＦｃεＲＩを標的にして、この受容体からのシグナル伝達をその根幹で遮断することは、アレルギー予防・治療剤の開発に有望な戦略である。
一方、ヒトにおいては、ヒトＦｃεＲＩが、α鎖、β鎖、および２つのγ鎖からなる四量体、あるいはα鎖と２つのγ鎖からなる三量体として、細胞表面上に発現して機能している。α鎖は、その細胞外領域で直接ＩｇＥと結合し、一方、β鎖・γ鎖は細胞内へのシグナル伝達に関与する。これらのサブユニットのうち、β鎖はγ鎖を介したシグナルを増幅する重要な役目を果たしているのみならず（たとえば、非特許文献１及び２参照）、最近ではα鎖の成熟化を促進することにより細胞上のＦｃεＲＩの発現を促進することも報告されている（たとえば、非特許文献３参照）。これは、β鎖の発現を抑制することにより、細胞表面上の受容体の発現も減少し、さらに受容体１個あたりが伝達する細胞内シグナルの強さも低減されることを意味する。そして、このβ鎖発現抑制は、非常に効果的にアレルギー反応を抑制することができると推測される。
ＦｃεＲＩ鎖の発現を抑制するにあたって、β鎖遺伝子の転写を特異的に抑制することは有用な方法である。
ところで、ヒトＦｃεＲＩβ鎖遺伝子に関しては、すでに、そのゲノム構造及び塩基配列が明らかになっている（たとえば、非特許文献４参照）。このうち、プロモーター領域を含む、開始コドンの上流域についてのみ既に解析が行われており、Ｏｃｔ−１の結合モチーフを含む領域がプロモーター活性に必須であることが報告されている（非特許文献５参照）。
しかしながら、その他の遺伝子領域については具体的に転写調節領域を特定した例は皆無であり、イントロンや３’側の非翻訳領域に転写調節領域が存在する例も多いことから、未解析の遺伝子領域中にＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写を調節する領域が存在する可能性もある。
Ｓ．Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ８５，９８５−９９５（１９９６） Ｄ．Ｄｏｍｏｂｒｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８，５１７−５２９（１９９８） Ｅ．Ｄｏｎｎａｄｉｅｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２，５１５−５２３（２０００） Ｈ．Ｋｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１２７８２−１２７８７（１９９２） Ｙ．Ａｋｉｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５，５４９−５５６（２００３）
肥満細胞や好塩基球の細胞膜上に発現する高親和性ＩｇＥ受容体（以下「ＦｃεＲＩ」という。）はＩ型アレルギー反応において、鍵を握る糖蛋白質であることが知られている。ＦｃεＲＩに結合した抗原特異的ＩｇＥが、対応する多価抗原（たとえば、杉花粉症の患者では杉花粉抗原、ダニアレルギー患者ではダニ抗原）によって架橋されると、ＦｃεＲＩは凝集し、シグナル伝達機構が作動し、肥満細胞が初めて活性化される。その結果、アレルギー性炎症を惹起する種々の化学伝達物質、すなわち予め細胞内顆粒に蓄えられているヒスタミンの放出をはじめとして、細胞内代謝産物であるロイコトリエン、プロスタグランジンなどの新たな合成と放出が爆発的に誘導され、Ｉ型アレルギー反応が惹起される。
さらに、肥満細胞上のＦｃεＲＩの凝集により、肥満細胞からのサイトカインの分泌が促進され、近接する血管内皮細胞に種々の接着分子の発現を誘導する。血液中の好酸球並びにリンパ球がこれらの接着分子を介して炎症局所の血管内皮細胞に結合し、集積する。結果として、遅発性喘息反応が惹起される。さらにまた、皮膚のランゲルハンス細胞に発現するＦｃεＲＩは、抗原提示、サイトカイン産出などにより、アトピー性皮膚炎の病態形成に寄与していると推定されている。
これらのことから、Ｉ型アレルギーを特異的に支配するＦｃεＲＩを標的にして、この受容体からのシグナル伝達をその根幹で遮断することは、アレルギー予防・治療剤の開発に有望な戦略である。
一方、ヒトにおいては、ヒトＦｃεＲＩが、α鎖、β鎖、および２つのγ鎖からなる四量体、あるいはα鎖と２つのγ鎖からなる三量体として、細胞表面上に発現して機能している。α鎖は、その細胞外領域で直接ＩｇＥと結合し、一方、β鎖・γ鎖は細胞内へのシグナル伝達に関与する。これらのサブユニットのうち、β鎖はγ鎖を介したシグナルを増幅する重要な役目を果たしているのみならず（たとえば、非特許文献１及び２参照）、最近ではα鎖の成熟化を促進することにより細胞上のＦｃεＲＩの発現を促進することも報告されている（たとえば、非特許文献３参照）。これは、β鎖の発現を抑制することにより、細胞表面上の受容体の発現も減少し、さらに受容体１個あたりが伝達する細胞内シグナルの強さも低減されることを意味する。そして、このβ鎖発現抑制は、非常に効果的にアレルギー反応を抑制することができると推測される。
ＦｃεＲＩ鎖の発現を抑制するにあたって、β鎖遺伝子の転写を特異的に抑制することは有用な方法である。
ところで、ヒトＦｃεＲＩβ鎖遺伝子に関しては、すでに、そのゲノム構造及び塩基配列が明らかになっている（たとえば、非特許文献４参照）。このうち、プロモーター領域を含む、開始コドンの上流域についてのみ既に解析が行われており、Ｏｃｔ−１の結合モチーフを含む領域がプロモーター活性に必須であることが報告されている（非特許文献５参照）。
しかしながら、その他の遺伝子領域については具体的に転写調節領域を特定した例は皆無であり、イントロンや３’側の非翻訳領域に転写調節領域が存在する例も多いことから、未解析の遺伝子領域中にＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写を調節する領域が存在する可能性もある。
Ｓ．Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ８５，９８５−９９５（１９９６） Ｄ．Ｄｏｍｏｂｒｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８，５１７−５２９（１９９８） Ｅ．Ｄｏｎｎａｄｉｅｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２，５１５−５２３（２０００） Ｈ．Ｋｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１２７８２−１２７８７（１９９２） Ｙ．Ａｋｉｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５，５４９−５５６（２００３）
