CN106459919B - 使用notch 1和/或notch 2激动剂扩增和植入干细胞 - Google Patents

Abstract

本公开提供了用于使作为非终末分化细胞如干细胞的前体细胞永生化的方法，所述方法包括在存在支持所述非终末分化细胞的增殖而非分化的Notch 1激动剂、Notch 2激动剂或Notch 1激动剂和Notch 2激动剂(以及，在具体实施方案中，一种或多种生长因子)的情况下培养所述前体细胞。本公开还提供了诱导永生化细胞分化的方法，所述方法包括在存在支持将所述细胞分化成更特化的细胞类型的Notch 1激动剂、Notch 2激动剂或Notch 1激动剂和Notch 2激动剂以及至少一种生长因子的情况下生长所述细胞。可使用本公开的永生化和/或分化的细胞再增殖已经例如由于感染或暴露于某些药物而减少的细胞群体。本公开还提供了包含通过本公开的方法永生化的非终末分化细胞群体的细胞培养物和包含促进前体细胞永生化的试剂的试剂盒。

Description

使用NOTCH 1和/或NOTCH 2激动剂扩增和植入干细胞

本申请要求2014年6月4日提交的美国临时申请NO.62/007,848的权益，该美国临时申请以全文引用的方式并入本文。

政府支持的声明

本发明是在由国立卫生研究院授予的HL100395下，通过政府支持完成的。政府对本发明享有一定的权利。

1.发明领域

本公开提供了用于产生永生化前体细胞群体的方法，所述方法包括在Notch 1激动剂和/或Notch 2激动剂和一种或多种增殖促进生长因子的存在下培养非永生化前体细胞一定时段，超出所述时段，前体细胞类型的细胞停止增殖并且分化或死亡。本公开还提供了用于产生永生化和分化的细胞类型的方法，其包括在永生化之前或之后将前体细胞暴露于促进其分化的条件。由其衍生的永生化细胞可用于细胞疗法。

2.发明背景

2.1 Notch信号传导途径

Notch家族的成员编码大的跨膜蛋白，这些跨膜蛋白在许多无脊椎动物系统中的早期发育期间在细胞-细胞相互作用和细胞命运决定中起主要作用。Notch受体是高度保守的途径的一部分，所述途径使得多种细胞类型能够基于紧邻细胞所采取的那些在替代的分化途径之间进行选择。此受体似乎经由共同的步骤起作用，该步骤控制未定型细胞向分化状态的进展，通过抑制其采取两种可选择的命运之一的能力，从而允许细胞延迟分化或者在存在适当的发育信号的情况下沿着非抑制途径进行分化。

遗传和分子研究已致使鉴定一组基因，其定义Notch信号传导途径的不同元件。虽然使用遗传工具作为初始指导，这些各种元素的初始鉴定已经完全来自果蝇，但是随后的分析已经致使鉴定出在包括人在内的脊椎动物物种中的同源蛋白质。已知的Notch途径元件之间的分子关系以及它们的亚细胞定位描述于Artavanis-Tsakonas等人，1995，Science268:225-232)和Artvanis-Tsakonas等人，1999，Science 284:770-776。

2.1.1.Notch信号传导途径的成员

已经在无脊椎动物和脊椎动物生物体中克隆和测序了Notch信号传导途径的若干成员。非哺乳动物Notch基因包括在果蝇属(Drosophila)(Wharton等人，1985，Cell 43:567-581)；爪蟾属(Xenopus)(Coffman等人，1990，Science 249:1438-1441)；和斑马鱼(Bierkamp等人，1993，Mech.Dev.43:87-100)中鉴定的那些。已经鉴定了至少四种哺乳动物Notch同源物(Notch-1、-2、-3和-4；Weinmaster等人,1991,Development 113:199-205；Ellisen等人,1991,Cell 66:523-534；Weinmaster等人,1992,Development 116:931-941；Franco del Amo等人,1993,Genomics 15:259-264；Lardelli and Lendahl,1993,Exp.Cell.Res.204:364-372；Milner等人,1994,Blood.83:2057-62；Lardelli等人,1994,Mech Dev.46:123-136；Uyttendaele等人,1996,Development 122:2251-9)。Notch途径的其他成员包括配体Delta和Serrate/Jagged，胞质蛋白Deltex，转录活化物RBP-Jκ(也称为CBF1)，下游靶标，包括但不限于bHLH转录因子的Split家族的增强子，以及，Fringe(Panin等人，1997，Nature 387:908-912)，其在高尔基中作为糖基转移酶起作用，所述糖基转移酶修饰Notch的表皮生长因子(EGF)模块，并改变Notch结合其配体Delta的能力。以下非详尽的文章列表描述了Notch信号传导途径的关键成员的基因和蛋白质序列以及功能性作用：

无脊椎动物配体：(i)Delta(Kopczynski等人,1988,Genes Dev.2:1723-1735；Henrique等人,1995,Nature 375:787-790；Chitnis等人,1995,Nature 375:761-766)；以及(ii)Serrate(Fleming等人,1990,Genes Dev.1:2188-2201；Lindsell等人,1995,Cell80:909-917；Thomas等人,1991,Development 111:749-761；Tax等人,1994,Nature 368:150-154)。

脊椎动物配体：(i)Serrate(Thomas,1991,Development 111:749-761；Lindsell等人,1995,Cell 80:909-917)；以及(ii)Delta(Chitnis等人,1995,Nature 375:761；Henrique等人,1995,Nature 375:787-790；Bettenhausen等人,1995,Development 121:2407)。

其他无脊椎动物Notch途径成员：(i)胞质蛋白Deltex(Busseau等，1994，Genetics136:585-596)；(ii)核蛋白Mastermind，Hairless，Split复合物的增强子(Smoller等人,1990,Genes Dev.4:1688-1700；Bang and Posakony,1992,Genes Dev.6:1752-1769；Maier等人,1992,Mech.Dev.38:143-156；Delidakis等人,1991,Genetics 129:803-823；Schrons等人,1992,Genetics 132:481-503；以及Fortini和Artavanis-Tsakonas,1994,Cell 79:273-282)；(iii)Hairless的抑制剂(Furukawa等人,1991,J.Biol.Chem.266:23334-23340；Furukawa等人,1992,Cell 69:1191-1197；以及Schweisguth and Posakony,1992,Cell69:1199-1212)；和(iv)Fringe(Irvine和Wieschaus，1994，Cell 79:595-606)。

其他脊椎动物Notch途径成员：(i)RBP-Jκ(Matsunami等人,1989,Nature 342:934-937；Kawaichi等人,1992,J.Biol.Chem.267:4016-4022)；(ii)Deltex(Matsunami等人,1998,Nat.Genet.19:74-78)；(iii)Fringe，包括Lunatic，Manic和Radical Fringe(Wu等人,1996,Science 273:355-358；Moran等人,1999,Mamm.Genome 10:535-541)。

2.1.2.Notch家族成员编码经由胞质结构域介导抑制信号的表面受体

在果蝇和秀丽隐杆线虫(C.elegans)中的广泛的遗传和分子研究已经表明由Notch同源物编码的蛋白质作为细胞表面受体起作用，所述细胞表面受体可以活化抑制性信号转导途径(Greenwald和Rubin,1992,Cell.68:271-281；Heitzler和Simpson,1991,Cell 64:1083-1092；Yochem和Greenwald,1989,Cell 58:553-63；Fehon等人,1991,J.CellBiol.113:657-669；Rebay等人,1993,Cell 74:319-329)。

认为Notch信号传导通过与Notch配体之一(Delta-1、-2、-3或Jagged-1或-2)的相互作用而起始(Shawber等人,1996,Developmental Biology 180:370-76；Luo等人,1997,Molecular and Cellular Biology 17:6057-6067；Henrique等人,1997,Current Biology7:661-70；Bettenhausen等人,1995,Development 121:2407-18；Dunwoodie等人,1997,Development 124:3065-76)。每个已知的配体的特征在于包含在果蝇，秀丽隐杆线虫和脊椎动物中发现的多个EGF重复的胞外结构域和高度保守的DSL结构域(Tax等人，1994，Nature 368:150-154)。有证据表明，特定的Notch配体诱导Notch活化的能力可以通过其他基因的表达来修饰。例如，Fringe的表达阻止Serrate(Jagged的果蝇同源物)活化Notch，但增强Delta活性(Fleming等，1997，Development 124:2973-81)。

有相当多的证据表明由胞外结构域介导的细胞相互作用调节胞内结构域的信号转导，致使对分化的调节(Yochem和Greenwald,1989,Cell 58:553-563；Rebay等人,1993,Cell 74:319-329)。数据表明，这是由于胞外结构域与其配体之一结合而发生的，随后是一系列蛋白水解切割，这又导致Notch的胞内结构域的释放(Struhl and Adachi,1998,Cell.93:649-660；Schroeter等人,1998,Nature 393:382-386)。涉及Notch受体的截短形式的表达的功能分析已经表明受体活化依赖于胞内结构域中的六个cdc10/锚蛋白重复。此外，Notch活化需要cdc10/锚蛋白重复序列到达细胞核--可能在从蛋白质的其余部分蛋白水解切割后--并参与转录活化(Struhl和Adachi，1998，Cell 93:649-660)。Deltex和Hairless的抑制剂(其过表达导致途径的明显活化)与那些重复结合。最近的证据表明，释放cdc10/锚蛋白重复以实现核进入的蛋白水解切割步骤依赖于早老素活性(De Strooper等人,1999,Nature 398:518-522；Struhl和Greenwald,同上:522-525；Ye等人,同上:525-529)。

除了将Notch的锚蛋白重复释放到核的步骤之外，Notch途径依赖于蛋白质加工事件。存在于质膜中的Notch受体包含两种Notch蛋白水解切割产物的异二聚体，一种包含包括胞外结构域的部分，跨膜结构域和胞内结构域的N末端片段，而另一种包括大部分胞外结构域(Blaumueller等人，1997，Cell 0:281-291)。Notch活化受体的蛋白水解切割步骤在高尔基体中进行并且由弗林蛋白酶样转化酶介导(Logeat等人，1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:8108-8112)。Notch配体Delta另外需要裂解用于活化。认为Delta被在细胞表面的ADAM解整联蛋白金属蛋白酶Kuzbanian切割以释放可溶性和活性形式的Delta(Qi等人，1999，Science 283:91-94)。

Notch的胞内结构域已显示出作为组成型活性受体起作用，因为该结构域的强制表达阻止C2成肌细胞中的肌细胞融合(Kopan等，1994，Development 120:2385-2396)，阻断通过MyoD和Myf-5对3T3细胞的肌肉转化(Kopan等，1994，Development 120:2385-2396),预防DMSO诱导的P19胚胎癌细胞的肌肉分化，并抑制神经发生，同时允许P19细胞的胶质分化(Nye等，1994，Development 120:2421-2430)。

认为胞内结构域被转运到细胞核，其在细胞核中似乎通过与许多分子靶标，包括CBF1/RBP-Jκ相互作用来调节转录(Struhl和Adachi，1998，Cell 93:649-660；Schroeter等人，1998，Nature 393:382-386Fortini等人，1993，Nature 365:555-7)。没有完全确定下游靶标，但是已知RBP-Jκ活化作为转录活性抑制剂发挥功能的发状分裂增强子(HairyEnhancer of Split)(HES)的表达(Jarriault等人，1998，Mol Cell Biol.18:2230-9)。RBP-Jκ(如所述，也称为CBF1，Hairless的果蝇基因抑制剂的同源物)是参与埃巴病毒诱导的B细胞永生化的哺乳动物DNA结合蛋白。已经证明，至少在培养的细胞中，Hairless的抑制剂与细胞质中的cdc10/锚蛋白重复结合，并且在Notch受体与其相邻细胞上的配体Delta相互作用时移位到细胞核中(Fortini和Artavanis，1994，Cell 79:273-282)。因此，使用酵母双杂交系统已经证明了Hairless(一种核蛋白)与Hairless抑制剂的关联，拒信Hairless抑制剂参与转录是通过Hairless调节的(Brou等人,1994,Genes Dev.8:2491；Knust等人1992,Genetics 129:803)。已知Notch信号传导导致分裂复合物的增强子内的至少某些bHLH基因的活化(Delidakis等人，1991，Genetics 129:803)。Mastermind编码一种新的遍在核蛋白，其与Notch信号传导的关系仍然不清楚，但参与Notch途径，如遗传分析所示(Smoller等人，1990，Genes Dev.4:1688)。

还有证据表明Notch信号传导由替代的、不依赖于HES的途径介导，其涉及经由Deltex的信号传导，并导致E蛋白活性的阻抑，例如在B细胞系统中，还已经显示是Deltex而非RBP-Jκ来负责抑制E47功能(Ordentlich等人，1998，Mol Cell Biol 18:2230-9)。Deltex是含有环锌指并与Notch的锚蛋白重复序列相互作用的胞质蛋白(Matsuno等人，1995，Development 121:2633-2644)。

2.1.3.Notch家族成员的作用

美国专利号US 5,780,300描述了Notch蛋白在分化过程中的作用。简言之，Notch调节许多不同细胞类型响应分化/增殖/凋亡信号的能力，其中特定细胞命运根据每种细胞类型的发育历史和在其内运行的特异性信号传导途径进行选择。在果蝇和秀丽隐杆线虫中，当确定特定细胞命运时，在多种组织分化过程中的多个步骤中需要Notchllin-12家族的成员。在秀丽隐杆线虫中，Notch相关基因lin-12和glp-1在多种细胞-细胞相互作用中发挥功能，所述相互作用导致一种或多种潜在细胞命运的抑制或表达(Greenwald andRubin,1992,Cell 68:271-81；Greenwald等人,1983,Cell 34:435-444；Austin和Kimble,1987,Cell 51:589-99；Yochem和Greenwald,1989,Cell 58:553-563；Wilkinson等人,1994,Cell 79:1187-1198)。一个特别清楚的实例是涉及规定发育中的外阴中的细胞命运的相互作用，其中两个等效的多潜力前体总是形成一种锚状细胞(AC)和一个腹侧子宫前体(VU)细胞(Greenwald和Rubin,1992,Cell 68:271-81；Greenwald等人,1983,Cell 34:435-44；Austin和Kimble,1987,Cell 51:589-99；Yochem和Greenwald,1989,Cell 58:553-63；Wilkinson等人,1994,Cell 79:1187-98)。如果消除干细胞之一，那么剩余的细胞总是变成AC；如果lin-12活性缺乏，那么两者都变成AC；并且如果lin-12活性升高，那么这两种细胞表达VU命运。进一步的证据表明，在进行AC分化的细胞中，lin-12配体(lag-2)的表达的相对增加通过直接的细胞-细胞相互作用诱导lin-12活性的增加，其对AC分化是一致性的但允许VU分化。

在果蝇中，Notch已显示为在许多组织中的合适的细胞命运决定是需要的，所述组织包括神经系统、眼、中胚层、卵巢和多能祖先进行细胞命运决定的其他区域(Artavanis-Tsakonas等人,1999,Science 284:770-776；Go等人,1998,Development 125:2031-2040；Doherty等人,1996,Genes Dev.10:421-434；Artavanis-Tsakonis等人,1995,Science268:225-232；Greenwald和Rubin,1992,Cell 68:271-81；Heitzler和Simpson,1991,Cell64:1083-1092；Artavanis-Tsakonas and Simpson,1991,Trends Genet.7:403-408；Cagan和Ready,1989,Genes Dev.3:1099-1112)。在神经源性区域中，例如，Notch的差异表达似乎介导侧向抑制，其中等同细胞簇内的单细胞采用神经命运，而相邻细胞采用表皮命运。类似地，在具有Notch基因的纯合无效突变的胚胎中，神经源性区域中的所有细胞都变成成神经细胞，而不是表皮前体。

在爪蟾中，在发育中的胚胎中Notch突变形式的表达与正常发育密切相关(Coffman等，1993，Cell 73:659)。

对斑马鱼和爪蟾中的Notch-1(Notch的三种已知脊椎动物同源物之一)的表达的研究已经显示一般模式是相似的；其中Notch表达通常与非终末分化的增殖细胞群体相关。具有高表达水平的组织包括发育中的脑、眼和神经管(Coffman等人,1990,Science 249:1438-1441；Bierkamp等人,1993,Mech.Dev.43:87-100)。虽然在哺乳动物中的研究显示相应的Notch同源物的表达开始于发育的后期，但是蛋白质在经历细胞命运测定或快速增殖的组织中以动态模式表达(Weinmaster等人,1991,Development 113:199-205；Reaume等人,1992,Dev.Biol.154:377-387；Stifani等人,1992,Nature Genet.2:119-127；Weinmaster等人,1992,Development 116:931-941；Kopan等人,1993,J.Cell Biol.121:631-641；Lardelli等人,1993,Exp.Cell Res.204:364-372；Lardelli等人,1994,Mech.Dev.46:123-136；Henrique等人,1995,Nature 375:787-790；Horvitz等人,1991,Nature 351:535-541；Franco del Amo等人,1992,Development 115:737-744)。在首先表达哺乳动物Notch同源物的组织中的是胚的体节前中胚层和发育中的神经上皮。在体节前中胚层中，Notch-1的表达在所有迁移的中胚层中都看到，并且在体节前中胚层的前边缘看到特别致密的带。已经表明，一旦已经形成体节，该表达就减少，表明Notch在体细胞前体细胞分化中的作用(Reaume等人,1992,Dev.Biol.154:377-387；Horvitz等人,1991,Nature351:535-541)。对于小鼠Delta看到相似的表达模式(Simske等人,1995,Nature 375:142-145)。

在发育中的哺乳动物神经系统内，Notch同源物的表达模式已显示在脊髓的室区的特定区域中以及在周围神经系统的组分中以重叠但不相同的模式是突出的。神经系统中的Notch表达似乎限于细胞增殖的区域，并且不存在于最近分化的细胞的附近群体中(Weinmster等人,1991,Development 113:199-205；Reaume等人,1992,Dev.Biol.154:377-387；Weinmaster等人,1992,Development 116:931-941；Kopan等人,1993,J.CellBiol.121:631-641；Lardelli等人,1993,Exp.Cell Res.204:364-372；Lardelli等人,1994,Mech.Dev.46:123-136；Henrique等人,1995,Nature 375:787-790；Horvitz等人,1991,Nature 351:535-541)。大鼠Notch配体也在发育中的脊髓内，在与Notch基因的表达结构域重叠的室区的不同带中表达。该配体的时空表达模式与定型于脊髓神经元命运的细胞的模式良好相关，这证明了Notch作为神经元命运的细胞群体的标志物的有用性(Henrique等人，1995，Nature 375:787-790)。这也已经提出用于脊椎动物Delta同源物，其表达结构域也与Notch-1的结构域重叠(Larsson等人,1994,Genomics 24:253-258；Fortini等人,1993,Nature 365:555-557；Simske等人,1995,Nature 375:142-145)。在爪蟾和鸡同源物的情况下，Delta实际上仅在Notch-1表达域内的分散细胞中表达，如从侧向规格模型所预期的，并且这些模式“预示”神经元分化的将来模式(Larsson等人,1994,Genomics 24:253-258；Fortini等人,1993,Nature 365:555-557)。

其他特别感兴趣的脊椎动物研究集中在Notch同源物在发育中的感觉结构，包括视网膜，毛囊和牙蕾中的表达。在爪蟾视网膜的情况下，Notch-1在中枢边缘区和中心视网膜的未分化细胞中表达(Coffman等人,1990,Science 249:1439-1441；Mango等人,1991,Nature 352:811-815)。大鼠中的研究还证明了Notch-1与发育的视网膜中的分化细胞的关联，并且已被解释为表明Notch-1在该组织中的连续细胞命运选择中起作用(Lyman等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10395-10399)。

进行对再生毛囊基质细胞中小鼠Notch-1表达的详细分析，以检查Notch蛋白在上皮/间充质诱导相互作用中的潜在参与(Franco del Amo等，1992，Development 115:737-744)。此类作用最初基于其在大鼠须和牙蕾中的表达被建议用于Notch-1(Weinmaster等人，1991，Development 113:199-205)。相反，发现Notch-1表达限于不经受上皮/间充质相互作用的非有丝分裂，分化细胞的亚群，这是与其他地方的Notch表达一致的发现。

最初从具有涉及该基因的易位的T细胞白血病克隆Notch-1的人同源物(TAN-1)，随后存在于多种成体组织中，但在胸腺和淋巴结中的存在量最大(Ellisen等人,1991,Cell66:649-661；Zhong等人,1997,Development 124:1887-1897；Vargesson等人,1998,MechDev.77:197-9；Lewis等人,1998,Mech Dev.78:159-163；Lindsell等人,1996,Mol.Cell.Neurosci.8:14-27；Hasserjian等人,1996,Blood.88:970-976)。Notch/TAN-1的同源物在人CD34+造血前体(Milner等人，1994，Blood 83:2057-2062)以及CD34-骨髓细胞(Milner等人,1994,Blood 83:2057-2062；Varnum-Finney等人,1998,Blood 91:4084-4091)中表达。随后的研究表明造血发育过程中Notch-1和Notch-2蛋白以及Notch配体Jagged-1在造血基质中的广泛表达(Varnum-Finney等人,1998,Blood 91:4084-4091；Li等人,1998,Immunity 8:43-55)。脊椎动物Notch同源物在经历细胞增殖和分化的组织中的优先表达表明这些分子参与在脊椎动物中介导细胞命运决定，因为它们在无脊椎动物中这样。这种在有丝分裂活性的组织中的持久性也表明Notch可能参与调节细胞增殖。与该概念一致的是与Notch-1的胞质结构域，并且在小鼠中，Notch相关的int-3基因座(其是病毒诱导的肿瘤中小鼠乳腺肿瘤病毒的常见整合位点)的失调表达相关的致癌表型(Jhappan等人,1992,Genes Dev.6:345-355；Robbins等人,1992,J.Virol.66:2594-2599)。

在包括正常和肿瘤性宫颈和结肠组织两者在内的成体组织切片上进行了人Notch-1和Notch-2表达的其他研究。Notch-1和Notch-2似乎以重叠模式在已检查的正常组织的鳞状上皮内的分化细胞群体中表达，并且在正常柱状上皮细胞中明显不表达，除了在一些前体细胞中外。两种蛋白质都在新生物形成中表达，在从相对良性鳞状转移到柱状上皮被这些肿瘤代替的癌性侵入性腺癌的情况下表达(Gray等人,1999,Am.J.Pathol.154:785-794；Zagouras等人,1995,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:6414-6418)。

2.1.4.造血作用中的Notch功能

人CD34+前体中Notch-1mRNA表达的证据已致使对造血作用中Notch信号传导的作用的推测(Milner等人,1994,Blood 3:2057-62)。这进一步得到Notch-1和-2蛋白存在于造血前体中，以及更高的量存在于T细胞，B细胞和单核细胞中的证明，以及得到在造血基质中的Jagged-1蛋白的证明支持(Ohishi等人,2000,Blood 95:2847-2854；Varnum-Finney等人,1998,Blood 91:4084-91；Li等人,1998,Immunity 8:43-55)。

Notch信号传导的生理学作用的最清楚的证据已经来自T细胞发育的研究，其显示活化的Notch-1抑制B细胞成熟但允许T细胞成熟(Pui等人,1999,Immunity 11:299-308)。相比之下，Notch-1的失活或通过敲除HES-1抑制Notch介导的信号传导抑制T细胞发育，但允许B细胞成熟(Radtke等人,1999,Immunity 10:47-58；Tomita等人,1999,Genes Dev.13:1203-10)。Notch-1对B和T细胞发育的这些相反作用提高了Notch-1通过共同的淋巴样祖细胞调节命运决定的可能性。

在转基因小鼠中的其他研究已经表明，活化的Notch-1影响呈现CD4对CD8表型以及αβ对γΔ细胞命运的细胞的比例(Robey等人,1996,Cell 87:483-92；Washburn等人,1997,Cell 88:833-4)。虽然这可以反映由共同前体对命运决定的影响，但更近期的研究已经表明这些作用可能源自Notch-1的抗凋亡作用，其使否则会死亡的分化T细胞能够存活(Deftos等人,1998,Immunity 9:777-86；Jehn等人,1999,J.Immunol.162:635-8)。

支持Notch信号传导在髓细胞生成中的关键作用的证据不太清楚。涉及Notch-1的过表达或失活的体内研究没有鉴定Notch-1信号传导对成熟髓样要素的发育的显著影响，尽管对T和B细胞发育具有深远的影响(Pui等人,1999,Immunity 11:299-308；Radtke等人,1999,Immunity 10:547-58)。然而，体外研究已经证明组成型活性Notch-1形式对髓细胞生成的影响。Notch-1的活化形式的组成型过表达抑制鼠32D细胞的G-CSF诱导的粒细胞分化(Milner等人,1996,Proc Natl Acad Sci U.S.A.93:13014-9)。更近期的研究表明，Notch-1的组成型活性胞内结构域的过表达抑制分离的鼠造血前体的分化，并增强早期前体细胞的产生，包括体内再增殖细胞(Milner等人,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:13014-13019；Bigas等人,1998,J.Mol.Cell.Biol.18:2324-2333)。因此，缺乏Notch-1对成熟髓样要素的体内产生的可鉴定的影响可以源自由于其他因素，如细胞因子所致的补偿效应，所述细胞因子可掩盖Notch活化在不太成熟的前体中的作用。

