JP2005531285A - スフィンゴ脂質代謝および／またはシグナル伝達の調節のための組成物および方法 - Google Patents

スフィンゴ脂質代謝および／またはシグナル伝達の調節のための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

癌および筋肉障害を診断および処置するための組成物、方法およびキットが提供される。治療組成物は、スフィンゴ脂質代謝経路および／またはシグナル伝達経路を調節する薬剤を含み得る。このような組成物は、癌に罹患した哺乳動物に投与され得る。診断方法およびキットは、スフィンゴ脂質代謝に関与する内因性遺伝子中の変更を検出するのに適切な薬剤を使用し得る。このような方法およびキットは、癌の存在を検出するため、または既知の疾患の予後を評価するために使用され得る。ＳＰＬポリペプチド、ＳＰＬポリヌクレオチドおよびＳＰＬ抗体もまた提供される。

Description

（関連出願の引用）
本出願は、２００２年１月１７日に出願された仮出願番号６０／３４９，５８２および２００２年１月１７日に出願された米国特許出願番号１０／０５３，５１０の利益を主張し、両方の出願は、それら全体について参考として本明細書中で援用される。
（連邦後援を受けている調査または開発に関する陳述）
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって授与されたＧｒａｎｔ番号１Ｒ０１ＣＡ７７５２８下での政府による支持のもとでなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、一般的に癌の検出および治療に関する。本発明は、スフィンゴ脂質の代謝に関するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドの発現および／または活性を調節する薬剤により特に関する。このような薬剤は、例えば、癌（例えば、乳癌、結腸癌、子宮癌、胃癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌および直腸癌）の診断および／または処置、筋肉発達欠陥および心筋症の診断および処置、ならびに遺伝知覚神経障害１型およびスフィンゴリピドーシスの診断および処置に使用され得る。本発明は、スフィンゴ脂質代謝に関するポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現および／または活性を調節する薬剤をスクリーニングする方法にさらに関する。
（関連分野の説明）
乳癌は、米国および世界中で女性にとって重要な健康の問題である。進歩は、この疾患の検出および処置についてなされたが、乳癌は現在も、癌の最も共通の形態であり、そして米国の女性にとって、癌の死亡を導く第二の原因である。米国黒人女性と１５〜５４歳の女性との間で、乳癌は、癌死亡の主要な原因である。米国で８人に１人の女性は、乳癌を発生し、その危険性は、１９５０〜１９９０年の間に５２％増加した。１９９４年には、１８２，０００人の新しいケースの女性乳癌が、診断され、そして４６，０００人の女性が、この疾患により死亡することが推定される。
乳癌の予防または処置のためのワクチンまたは他の広く成功する方法は、現在利用可能ではない。この疾患の管理は現在、早い診断（慣用的な胸スクリーニング手順）および一つ以上の様々な処置（例えば、手術、放射線治療、化学治療およびホルモン治療）を含み得る、攻撃的な処置の組み合わせを頼りにしている。特定の乳癌についての処置の経路は、特定の腫瘍マーカーの分析を含む、様々な予後パラメーターに基づいてしばしば選択される。しかし、確立されたマーカーの使用は、解釈することが困難であるという結果をしばしば導く。
現在の治療では、腫瘍侵襲性および転移は、乳癌患者の結果について重要な決定因子である。限局性乳癌と診断された女性について５年間の生存度は、約９０％であるが、疾患が転移した女性については、５年間の生存度が、１８％に落ちる。現在の治療は、この重篤な疾患を有する女性の大集団について、腫瘍侵襲性を阻害するために不適正である。
結腸癌は、米国で２番目に最も頻繁に診断された悪性疾患ならびに癌死亡の２番目に最も共通の原因である。早い限局性段階で検出された結腸直腸癌を有する患者についての５年生存率は、９２％であり；不運にも、結腸直腸癌の３７％だけが、この段階で診断されている。癌が、隣接器官またはリンパ結節に広がることを可能にされる場合、生存率は、６４％まで落ち、そして遠隔転移を有する患者については７％まで落ちる。
結腸癌の予後は、腸壁を通る腫瘍の穿通の程度および結節性併発の存在または非存在に直接的に関連し、従って、早い検出および処置は、特に重要である。現在、診断は、糞潜血、Ｓ状結腸鏡検査、結腸鏡検査および二重造影バリウム注腸についてのスクリーニングアッセイの使用によって補助される。処置レジメンは、癌の型および段階によって決定され、そして手術、放射治療および／または化学治療を包含する。手術（治療の最も共通の形態）後の再発は、主な問題であり、そしてしばしば、死亡の最終的な原因である。疾患についての治療へのかなりの研究にかかわらず、結腸癌は今なお、診断および処置することが困難である。これらおよび他の癌についての治療へのかなりの研究にかかわらず、結腸癌を、効果的に診断および処置することは困難なままである。従って、改善は、乳癌および結腸癌の処置、診断ならびに予防において必要とされる。本発明は、この必要性を果たし、そしてさらに他の関連した有利な効果を提供する。
スフィンゴ脂質の合成または異化の欠失または失調症を生じる変異は、遺伝知覚神経障害１型およびスフィンゴリピドーシスと呼ばれるリソソーム貯蔵疾患の群を含む、多数のヒト疾患の直接的な原因である（Ｂｅｊａｏｕｉ、Ｋ．、Ｗｕ、Ｃ．、Ｓｃｈｅｆｆｌｅｒ、Ｍ．Ｄ．、Ｈａａｎ、Ｇ．、Ａｓｈｂｙ、Ｐ．、Ｗｕ、Ｌ．、ｄｅ Ｊｏｎｇ、Ｐ．ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ、Ｒ．Ｈ．、Ｊｒ．（２００１）．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２７、２６１−２．；Ｄａｗｋｉｎｓ、Ｊ．Ｌ．、Ｈｕｌｍｅ、Ｄ．Ｊ．、Ｂｒａｈｍｂｈａｔｔ、Ｓ．Ｂ．、Ａｕｅｒ−Ｇｒｕｍｂａｃｈ、Ｍ．ａｎｄ Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ、Ｇ．Ａ．（２００１）．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２７、３０９−１２．；Ｇａｂｌｅ、Ｋ．、Ｈａｎ、Ｇ．、Ｍｏｎａｇｈａｎ、Ｅ．、Ｂａｃｉｋｏｖａ、Ｄ．、Ｎａｔａｒａｊａｎ、Ｍ．、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｒ．ａｎｄ Ｄｕｎｎ、Ｔ．Ｍ．（２００２）．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７、１０１９４−２００．）。証拠の大きな一群は現在、スフィンゴ脂質代謝およびスフィンゴ脂質代謝の酵素が、真核細胞中で細胞移動、ストレス応答、生存度、分化、老化、アポトーシス、レセプターシグナル伝達、およびエンドサイトーシスを調節する際の重要な役割を果たすことを示す。これらの知見は、スフィンゴ脂質が、動物生理学に影響し得、そして疾患状態に貢献し得る分子メカニズムを示唆する。
スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ−１−Ｐ）は、ほとんどの哺乳動物細胞および血清中に存在する内因性スフィンゴ脂質代謝産物である。他の様スフィンゴ脂質代謝産物（例えば、セラミドおよびスフィンゴシン）と同様に、Ｓ−１−Ｐは、特異的なシグナル伝達経路に関与する。細胞増殖の発癌補助作用、移動の増大、アポトーシスの阻害および新脈管形成の刺激を含む、Ｓ−１−Ｐシグナル伝達の多くの効果は、癌細胞の形質転換、増殖、薬物抵抗、血管分布および転移能力に影響する。いくつかの観察は、スフィゴシンキナーゼ（ＳＫ）およびスフィゴシン−１−リン酸リアーゼ（ＳＰＬ）が、癌関連遺伝子であり得る考えを支持する。第一に、ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞中でのＳＫの過剰発現は、トランスフェクトされた細胞の、インビトロで病巣を形成する能力、およびＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス中で線維肉腫を形成する能力によって決定されたような、腫瘍形成の形質転換を導く。第二に、ヒトＳＰＬは、クローン化され、そして様々なヒトの癌で頻繁に削除される染色体領域である、１０ｑ２１にマップされた。一緒にすると、これらの観察は、ＳＫおよびＳＰＬが、癌の処置についての薬理学的介入のための潜在的に有効な標的であり得る可能性を生じる。従って、本発明は、スフィンゴ脂質の代謝を調節する薬剤をスクリーニングするための方法を提供する。さらに、本発明は、癌を検出および処置するための方法を提供する。
新規治療薬剤の同定および開発における重大な段階は：（ａ）候補薬剤の発生；および（ｂ）効力および安全性についての候補薬剤のスクリーニングである。無作為配列化学プロトコルの出現により、ライブラリーとして公知である、多くの潜在化合物は、迅速に生成され得る。このようなライブラリーは、潜在治療薬剤の収集として働く。潜在治療薬剤のライブラリーの発生に続き、ライブラリーは、有望な候補を同定するためにスクリーンされなければならない。
スクリーニングの目的のため、多くのインビトロハイスループットスクリーニングのプロトコールが、開発されてきた。しかしながら、これらのインビトロスクリーニングアッセイは、インビボスクリーニングアッセイの前になされるべきである。インビトロアッセイにより見込みのある化合物を、即座にヒトでスクリーニングすることは望ましくないため、このような細胞増殖性疾患に対する治療剤の同定の重要な段階として、潜在的治療化合物のヒト以外の動物モデルでのスクリーニングがある。よって、癌および他の細胞増殖性疾患のヒト以外の動物モデルは、このような疾患に対する治療剤の発見において、重要な役割を果たす。
癌および他の細胞増殖性疾患の処置に使用する治療剤を同定するためにスクリーニング目的で使用され得る、ヒト以外の動物モデルのひとつの型として、ヒト以外の哺乳類モデル、例えばマウスなどがある。しかしながら、マウスは、高価であり、世代交代時間が遅くかつ産み出す子孫の数が少ない。その理由で、多数のハイスループットスクリーニングには、理想的でない方である。
従って、癌、およびスフィンゴ脂質代謝の変化に関連したほかの疾患に対する治療剤の同定に対する、さらなる動物モデルといったものが、要求される。特に興味があるものは、大量の子孫産出によって特徴づけられる、比較的短期の寿命でかつ速い生殖サイクルを持つ動物モデルの開発である。好ましくは、このような動物モデルは、維持することが比較的単純で、かつ経済的であるべきである。
（発明の簡単な要旨）
上に記したように、本発明は、一般的に癌の検出および治療に関連する。本発明は、より具体的には、スフィンゴ脂質、ポリペプチドの代謝および／または信号伝達に関するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにこのようなポリペプチドの発現および／または活性を調節する薬剤、および／またはスフィンゴ脂質中間体のレベルを変化させる薬剤に関連する。このような薬剤は、例えば、乳房、結腸、子宮、胃、卵巣、肺、腎臓および直腸の癌のような癌の診断および／または処置、筋肉発達障害および心筋症の診断および処置、ならびに１型遺伝性感覚ニューロパシーおよびスフィンゴリピドーシスの診断および処置に使用され得る。本発明は、スフィンゴ脂質の代謝および／または信号伝達に関する構成要素および中間体を調節する薬剤のスクリーニングの方法に、さらに関連する。
スフィンゴ脂質代謝を調節する薬剤を同定する方法を提供することは、本発明の一局面であり、この方法は、（ａ）ホモ接合型ヌル変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒを、候補薬剤の非存在下および存在下で、その変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒにおいて、（ｉ）少なくとも一つのスフィンゴ脂質中間体、または（ｉｉ）スフィンゴ脂質経路の少なくとも一つの構成要素の活性のうちの、どちらかのレベルに対するその薬剤の効果を観察するのに十分な条件および時間で、培養する工程（ここでその変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒは、スフィンゴ脂質経路の構成要素をコードする遺伝子にＰ因子トランスポゾンの挿入を含み、少なくとも一つのスフィンゴ脂質中間体の変化したレベル、および少なくとも一つのスフィンゴ脂質経路構成要素の変化した活性レベルのうち、少なくとも一つの結果を招く。）；および（ｂ）その候補薬剤の存在下での（ｉ）産生されるスフィンゴ脂質中間体、または（ｉｉ）そのスフィンゴ脂質経路構成要素の活性のうちの、どちらかのレベルを、その候補薬剤の非存在下でのレベルと比較する工程（ここで変化したレベルが、その薬剤がスフィンゴ脂質代謝を調節することを示す。）を包含する。ある実施形態では、スフィンゴ脂質中間体の変化したレベルは、Ｃ１４／１６長鎖ベースの増加を含み、また別の実施形態では、スフィンゴ脂質中間体の変化したレベルは、Ｃ１４／１６リン酸化長鎖ベースの増加を含む。ある実施形態では、スフィンゴ脂質経路の構成要素をコードする遺伝子は、配列番号１５、２４および２５のどれか一つに示されたポリヌクレオチド配列を包含する。ある実施形態では、そのホモ接合型ヌル変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒは、飛行しない表現型を示し、および特定の別の実施形態では、そのホモ接合型ヌル変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒは、腫瘍を含む。ある実施形態では、そのホモ接合型ヌル変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒは、胸部筋肉の異常な発生パターン形成を包含するＴ２セグメントを包含する。ある実施形態では、候補薬剤の存在下で産生されたスフィンゴ脂質中間体のレベルの変化は、スフィンゴシン−１−ホスフェートの減少を包含し、およびある実施形態では、候補薬剤の存在下で産生されるスフィンゴ脂質中間体のレベルの変化は、スフィンゴシン−１−ホスフェートの増加を包含する。