そこで、本発明は、ヒトＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写調節に関与する領域を未解析の領域中から特定し、さらにその領域に結合する転写因子を特定することを目的とする。そして、ヒトＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写調節に関与する領域と当該領域に結合する転写因子に基づく知見から本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、（１）ヒト高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）β鎖遺伝子の転写を調節する、配列番号１で記載される塩基配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチド；（２）前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである、前記（１）記載のポリヌクレオチド；（３）配列番号１で記載される塩基配列を含むＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写調節領域と、ＭＺＦ−１との結合を促進する工程を含む、ＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写調節方法；（４）配列番号１で記載される塩基配列を含むＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写調節領域と、ＭＺＦ−１を含む転写抑制複合体との結合を促進する工程を含む、ＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写調節方法；（５）配列番号１で記載される塩基配列を含むＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写調節領域と、ＭＺＦ−１との結合を促進する化合物又はその塩のスクリーニング方法；（６）配列番号１で記載される塩基配列を含むＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写調節領域と、ＭＺＦ−１を含む転写抑制複合体との結合を促進する化合物又はその塩のスクリーニング方法；（７）配列番号１で記載される塩基配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチドを用いる、ＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写を調節する化合物又はその塩のスクリーニング用キット；（８）前記（５）又は（６）記載のスクリーニング方法、又は前記（７）記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、ＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写を調節する化合物又はその塩；（９）前記（８）記載の化合物又はその塩を含有してなる医薬；（１０）前記医薬がアレルギー疾患の予防・治療剤である、前記（９）記載の医薬；（１１）哺乳動物に対して、前記（８）記載の化合物又はその塩を有効量投与する工程を含む、アレルギー疾患の予防・治療方法；（１２）アレルギー疾患の予防・治療剤を製造するための、前記（８）記載の化合物又はその塩の使用；を提供する。
すなわち、本発明は、（１）ヒト高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）β鎖遺伝子の転写を調節する、配列番号１で記載される塩基配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチド；（２）前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである、前記（１）記載のポリヌクレオチド；（３）配列番号１で記載される塩基配列を含むＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写調節領域と、ＭＺＦ−１との結合を促進する工程を含む、ＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写調節方法；（４）配列番号１で記載される塩基配列を含むＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写調節領域と、ＭＺＦ−１を含む転写抑制複合体との結合を促進する工程を含む、ＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写調節方法；（５）配列番号１で記載される塩基配列を含むＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写調節領域と、ＭＺＦ−１との結合を促進する化合物又はその塩のスクリーニング方法；（６）配列番号１で記載される塩基配列を含むＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写調節領域と、ＭＺＦ−１を含む転写抑制複合体との結合を促進する化合物又はその塩のスクリーニング方法；（７）配列番号１で記載される塩基配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチドを用いる、ＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写を調節する化合物又はその塩のスクリーニング用キット；（８）前記（５）又は（６）記載のスクリーニング方法、又は前記（７）記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、ＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写を調節する化合物又はその塩；（９）前記（８）記載の化合物又はその塩を含有してなる医薬；（１０）前記医薬がアレルギー疾患の予防・治療剤である、前記（９）記載の医薬；（１１）哺乳動物に対して、前記（８）記載の化合物又はその塩を有効量投与する工程を含む、アレルギー疾患の予防・治療方法；（１２）アレルギー疾患の予防・治療剤を製造するための、前記（８）記載の化合物又はその塩の使用；を提供する。
図１は、本発明におけるレポーターアッセイによるヒトＦｃεＲＩβ鎖遺伝子ｎｔ４１８０−ｎｔ４２６０領域の転写調節活性の測定結果を示す図である。
図２は、本発明における部位特異的変異の導入によるｎｔ４１８０−ｎｔ４２６０領域中の転写調節エレメントの詳細なマッピングを示す。
図３は、本発明におけるゲルシフトアッセイによる結合因子の同定を示す。（Ａ）非標識二本鎖オリゴＤＮＡを用いた競合試験（添加した非標識二本鎖ＤＮＡは、レーン３−５；プローブと同じ配列、レーン６−８；プローブの配列中の３塩基置換、レーン９−１１；非特異的配列）（Ｂ）組換えＭＺＦ−１を用いた試験（レーン１；無添加、レーン２；ＧＳＴ、レーン３；ＧＳＴ−ＭＺＦ−１）。
図４は、本発明におけるＭＺＦ−１アンチセンス導入による、ヒトＦｃεＲＩβ鎖遺伝子プロモーター活性の増大を示す。
図５は、本発明におけるＭＺＦ−１アンチセンス導入による、ヒトＦｃεＲＩβ鎖発現量の増加を示す。
図２は、本発明における部位特異的変異の導入によるｎｔ４１８０−ｎｔ４２６０領域中の転写調節エレメントの詳細なマッピングを示す。
図３は、本発明におけるゲルシフトアッセイによる結合因子の同定を示す。（Ａ）非標識二本鎖オリゴＤＮＡを用いた競合試験（添加した非標識二本鎖ＤＮＡは、レーン３−５；プローブと同じ配列、レーン６−８；プローブの配列中の３塩基置換、レーン９−１１；非特異的配列）（Ｂ）組換えＭＺＦ−１を用いた試験（レーン１；無添加、レーン２；ＧＳＴ、レーン３；ＧＳＴ−ＭＺＦ−１）。
図４は、本発明におけるＭＺＦ−１アンチセンス導入による、ヒトＦｃεＲＩβ鎖遺伝子プロモーター活性の増大を示す。
図５は、本発明におけるＭＺＦ−１アンチセンス導入による、ヒトＦｃεＲＩβ鎖発現量の増加を示す。
次に、本発明の実施の形態について説明する。以下の実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施することができる。