研究还表明，分离的造血前体细胞的分化可以通过配体诱导的Notch信号传导而受到抑制。鼠骨髓前体细胞(lin-Sca-1+c-kit+)与表达人Jagged-1的3T3细胞的共培养导致原始前体细胞群体形成的2至3倍增加(Varnum-Finney等人,1998,Blood 91:4084-4991；Jones等人,1998,Blood 92:1505-11)。用包被有人Jagged-1的纯化的胞外结构域的珠粒温育分选的前体也导致前体细胞的增强的产生(Varnum-Finney等人,1998,Blood 91:4084-91)。

在人CD34+细胞的研究中，Notch-1的胞内结构域的表达或暴露于过表达Jagged-2的细胞也导致增强的前体细胞的产生和CD34表达的延长的维持(Carlesso等人，1999，Blood 93:838-48)。在另一项研究中，Jagged-1表达细胞对CD34+细胞的影响受到培养物中存在的细胞因子的影响；在不存在添加的生长因子的情况下，与细胞结合的Jagged-1的相互作用导致维持在非增殖，未分化状态的CD34+细胞，而添加c-kit配体导致红系集落形成细胞的2倍增加(Walker等人，1999，Stem Cells 17:162-71)。

更成熟的髓样要素的研究也表明Notch信号在调节其细胞命运决定中的潜在作用。在那些研究中，固定化的，截短的Delta-1抑制CD14+单核细胞分化为巨噬细胞，并在特异性细胞因子存在下诱导凋亡(Ohishi等人，2000，Blood 95:2847-2854)。此外，配体诱导的Notch信号转导允许在合适的细胞因子刺激的情况下单核细胞分化为树突细胞。因此，如在其他发育系统中观察到的，Notch信号传导似乎抑制沿着特定途径的分化，从而允许细胞保持未分化或沿着未抑制的默认途径分化。

已经表明了Notch信号传导在许多发育系统中在细胞命运决定中起主要作用。已知进化上保守的Notch跨膜受体在分化，增殖和凋亡事件中起作用。一般来说，Notch信号传导抑制沿着特定途径的分化，从而允许细胞保持未分化或响应于特定环境因素沿着替代途径分化。Notch信号传导在受体配体相互作用后诱导，引起蛋白水解切割和释放活性胞内结构域，其被转运至细胞核并与许多下游靶标(包括转录调节因子RBP-Jκ)相互作用。目前，已经在脊椎动物中鉴定了4个Notch基因的侧向同源物(Notch-1-4)。Notch的配体也是跨膜蛋白，包括Jagged-1和-2，以及Delta-1，-2和-3。人CD34+前体中Notch-1mRNA表达的证据已导致对血细胞生成中Notch信号传导的作用的推测。进一步的研究已经证明造血前体中，以及以更高的量在T细胞，B细胞和单核细胞中的Notch-1和-2蛋白，以及显示Jagged-1在造血基质中表达。Notch信号传导的生理学作用的最清楚的证据已经来自T细胞发育的研究，其中Notch-1介导的信号传导是T细胞发育需要的，并且影响CD4/CD8和αβ/γΔ细胞命运决定，并且Notch-1的组成型活性形式诱导T细胞淋巴瘤。此外，组成型活性Notch-1形式的过表达抑制B细胞成熟，表明Notch-1可以通过共同的淋巴样祖细胞调节命运决定。支持Notch信号在髓细胞生成中的关键作用的证据不太清楚。活化的Notch-1形式的组成型过表达抑制32D细胞的G-CSF诱导的粒细胞分化和分离的造血前体的分化。前体细胞的分化也被配体诱导的Notch信号传导抑制。鼠骨髓前体细胞(sca-1+lin-c-kit+)与表达人Jagged-1的3T3细胞层的共培养或用包被有人Jagged-1的纯化胞外结构域的珠粒温育分选的前体导致原始前体细胞群体的形成的2-3倍增加。发现Notch配体Delta-1的固定化的截短形式抑制分离的前体的分化，允许sca-1+lin-细胞数量的显著增加。

2.2发育期间的细胞分化

控制多细胞生物体(包括人)的个体发育的发育过程取决于信号传导途径之间的相互作用，其逐渐缩小细胞从原始全能干细胞到终末分化的成熟细胞的发育潜力，所述终末分化的成熟细胞执行特定的功能，如心脏细胞或神经细胞。

受精卵是所有其他细胞谱系来源的细胞，即最终的干细胞。随着发育进行，早期胚胎细胞响应生长和分化信号，其逐渐缩小细胞的发育潜能，直到细胞达到发育成熟，即是终末分化的。这些终末分化的细胞具有特化的功能和特征，并且代表前体细胞分化成特定细胞的多步骤过程的最后一步。

在细胞分化中从一个步骤到下一步骤的转变由特定的生物化学机制控制，所述生物化学机制逐渐控制进展直到达到成熟。显然，组织和细胞的分化是一个逐步的过程，其遵循特定的步骤，直到达到终末分化状态。

原肠胚形成，早期胚胎细胞团的形态发生运动，导致形成三个不同的生殖细胞层，外胚层，中胚层和内胚层。由于每个生殖细胞层中的细胞对各种发育信号响应，产生由特定分化细胞组成的特定器官。例如，表皮和神经系统从外胚层衍生的细胞发育、呼吸系统和消化道从内胚层衍生的细胞发育，并且中胚层来源的细胞发育成结缔组织、造血系统、泌尿生殖系统、肌肉和大多数内部器官的部分。

神经嵴来源于外胚层，并且是产生非常大且复杂数目的分化细胞类型的细胞团，包括外周神经系统、色素细胞、肾上腺髓质和头部软骨的某些区域。

神经嵴细胞的多能性是完善建立的(LeDouarin等人,1975,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72:728-732)。单个神经嵴细胞可以分化成几种不同的细胞类型。

表皮由若干细胞层组成，其界定从未分化的、有丝分裂活性的基底细胞至终末分化的非分裂的角质形成细胞的分化谱系。

内胚层是为成体内的两个管做衬里的组织来源。消化管延伸穿过身体的整个长度。消化管不仅引起消化道，而且引起例如肝、胆囊和胰腺。第二个管、呼吸管、形成肺和咽的一部分。咽产生扁桃体、甲状腺、胸腺和甲状旁腺。

中胚层的起源(其也已经称为中胚层生成(mesengenic)过程)产生非常大量的内部组织，其覆盖外胚层壁与消化道和呼吸道管之间的所有器官。

胚胎发育产生完全形成的生物体。限定每个器官的细胞边界的形态学过程不仅包括增殖和分化，而且包括凋亡(程序性细胞死亡)。例如，在神经系统中，约50％的神经元在胚胎发生期间经历程序性细胞死亡。

在幼年或成年个体中，组织的维持，无论在正常生活期间还是对损伤和疾病的应答，均取决于器官从能够响应特定发育信号的前体细胞的补充。

通过分化未成熟细胞的成人细胞更新的最已知的实例是造血系统。在这里，发育不成熟的前体(造血干细胞和祖细胞)响应分子信号，逐渐形成改变的血液和淋巴样细胞类型。

在造血发育期间，多能干细胞的后代逐渐丧失其增殖潜力和自我更新的能力，并对给定的分化途径表现出更大的定型。调节对各种造血谱系的这种定型的因素不被理解，但认为包括随机过程和与可溶性和细胞结合的细胞因子的相互作用(Fairbairn等人,1993,Cell 4:823-32；Ogawa,1993,Blood 81:2844-53；Metcalf,1989,Nature 339:27-30；Metcalf,1993,Blood.82:3515-23；Goldsmith等人,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.95:7006-11；Socolovsky等人,1997,J.Biol.Chem.272:14009-12)。

虽然造血系统是最理解的自我更新的成体细胞系统，但认为大多数(或许是所有)成体器官都含有前体细胞，其在正确的情况下可被触发以补充成体组织。例如，上面已经描述了神经嵴细胞的多能性。成年肠含有补充分化组织的不成熟前体。肝具有再生的能力，因为它含有肝的未成熟前体；皮肤更新自身等。通过中胚层生成过程，大多数中胚层衍生物通过前体的分化连续补充。此类修复重演了胚胎谱系并且包括涉及多能祖细胞的分化途径。

间充质祖细胞是对特定信号响应并采用特定谱系的多能细胞。例如，响应骨形态发生因子，间充质祖细胞采用骨形成谱系。例如，响应损伤，中胚层祖细胞可以迁移到合适的位置，繁殖并对局部分化因子反应，因此采用不同的分化途径。

已经提出，在成年人中仅观察到有限的组织修复的原因是因为存在太少的能采用特异性分化谱系的祖细胞。显然，如果这些细胞可以通过在培养物中使其永生化来扩增，则可以通过移植培养的细胞来促进组织修复。然而，二倍体细胞通常在体外具有有限的增殖能力。在初始培养后，细胞经历一系列快速循环，其减慢直到群体经历生长停滞，其是有丝分裂的G1/S期或G2/M期阻断的结果(Derventz等人，1996，Anticancer Res.16:2901-2910)。例如，在有限数目的分裂后，人成纤维细胞由于细胞衰老而进入非复制状态。当某些病毒癌基因在成纤维细胞中表达时，复制寿命延长，但是细胞仍然进入称为“危机”状态的非复制状态(Wei和Sedivy，1999，Exp Cell Res 253:519-522)。细胞在达到生长停滞期之前经历的细胞周期的数量取决于细胞类型；对于人细胞，数量通常在30和60之间(Derventz等人，1996，Anticancer Res.16:2901-2910及其中引用的参考文献)。因此，离体使多能或多能细胞(如期望类型的干细胞或祖细胞)永生化的过程将导致所需细胞类型的更快速增殖并允许更快速的治疗损伤或创伤。此外，该能力将产生治疗许多人疾病的潜力，并且可以避免组织排斥而不需要免疫抑制剂。

3.发明内容

本文中描述了用于扩增造血前体细胞的方法，所述方法包括在存在一种或多种激动剂的情况下培养所述造血前体细胞，从而产生扩增的造血前体细胞群体，所述激动剂是(a)(i)Notch 1激动剂、(ii)Notch 2激动剂或(iii)Notch 1激动剂和Notch 2激动剂，以及(b)一种或多种生长因子；其中所述Notch 1激动剂是结合Notch 1的固定化抗体，或其固定化抗原结合片段；并且所述Notch 2激动剂是结合Notch 2的固定化抗体，或其固定化抗原结合片段。在某些实施方案中，一种或多种激动剂处于在造血前体细胞中将Notch信号传导途径活化水平维持于亚最大水平的量。

本文中描述了用于扩增造血前体细胞的方法，所述方法包括在存在一种或多种激动剂的情况下培养所述造血前体细胞，从而产生扩增的造血前体细胞群体，所述激动剂是(a)(i)Notch 1激动剂、(ii)Notch 2激动剂或(iii)Notch 1激动剂和Notch 2激动剂，以及(b)一种或多种生长因子；其中所述Notch 1激动剂是结合Notch 1的固定化抗体，或其抗原结合片段；并且所述Notch 2激动剂是结合Notch 2的固定化抗体，或其抗原结合片段，所述方法还包括在所述培养步骤：检测或测量造血前体细胞的Notch 1表达和/或Notch 2表达的第一步骤，其中所述培养步骤中使用的所述一种或多种激动剂是显示为在所述第一步骤中检测或表达的Notch横向同源物的激动剂。

本文中描述了用于扩增造血前体细胞的方法，所述方法包括在存在一种或多种激动剂的情况下培养所述造血前体细胞，从而产生扩增的造血前体细胞群体，所述激动剂是(a)(i)Notch 1激动剂、(ii)Notch 2激动剂或(iii)Notch 1激动剂和Notch 2激动剂，以及(b)一种或多种生长因子；其中所述Notch 1激动剂是结合Notch 1的固定化抗体，或其抗原结合片段；并且所述Notch 2激动剂是结合Notch 2的固定化抗体，或其抗原结合片段，所述方法还包括重复检测或测量所述培养步骤期间由所述造血前体细胞的Notch 1和Notch 2表达，并且使用所述培养步骤中的所述一种或多种激动剂，所述激动剂是通过紧邻在先的检测或测量步骤显示为由所述造血前体细胞表达的所述Notch横向同源物的激动剂。

在某些实施方案中，所述培养持续一定时段，超出所述时段，不在存在(a)(i)所述Notch 1激动剂、(ii)所述Notch 2激动剂或(iii)所述Notch 1激动剂和所述Notch 2激动剂，以及(b)所述生长因子的情况下培养的造血前体细胞停止增殖并且分化或死亡。

在具体的实施方案中，在存在Notch 1激动剂和Notch 2激动剂的情况下进行所述培养。在具体的实施方案中，在存在Notch 1激动剂的情况下进行所述培养。在具体的实施方案中，在存在Notch 2激动剂的情况下进行所述培养。

在某些实施方案中，所述造血前体细胞获自骨髓、脐带血、胎盘血或瓦顿氏凝胶。在某些实施方案中，所述造血前体细胞获自胎儿或新生儿血液。

在某些实施方案中，在所述培养期间，所述Notch 2激动剂与所述Notch 1激动剂的重量比率是150:1；140:1；130:1；120:1；110:1；100:1；90:1；80:1；70:1；60:1；50:1；40:1；30:1；25:1；24:1；23:1；22:1；21:1；20:1；19:1；18:1；17:1；16:1；15:1；14:1；13:1；12:1；11:1；10:1；9:1；8:1；7:1；6:1；5:1；4:1；3:1；2:1；1.5:1；或1.25:1。在具体的实施方案中，所述Notch 2激动剂处于0.1μg/ml至50μg/ml的浓度。在具体的实施方案中，所述Notch 1激动剂处于0.005μg/ml至30μg/ml的浓度。在具体的实施方案中，所述Notch 2激动剂处于20μg/ml的浓度。在具体的实施方案中，所述Notch 1激动剂处于2.5μg/ml，10μg/ml或0.15μg/ml的浓度。在具体的实施方案中，所述Notch 2激动剂处于10μg/ml的浓度。在具体的实施方案中，所述Notch 1激动剂处于0.02μg/ml的浓度。

在某些实施方案中，所述一种或多种生长因子是白介素3(IL-3)、白介素-6(IL-6)、血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)和Flt-3配体。在具体的实施方案中，IL-3处于10ng/ml的浓度。在具体的实施方案中，IL-3、IL-6、TPO、SCF和Flt-3配体中的一种或多种处于50ng/ml的浓度。

在某些实施方案中，所述培养进行7-8天。在某些实施方案中，所述培养进行至少5周。在某些实施方案中，所述培养进行至少6周。

在某些实施方案中，本文中描述了用于扩增造血前体细胞的方法，所述方法包括在存在一种或多种激动剂的情况下培养所述造血前体细胞，从而产生扩增的造血前体细胞群体，所述激动剂是(a)(i)Notch 1激动剂、(ii)Notch 2激动剂或(iii)Notch 1激动剂和Notch 2激动剂，以及(b)一种或多种生长因子；其中所述Notch 1激动剂是结合Notch 1的固定化抗体，或其抗原结合片段；并且所述Notch 2激动剂是结合Notch 2的固定化抗体，或其抗原结合片段，所述方法还包括重复测量所述培养步骤期间由所述造血前体细胞的Notch 1和Notch 2表达，并且使用所述培养步骤中的所述一种或多种激动剂，所述激动剂是显示为在所述培养期的前24-72小时中由所述造血前体细胞表达的Notch横向同源物的激动剂。

在某些实施方案中，本文中描述了用于扩增造血前体细胞的方法，所述方法包括在存在一种或多种激动剂的情况下培养所述造血前体细胞，从而产生扩增的造血前体细胞群体，所述激动剂是(a)(i)Notch 1激动剂、(ii)Notch 2激动剂或(iii)Notch 1激动剂和Notch 2激动剂，以及(b)一种或多种生长因子；其中所述Notch 1激动剂是结合Notch 1的固定化抗体，或其抗原结合片段；并且所述Notch 2激动剂是结合Notch 2的固定化抗体，或其抗原结合片段，所述方法还包括重复测量所述培养步骤期间由所述造血前体细胞的Notch 1和Notch 2表达，并且使用所述培养步骤中的所述一种或多种激动剂，所述激动剂是显示为在所述培养期的中间24-72小时中由所述造血前体细胞表达的Notch横向同源物的激动剂。

在某些实施方案中，本文中描述了用于扩增造血前体细胞的方法，所述方法包括在存在一种或多种激动剂的情况下培养所述造血前体细胞，从而产生扩增的造血前体细胞群体，所述激动剂是(a)(i)Notch 1激动剂、(ii)Notch 2激动剂或(iii)Notch 1激动剂和Notch 2激动剂，以及(b)一种或多种生长因子；其中所述Notch 1激动剂是结合Notch 1的固定化抗体，或其抗原结合片段；并且所述Notch 2激动剂是结合Notch 2的固定化抗体，或其抗原结合片段，所述方法还包括重复测量所述培养步骤期间由所述造血前体细胞的Notch 1和Notch 2表达，并且使用所述培养步骤中的所述一种或多种激动剂，所述激动剂是显示为在所述培养期的最后24-72小时中由所述造血前体细胞表达的Notch横向同源物的激动剂。

在某些实施方案中，本文中描述了用于扩增造血前体细胞的方法，所述方法包括在存在一种或多种激动剂的情况下培养所述造血前体细胞，从而产生扩增的造血前体细胞群体，所述激动剂是(a)(i)Notch 1激动剂、(ii)Notch 2激动剂或(iii)Notch 1激动剂和Notch 2激动剂，以及(b)一种或多种生长因子；其中所述Notch 1激动剂是结合Notch 1的固定化抗体，或其抗原结合片段；并且所述Notch 2激动剂是结合Notch 2的固定化抗体，或其抗原结合片段，所述方法还包括重复测量所述培养步骤期间由所述造血前体细胞的Notch 1和Notch 2表达，并且使用所述培养步骤中的所述一种或多种激动剂，所述激动剂是显示为在所述培养期的前三分之一中由所述造血前体细胞表达的Notch横向同源物的激动剂。

在某些实施方案中，本文中描述了用于扩增造血前体细胞的方法，所述方法包括在存在一种或多种激动剂的情况下培养所述造血前体细胞，从而产生扩增的造血前体细胞群体，所述激动剂是(a)(i)Notch 1激动剂、(ii)Notch 2激动剂或(iii)Notch 1激动剂和Notch 2激动剂，以及(b)一种或多种生长因子；其中所述Notch 1激动剂是结合Notch 1的固定化抗体，或其抗原结合片段；并且所述Notch 2激动剂是结合Notch 2的固定化抗体，或其抗原结合片段，所述方法还包括重复测量所述培养步骤期间由所述造血前体细胞的Notch 1和Notch 2表达，并且使用所述培养步骤中的所述一种或多种激动剂，所述激动剂是显示为在所述培养期的中间三分之一中由所述造血前体细胞表达的Notch横向同源物的激动剂。

在某些实施方案中，本文中描述了用于扩增造血前体细胞的方法，所述方法包括在存在一种或多种激动剂的情况下培养所述造血前体细胞，从而产生扩增的造血前体细胞群体，所述激动剂是(a)(i)Notch 1激动剂、(ii)Notch 2激动剂或(iii)Notch 1激动剂和Notch 2激动剂，以及(b)一种或多种生长因子；其中所述Notch 1激动剂是结合Notch 1的固定化抗体，或其抗原结合片段；并且所述Notch 2激动剂是结合Notch 2的固定化抗体，或其抗原结合片段，所述方法还包括重复测量所述培养步骤期间由所述造血前体细胞的Notch 1和Notch 2表达，并且使用所述培养步骤中的所述一种或多种激动剂，所述激动剂是显示为在所述培养期的最后三分之一中由所述造血前体细胞表达的Notch横向同源物的激动剂。

在某些实施方案中，本文中公开的方法还包括通过评估Hes1表达测量造血前体细胞中的Notch信号传导途径活化。

在某些实施方案中，所述一种或多种激动剂各自是单克隆抗体。在某些实施方案中，所述一种或多种激动剂各自是Fv、Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fc或单链Fv片段(scFv)。在具体的实施方案中，结合Notch 1的所述抗体或其抗原结合片段结合Notch 1的胞外EGF重复结构域。在更具体的实施方案中，结合Notch 1的所述抗体或其抗原结合片段结合Notch 1的EGF样重复序列1-6。在具体的实施方案中，结合Notch 2的所述抗体或其抗原结合片段结合Notch 2的胞外EGF重复结构域。在某些实施方案中，所述一种或多种激动剂各自是人抗体、人源化抗体、合成抗体或嵌合抗体。

在某些实施方案中，其中在Notch 1激动剂和Notch 2激动剂的存在下进行培养，并且在第一固相上固定化所述Notch 1激动剂。在具体的实施方案中，其中在Notch 1激动剂和Notch 2激动剂的存在下进行培养，并且在第一固相上固定化所述Notch 1激动剂，在第二固相上固定化所述Notch 2激动剂，所述第二固相不是所述第一固相。在具体的实施方案中，其中在Notch 1激动剂和Notch 2激动剂的存在下进行培养，并且在第一固相上固定化所述Notch 1激动剂，在第一固相上固定化所述Notch 2激动剂。在具体的实施方案中，所述第一固相是组织培养皿或烧瓶的表面。在更具体的实施方案中，所述第一固相是组织培养皿或烧瓶的表面，并且所述第二固相是珠粒。在更具体的实施方案中，所述第一固相是珠粒，并且所述第二固相是组织培养皿或烧瓶的表面。

在某些实施方案中，所述Notch 1激动剂能够克服在表达Notch 1和Delta的细胞系中的Notch 1的顺式抑制。在某些实施方案中，所述Notch 1激动剂以比其结合Notch 2更大的亲和力结合Notch 1。在某些实施方案中，所述Notch 1激动剂基本上不表现出对Notch2的结合。在某些实施方案中，所述Notch 2激动剂以比其结合Notch 1更大的亲和力结合Notch 2。在某些实施方案中，所述Notch 2激动剂基本上不表现出对Notch 1的结合。

在某些实施方案中，本文中描述了用于扩增造血前体细胞的方法，所述方法包括在存在一种或多种激动剂的情况下培养造血干细胞，从而产生扩增的造血干细胞群体，所述激动剂是(a)(i)Notch 1激动剂、(ii)Notch 2激动剂或(iii)Notch 1激动剂和Notch 2激动剂，以及(b)一种或多种生长因子；其中所述Notch 1激动剂是结合Notch 1的固定化抗体，或其抗原结合片段；并且所述Notch 2激动剂是结合Notch 2的固定化抗体，或其抗原结合片段，所述方法在所述培养步骤前还包括检测或测量由所述造血前体细胞的Notch 1表达和/或Notch 2表达的第一步骤，其中如果表达Notch 1，则在所述培养步骤中使用所述Notch 1激动剂。

在某些实施方案中，本文中描述了用于扩增造血前体细胞的方法，所述方法包括在存在一种或多种激动剂的情况下培养所述造血前体细胞，从而产生扩增的造血前体细胞群体，所述激动剂是(a)(i)Notch 1激动剂、(ii)Notch 2激动剂或(iii)Notch 1激动剂和Notch 2激动剂，以及(b)一种或多种生长因子；其中所述Notch 1激动剂是结合Notch 1的固定化抗体，或其抗原结合片段；并且所述Notch 2激动剂是结合Notch 2的固定化抗体，或其抗原结合片段，所述方法在所述培养步骤前还包括检测或测量由所述造血前体细胞的Notch 1表达和/或Notch 2表达的第一步骤，其中如果表达Notch 2，则在所述培养步骤中使用所述Notch 2激动剂。

在某些实施方案中，本文中描述了用于扩增造血前体细胞的方法，所述方法包括在存在一种或多种激动剂的情况下培养所述造血前体细胞，从而产生扩增的造血前体细胞群体，所述激动剂是(a)(i)Notch 1激动剂、(ii)Notch 2激动剂或(iii)Notch 1激动剂和Notch 2激动剂，以及(b)一种或多种生长因子；其中所述Notch 1激动剂是结合Notch 1的固定化抗体，或其抗原结合片段；并且所述Notch 2激动剂是结合Notch 2的固定化抗体，或其抗原结合片段，所述方法在所述培养步骤前还包括检测或测量由所述造血前体细胞的Notch 1表达和/或Notch 2表达的第一步骤，其中如果表达Notch 1和Notch 2两者，则在所述培养步骤中使用所述Notch 1激动剂和Notch 2激动剂。