また別の実施形態では、候補薬剤の存在下でのスフィンゴ脂質経路構成要素の活性のレベルの変化は、スフィンゴシン−１−ホスフェートリアーゼ（ＳＰＬ）活性の減少を包含し、一方で別の実施形態では、候補薬剤の存在下でのスフィンゴ脂質経路構成要素の活性のレベルの変化は、スフィンゴシン−１−ホスフェートリアーゼ（ＳＰＬ）活性の増加を包含する。また別の実施形態では、候補薬剤の存在下でのスフィンゴ脂質経路構成要素の活性のレベルの変化は、スフィンゴシンキナーゼ（ＳＫ）活性の減少を包含し、一方で別の実施形態では、候補薬剤の存在下でのスフィンゴ脂質経路構成要素の活性のレベルの変化は、スフィンゴシンキナーゼ（ＳＫ）活性の増加を包含する。ある実施形態では、その薬剤は、ＳＫ活性を阻害し、およびある別の実施形態では、その薬剤は、ＳＰＬ活性を阻害する。ある実施形態では、その薬剤は、１−アリール−２−ジメチルアミノプロパン−１，３−ジオール誘導体を包含し、およびある別の実施形態では、その薬剤は、脂肪酸アミド基の置換を包含する。あるさらなる実施形態では、その置換は、２つのＮ−メチル基を包含する。別の実施形態では、その薬剤は、セリンパルミトイルトランスフェラーゼの活性を増加させる。
別の局面に向けると、本発明は、スフィンゴ脂質代謝を調節する薬剤を同定する方法を提供し、この方法は、（ａ）ホモ接合型ヌル変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒを、候補薬剤の非存在下および存在下で、上記変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒにおいて、（ｉ）少なくとも一つのスフィンゴ脂質中間体、または（ｉｉ）スフィンゴ脂質経路の少なくとも一つの構成要素の活性のうちの、どちらかのレベルに対するその薬剤の効果を観察するのに十分な条件および時間で、培養する工程（ここでその変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒは、スフィンゴ脂質経路の構成要素をコードする遺伝子にＰ因子トランスポゾンの挿入を含み、少なくとも一つのスフィンゴ脂質経路構成要素の変化した活性レベルの結果を招く。そして、その変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒは、上記挿入から生じる、飛行しない表現型を示す）；および（ｂ）その候補薬剤の存在下で培養されるその変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの飛行能力を、その候補薬剤の非存在下で培養されるその変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの飛行能力に対して、比較する工程（ここでその薬剤の存在下で培養されたその変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの飛行能力の増加は、その薬剤がスフィンゴ脂質代謝を調節することを示す）を包含する。ある実施形態では、その変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａは、スフィンゴシン−１−ホスフェートリアーゼ（ＳＰＬ）をコードする遺伝子のホモ接合型変異を包含し、およびある実施形態では、そのホモ接合型ヌル変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒは、胸部筋肉の異常な発生パターン形成を包含するＴ２セグメントを包含する。ある実施形態では、スフィンゴ脂質代謝を調節するその薬剤は、スフィンゴシンキナーゼ活性を阻害する。
なお別の実施形態では、スフィンゴ脂質信号伝達を調節する薬剤を同定する方法が提供され、（ａ）ホモ接合型ヌル変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒを、候補薬剤の非存在下および存在下で、上記変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒにおいて、少なくとも一つのスフィンゴ脂質中間体のレベルに対するその薬剤の効果を観察するのに十分な条件および時間で、培養する工程（ここでその変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒは、スフィンゴ脂質経路の構成要素をコードする遺伝子にＰ因子トランスポゾンの挿入を含み、少なくとも一つのスフィンゴ脂質中間体の変化したレベルの結果を招く）；および（ｂ）その候補薬剤の存在下で産生されるスフィンゴ脂質中間体のレベルと、その候補薬剤の非存在下でのレベルを比較する工程（ここで変化したレベルは、その薬剤がスフィンゴ脂質シグナル伝達の調節を示す）を包含する。上に記された方法のうちのいずれか一つの方法によって同定される薬剤を提供することもまた、本発明の局面であり、ある実施形態では、そのような薬剤を、生理学的に受容可能なキャリアと組み合わせて含む組成物である。ある実施形態では、ホモ接合型ヌル変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒの飛行能力を増加させる薬剤を含む組成物が、提供される（ここでその変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒは、配列番号１６に示されたアミノ酸配列を含むスフィンゴシン−１−ホスフェートリアーゼ（ＳＰＬ）ポリペプチドをコードする遺伝子にＰ因子トランスポゾンの挿入を含み、ここでその変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒは、上記挿入から生じる、飛行しない表現型を示し、あるさらなる実施形態では、その薬剤は、スフィンゴシンキナーゼ活性を阻害する）。
本発明の特定の別の実施形態によると、配列番号１５に示されたヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸構築物にて形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を培養する工程；および、スフィンゴシン−１−ホスフェートリアーゼポリペプチドを回収する工程を包含する、スフィンゴシン−１−ホスフェートリアーゼ（ＳＰＬ）ポリペプチドを調製するための方法が、提供される。
なお別の実施形態では、スフィンゴシン−１−ホスフェートリアーゼ活性を調節する薬剤を同定するための方法が、提供され、この方法は、（ａ）候補薬剤を、配列番号１６に示されたアミノ酸配列、および配列番号１６に示されたアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を持つアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドに接触させる工程（ここでそのポリペプチドは、スフィンゴシン−１−ホスフェートリアーゼ活性を持ち、かつその接触の工程は、その候補薬剤を上記ポリペプチドと相互作用させ得るのに十分な条件および時間で、実施される）；および（ｂ）その候補薬剤の存在下で、スフィンゴシン−１−ホスフェートまたはスフィンゴシン−１−ホスフェート誘導体の上記ポリペプチドによる分解を、その候補薬剤の存在下での、前記ポリペプチドによる、スフィンゴシン−１−ホスフェートまたはスフィンゴシン−１−ホスフェート誘導体の分解に対して比較して決定し、そこからスフィンゴシン−１−ホスフェートリアーゼ活性を調節する薬剤を同定する工程、を包含する。
別の実施形態では、スフィンゴシン−１−ホスフェートリアーゼ活性を調節する薬剤を同定するための方法が、提供され、（ａ）候補薬剤を、配列番号１６に示されたアミノ酸配列、および配列番号１６に示されたアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を持つアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する細胞を含む生物学的サンプルに接触させる工程（ここで上記ポリペプチドは、スフィンゴシン−１−ホスフェートリアーゼ活性を持ち、かつその接触の工程は、その候補薬剤をそのポリペプチドと相互作用させ得るのに十分な条件および時間で、実施される）；および（ｂ）その候補薬剤の存在下での、スフィンゴシン−１−ホスフェートまたはスフィンゴシン−１−ホスフェート誘導体の上記ペプチドによる分解を、その候補薬剤の非存在下での、スフィンゴシン−１−ホスフェートまたはスフィンゴシン−１−ホスフェート誘導体の上記ポリペプチドによる分解に対して比較して決定し、そこからスフィンゴシン−１−ホスフェートリアーゼ活性を調節する薬剤を同定する工程、を包含する。ある実施形態では、その決定工程は、その細胞からの抽出物のインビトロアッセイを含む。
ある実施形態では、本発明は、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて、ポリペプチド（配列番号１６に示された配列を含む上記ポリペプチド）のスフィンゴシン−１−ホスフェートリアーゼ活性を調節する薬剤を含む組成物を提供する。あるさらなる実施形態では、その薬剤は、ポリヌクレオチドを含む。ある別のさらなる実施形態では、その薬剤は、配列番号１６に示された配列を含むスフィンゴシン−１−ホスフェートリアーゼ（ＳＰＬ）ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含み、ここでその抗体は、ＳＰＬポリペプチドのスフィンゴシン−１−ホスフェートを分解する能力を増加させる。ある実施形態では、本発明は、癌細胞の増殖を阻害するための方法を提供し、この方法は、その癌細胞を、配列番号１６に示された配列を含むポリペプチドのスフィンゴシン−１−ホスフェートリアーゼ活性を増加させる薬剤と接触させる工程を含む。あるさらなる実施形態では、その薬剤は、内在性のスフィンゴシン−１−ホスフェートリアーゼ遺伝子の発現を増加させ、ある別のさらなる実施形態では、その癌細胞は乳癌細胞である。
別の実施形態によると、哺乳動物での癌の発生、転移の発生、または癌および転移の両方の発生を阻害するための方法が提供され、この方法は上記哺乳動物に、配列番号１６に示された配列を含むポリペプチドのスフィンゴシン−１−ホスフェートリアーゼ活性を増加させる薬剤を投与する工程を、包含する。あるさらなる実施形態では、その薬剤は、内在性のスフィンゴシン−１−ホスフェートリアーゼ遺伝子の発現を増加させ、あるなおさらなる実施形態では、その薬剤は、標的化する成分と連結され、あるなおさらなる実施形態では、その成分は、抗腫瘍抗体であり、別のなおさらなる特定の実施形態では、その成分は、エストロゲン受容体に結合する。ある実施例では、その哺乳動物は、乳癌に罹患している。
患者における癌の存在を決定するための方法を提供することは、本発明の一局面であり、この方法は、（ａ）少なくとも一つのポリヌクレオチドを含み、かつ癌を持っている疑いのある患者から採取される、第一の生物学的サンプルを、配列番号２３に示された核酸配列を含むポリヌクレオチドに特異的である、少なくとも一つのオリゴヌクレオチドに接触させる工程；（ｂ）その第一のサンプルの中のそのポリヌクレオチドにハイブリダイズするそのオリゴヌクレオチドの量を、検出する工程；および、（ｄ）その第一のサンプルの中のそのポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドのその量を、癌を保持しないことが知られている正常コントロール被験体から採取された、第二の生物学的サンプルの中のポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの量に対して、比較する工程を包含する。ここでその第二のサンプルの中のそのポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドのその量に対して比較した、その第一の生物学的サンプルの中のそのポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドのその量の、統計学的に有意な減少は、上記患者内における癌の存在を意味する。
スフィンゴ脂質代謝の変化に関連した疾患を診断するための方法を提供することは、本発明の別の局面であり、この方法は、（ａ）少なくとも一つのポリヌクレオチドを含み、かつスフィンゴ脂質代謝の変化に関連した疾患を持っている疑いのある患者から採取される、第一の生物学的サンプルを、配列番号２３に示された核酸配列を含むポリヌクレオチドに特異的である、少なくとも一つのオリゴヌクレオチドに接触させる工程；（ｂ）その第一のサンプルの中のそのポリヌクレオチドにハイブリダイズするそのオリゴヌクレオチドの量を、検出する工程；および、（ｄ）その第一のサンプルの中のそのポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドのその量を、スフィンゴ脂質代謝の変化に関連した疾患を保持しないことが知られている正常コントロール被験体から採取された、第二の生物学的サンプルの中のポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの量に対して、比較する工程を包含する。ここでその第二のサンプルの中のそのポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドのその量に対して比較した、その第一の生物学的サンプルの中のそのポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドのその量の、統計学的に有意な減少は、上記患者内におけるスフィンゴ脂質代謝の変化に関連した疾患の存在を意味する。
患者における癌の存在を決定するための方法を提供することは、本発明の別の局面であり、この方法は、（ａ）少なくとも一つのポリヌクレオチドを含み、かつ癌を持っている疑いのある患者から採取される、第一の生物学的サンプルを、配列番号２２に示された核酸配列を含むポリヌクレオチドに特異的である、少なくとも一つのオリゴヌクレオチドに接触させる工程；（ｂ）その第一のサンプルの中のそのポリヌクレオチドにハイブリダイズするそのオリゴヌクレオチドの量を、検出する工程；および、（ｄ）その第一のサンプルの中のそのポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドのその量を、癌を保持しないことが知られている正常コントロール被験体から採取された、第二の生物学的サンプルの中のポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの量に対して、比較する工程を包含する。ここでその第二のサンプルの中のそのポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドのその量に対して比較した、その第一の生物学的サンプルの中のそのポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドのその量の、統計学的に有意な増加は、上記患者内における癌の存在を意味する。