本発明に係るヒト高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）β鎖遺伝子の転写を調節する領域を含むＤＮＡは、次に示す方法で取得した。
まず、レポーター遺伝子を用いたアッセイにより、ヒトＦｃεＲＩβ鎖遺伝子のうち、第４エクソンと第５エクソンとの間に存在する第４イントロンの一部に相当する領域が、ＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写を抑制することを見出した。また、部位特異的変異法を用いて、第４イントロン中のＭＺＦ−１結合モチーフと相同性を持つ、配列番号１で記載される配列が実際に転写抑制に関与することを明らかにした。次いで、転写調節領域である配列番号１で記載される配列に結合する転写調節因子の同定を行った。ＦｃεＲＩ発現細胞より調製した核抽出物蛋白質を用いたゲルシフトアッセイにより、この配列に実際にＭＺＦ−１が結合することが判明した。さらにまた、ＭＺＦ−１のアンチセンス発現ベクターを、ＦｃεＲＩβ鎖発現細胞に導入することにより、ＦｃεＲＩβ鎖遺伝子のプロモーター活性が増大し、ＦｃεＲＩβ鎖のｍＲＮＡ量が増大したことから、転写調節因子であるＭＺＦ−１が、実際にＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写を抑制することが確認された。
このようにして、ＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写調節に関与するＤＮＡ領域並びにその領域に結合する転写調節因子が決定されたことにより、ＦｃεＲＩβ鎖発現を阻害する化合物又はその塩のスクリーニング方法及びスクリーニング用キットを構築することが可能となり、ひいてはアレルギー疾患の治療・予防剤の開発に資するものとなる。たとえば、同定した転写調節因子ＭＺＦ−１と特定した遺伝子領域の結合を促進する物質を探索するといった方策により、β鎖発現を阻害する化合物又はその塩を開発することが可能となる。
転写調節因子ＭＺＦ−１は、細胞の種類や遺伝子のプロモーター構造によって転写活性又は転写抑制にも機能することが報告されており、転写活性化及び抑制性補因子の存在が示唆されている（Ｒ．Ｈｒｏｍａｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｕｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２１１，１５９−１６４（１９９６））。したがって、ＭＺＦ−１がさらに他の補因子と結合することにより転写抑制に寄与している可能性もあり、その相互作用を促進するような物質を探索する方策により、β鎖発現を阻害する化合物又はその塩を開発することも可能となる。たとえば、後述する本発明の実施例１中のβ鎖遺伝子のｎｔ４１８０−ｎｔ４２６０領域を挿入したレポータープラスミドを適当なＦｃεＲＩβ鎖発現細胞に導入し、ルシフェラーゼ活性の低下を指標として、天然物や合成化合物から、ＦｃεＲＩβ鎖転写抑制のスクリーニング方法を提供できる。また、ＭＺＦ−１の転写活性化補因子との結合領域に相当するペプチドあるいはＭＺＦ−１の転写活性化補因子のアンチセンスＤＮＡを利用して、ＭＺＦ−１を含む転写抑制複合体と配列番号１で記載される配列を含む領域の結合を促進する化合物又はその塩を探索することも可能となる。
ここで、化合物の塩とは生理学的に許容される酸（たとえば、無機酸、有機酸など）や、生理学的に許容される塩基（たとえば、アルカリ金属など）などとの塩である。とりわけ好ましいのは、生理学的に許容される酸付加塩である。かかる塩の具体例としては、無機酸として、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸との塩が挙げられ、あるいは有機酸として、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などとの塩が挙げられる。
本発明に係るスクリーニング方法及びスクリーニング用キットを用いて得られる、ＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写を調節する化合物又はその塩は、アレルギー疾患の予防・治療剤として有用である。とりわけ、前記化合物又はその塩を含有する医薬は、その利用価値が高い。
本発明により得られる化合物又はその塩は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。たとえば、本発明により得られる化合物又はその塩を、生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これらの製剤における有効成分量は、指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、たとえば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液体担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油などのような天然産出植物油などを溶解又は懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することできる。注射用水の水性液としては、たとえば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（たとえば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが挙げられ、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール（たとえば、エタノールなど）、ポリアルコール（たとえば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（たとえば、ポリソルベート８０（登録商標）、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。溶解補助剤として、たとえば、ゴマ油、大豆油などが挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（たとえば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（たとえば、塩酸ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定化剤（たとえば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（たとえば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られえた製剤は、安全で低毒性であるので、たとえば、哺乳動物や温血動物（たとえばヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ）に対して投与することができる。本発明により得られる化合物又はその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、たとえば、花粉症治療の目的で本発明により得られる化合物又はその塩を経口投与する場合、一般的に成人（６０Ｋｇ）において、１日につき、該化合物又はその塩を０．１ｍｇ〜１．０ｇ、好ましくは約１．０ｍｇ〜５０ｍｇ投与する。
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明をこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１ ヒトＦｃεＲＩβ鎖遺伝子ｎｔ４１８０−ｎｔ４２６０領域の転写調節活性の測定
ヒトゲノミックライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）よりプラークハイブリダイゼーション法を用いて、ＦｃεＲＩβ鎖遺伝子断片を取得した。制限酵素切断及びＰＣＲを利用して得た、第４イントロンの一部を含む遺伝子断片ｎｔ４１８０−ｎｔ４２６０をヒトＦｃεＲＩβ鎖プロモーター下流にレポーター遺伝子としてルシフェラーゼをコードする発現プラスミドに挿入した。
５００μｌの培地（２０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））に懸濁したヒトのＦｃεＲＩβ鎖発現肥満細胞株ＫＵ８１２（１×１０７個）に、上記レポータープラスミド５μｇ、及び対照としてＣＭＶプロモーター支配下にシーパンジールシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミドｐＲＬ−ＣＭＶ（東洋インク社）０．１μｇを添加し、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、エレクトロポレーション（３００Ｖ、９５０μＦ）を行った。１ｗｅｌｌあたり２ｍｌの培地を添加した１２ｗｅｌｌプレートに半量ずつを移し、３７℃、５％ ＣＯ２条件下で、２４時間培養した。細胞を回収し、細胞溶解液を添加後、Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社）を使用してホタルルシフェラーゼ活性及びシーパンジールシフェラーゼ活性の測定を行った。細胞溶解液及び基質は、Ｄｕａｌ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に含まれるものを用いた。各サンプルについて、ホタルルシフェラーゼ活性／シーパンジールシフェラーゼ活性の値を算出した。
図１は、β鎖プロモーターのみのときのホタルルシフェラーゼ活性／シーパンジールシフェラーゼ活性の値を１．０とした、相対活性を示す。その結果、遺伝子断片ｎｔ４１８０−ｎｔ４２６０にその挿入向きに関わらず強い転写抑制活性が認められた。
実施例２ 部位特異的変異の導入による転写調節エレメントの詳細なマッピング
次に、β鎖遺伝子領域ｎｔ４１８０−ｎｔ４２６０中の転写活性化配列の特定を行った。この領域中の３−５塩基にＱｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を利用し、それぞれ部位特異的変異を導入したレポータープラスミドを用いて、実施例１に示したのと同様の方法でルシフェラーゼアッセイを行った。
図２に示したように、ｎｔ４１９０近傍に変異を導入した場合に、転写抑制活性が阻害されることから、ｎｔ４１９０近傍の配列が転写抑制活性に必須であることが明らかとなった。
実施例３ ゲルシフトアッセイによる結合因子の同定
ＫＵ８１２細胞より、以下のようにして、核タンパク質画分を調製した。ＫＵ８１２細胞を回収後、氷冷したリン酸緩衝塩溶液（８ｇ ＮａＣｌ、０．２ｇ ＫＣｌ、０．２ｇ ＫＨ２ＰＯ４、２．９ｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ／１Ｌ Ｈ２Ｏ）にて洗浄し、同じく氷冷したバッファーＡ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．９，１０ｍＭＫＣｌ，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＰＭＳＦ，１μｇ／ｍｌ ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，１μｇ／ｍｌ ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）に懸濁後、氷上で１０分間静置した。ＮＰ−４０を最終濃度０．５％となるように添加し、さらに、氷上で１５分間静置後、６０００×ｇで１分間遠心した。沈殿画分をバッファーＥ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．９，４００ｍＭ ＫＣＬ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．２ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＰＭＳＦ，１ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＰＭＳＦ，１μｇ／ｍｌ ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，１μｇ／ｍｌ ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）に懸濁して、氷上で１時間放置後、１００００×ｇで１０分間遠心した。遠心分離した上清を核タンパク質画分とした。
ＦＩＴＣ標識した合成ＤＮＡオリゴ５’−ＧＴＧＡＧＴＴＧＣＣＣＧＣＴＴＣＴＧＴＣＴＴＴＧ−３’及び５’−ＣＡＡＡＧＡＣＡＧＡＡＧＣＧＧＧＣＡＡＣＴＣＡＣ−３’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を等モル混合し、９５℃５分間静置後ゆっくり放冷し、プローブとして使用した。また、プローブと同一の塩基配列を持つもの（ｓｅｌｆ）、ｎｔ４１９０近傍の３塩基を置換したもの（ｍｕｔａｎｔ）、プローブと無関係の配列を持つもの（ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）の３種類の非標識二本鎖合成オリゴＤＮＡをコンペティターとして用いた。
調製した核抽出物３０μｇと、プローブ５ｐｍｏｌ、コンペティター各５−１２５ｐｍｏｌをｐｏｌｙ（ｄＩ−ｄＣ）４００ｎｇ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、３０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、５％グリセロールを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．９）中で混合して、室温で２０分間静置した。その後、０．５×ＴＢＥ緩衝液（４５ｍＭトリス、４５ｍＭホウ酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いた、４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。１２０Ｖにて２−３時間泳動後、ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ ５９５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を使用して、ＦＩＴＣの蛍光を検出した。その結果を図３（Ａ）に示す。プローブ単独のバンドより移動度の小さい位置にいくつかのシフトしたバンドが観察され（レーン２）、このうち白抜きの矢印で示したバンドは、ｓｅｌｆコンペティターを添加した場合（レーン３−５）にコンペティターの濃度依存的に消失し、ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃコンペティターを添加した場合（レーン６−８）には影響を受けなかったことから、このバンドがプローブに特異的にタンパク質が結合したことによるものであることが示された。さらに、ｍｕｔａｎｔコンペティターを添加した場合（レーン９−１１）には、競合のかかり方が非常に弱くなったことから、このタンパク質がｎｔ４１９０近傍の配列を認識して結合することが明らかとなった。