在某些实施方案中，本文中描述了用于扩增造血前体细胞的方法，所述方法包括在存在一种或多种激动剂的情况下培养所述造血前体细胞，从而产生扩增的造血前体细胞群体，所述激动剂是(a)(i)Notch 1激动剂、(ii)Notch 2激动剂或(iii)Notch 1激动剂和Notch 2激动剂，以及(b)一种或多种生长因子；其中所述Notch 1激动剂是结合Notch 1的固定化抗体，或其抗原结合片段；并且所述Notch 2激动剂是结合Notch 2的固定化抗体，或其抗原结合片段，所述方法还包括重复测量所述培养步骤期间由所述造血前体细胞的Notch 1和Notch 2表达，其中在所述培养步骤期间，所述检测或测量步骤的情况显示所述造血前体细胞基本上不表达Notch 2，并且在此种情况后，在所述培养中使用Notch 1激动剂而非Notch 2激动剂。

在具体的实施方案中，在存在Notch 1激动剂的情况下进行培养，其中当在存在所述Notch 1激动剂的情况下进行培养时，Notch 2激动剂是不存在的。在具体的实施方案中，在存在Notch 2激动剂的情况下进行培养，当在存在所述Notch 2激动剂的情况下进行所述培养时，Notch 1激动剂是不存在的。

在具体的实施方案中，所述造血前体细胞是人的。在具体的实施方案中，Notch 1和Notch 2是人Notch 1和Notch 2。在具体的实施方案中，所述生长因子是人生长因子。

在具体的实施方案中，所述造血前体细胞是造血干细胞。在具体的实施方案中，所述造血前体细胞是造血干细胞和造血祖细胞。在具体的实施方案中，所述造血前体细胞是造血祖细胞。在具体的实施方案中，所述造血前体细胞是短期骨髓移植细胞。在具体的实施方案中，本文中描述的方法还产生能够迁移至胸腺并且产生成熟T细胞的早期T细胞前体。

先前已经显示，通过将Delta1的胞外结构域(Delta1^ext-IgG)固定化到塑料表面诱导的Notch信号传导在来自鼠骨髓或人脐带血的纯化的造血祖先的离体培养后产生增加数量的造血祖细胞，包括短期再增殖细胞。尽管该培养系统已经用于产生在临床环境中改善脐带血移植的产品，但是固定化的Delta1^ext-IgG可以高度活化由培养的HSC表达的Notch 1和Notch 2受体两者，从而也诱导很可能对干细胞自我更新抑制性的分化程序。

本公开提供了低Notch信号强度的维持导致干细胞的改善的扩增和移植。由于指示Notch信号传导的定量差异而不是定性差异，Notch 1和/或Notch 2的活化可用于产生所需水平的Notch信号传导。此外，因为Notch 1和Notch 2受体表达在培养期间彼此独立地发生，可以基于随时间的改变的表达水平来选择不同的Notch激动剂。在这些实施方案中，Notch信号传导可以归因于Notch 1激动剂；Notch 2激动剂；或Notch 1激动剂和Notch 2激动剂的存在。因此，如本文所述，应当维持低水平的Notch信号强度，无论是通过活化Notch1、Notch 2还是Notch 1和Notch 2。

本公开还提供了低Notch信号强度(其可以由干细胞中的Notch 2介导)的维持以及Notch 1(其表达在Notch活化后的培养期间增加)的低活化导致干细胞的扩增和移植的改善。结果表明通过选择性侧向同源物活化仔细滴定干细胞中的Notch信号是有益的。本公开显示当对Notch 1或Notch 2受体特异的单克隆抗体固定化于塑料表面时，在与单独用Delta1^ext-IgG，Notch 2激动剂或对照配体的培养物中小于1倍增加相比，具有低量的Notch1激动剂与相对更高量的Notch 2激动剂的组合的孔中的鼠骨髓高度富集的干(SK-SLAM)细胞的培养物在培养7-8天后导致SK-SLAM细胞(Sca-1⁺c-kit⁺CD150⁺CD48^-CD11b^-)的2倍增加产生。因此，通过使用Notch 1激动剂、Notch 2激动剂或Notch 1激动剂和Notch 2激动剂的Notch侧向同源物特异性活化提供了扩增干细胞(包括造血干细胞)的新方式。

一个具体实施方案包括用于产生永生化前体细胞群体的方法，所述方法包括在存在Notch 1激动剂、Notch 2激动剂或Notch 1激动剂和Notch 2激动剂(以及，在具体的实施方案中，一种或多种生长因子)的情况下将非永生化前体细胞培养一定时段，使得所述前体细胞在所述时段期间增殖但不终末分化，从而产生永生化前体细胞群体，超出所述时段，不在存在所述Notch 1激动剂、所述Notch 2激动剂或所述Notch 1激动剂和所述Notch 2激动剂(以及，在具体的实施方案中，一种或多种生长因子)的情况下的前体细胞类型的细胞停止增殖和/或分化或死亡。

在另一个实施方案中，在培养期间，以高于Notch 1激动剂的浓度提供Notch 2激动剂。

在另一个实施方案中，在所述培养期间，所述Notch 2激动剂与所述Notch 1激动剂的比率是150:1；140:1；130:1；120:1；110:1；100:1；90:1；80:1；70:1；60:1；50:1；40:1；30:1；25:1；24:1；23:1；22:1；21:1；20:1；19:1；18:1；17:1；16:1；15:1；14:1；13:1；12:1；11:1；10:1；9:1；8:1；7:1；6:1；5:1；4:1；3:1；2:1；1.5:1；或1.25:1。在一个优选的实施方案中，比率是重量比率。

在另一个实施方案中，在培养期间，Notch 2激动剂处于0.1μg/ml；1μg/ml；5μg/ml；10μg/ml；15μg/ml；20μg/ml；25μg/ml；30μg/ml；35μg/ml；40μg/ml；45μg/ml；50μg/ml；55μg/ml；60μg/ml；65μg/ml；70μg/ml；75μg/ml；80μg/ml；85μg/ml；90μg/ml；95μg/ml；或100μg/ml的浓度。

在另一个实施方案中，在培养期间，Notch 1激动剂处于0.005μg/ml；0.05μg/ml；0.5μg/ml；1μg/ml；5μg/ml；10μg/ml；15μg/ml；20μg/ml；25μg/ml；30μg/ml；35μg/ml；40μg/ml；45μg/ml；50μg/ml；55μg/ml；或60μg/ml的浓度。

在另一个实施方案中，在培养期间，Notch 2激动剂处于20μg/ml的浓度，并且Notch 1激动剂处于2.5μg/ml、10μg/ml或0.15μg/ml的浓度。

在另一个实施方案中，在培养期间，Notch 2激动剂处于10μg/ml的浓度，并且Notch 1激动剂处于0.02μg/ml的浓度。

在另一个实施方案中，一种或多种生长因子是IL-3；IL-6；TPO；SCF和Flt-3。

在另一个实施方案中，在培养期间，IL-3处于10ng/ml的浓度。在另一个实施方案中，在所述培养期间，IL-3、IL-6、TPO、SCF和Flt-3配体中的一种或多种处于50ng/ml的浓度。

在另一个实施方案中，在所述时段期间，前体细胞群体基本上不分化。

在另一个实施方案中，前体细胞是干细胞。在另一个实施方案中，前体细胞是祖细胞。在另一个实施方案中，干细胞是造血干细胞(HSC)。在另一个实施方案中，祖细胞是造血祖细胞。在另一个实施方案中，造血干细胞或祖细胞获自骨髓。在另一个实施方案中，造血干细胞或祖细胞获自胎儿或新生儿血液。

在另一个实施方案中，时段是7-8天。在另一个实施方案中，时段是至少5周。在另一个实施方案中，时段是至少6周。

4.附图简述

图1。具有特异性Notch抗体的培养物导致SK-SLAM(Sca-1⁺c-kit⁺CD150⁺CD48^-CD11b^-)细胞的产生增加。每个条表示具有(i)5μg/ml的固定化Delta1^ext-IgG(Delta)，(ii)5μg/ml的固定化的人对照IgG(HuIgG)和指定剂量的固定化的(iii)Notch 2抗体[HMN2-35(MN2)]或(iv)Notch 2和Notch 1抗体[HMN1-12(MN1)](购自Biolegend，San Diego，CA)的单克隆抗体的培养物中SK-SLAM细胞的平均倍数增加的数目。x轴上括号中的数字以μg/ml给出。条是与放置在2个单独实验的培养孔中的SK-SLAM的初始数量相比的平均倍数增加+/-范围。

图2A-D。在具有IL-3(10ng/ml)、IL-6、TPO、SCF和Flt-3配体(全部50ng/ml)的Stemspan中将来自两个不同单位的脐带血CD34⁺细胞培养14天。在存在固定化的retronectin 5μg/ml和(i)固定化Delta1(Delta，2.5μg/ml)，(ii)固定化的抗人Notch 2(αNotch 2，克隆MHN2-25，0.5μg/ml(可购自Biolegend，San Diego，CA))，(iii)固定化的抗人Notch 2 0.5μg/ml与固定化的抗人Notch 1(αNotch1，克隆MHN1-519(购自Biolegend，SanDiego，CA))的组合，或(iv)固定化的对照IgG(IgG)的情况下培养细胞。测定CD34⁺祖细胞的(A)百分比和(B)数目，以及更原始的CD34⁺/90低细胞的(C)比例和(D)数目。x轴上的数字以μg/ml给出。

图3。在如图2中培养14天后，将10,000个脐带血CD34⁺细胞的扩增后代移植到每组6只NSG小鼠的每只中。在移植后两周通过流式细胞术分析来自小鼠的骨髓抽吸物的植入。Notch 1抗体(αN1，克隆MHN1-519(可购自Biolegend，San Diego，CA))和Notch 2抗体(αN2，克隆MHN2-25，0.5μg/ml(可购自Biolegend，San Diego，CA))的组合使得比单独的Delta，IgG或Notch 2抗体显著更高水平的人植入(对于两个脐带血单位分别为p＝0.0024和p＝0.0225)，如通过在2周时骨髓抽吸物中的CD45⁺细胞百分比(y轴)显示。x轴上的数字以μg/ml给出。

图4A-D。特异性Notch抗体上的AGM衍生的CD45⁺/VE-钙粘着蛋白⁺细胞的培养实现LSK-SLAM细胞的产生和多谱系植入。(A)在2.5μg/ml的Delta1^ext-IgG(Delta)，2.5μg/ml的HuIgG和对于Notch 1抗体(MN1或抗N1，克隆HMN1-12(可购自Biolegend，San Diego，CA))或Notch 2抗体(MN2或抗N2，克隆HMN2-35(可购自Biolegend，San Diego，CA))的指定剂量的固定化单克隆抗体上培养5天后产生的通过流式细胞术得到的LSK-SLAM(Sca1+c-kit+CD150+CD48-Gr1-F480-)细胞的数目。每一个AGM当量的输入起始CD45+/VE-钙粘着蛋白+细胞表示细胞数，并且误差条表示所分析的一式三份孔的标准偏差。在图A中培养的细胞的(B)第2周和(C-D)第6周外周血植入，每只小鼠以0.5AGM当量的起始细胞(CD45.2)以3×10⁴挽救CD45.1骨髓细胞移植。显示每个分析小鼠的外周血中占总CD45⁺细胞百分比的％供体植入(CD45.2)，供体髓样植入(Gr1和/或F480)和供体B淋巴样(CD19)/T淋巴样(CD30)植入。x轴上的数字以μg/ml给出。

图5A-D。在具有IL-3(10ng/ml)、IL-6、TPO、SCF和Flt-3配体(全部50ng/ml)的Stemspan中将来自两个不同单位的脐带血CD34⁺细胞培养14天。在存在固定化的retronectin 5μg/ml和(i)固定化的Delta1(Delta，2.5μg/ml)，(ii)固定化的抗人Notch 2(αNotch 2，克隆MHN2-25(可购自Biolegend,San Diego,CA))0.5μg/ml，(iii)固定化的抗人Notch 2 0.5μg/ml与固定化的抗人Notch 1(αNotch 1，克隆MHN1-519(可购自Biolegend，San Diego，CA))组合，或(iv)固定化的对照IgG的情况下培养细胞。测定CD14⁺细胞的(A)百分比和(B)总数两者，也测定CD15⁺细胞的(C)百分比和(D)总数。x轴上的数字以μg/ml给出。

图6A-B。在具有IL-3(10ng/ml)、IL-6、TPO、SCF和Flt-3配体(全部50ng/ml)的Stemspan中将来自两个不同单位的脐带血CD34⁺细胞培养14天。在存在固定化的retronectin 5μg/ml和(i)固定化的Delta1(Delta，2.5μg/ml)，(ii)固定化的抗人Notch 2(αNotch 2，克隆MHN2-25(可购自Biolegend,San Diego,CA))0.5μg/ml，(iii)固定化的抗人Notch 2 0.5μg/ml，与固定化的抗人Notch 1(αNotch 1，克隆MHN1-519(可购自Biolegend，San Diego，CA))的组合，或(iv)固定化的对照IgG(IgG)的情况下培养细胞。测定CD7⁺细胞的(A)百分比和(B)总数两者。x轴上的数字以μg/ml给出。

图7A-B。在具有IL-3(10ng/ml)、IL-6、TPO、SCF和Flt-3配体(全部50ng/ml)的Stemspan中将来自两个单位的合并物的脐带血CD34⁺细胞培养14天。在存在固定化的retronectin 5μg/ml和(i)固定化的Delta1(Delta，2.5μg/ml)，(ii)固定化的抗人Notch 1(aN1，克隆MHN1-519(可购自Biolegend，San Diego，CA))0.02μg/ml，(iii)固定化的抗人Notch 2(aN2，克隆MHN2-25(可购自Biolegend，San Diego，CA))0.5μg/ml与固定化的抗人Notch 1 0.02μg/ml的组合，或(iv)固定化的对照IgG的情况下培养细胞。将10,000个细胞的扩增后代移植到每组5只NSG小鼠的每只中。在移植后2周和移植后8或10周，通过流式细胞术分析骨髓抽吸物的总人(CD45)，淋巴样(CD19)和髓样。显示的是(A)来自2周时实验409的CD45⁺细胞的百分比的结果，如图3中显示，和(B)来自2周时实验414的CD45⁺细胞的百分比的结果，用于比较。x轴上的数字以μg/ml给出。

图8A-B。在两个实验((A)实验409和(B)实验414)中，在具有IL-3(10ng/ml)、IL-6、TPO、SCF和Flt-3配体(全部50ng/ml)的Stemspan中将来自两个单位的合并物的脐带血CD34⁺细胞培养14天。在存在固定化的retronectin 5μg/ml和(i)固定化的Delta1(Delta，2.5μg/ml)，(ii)固定化的抗人Notch 1(αN1，克隆MHN1-519(可购自Biolegend，San Diego，CA))，0.02μg/ml，(iii)固定化的抗人Notch 2(αN2，克隆MHN2-25(可购自Biolegend，SanDiego，CA))0.5μg/ml与固定化的抗人Notch 1 0.02μg/ml的组合，或(iv)固定化的对照IgG(IgG)的情况下培养细胞。在移植后2周和移植后8或10周，通过流式细胞术分析骨髓抽吸物的总人(CD45)，淋巴样(CD19)和髓样。显示的是(A)来自10周时实验409的CD45⁺细胞的百分比的结果，和(B)来自8周时实验414的CD45⁺细胞的百分比的结果。x轴上的数字以μg/ml给出。

图9A-C。在具有IL-3(10ng/ml)、IL-6、TPO、SCF和Flt-3配体(全部50ng/ml)的Stemspan中将来自两个单位的合并物的脐带血CD34⁺细胞培养14天。在存在固定化的retronectin 5μg/ml和(i)固定化的Delta1(Delta，2.5μg/ml)，(ii)固定化的抗人Notch 1(αN1或aN1，克隆MHN1-519(可购自Biolegend，San Diego，CA))0.02μg/ml，(iii)固定化的抗人Notch 2(αN2或aN2，克隆MHN2-25(可购自Biolegend，San Diego，CA))0.5μg/ml与固定化的抗人Notch 1 0.02μg/ml组合，或(iv)固定化对照IgG(IgG)的情况下培养细胞。在移植后2周和移植后8或10周，通过流式细胞术分析骨髓抽吸物的总人(CD45)，淋巴样(CD19)和髓样。显示了(A)对于实验409，在10周后骨髓中CD33⁺细胞的百分比的结果，(B)对于实验414，8周后骨髓中CD33⁺细胞的百分比的结果，和(C)对于实验414，8周后骨髓中CD33⁺和/或CD14⁺/CD15⁺细胞的百分比的结果。x轴上的数字以μg/ml给出。

图10A-C。正常鼠外周血(PB)造血谱系的表面标志物表达，其中将整个Notch 2胞内结构域(ICD)的基因组编码区交换到Notch 1基因座(Notch 1^12/12)，并且将Notch 1ICD交换到Notch 2基因座(Notch 2 ^21/21)中。点图显示用谱系抗体CD3、CD4、CD8(T细胞)、CD19(B细胞)和F4/80，GR1(髓样)染色和FACS分析的来自指定小鼠的PB。显示的结果是对于(A)CD3和CD19表达，(B)CD4和CD8表达和(C)F4/80和GR1表达。角中的数字描绘了该象限内事件的百分比。

图11。分析新鲜分离的脐带血(CB)总CD34⁺或CD34⁺CD90^lo原始亚组的Notch 1(N1)和Notch 2(N2)的细胞表面表达。直方图显示与同种型对照(所有图中最左边的峰)相比，Notch 1或Notch 2抗体染色(所有图中最右边的峰)的相对量。

图12A-B。在存在固定化的Delta1(Delta，2.5μg/ml)和(A)固定化的Notch 1抗体(Notch 1，克隆MHN1-519(可购自Biolegend，San Diego，CA))0.02μg/ml，或(B)固定化的Notch 2抗体(Notch 2，克隆MHN2-25(可购自Biolegend，San Diego，CA))0.5μg/ml的存在下将脐带血CD34⁺细胞培养14天。将10,000个细胞的扩增后代移植到每个NSG小鼠中。在移植后分析骨髓(BM)抽吸物(2-3周)的总人细胞。y轴表示CD45阳性细胞的百分比，指示人细胞的百分比。

图13。人Notch 1的示意图。标记为EGF-N1的线代表用于产生Notch 1抗体克隆MHN1-519(可购自Biolegend，San Diego，CA)的肽的相对位置。标记为NRR-N1的线代表用于产生NRR-N1抗体的肽的相对位置。

图14。在用retronectin和(i)对照(IgG)，(ii)Delta1(Delta)，(iii)Notch 1抗体克隆MHN1-519(EGF-N1)，(iv)NRR-N1，(v)Notch 2抗体克隆MHN2-25(EGF-N2)或(vi)NRR-N2(0.1μg/ml或2.5μg/ml)包被的非组织培养孔上将CB-衍生的CD34⁺细胞温育4小时。使用从收获的细胞分离的RNA产生cDNA。与对照IgG相比，报道了每种培养条件的Hes1的相对表达(y轴，2^ΔΔCt)。x轴上的数字以μg/ml给出。

图15A-B。(A)分选脐带血CD34⁺细胞以分离CD34⁺CD90^lo和CD34⁺CD90^-亚组。将等同数目的细胞转移至用retronectin和(i)人IgG 2.5μg/ml，(ii)Delta1 10μg/ml，(iii)Notch 1抗体克隆MHN1-519(EGF-N1)0.02μg/ml，或(iv)Notch 1抗体克隆MHN1-519，5μg/ml包被的孔，并在具有5GF(IL-3 10ng/ml，IL-6，SCF、Flt-3L，TPO，全部50ng/ml)的Stemspan中温育4小时。收获细胞用于Hes1RT-PCR。与对照IgG相比，报道了每种培养条件的Hes1的相对表达(y轴，2^ΔΔCt)。x轴上的数字以μg/ml给出。(B)在具有固定化的人IgG 2.5μg/ml和retronectin 5μg/ml的情况下在具有5GF的Stemspan中将未分选的脐带血CD34⁺细胞的一部分培养15天。将细胞转移至用retronectin和(i)人IgG 10μg/ml，(ii)Delta1 10μg/ml，或(iii)Notch 1抗体克隆MHN1-519(EGF-N1)5μg/ml包被的新孔，并且温育4小时。收获细胞用于Hes1RT-PCR。与对照IgG相比，报道了每种培养条件的Hes1的相对表达(y轴，2^ΔΔCt)。

图16A-B。将Jurkat细胞与(A)Delta1-myc(25ug/ml)或(B)偶联有PE的Notch 1抗体克隆MHN1-519(EGF-N1)(5ug/ml)温育，其中添加或不添加与人IgG1的Fc部分融合的Delta1(Delta1，小虚曲线，图A和B；无阻断剂，大的虚曲线，图A和B)。使用抗myc抗体9E10检测Delta1-myc。Delta 1-myc的对照(实线，图A)为单独的结合缓冲液。MHN1-519的对照(实线，图B)是非结合小鼠IgG1。

图17A-F。将CHO K1-DLL1细胞与(虚线曲线)或不与(实线曲线)多西环素(Doxycycline)(1μg/ml)温育过夜以诱导DLL1并转移至用(A)无物质，(B)固定化的人IgG(2.5μg/ml)，(C)固定化的Delta1 2.5μg/ml，(D)固定化的Delta1 10μg/ml，(E)固定化的Notch 1抗体克隆MHN1-519(EGF-N1)0.02μg/ml，或(F)固定化的Notch 1抗体克隆MHN1-5195μg/ml包被的孔，全部具有Retronectin(5μg/ml)。2天后，收获细胞，并且通过流式细胞术评估YFP表达。

图18。与PE偶联的人抗Notch 1抗体和与APC偶联的人抗Notch 2抗体用于检测新分离的脐带血CD34+细胞以及在固定化Delta1上培养的那些细胞的Notch表达。对于(i)与PE偶联的抗Notch 1抗体(N1，正方形)，(ii)与APC偶联的抗Notch 2抗体(N2，交叉)，(iii)对照IgG1(G1，菱形)或(iv)对照IgG2a(2A，三角形)，以培养的0至14天的间隔测量平均荧光强度(MFI)。

图19。在存在固定化的retronectin 5μg/ml和(i)固定化的对照IgG(ii)固定化的Delta1(0.5，2.5或10μg/ml)，或(iii)固定化的抗人Notch 1(Notch 1(0.02，0.1，0.5或2.5μg/ml)，克隆MHN1-519(可购自Biolegend，San Diego，CA))的情况下培养来自两个不同单位的脐带血CD34⁺细胞。通过流式细胞术评估共同淋巴样祖细胞(CLP)、CD34⁺/CD38^-/CD7⁺群体。y轴表示第7天的CD34⁺/CD38^-/CD7⁺细胞的总数。x-轴上的数字以μg/ml给出。

图20A-B。在存在固定化的retronectin 5μg/ml和(i)固定化的Delta1 2.5μg/ml，(ii)固定化的对照IgG，(iii)固定化的抗人Notch 1(aN1，克隆MHN1-519(可购自Biolegend，San Diego，CA))0.02μg/ml，或(iv)固定化的抗人Notch 1 0.02μg/ml与抗人Notch 2(aN2，克隆MHN2-25(可购自Biolegend，San Diego，CA))0.5μg/ml的组合的情况下培养来自两个单位的合并物的脐带血CD34⁺细胞。在培养的第14天，将10,000个细胞的扩增后代移植到每组5只NSG小鼠的每只中。在18周后，收获骨髓，并通过流式细胞术评估(A)总人植入(CD45百分比，y-轴)和(B)人T细胞植入(CD3百分比，y-轴)。x轴上的数字以μg/ml给出。

5.缩写和定义

如本文中使用，以下缩写和定义将具有所指示的含义：

ATRA：全反式视黄酸。

BDNF：脑源性神经营养因子

BFU-E：爆发形成单位-红细胞。一种造血祖细胞，其能够在半固体培养基中产生红细胞后代细胞的集落。

CFU或CFU-C：集落形成单位或集落形成单位细胞。能够在半固体培养基中产生后代细胞集落的细胞。

CFU-E/Mega：集落形成单位-红细胞，巨核细胞。一种造血祖细胞，其能够在半固体培养基中产生由红细胞和巨核细胞后代组成的集落。

CFU-Eo：集落形成单位-嗜曙红细胞。一种造血祖细胞，其能够在半固体培养基中产生由嗜曙红细胞后代组成的集落。

CFU-G：集落形成单位-粒细胞。一种造血祖细胞，其能够在半固体培养基中产生由粒细胞(或多形核白细胞)后代组成的集落。

CFU-GM：集落形成单位-粒细胞，巨噬细胞。一种造血祖细胞，其能够在半固体培养基中产生由粒细胞和巨噬细胞后代组成的集落。

CFU-M：集落形成单位巨噬细胞。一种造血祖细胞，其能够在半固体培养基中产生由巨噬细胞后代组成的集落。

CFU-Mega：集落形成单位巨核细胞。一种造血祖细胞，其能够在半固体培养基中产生由巨核细胞后代组成的集落。巨核细胞是血小板的前体。

CFU-S：集落形成单位-脾。具有自我更新能力的多能干细胞，其在接种到致死照射的小鼠中时能够在含有巨核细胞，粒细胞和红细系前体的脾上产生集落(结节)。

CNTF：睫状神经营养因子

EGF：表皮生长因子

EPO：红细胞生成素

FGF-1：成纤维细胞生长因子-1/酸性FGF

FGF-2：成纤维细胞生长因子-2/碱性FGF

FGF-7：成纤维细胞生长因子-7

Flt-3L：flt-3配体

GDNF：胶质细胞系衍生的神经营养因子

GM-CSF：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子

HGF：肝细胞生长因子

HSC：造血干细胞。HSC的定义是功能性的，并且基于移植细胞再增殖已经经过骨髓根除治疗的接受者的造血系统的能力。HSC代表约0.01％的骨髓细胞。它们可以自我更新，并且可以通过它们再生骨髓并产生长期的淋巴和髓细胞生成的能力来测定(Dexter和Allen,1992,Nature 360:709-710)。