スフィンゴ脂質代謝の変化に関連した疾患を診断するための方法を提供することは、本発明の別の局面であり、この方法は、（ａ）少なくとも一つのポリヌクレオチドを含み、かつスフィンゴ脂質代謝の変化に関連した疾患を持っている疑いのある患者から採取される、第一の生物学的サンプルを、配列番号２２に示された核酸配列を含むポリヌクレオチドに特異的である、少なくとも一つのオリゴヌクレオチドに接触させる工程；（ｂ）その第一のサンプルの中のそのポリヌクレオチドにハイブリダイズするそのオリゴヌクレオチドの量を、検出する工程；および、（ｄ）その第一のサンプルの中のそのポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドのその量を、スフィンゴ脂質代謝の変化に関連した疾患を保持しないことが知られている正常コントロール被験体から採取された、第二の生物学的サンプルの中のポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの量に対して、比較する工程を包含する。ここでその第二のサンプルの中のそのポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドのその量に対して比較した、その第一の生物学的サンプルの中のそのポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドのその量の、統計学的に有意な増加は、上記患者内におけるスフィンゴ脂質代謝の変化に関連した疾患の存在を意味する。患者の中のスフィンゴ脂質代謝の変化に関連した疾患を処置するための方法を提供することは、本発明の別の局面であり、この方法は、上記患者に、上に記される方法のいずれかに従って同定される薬剤を投与する工程を、包含する。あるさらなる実施形態では、その疾患は、結腸癌、乳癌、子宮癌、胃癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、直腸の腺癌、１型遺伝性感覚ニューロパシー、または、いずれか一つのスフィンゴリピドーシスである。
本発明のこれらのおよび他の局面は、以下の詳細な説明および付属の図面の参照によって明確になり得る。本明細書中に開示されるすべての参考文献（ウェブサイトを含む）は、それぞれが個別に援用されるように、それらの全体が参考として援用される。
配列番号１は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＰＬの決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２は、配列番号１に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＰＬのアミノ酸配列である。
配列番号３は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ＳＰＬの決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４は、配列番号３に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされるＣ．ｅｌｅｇａｎｓ ＳＰＬのアミノ酸配列である。
配列番号５は、マウスＳＰＬの決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６は、配列番号５に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされるマウスＳＰＬのアミノ酸配列である。
配列番号７は、全長ヒトＳＰＬの決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８は、配列番号７に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされるヒトＳＰＬのアミノ酸配列である。
配列番号９は、欠失を含むヒトＳＰＬの決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０は、配列番号９に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされる欠失を含むヒトＳＰＬのアミノ酸配列である。
配列番号１１は、配列番号１２に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされるＣ．ｅｌｅｇａｎｓ ＳＰＬのアミノ酸配列である。
配列番号１２は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ＳＰＬの決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３は、ＰＣＲプライマーである。
配列番号１４は、ＰＣＲプライマーである。
配列番号１５は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＳＰＬをコードする決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６は、配列番号１５に示されるｃＤＮＡ配列によりコードされる、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＳＰＬのアミノ酸配列である。
配列番号１７は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１４４６３８に示されるヒトＳＰＬの決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８は、配列番号１７に提供されるポリヌクレオチド配列によりコードされるヒトＳＰＬのアミノ酸配列である。
配列番号１９は、第一Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＳＫタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号２０は、第二Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＳＫタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号２１は、ヒトＳＫタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号２２は、配列番号２１に示されるヒトＳＫタンパク質をコードするｃＤＮＡである。
配列番号２３は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列をコードする、ヒトＳＰＬのｃＤＮＡ配列である。
配列番号２４は、配列番号１９および２８に示されるアミノ酸配列をコードする、第一Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＳＫ１、ＧＩ：２１４２９１７３についての全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５は、配列番号２０および２９に示されるアミノ酸配列をコードする、第二Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＳＫ２、ＧＩ：１７８６２１６９についての全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＳＰＬの全長ｃＤＮＡ配列、クローンＧＨ１３７８３、ＧＩ：１５２９２４６０である。
配列番号２７は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＳＰＬの全長ｃＤＮＡ配列、クローンＬＰ０４４１３、ＧＩ：１５２９２４６０である。
配列番号２８は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＳＫ１、ＣＧ１７４７の全長アミノ酸配列である。
配列番号２９は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＣＧ２１５９の全長アミノ酸配列である。
（発明の詳細な説明）
本発明は、スフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達を調節する薬剤のための組成物および方法（スクリーニングアッセイを含む）を提供し（その薬剤は、スフィンゴ脂質中間体のレベル、および／またはスフィンゴ脂質の代謝経路および／またはシグナル伝達経路の一つ以上の構成要素の活性に対して影響を有する。）、かつさらに、上記薬剤のスクリーニングのための方法を提供する。本発明の薬剤は、癌および変化したスフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達に関連した他の疾患の検出、診断、および治療における有用性を持つ。
一般に、本発明は、さまざまな癌（例えば、結腸、乳房、子宮、胃、卵巣、肺、腎臓および直腸の腺癌）を含む、数多くのヒトの疾患における、スフィンゴ脂質中間体の関与、ならびにスフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達に関与する構成要素に関連する。特に、本発明は、ＳＰＬの発現が、結腸の膠質癌および結腸の腺癌において減少するという予期せぬ知見に由来する。また、より詳細に以下に開示する本発明によると、減少したＳＰＬの発現は、子宮の腺癌においても観察され、および、ＳＫの発現は、さまざまな腫瘍組織（例えば、乳房、子宮、胃、卵巣、肺、腎臓および直腸の腺癌）において、正常な組織に比べて増加する。スフィンゴ脂質の代謝経路および／またはシグナル伝達経路に関与する他の構成要素は、他のヒトの疾患にもまた関連する。特に、スフィンゴ脂質の合成および異化の、欠損および調節不全は、１型遺伝性感覚ニューロパシーおよび、スフィンゴリピドーシスと呼ばれるリソソーム蓄積症のグループを含む、多数のヒトの疾患についての直接の原因である（Ｂｅｊａｏｕｉ，Ｋ．，Ｗｕ，Ｃ．，Ｓｃｈｅｆｆｌｅｒ，Ｍ．Ｄ．，Ｈａａｎ，Ｇ．，Ａｓｈｂｙ，Ｐ．，Ｗｕ，Ｌ．，ｄｅ Ｊｏｎｇ，Ｐ．およびＢｒｏｗｎ，Ｒ．Ｈ．，Ｊｒ．（２００１）．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２７，２６１−２．；Ｄａｗｋｉｎｓ，Ｊ．Ｌ．，Ｈｕｌｍｅ，Ｄ．Ｊ．，Ｂｒａｈｍｂｈａｔｔ，Ｓ．Ｂ．，Ａｕｅｒ−Ｇｒｕｍｂａｃｈ，Ｍ．およびＮｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｇ．Ａ．（２００１）．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２７，３０９−１２．；Ｇａｂｌｅ，Ｋ．，Ｈａｎ，Ｇ．，Ｍｏｎａｇｈａｎ，Ｅ．，Ｂａｃｉｋｏｖａ，Ｄ．，Ｎａｔａｒａｊａｎ，Ｍ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ．およびＤｕｎｎ，Ｔ．Ｍ．（２００２）．ＪＢｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７，１０１９４−２００．）。
本発明は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＳＰＬ変異体およびＳＫ変異体が、変化したスフィンゴ脂質代謝を示すという、予期せぬ知見とさらに関連する。驚くべきことに、ＳＰＬ変異体のハエは、飛行しない表現型を持ち、そのような変異体のハエを、スフィンゴ脂質の代謝経路および／またはシグナル伝達経路の構成要素を改変させる薬剤の存在下で飼育することにより、その表現型は、回復され得る。従って、本発明は、本明細書に記載のヒトの疾患の検出、診断および処置に有用な薬剤のスクリーニングに使用され得る、変化したスフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達を有する、変異体および／またはトランスジェニックのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒを、提供する。
（スフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達の構成要素）
スフィンゴ脂質の代謝経路および／またはシグナル伝達経路のどの要素も、本発明の状況に含まれる。そういうものとして、スフィンゴ脂質の代謝経路および／またはシグナル伝達経路の構成要素としては、ＳＰＬ、ＳＫ、セラミダーゼ、Ｓ−１−ＰＰ、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）、３−ケトジヒドロスフィンゴシンレダクターゼ、セラミドシンターゼ、スフィンゴシンデサチュラーゼ、セラミドキナーゼ、ホスホエタノールアミンシチジリルトランスフェラーゼ、ＣＤＰ−エタノールアミンホスホトランスフェラーゼ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、スフィンゴミエリンシンターゼ、中性スフィンゴミエリナーゼ、オキソスフィナニンレダクターゼ、およびグルコシルセラミドシンターゼといった、これらの経路に関与する酵素（及び上記酵素をコードするポリヌクレオチド）が挙げられるが、それらに限定されない。スフィンゴ脂質の代謝経路および／またはシグナル伝達経路の構成要素は、細胞内レセプターまたは細胞表面のレセプター、および、ＥＤＧレセプター（例えば、ＥＤＧ１、ＥＤＧ３、ＥＤＧ５、ＥＤＧ６、ＥＤＧ８）およびＣＦＴＲのような、上記レセプターをコードするポリヌクレオチドを、さらに含む。
一般に、スフィンゴ脂質代謝は、本明細書に記載される、任意のスフィンゴ脂質またはスフィンゴ脂質中間体に関与する、すべての合成および異化の経路として見なされ得る。スフィンゴ脂質シグナル伝達経路は、当該分野で公知であり、Ｐｙｎｅ，Ｓ．，およびＮ．Ｊ．Ｐｙｎｅ．２０００ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３４９：３８５−４０２およびＰｙｎｅ，Ｓ．，ならびにＮ．Ｊ．Ｐｙｎｅ．２０００ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８８：１１５−１３１に記載されるようなスフィンゴシン−１−ホスフェートのシグナル伝達経路のような、スフィンゴ脂質により活性化される任意のシグナル伝達経路として、本明細書では一般に見なされ得る。しかしながら、他のスフィンゴ脂質シグナル伝達経路は、本発明の範囲にあり、本明細書中で企図されることを、当業者は、認識する。