ｎｔ４１９０近傍の遺伝子領域は転写因子ＭＺＦ−１の結合モチーフと相同性を有する塩基配列を含んでいた。そこで、次にこの配列に結合する転写因子の同定を行った。通常、ゲルシフトアッセイにおいてＭＺＦ−１に対する抗体を添加してシフトバンドのスーパーシフトあるいは消失が起こるかどうかにより解析するが、ＭＺＦ−１に対する抗体が市販されていないため、大腸菌を用いてｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ）との融合タンパクとして発現させた組換えＭＺＦ−１を用いて解析を行った（図３（Ｂ））。ＧＳＴ−ＭＺＦ−１融合タンパクをプローブに添加した場合にはシフトしたバンドが観察され、ＧＳＴのみを発現させた場合には観察されなかったことから、ＭＺＦ−１が特定したｎｔ４１９０近傍の遺伝子領域に結合することが示された。
実施例４ ＫＵ８１２細胞へのＭＺＦ−１アンチセンス導入によるβ鎖プロモーター活性の増大
次に、同定された転写因子の細胞内における転写調節能を確認するため、ＭＺＦ−１のアンチセンスを細胞に導入しその因子の発現を抑制した状態で、ＦｃεＲＩβ鎖プロモーター活性を測定した。まず、以下のようにして、ＭＺＦ−１アンチセンスを作製した。Ｋ５６２細胞より、ＴＲＩＺＯＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。調製したｔｏｔａｌ ＲＮＡ １μｇを鋳型とし、ランダムヘキサマーをプライマーとして用いてＲＴ反応を行った。その後、ヒトＭＺＦ−１の塩基配列に特異的なプライマー
を用いて、９４℃３０秒、６５℃３０秒、７２℃２分を３０サイクルのプロトコールでＰＣＲを行った。得られた増幅断片を、ｐＣＲ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に挿入し、制限酵素の切断パターンからＣＭＶプロモーターに対して逆向きに断片が挿入されたクローンを選択し、シークエンスにより塩基配列を確認した（ｐＣＲ３．１−ｈＭＺＦ−１ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）。また、コントロールとして使用するために、ｐＣＲ３．１をＥｃｏＲＩで切断後、Ｔ４ Ｌｉｇａｓｅを用いて閉環したプラスミドｐＣＲ３．１−ｓｅｌｆを作製した。
ｐＣＲ３．１−ｈＭＺＦ−１ ａｎｔｉｓｅｎｓｅあるいはｐＣＲ３．１−ｓｅｌｆ ５−２０μｇをβ鎖プロモーターおよびｎｔ４１８０−ｎｔ４２６０領域を含むレポータープラスミド５μｇとともに実施例１に記載の条件と同条件のエレクトロポレーションによりＫＵ８１２細胞に導入し、同様にルシフェラーゼアッセイを行った。レポータープラスミドのみの場合のホタルルシフェラーゼ活性／シーパンジールシフェラーゼ活性の値を１．０とした、相対活性を図４に示した。その結果、ｐＣＲ３．１−ｈＭＺＦ−１ ａｎｔｉｓｅｎｓｅの濃度依存的に、ルシフェラーゼ活性、すなわち、ヒトＦｃεＲＩβ鎖遺伝子のプロモーター活性が増大した。このことより、実施例３で同定したＭＺＦ−１が、特定したＤＮＡ配列に結合することにより、プロモーター活性を抑制することが確認された。
実施例５ ＫＵ８１２細胞へのＭＺＦ−１アンチセンス導入によるβ鎖ｍＲＮＡ量の増大
ｐＣＲ３．１−ｈＭＺＦ−１ ａｎｔｉｓｅｎｓｅあるいはｐＣＲ３．１−ｓｅｌｆ２０μｇを実施例１と同様にしてエレクトロポレーションによりＫＵ８１２細胞へ導入した。５％ ＣＯ２存在下３７℃で１２時間培養した後、ＤＮＡが導入された細胞を選択するためにＧ４１８を最終濃度０．４ｍｇ／ｍｌとなるように添加した。さらに４８時間培養した後細胞を回収し、ＴＲＩＺＯＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。ｔｏｔａｌ ＲＮＡ各１μｇを鋳型としたＲＴ−ＰＣＲにより、ＦｃεＲＩβ鎖およびβ−ａｃｔｉｎのｍＲＮＡ量の測定を行った。ＰＣＲはＲＴ産物各１μｌを鋳型として９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分のサイクルをβ鎖は２８−３２回、β−ａｃｔｉｎは１８−２２回行った。ＰＣＲ反応に用いたプライマーは以下のとおりである。
ＭＺＦ−１のアンチセンスの導入によりβ鎖のｍＲＮＡ量が増加することが明らかとなった。また、β−ａｃｔｉｎのバンドの濃さはほとんど変化しないことから、この転写活性化効果がβ鎖に特異的であると考えられた。（図５（Ａ））
さらに、ｐＣＲ３．１−ｈＭＺＦ−１ ａｎｔｉｓｅｎｓｅあるいはｐＣＲ３．１−ｓｅｌｆ１０μｇを同様にしてＫＵ８１２細胞へ導入し、Ｇ４１８によりＤＮＡが導入された細胞を選択した。回収した細胞よりｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製し、ノーザンブロッティングによりＦｃεＲＩβ鎖およびβ−ａｃｔｉｎのｍＲＮＡ量の測定を行った。ｔｏｔａｌ ＲＮＡ １０μｇを２．２Ｍホルムアルデヒドを含む１．５％アガロースゲルを用いた電気泳動に供し、ＨｙｂｏｎｄＮ（＋）ナイロンメンブラン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に転写した。５０％ホルムアミド、１％ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）、０．１％ Ｎ−ｌａｕｒｏｉｌ ｓａｌｃｏｓｉｎｅ、０．０２％ ＳＤＳを含む５×ＳＳＣ緩衝液中で、ＤＩＧ標識したＦｃεＲＩβ鎖およびβ−ａｃｔｉｎに対するプローブとハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたプローブを抗ＤＩＧ抗体とＣＤＰ−Ｓｔａｒｓｕｂｓｔｒａｔｅ（いずれもＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いて検出した。結果を図５（Ｂ）に示した。（Ｂ）の右側のグラフはβ鎖のバンドの濃さを数値化してβ−ａｃｔｉｎのバンドの濃さで補正した値である。ＭＺＦ−１のアンチセンスを導入することによりβ鎖のｍＲＮＡ量が約２．５倍増加した。
以上の結果より、ＭＺＦ−１アンチセンスを導入して細胞内のＭＺＦ−１の発現を抑制することにより、ＦｃεＲＩβ鎖の発現が増大することが示された。
本発明に係るヒト高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）β鎖遺伝子の転写を調節する領域を含むＤＮＡは、次に示す方法で取得した。
まず、レポーター遺伝子を用いたアッセイにより、ヒトＦｃεＲＩβ鎖遺伝子のうち、第４エクソンと第５エクソンとの間に存在する第４イントロンの一部に相当する領域が、ＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写を抑制することを見出した。また、部位特異的変異法を用いて、第４イントロン中のＭＺＦ−１結合モチーフと相同性を持つ、配列番号１で記載される配列が実際に転写抑制に関与することを明らかにした。次いで、転写調節領域である配列番号１で記載される配列に結合する転写調節因子の同定を行った。ＦｃεＲＩ発現細胞より調製した核抽出物蛋白質を用いたゲルシフトアッセイにより、この配列に実際にＭＺＦ−１が結合することが判明した。さらにまた、ＭＺＦ−１のアンチセンス発現ベクターを、ＦｃεＲＩβ鎖発現細胞に導入することにより、ＦｃεＲＩβ鎖遺伝子のプロモーター活性が増大し、ＦｃεＲＩβ鎖のｍＲＮＡ量が増大したことから、転写調節因子であるＭＺＦ−１が、実際にＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写を抑制することが確認された。