HSPC：造血干细胞和祖细胞

HPP-CFC或HPP-混合物：高增殖潜力集落形成细胞，其是未成熟骨髓干细胞。

ICD：胞内结构域

IGF-1：胰岛素样生长因子-1

IL-3：白介素-3

IL-6：白介素-6

IL-7：白介素-7

IL-11：白介素-11

IRES：内部核糖体进入位点

淋巴样干细胞：淋巴样干细胞具有有限的自我更新能力，并且能够再生整个淋巴样谱系和在半固体培养基中产生由所有淋巴样细胞类型组成的集落。鼠淋巴样干细胞通过其CD25的表达来标记。

髓样干细胞：髓样干细胞具有有限的自我更新能力，并且能够再生整个髓样谱系和在半固体培养基中产生由所有髓样细胞类型组成的集落。鼠髓样干细胞通过Gr-1和F4/80的表达来鉴定。

NGF：神经生长因子

NSG小鼠：NOD-scid IL2Rγ无效小鼠

PDGF：血小板衍生生长因子

RAM：Notch的RBPJκ结合结构域

RAR：视黄酸受体

SCF：干细胞因子，也称为c-kit配体或肥大细胞生长因子

TGF-β：转化生长因子-β

TPO：血小板生成素

6.具体实施方式

本公开提供了用于扩增造血干细胞的方法，所述方法包括在存在一种或多种激动剂的情况下培养所述造血干细胞，从而产生扩增的造血干细胞群体，所述激动剂是(a)(i)Notch 1激动剂、(ii)Notch 2激动剂或(iii)Notch 1激动剂和Notch 2激动剂，以及(b)一种或多种生长因子；其中所述Notch 1激动剂是结合Notch 1的固定化抗体，或其固定化抗原结合片段；并且所述Notch 2激动剂是结合Notch 2的固定化抗体，或其固定化抗原结合片段。离体进行本发明的用于扩增前体细胞的方法。

本公开提供了用于产生非终末分化细胞的永生化细胞群体的方法。通过本公开的方法永生化的细胞在下文中称为永生化细胞。具体地，本公开提供了在培养物中将前体细胞(非终末分化细胞)培养一定时段的方法，否则，超出所述时段，细胞将停止增殖、分化和/或死亡，这由于衰老和/或经历导致细胞死亡的危机所致。所述方法包括将细胞暴露于Notch 1激动剂、Notch 2激动剂和/或Notch 1激动剂和Notch 2激动剂。在具体实施方案中，还将细胞暴露于一种或多种促进前体细胞增殖而非分化的生长因子。

本公开还提供了Notch信号传导中的定量差异造成髓样分化延迟。由于指示Notch信号传导的定量差异而非定性差异，Notch 1和/或Notch 2的活化可用于产生所需水平的Notch信号传导。由于Notch 1和Notch 2受体表达在培养期间彼此独立地发生，可以基于随时间改变的表达水平来选择不同的Notch激动剂。此外，Notch 1激动剂、Notch 2激动剂或Notch 1和Notch 2激动剂的量可以基于Notch 1受体表达和Notch 2受体表达来校准。因此，在这些实施方案中，Notch信号传导可以归因于Notch 1激动剂、Notch 2激动剂或Notch1激动剂和Notch 2激动剂的存在。

如本文中所述，应当维持造血干细胞群体的至少一部分的个别细胞中Notch信号强度的低水平(例如通过个别细胞水平上的亚最大Hes1表达测量)，无论是通过活化Notch1、Notch 2或Notch 1和Notch 2。个别造血干细胞中低Notch信号强度的维持支持如本文中所述的扩增造血干细胞的方法，而较高Notch信号强度的诱导会诱导向淋巴样谱系的细胞分化，如分化成Thy1+和CD25+T细胞前体。参见，例如，Dallas等人,J.Exp.Med.,第201卷，2005年5月,第1361-1366页。在整个造血干细胞群体中，在不同造血干细胞中诱导低和高Notch信号强度两者可用于从群体产生造血干细胞和此类淋巴样前体两者。

本公开还提供了用于从较小分化类型产生所需分化细胞类型的方法，包括根据本公开的方法将前体细胞永生化，然后将永生化细胞和/或其后代暴露于促进将前体细胞分化成所需的细胞类型的条件。通过本公开的方法分化的细胞在下文中称为分化细胞。

这些方法可用于产生细胞以再增殖或补充消减的细胞群体，例如重建化学疗法后的造血细胞或在感染人免疫缺陷病毒后的T细胞。也可以使通过本公开的方法永生化或分化的细胞变为重组的，例如以递送所需的基因产物。

在本公开的某些实施方案中，将永生化细胞移植回受试者体内的适当区域，例如永生化的HSC进入受试者的骨髓。在另一个实施方案中，根据本公开的方法或通过本领域中已知的任何方法，通过活化Notch途径和/或通过改变培养细胞的生长因子的组合来分化永生化细胞。在又一个实施方案中，通过Notch 1、Notch 2或Notch 1和Notch 2活化和合适生长因子的组合来对前体干细胞进行同时永生化和分化，然后移植回到受试者中。优选地，在移植入受试者之前灭活Notch 1和/或Notch 2激动剂。

本公开还提供通过本文中所述的方法产生的培养物和HSC。

本公开还进一步提供了试剂盒，其包括用于永生化或永生化和分化细胞的试剂，包括但不限于Notch 1、Notch 2激动剂和生长因子，它们一起能够将暴露于它们的前体细胞永生化。

6.1Notch 1和Notch 2激动剂

本公开的方法包括在存在Notch 1激动剂、Notch 2激动剂或Notch 1激动剂和Notch 2激动剂(以及，在具体的实施方案中，一种或多种生长因子)的情况下将前体细胞永生化(非终末分化的细胞)一定的给定时段。根据需要，Notch 1和/或Notch 2激动剂是促进，即引起或增加Notch途径功能的活化的药剂，其对于Notch 1或Notch 2是特异性的。如本文中所用，“Notch途径功能”应当指由Notch信号传导途径介导的功能，包括但不限于RBP-Jκ或其Hairless果蝇同源物抑制剂的核转位；活化分裂复合物的增强子的bHLH基因，例如Mastermind；对果蝇成神经细胞分离的抑制；Notch与Delta，Jagged/Serrate，Fringe，Deltex或RBP-Jκ/Hairless的抑制剂，或其同源物或类似物的结合。

通过将前体细胞暴露于Notch 1激动剂、Notch 2激动剂或Notch 1激动剂和Notch2激动剂来进行Notch活化。Notch 1的激动剂和Notch 2的激动剂可为但不限于前体细胞被暴露的细胞单层上重组表达为细胞表面分子的可溶性分子，或固定化在固相上的分子。在优选的实施方案中，Notch 1激动剂和/或Notch 2激动剂是固定化的Notch 1和/或Notch 2抗体。在另一个实施方案中，Notch 1激动剂和/或Notch 2激动剂可以从导入前体细胞中的核酸进行重组表达。

在一些实施方案中，通过用固定化在第一固相上的Notch 1激动剂和固定化在第二固相上的Notch 2激动剂培养细胞来扩增细胞，其中第一固相和第二固相是相同的。

在一些实施方案中，通过用固定化在第一固相上的Notch 1激动剂和固定化在第二固相上的Notch 2激动剂培养细胞来扩增细胞，其中第二固相不是第一固相。在一个具体的实施方案中，第一固相和第二固相是不同类型的固相，选自本领域中已知的任何固相，包括但不限于培养皿，培养瓶，培养板，珠粒，颗粒等。在具体实施方案中，第一固相是组织培养皿或烧瓶的表面，并且第二固相是珠粒，例如磁性微珠。在其他具体实施方案中，第一固相是珠粒，例如磁性微珠，并且第二固相是组织培养皿或烧瓶的表面。在其中Notch 1激动剂和Notch 2激动剂固定化在不同固相上的实施方案中，可以同时或依次将前体细胞与Notch 1激动剂和Notch 2激动剂一起培养。

本公开的Notch 1和Notch 2激动剂包括但不限于Notch蛋白及其类似物和衍生物(包括其片段)、作为Notch途径的其他要素的蛋白质及其类似物和衍生物(包括其片段)、针对其的抗体和包含其结合区的此类抗体的片段或其他衍生物、编码蛋白质的核酸和衍生物或类似物的核酸；以及toporythmic蛋白及其衍生物和类似物，其结合Notch蛋白或Notch途径中的其他蛋白或以其他方式与Notch蛋白或Notch途径中的其他蛋白相互作用，从而促进Notch 1或Notch 2活性，如本文中所述。此类激动剂包括但不限于包含胞内结构域的Notch蛋白及其衍生物、编码前述物的Notch核酸以及包含Notch 1或Notch 2受体配体的Notch相互作用结构域的蛋白(例如，Delta，Jagged,Serrate的胞外结构域)。其他激动剂包括但不限于RBPJκ/Hairless的抑制剂或Deltex。Fringe可以用于增强Notch活性，例如与Delta蛋白结合。这些蛋白质，其片段和衍生物可以重组表达和分离或可以化学合成。当Notch 1激动剂和/或Notch 2激动剂通过重组核酸在前体细胞本身(例如Notch的显性活性形式)中表达时，鉴定表达Notch 1激动剂和/或Notch 2激动剂的细胞可以通过在重组核酸构建体中引入内部核糖体进入位点(IRES)，其后是Notch 1激动剂和/或Notch 2激动剂的可读框3’的编码标志物蛋白质的可读框来促进。优选地，标志物蛋白是荧光蛋白，如绿色荧光蛋白(GFP；参见例如美国专利号5,491,084和5,777,079)；修饰为在不同强度和/或波长下发荧光的GFP(例如，如Heim和Tsien，1996,Curr.Biol.6:178-82所述的蓝色GFP)或最近在珊瑚礁中发现的黄色或红橙色发射体(Matz等人,1999,Nature Biotechnol.17:969-973)。

在另一个具体的实施方案中，Notch 1激动剂和/或Notch 2激动剂是表达激动Notch 1和/或Notch 2的蛋白质或其片段或衍生物的细胞。细胞以下述方式表达Notch 1激动剂和/或Notch 2激动剂，使得其可用于前体细胞，例如分泌，在细胞表面上表达等。在又一个具体实施方案中，Notch 1激动剂和/或Notch 2激动剂是编码活化Notch 1或Notch 2的蛋白质或其片段或衍生物的核酸；此类激动剂可以例如根据下文4.3节中描述的方法使用或递送。

在又一个具体实施方案中，Notch的激动剂是结合Notch信号传导途径的成员的肽模拟物或肽类似物或有机分子。此类激动剂可以通过选自本领域已知的那些测定法的结合测定法来鉴定。

在优选的实施方案中，激动剂是由至少由介导与Notch蛋白或其粘附片段结合的Notch相互作用基因编码的蛋白的片段组成的蛋白。如本文中使用，Notch相互作用基因应当意指基因Notch，Delta，Jagged，Serrate，RBPJκ，Hairless的抑制剂和Deltex，以及可以通过序列同源性或遗传相互作用鉴定的Delta/Serrate/Jagged家族或Deltex家族的其他成员序列，和更一般地，通过分子相互作用(例如，体外结合或遗传相互作用(如表型描述，例如在果蝇中)所鉴定的“Notch级联”或“Notch组”的成员。上文引用的Notch结合蛋白的粘附片段描述于美国专利号5,648,464；5,849,869；和5,856,441)。

在一个实施方案中，Notch 1激动剂和/或Notch 2激动剂由重组核酸表达。例如，缺乏胞外配体结合结构域的Notch受体的截短的“活化”形式的表达导致功能获得突变体表型。优选地，Notch显性活性突变体由来自诱导型启动子的前体细胞表达，使得可以用在细胞来自的生物体中体内缺乏的诱导物诱导表达用于扩增和/或分化，使得移植细胞可以响应其环境因素。在另一个实施方案中，编码Notch 1激动剂和/或Notch 2激动剂的核酸侧翼为Cre位点。在前体细胞扩增和/或分化之后但在移植至受试者之前，将包含核酸的后代细胞暴露于Lox蛋白，如下文第4.8节中所述。或者，FLP/FRT重组系统可用于控制Notch 1激动剂和/或Notch 2激动剂的存在和表达(Brand和Perrimon，1993，Development 118:401-415)。

或者，在另一个实施方案中，Notch的激动剂不是重组显性Notch活性突变体。或者，在另一个实施方案中，前体细胞暴露于Notch 1激动剂和/或Notch 2激动剂不通过与在细胞表面上重组表达Notch 1激动剂和/或Notch 2激动剂的其他细胞温育来进行(尽管在其他实施例中，可以使用该方法)。

在另一个实施方案中，重组表达的Notch 1激动剂和/或Notch 2激动剂是嵌合Notch蛋白，其包含Notch的胞内结构域和另一配体结合表面受体的胞外结构域。例如，包含EGF受体胞外结构域和Notch胞内结构域的嵌合Notch蛋白在前体细胞中表达。然而，Notch途径将不具有活性，除非表达嵌合体的前体细胞暴露于EGF受体的配体，即EGF。与控制截短形式的Notch的表达的诱导型启动子一样，嵌合Notch蛋白的活性是可逆的；当从细胞中除去EGF时，Notch活性将停止。可以通过添加配体再次开启切口活性。优选地，在诱导型启动子的控制下表达嵌合受体，所述诱导型启动子在移植永生化细胞之前被关闭，例如通过除去诱导物关闭，使得移植的细胞在体内不通过活化Notch途径而响应EGF。

在其他实施方案中，可以通过Notch 1激动剂或Notch 2激动剂与Notch 1或Notch2受体的胞外部分的结合来操作Notch 1和Notch 2活性。Notch信号传导似乎由Notch的胞外结构域与其在相邻细胞上膜结合或固定化在固体表面上的配体之间的物理相互作用触发。全长配体是Notch的激动剂，因为它们在一个细胞上的表达触发表达Notch受体的相邻细胞中的途径的活化。已经固定化在固体表面，如组织培养板上的包含蛋白质的胞外结构域或其Notch结合部分的可溶性截短的Delta或Serrate分子可以用作Notch途径激动剂。此类可溶性蛋白质可以通过抗体或相互作用蛋白质固定化在固体表面上，例如针对与Delta或Serrate一起作为融合蛋白表达的表位标签(例如myc表位标签，其被抗体9E10识别)的抗体或与同Delta或Serrate一起作为融合蛋白表达的表位标签(例如，由蛋白A结合的免疫球蛋白表位标签))相互作用的蛋白质。缺乏胞内结构域的可溶性截短的Delta或Serrate分子作为途径的拮抗剂起作用，因为它们的表达在邻近的Notch表达细胞中导致非自主的显性阴性表型。

在另一个具体实施方案中，并且如Artavanis-Tsakonas等人的美国专利号5,780,300中描述，Notch激动剂包括促进或活化介导活化Notch或Notch信号传导途径成员所需的成熟或加工步骤的细胞过程的试剂，如Notch加工所需的弗林蛋白酶样转化酶Kuzbanian，被认为是Notch上游或平行的Notch途径活化所需的金属蛋白酶-解整联蛋白(ADAM)(Schlondorff和Blobel，1999，J.Cell Sci.112:3603-3617)，或，更一般地，细胞运输和加工蛋白质，如在细胞区室之间移动所需的GTP酶的rab家族(关于Rab GTP酶的综述，参见Olkkonen和Stenmark，1997，Int.Rev.Cytol.176:1-85)。激动剂可为增加上述过程之一的活性的任何分子，如编码弗林蛋白酶，Kuzbanian或rab蛋白，或其片段或衍生物或显性活性突变体的核酸，或肽模拟物或肽类似物或有机分子，其结合并活化上述蛋白质的功能。可以通过上述测定法鉴定肽模拟物或肽类似物或有机分子。

Notch 1激动剂和Notch 2激动剂包括根据需要的Notch 1或Notch 2的抗体及其抗原结合片段。“抗体”包括例如完整抗体或单链Fv片段(scFv)。抗体的抗原结合片段包括例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')₂、Fc或特异性结合Notch 1或Notch 2的胞外结构域的免疫球蛋白的任何生物学有效片段。抗体或抗原结合片段包括多克隆抗体，单克隆抗体，人抗体，人源化抗体，合成抗体，嵌合抗体，双特异性抗体，微型体和线性抗体的全部或部分。在某些实施方案中，Notch 1激动剂是结合Notch 1的胞外结构域的抗体或其抗原结合片段。在具体实施方案中，Notch 1激动剂是结合Notch 1的胞外EGF重复结构域的抗体或其抗原结合片段。在更具体的实施方案中，Notch 1激动剂是结合Notch 1的EGF重复1-6的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，Notch 2激动剂是结合Notch 2的胞外域的抗体或其抗原结合片段。在具体的实施方案中，Notch 2激动剂是结合Notch 2的胞外EGF重复结构域的抗体或其抗原结合片段。在具体实施方案中，Notch 1激动剂是抗Notch-1MHN1-519抗体(可购自Biolegend，San Diego，CA)。在具体实施方案中，Notch 2激动剂是抗Notch-2MHN2-25抗体(可购自Biolegend，San Diego，CA)。

如下文中实施例中所示，针对Notch 1的抗体可以克服Notch顺式抑制以提供Notch信号传导途径活化(实施例4)，并且针对Notch 1的抗体和针对Notch 2的抗体提供了比用Notch配体Delta实现的扩增更大的造血干细胞的扩增(实施例3)。

虽然不意图受任何机制的限制，但认为结合Notch 1或Notch 2的抗体在一定浓度范围内可用于扩增造血干细胞群体中的造血干细胞，因为在造血干细胞群体内，拒信一些个体造血干细胞将受到顺式抑制，并且一些不会受到顺式抑制。拒信在相对高水平的抗Notch 1或抗Notch 2抗体浓度下，否则将受到顺式抑制的造血干细胞被活化以在此类细胞中实现低至中等水平的Notch信号传导途径活化，从而扩增以产生更多的造血干细胞，而非顺式抑制的造血干细胞被活化以在此类细胞中实现高水平的Notch信号传导途径活化，以产生能够迁移到胸腺并产生成熟的早期T细胞前体T细胞。认为在相对低水平的抗Notch 1或抗Notch 2抗体浓度下，不受顺式抑制的造血干细胞被活化以在此类细胞中实现低至中等水平的Notch信号传导途径活化，并且因此扩增以产生更多的造血干细胞。在一些情况下，造血干细胞的扩增(即，从更多造血干细胞的造血干细胞群体产生)以及能够迁移到胸腺并产生成熟T细胞的早期T细胞前体的产生是期望的并且是本发明所提供的。

特异性结合Notch 1或Notch 2的胞外结构域的抗体可以使用获得单克隆抗体的方法、噬菌体展示的方法、产生人或人源化抗体的方法或使用工程化改造为产生抗体的转基因动物或植物的方法来制备，如本领域普通技术人员已知的(参见例如美国专利号6,291,161和6,291,158)。部分或完全合成的抗体的噬菌体展示文库是可获得的，并且可以筛选可结合Notch 1或Notch 2的胞外结构域的抗体或其片段。例如，可以通过对Fab噬菌体文库筛选特异性结合Notch 1或Notch 2的胞外结构域的Fab片段来鉴定结合结构域(参见Hoet等人，Nat.Biotechnol.23:344,2005)。人抗体的噬菌体展示文库也是可获得的。此外，在方便的系统(例如，小鼠，HuMAb

TC小鼠^TM、KM-

羊驼(llamas)、鸡、大鼠、仓鼠、兔等)中使用感兴趣的靶标作为免疫原的杂交瘤开发的传统策略可以用于开发结合结构域。在具体实施方案中，抗体特异性结合Notch 1或Notch 2胞外结构域，并且不与非特异性组分或不相关靶标交叉反应。一旦鉴定，就可分离和/或测定编码抗体的氨基酸序列或多核苷酸序列。

最后，美国专利号5,780,300还公开了可用于在本公开的实践中活化Notch途径的Notch激动剂分子类别(及其鉴定方法)，例如触发Notch锚蛋白重复序列与RBP-Jκ解离，从而促进RBP-Jκ从细胞质向细胞核的转运的分子。

在某些实施方案中，为了确定Notch结合蛋白(例如结合Notch 1或Notch 2的抗体)是否为Notch激动剂，将前体细胞(例如造血干细胞或造血祖细胞)在存在Notch结合蛋白的情况下培养，然后测试增加的Hes1表达水平(相对于在不具有Notch激动剂活性的对照分子存在下培养的前体细胞)，例如通过q-PCR，其中在Notch结合蛋白的存在下培养的细胞中增加的Hes1表达水平表明Notch结合蛋白是Notch激动剂。在其他实施方案中，为了确定Notch结合蛋白(例如结合Notch 1或Notch 2的抗体)是否为Notch激动剂，在Notch结合蛋白存在下培养前体细胞，例如造血干细胞或造血祖细胞，然后注射到NSG小鼠中，其中在存在NSG小鼠中的Notch结合蛋白的情况中培养的细胞的增加的植入(相对于在不具有Notch激动剂活性的对照分子存在下培养的前体细胞)表明Notch结合蛋白是Notch激动剂。

在优选的实施方案中，本文中提供的抗Notch 1抗体结合人Notch 1。在优选的实施方案中，本文中提供的抗Notch 2抗体结合人Notch 2。人Notch 1的氨基酸序列是可获得的，如GenBank登录号P46531或GenBank登录号NP_060087。人Notch 2的氨基酸序列是可获得的，例如，GenBank登录号Q04721或GenBank登录号NP_077719。

6.2生长因子

本公开提供了包括通过在选择的生长因子存在下活化Notch途径来永生化和任选地分化前体细胞的方法。在要实现永生化而非分化的情况下，在支持生长但不分化的生长因子存在下培养本公开的前体细胞。生长因子可为任何类型的分子，如促进细胞增殖和/或存活而基本上不引起分化的蛋白质或化学化合物。

一般而言，本公开提供了通过将细胞暴露于Notch 1激动剂、Notch 2激动剂或Notch 1激动剂和Notch 2激动剂(以及，在具体实施方案中，一种或多种生长因子)在培养物中将前体细胞(非终末分化细胞)培养一定时段的方法，否则，超出所述时段，细胞将停止增殖、分化和/或死亡，所述生长因子促进前体细胞的增殖而非分化。将细胞暴露于一种或多种生长因子最初可以在将细胞暴露于Notch 1激动剂、Notch 2激动剂或Notch 1激动剂和Notch 2激动剂之前，同时或之后进行。将前体细胞同时暴露于生长因子和Notch 1激动剂、Notch 2激动剂或Notch 1激动剂和Notch 2激动剂至少最小培养时间的一部分，最优选大部分此时间。最小培养时间是细胞在不存在Notch 1激动剂、Notch 2激动剂或Notch 1激动剂和Notch 2激动剂和选择的生长因子的情况下会死亡或停止增殖的时间量。在一个实施方案中，时段至少为至少20个细胞分裂周期的时段，在另一个实施方案中，时段至少为100个细胞分裂周期的时段。在其他实施方案中，所述时段为至少25、30、40、50、60、70、80或90个细胞分裂周期的时段。在其他实施方案中，所述时段至少为125、150、175或200个细胞分裂周期的时段。时间量将根据细胞类型而变化，并且是本领域技术人员已知的。对于造血细胞，例如，最小培养时间可为3-4周。在其他实施方案中，造血细胞的培养时间为5、6、7、8、9或10周。在其他实施方案中，造血细胞的培养时间大于10周，例如12、15、18、20或25周。

在具体的示例性实施方案中，前体细胞是HSC。干细胞因子(SCF)，也称为c-kit配体或肥大细胞生长因子，可以单独用于使HSC永生化或与例如一种或多种以下生长因子组合使用：Flt-3L，IL-3，IL-6、IL-11，SCF，TPO，GM-CSF和/或G-CSF。SCF、Flt-3L，IL-6或TPO的量可以在5-1000ng/ml，更优选约10-500ng/ml，最优选约10-300ng/ml的范围内。在某些具体实施方案中，SCF、Flt-3L、IL-6或TPO的量为10、20、50、75 125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425或450ng/ml。IL-3、IL-11G-CSF或GM-CSF的量可以在1-100ng/ml，更优选约5-50ng/ml，更优选约7.5-25ng/ml，最优选约10-15ng/ml的范围内。在某些具体实施方案中，IL-3、IL-11、G-CSF或GM-CSF的量为5、6、7、8、9、10、12.5或15ng/ml。在优选的实施方案中，将前述因子添加到无血清培养基中的HSC。生长因子也可以以下列组合提供：IL-3；IL-6；TPO；SCF和Flt-3。生长因子也可以以下列组合和量提供：IL-3(10ng/ml)；IL-6；TPO；SCF和Flt-3(各50ng/ml)。