従って、本発明は、スフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達に関与するポリペプチド、およびそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、任意の長さのアミノ酸鎖を包含し、それらは、スフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達に関与する、全長の内因性（すなわち、ネイティブ）タンパク質および内因性配列の改変体を含む。本発明の例示的ポリペプチドは、配列番号２，４，６，８，１０，１１，１６，１８〜２１、および２８〜２９に示される。特に例示的なポリペプチドは、配列番号１６，１８〜２１、および２８〜２９に示される。「改変体」は、本発明のポリペプチドと、置換、欠失および／または他の改変においてのみ配列が異なり、その結果その改変体は、例えば細胞内Ｓ−１−Ｐ、セラミド、スフィンゴシン、または他のＬＣＢまたはＬＣＢＰのレベルといった、本明細書中に記載される代表的方法を使用して決定され得る、一つ以上のスフィンゴ脂質中間体のレベルに影響を与えることにより、スフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達を改変する能力を保持する、ポリペプチドである。本発明に一般に含まれるペプチド改変体は、本明細書に示されるペプチド配列に対し、その長さに沿って少なくともおよそ７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％またはそれより上の同一性を典型的には示す。ポリペプチド改変体の中において、アミノ酸置換が、好ましくはネイティブのポリペプチドのアミノ酸残基の５０％以下でなされ、より好ましくはそのアミノ酸残基の２５％以下でなされる。このような置換は、好ましくは保存的である。保存的置換は、一つのアミノ酸が、同様の特性を持つ別のアミノ酸に置換されその結果、ペプチド化学の当業者が、そのポリペプチドの二次構造および疎水性親水性性質は実質的に不変であると予測する、置換である。一般に、以下のアミノ酸は、保存的変化を示す：（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ。置換、欠失および／またはアミノ酸付加は、そのポリペプチドのいかなる位置においてもなされ得、但し、その改変は、その改変体が細胞内Ｓ−１−Ｐのレベルを調節する能力を減少させない。このように、改変体は、本明細書に提供されるネイティブのポリペプチド配列の一部分のみを含み得る。さらに、またはあるいは、改変体は、付加のアミノ酸配列（例えば、リンカー、タグおよび／またはリガンドといったもの）を、好ましくはアミノ末端および／またはカルボキシ末端に含み得る。このような配列は、例えば、そのポリペプチドの精製、検出または細胞への取り込みを容易にするために使用され得る。
ポリペプチド配列を比較する場合、二つの配列は、その二つの配列のアミノ酸の配列が、以下に記載されるように、最大の一致性のために整列された場合に同じとなる場合に、「同一」であると言われる。二つの配列間の比較は、配列類似性の局所領域を同定および比較するための、比較ウィンドウ上での配列比較によって典型的に行われる。本明細書で使用する「比較ウィンドウ」は、少なくとも２０個連続する位置のセグメント（通常は、３０〜およそ７５、４０〜およそ５０）を指し、その中では、配列は、同じ数の連続する位置の参照配列と、その二つの配列を、最適に整列した後に、比較され得る。
比較のための配列の最適な整列化は、デフォルトパラメータを使用して、バイオインフォマティクスソフトウェアのＬａｓｅｒｇｅｎｅパッケージソフト（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用して実行され得る。このプログラムは、以下の参照に記載されるいくつかの整列化理論体系を具体化する：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ、第５巻補遺３、ｐｐ．３４５−３５８；Ｈｅｉｎ Ｊ．（１９９０）Ｕｎｉｆｉｅｄ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ ｐｐ．６２６−６４５ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ第１８３巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｈａｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ Ｗ．（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ ４：１１−１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．（１９７１）Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ １１：１０５；Ｓａｉｔｏｕ，Ｎ．Ｎｅｉ，Ｍ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．（１９７３）Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ−ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：７２６−７３０。
あるいは、比較のための配列の最適な整列化は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ ２：４８２の局所同一性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の同一性整列化アルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅの中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、または視察によって実行され得る。
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するために適するアルゴリズムの好ましい例として、ＢＬＡＳＴアルゴリズムよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが挙げられ、これらは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０にそれぞれ記載される。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、例えば、本明細書に記載のパラメータを用いて、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列同一性のパーセントを決めるために使用され得る。ＢＬＡＳＴ分析の実行のためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公に入手可能である。アミノ酸配列に関して、スコアリングマトリックスが、累積スコアの計算のために使用され得る。各方向でのワードヒットの拡張は、以下の場合に停止される：累積整列化スコアが、最大到達値から量Ｘの分低下する場合；一つ以上の負のスコアとなる残基整列化の蓄積に起因して、累積スコアが０またはそれ以下となる場合；または、どちらかの配列の末端に達する場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、整列化の感度および速度を決定する。
「単離された」ポリペプチドは、元来の環境から離されたポリペプチドである。例えば、天然に存在するタンパク質またはポリペプチドは、それが、自然の系で共存する物質のうちのいくつかまたはすべてから分離されている場合に、単離されている。好ましくは、そのようなポリペプチドは、精製もされる。例えば、そのようなポリペプチドには、少なくとも９０％純粋であり、より好ましくは少なくとも９５％純粋であり、そして最も好ましくは少なくとも９９％純粋である。
本発明の一つの実施形態において、ポリペプチドは、スフィンゴ脂質の代謝経路および／またはシグナル伝達経路の構成要素を含む融合タンパク質を含む。本発明は、別の局面で、少なくとも一つの上記のポリペプチドを含む融合タンパク、ならびにそのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドも、代表的には薬学的組成物（例えば、生理学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む、ワクチン組成物）の形態として、さらに提供する。その融合タンパク質は、本明細書に記載の、複数のポリペプチドまたはその部分／改変体を含み得、そのポリペプチドの発現、精製、検出を容易にするために、および／またはそのポリペプチドの活性のために、一つ以上のポリペプチドセグメントをさらに含み得る。
一般に、スフィンゴ脂質の代謝経路および／またはシグナル伝達経路のポリペプチド構成要素、および、本明細書記載のそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、当該分野で周知の種々の技術のいずれかを使用して調製され得る。例えば、ネイティブのＳＫ、ＳＰＬまたはＳＰＴをコードするＤＮＡ配列は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）またはハイブリダイゼーション技術を使用して、適切なｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーからの増幅により調製され得る。ライブラリーは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載されるような、当業者に周知の方法を使用して、一般には調製およびスクリーニングされ得る。ｃＤＮＡライブラリーは、スフィンゴ脂質代謝に関与する酵素を含むことが公知であるさまざまな供給源のいずれかから、調製され得る。例えば、ＳＰＬ活性は、血小板（そこでは、ＳＰＬ活性が、著しく欠失する）を例外として、種および哺乳類組織に関して遍在する。ラットの組織においては、最高レベルの活性が、腸粘膜、肝臓およびハーダー腺において示されており、骨格筋および心臓において低い活性が示されている。活性は、多数のヒト（肝臓癌細胞株ＨＢ８０６５、子宮頸癌ＨｅＬａ）、マウス（肝臓癌株ＢＷ１、マウス胚３Ｔ３−Ｌ１、Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞）および他の細胞株ならびにヒト培養線維芽細胞でも示されている。好ましいｃＤＮＡライブラリーは、ヒトの肝臓、腸または脳の組織または細胞から調製され得る。使用され得る他のライブラリーは、当業者にとって明らかである。増幅における使用のためのプライマーは、ネイティブのＳＰＬ、ＳＫ、ＳＰＴ、Ｓ−１−ＰＰまたは、本明細書に提供されるかまたは、当業者に公知であり、かつ多くの公開データベースで入手可能な他のポリヌクレオチドの、ポリヌクレオチド配列をもとに容易に設計され得る。
ＳＰＬ、ＳＫ、ＳＰＴ、およびＳ−１−ＰＰをコードするポリヌクレオチドのような、スフィンゴ脂質経路（代謝および／またはシグナル伝達）に関与するポリペプチド要素をコードするポリヌクレオチドは、本発明によってまた提供される。本明細書で使用されるポリヌクレオチドは、一本鎖（コードする側またはアンチセンス側）または二本鎖であり得、かつＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡ）またはＲＮＡ分子であり得る。従って、本発明の文脈において、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、遺伝子でもあり得る。遺伝子は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントである；それは、そのコード領域の前および後ろの領域（リーダーおよびトレーラー）を含み、個々のコードするセグメント（エクソン）の間を介在する配列（イントロン）も同様である。付加するコード配列または非コード配列は、本発明のポリヌクレオチド中に存在し得るが、存在する必要はなく、ポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持物質に連結され得るが、連結される必要はない。本明細書で使用される「単離される」は、ポリヌクレオチドが、他のコード配列から実質的に離れていて、かつそのＤＮＡ分子が、長い染色体フラグメントまたは、他の機能的な遺伝子またはポリペプチドコード領域のような、無関係なコードＤＮＡの長い部分を含まないことを、意味する。もちろん、これは最初に単離されるＤＮＡ分子をいい、そのセグメントに人の手で後に加えられる遺伝子またはコード領域を除外しない。
本発明のポリヌクレオチドは、ＳＰＬ、ＳＫ、ＳＰＴまたはスフィンゴ脂質の代謝またはシグナル伝達の他の要素をコードするネイティブな配列（すなわち、内因性ポリヌクレオチド、例えば、本明細書に提供されるネイティブなまたは人工的に手を加えない、または天然に存在する遺伝子）を含み得、代替形態配列、またはそれの部分またはスプライシング改変体は、そのような配列の改変体を含み得る。ポリヌクレオチド改変体は、本明細書に記載されるように、そのコードされるポリペプチドの活性が実質的に減少しないような、一つ以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含み得る。コードされるポリペプチドの活性に対する効果は、一般的に本明細書中に記載されるように、評価され得る。改変体は、好ましくは、スフィンゴ脂質の代謝またはシグナル伝達に関与するネイティブなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号１、３、５、７、９、１２、１５、１７および２２〜２７に示されるポリヌクレオチドのような配列）またはこの部分の代替形態、および配列番号２、４、６、８、１０、１１、１６、および１８〜２１のいずれか一つに示されるポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド、またはそれの一部分に対し少なくとも約７０％の同一性を示し、より好ましくは少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％の同一性および最も好ましくは、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を示す。本発明の特に図示されるポリヌクレオチドは、配列番号１８〜２１および２８〜２９に示すアミノ酸配列のような、図１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。同一性の割合は、当業者に公知であり、そして本明細書に記載されるコンピューターアルゴリズムを使用する配列比較により容易に決定され得る。
本明細書に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列に対して実質的に相同であるポリヌクレオチドは、本発明の範囲内でもある。本明細書で使用される「実質的な相同性」は、ＳＫ、ＳＰＬ、ＳＰＴ、Ｓ−１−ＰＰまたは本明細書に提供される他のポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチドに対して、中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であるポリヌクレオチドをいう。ただし、コードされるポリペプチド改変体に、酵素活性またはシグナル伝達活性を保持する適切な中程度にストリンジェントな条件は、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）溶液中でのプレ洗浄；５０〜６５℃、５×ＳＳＣで、一晩のハイブリダイズ操作；それに続く、６５℃で２０分間の、０．１％ＳＤＳを含む、２×、０．５×および０．２×ＳＳＣのそれぞれを用いた、２回の洗浄を含む。任意の上記の配列によってコードされるポリペプチドを、遺伝コード縮退に起因してコードする核酸配列も、本発明によって含まれる。