このようにして、ＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写調節に関与するＤＮＡ領域並びにその領域に結合する転写調節因子が決定されたことにより、ＦｃεＲＩβ鎖発現を阻害する化合物又はその塩のスクリーニング方法及びスクリーニング用キットを構築することが可能となり、ひいてはアレルギー疾患の治療・予防剤の開発に資するものとなる。たとえば、同定した転写調節因子ＭＺＦ−１と特定した遺伝子領域の結合を促進する物質を探索するといった方策により、β鎖発現を阻害する化合物又はその塩を開発することが可能となる。
転写調節因子ＭＺＦ−１は、細胞の種類や遺伝子のプロモーター構造によって転写活性又は転写抑制にも機能することが報告されており、転写活性化及び抑制性補因子の存在が示唆されている（Ｒ．Ｈｒｏｍａｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｕｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２１１，１５９−１６４（１９９６））。したがって、ＭＺＦ−１がさらに他の補因子と結合することにより転写抑制に寄与している可能性もあり、その相互作用を促進するような物質を探索する方策により、β鎖発現を阻害する化合物又はその塩を開発することも可能となる。たとえば、後述する本発明の実施例１中のβ鎖遺伝子のｎｔ４１８０−ｎｔ４２６０領域を挿入したレポータープラスミドを適当なＦｃεＲＩβ鎖発現細胞に導入し、ルシフェラーゼ活性の低下を指標として、天然物や合成化合物から、ＦｃεＲＩβ鎖転写抑制のスクリーニング方法を提供できる。また、ＭＺＦ−１の転写活性化補因子との結合領域に相当するペプチドあるいはＭＺＦ−１の転写活性化補因子のアンチセンスＤＮＡを利用して、ＭＺＦ−１を含む転写抑制複合体と配列番号１で記載される配列を含む領域の結合を促進する化合物又はその塩を探索することも可能となる。
ここで、化合物の塩とは生理学的に許容される酸（たとえば、無機酸、有機酸など）や、生理学的に許容される塩基（たとえば、アルカリ金属など）などとの塩である。とりわけ好ましいのは、生理学的に許容される酸付加塩である。かかる塩の具体例としては、無機酸として、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸との塩が挙げられ、あるいは有機酸として、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などとの塩が挙げられる。
本発明に係るスクリーニング方法及びスクリーニング用キットを用いて得られる、ＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写を調節する化合物又はその塩は、アレルギー疾患の予防・治療剤として有用である。とりわけ、前記化合物又はその塩を含有する医薬は、その利用価値が高い。
本発明により得られる化合物又はその塩は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。たとえば、本発明により得られる化合物又はその塩を、生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これらの製剤における有効成分量は、指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、たとえば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液体担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油などのような天然産出植物油などを溶解又は懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することできる。注射用水の水性液としては、たとえば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（たとえば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが挙げられ、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール（たとえば、エタノールなど）、ポリアルコール（たとえば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（たとえば、ポリソルベート８０（登録商標）、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。溶解補助剤として、たとえば、ゴマ油、大豆油などが挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（たとえば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（たとえば、塩酸ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定化剤（たとえば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（たとえば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られえた製剤は、安全で低毒性であるので、たとえば、哺乳動物や温血動物（たとえばヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ）に対して投与することができる。本発明により得られる化合物又はその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、たとえば、花粉症治療の目的で本発明により得られる化合物又はその塩を経口投与する場合、一般的に成人（６０Ｋｇ）において、１日につき、該化合物又はその塩を０．１ｍｇ〜１．０ｇ、好ましくは約１．０ｍｇ〜５０ｍｇ投与する。
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明をこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１ ヒトＦｃεＲＩβ鎖遺伝子ｎｔ４１８０−ｎｔ４２６０領域の転写調節活性の測定
ヒトゲノミックライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）よりプラークハイブリダイゼーション法を用いて、ＦｃεＲＩβ鎖遺伝子断片を取得した。制限酵素切断及びＰＣＲを利用して得た、第４イントロンの一部を含む遺伝子断片ｎｔ４１８０−ｎｔ４２６０をヒトＦｃεＲＩβ鎖プロモーター下流にレポーター遺伝子としてルシフェラーゼをコードする発現プラスミドに挿入した。