在用于将HSC永生化的优选实施方案中，在其上结合有细胞外基质蛋白的组织培养皿中培养细胞。在实施方案的优选模式中，胞外基质蛋白是纤连蛋白(FN)或其片段。此类的片段包括但不限于CH-296(Dao等人，1998,Blood 92(12):4612-21)。

在用于将HSC永生化的具体实施方案中，在含有Notch 1激动剂、Notch 2激动剂或Notch 1激动剂和Notch 2激动剂的塑料组织培养皿上，在存在IL-3；IL-6；TPO；SCF和Flt-3的情况下培养细胞。在用于将HSC永生化的另一个具体实施方案中，在含有Notch 1激动剂、Notch 2激动剂或Notch 1激动剂和Notch 2激动剂的塑料组织培养皿上，在存在各100ng/ml的SCF、Flt-3L、TPO和IL-6和10ng/ml的IL-3的情况下培养细胞。在用于将HSC永生化的另一个具体实施方案中，在含有Notch 1激动剂、Notch 2激动剂或Notch 1激动剂和Notch 2激动剂的塑料组织培养皿上，在存在各100ng/ml的SCF和Flt-3L和10mg/ml的G-CSF和GM-CSF的情况下培养细胞。在用于将HSC永生化的另一个具体实施方案中，在含有Notch 1激动剂、Notch 2激动剂或Notch 1激动剂和Notch 2激动剂的塑料组织培养皿上，在存在各100ng/ml的SCF、Flt-3L和TPO和10mg/ml GM-CSF的情况下培养细胞。在用于将HSC永生化的另一个具体实施方案中，在含有Notch 1激动剂、Notch 2激动剂或Notch 1激动剂和Notch2激动剂的塑料组织培养皿上，在存在各300ng/ml的SCF和Flt-3L、各100ng/ml的TPO和IL-6和10mg/ml的IL-3的情况下培养细胞。在用于将HSC永生化的高度优选的实施方案中，在含有Notch 1激动剂、Notch 2激动剂或Notch 1激动剂和Notch 2激动剂的塑料组织培养皿上，在存在各100ng/ml的SCF、Flt-3L和TPO以及个10mg/ml的G-CSF和GM-CSF的情况系培养细胞。在前述培养条件的备选实施方案中，纤连蛋白或另一种胞外基质蛋白可以包括在组织培养皿中。

当需要分化时，SCF可与GM-CSF或白介素-7(IL-7)组合使用，以将永生化的HSC分别分化成髓样干细胞或淋巴样干细胞。在其他实施方案中，视黄酸受体(RAR)激动剂，最优选全反式视黄酸(ATRA)用于促进永生化HSC分化成HPP-CFC。

在其他实施方案中，EGF可与Notch 1激动剂、Notch 2激动剂或Notch 1激动剂和Notch 2激动剂联合使用，以单独或与IGF-1和TGF-β组合使表皮和成纤维细胞永生化。在另一个实施方案中，FGF-1可与Notch 1激动剂、Notch 2激动剂或Notch 1激动剂和Notch 2激动剂联合使用以使内皮细胞永生化。在又一个实施方案中，FGF-2可与Notch 1激动剂、Notch 2激动剂或Notch 1激动剂和Notch 2激动剂联合使用以使中胚层和神经外胚层细胞永生化或分化脂肪细胞和卵巢颗粒细胞。在其他实施方案中，FGF-7可与Notch 1激动剂、Notch 2激动剂或Notch 1激动剂和Notch 2激动剂联合用于角质形成细胞永生化和/或分化或前列腺表皮永生化和/或分化。在另一个实施方案中，HGF可与Notch 1激动剂、Notch 2激动剂或Notch 1激动剂和Notch 2激动剂联合使用以使肝细胞永生化。在又一个实施方案中，IL-6可与Notch 1激动剂、Notch 2激动剂或Notch 1激动剂和Notch 2激动剂联合使用以分化角质形成细胞或神经元干细胞和祖细胞。在又一个实施方案中，PDGF可与Notch 1激动剂、Notch 2激动剂或Notch 1激动剂和Notch 2激动剂联合使用，以单独或与EGF和/或IGF-1组合永生化中胚层和神经外胚层细胞。在其他实施方案中，NGF，CNTF，GDNF或BDNF可以单独使用或与Notch 1激动剂、Notch 2激动剂或Notch 1激动剂和Notch 2激动剂联合使用以使神经元细胞永生化。

通过本公开的方法利用的生长因子可以商业获得，通过重组表达产生或化学合成。例如，ATRA、BDNF(人)、CNTF(人和大鼠)、EGF(人)、FGF-1(人和牛)、FGF-2(人和牛)、FGF-7(人)、Flt-3L(人)、GDNF(人和大鼠)、HGF(人)、IGF-1(人)、IL-6(人和小鼠)、IL-11(人)、NGF(鼠)、PDGF(人AA、AB和BB同等性)、SCF(人)、TGF-β(人)、TPO(人和鼠)可以购自Sigma(St.Louis，Mo.)。EGF(人和鼠)、FGF-1(人)、FGF-2(人)、GM-CSF(人和鼠)、IGF-1(人)、IL-6(人和鼠)、IL-7(人和鼠)、NGF(鼠)、PDGF(人AA、AB和BB同等性)、SCF(人)和TGF-β(人)可以购自Life Technologies，Inc.(Rockville，Md.)。

在其他实施方案中，通过重组表达(例如，如下文4.3节中所述)或通过化学肽合成(例如，通过肽合成仪)产生生长因子。生长因子核酸和肽序列通常可从GenBank获得。下文提供了生长因子的示例性GenBank登录号(其提供核酸序列和编码的蛋白质的序列两者)：

优选但非必需地，用于通过本公开的方法在Notch 1激动剂、Notch 2激动剂或Notch 1激动剂和Notch 2激动剂的存在下将前体细胞永生化和任选地分化的生长因子衍生自与前体细胞相同的物种。用于永生化或分化前体细胞的特定生长因子取决于前体细胞类型，并且是本领域技术人员公知的。

适合于将前体细胞永生化或分化永生化前体细胞的生长因子的量或浓度将取决于生长因子制剂的活性，生长因子和前体细胞之间的物种对应性等。通常，当生长因子和前体细胞是相同物种时，培养基中生长因子的总量为1ng/ml至5μg/ml，更优选5ng/ml至1μg/ml，最优选约10ng/ml至200ng/ml。在优选的实施方案中，前体细胞是HSC，并通过将细胞暴露于Notch 1激动剂、Notch 2激动剂或Notch 1激动剂和Notch 2激动剂和100ng/ml的SCF来永生化。在另一个优选的实施方案中，前体细胞是HSC，并通过将细胞暴露于Notch 1激动剂、Notch 2激动剂或Notch 1激动剂和Notch 2激动剂和IL-3；IL-6；TPO；SCF和Flt-3而永生化。在另一个优选的实施方案中，通过将细胞暴露于各100ng/ml的SCF和IL-7将永生化的HSC分化成淋巴样前体细胞。在另一个优选的实施方案中，通过将细胞暴露于各100ng/ml的SCF和GM-CSF将HSC分化成髓样前体细胞。

6.3Notch 1和Notch 2激动剂和生长因子的重组表达

本公开提供用于永生化和任选地分化前体细胞的方法，所述方法包括在Notch 1激动剂、Notch 2激动剂或Notch 1激动剂和Notch 2激动剂和选择的生长因子存在下培养前体细胞。在具体实施方案中，重组产生Notch 1激动剂和Notch 2激动剂和/或生长因子。可以分离Notch 1激动剂和Notch 2激动剂或生长因子以添加到培养前体细胞的细胞培养基中，在永生化和/或分化期期间在前体细胞中重组表达，或在永生化和/或分化期期间与前体细胞一起培养的细胞中内源或重组表达。

本文中提供了用于表达Notch 1激动剂和Notch 2激动剂和生长因子的方法。编码生长因子或生长因子途径组分、Notch或Notch途径组分或其功能活性片段或其其他衍生物的核苷酸序列在本节中称为“感兴趣的核酸”，它编码的蛋白质称为“感兴趣的蛋白质”。可以将感兴趣的核酸插入合适的表达载体，即含有插入的蛋白质编码序列的转录和翻译的必需元件的载体中。必要的转录和翻译信号也可以由天然基因和/或其侧翼区提供。可以使用多种宿主-载体系统来表达蛋白质编码序列。这些包括但不限于感染有病毒(例如痘苗病毒，腺病毒等)的哺乳动物细胞系统；感染有病毒(例如杆状病毒)的昆虫细胞系统；微生物如含有酵母载体的酵母，或用噬菌体，DNA，质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌。载体的表达元件在其强度和特异性上变化。根据所使用的宿主-载体系统，可以使用许多合适的转录和翻译元件中的任何一种。

先前描述的用于将DNA片段插入载体中的任何方法均可用于构建含有由合适的转录/翻译控制信号和蛋白质编码序列组成的嵌合基因的表达载体。这些方法可以包括体外重组DNA和合成技术和体内重组体(遗传重组)。编码其感兴趣的蛋白质的核酸序列的表达可以通过第二核酸序列调节，使得感兴趣的蛋白质在用重组DNA分子转化的宿主中表达。例如，感兴趣的蛋白的表达可以通过本领域已知的任何启动子/增强子元件来控制。可用于控制细胞命运控制基因或细胞命运基因途径组分表达的启动子包括但不限于SV40早期启动子区(Bernoist和Chambon，1981，Nature 290:304-310)，包含在劳斯(Rous)肉瘤病毒的3'长末端重复序列内的启动子(Yamamoto等人，1980，Cell 22:787-797)，疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等人，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:1441-1445)，金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等人，1982,Nature 296:39-42)；热休克蛋白70基因的调节序列(Bienz和Pelham，1986，Cell 45:753-60)，原核表达载体如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75:3727-3731)或tac启动子(DeBoer等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:21-25)；还参见Scientific American,1980,242:74-94中的“Useful proteins from recombinant bacteria”；包含胭脂碱合成酶启动子区(Herrera-Estrella等人，Nature 303:209-213)或花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(Gardner，等人，1981，Nucl.Acids Res.9:2871)的植物表达载体，和光合酶核酮糖二磷酸羧化酶的启动子(Herrera-Estrella等人，1984，Nature 310:115-120)；来自酵母或其他真菌的启动子元件，如Gal 4启动子，ADH(醇脱氢酶)启动子，PGK(磷酸甘油激酶)启动子，碱性磷酸酶启动子和以下动物转录控制区，其表现出组织特异性并且已经用于转基因动物：在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等人,1984,Cell 38:639-646；Omitz等人,1986,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50:399-409；MacDonald,1987,Hepatology 7:425-515)；在胰腺β细胞中有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan，1985，Nature 315:115-122)，在淋巴样细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等人，1984，Cell 38:647-658；Adames等人，1985，Nature 318:533-538；Alexander等人，1987，Mol.Cell.Biol.7:1436-1444)，在睾丸，乳腺，淋巴样和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区(Leder等人，1986，Cell 45:485-495)，在肝中有活性的清蛋白基因控制区(Pinkert等人，1987，Genes和Devel.1:268-276)，在肝中有活性的α-胎蛋白基因控制(Krumlauf等人，1985，Mol.Cell.Biol.5:1639-1648；Hammer等人，1987，Science 235:53-58；在肝脏中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等人，1987，Genes and Devel.1:161-171)，在髓样细胞中有活性的β-珠蛋白基因控制区(Mogram等人，1985，Nature 315:338-340；Kollias等人，1986，Cell 46:89-94；髓磷脂碱性蛋白基因控制区，其在脑中的少突胶质细胞中有活性(Readhead等人，1987，Cell 48:703-712)；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区(Sani，1985，Nature 314:283-286)，和在下丘脑中有活性的促性腺激素释放激素基因控制区(Mason等人，1986，Science 234:1372-1378)。

在一个实施方案中，利用来自大肠杆菌(E.coli)的四环素调节基因表达的方法，称为“Tet系统”(Gossen等人，1995，Science 268:1766-1769；Gossen和Bujard，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547-5551)用于指导基因表达。在这种情况下，产生转基因细胞系，其中四环素控制的转录活化物(tTA)的编码区可操作地融合到以组成型或诱导型方式指导tTA表达的启动子/增强子。产生转基因细胞系，其中待错误表达的感兴趣的核酸的编码区可操作地融合到拥有tTA响应调节元件的启动子。当细胞培养基补充足够量的四环素时，其完全阻断所得后代中感兴趣基因的表达。感兴趣基因的表达可以简单地通过从食物或细胞培养基中除去四环素而被诱导。此外，可以通过改变食物中四环素的水平来调节感兴趣基因的表达水平。因此，使用Tet系统作为用于错误表达的二元控制机制具有提供控制感兴趣的核酸的错误表达的幅度和时机的手段的优点。

含有感兴趣核酸的表达载体可以通过以下四种一般方法来鉴定：(a)核酸杂交；(b)分子生物学，(c)插入序列的表达；和(d)“标志物”基因功能的存在或不存在。在第一种方法中，插入表达载体中的感兴趣核酸的存在可以通过使用包含与插入的感兴趣核酸同源的序列的探针通过核酸杂交来检测。在第二种方法中，使用分子生物学和“标志物”基因功能的组合来鉴定含有感兴趣核酸的重组表达载体。例如，如果将感兴趣的核酸插入到编码两者抗生素抗性的表达载体的特定限制性位点中，则摄取载体的细菌细胞通过其对抗生素的抗性来鉴定，并且那些含有感兴趣核酸的载体可以通过用特定限制酶限制性消化扩增的载体DNA来鉴定。在第三种方法中，可以通过测定由重组体表达的感兴趣蛋白质来鉴定重组表达载体。这样的测定可以基于例如感兴趣蛋白质的物理或功能性质。在第四种方法中，可以基于由在载体中插入感兴趣的核酸引起的某些“标志物”基因功能(例如胸苷激酶活性，β-半乳糖苷酶，对抗生素的抗性，转化表型，杆状病毒中的包含体(occlusion body)形成等)的存在或不存在来鉴定载体/宿主系统。例如，如果感兴趣的核酸插入载体的标志物基因序列内，则可以通过标志物基因功能的不存在来鉴定含有感兴趣核酸的重组体。

一旦鉴定和分离特定的重组DNA分子，就可以使用本领域中已知的几种方法来繁殖它。一旦建立了合适的宿主系统和生长条件，就可以大量繁殖和制备重组表达载体。如前所述，可以使用的表达载体包括但不限于以下载体或其衍生物：人或动物病毒，如痘苗病毒或腺病毒；昆虫病毒如杆状病毒；酵母载体；噬菌体载体(例如λ)，以及质粒和粘粒DNA载体，等等。

另外，可以选择调节插入序列的表达，或以所需的特定方式修饰和加工基因产物的宿主细胞菌株。来自某些启动子的表达可以在某些诱导物的存在下升高；因此，可以控制遗传工程改造的感兴趣蛋白(例如Notch 1和Notch 2激动剂)的表达。此外，不同的宿主细胞具有用于蛋白质的翻译和翻译后加工和修饰(例如糖基化，切割[例如信号序列])的特征和特定机制。可以选择合适的细胞系或宿主系统以确保所表达的外来蛋白的期望的修饰和加工。例如，细菌系统中的表达可用于产生大量的Notch 1和Notch 2激动剂，因为它们的功能需要较小的翻译后修饰。在真核细胞中的表达将产生糖基化产物，其对于一些蛋白质，如TPO是必需的。后生动物细胞中的表达可用于确保信号传导分子的信号序列的“天然”加工。

在其他具体实施方案中，感兴趣的蛋白可以表达为融合物或嵌合蛋白产物(包含通过肽键与异源蛋白序列(不同蛋白)连接的肽，片段，类似物或衍生物))。此类嵌合产物可以通过本领域已知的方法在适当的编码框架中将编码期望的氨基酸序列的适当的核酸序列彼此连接，并通过本领域通常已知的方法表达嵌合产物来制备。或者，此类嵌合产物可以通过蛋白质合成技术制备，例如，通过使用肽合成仪。可以克隆和表达cDNA和基因组序列两者。

本部分中描述的方法不但适用于不是Notch途径组分的基因和蛋白质，而且适用于可用于间接改变Notch途径的基因或蛋白质的功能的基因和蛋白质。

6.4前体细胞

本公开提供了通过规避或延迟前体细胞进入细胞周期停滞或进入非复制期而将前体细胞永生化和任选分化的方法。根据本公开的永生化的前体细胞是非末端分化的细胞，并且可以来自任何物种，包括但不限于人、动物、植物、哺乳动物、灵长类动物、小鼠、大鼠、犬、猫、马、牛、禽、昆虫、果蝇和秀丽隐杆线虫。最优选地，前体细胞是脊椎动物，更优选哺乳动物，最优选人。在优选的实施方案中，前体细胞尚未经历“危机”或“衰老”阶段，导致细胞系特征(例如，导致稳定的表型变化的转化(参见Freshney,1994,于"Culture ofAnimal Cells--A manual of Basic Technique,"第3版，在12页，John Wiley&Sons,Inc.)。在优选的实施方案中，前体细胞是原代细胞。术语“原代细胞”表示细胞在它们从组织来源(如哺乳动物受试者)辩明后尚未通过传代培养。

通常但非必需地，前体细胞是多能干细胞或多能祖细胞。在一个实施方案中，前体细胞是干细胞。在另一个实施方案中，前体细胞是祖细胞。如果需要的话，可以在永生化之前或之后从细胞群体中分离前体细胞。优选地，通过将细胞暴露于Notch 1激动剂、Notch 2激动剂或Notch 1激动剂和Notch 2激动剂(例如固定化在细胞表面中的固体表面上或在细胞表面上重组表达，或通过将表达显性活性Notch突变体或活化Notch配体或活化Notch 1和/或Notch 2的其他分子的重组核酸导入细胞中)实现Notch途径的活化。

最优选地，当前体细胞的永生化和/或分化的后代要用于再增殖或基因治疗时，前体细胞在永生化和任选地分化后直接从接受它们施用的受试者的组织获得。例如，如果前体细胞是HSC，则其可通过在Notch 1激动剂、Notch 2激动剂或Notch 1激动剂和Notch 2激动剂和IL-3、IL-6、TPO、SCF和Flt-3L的组合的存在下培养细胞，使得在其与受试者分离后而永生化。在另一个实施方案中，如所述培养细胞，然后暴露于SCF和GM-CSF或IL-7以分别刺激分化成髓样或淋巴样谱系，然后将所得髓样或淋巴样细胞群体移植回受试者。移植优选是自体的，但也可为非自体的。对于非自体移植，优选给予接受者免疫抑制药物以降低移植细胞排斥的风险。

以下示例性实施方案描述了允许分离前体细胞和含前体细胞的组织的方法，所述前体细胞和含前体细胞的组织要用根据本公开的Notch 1激动剂、Notch 2激动剂或Notch1激动剂和Notch 2激动剂以及生长因子进行处理。如已经提到的，可以根据本公开的方法处理分离的细胞类型或甚至细胞群体的混合物。如果得到的细胞群要用于移植，则可以将重组基因导入细胞中，使得其或其后代在移植前表达所需的基因产物。重组基因的导入可以在前体细胞扩增和/或分化之前或之后完成。

在优选的实施方案中，前体细胞群体是纯化的或至少高度富集的。然而，为了通过本公开的方法将前体细胞永生化和/或分化，前体细胞不必是纯群体。一旦处理混合物，就可选择和纯化所需的群体。此外，在体内治疗性施用之前，纯化可能不是必需的或期望的。

用于本公开内容的前体细胞的分离可以通过本领域技术人员通常已知的许多方法中的任一种进行。例如，用于分离前体细胞的一种常用方法是从受试者并使用差异抗体结合来收集细胞群体，其中一个或多个某些分化阶段的细胞被针对分化抗原的抗体结合，使用荧光激活细胞分选(FACS)来从所述分离的细胞群体中分离表达选择的分化抗原的所需前体细胞。FACS是基于颗粒的荧光性质分离颗粒(包括细胞)的公知方法(Kamarch，1987，Methods Enzymol.151:150-165)。单个颗粒中荧光部分的激光激发导致允许正和负颗粒从混合物的电磁分离的小电荷。

在另一个实施方案中，磁珠可用于从细胞群体中分离前体细胞。具体而言，可以使用磁活化细胞分选(MACS)技术。MACS是基于其结合磁珠(直径为0.5-100μm)的能力分离颗粒的方法。磁珠可以从Dynal(Oslo,Norway；http://www.dynal.no)获得。可以对磁性微球进行多种有用的修饰，包括共价添加特异性识别细胞-固相表面分子或半抗原的抗体。然后施加磁场，以物理操作所选择的珠粒。然后将珠粒与细胞混合，例如包含前体细胞的细胞群体，以允许结合。然后使细胞通过磁场以分离出具有所需细胞表面标志物的细胞。

在另一个实施方案中，培养皿的表面可以用抗体包被，并用于通过称为淘选的方法分离细胞。细胞可以在分开的皿中连续温育，每个板用针对所需细胞类型的标志物的抗体包被，并在每次温育后彻底漂洗。所使用的抗体的特定组合识别对所需细胞类型，而非对可能存在于混合细胞群体中的其他细胞类型特异性的标记物的相应组合。在最后的漂洗步骤后，与板保持结合的细胞将是所需细胞类型的细胞。

永生化或分化细胞可以稀释到分开的皿中(如微量滴定板)以用于克隆分离。优选地，在稀释之前，可以通过本领域中已知的任何方法纯化所需细胞类型的细胞。例如，可以通过FACS或MACS纯化永生化或分化细胞。除了前体或分化的细胞类型的内源性标志物之外，还可通过使用在所需细胞类型中活化的谱系特异性启动子控制下的编码报道基因的构建体转染前体细胞来纯化永生化或分化细胞(参见例如美国专利号5,639,618)。

以下部分描述了用于提取或分离特定类型的细胞的示例性方法。此外，可以使用本领域已知中的任何方法。

6.4.1.造血细胞

优选地，根据本文中所述的方法扩增的前体细胞是造血前体细胞。本公开的方法涵盖任何非终末分化的造血细胞的永生化和任选分化，包括但不限于HSC，淋巴样干细胞和髓样干细胞。提供造血细胞分离的任何技术可用于本公开的实施方案中。

在优选的实施方案中，造血细胞是HSC。造血干细胞也称为长期骨髓植入细胞。在优选的实施方案中，造血干细胞和/或造血祖细胞是人造血干细胞和/或造血祖细胞。

可以实现HSC的分离的技术包括从分离自供体的骨髓细胞中分离HSC，或其中HSC的后代将用于移植，即未来宿主。非自体HSC优选与抑制未来宿主/受试者的移植免疫反应的方法联合使用。在本公开的一个具体实施方案中，可以通过针抽吸从后髂嵴获得人骨髓细胞(参见例如Kodo等人，1984，J.Clin.Invest.73:1377-1384)。在本公开的优选实施方案中，HSC或其后代可以制成高度富集或基本上纯的形式。这种富集可以根据本公开的方法在永生化和/或分化之前，期间或之后完成。

Milner等人，1994，Blood 83:2057-2062描述了用于分离HSC的另一种技术。获得骨髓样品，并通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离，洗涤，并使用双色间接免疫荧光抗体结合染色，然后通过荧光激活细胞分选(FACS)分离。用IgG抗体同时标记细胞，使得从收集自骨髓的细胞中分离CD34+HSC，包括缺乏个别谱系相关抗原CD34+lin-的表达的未成熟亚群。

当需要造血祖细胞时，可以通过公知的体外集落形成测定法(例如，检测CFU-GM，BFU-E的测定法)检测造血祖细胞和/或其后代的存在。作为另一个实例，HSC的测定法在本领域中也是已知的(例如，脾焦点形成测定法，检测在再铺板后形成祖先的能力的测定法)。

在一个具体的实施方案中，前体细胞是造血干细胞。在具体实施方案中，前体细胞是造血祖细胞。在具体实施方案中，前体细胞是造血干细胞和造血祖细胞。

在一个实施方案中，造血前体细胞包含作为短期骨髓植入细胞(快速再增殖细胞)的多能祖细胞。

在一个具体的实施方案中，前体细胞是富集造血干细胞的细胞群体。在另一个实施方案中，前体细胞是富集造血干细胞和祖细胞的细胞群体。

造血细胞标志物

造血细胞类型的以下标志物可用于鉴定造血细胞并选择或富集所需的造血细胞类型(在前体细胞群体中或在永生化或分化的细胞群体中)。

已经使用抗体组来区分造血系统的不同细胞，主要基于不同造血细胞类型上的各种细胞表面抗原的差异表达。单克隆抗体可与细胞分选结合使用以富集所选择的造血细胞。例如，人HSC最初基于CD34表达和缺乏CD38表达来纯化。使用抗CD34抗体，HSC可以从1-2％的正常骨髓细胞群体中富集(Civin等人,1989,Report on the CD34clusterworkshop,于:Leucocyte typing IV,White Cell Differentiation Antigens.Knapp等人编,Oxford University Press.Oxford,第818页)至大约50-80％的群体(Ishizawa等人，于：HSCs:The Mulhouse Manual，Wunder等人编AlphaMed Press，Ohio第171-182页；Shpall等人，1994，J.Clinical Oncology 12:28-36；Winslow等人，1994，Bone MarrowTransplantation 14:265-271；Thomas，1994，Cancer Research，Therapy and Control 4(2):119-128)。本领域中已知的抗体的任何组合可以用于通过选择表达存在于感兴趣的细胞上的抗原的细胞或通过消减表达不想要的抗原的细胞来鉴定或选择所需的造血细胞类型。