本明細書に記載のポリヌクレオチドは、当業者に公知の標準的な酵母遺伝学を使用して同定され得る。ｃＤＮＡ発現ライブラリーは、調節可能な酵母発現ベクター（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．より入手可能な、ｐＹＥＳ）および標準的な技術を用いて作成され得る。次いで、酵母の変異体株は、そのｃＤＮＡライブラリーにて形質転換され得、その酵母のスフィンゴ脂質代謝欠損を機能的に相補する（すなわち、Ｄ−エリトロ−スフィンゴシンまたは他の適切なスフィンゴ脂質中間体の存在下で増殖する能力を回復する）能力を有する外来ｃＤＮＡが、単離され得る。
スフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達に影響を与えるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、そのタンパク質産物の、ＳＰＬ、ＳＫ、ＳＰＴ、およびスフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達に関与する他のポリペプチドに対して反応する抗体との交差反応性に基づいて同定され得、それらのポリヌクレオチドは、本明細書のように調製され得る。そのようなスクリーニングは、一般に標準的な技術（Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，１：４９−７８，１９８４（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）中のＨｕｙｎｈら，「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｉｎ λｇｔ１１」を参照のこと）を使用して実行され得る。
本発明のポリペプチドは、そのポリペプチドをコードする組み替えＤＮＡの培養宿主細胞中での発現により調製され得る。好ましくは、その宿主細胞は、細菌、酵母、昆虫または哺乳動物の細胞であり、そして、好ましくは、その宿主細胞は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｂｓｔ１Δ細胞である。その組み換えＤＮＡは、その宿主細胞の中での使用に最適な任意の発現ベクターの中にクローニングされ得、当業者に周知の技術を使用して宿主細胞にトランスフェクトされ得る。適切な発現ベクターは、宿主細胞において活性なプロモーター配列を含む。組織特異的な、または条件によって活性なプロモーターはまた、使用され得る。好ましいプロモーターは、そのポリペプチドを高いレベルで発現する。当業者によって容易に理解されるように、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、目的のポリペプチドが適切に翻訳されるプロモーターに作動可能に連結される発現ベクターの中にクローニングされる。従って、ある実施形態では、ライゲーションされたＤＮＡ配列は、適切な転写または翻訳の調節エレメントに作動可能に連結される。ＤＮＡの発現を担う調節エレメントは、一般に、第一のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’側のみに位置される。同様に、翻訳を終結させるのに必要な終止コドンおよび転写終結シグナルは、第二のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の３’側にのみ存在する。
必要に応じて、その構築物は、エンハンサー、転写終結シグナル、ポリ（Ａ）シグナル配列、細菌または哺乳動物の複製起点および／または選択マーカーを含み得、それらのすべては、当該分野で周知である。エンハンサー配列は、プロモーター領域の一部としてまたは分離して含まれ得る。転写終結因子は、ＲＮＡポリメラーゼ媒介性転写を終了する配列である。ポリ（Ａ）シグナルは、その終結配列の中にまたは別々に組み込まれ得る。選択マーカーは、形質転換された細胞が同定される宿主細胞に対して、表現型を与える任意の遺伝子を含む。そのようなマーカーは、特殊な条件下で増殖の利点を与え得る。細菌の適切な選択マーカーは、周知であり、アンピシリン、カナマイシンおよびテトラサイクリンに対する耐性遺伝子を含む。哺乳動物細胞の適切な選択マーカーは、ハイグロマイシン、ネオマイシン、宿主内の欠損を相補する遺伝子（例えば、チミジンキナーゼおよびＴＫ−細胞）および当該分野で周知の他のものを含む。酵母細胞についての、一つの適切な選択マーカーは、ＵＲＡ３であり、それはウラシル非存在下の培地上で増殖する能力を与える。
この様式で発現されるＤＮＡ配列は、ＳＫ、ＳＰＬ、ＳＰＴのような、スフィンゴ脂質の代謝またはシグナル伝達に関与するネイティブな（例えば、ヒトの）ポリペプチドをコードし得、または、ＳＫ、ＳＰＬ、ＳＰＴまたは本明細書に記載の本発明の他のポリペプチドのような、スフィンゴ脂質の代謝またはシグナル伝達に関与するネイティブなポリペプチドの部分または他の改変体をコードし得る。ネイティブなポリペプチドの改変体をコードするＤＮＡ分子は、オリゴヌクレオチド指向の部位特異的変異誘発法のような、標準的な変異誘発技術を使用して、一般に調製され得、ＤＮＡ配列のセクションは、短縮化ポリペプチドの調製を可能にするために除去され得る。
スフィンゴ脂質の代謝に関与するＳＰＬ、ＳＰＴ、ＳＫといったポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現する細胞を作成するために、細胞に、当該分野で公知の任意の種々の技術を使用して、トランスフェクト、形質転換または形質導入され得る。当業者に公知となる、トランスフェクション、形質転換、および形質導入のいかなるプロトコールは、（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．Ｎ．Ｙ．または市販の多数のキット（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に概略されるプロトコール）使用され得る。そのような技術は、安定な形質転換体を生じ得、または一過性であり得る。一つの適切なトランスフェクション技術は、エレクトロポレーションであり、それは、哺乳動物細胞、酵母細胞および細菌を含む、種々の細胞型に、市販の設備を使用して実行され得る。（電圧、抵抗およびパルスの長さを含む）エレクトロポレーションの最適条件は、特定の宿主細胞型のために実験的に決定され、エレクトロポレーションの最適化のための一般指針は、製造者より入手され得る。トランスフェクションのための他の適切な方法（例えば、酵母のための酢酸リチウム法）は、使用される細胞型に依存し、当業者に明確となる。トランスフェクションの後、細胞を、その細胞内でそのポリヌクレオチドの発現を促進する条件で維持され得る。適切な条件は、その発現系および細胞型に依存し、および当業者に明確となる。
スフィンゴ脂質代謝に関与するポリペプチドは、トランスフェクトされた細胞で、その細胞をそのトランスフェクトされたポリヌクレオチドの発現を促進する条件下で培養することによって、発現し得る。適切な条件は、その特定の宿主細胞および使用される発現ベクターに依存し、および容易に当業者に明確となる。市販の発現ベクターについて、そのポリペプチドは、製造業者の指示書に従って一般に発現し得る。ある目的のために、本発明の発現されるポリペプチドは、実質的に純粋な形態で単離され得る。好ましくは、そのポリペプチドは、少なくとも８０％重量の純度で単離され、さらに好ましくは、少なくとも９５重量％の純度で単離され、最も好ましくは、少なくとも９９重量％の純度で単離される。一般に、そのような精製操作は、例えば、硫酸アンモニウム分画、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動、および／またはアフィニティークロマトグラフィーの標準的な技術を使用してなされ得る。
（スフィンゴ脂質中間体）
本明細書中において上記のように、本発明はまた、スフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達経路の一つ以上要素の活性を調節する薬剤を提供する。本発明のその薬剤は、少なくとも一つのスフィンゴ脂質中間体のレベル（例えば、相対的または絶対的な量、濃度、安定性など）を変化させ得る。本発明のスフィンゴ脂質中間体は、スフィンゴ脂質代謝経路における任意のスフィンゴ脂質中間体を含む。そのように、本発明のスフィンゴ脂質中間体は、Ｃ１０およびＣ２０の間のスフィンゴ脂質骨格構造を含む長鎖ベース（ＬＣＢ）およびリン酸化長鎖ベース（ＬＣＢＰ）を含むが、それに限定されない。一つの実施形態において、その骨格構造は、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、またはＣ２０を含む。さらなる実施形態において、本発明のそのスフィンゴ脂質中間体は、Ｃ１４およびＣ１６スフィンゴシンおよび、Ｃ１４およびＣ１６のジヒドロスフィンゴシンを含む、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒから単離された内因性遊離スフィンゴイドベースを含む。別の実施形態において、スフィンゴ脂質中間体は、Ｓ−１−Ｐ、ヘキサデカナール、ホスホエタノールアミン、セラミド、スフィンゴシン、３−ケト−ジヒドロスフィンゴシン、ジヒドロスフィンゴシン、スフィンゴミエリン、ジヒドロセラミド、セラミド−１−ホスフェート、ジヒドロスフィンゴシン−１−ホスフェート、ホスホエタノールアミン、長鎖不飽和アルデヒド、および長鎖飽和アルデヒドのうち、いずれか一つ以上の要素を含む。当業者は、スフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達経路のいずれか一つ以上の要素によって影響される、または産生される、任意のスフィンゴ脂質中間体の種類が、本発明の範囲内に含まれ、当該分野において公知の、およびさらに本明細書に記載の種々のアッセイを使用して同定され得ると容易に理解される。
（スフィンゴ脂質中間体および／またはスフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達の要素を調節する薬剤）
本発明に従って使用する薬剤は、人工的または天然由来のどちらでも、本明細書にさらに詳細に記載される、スフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達を調節する、任意の組成物、化合物、基質、分子、物質、生成物などとして定義される。スフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達を調節する薬剤は、少なくとも一つのスフィンゴ脂質中間体のレベル、または、スフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達の少なくとも一つの要素の活性を変化させる（例えば、統計学的に有意な様式で増加または減少する）薬剤である。レベルまたは活性の変化は、単離された要素、または、中間体または要素を含む宿主細胞または動物が、その薬剤と接触しない単離された要素、中間体または要素を含む宿主細胞または動物と比較して、その薬剤と接触する場合に、任意の統計学的に顕著な変化（例えば、一つ以上のスフィンゴ脂質中間体のレベル、または、本明細書に記載のスフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達の一つ以上の要素の活性における、増加または減少）を含む。このように、一つの実施形態において、調節は、本明細書に記載のスフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおける、変化されるレベル（例えば、減少または増加）を含む。ポリヌクレオチドのレベル（すなわち、遺伝子発現）を検出する多数の方法が、当該分野において公知であり、本発明の文脈において有用である。図示される方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９３ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｌｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．Ｉｎｃ．＆Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， 第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）；Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）および他の場所に記載される。
さらなる実施形態では、調節は、変化される活性レベルを含み、それは、ＳＰＬ、ＳＫ、ＳＰＴ、Ｓ−１−ＰＰなどのような、スフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達に関与する任意の酵素の酵素活性における、統計学的に有意な減少または増加である。酵素活性を検出および測定するための多数の方法は、当該分野で公知であり、本発明の文脈において使用され得る（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡを参照のこと。）。ある図示される方法は、例えば、Ｓａｂａ，Ｊ．Ｄ．，Ｎａｒａ，Ｆ．，Ｂｉｅｌａｗｓｋａ，Ａ．，Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｓ．およびＨａｎｎｕｎ，Ｙ．Ａ．（１９９７）．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２，２６０８７−２６０９０，およびＶａｎ Ｖｅｌｄｈｏｖｅｎ，Ｐ．Ｐ．およびＭａｎｎａｅｒｔｓ，Ｇ．Ｐ．（１９９１）．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６６，１２５０２−７，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ，Ｗａｎｇ ＥおよびＭｅｒｒｉｌｌ Ａ，１９８４．，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ２２８：２８２−２９１．，Ｃａｌｉｇａｎ，ＴＢ，Ｐｅｔｅｒｓ Ｋ，Ｏｕ Ｊ，Ｗａｎｇ Ｅ，Ｓａｂａ ＪおよびＭｅｒｒｉｌｌ ＡＨ，Ｊｒ．，２０００．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８１：３６−４４に記載される。
ある実施形態では、調節は、Ｓ−１−Ｐ、セラミド、スフィンゴシン、または他のＬＣＢまたはＬＣＢＰのような、本明細書に記載の一つ以上のスフィンゴ脂質中間体のレベルの統計学的に有意な減少または増加（すなわち、変化されるレベル）を含む。スフィンゴ脂質中間体（例えば、スフィンゴシン−１−ホスフェートまたはそれの分解産物、セラミド、スフィンゴシンなど）を測定するための種々の方法は、当該分野で公知であり、本発明の文脈において有用であり得る。図示される方法は、以下の参考文献に記載される：Ｂｏｓｅ，ＲおよびＫｏｌｅｓｎｉｃｋ Ｒ，２０００．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３２２：３７３−３７８；Ｆｙｒｓｔ，Ｈ，Ｏｓｋｏｕｉａｎ Ｂ，Ｋｕｙｐｅｒｓ ＦおよびＳａｂａ Ｊ，１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：５８６４−５８７１；Ｆｙｒｓｔ，Ｈ，Ｐｈａｍ ＤＶ，Ｌｕｂｉｎ ＢＨおよびＫｕｙｐｅｒｓ ＦＡ，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：２６４４−２６５０。