５００μｌの培地（２０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））に懸濁したヒトのＦｃεＲＩβ鎖発現肥満細胞株ＫＵ８１２（１×１０７個）に、上記レポータープラスミド５μｇ、及び対照としてＣＭＶプロモーター支配下にシーパンジールシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミドｐＲＬ−ＣＭＶ（東洋インク社）０．１μｇを添加し、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、エレクトロポレーション（３００Ｖ、９５０μＦ）を行った。１ｗｅｌｌあたり２ｍｌの培地を添加した１２ｗｅｌｌプレートに半量ずつを移し、３７℃、５％ ＣＯ２条件下で、２４時間培養した。細胞を回収し、細胞溶解液を添加後、Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社）を使用してホタルルシフェラーゼ活性及びシーパンジールシフェラーゼ活性の測定を行った。細胞溶解液及び基質は、Ｄｕａｌ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に含まれるものを用いた。各サンプルについて、ホタルルシフェラーゼ活性／シーパンジールシフェラーゼ活性の値を算出した。
図１は、β鎖プロモーターのみのときのホタルルシフェラーゼ活性／シーパンジールシフェラーゼ活性の値を１．０とした、相対活性を示す。その結果、遺伝子断片ｎｔ４１８０−ｎｔ４２６０にその挿入向きに関わらず強い転写抑制活性が認められた。
実施例２ 部位特異的変異の導入による転写調節エレメントの詳細なマッピング
次に、β鎖遺伝子領域ｎｔ４１８０−ｎｔ４２６０中の転写活性化配列の特定を行った。この領域中の３−５塩基にＱｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を利用し、それぞれ部位特異的変異を導入したレポータープラスミドを用いて、実施例１に示したのと同様の方法でルシフェラーゼアッセイを行った。
図２に示したように、ｎｔ４１９０近傍に変異を導入した場合に、転写抑制活性が阻害されることから、ｎｔ４１９０近傍の配列が転写抑制活性に必須であることが明らかとなった。
実施例３ ゲルシフトアッセイによる結合因子の同定
ＫＵ８１２細胞より、以下のようにして、核タンパク質画分を調製した。ＫＵ８１２細胞を回収後、氷冷したリン酸緩衝塩溶液（８ｇ ＮａＣｌ、０．２ｇ ＫＣｌ、０．２ｇ ＫＨ２ＰＯ４、２．９ｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ／１Ｌ Ｈ２Ｏ）にて洗浄し、同じく氷冷したバッファーＡ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．９，１０ｍＭＫＣｌ，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＰＭＳＦ，１μｇ／ｍｌ ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，１μｇ／ｍｌ ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）に懸濁後、氷上で１０分間静置した。ＮＰ−４０を最終濃度０．５％となるように添加し、さらに、氷上で１５分間静置後、６０００×ｇで１分間遠心した。沈殿画分をバッファーＥ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．９，４００ｍＭ ＫＣＬ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．２ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＰＭＳＦ，１ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＰＭＳＦ，１μｇ／ｍｌ ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，１μｇ／ｍｌ ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）に懸濁して、氷上で１時間放置後、１００００×ｇで１０分間遠心した。遠心分離した上清を核タンパク質画分とした。
ＦＩＴＣ標識した合成ＤＮＡオリゴ５’−ＧＴＧＡＧＴＴＧＣＣＣＧＣＴＴＣＴＧＴＣＴＴＴＧ−３’及び５’−ＣＡＡＡＧＡＣＡＧＡＡＧＣＧＧＧＣＡＡＣＴＣＡＣ−３’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を等モル混合し、９５℃５分間静置後ゆっくり放冷し、プローブとして使用した。また、プローブと同一の塩基配列を持つもの（ｓｅｌｆ）、ｎｔ４１９０近傍の３塩基を置換したもの（ｍｕｔａｎｔ）、プローブと無関係の配列を持つもの（ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）の３種類の非標識二本鎖合成オリゴＤＮＡをコンペティターとして用いた。
調製した核抽出物３０μｇと、プローブ５ｐｍｏｌ、コンペティター各５−１２５ｐｍｏｌをｐｏｌｙ（ｄＩ−ｄＣ）４００ｎｇ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、３０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、５％グリセロールを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．９）中で混合して、室温で２０分間静置した。その後、０．５×ＴＢＥ緩衝液（４５ｍＭトリス、４５ｍＭホウ酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いた、４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。１２０Ｖにて２−３時間泳動後、ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ ５９５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を使用して、ＦＩＴＣの蛍光を検出した。その結果を図３（Ａ）に示す。プローブ単独のバンドより移動度の小さい位置にいくつかのシフトしたバンドが観察され（レーン２）、このうち白抜きの矢印で示したバンドは、ｓｅｌｆコンペティターを添加した場合（レーン３−５）にコンペティターの濃度依存的に消失し、ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃコンペティターを添加した場合（レーン６−８）には影響を受けなかったことから、このバンドがプローブに特異的にタンパク質が結合したことによるものであることが示された。さらに、ｍｕｔａｎｔコンペティターを添加した場合（レーン９−１１）には、競合のかかり方が非常に弱くなったことから、このタンパク質がｎｔ４１９０近傍の配列を認識して結合することが明らかとなった。
ｎｔ４１９０近傍の遺伝子領域は転写因子ＭＺＦ−１の結合モチーフと相同性を有する塩基配列を含んでいた。そこで、次にこの配列に結合する転写因子の同定を行った。通常、ゲルシフトアッセイにおいてＭＺＦ−１に対する抗体を添加してシフトバンドのスーパーシフトあるいは消失が起こるかどうかにより解析するが、ＭＺＦ−１に対する抗体が市販されていないため、大腸菌を用いてｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ）との融合タンパクとして発現させた組換えＭＺＦ−１を用いて解析を行った（図３（Ｂ））。ＧＳＴ−ＭＺＦ−１融合タンパクをプローブに添加した場合にはシフトしたバンドが観察され、ＧＳＴのみを発現させた場合には観察されなかったことから、ＭＺＦ−１が特定したｎｔ４１９０近傍の遺伝子領域に結合することが示された。