除了作为CD34+之外，HSC优选是CD33-、CD38-、HLA DR-和Thy-1-lo(Craig等人,1993,J.Exp.Med.177:1331；Civin等人,1994,J.Immunol.133:157；Civin等人,1987,Exp.Hematol.15:10；Terstappen等人,1991,Blood 77:1218)。此外，人HSC优选为CD45Ra-、CD19-和c-kit+(Scadden的美国专利号5,965,437)。

可用于选择和/或富集HSC的另一种HSC标志物是细胞血管内皮生长因子受体2(VEGFR2，也称为KDR；Ziegler等，1999，Science 285:1553-1558)。

通过将识别血型糖蛋白A、CD3、CD24、CD16和CD14的抗体与诸如骨髓提取物的样品一起温育，并将抗体结合的细胞与非抗体结合的细胞分离，也可以富集人造血祖细胞和人HSC。针对CD45RA、CD36、CD56、CD2、CD19、CD66a和CD66b的抗体也可用于完善该过程。对非抗体结合的细胞群富集造血干细胞和祖细胞(参见Thomas和Lansdorp的美国专利号5,877,299)。在其他研究中，My10和HLA-DR抗体已经与双色分选结合使用，以获得来自人骨髓的高度富集的祖细胞群(Lu等人，1987，J.Immunol.139(6):1823-1829)。T淋巴细胞消减也可用于富集造血干细胞或祖细胞。在该过程中，通过用识别T细胞抗原的单克隆抗体加上补体预处理细胞，从细胞群体中选择性地去除T淋巴细胞。此类方法先前已有描述(Broxmeyer等，1984,J.Clin.Invest.73:939-953)。

血型糖蛋白A抗体可用于就红细胞或针对红细胞进行选择。针对CD14、CD16、CD66a和CD66b的抗体可用于就单核细胞或针对单核细胞进行选择。针对CD24、CD3、CD19、CD20、CD56、CD2的抗体可用于就B和T淋巴细胞和NK细胞或针对B和T淋巴细胞和NK细胞进行选择。针对CD45RA和CD36的抗体可用于选择或针对T细胞、B细胞、粒细胞、血小板、单核细胞、分化的红系前体细胞和一些定型的成熟祖细胞。参见例如，美国专利号5,877,299。其他T细胞标志物包括CD7、CD5、TCD-2和CD4或CD8。CD7和末端脱氧核糖核苷酸转移酶(Tdt)是前T祖细胞的标志物。前B祖细胞的另外的标志物是MHC II类抗原。成熟B细胞的进一步特征在于CD21的表达。参见例如Raska和Ponzio,1994,于"Immunology and Inflammation:BasicMechanisms and Clinical Consequences,"Sigal和Ron编,McGraw-Hill,Inc.。

在具体的实施方案中，目前可用并可用于富集方案的抗体包括My-10和3C5(其识别CD34)，或RFB-1(其识别CD99(Petty和Tippett，1995，Vox Sang 69(3):231-5)并鉴定BFU-E细胞的群体(Kannourakis和Johnson，1988,Blood 71(3):758-65))。针对上述造血抗原的其他目前可获得的抗体公开于美国专利号5,877,299。这些抗体可以单独使用或与诸如“淘选”(Broxmeyer等人，1983，J.Clin.Invest.73:939-953)或荧光激活细胞分选(FACS)(Williams等人，1985，J.Immunol.135:1004；Lu等人,1986,Blood 68(1):126-133)以分离含有由单克隆抗体识别的表面决定簇的那些细胞。

可使用的另一种方法是通过使用凝集素，如大豆的选择性凝集来分离干细胞和祖细胞(Reisner等人，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77:1164)。该方法可为用于分离和富集干细胞和祖细胞而不除去可能必需的辅助细胞的可行替代方法(Reisner等人，1983,Blood 61(2):341-348；Reisner等人,1982,Blood 59(2):360-363)。

理论上，仅需要一个早期干细胞用于整个造血系统的再增殖。有实验室证据表明，在理想条件下和当培养受体动物中的干细胞和祖细胞的微环境不受影响时，单个干细胞可以完全再增殖小鼠的有缺陷的造血系统，并且将其从贫血的致死性并发症中挽救(Boggs等人，1982，J.Clin.Invest.70:242-253)。毫无疑问，在人的临床条件下，通常会需要多于一个干细胞来挽救造血系统。此外，除了干细胞和祖细胞外，还可能需要佐细胞或辅助细胞(影响干细胞/祖细胞生长的非干细胞/祖细胞)的存在(Spooncer等人，1985,Nature(London)316:62-64)，特别是如果宿主的微环境受到诸如照射或化学疗法的治疗损伤。因此，虽然有从其他脐带血细胞分离造血干细胞和祖细胞的方式(Leary等人，1984，J.Clin.Invest.74:2193-2197)，并且这些和其他方法可用于分离和储存纯或高度富集的这些细胞的制剂用于永生化和最终移植，在尝试用干细胞和祖细胞的纯化制剂移植患者时应当谨慎。

6.4.2.间充质干细胞

用于治疗应用的最重要前体细胞类型之一是源自间充质的那些。间充质干细胞是在骨髓，血液，真皮和骨膜中发现的多能细胞，其能够根据体外或体内微环境分化成各种谱系(例如，骨形成(steogenic)，软骨形成、腱形成(tendonogenic)、脂肪形成、肌源性谱系等)的细胞。(Caplan,1991,J.Orth.Res.641-650)。迄今为止的大多数工作涉及分离和培养可以分化成软骨细胞和成骨细胞的细胞。开发用于分离相关祖细胞群体的系统首先在鸡胚中进行(Caplan,1970,Exp.Cell.Res.62:341-355；Caplan,1981,39th Annual Symposiumof the Society for Developmental Biology,第37-68页；Caplan等人,1980,Dilatationof the Uterine Cervix 79-98；DeLuca等人,1977,J.Biol.Chem.252:6600-6608；Osdoby等人,1979,Dev.Biol.73:84-102；Syftestad等人,1985,Dev.Biol.110:275-283)。

Caplan等人，1993，和Caplan等人，1996，美国专利号5,226,914和5,486,359分别描述了从骨髓中分离间充质干细胞的示例性方法。这些分离的骨髓干细胞可以使用Notch1激动剂、Notch 2激动剂或Notch 1激动剂和Notch 2激动剂和促进增殖但非分化的生长因子永生化。然后，这些前体细胞可以进一步分化，例如通过在促进分化的生长因子的存在下培养。细胞优选分化成骨细胞、软骨、软骨细胞、脂肪细胞等。

已经报道了若干种骨髓分离方案，并且可以用于获得前体细胞。可以根据Goshima等人，1991，Clin.Orth.and Rel.Res.262:298-311制备来自大鼠骨髓的单细胞悬浮液。来自骨髓的人干细胞培养物可以如Bab等人，1988，Bone Mineral 4:373-386所述如下制备：从受试者获得全骨髓细胞。将骨髓样品与髂嵴或股骨中段(femoral midshaft)分离。将3ml体积的骨髓样品转移至6ml含有50U/ml青霉素和0.05mg/ml硫酸链霉素的无血清最小必需培养基(MEM)中。如先前所述(Bab等人,1984,Calcif.Tissue Int.36:77-82；Ashton等人,1984,Calcif.Tissue Int.36:83-86)通过将制剂抽入注射器中并且依次通过19、21、23和25号针将它排出几次制备主要单细胞的悬浮液。使用固定体积血细胞计数器计数细胞，并将浓度调整至每毫升悬浮液1-5×10⁸个总骨髓细胞。可以分别使用兔全骨髓和脾细胞如前所述设定阳性和阴性对照细胞悬浮液(Shteyer等，1986，Calcif.Tissue Int.39:49-54)。

6.4.3.成纤维细胞

结缔组织包括成纤维细胞，软骨，骨，脂肪和平滑肌细胞。成纤维细胞是结缔组织细胞最少分化的，并且分散在整个身体的结缔组织中。它们可以通过其I型和/或III型胶原的特征分泌来鉴定。成纤维细胞可以迁移到组织创伤并分泌愈合和分离伤口的胶原基质。此外，它们可以根据其局部因素分化为结缔组织家族的其他成员。根据本领域普通技术人员已知的方法，可以从多种不同的组织中分离成纤维细胞，包括但不限于骨髓基质。

6.4.4.神经干细胞

通常假定中枢神经系统中的神经发生在出生之前或之后不久停止。近年来，一些研究提出了证据，表明至少在一定程度上新的神经元继续添加到成年脊椎动物的脑(Alvarez-Buylla和Lois，1995，Stem Cells(Dayt)13:263-272)。前体通常位于脑室的壁中。认为从这些增殖区域，神经元前体向靶标位置迁移，在那里微环境诱导它们分化。已经报道了研究，其中来自室下区的细胞可以既在体内又在体外产生神经元，在Alvarez-Buylla和Lois,1995,Stem Cells(Dayt)13:263-272中综述。

来自成人脑的神经元前体可以用作用于神经元移植的细胞来源(Alvarez-Buylla,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2074-2077)。神经嵴细胞也已经长期被认为是多能神经元细胞，其可以根据它们从其自身所存在的微环境中获得的指令迁移和分化成不同的细胞神经元细胞类型(LeDouarin和Ziller,1993,Curr.Opin.Cell Biol.5:1036-1043)。

6.4.5.胎儿细胞

在本公开的某些实施方案中，前体细胞可为胎儿细胞，例如用于培养直到在生命的后期点时需要。可以通过本领域中已知的任何方法获得胎儿血液。例如，可以使用由超声(Daffos等人,1985,Am.J.Obstet.Gynecol.153:655-660；Daffos等人,1983,Am.J.Obstet.Gynecol.146:985)，通过胎盘穿刺术(placentocentisis)(Valenti,1973,Am.J.Obstet.Gynecol.115:851；Cao等人,1982,J.Med.Genet.19:81)，通过胎儿镜检查(Rodeck,1984,于Prenatal Diagnosis,Rodeck,C.H.和Nicolaides,K.H.编,RoyalCollege of Obstetricians and Gynecologists,London)等引导的针从胎盘根处的胎儿循环中获取胎儿血液。在某些实施方案中，胎儿细胞获自脐带血，胎盘血或瓦顿氏凝胶。瓦顿氏凝胶是在脐带中发现的凝胶状物质，其通常被认为是松散的粘液结缔组织，并且经常被描述为由成纤维细胞，胶原纤维和主要由透明质酸组成的无定形物质组成(Takechi等人,1993,Placenta 14:235-45)。

或者，可以从新生儿血液获得本公开的前体细胞。可优选通过从脐带直接排出和/或通过在腐烂和膨胀静脉处从分娩的胎盘中针抽吸获得新生儿血液。

应在无菌条件下进行收集。收集后，应立即将新生儿或胎儿血液与抗凝血剂混合。此类抗凝剂可为本领域已知的任一种，包括但不限于CPD(柠檬酸盐-磷酸盐-右旋糖)、ACD(酸性柠檬酸盐-右旋糖)、Alsever氏溶液(Alsever和Ainslie，1941,N.Y.St.J.Med.41:126)、DeGowin氏溶液(DeGowin等，1940,J.Am.Med.As.114:850)、Edglugate-Mg(Smith等，1959，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.38:573)、Rous-Turner溶液(Rous和Turner，1916,J.Exp.Med.23:219)，其他葡萄糖混合物、肝素、双乙酸乙酯等(参见，Hurn,1968,Storageof Blood,Academic Press,New York,第26-160页)。

人胎儿脑细胞的原代培养物可以从人胎儿中分离，获自在妊娠5至12周之后的合法堕胎。可以通过在超声描记控制下的注射器驱动的温和抽吸进行娩出。

6.4.6.表皮干细胞和角质形成细胞

可以通过已知的方法(Rheinwald，1980，Meth.Cell Bio.21A:229)从组织，如皮肤和肠的内衬获得上皮干细胞(ESC)和角质形成细胞。在分层的上皮组织，如皮肤中，通过生发层(最接近基底层的层)内的前体细胞的有丝分裂发生更新。肠内衬内的前体细胞提供了该组织的快速更新速率。可以根据本公开的方法永生化从受试者或供体的皮肤或肠内衬获得的ESC(Rheinwald,1980,Meth.Cell Bio.21A:229；Pittelkow和Scott,1986,MayoClinic Proc.61:771)。

6.4.7.肝干细胞

可以通过日期为1994年4月28日的PCT公开WO 94/08598中所述的方法分离肝干细胞。

6.4.8.肾干细胞

哺乳动物肾从后肾间充质中出现，其诱导子宫芽(uteric bud)经历一系列形态发生运动，最终形成成熟的泌尿收集系统(Nigam和Brenner,1992,Curr.Opin.Nephrol.Huper1:187-191)。子宫芽，Wolfian管的表皮长出，收缩并诱导沿着早期胚胎生命中的上皮趋异的分化途径诱导浓缩的相邻间充质；已经报道了尝试在体外研究该过程；可以使用胚胎脊髓作为诱导物诱导器官培养中的后肾形成小管。虽然不知道通过子宫芽在体内或通过脊髓在体外诱导后肾间充质的特异性转导剂，细胞特异性标志物显示在祖细胞中诱导分化程序(Karp等人，1994,Dev.Biol.91:5286-5290)。

6.5前体细胞的分化

本公开提供了根据本公开的方法在前体细胞永生化之前，之后或同时分化前体细胞的方法。通过将细胞暴露于促进分化的一种或多种生长因子，并在允许发生分化的条件下培养细胞来实现前体细胞的分化。分化前体细胞或其永生化后代的生长因子包括在上文4.2节中描述的那些。促进前体细胞分化的生长因子的选择取决于前体细胞类型，并且是本领域技术人员已知的。例如，如第4.2节所述，通过将细胞暴露于各100ng/ml的SCF和IL-7，将永生化的HSC分化为淋巴样干细胞，并且通过将细胞暴露于各100ng/ml的SCF和GM-CSF分化为髓样干细胞。在某些情况下，生长因子可以通过将其与不同的生长因子组合用于分化和增殖两者；例如SCF可以单独使用或与IL-6、IL-11和Flt-3L组合使用以使HSC永生化(通过将HSC暴露于SCF(以及任选地IL-6、IL-11和Flt-3L)和Notch 1激动剂、Notch 2激动剂或Notch 1激动剂和Notch 2激动剂达一定时段，超过该时段，HSC通常会停止增殖和/或死亡)，并与IL-7或GM-CSF组合以分别促进永生化的HSC分化为淋巴样干细胞或髓样干细胞。

6.6本公开的培养细胞的治疗用途

本公开提供了允许前体细胞永生化和任选分化的方法。在某些实施方案中，所得细胞用于细胞疗法。作为示例而非限制，以下部分描述了使用通过本公开的方法产生的细胞治疗造血病症和对神经组织的损伤的示例性实施方案。然而，永生化或分化细胞可用于补充任何缺陷细胞群体或提供前体细胞类型的治疗性细胞群体或作为基因治疗载体(参见下文第4.8节)。另外，可以在永生化之前或之后保留前体细胞，例如通过冷冻(参见下文第4.7节)。

6.6.1.造血病症

永生化HSC或分化的造血细胞的移植可用于治疗或预防造血病症和疾病。在一个实施方案中，永生化或分化细胞用于治疗或预防以正常血细胞产生和成熟细胞的失效或功能障碍为特征的造血病症或疾病。在另一个实施方案中，永生化或分化细胞用于治疗或预防由造血恶性肿瘤引起的造血病症或疾病。在另一个实施方案中，永生化或分化细胞用于治疗或预防由免疫抑制，特别是具有恶性实体瘤的受试者中的免疫抑制引起的造血病症或疾病。在另一个实施方案中，永生化或分化细胞用于治疗或预防影响造血系统的自身免疫性疾病。在又一个实施方案中，永生化或分化细胞用于治疗或预防遗传性或先天性造血病症或疾病。选择用于治疗受试者的造血疾病或病症的分化细胞的类型以改善受试者的状况，例如沿着红系途径分化以治疗贫血的细胞。

可以通过本公开的永生化细胞和/或通过分化细胞治疗的特定造血疾病和病症的实例包括但不限于表2中列出的那些：

在一个实施方案中，将永生化或分化细胞施用于具有造血缺陷的受试者。在该实施方案的一个模式中，将永生化或分化细胞在出生前施用于诊断有造血缺陷的胎儿。

本公开的方法涵盖用本公开的永生化或分化细胞治疗的造血缺陷包括但不限于造血系统的髓样细胞，红系细胞，淋巴样细胞或巨核细胞的水平降低或其组合，包括表2中所列的那些。选择用于治疗或预防造血疾病或病症的分化细胞的类型，以使其补充受试者的造血缺陷；例如，已经沿淋巴细胞途径分化的永生化HSC用于治疗患有AIDS的个体。

在易受用本公开的细胞系治疗的病症中的是白细胞减少，即外周血中循环白细胞(白细胞)数目的减少。白细胞减少可以通过暴露于某些病毒或辐射来诱导。它通常是各种形式的癌症疗法，例如，暴露于化疗药物、辐射和感染或出血的副作用。

永生化的HSC或分化的造血细胞也可用于治疗或预防中性粒细胞减少，并且例如用于治疗如再生障碍性贫血、周期性粒细胞减少症、特发性中性粒细胞减少症、Chediak-Higashi综合征、系统性红斑狼疮(SLE)、白血病、骨髓增生异常综合征、骨髓纤维化、血小板减少症。严重血小板减少症可能由遗传缺陷如Fanconi氏贫血、Wiscott-Aldrich或May-Hegglin综合征以及化疗和/或放射治疗或癌症引起。获得性血小板减少症可能由自身或同种抗体引起，如在免疫血小板减少性紫癜、系统性红斑狼疮、溶血性贫血或胎儿母体不相容性中。此外，脾肿大、弥散性血管内凝血、血栓性血小板减少性紫癜、感染或假体心脏瓣膜可导致血小板减少症。血小板减少也可以由癌、淋巴瘤、白血病或纤维化的骨髓侵入引起。

许多药物可引起骨髓抑制或造血缺陷。此类药物的实例是AZT、DDI、用于化疗的烷化剂和抗代谢物、抗生素如氯霉素、青霉素、更昔洛韦、道诺霉素和磺胺药物、吩噻嗪酮、安定药如甲氨蝶呤、镇痛药如氨基比林和安乃近、抗惊厥药如苯妥英或卡马西平、抗甲状腺如丙硫氧嘧啶和甲硫咪唑和利尿剂。永生化HSC的移植可用于预防或治疗经常在用这些药物治疗的受试者中发生的骨髓抑制或造血缺陷。

造血缺陷还可以由于病毒，微生物或寄生虫感染以及由于肾病或肾衰竭(例如透析)治疗而发生。永生化HSC的移植可用于治疗此类造血缺陷。

各种免疫缺陷，例如在T淋巴细胞和/或B淋巴细胞，或免疫疾病，例如类风湿性关节炎，也可以通过用永生化HSC的治疗有益地影响。免疫缺陷可为病毒感染(包括但不限于HIV、HTLVI、HTLVII、HTLVIII)、严重暴露于辐射、癌症治疗的结果或其他医药治疗的结果。

6.6.2.神经系统病症和损伤的治疗

可通过本公开的方法治疗涉及需要补充或置换并可通过移植永生化或分化细胞补充的细胞类型的神经系统疾病。这些包括但不限于神经系统损伤，以及导致轴突断开，神经元减少或变性或脱髓鞘的疾病或病症。根据本公开可以在受试者(包括人和非人哺乳动物受试者)中治疗的神经系统损伤包括但不限于中枢(包括脊髓，脑)或周围神经系统的以下损伤：(i)创伤性损伤，包括由物理损伤引起或与手术相关的损伤，例如切断神经系统的一部分的损伤或压迫性损伤；(ii)缺血性损伤，其中神经系统的一部分中缺氧导致神经元损伤或死亡，包括脑梗塞或缺血，或脊髓梗塞或缺血；(iii)恶性损伤，其中神经系统的一部分被恶性组织破坏或损伤，所述恶性组织是神经系统相关的恶性肿瘤或源自非神经系统组织的恶性肿瘤；(iv)感染性损害，其中神经系统的一部分由于感染，例如脓肿而被破坏或损伤或与人免疫缺陷病毒，带状疱疹或单纯疱疹病毒感染或与莱姆病，结核病，梅毒有关；(v)变性性损伤，其中神经系统的一部分由于变性性过程而被破坏或损伤，所述变性性过程包括但不限于与帕金森病，阿尔茨海默氏病，亨廷顿氏舞蹈病或肌萎缩性侧索硬化症相关的变性；(vi)与营养性疾病或病症相关的损伤，其中神经系统的一部分受营养病症或代谢病症破坏或损伤，包括但不限于维生素B12缺乏，叶酸缺乏，韦尼克病(Wernicke disease)，烟草-酒精性弱视(tobacco-alcohol amblyopia)，马-比二氏病(Marchiafava-Bignamidisease)(胼胝体的原发性变性)和酒精性小脑变性；(vii)与全身性疾病相关的神经性损伤，包括但不限于糖尿病(糖尿病性神经病，贝尔麻痹(Bell's palsy))，系统性红斑狼疮，癌或结节病；(viii)由毒性物质，包括酒精，铅或特定神经毒素引起的损伤；和(ix)脱髓鞘损伤，其中神经系统的一部分被脱髓鞘疾病破坏或损伤，包括但不限于多发性硬化，人免疫缺陷病毒相关性脊髓病，脊髓横断面病(transverse myelopathy)或各种病因，进行性多灶性白质脑病和脑桥中央髓鞘溶解。

在具体实施方案中，可以根据本公开治疗的运动神经元病症包括但不限于病症，如梗塞、感染、暴露于毒素、创伤、手术损伤、变性性疾病或可能影响运动神经元的恶性肿瘤以及神经系统的其他组分，以及选择性影响神经元的病症，如肌萎缩性侧索硬化，包括但不限于进行性脊髓性肌萎缩、进行性延髓性麻痹、原发性侧索硬化、婴儿和幼年型肌萎缩、进行性延髓性儿童瘫痪(法齐奥-隆德综合征(Fazio-Londe syndrome))、脊髓灰质炎和小儿麻痹症后期综合征，以及遗传性运动感觉性神经病(夏科-马里-图斯病(Charcot-Marie-Tooth Disease))。

本领域技术人员将理解，上述实施方案仅仅是示例性的；本公开的永生化和/或分化细胞或其后代可用于治疗需要细胞或组织补充的疾病。

6.7前体细胞的保存

在某些实施方案中，(i)在永生化和任选地分化之前，或(ii)在永生化和任选地分化之后，在维持细胞及其基因组两者的完整性的情况下保存本公开的前体细胞。

在优选的实施方案中，通过冷冻保存保存前体细胞。冷冻对大多数活细胞是破坏性的。冷却时，随着外部介质冻结，细胞通过失去水而平衡，因此增加胞内溶质浓度。低于约10℃-15℃，会发生胞内冻结。胞内冷冻和溶液效应两者都造成细胞损伤(Mazur，1970，Science 168:939-949)。因此，优选使用方法冷冻保存前体细胞，所述方法已经确立以在冷冻活细胞时规避细胞损伤，例如使用冷冻保护剂和最佳冷却速率(Meryman等，1977，Cryobiology 14:287-302)。

前体，永生化和分化细胞也可以通过冷冻干燥来保存(由Simione,1992,J.Parenter.Sci.Technol.46(6):226-32综述)。

因为冷冻保存比冷冻干燥有更小的损伤，所以主储液(master stock)通常维持在液氮或相当的温度，而可以冷冻或冷冻干燥工作储液(working stock)。

6.8细胞的遗传工程

永生化细胞群体可以被遗传工程化以产生在将基因工程细胞移植给受试者时有益的基因产物。此类基因产物包括但不限于抗炎因子，例如抗TNF、抗IL-1、抗IL-2等。或者，间充质干细胞和祖细胞可以被遗传工程化以“敲除”MHC的表达以降低排斥的风险。此外，细胞群体可以被遗传工程改造以用于基因治疗，以调整受试者中的基因活性水平，以协助或改善移植结果或治疗由例如重组基因的缺陷引起的疾病。通过将重组核酸导入前体细胞或永生化或分化细胞群体中使细胞群体变为重组的。