ある実施形態では、スフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達の調節は、細胞増殖、アポトーシス、血管新生、薬物耐性および細胞運動性における増加または減少を含む。これらの活性を測定するための種々の方法は、当該分野において公知であり、これらは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，または Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（両方ともＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡによって出版）に記載される方法を含む。
本発明の候補薬剤は、スフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達経路のポリペプチド要素（例えば本明細書に記載の任意のこれらのポリペプチド要素）をコードするポリヌクレオチドを含む。本発明の薬剤は、スフィンゴ脂質の代謝またはシグナル伝達に関与する酵素を含むポリペプチド（例えば本明細書に記載のような）をさらに含む。
候補薬剤は、例えば、Ｓ−１−Ｐ、ヘキサデカナール、ホスホエタノールアミン、セラミド、スフィンゴシン、３−ケト−ジヒドロスフィンゴシン、ジヒドロスフィンゴシン、スフィンゴミエリン、ジヒドロセラミド、セラミド−１−ホスフェート、ジヒドロスフィンゴシン−１−ホスフェート、ホスホエタノールアミン、長鎖不飽和アルデヒド、および長鎖飽和アルデヒドであるが、これらに限定されない、本明細書に記載の任意のスフィンゴ脂質中間体をさらに含む。一つの実施形態として、本発明の薬剤は、本明細書に記載される、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒで同定されるＣ１４およびＣ１６スフィンゴシンおよび、Ｃ１４およびＣ１６のジヒドロスフィンゴシンのような、ＬＣＢおよびＬＣＢＰを含む。
一つの特別な実施形態では、本発明の薬剤は、内因性Ｓ−１−Ｐのレベルを減少させる。そのような調節する薬剤は、本明細書記載の方法を使用して同定され得、例えば、癌治療および、筋肉発達欠損および心筋症の処置に使用され得る。本発明の文脈において、内因性Ｓ−１−Ｐレベルにおける変化の検出が、癌および筋肉発達および心筋症における欠損の診断、および回復のための予後評価のために使用され得ることも、また見出される。本発明は、そのような診断の方法およびキットをさらに提供する。
ＳＫの活性または発現を阻害またはブロックする薬剤も、本発明において提供される。本発明の一つの局面として、そのような薬剤は、少なくともいくつかの種類の癌、特にＲａｓの優性変異が関与する癌の効果的な処置となり得る。ＳＫの活性を阻害する新しくおよび効果的な薬理学的薬剤の同定のための方法は、Ｓ−１−Ｐシグナル伝達の下流の薬剤標的と同様に、本発明で提供される。本明細書で使用される、ＳＫ活性の阻害は、当業者に公知のあらゆる数のアッセイ、または本明細書に記載の特定の例示されたアッセイを使用して測定する場合、ＳＫの酵素活性のレベルが減少することを意味する。好ましくは、酵素的ＳＫ活性の減少は、適切なコントロールと比べての、酵素活性の統計学的に有意な減少である。同様に、阻害は、ＳＰＬ、ＳＰＴなどというような、スフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達経路のあらゆる要素の活性に適用され得る。
スフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達を調節する本発明の薬剤は、合成または天然の化合物のライブラリーを含む幅広い供給源から得られる。例えば、数多くの手法が、ランダム化されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む、幅広い有機化合物および生物分子のランダムなおよび指定された合成のために使用可能である。その代わりに、細菌、真菌、植物および動物の抽出物の形態での天然化合物のライブラリーは、入手可能であるかまたは容易に産生される。それに加え、天然のまたは合成生産のライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理学的および生化学的手法を通じて容易に調節され、コンビナトリアルライブラリーを産出するために使用され得る。既知の薬理学的薬剤は、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などのような、指定されたまたはランダムな化学改変に供され得、構造学的アナログを産生する。新規の潜在的な治療薬剤は、合理的なドラッグデザインまたはコンピューターによるモデル化のような方法を使用しても、創作され得る。
本発明の例示される薬剤は、スフィンゴ脂質に対する相同性により合理的に設計される一連の化合物を含む。特に、スフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達経路を調節する合成アナログが、合成される。一つの実施形態では、合理的に設計された化学的ライブラリーは、１−アリール−２−ジメチルアミノプロパン−１，３−ジオール誘導体を含む。誘導体は、当業者に理解される用語である。例えば、誘導体は、親化合物から一原子の別の原子または原子団への置換により生成されると考えられ得る化合物を意味する。本発明の文脈中で、これらの誘導体は、合理的に設計される。４つのジアステレオマー（ＤまたはＬ、エリトロまたはスレオ）は、そのライブラリーの各メンバーとなり得る。一つの特定の実施形態として、その１−アリール−２−ジメチルアミノプロパン−１，３−ジオール誘導体は、ＰＤＭＰのアミン、脂肪酸アミドおよびベンゼン環の改変により誘導される。一つの特定の実施形態として、その脂肪酸アミド基は、二つのＮ−メチル基に置換される。当業者は、同様の変化が、極性および芳香族の置換基でなされ得、本発明の文脈で特に例示的な候補薬剤であり得ることを、容易に理解し得る。本発明の別の実施形態では、１−アリール−２−ジメチルアミノプロパン−１，３−ジオール誘導体は、アレーン環に結合される親油性アルキル基が、スフィンゴシンの特徴により近接に類似しうるように設計される。一つの特定の実施形態として、その合成計画は、開始物質として、周知のガーナーアルデヒド（図２の１を参照のこと）を利用する。なぜなら、１は、どちらのエナンチオマー型でも容易に入手可能であるからである。一つの実施形態として、１のＤ−エナンチオマーまたはＬ−エナンチオマーは、開始物質として使用され、各ライブラリーメンバーの純粋なエリトロ型立体異性体が、調製される。追加の実施形態では、その相当するスレオ型アナログ（４ａ−ｃ、図２）を合成するための新規のおよび柔軟性のある経路は、ＰＤＭＰアナログを作製するための方法論の延長線上の使用に従う。その戦略は、ある硫化物およびホスフィン添加物の存在下でのアリール金属化合物（Ａｒｙｌ−Ｍｅｔ）の１へのｓｙｎ−選択的付加に依存する。この実施形態では、エリトロ型およびスレオ型両方の合成経路は、第一炭素原子での置換された変化を調製するために改変される。代表的な合成手順は、７ａ−ｃの調製として図３に示される。このように、幅広い範囲の窒素、酸素、および炭素の求核試薬は、５ａ−ｃのようなメシレートと反応し得、本発明に照らして候補としての使用のためのジメチル化ＰＤＭＰアナログおよびホモログの新規ライブラリーを提供し得る。
本発明に従ってスフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達の調節薬剤のためのスクリーニングの方法に使用する候補薬剤は、化合物、組成物または分子の「ライブラリー」または収集物として提供され得る。そのような分子は、当該分野において「低分子」として知られる化合物を含み、その化合物は、１０５ドルトン未満の分子量を持ち、好ましくは１０４ドルトン未満の分子量を持ち、またさらに好ましくは１０３ドルトン未満の分子量を持つ。例えば、試験化合物のライブラリーは、本明細書記載の変異型またはトランスジェニックのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒに投与され得、その化合物の、前記変異型および／またはトランスジェニックのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒに対し野生型表現型を回復する能力についてアッセイされ得る。（例えば、Ｓ−１−Ｐ、セラミド、またはスフィンゴシンのようなスフィンゴ脂質中間体のレベルを変化させることにより）スフィンゴ脂質の代謝またはシグナル伝達経路の要素に影響を与える能力があるとして同定される化合物は、治療および／または診断の目的のために価値がある。なぜなら、それらの化合物は、スフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達に関連する疾患の処置および／または検出を可能にするからである。
候補薬剤は、コンビナトリアルライブラリーのメンバーとして提供され得、それらは、好ましくは、多数の反応槽で行われる多数の所定の化学反応に従って調製される合成薬剤を含む。例えば、さまざまな開始化合物は、一つ以上の固相合成の使用により調製され得、ランダムな混合の方法論について記載され、与えられた成分が、反応条件の多数の順序および／または組み合わせを追跡して行い得る反応分割技術について記載され得る。結果として得られる産物は、反復した選択および合成手順の前に、スクリーニングされ得るライブラリー、例えば、ペプチドの合成のコンビナトリアルライブラリー（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０８６９４、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０４６６６を参照のこと）、または本明細書に呈示される低分子を含み得る他の組成物（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０８５４２、ＥＰ ０７７４４６４、Ｕ．Ｓ．５，７９８，０３５、Ｕ．Ｓ．５，７８９，１７２、Ｕ．Ｓ．５，７５１，６２９を参照のこと）を含む。当業者は、広範囲な種類のそのようなライブラリーが、確立した手順に従って調製され得、本開示に従ったスクリーニング方法を使用して試験され得る。
本発明の候補薬剤は、さらに、スフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達に関与するポリペプチドに結合する抗体を提供する。抗体は、調節薬剤（さらに下のほうで議論されるように）として機能し得、本発明のポリペプチドの活性をインビボで阻害またはブロックする。その代わりに、または加えて、抗体は、本発明のポリペプチド（例えば、ＳＫ、ＳＰＬ、ＳＰＴ、または調節薬剤）の内在的活性についてのスクリーニングの中で使用され得、該ポリペプチドの精製のために使用され得、試料の中の該ポリペプチドの活性のレベルをアッセイするために使用され得、および／または、該ポリペプチドの発現の調査のために使用され得る。そのような抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、スフィンゴ脂質代謝に関与する一つ以上のポリペプチド、および／またはそれの一つ以上のその改変体に対して、一般に特異的である。いくつかの望ましい実施形態の中では、抗体は、ポリクローナルである。
抗体は、当業者に公知の、さまざまな技術のいずれかにより調製され得る（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと）。一つのそのような技術では、ＳＰＬポリペプチドまたはそれの抗原性部位を含む免疫原を、好ましくは、一つ以上の追加免疫を取り入れる予定されたスケジュールに従い、はじめに適切な動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジおよびヤギ）に注入する。ウサギの使用が、望ましい。免疫原性を増加させるために、免疫原を、例えば、グルタルアルデヒドまたはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に連結し得る。注入の後、その動物を、定期的に採血し、ＳＫ、ＳＰＬ、ＳＰＴ、Ｓ−１−ＰＰのような、スフィンゴ脂質代謝に関与するポリペプチドに結合するポリクローナル抗体を含む、免疫後血清を入手する。ポリクローナル抗体を、その後、例えば、適切な固体支持体に結合された（ＳＫまたはＳＰＬ、またはそれらの抗原性部位のような）本発明のポリペプチドを使用するアフィニティークロマトグラフィーにより、そのような抗血清から精製され得る。そのようなポリクローナル抗体を、直接、スクリーニングの目的のために、およびウェスタンブロットのために使用し得る。
さらに具体的には、成体のウサギ（例えば、ＮＺＷ）を、１ｍＬの容積にて完全フロイントアジュバンド（１：１ ｖ／ｖ）の中で乳化させた、１０μｇの（例えば、ニッケルカラムを使用して）精製されたＳＫポリペプチドまたはＳＰＬポリペプチドにより、免疫化し得る。免疫化を、少なくとも６箇所の異なる皮下部位での注入を通じて行い得る。引き続いての免疫化のために、５μｇのＳＫ、ＳＰＬまたはＳＰＴポリペプチドを、不完全フロイントアジュバンドの中で乳化させ得、同じ方法で注入し得る。免疫化を、適切な血清抗体価が達成されるまで、続け得る（通常では全部でおよそ３回の免疫化）。そのウサギを、免疫前の血清を入手するために免疫化の直前に採血し得、さらにそれから各免疫化の７〜１０日後に採血し得る。
ある実施形態のために、モノクローナル抗体が、望まれ得る。モノクローナル抗体を、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９，１９７６の技術、およびそれの改良を使用して調製され得る。簡単にいうと、これらの方法は、望まれる特異性（すなわち、目的のポリペプチドとの反応性）を持つ抗体を産生する能力を持つ不死化細胞の調製に関係する。そのような細胞株は、例えば、上記の通りに免疫化された動物から得た脾臓細胞から、産生され得る。次いで脾臓細胞を、例えば、ミエローマ細胞融合パートナー（好ましくは、免疫化動物と同系のもの）との融合によって不死化される。例えば、その脾臓細胞およびミエローマ細胞を、数分間非イオン性界面活性剤と合わせ得、それから、ハイブリッド細胞の増殖を補助するが、ミエローマ細胞の増殖を補助しない選択培地上で、低密度に播種し得る。望ましい選択技術には、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択が使用される。十分な時間の後、通常はおよそ１〜２週間後、ハイブリッドのコロニーが、観察される。単一コロニーを、選択し、さらにそのポリペプチドに対する結合活性について試験する。高い反応性および特異性を持つハイブリドーマが、望まれる。