実施例４ ＫＵ８１２細胞へのＭＺＦ−１アンチセンス導入によるβ鎖プロモーター活性の増大
次に、同定された転写因子の細胞内における転写調節能を確認するため、ＭＺＦ−１のアンチセンスを細胞に導入しその因子の発現を抑制した状態で、ＦｃεＲＩβ鎖プロモーター活性を測定した。まず、以下のようにして、ＭＺＦ−１アンチセンスを作製した。Ｋ５６２細胞より、ＴＲＩＺＯＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。調製したｔｏｔａｌ ＲＮＡ １μｇを鋳型とし、ランダムヘキサマーをプライマーとして用いてＲＴ反応を行った。その後、ヒトＭＺＦ−１の塩基配列に特異的なプライマー
ｐＣＲ３．１−ｈＭＺＦ−１ ａｎｔｉｓｅｎｓｅあるいはｐＣＲ３．１−ｓｅｌｆ ５−２０μｇをβ鎖プロモーターおよびｎｔ４１８０−ｎｔ４２６０領域を含むレポータープラスミド５μｇとともに実施例１に記載の条件と同条件のエレクトロポレーションによりＫＵ８１２細胞に導入し、同様にルシフェラーゼアッセイを行った。レポータープラスミドのみの場合のホタルルシフェラーゼ活性／シーパンジールシフェラーゼ活性の値を１．０とした、相対活性を図４に示した。その結果、ｐＣＲ３．１−ｈＭＺＦ−１ ａｎｔｉｓｅｎｓｅの濃度依存的に、ルシフェラーゼ活性、すなわち、ヒトＦｃεＲＩβ鎖遺伝子のプロモーター活性が増大した。このことより、実施例３で同定したＭＺＦ−１が、特定したＤＮＡ配列に結合することにより、プロモーター活性を抑制することが確認された。
実施例５ ＫＵ８１２細胞へのＭＺＦ−１アンチセンス導入によるβ鎖ｍＲＮＡ量の増大
ｐＣＲ３．１−ｈＭＺＦ−１ ａｎｔｉｓｅｎｓｅあるいはｐＣＲ３．１−ｓｅｌｆ２０μｇを実施例１と同様にしてエレクトロポレーションによりＫＵ８１２細胞へ導入した。５％ ＣＯ２存在下３７℃で１２時間培養した後、ＤＮＡが導入された細胞を選択するためにＧ４１８を最終濃度０．４ｍｇ／ｍｌとなるように添加した。さらに４８時間培養した後細胞を回収し、ＴＲＩＺＯＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。ｔｏｔａｌ ＲＮＡ各１μｇを鋳型としたＲＴ−ＰＣＲにより、ＦｃεＲＩβ鎖およびβ−ａｃｔｉｎのｍＲＮＡ量の測定を行った。ＰＣＲはＲＴ産物各１μｌを鋳型として９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分のサイクルをβ鎖は２８−３２回、β−ａｃｔｉｎは１８−２２回行った。ＰＣＲ反応に用いたプライマーは以下のとおりである。
さらに、ｐＣＲ３．１−ｈＭＺＦ−１ ａｎｔｉｓｅｎｓｅあるいはｐＣＲ３．１−ｓｅｌｆ１０μｇを同様にしてＫＵ８１２細胞へ導入し、Ｇ４１８によりＤＮＡが導入された細胞を選択した。回収した細胞よりｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製し、ノーザンブロッティングによりＦｃεＲＩβ鎖およびβ−ａｃｔｉｎのｍＲＮＡ量の測定を行った。ｔｏｔａｌ ＲＮＡ １０μｇを２．２Ｍホルムアルデヒドを含む１．５％アガロースゲルを用いた電気泳動に供し、ＨｙｂｏｎｄＮ（＋）ナイロンメンブラン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に転写した。５０％ホルムアミド、１％ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）、０．１％ Ｎ−ｌａｕｒｏｉｌ ｓａｌｃｏｓｉｎｅ、０．０２％ ＳＤＳを含む５×ＳＳＣ緩衝液中で、ＤＩＧ標識したＦｃεＲＩβ鎖およびβ−ａｃｔｉｎに対するプローブとハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたプローブを抗ＤＩＧ抗体とＣＤＰ−Ｓｔａｒｓｕｂｓｔｒａｔｅ（いずれもＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いて検出した。結果を図５（Ｂ）に示した。（Ｂ）の右側のグラフはβ鎖のバンドの濃さを数値化してβ−ａｃｔｉｎのバンドの濃さで補正した値である。ＭＺＦ−１のアンチセンスを導入することによりβ鎖のｍＲＮＡ量が約２．５倍増加した。
以上の結果より、ＭＺＦ−１アンチセンスを導入して細胞内のＭＺＦ−１の発現を抑制することにより、ＦｃεＲＩβ鎖の発現が増大することが示された。
本発明によれば、ヒトＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写抑制に関与する塩基配列が提供され、β鎖発現を阻害する化合物又はその塩のスクリーニング方法及びそのキットが確立される。そのため、本発明は、新しいアレルギー疾患の予防・治療剤の開発を進めることが可能となる。
【配列表】
Claims (12)
- ヒト高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）β鎖遺伝子の転写を調節する、配列番号１で記載される塩基配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号１で記載される塩基配列を含むＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写調節領域と、ＭＺＦ−１との結合を促進する工程を含む、ＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写調節方法。
- 配列番号１で記載される塩基配列を含むＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写調節領域と、ＭＺＦ−１を含む転写抑制複合体との結合を促進する工程を含む、ＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写調節方法。
- 配列番号１で記載される塩基配列を含むＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写調節領域と、ＭＺＦ−１との結合を促進する化合物又はその塩のスクリーニング方法。
- 配列番号１で記載される塩基配列を含むＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写調節領域と、ＭＺＦ−１を含む転写抑制複合体との結合を促進する化合物又はその塩のスクリーニング方法。
- 配列番号１で記載される塩基配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチドを用いる、ＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写を調節する化合物又はその塩のスクリーニング用キット。
- 請求項５又は６記載のスクリーニング方法、又は請求項７記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、ＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の転写を調節する化合物又はその塩。
- 請求項８記載の化合物又はその塩を含有してなる医薬。
- 前記医薬がアレルギー疾患の予防・治療剤である、請求項９記載の医薬。
- 哺乳動物に対して、請求項８記載の化合物又はその塩を有効量投与する工程を含む、アレルギー疾患の予防・治療方法。
- アレルギー疾患の予防・治療剤を製造するための、請求項８記載の化合物又はその塩の使用。
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