在其最广泛的意义上，基因治疗是指通过向受试者施用核酸进行的疗法。核酸直接或间接地通过其编码的蛋白质介导受试者中的治疗效果。本公开提供了基因治疗方法，其中在操纵之前或之后以及在永生化之前或之后将编码(优选对人)具有治疗价值的蛋白质的核酸导入根据本公开的方法操作的前体细胞中，使得所述核酸可由前体细胞和/或其后代表达，然后向受试者施用重组细胞。

本公开的重组细胞可以用于本领域可用的任何基因治疗方法。因此，导入细胞中的核酸可以编码任何所需的蛋白质，例如，在疾病或病症中缺失或功能障碍的蛋白质。下面的描述意在说明此类方法。本领域技术人员将容易理解，所示的方法仅代表所有可用的基因治疗方法的样品。

对于基因治疗方法的一般综述，参见Lundstrom,1999,J.Recept.SignalTransduct.Res.19:673-686；Robbins和Ghivizzani,1998,Pharmacol.Ther.80:35-47；Pelegrin等人,1998,Hum.Gene Ther.9:2165-2175；Harvey和Caskey,1998,Curr.Opin.Chem.Biol.2:512-518；Guntaka和Swamynathan,1998,Indian J.Exp.Biol.36:539-535；Desnick和Schuchman,1998,Acta Paediatr.Jpn.40:191-203；Vos,1998,Curr.Opin.Genet.Dev.8:351-359；Tarahovsky和Ivanitsky,1998,Biochemistry(Mosc)63:607-618；Morishita等人,1998,Circ.Res.2:1023-1028；Vile等人,1998,Mol.Med.Today 4:84-92；Branch和Klotman,1998,Exp.Nephrol.6:78-83；Ascenzioni等人,1997,Cancer Lett.118:135-142；Chan和Glazer,1997,J.Mol.Med.75:267-282。可以使用的重组DNA技术领域中通常已知的方法描述于Ausubel等人(编)，1993,CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY；以及Kriegler,1990,GeneTransfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY。

在其中重组前体细胞用于基因治疗的实施方案中，将在受试者中期望表达的基因导入前体细胞中，使得其可由细胞和/或其后代表达，并且然后在体内施用重组细胞用于治疗效果。

重组细胞群体可用于任何合适的基因治疗方法中，如本领域技术人员在考虑本公开内容时将认识到的。施用于受试者的重组细胞群体的所得作用可例如导致受试者中预选基因的活化或抑制，从而导致折磨受试者的疾病状况的改善。

在该实施方案中，在体内施用所得重组细胞之前，将所需基因导入前体细胞或其后代中。此类导入可以通过本领域已知的任何方法进行，包括但不限于转染、电穿孔、显微注射、脂转染、磷酸钙介导的转染、用含有基因序列的病毒或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合等。本领域已知用于将外源基因导入细胞中的多种技术(参见例如Loeffler和Behr,1993,Meth.Enzymol.217:599-618；Cohen等人,1993,Meth.Enzymol.217:618-644；Cline,1985,Pharmac.Ther.29:69-92)，并且可以根据本公开内容使用，只要受体细胞的必需的发育和生理功能不被破坏。该技术应该提供基因向细胞的稳定转移，使得该基因可被细胞表达，并且优选可遗传的并且可通过其细胞后代表达。通常，转移的方法包括将可选择标志物转移到细胞。然后将细胞置于选择下，以分离已摄取并表达转移的基因的那些细胞。然后，将那些细胞递送给受试者。

实施基因治疗的一种常见方法是通过利用逆转录病毒载体(参见Miller等，1993，Meth.Enzymol.217:581-599)。逆转录病毒载体是已经修饰以掺入预选基因以实现该基因表达的逆转录病毒。已经发现，逆转录病毒的许多天然存在的DNA序列在逆转录病毒载体中是不必要的。仅逆转录病毒的天然存在的DNA序列的小亚组是必需的。通常，逆转录病毒载体必须含有病毒基因组的包装和整合必需的所有顺式作用序列。这些顺式作用序列是：(a)载体每个末端的长末端重复序列(LTR)或其部分；(b)用于负和正链DNA合成的引物结合位点；和(c)将基因组RNA掺入病毒体必需的包装信号。

将用于基因治疗的基因克隆到载体中，其通过感染或将载体递送到细胞中而有助于将基因递送到前体细胞中。关于逆转录病毒载体的更多细节可以参见Boesen等人1994，Biotherapy 6:291-302，其描述了使用逆转录病毒载体将mdr1基因递送至HSC以使干细胞对化学疗法更具抗性。阐明逆转录病毒载体在基因治疗中的应用的其他参考文献是：Clowes等人,1994,J.Clin.Invest.93:644-651；Kiem等人,1994,Blood 83:1467-1473；Salmons和Gunzberg,1993,Human Gene Therapy 4:129-141；以及Grossman and Wilson,1993,Curr.Opin.in Genetics and Devel.3:110-114。

腺病毒也用于基因治疗。腺病毒是向呼吸前体细胞递送基因的特别有吸引力的载体。腺病毒也可用于从肝脏、中枢神经系统、内皮和肌肉递送基因至前体细胞。腺病毒具有能够感染非分裂细胞的优点。Kozarsky和Wilson，1993，Current Opinion in Geneticsand Development 3:499-503提出了基于腺病毒的基因治疗的综述。在基因治疗中使用腺病毒的其他实例可以参见Rosenfeld等人，1991，Science 252:431-434；Rosenfeld等人，1992，Cell 68:143-155；和Mastrangeli等人，1993，J.Clin.Invest.91:225-234。

已经提出腺伴随病毒(AAV)用于基因治疗(Walsh等人，1993，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204:289-300)。还提出了甲病毒用于基因治疗(Lundstrom,1999,J.Recept.Signal Transduct.Res.19:673-686)。

在基因治疗中的基因递送的其他方法包括哺乳动物人工染色体(Vos,1998,Curr.Op.Genet.Dev.8:351-359)；脂质体(Tarahovsky和Ivanitsky,1998,Biochemistry(Mosc)63:607-618)；核酶(Branch和Klotman,1998,Exp.Nephrol.6:78-83)；和三链DNA(Chan和Glazer，1997，J.Mol.Med.75:267-282)。

期望的基因可以通过同源重组在细胞内导入并掺入宿主前体细胞DNA中进行表达(Koller和Smithies,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8932-8935；Zijlstra等人,1989,Nature 342:435-438)。

在具体实施方案中，为了基因治疗的目的而在前体细胞或其后代中重组表达的所需基因包含可操作地连接于编码区的诱导型启动子，使得重组基因的表达可通过控制存在或不存在合适的转录诱导物控制。

在优选的实施方案中，在前体细胞或其后代中重组表达的所需基因侧翼为Cre位点。当不再需要基因功能时，使包含重组基因的细胞经受Lox蛋白，例如是提供含有与诱导型或组织特异性启动子功能性偶联的Lox编码序列的核酸的手段，或通过提供与核内化信号功能偶联的Lox蛋白。Lox重组酶发挥功能以重组Cre序列(Hamilton等人，1984，J.Mol.Biol.178:481-486)，切除该过程中的居间序列，其根据该实施方案含有所需基因的核酸。该方法已经成功地用于操作重组基因表达(Fukushige等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7905-7909)。或者，FLP/FRT重组系统可用于通过位点特异性重组来控制基因的存在和表达(Brand和Perrimon，1993，Development 118:401-415)。

6.9移植方法

无论是否重组表达所需基因，永生化和/或分化的细胞群体均可通过本领域已知的任何方法移植到受试者中用于治疗疾病或损伤或用于基因治疗，所述方法适合于移植的干细胞的类型和移植位置。HSC或更分化的衍生物可以静脉内移植，将定位于肝的肝细胞也可以。神经干细胞可以在损伤或疾病部位直接移植到脑中。

在优选的实施方案中，包含用于移植的永生化或分化细胞的细胞群体是纯化的或至少高度富集的。描述上文4.4节中对前体细胞描述的细胞群体(例如，FACS，MACS等)的纯化和富集的方法适用于纯化或富集用于移植的细胞群体。

在一个实施方案中，永生化或分化细胞的移植是自体的。可以进行自体移植，例如当永生化或分化细胞已经被遗传工程化以表达受试者在其他情况下缺陷的基因时。可以进行永生化或分化细胞的自体移植以在受试者中重建已经由化疗耗尽的造血细胞群体。优选地，在受试者暴露于化疗之前根据本公开的方法分离HSC用于永生化，并且在暴露于化疗后将永生化或分化细胞移植回受试者。

在另一个实施方案中，永生化或分化细胞的移植是非自体的。例如，当受试者自身的细胞不存在或数量太低而不能建立培养物，或者受试者太不舒服而不能进行外植体程序时，实施本实施方案。非自体移植优选与抑制排斥的方法联合使用。

引入方法包括但不限于真皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内和硬膜外途径。细胞群体可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注，通过经由表皮或粘膜皮肤内衬(例如口腔粘膜，直肠和肠粘膜等)的吸收，并且可与其他生物活性剂一起施用。施用可为全身或局部的。此外，可能需要通过任何合适的途径将本公开的药物组合物引入中枢神经系统，包括心室内和鞘内注射；心室内注射可以通过例如附接到储器(例如Ommaya储器)的心室内导管来促进。

在具体实施方案中，可能需要将本公开的细胞群体局部施用于需要治疗的区域；这可以通过例如但不限于手术期间的局部输注，局部施用，例如结合手术后的创伤敷料，通过注射，通过导管，或通过植入物实现，植入物是多孔、非多孔或凝胶状材料，包括膜，例如硅橡胶膜或纤维。

举例而言，可以如下进行细胞向脑中的植入。使用立体定向技术在左壳中的三个位置处进行植入(Lindvall等人，1989,Arch.Neurol.46:615)。对于每个位置，将20μl解离的细胞吸入仪器(外径，1.0mm)中。沿着10、12和14mm线性管道分别以2.5μl部分各注射细胞15至20秒。在每次注射之间有2分钟的延迟，然后插管缩回1.5至1.7mm。在最后一次注射后，将插管原位留置8分钟，然后从脑中缓慢抽出。手术后，按照Brundin等，1985(Brain.Res.331:251)的方法评估细胞存活力。

在优选的实施方案中，细胞移植是自体的。在另一个实施方案中，移植物是非自体的。在具体实施方案中，移植细胞可为根据本公开的方法产生的器官或组织类型。

将有效治疗特定病症或病症的移植的干细胞的滴度将取决于病症或病症的性质，并且可以通过标准临床技术确定。此外，可以任选地使用体外测定法以帮助鉴定最佳剂量范围。在制剂中使用的精确剂量还将取决于施用途径和疾病或病症的严重性，并且应当根据从业者的判断和每个受试者的情况来决定。

受试者优选是动物，包括但不限于动物，如牛、猪、马、鸡、猫、犬等，并且优选是哺乳动物，并且最优选是人。

6.10药物组合物

本公开提供通过向受试者施用药物(治疗性)组合物来治疗的方法，所述药物(治疗性)组合物包含治疗有效量的重组或非重组细胞，其通过根据本发明的方法永生化和任选地分化前体细胞生成。在优选的方面，永生化或分化细胞是基本上纯化的。

本公开提供了药物组合物。此类组合物包含治疗有效量的永生化细胞和药学可接受的载体或赋形剂。此类的载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其组合。载体和组合物可为无菌的。制剂应该适合施用模式。

如果需要的话，组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。组合物可为液体溶液，悬浮液或乳液。

在优选的实施方案中，根据常规方法将组合物配制为适合于静脉内施用于人的药物组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是在无菌等张水性缓冲液中的溶液。在必要时，组合物还可以包含增溶剂和局部麻醉剂，如利多卡因，以减轻注射部位的疼痛。

6.10.1.药物试剂盒

本公开还提供了包含一个或多个容器的药物包装或试剂盒，所述容器填充有通过本公开的方法产生的一种或多种细胞群体和/或用于制备细胞的试剂，或用于对细胞进行遗传操作的细胞。

在优选的实施方案中，本公开的试剂盒在一个或多个容器中包含一种或多种促进前体细胞增殖而非分化的纯化的生长因子和纯化的Notch 1激动剂和/或Notch 2激动剂，所述生长因子和Notch 1激动剂和/或Notch 2激动剂一起有效使在培养物中暴露于它们的前体细胞永生化。任选地，试剂盒还在分开的容器中含有一种或多种促进前体细胞分化的纯化的生长因子。任选地，还提供细胞培养基。任选地与此类容器相关联的可为由管理药物或生物制品的制造，使用或销售的政府机构规定的形式的通知，所述通知显示出机构对制造、施用或销售用于人体施用的批准。

示例性实施方案

1.一种用于产生永生化前体细胞群体的方法，所述方法包括在存在(i)Notch 1激动剂、Notch 2激动剂或Notch 1激动剂和Notch 2激动剂和(ii)一种或多种生长因子的情况下将非永生化前体细胞培养一定时段，使得所述前体细胞在所述时段期间增殖但不终末分化，从而产生永生化前体细胞群体，超出所述时段，不在存在(i)所述Notch 1激动剂、所述Notch 2激动剂或所述Notch 1激动剂和所述Notch 2激动剂和(ii)所述生长因子的情况下的前体细胞类型的细胞停止增殖并且分化或死亡。

2.一种用于产生永生化前体细胞群体的方法，所述方法包括在存在维持低Notch信号强度的量的(i)Notch 1激动剂、Notch 2激动剂或Notch 1激动剂和Notch 2激动剂和(ii)一种或多种生长因子的情况下将非永生化前体细胞培养一定时段，使得所述前体细胞在所述时段期间增殖但不终末分化，从而产生永生化前体细胞群体，超出所述时段，不在存在(i)所述Notch 1激动剂、所述Notch 2激动剂或所述Notch 1激动剂和所述Notch 2激动剂和(ii)所述生长因子的情况下的前体细胞类型的细胞停止增殖并且分化或死亡。

3.一种用于产生永生化前体细胞群体的方法，所述方法包括：

评估由前体细胞的Notch 1受体表达和/或Notch 2受体表达；

在存在维持低Notch信号强度的量的(i)Notch 1激动剂、Notch 2激动剂或Notch1激动剂和Notch 2激动剂，其中基于所述评估选择所述Notch 1激动剂、Notch 2激动剂或Notch 1激动剂和Notch 2激动剂；和(ii)一种或多种生长因子的情况下培养非永生化前体细胞，

持续一定时段，使得所述前体细胞在所述时段期间增殖但不终末分化，从而产生永生化前体细胞群体，超过所述时段，不在存在(i)所述Notch 1激动剂、所述Notch 2激动剂或所述Notch 1激动剂和所述Notch 2激动剂和(ii)所述生长因子的情况下的前体细胞类型的细胞停止增殖并且分化或死亡。

4.本文中公开的实施方案的方法，其中在所述培养期间，以比所述Notch 1激动剂更高的浓度提供所述Notch 2激动剂。

5.本文中公开的实施方案的方法，其中在所述培养期间，所述Notch 2激动剂与所述Notch 1激动剂的比率是150:1；140:1；130:1；120:1；110:1；100:1；90:1；80:1；70:1；60:1；50:1；40:1；30:1；25:1；24:1；23:1；22:1；21:1；20:1；19:1；18:1；17:1；16:1；15:1；14:1；13:1；12:1；11:1；10:1；9:1；8:1；7:1；6:1；5:1；4:1；3:1；2:1；1.5:1；或1.25:1。

6.本文中公开的实施方案的方法，其中在所述培养期间，所述Notch 2激动剂处于0.1μg/ml至50μg/ml的浓度。

7.本文中公开的实施方案的方法，其中在所述培养期间，所述Notch 1激动剂处于0.005μg/ml至30μg/ml的浓度。

8.本文中公开的实施方案的方法，其中在所述培养期间，所述Notch 2激动剂处于20μg/ml的浓度。

9.本文中公开的实施方案的方法，其中在所述培养期间，所述Notch 1激动剂处于2.5μg/ml，10μg/ml或0.15μg/ml的浓度。

10.本文中公开的实施方案的方法，其中在所述培养期间，所述Notch 2激动剂处于10μg/ml的浓度。

11.本文中公开的实施方案的方法，其中在所述培养期间，所述Notch 1激动剂处于0.02μg/ml的浓度。

12.本文中公开的实施方案的方法，其中所述一种或多种生长因子是IL-3；IL-6；TPO；SCF和Flt-3。

13.本文中公开的实施方案的方法，其中在所述培养期间，IL-3处于10ng/ml的浓度。

14.本文中公开的实施方案的方法，其中在所述培养期间，IL-6、TPO、SCF和Flt-3配体中的一种或多种处于50ng/ml的浓度。

15.本文中公开的实施方案的方法，其中所述前体细胞群体在所述时段期间基本上不分化。

16.本文中公开的实施方案的方法，其中所述前体细胞是干细胞。

17.本文中公开的实施方案的方法，其中所述前体细胞是祖细胞。

18.本文中公开的实施方案的方法，其中所述干细胞是造血干细胞(HSC)。

19.本文中公开的实施方案的方法，其中所述祖细胞是造血祖细胞。

20.本文中公开的实施方案的方法，其中所述造血干细胞或祖细胞获自骨髓。

21.本文中公开的实施方案的方法，其中所述造血干细胞或祖细胞获自胎儿或新生儿血液。

22.本文中公开的实施方案的方法，其中所述时段为7-8天。

23.本文中公开的实施方案的方法，其中所述时段为至少5周。

24.本文中公开的实施方案的方法，其中所述时段为至少6周。

25.本文中公开的实施方案的方法，其中基于在所述时段的子集期间由前体细胞的Notch 1受体表达水平选择Notch 1、Notch 2激动剂或Notch 1和Notch 2激动剂。

26.本文中公开的实施方案的方法，其中所述时段的子集包括培养期的前24小时。

27.本文中公开的实施方案的方法，其中所述时段的子集包括培养期的前48小时。

28.本文中公开的实施方案的方法，其中所述时段的子集包括培养期的前72小时。

29.本文中公开的实施方案的方法，其中所述时段的子集包括培养期的前三分之一。

30.本文中公开的实施方案的方法，其中所述时段的子集包括培养期的前四分之一。

31.本文中公开的实施方案的方法，其中所述时段的子集包括培养期的后24小时。

32.本文中公开的实施方案的方法，其中所述时段的子集包括培养期的后48小时。

33.本文中公开的实施方案的方法，其中所述时段的子集包括培养期的后72小时。

34.本文中公开的实施方案的方法，其中所述时段的子集包括培养期的后三分之一。

35.本文中公开的实施方案的方法，其中所述时段的子集包括培养期的后四分之一。

36.本文中公开的实施方案的方法，其中所述时段的子集包括培养期的中间24小时。

37.本文中公开的实施方案的方法，其中所述时段的子集包括培养期的中间48小时。

38.本文中公开的实施方案的方法，其中所述时段的子集包括培养期的中间72小时。

39.本文中公开的实施方案的方法，其中所述时段的子集包括培养期的中间三分之一。

40.本文中公开的实施方案的方法，其中所述时段的子集包括培养期的中间四分之一。

41.本文中公开的实施方案的方法，所述方法还包括基于在所述培养期期间由前体细胞的改变的Notch 1受体表达水平选择Notch 1、Notch 2激动剂或Notch 1和Notch 2激动剂以继续培养。

42.本文中公开的实施方案的方法，其中通过评估Hes1表达测量低Notch信号强度。

43.本文中公开的实施方案的方法，其中通过缺乏前体细胞对Thy1+和CD25+T细胞前体的分化确认低Notch信号强度。

44.本文中公开的实施方案的方法，其中基于在所述时段期间由前体细胞的Notch1受体表达水平选择Notch 1、Notch 2激动剂或Notch 1和Notch 2激动剂。

45.本文中公开的实施方案的方法，其中基于在所述时段期间由前体细胞的Notch2受体表达水平选择Notch 1、Notch 2激动剂或Notch 1和Notch 2激动剂。

46.本文中公开的实施方案的方法，所述方法还包括基于在所述培养期期间由前体细胞的改变的Notch 2受体表达水平选择Notch 1、Notch 2激动剂或Notch 1和Notch 2激动剂以继续培养。

47.本文中公开的实施方案的方法，其中基于在所述时段期间由前体细胞的Notch1受体表达水平和Notch 2受体表达水平选择Notch 1、Notch 2激动剂或Notch 1和Notch 2激动剂。

48.本文中公开的实施方案的方法，所述方法还包括基于在所述培养期期间由前体细胞的改变的Notch 2受体表达水平选择Notch 1、Notch 2激动剂或Notch 1和Notch 2激动剂以继续培养。

49.本文中公开的实施方案的方法，所述方法还包括基于在所述培养期期间由前体细胞的改变的Notch 1受体表达水平和Notch 2受体表达水平选择Notch 1、Notch 2激动剂或Notch 1和Notch 2激动剂以继续培养。

50.本文中公开的实施方案的方法，其中所述评估或进一步评估测量Notch 1受体表达。

51.本文中公开的实施方案的方法，其中所述评估或进一步评估测量Notch 2受体表达。

52.本文中公开的实施方案的方法，其中所述评估或进一步评估测量Notch 1受体表达和Notch 2受体表达。

本公开的用于实施方法和产生细胞和动物的备选实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的，并且意在被包括在所附权利要求书内。提供以下实验实施例为了阐明而不是限制。

7.实施例

包括以下实施例以证明本公开的具体实施方案。本领域普通技术人员应当根据本公开认识到，可以对本文中公开的具体实施方案进行许多改变，并且仍然获得相同或相似的结果，而不脱离本公开的精神和范围。

所描述的实施例显示维持低Notch信号强度(其可以由Notch 1和/或Notch 2介导)导致干细胞的改善的扩增和植入。结果表明，通过选择性侧向同源物活化在干细胞中仔细滴定Notch信号可为有益的。本公开显示当对Notch 1或Notch 2受体特异的单克隆抗体固定化于塑料表面时，在与单独用Delta1^ext-IgG，Notch 2激动剂或对照配体的培养物中小于1倍增加相比，具有低量的Notch 1激动剂与相对更高量的Notch 2激动剂的组合的孔中的鼠骨髓高度富集的干(SK-SLAM)细胞的培养物在培养7-8天后导致SK-SLAM细胞(Sca-1⁺c-kit⁺CD150⁺CD48^-CD11b^-)的2倍增加产生。因此，通过使用提供低Notch信号强度的Notch1激动剂、Notch 2激动剂或Notch1激动剂和Notch 2激动剂的Notch侧向同源物特异性活化提供了扩增干细胞(包括造血干细胞)的新方式。

本公开还提供了Notch信号传导中的定量差异造成髓样分化延迟。由于指示Notch信号传导的定量差异而非定性差异，Notch 1和/或Notch 2的活化可用于产生所需水平的Notch信号传导。此外，由于Notch 1和Notch 2受体表达在培养期间彼此独立地发生，可以基于随时间改变的表达水平来选择不同的Notch激动剂。在这些实施方案中，Notch信号传导可以归因于Notch 1激动剂；Notch 2激动剂；或Notch 1激动剂和Notch 2激动剂的存在。

7.1实施例1

图1。具有特异性Notch抗体的培养物导致SK-SLAM细胞的产生增加。每个条表示具有5μg/ml的Delta1^ext-IgG，5μg/ml的HuIgG和指定剂量的Notch 1[HMN1-12(MN1)]或Notch 2抗体[HMN2-35(MN2)](Biolegend)的固定化单克隆抗体的培养物中SK-SLAM细胞的平均倍数增加的数目。条是与放置在2个单独实验的培养孔中的SK-SLAM的初始数量相比的平均倍数增加+/-范围。

图2。在具有IL-3(10ng/ml)、IL-6、TPO、SCF和Flt-3配体(全部50ng/ml)的Stemspan中将来自两个不同单位的脐带血CD34+细胞培养14天。在存在固定化的retronectin 5μg/ml和Delta1(2.5μg/ml)、抗人Notch 2(克隆MHN2-25，0.5μg/ml)、抗人Notch 2 0.5μg/ml与抗人Notch 1(克隆MHN1-519)的组合，或对照IgG的情况下培养细胞。Notch抗体维持比Delta或对照IgG更高比例的CD34+祖细胞和更原始的CD34+90低细胞。此外，单独的和与Notch 1抗体组合的Notch 2抗体给出CD34+CD90低细胞的更大扩增。

图3。在如上文培养14天后，将10,000个脐带血CD34+细胞的扩增后代移植到每组6只NSG小鼠的每只中。在移植后两周通过流式细胞术分析来自小鼠的骨髓抽吸物的植入。Notch 1抗体和Notch 2抗体的组合使得比单独的Delta、IgG或Notch 2抗体显著更高水平的人植入(对于两个脐带血单位分别为p＝0.0024和p＝0.0225)。