モノクローナル抗体は、増殖するハイブリドーマコロニーの上清から単離され得る。加えて、そのハイブリドーマ細胞株の、マウスのような、適切な哺乳生物宿主の腹膜腔内への注入のような、さまざまな技術が、その収量の高めるために使用され得る。モノクローナル抗体を、その後、腹水または血液から収集し得る。混入異物を、クロマトグラフィー、ゲルろ過、沈殿、および抽出のような従来の技術により、その抗体から除去し得る。
スフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達経路の要素に特異的に結合する抗体は、特異的結合を通じて該ポリペプチド要素と相互作用し得る（その抗体が、そのポリペプチドにおよそ１０４Ｍ−１より大きいまたは等しいＫａで結合する場合、好ましくは、１０５Ｍ−１より大きいまたは等しいＫａで結合する場合、より好ましくは、１０６Ｍ−１より大きいまたは等しいＫａで結合する場合、さらにより好ましくは、１０７Ｍ−１から１０９Ｍ−１より大きいまたは等しいＫａで結合する場合）。それらが結合する抗体およびポリペプチドのような結合パートナーの親和性を、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．５１：６６０（１９４９）、および、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙまたはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（両方とも、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡより出版）に記載される技術といった、従来の技術を使用して容易に決定し得る。
上記のように、本発明は、スフィンゴ脂質代謝に関与するポリペプチドの発現（転写または翻訳）、安定性および／または活性を変化させる薬剤を提供する。そのような調節薬剤を同定するため、あらゆる種類のスクリーニングが、行われ得る。候補調節薬剤は、植物、真菌、または、化学物質、低分子またはランダムペプチドのライブラリーのような、さまざまな供給源から、周知の技術を使用して入手され得る。本発明のポリペプチドに結合する抗体、および、スフィンゴ脂質代謝に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチドは、候補調節薬剤であり得る。好ましくは、調節薬剤は、最小の副作用を持ち、無毒性である。いくつかの適用のために、細胞を透過し得る薬剤が、望まれる。
本方法は、種々の異なる潜在的に治療的な候補薬剤のスクリーニングにおける使用を見出す。候補薬剤は、多数の化学分野を包含するとはいえ、典型的に、それらは、有機物分子であり、好ましくは、５０ダルトンより大きくかつ約２，５００ダルトンより小さい分子量を持つ有機化合物である。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合のために必要な官能基を含み、典型的に、少なくとも一つの、アミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基を含み、好ましくは、少なくとも２つの官能化学基を含む。その候補薬剤は、しばしば、一つ以上の上記の官能基で置換された、環状炭素または複素環式構造、および／または、芳香族またはポリ芳香族を含む。候補薬剤は、生物分子の中にも見出され、ペプチド、サッカライド、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、これらの誘導体構造的アナログまたは組み合わせを含むが、それらに限定されない。
本発明の候補薬剤は、本明細書、特に本実施例に記載のように、変異体またはトランスジェニックのハエに対し、野生型の表現型を回復する薬剤をさらに含む。一つの実施形態で、調節薬剤は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒヌル変異体を、該変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒにおいて少なくとも一つのスフィンゴ脂質中間体、または、スフィンゴシンの代謝および／またはシグナル伝達経路の少なくとも一つの要素の活性のどちらかのレベル上でのその薬剤の効果が観察されるのに十分な期間、培養する操作、またはこの他でその薬剤と接触させる操作によりスクリーニングされる。一つの実施形態では、そのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒヌル変異体は、変態の間における間接飛行筋肉（ＩＦＭ）の異常な発生が原因となる飛行不能な表現型を持つ。この表現型は、スフィンゴ脂質の代謝およびシグナル伝達を説明し、遺伝学的抑制因子を同定させ、スフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達を調節する化学物質を、そのスフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達経路における鍵となる要素に対するその化学物質の効果を通じて同定させる新規のスキームを提供する。スフィンゴ脂質中間体のレベルの統計学的に有意な変化、または、スフィンゴ脂質の代謝またはシグナル伝達経路の要素の活性のレベルの変化を生じる薬剤は、スフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達を調節する薬剤である。本明細書に記載のように、薬剤の比存在下で増殖させ、またはそれ以外で培養させた変異体またはトランスジェニックなハエと比較して、この薬剤の存在下で増殖またはそれ以外で培養させた変異体またはトランスジェニックなハエの表現型の、統計学的に有意な回復を引き起こす薬剤は、スフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達を調節する薬剤である。
上で述べたように、その被検の変異体およびトランスジェニックなハエは、本明細書に記載のさまざまなヒトの疾患（例えば、乳癌、大腸癌、子宮癌、胃癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌および直腸癌を含む数多くの癌）のための診断および治療、ならびに、１型遺伝性感覚性ニューロパシーおよびスフィンゴリピドーシスの診断および処置のための化合物を同定するために設計されたスクリーニングアッセイにおける特定の利用を、見出す。その被検トランスジェニックハエ（または、その特定のスクリーニングアッセイに依存してそれらに由来する細胞）の使用を通じて、スフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達に関する活性を持つ化合物を同定し得、それゆえ、スフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達の調節に関する疾患を同定し得る。化合物は、その疾患の少なくとも一つのパラメーターまたは症状（例えば、癌の成長など）に対する効果を調節するか、またはその効果を持ち、その調節活性が、その症状の重さを減少させるか、または増強させ得る場合、スフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達に関する活性を持つ。腫瘍は、異常な量の組織を含み、良性または癌性になり得る。当業者に容易に理解されるように、何十もの腫瘍の異なる型が、存在し、それらの同定および診断は、当該分野に公知であり、資格のある臨床医により決定され得る。
このように、本発明のスクリーニング方法は、（例えば、スフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達に関与するタンパク質またはペプチドに結合することにより、そのタンパク質またはペプチドの活性を調節、促進または抑制することにより）疾患の進行を調節する化合物を同定するために使用され得、および／または、その疾患の表現型の症状を改善、緩和、または除去する化合物を同定するために使用され得、そのような活性は、その疾患の根底にある機構に関する活性の結果であってもなくてもよい。
本発明のアッセイにより、最終的に以下の化合物の同定が、可能になる：（１）スフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達に関連する疾患について良好な効果を持ち、それゆえ治療的である、化合物（例えば、腫瘍の成長を停止または逆進行させる薬剤、または、そのような状態の症状を改善、または緩和する薬剤）；あるいは（２）その疾患に関して有害な効果を持ち、それゆえ治療薬剤として避けるべき化合物。
本発明のある望ましいスクリーニング方法において、候補薬剤の量は、一般に経口でハエに投与される。経口投与に続いて、その候補薬剤のそのハエの表現型に対する影響を、典型的にコントロール（すなわち、その候補薬剤を投与していない、変異体またはトランスジェニックなハエ）との比較により、決定した。その候補薬剤の効果は、本明細書に記載の変異体またはトランスジェニックなハエの一つ以上の表現型上の特徴が、コントロールのハエに比べて、悪化するかまたは改善するかを決定する操作により決定し、そこで、モニターされる特徴は、スフィンゴ脂質中間体のレベル、飛行能力、飛行筋肉の発生上の欠損、などを含む。その候補薬剤を、一般に、その薬剤をハエ飼育培地の中に混合し、その培地をハエ（幼虫または成虫のハエのどちらか）の存在下に配置し、そのハエが、培地を食べるようにする操作により、ハエに経口投与する。一般に、多数のアッセイ混合物を、異なる候補薬剤濃度で（または候補薬剤なしで）平行して調査し、その候補薬剤のさまざまな濃度に対する異なる応答を、得る。典型的に、これらの試験集団の中の一つは、陰性コントロールを提供する（すなわち、候補薬剤が、存在しない）。望ましい実施形態では、高速大量処理スクリーニングのプロトコールが使用され、その中で、多数の候補薬剤を、多数のハエを平行して使用して、試験する。「多数」とは、ある複数を意味し、その複数は、少なくとも５０、通常は少なくとも１００、さらに通常では少なくとも１０００を意味し、また、その数は、１０，０００または５０，０００またはそれ以上になり得るが、多くの例では、５０００を超え得ない。
調節薬剤は、所望の組織型もしくは細胞型へとこの薬剤を指向するように作用する標的化成分をさらに含み得るか、またはこのような標的化成分と会合し得る。本明細書中で使用する場合、「標的化成分」は、化合物に連結される場合に、標的組織への化合物の輸送を増強し、それによって、化合物の局所濃度を増大させる、任意の基質（例えば、化合物または細胞）であり得る。標的化成分としては、抗体またはそのフラグメント（例えば、抗腫瘍抗体）、レセプター、リガンドおよび標的組織の細胞または標的組織の近傍の細胞に結合する他の分子が挙げられる。公知の標的化成分としては、ホルモン、細胞表面抗原に対する抗体、レクチン、接着分子、腫瘍細胞表面結合リガンド、ステロイド、コレステロール、リンホカイン、フィブリン溶解酵素、ならびに所望の標的化部位に結合する他の薬物およびタンパク質が挙げられる。特に、エストロゲンレセプターに結合する抗腫瘍抗体および化合物は、標的化成分として作用し得る。本発明において使用される抗体は、インタクトな（全）分子、そのフラグメントまたはその機能的等価物（例えば、抗原結合フラグメント）であり得る。抗体フラグメントの例としては、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、−Ｆａｂ’フラグメント、ＦａｂフラグメントおよびＦ［ｖ］フラグメントが挙げられ、これらは、従来の方法または遺伝子操作もしくはタンパク質操作によって、生成され得る。連結は、当該分野で周知の標準的な技術を使用して、任意の適切な共有結合を介し得る。このような連結は、一般に共有結合であり、そして例えば、直接的な縮合反応もしくは他の反応によって、または二官能性リンカーもしくは多官能性リンカーによって、達成され得る。
（スフィンゴ脂質中間体ならびに／またはスフィンゴ脂質代謝の成分および／もしくはシグナル伝達の成分の調節の検出のためのアッセイ）
スフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達の成分の調節を検出するための多数のアッセイが、当該分野で利用可能である。例示的なアッセイは、例えば、実施例の節で記載されるように、本明細書中でさらに記載される。
本発明のポリヌクレオチドを検出するための多数の方法が当該分野で公知であり、そして本発明の文脈において有用である。例示的な方法は、以下に記載される：Ａｕｓｕｂｅｌら、（１９９３ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．Ｉｎｃ．＆Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、（１９８２ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）など。１実施形態において、ポリヌクレオチド発現は、任意の数のハイブリダイゼーション技術を使用して測定される。さらなる実施形態において、ポリヌクレオチド発現は、増幅技術（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ＰＣＲ、定量的−競合的（ＱＣ）ＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲ）を使用して測定される。
スフィンゴの脂質代謝および／またはシグナル伝達に関与する成分の酵素活性を検出および測定するための多数の方法が当該分野で公知であり、そして本発明の文脈において使用され得る（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ．を参照のこと）。特定の例示的な方法は、以下に記載される：Ｓａｂａ，Ｊ．Ｄ．，Ｎａｒａ，Ｆ．，Ｂｉｅｌａｗｓｋａ，Ａ．，Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｓ．およびＨａｎｎｕｎ，Ｙ．Ａ．（１９９７）．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２，２６０８７−２６０９０ならびにＶａｎ Ｖｅｌｄｈｏｖｅｎ，Ｐ．Ｐ．およびＭａｎｎａｅｒｔｓ，Ｇ．Ｐ．（１９９１）．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６６，１２５０２−７，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ，Ｗａｎｇ ＥおよびＭｅｒｒｉｌｌ Ａ，１９８４．，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ２２８：２８２−２９１．，Ｃａｌｉｇａｎ，ＴＢ，Ｐｅｔｅｒｓ Ｋ，Ｏｕ Ｊ，Ｗａｎｇ Ｅ，Ｓａｂａ ＪおよびＭｅｒｒｉｌｌ ＡＨ，Ｊｒ．，２０００．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８１：３６−４４。