在另一个应用中，这些方法应用于在体内衍生的胚胎造血干细胞。在AGM(Aorta-Gonad-Mesonephros)区域中的发育期间产生第一HSC，并且共表达内皮(VE-钙粘着蛋白)和造血(CD45)标志物。已经确定使用固定化配体Delta1(2.5μg/ml)，retronectin 5μg/ml，rmSCF，rhIL6，rhFLT3L(均为100ng/ml)，rhTPO(20ng/ml)和小分子TGF-β抑制(10μM)的组合的条件，其能够在培养物中扩增来自鼠AGM-衍生的CD45+/VE-钙粘着蛋白+细胞的短期和长期再增殖HSC/祖先。对于固定化在塑料表面上的Notch 1或Notch 2受体特异性的单克隆抗体可以替代该培养系统中的Delta1，现在显示产生能够在移植测定法中的髓样和淋巴样植入的细胞。此外，在初步实验中，使用固定化MN2抗体的Notch 2特异性侧向同源物活化在5天培养期后产生更大数量的LSK-SLAM(Sca1+c-kit+CD150+CD48-F480-Gr1-)细胞(A)，并且与固定化的Notch配体Delta1^ext-IgG相比导致增强的2周和6周外周血植入(B)。因此，Notch侧向同源物特异性活化可以进一步增强从胚胎来源扩展多谱系HSC的能力，其可以在从新来源，如胚胎干细胞和诱导的多能干细胞扩增HSC中具有应用。

图4。特异性Notch抗体上的AGM衍生的CD45+/VE-钙粘着蛋白+细胞的培养实现LSK-SLAM细胞的产生和多谱系植入。A.在2.5μg/ml的Delta1^ext-IgG、2.5μg/ml的HuIgG和对于Notch 1[HMN1-12(MN1)]或Notch 2抗体[HMN2-35(MN2)](Biolegend)的指定剂量的固定化单克隆抗体上在培养5天后产生的通过流式细胞术得到的LSK-SLAM(Sca1+c-kit+CD150+CD48-Gr1-F480-)细胞的数目。每一个AGM当量的输入起始CD45+/VE-钙粘着蛋白+细胞表示细胞数，并且误差条表示所分析的一式三份孔的标准偏差。B-D。在图A中培养的细胞的第2周和第6周外周血植入，每只小鼠以0.5AGM当量的起始细胞(CD45.2)以3×10⁴挽救CD45.1骨髓细胞移植。显示每个分析小鼠的外周血中占总CD45+细胞百分比的％供体植入(CD45.2)，供体髓样植入(Gr1和/或F480)和供体B淋巴样(CD19)/T淋巴样(CD3)植入。

图5和图6提供额外的数据。

图3和7。图7在具有IL-3(10ng/ml)、IL-6、TPO、SCF和Flt-3配体(全部50ng/ml)的Stemspan中将来自两个单独单位的脐带血CD34+细胞(实验409)或两个单位的合并物(实验414)培养14天。在存在固定化的retronectin 5μg/ml和Delta1(2.5μg/ml)，抗人Notch 2(克隆MHN2-25，0.5μg/ml，实验409)，抗人Notch 1(克隆MHN1-519,0.02μg/ml，实验414)，抗人Notch 2 0.5μg/ml与抗人Notch 1 0.02μg/ml的组合，或对照IgG的情况下培养细胞。

将10,000个细胞的扩增后代移植到每组五只(实验414)或六只(实验409)NSG小鼠的每只中。在移植后两周(两个实验)和移植后8周(实验414)通过流式细胞术分析骨髓抽吸物的总人(CD45)，淋巴样(CD19)和髓样。对于实验409，在移植后10周收获并分析骨髓。

图8A和8B以及9A，9B和9C提供额外的数据。

7.2实施例2

单个Notch侧向同源物的胞内结构域(ICD)的定性差异不影响谱系测定。作为朝向进一步推进谱系测定受Notch信号强度的定量差异影响的模型的步骤，评估Notch 1或Notch 2的信号传导能力的定性差异以测定它们是否影响细胞命运决定。为了评估这些差异，使用小鼠，其中将整个Notch 2-ICD的基因组编码区交换到Notch 1基因座(N 1^12/12)，并且将Notch 1-ICD交换到Notch 2基因座(N 2^21/21)中(Liu Z,Chen S,Boyle S,Zhu Y,ZhangA,Piwnica-Worms DR等人Dev Cell.2013；25(6):585-98)。在肾发育的研究中，其中Notch2，而非Notch 1在器官发生中起不可缺少的作用，发现在N2^21/21小鼠中发育是正常的，表明交换的Notch 1-ICD是功能性的，并且与Notch 2-ICD相当地运行。关于造血，结果显示N1^{12 /12}和N2^21/21小鼠都能既在体内又在体外产生与同窝仔对照相似的T，B和髓样细胞数目(图10)。该结果证实了我们在谱系测定中的Notch信号传导的定量模型。

7.3实施例3

与固定化的Delta 1配体相比，由固定化的侧向同源物特异性抗体介导的Notch活化产生快速再增殖细胞的显著增加。Notch侧向同源物表达的动态变化伴随鼠造血作用。Notch 2是新鲜分离的LSK-SLAM(谱系-Sca1+Kit+CD150+CD48-)和LSK细胞表面上的主要Notch受体，而Notch 1在具有高密度Delta1的培养(以HSPC合并物为代价促进向T细胞分化的条件)后变成主要的(数据未显示)。由于细胞表面表达的此种转变，研究了与固定化Delta1相比，使用侧向同源物特异性抗体的个别受体的选择性活化是否将限制Notch活化并增强再增殖细胞的离体产生。将鼠骨髓LSK-SLAM细胞与固定化的Delta1或固定化的针对Notch 2胞外结构域的活化抗体一起培养，并在限制稀释移植测定法中使用。发现了与Delta1相比，抗体选择性Notch 2活化在移植后6周产生高3.6倍的再增殖细胞频率(在测试的最高细胞剂量下，对于谱系再增殖，L计算p＝0.02)(数据未显示))。这些研究显示了，Notch侧向同源物特异性抗体与Notch配体相比更大程度增强了再增殖细胞的离体产生。

与鼠LSK-SLAM细胞相反，新鲜分离的脐带血(CB)CD34⁺细胞表达Notch 1和Notch2两者(图11)。用对人Notch 1或Notch 2的胞外结构域特异性的固定化抗体(MHN1-519和MHN2-25，参见www.Biolegend.com；Haraguchi K,Suzuki T,Koyama N,Kumano K,NakaharaF,Matsumoto A等人J Immunol.2009；182(10):6168-78)培养2周的CB CD34⁺细胞比先前发表的最佳剂量的固定化Delta1可再现地产生实质性更多的CD34⁺和CD34⁺CD90^lo细胞，再增殖细胞驻留的不太成熟的CD34⁺细胞亚群(Delaney C,Varnum-Finney B,Aoyama K,Brashem-Stein C,Bernstein ID.Blood.2005；106(8):2693-9；Delaney C,Heimfeld S,Brashem-Stein C,Voorhies H,Manger RL,Bernstein ID.Nat Med.2010；16(2):232-6；CD90^lo细胞是那些表达少量CD90的细胞，如由先前在Majeti R,Park CY,Weissman IL.CellStem Cell 2007；1:635-645中限定的门控截留量确定)(数据未显示)。最重要的是，与固定化的Delta1相比，用使CD34⁺CD90^lo细胞产生最大化的固定化抗Notch 1或抗Notch 2抗体(分别为MHN1-519和MHN2-25)浓度培养的CD34⁺细胞在NOD-scid IL2Rγ无效(NSG)小鼠中诱导显著更大的快速再增殖(2-3周)活性(图12；p值MHN1-519＝0.0286，p值MHN2-25＝0.0460)。总体而言，这些数据指向使用侧向同源物特异性Notch活化以增加离体衍生的HSPC，增强用于治疗应用的快速再增殖细胞的产生。

7.4实施例4

侧向同源物特异性Notch抗体活化对配体诱导的活化不易感的Notch受体。作为解决个别受体抗体在诱导可移植HSPC的扩增中为何比配体更有效的第一步，通过固定化的Delta1，抗Notch 1或抗Notch 2抗体测试CB CD34+细胞是否展现在4小时Notch活化后立即诱导靶基因Hes1的表达的能力的差异。针对它们各自的氨基末端片段(包括参与配体的EGF结构域)产生抗Notch 1抗体(MHN1-519)或抗Notch 2抗体(MHN2-25)(均可从Biolegend,San Diego,CA购得)，以及针对它们关联的近膜阴性调节区(NRR)产生抗Notch 1和抗Notch2抗体(此类抗体在下文中分别称为NRR-N1和NRR-N2)，已知其在可溶时抑制Notch活化并且在固定化时活化(个人通信C.Siebel,Genentech；Wu Y,Cain-Hom C,Choy L,HagenbeekTJ,de Leon GP,Chen Y,等人Nature.2010；464(7291):1052-7)(图13)。如图14中显示，用MHN1-519诱导导致比Delta1高2-3倍的Hes1表达。相反，MHN2-25在测试的较低剂量导致比Delta1高大约两倍的Hes1表达，但在较高剂量等同于Delta1。相比之下，NRR-N1和NRR-N2在诱导Hes1表达方面不如各自的EGF抗体有效。

进一步的研究解决观察到的激动剂活化效力的差异是否反映了Delta1和MHN1-519或MHN2-25与更原始的CD34⁺CD90^lo HSPC亚群上的Notch相互作用的差异能力。将新鲜分离的CB CD34⁺CD90^lo和CD34⁺CD90^-细胞与Delta1，MHN1-519或对照IgG温育4小时，并且通过qPCR测定Hes1表达。与CD34⁺CD90^-细胞相比，与暴露于Delta1相比，观察到CD34⁺CD90^lo群体暴露于MHN1-519后更大的Notch活化的趋势(图15A)。这些数据与CD34⁺CD90^lo细胞中的配体结合测定法的结果相关，其中MHN1-519和MHN2-25能够结合它们各自的侧向同源物，而Delta1显示很少的结合或没有结合(数据未显示)。在通过用细胞因子培养分化这些细胞后，如通过Hes1表达测量，发现与固定化Delta1或MHN1-519相当水平的Notch活化(图15B)。总之，这些研究表明MHN1-519和MHN2-25在产生CD34⁺CD90^lo细胞方面更有效，因为它们结合到最初对Delta1结合和活化不易感的受体的能力。

能够抑制Notch受体的反式表达的配体活化的一种机制是由内源性表达的配体介导的顺式抑制。最近的研究已经显示顺式表达的配体可以与反式结合的配体与相同的Notch受体界面相互作用(Luca VC,Jude KM,Pierce NW,Nachury MV,Fischer S,GarciaKC.Science.2015；347(6224):847-53)。假设Notch抗体激动剂能够在顺式表达的配体的背景下诱导其关联受体的活化，因为抗体-受体界面不同于配体-受体界面。为了测试此假设，利用Jurkat细胞中的交叉阻断测定法。发现Delta1的添加阻断了加myc标签的Delta1的结合，但不阻断MHN1-519的结合(图16)。这些研究表明MHN1-519结合Notch 1上的表位，其不同于Delta1结合的位点。进一步发现，涵盖Notch 1EGF样重复序列7-14的多肽(包括参与配体结合的EGF样重复序列11和12)抑制Delta1与Notch 1的结合，但不改变MHN1-519与Notch的相互作用1(数据未显示)，提供激动剂抗体和配体相互作用界面是独特的进一步证据。此外，由于用于产生MHN1-519抗体的免疫原涵盖Notch 1EGF样重复序列1-13，简单的消减表明抗体表位可能驻留于Notch 1膜远端EGF样重复序列1-6中，其在配体结合位点的N末端。

为了确定抗体是否能够活化否则为顺式抑制的配体，使用在表达Notch 1变体的CHO-K1细胞中先前开发的Notch报告基因系统，其中Notch 1的ICD被酵母Gal4连同UAS驱动YFP报告基因替换。使用此系统，显示由外源Delta1的Notch受体刺激导致YFP的积累(Sprinzak D,Lakhanpal A,Lebon L,Santat LA,Fontes ME,Anderson GA,等人Nature.2010；465(7294):86-90)。然而，稳定整合的四环素诱导型Delta1基因的共表达导致顺式抑制，防止反式配体对Notch的活化，减少YFP积累。因此，这些细胞提供了用于分析顺式抑制和Notch活化的验证模型。使用此系统，观察到当在不存在顺式配体的情况下外源性呈递时，MHN1-519和Delta1两者均能以剂量依赖性方式诱导YFP(图17)。如先前所示，在诱导顺式表达的配体时，反式Delta不能活化Notch。然而，当呈递有MHN1-519时，Notch 1能够信号传导，而不管顺式配体状态。总之，这些数据表明，经由与Delta1不同的Notch 1界面，MHN1-519能够活化由于配体顺式抑制而通常不易感的Notch受体。

为了评估内源性配体表达的顺式抑制在我们的人CB研究中造成抗体的优势的可能性，使用定量RT-PCR和FACS分析测定CB CD34⁺CD90^lo细胞是否表达规范(DLL1，DLL3，DLL4，JAG1和JAG2)或非规范(DLK1和DLK2)配体。PCR评估揭示了Jag2，Dll1，Dll4和Dlk1的表达(数据未显示)。使用FACS分析，在已知含有再增殖细胞的原始CD34⁺CD90^lo亚群上，但非在CD34⁺CD90^-亚群上确认Jag2的细胞表面表达(数据未显示)。

使用MHN1-519和MHN2-25，在固定化Delta1上两周扩增之前和期间，评估CB衍生的CD34⁺细胞的Notch 1和Notch 2的细胞表面表达(图18)。虽然新鲜分选的CB CD34⁺细胞表达相对相同量的Notch 1和Notch 2，但培养中的时间显示出细胞表面表达的动态变化，Notch1持续增加并且Notch 2减少，然后保持恒定

7.5实施例5

侧向同源物特异性Notch 1抗体产生比Delta更高数目的淋巴样祖细胞。在具有IL-3(10ng/ml)、IL-6、TPO、SCF和Flt-3配体(全部50ng/ml)的Stemspan中将来自两个单独单位的脐带血CD34⁺细胞培养7天。在存在固定化的retronectin 5μg/ml和(i)固定化的对照IgG(ii)固定化的Delta1，0.5，2.5或10μg/ml)，或者(iii)固定化的抗人Notch 1抗体((0.02，0.1，0.5或2.5μg/ml，克隆MHN1-519(可购自Biolegend，San Diego，CA))的情况下培养细胞。通过流式细胞术评估常见淋巴样祖细胞(CLP)、CD34⁺/CD38^-/CD7⁺群体。结果示于图19中。在具有抗Notch 1抗体的情况下的细胞生长产生比Delta 1更高数目的CLP。

7.6实施例6

用固定化的Notch 1抗体培养的脐带血CD34⁺细胞当移植到NSG小鼠中时导致T细胞植入。在具有IL-3(10ng/ml)、IL-6、TPO、SCF和Flt-3配体(全部50ng/ml)的Stemspan中将来自两个单位的合并物的脐带血CD34⁺细胞培养14天。在存在固定化的retronectin 5μg/ml和(i)Delta1 2.5μg/ml，(ii)对照IgG，(iii)抗人Notch 1抗体0.02μg/ml(克隆MHN1-519(可购自Biolegend,San Diego,CA))或(iv)与抗人Notch 2 0.5μg/ml(克隆MHN2-25，(可购自Biolegend,San Diego,CA))组合的抗人Notch 1 0.02μg/ml的情况下培养细胞。

在培养的第14天，将10,000个细胞的扩增后代移植到每组5只NSG小鼠的每只中。18周后，收获骨髓，并且通过流式细胞术评估总人植入(CD45百分比，图20A)和人T细胞植入(CD3百分比，图20B)。用抗Notch 1抗体培养的细胞在5只小鼠中的4只中生长T细胞。仅在接受用抗Notch 1抗体培养的细胞的小鼠中形成人T细胞(CD3⁺)(图20B)，表明在细胞的部分中诱导较高的Notch信号，所述部分足以诱导向T细胞谱系的分化，并且产生迁移并且植入胸腺中的细胞，在那里它们成熟为CD3⁺T细胞。

除非另有指示，本公开的实践可以采用免疫学，分子生物学，微生物学，细胞生物学和重组DNA的常规技术。这些方法描述于以下出版物中。参见，例如Sambrook等人Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版(1989)；F.M.Ausubel等人编,CurrentProtocols in Molecular Biology,(1987)；系列Methods IN Enzymology(AcademicPress,Inc.)；M.MacPherson等人,PCR:A Practical Approach,IRL Press at OxfordUniversity Press(1991)；MacPherson等人编PCR 2:Practical Approach,(1995)；Harlow和Lane编Antibodies,A Laboratory Manual,(1988)；以及R.I.Freshney编Animal CellCulture(1987)。

如本领域普通技术人员将理解，本文中公开的每个实施方案可以包含其具体陈述的元件，步骤，成分或组分，基本上由或由其具体陈述的元件，步骤，成分或组分组成。如本文中使用，过渡术语“包括”或“包含”意指包括但不限于，并且允许包括甚至大量的未规定的元素，步骤，成分或组分。过渡短语“由...组成”排除未规定的任何元素，步骤，成分或组分。过渡短语“基本上由...组成”将实施方案的范围限为规定的要素，步骤，成分或组分以及不实质影响实施方案的那些。如本文中使用，材料效应将导致HSPC的扩增或植入的统计学显著的降低。

除非另有指示，在说明书和权利要求书中使用的表示成分量，性质如分子量，反应条件等的所有数字应理解为在所有情况下由术语“约”修饰。因而，除非相反指出，否则在说明书和所附权利要求书中列出的数值参数是近似值，其可以根据本发明寻求获得的期望性质而变化。至少，并且不试图将等同原则的应用限制于权利要求书的范围，每个数值参数应当至少根据报告的有效数字的数目并通过应用普通的舍入技术来解释。当需要进一步澄清时，术语“约”具有本领域技术人员在与所述数值或范围结合使用时，合理地归因于它的含义，即表示稍微大于或略小于所述值或范围，在所述值的±20％的范围内；所述值的±19％；所述值的±18％；所述值的±17％；所述值的±16％；所述值的±15％；所述值的±14％；所述值的±13％；所述值的±12％；所述值的±11％；所述值的±10％；所述值的±9％；所述值的±8％；所述值的±7％；所述值的±6％；所述值的±5％；所述值的±4％；所述值的±3％；所述值的±2％；或所述值的±1％。

尽管阐述本发明的宽范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体实例中阐述的数值尽可能精确地报道。然而，任何数值固有地包含必然由在它们各自的测试测量中发现的标准偏差导致的某些误差。

在描述本发明的上下文中(特别是在所附权利要求书的上下文中)使用的术语“一个”，“一种”，“该/所述”和类似指示物应被解释为覆盖单数和复数，除非本文中另有指示或与上下文明显矛盾。本文中数值范围的叙述仅仅意在充当单独提及落在该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文中另有指示，否则每个单独的值被并入本说明书中，如同其在本文中被单独叙述一样。本文中所述的所有方法可以以任何合适的顺序进行，除非本文中另有指示或上下文明显矛盾。本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不对所要求保护的本发明的范围构成限制。说明书中的语言不应被解释为指示对本发明的实践必要的任何非要求保护的要素。

本文中公开的本发明的备选元件或实施方案的分组不应被解释为限制。每个组成员可以单独地或者与组的其他成员或本文中找到的其他元素的任何组合被提及和要求保护。预期为了方便和/或可专利性的原因，组中的一个或多个成员可以包括在组中或从组中删除。当发生任何此类纳入或删除时，说明书被认为含有如修饰的组，从而满足在所附权利要求书中使用的所有马库什组的书面描述。

本文描述了本发明的某些实施方案，包括发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。当然，在阅读前述描述后，这些所描述的实施方案的变化对于本领域普通技术人员将变得显而易见。发明人预期熟练技术人员在适当时采用此类变化，并且本发明人意图以除本文中具体描述以外的方式实施本发明。因此，本发明包括适用法律所允许的所附权利要求中所述的主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另有指示或与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述元件在其所有可能变型中的任何组合。

此外，在整个说明书中已经对专利和印刷出版物进行了许多参考。以上引用的参考文献和印刷出版物中的每一个通过引用单独地以其具体引用的教导并入本文。

最后，应当理解，本文中公开的本发明的实施方案说明本发明的原理。可以采用的其他修改在本发明的范围内。因此，作为示例而非限制，可以根据本文中的教导利用本发明的备选配置。因此，本发明不限于精确如示出和描述的。

本文中所示的细节作为实例并且仅出于对本发明的优选实施方案的说明性讨论的目的，并且是为了提供被认为是本发明的各个实施方案的原则和构思方面的最有用和容易理解的描述而提出。在这方面，没有试图比基本理解本发明所必需更为详细示出本发明的结构细节，用附图和/或实施例进行的描述使得本领域技术人员明白如何可以在实践中体现本发明的几种形式。

在本公开中使用的定义和解释意味着并且旨在在任何未来的构造中进行控制，除非在以下实例中清楚和明确地修改，或者当意义的应用使任何解释无意义或基本上无意义时。在该术语的解释将使其无意义或基本上无意义的情况下，该定义应取自韦氏字典，第3版或本领域普通技术人员已知的字典，例如Oxford Dictionary of Biochemistry andMolecular Biology(Ed.Anthony Smith,Oxford University Press,Oxford,2004)。

本文中引用了各种参考文献，如专利，专利申请和出版物，其公开内容在此通过引用的方式以其整体并入本文。

Claims (17)

1.一种用于扩增造血干细胞/祖细胞的方法，所述方法包括

在存在以下的情况下培养所述造血干细胞/祖细胞：

(a)一种或多种Notch激动剂，其包括(i)Notch 1特异性抗体或其抗原结合片段，其特异性结合至Notch 1的胞外EGF重复结构域；(ii)Notch2特异性抗体或其抗原结合片段，其特异性结合至Notch 2的胞外EGF重复结构域；或(iii)Notch 1特异性抗体或其抗原结合片段，其特异性结合至Notch 1的胞外EGF重复结构域，和Notch 2特异性抗体或其抗原结合片段，其特异性结合至Notch 2的胞外EGF重复结构域，以及

(b)生长因子；

从而产生扩增的造血干细胞/祖细胞群体。

2.根据权利要求1所述的方法，其在所述培养步骤前和/或期间，还包括检测由所述造血干细胞/祖细胞进行的Notch 1和/或Notch 2表达，

其中如果在检测步骤中检测到Notch 1，在所述培养步骤中使用Notch 1特异性抗体或其抗原结合片段，和/或

其中如果在检测步骤中检测到Notch 2，在所述培养步骤中使用Notch 2特异性抗体或其抗原结合片段。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养持续一定时段使得所述造血干细胞/祖细胞增殖但不终末分化，且超出所述时段，不在存在(a)(i)所述Notch 1特异性抗体或其抗原结合片段、(ii)所述Notch 2特异性抗体或其抗原结合片段或(iii)所述Notch 1特异性抗体或其抗原结合片段和所述Notch 2特异性抗体或其抗原结合片段，以及(b)所述生长因子的情况下培养的造血干细胞/祖细胞停止增殖并且分化或死亡。

4.根据权利要求1所述的方法，其中在存在所述Notch 1特异性抗体或其抗原结合片段和所述Notch 2特异性抗体或其抗原结合片段的情况下进行所述培养。

5.根据权利要求1所述的方法，其中在(i)存在Notch 1特异性抗体或其抗原结合片段但不存在Notch 2特异性抗体或其抗原结合片段的情况下或(ii)存在Notch 2特异性抗体或其抗原结合片段但不存在Notch 1特异性抗体或其抗原结合片段的情况下进行所述培养。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述造血干细胞/祖细胞获自脐带血。

7.根据权利要求1所述的方法，其中在所述培养期间，所述Notch 2特异性抗体或其抗原结合片段的浓度为0.1μg/ml至50μg/ml。

8.根据权利要求1所述的方法，其中在所述培养期间，所述Notch 1特异性抗体或其抗原结合片段的浓度为0.005μg/ml至30μg/ml。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述生长因子是白介素3(IL-3)、白介素-6(IL-6)、血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)和Flt-3配体。

10.根据权利要求1所述的方法，其中培养的时间周期为7天至6周。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述Notch 1特异性抗原结合片段和/或Notch 2特异性抗原结合片段选自Fv、Fab、Fab’、F(ab’)₂或单链Fv片段(scFv)的抗原结合片段。

12.根据权利要求1所述的方法，其中在第一固相上固定化所述Notch 1特异性抗体或其抗原结合片段和/或所述Notch 2特异性抗体或其抗原结合片段。

13.根据权利要求1所述的方法，其中在第一固相上固定化所述Notch 1特异性抗体或其抗原结合片段以及在第二固相上固定化所述Notch 2特异性抗体或其抗原结合片段。

14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述第一固相是组织培养皿或烧瓶的表面或珠粒。

15.根据权利要求13所述的方法，其中(i)所述第一固相是组织培养皿或烧瓶的表面，并且所述第二固相是珠粒，或(ii)所述第一固相是珠粒并且所述第二固相是组织培养皿或烧瓶。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述造血干细胞/祖细胞是(i)造血干细胞，(ii)造血祖细胞，(iii)造血干细胞和造血祖细胞。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还产生能够迁移至胸腺并且产生成熟T细胞的早期T细胞的干细胞/祖细胞。

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