１実施形態において、ＳＫポリペプチドまたはその改変体のＳＫ活性は、一般に、標識化基質（すなわち、スフィンゴシン−１−リン酸またはその誘導体）の産生を検出するインビトロアッセイを使用して、評価され得る。ＳＫは、スフィンゴシンをリン酸化してＳ−１−Ｐを生じる役割を担う。本発明の１実施形態において、ＳＫのインビトロアッセイは、スフィンゴシンの第一の炭素上のヒドロキシル基をリン酸化するために、ＡＴＰおよび二価カチオン（マグネシウム、カルシウムまたはマンガン）の両方を必要とする。ＳＫ活性は、種々の種由来の組織（ヒトおよびブタの血小板、ウシの脳および腎臓、ラットの肝臓、酵母Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｃｉｆｅｒｒｉｉおよびＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｐｙｒｉｆｏｒｍｉｓを含む）においてアッセイされ得る。１実施形態において、このアッセイは、５：１のＡＴＰに対するマグネシウムの固定比および中性のｐＨ（７．２〜７．５の間）を必要とする。ＳＫは、血小板の細胞質において見出され、そしてラットの脳およびいくつかの他の組織の膜に会合している。Ｄ−エリトロ−スフィンゴシン（スフィンゴシンの天然に存在する異性体であり、ほとんどの哺乳動物の細胞において最も豊富なスフィンゴイドベースである）は、全ての供給源由来のＳＫに対する基質として作用する。スフィンゴシンは、プロテインキナーゼＣの活性を阻害し、そしてエリトロ配座に対する立体特異性は、ヒトの血小板およびラットの脳由来の酵素を使用する、混合ミセルアッセイにおいて実証されている。種々の長鎖ベース（エリトロ−ジヒドロスフィンゴシンおよびフィトホスフィンゴシンを含む）もまた、ＳＫの基質として作用し得る。ＳＫ活性は、Ｄ−エリトロ−ジヒドロスフィンゴシン基質の炭素鎖長と共に増大する。１実施形態において、いくつかの増殖誘導因子（胎仔ウシ血清またはＰＤＧＦ）を用いたＳｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞の刺激は、スフィンゴシンレベルおよびＳＫ活性の両方における増大をアッセイするために使用され得る。ＳＫを活性化するために使用され得る例示的な刺激としては、神経成長因子、ムスカリン性アセチルコリンアゴニスト、ＴＮＦα、ならびにＦｃεＲＩおよびＦｃγＲＩ免疫グロブリンレセプターの架橋が挙げられる。さらなるマイトジェン（例えば、コレラ毒素のｂサブユニットおよび１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート）もまた、ＳＫ酵素活性を増大させるために使用され得る。
特定の実施形態において、ＳＫ活性についてのインビトロアッセイは、目的のポリペプチドを発現する細胞から調製した細胞抽出物を使用して実施され得る。好ましくは、ＳＫポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの非存在下で、このような細胞は、有意な量の内因性ＳＫを産生しない（すなわち、細胞抽出物は、抽出物なしの緩衝液単独と比較して、ＳＫのレベルの検出可能な増加を含まないはずである）。ＳＫ活性の検出のための例示的なアッセイ（例えば、本明細書の実子例中で記載されるアッセイ）は、当該分野で公知である。
本発明のポリペプチドの発現または安定性を変更する調節因子についてのスクリーニングは、タンパク質またはｍＲＮＡのレベルを検出する周知技術を使用して容易に実施され得る。適切なアッセイとしては、ＲＮＡｓｅ保護アッセイ、インサイチュハイブリダイゼーション、ＥＬＩＳＡ、ノーザンブロットおよびウエスタンブロットが挙げられる。このようなアッセイは、一般に、標準的な方法を使用して実施され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９を参照のこと）。例えば、ＳＫ、ＳＰＬまたはスフィンゴ脂質の代謝に関与する他のポリヌクレオチドをコードするｍＲＮＡを検出するために、目的の遺伝子配列の全てまたは一部に相補的な核酸プローブが、適切な細胞から調製したｍＲＮＡのノーザンブロット分析において使用され得る。さらに、インサイチュハイブリダイゼーションは、Ｂｌａｉｒ，Ｓ．（Ｂｌａｉｒ Ｓ．，２０００．Ｉｍａｇｉｎａｌ ｄｉｓｃｓ．Ｉｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｗ．Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｍ．ＡｓｈｂｕｒｎｅｒおよびＲ．Ｈａｗｌｅｙ編者、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．１５９−１７５）に記載されるように実施され得る。
あるいは、リアルタイムＰＣＲもまた、本明細書中に記載されるような、ＳＰＬ、ＳＫまたはスフィンゴ脂質代謝に関与する他のポリペプチドをコードするｍＲＮＡのレベルを検出するために使用され得る（Ｇｉｂｓｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９９５−１００１，１９９６；Ｈｅｉｄら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９８６−９９４，１９９６を参照のこと）。定量的リアルタイムＰＣＲにおいて使用されるべき第一鎖ｃＤＮＡは、最初にＤＮａｓｅ Ｉ（例えば、Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｇｒａｄｅ，Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＤ）で処理した総ＲＮＡ２０μｇから、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＲＴ）（例えば、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して合成される。リアルタイムＰＣＲは、例えば、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ５７００配列検出システム（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて実施される。この５７００システムは、ＳＹＢＲＴＭグリーン（二本鎖ＤＮＡにのみインターカレートする蛍光色素）ならびに遺伝子特異的な順方向および逆方向のプライマーのセットを使用する。蛍光の増大は、全増幅プロセスの間、モニタリングされる。プライマーの最適濃度は、チェッカーボードを使用して決定される。ＰＣＲ反応は、２．５μｌのＳＹＢＲグリーン緩衝液、２μｌのｃＤＮＡテンプレート、ならびにＳＰＬ遺伝子または目的の他の遺伝子についての順方向および逆方向のプライマー各々２μｌを含む、２５μｌの容量で実施される。ＲＴ反応に使用されるｃＤＮＡは、目的の各遺伝子について約１：１０、そしてβ−アクチンコントロールについて１：１００に希釈される。サンプル中の特定のｃＤＮＡ（および従って、最初のｍＲＮＡ）の量を定量するために、標準曲線が、目的の遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを使用して、各実行について生成される。標準曲線は、リアルタイムＰＣＲにおいて決定されたＣｔ値を使用して生成され、このＣｔ値は、アッセイにおいて使用された最初のｃＤＮＡ濃度に相関する。２０〜２×１０６コピーの範囲のＳＰＬ遺伝子または目的の他の遺伝子の標準希釈が、この目的のために使用される。さらに、標準曲線は、２００ｆｇ〜２０００ｆｇの範囲のβ−アクチンについて生成される。このことにより、比較目的のために、サンプルの最初のＲＮＡ含量をβ−アクチンの量に対して正規化することが可能となる。試験される各サンプルについての平均コピー数は、一定量のβ−アクチンに対して正規化されて、ＳＰＬまたは目的の他の遺伝子の観察された発現レベルの評価を可能にする。
本発明のタンパク質を検出するために、タンパク質に結合する試薬（代表的には、本明細書中に記載されるような抗体）が、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンアッセイにおいて使用され得る。結合後、この試薬の直接的検出または間接的検出に適切なレポーター基が使用される（すなわち、このレポーター基は、試薬に共有結合され得るか、またはそれ自体が試薬に結合し得る第二の分子（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリンまたはレクチン）に結合し得る）。適切なレポーター基としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、基質、補因子、インヒビター、色素、放射性核種、発光基、蛍光基およびビオチン。このようなレポーター基は、当業者に公知の標準的な方法を使用して、サンプル成分に対する試薬の結合を、直接的または間接的に検出するために使用され得る。
あるいは、またはさらに、候補調節薬剤は、本明細書中に記載される、標識化基質（すなわち、スフィンゴシン−１−リン酸またはその誘導体）の分解を検出するインビトロアッセイを使用して、酵素活性（例えば、ＳＰＬ活性またはＳＫ活性）を変更する能力について試験され得る（Ｖａｎ ＶｅｌｄｈｏｖｅｎおよびＭａｎｎａｅｒｔｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１２５０２−０７，１９９１）。簡潔には、ＳＫポリペプチドまたはＳＰＬポリペプチド（例えば、１０ｎＭ〜約１０ｍＭ）を含む溶液（例えば、細胞抽出物）は、候補調節薬剤（代表的には、１ｎＭ〜１０ｍＭ、好ましくは１０ｎＭ〜１ｍＭ）および基質（例えば、４０μＭ）と共に、３７℃で１時間、例えば、５０ｍＭ スクロース，１００ｍＭ Ｋ−リン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４），２５ｍＭ ＮａＦ，０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，０．５ｍＭ ＥＤＴＡ，２ｍＭ ＤＴＴ，０．２５ｍＭ ピリドキサルリン酸の存在下で、インキュベートされ得る。次いで、反応は停止され、そして標識化脂肪酸アルデヒドの形成およびさらなる代謝を検出するために、薄層クロマトグラフィーによって分析され得る。ＳＫ活性またはＳＰＬ活性を変更する調節薬剤（例えば、抗体または本明細書中に記載されるような他の調節薬剤）は、調節薬剤の非存在下での分解レベルと比較して、スフィンゴシン−１−リン酸の分解における統計的に有意な増大または減少を生じる。このような調節薬剤は、本明細書中に記載されるように、細胞培養物または哺乳動物において、ＳＫ活性またはＳＰＬ活性を増大または低減させるために使用され得る。
ＳＰＬポリペプチドまたはその改変体のＳＰＬ活性を変更する調節薬剤は、一般に、標識化基質（すなわち、スフィンゴシン−１−リン酸またはその誘導体）の分解を検出するインビトロアッセイを使用して、評価され得る。このようなアッセイにおいて、ピリドキサル５’−リン酸は、通常、ＳＰＬ活性についての要件である。さらに、この反応は、一般に、約７．４〜７．６のｐＨレベルで最適に進行し、そして重金属イオンに対する感受性に起因して、キレーターを必要とする。ｐＨレベルは、６．５，６．７，６．９，７．０，７．１，７．２，７．３，７．７，７．８，７．９，８．０，８．１，８．２，８．３，８．４または８．５であり得る。この基質は、Ｄ−エリトロ異性体でるべきだが、スフィンゴシン−１−リン酸の誘導体において、スフィンゴイドベースの型および鎖長は変動し得る。一般に、Ｖａｎ ＶｅｌｄｈｏｖｅｎおよびＭａｎｎａｅｒｔｓ，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１２５０２−０７，１９９１によって記載されるようなアッセイが、使用され得る。簡潔には、このポリペプチドを含む溶液（例えば、細胞抽出物）が、約４０μＭの基質と共に、３７℃で約１時間、例えば、５０ｍＭ スクロース，１００ｍＭ Ｋ−リン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）、２５ｍＭ ＮａＦ、０．１％（ｗ／ｖ） Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＤＴＴ、０．２５ｍＭ ピリドキサルリン酸の存在下で、インキュベートされ得る。次いで反応は停止され、そして標識化脂肪酸アルデヒドの形成およびさらなる代謝を検出するために、薄層クロマトグラフィーによって分析され得る。ＳＰＬポリペプチドまたはその改変体のＳＰＬ活性を変更する、本明細書中で記載されるような調節薬剤は、この調節薬剤の非存在下での活性と比較して、本明細書中でアッセイされるようなＳＰＬ活性の、統計的に有意な増大または低減を生じる。
特定の実施形態において、ＳＰＬ活性についてのインビトロアッセイは、目的のポリペプチドを発現する細胞から調製された細胞抽出物を使用して実施され得る。好ましくは、ＳＰＬポリペプチドをコードする遺伝子の非存在下で、このような細胞は、有意な量の内因性ＳＰＬを産生しない（すなわち、細胞抽出物は、抽出物なしの緩衝液単独と比較して、ＳＰＬのレベルの検出可能な増加を含まないはずである）。本発明の文脈において、ＳＰＬ遺伝子（ＢＳＴ１）の欠失を含む酵母細胞が、ポリペプチドのＳＰＬ活性を評価する際の使用に適切であることが、見出されている。ｂｓｔ１Δ細胞は、本明細書中に記載されるような標準的な技術（例えば、ＰＣＲ）を使用して、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから作製され得る。ＳＰＬ活性について試験されるべきポリペプチドは、次いで、ｂｓｔ１Δ細胞において発現され得、そしてこのポリペプチドを含む抽出物におけるＳＰＬ活性のレベルが、このポリペプチドを発現しない細胞から調製した抽出物のＳＰＬ活性のレベルと比較され得る。このような試験について、ポリペプチドは、好ましくは、細胞当たり２０コピーより多い遺伝子を生じる、高コピー数酵母ベクター（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐＹＥＳ２）で発現される。一般に、ポリペプチドは、ｂｓｔ１Δ細胞においてこのようなベクターを使用して発現される場合、ＳＰＬ活性を有し、細胞抽出物は、このポリペプチドを発現しない細胞から調製した抽出物について観察されたレベルよりも、２倍増加した基質分解を生じる。
ＳＰＬ活性についてのさらなる試験は、ｂｓｔ１Δ株における機能的補償に基づき得る。本発明の文脈において、ｂｓｔ１Δ細胞が、Ｄ−エリトロ−スフィンゴシンに対して高度に感受性であることが見出されている。特に、１０μＭほどの低さのスフィンゴシン濃度は、ｂｓｔ１Δ細胞の増殖を完全に阻害する。このようなレベルのスフィンゴシンは、野生型細胞の増殖に対して影響がない。上述のようなＳＰＬ活性を有するポリペプチドは、細胞当たり２０コピーより多い遺伝子を生じる高コピー数酵母ベクターで発現される場合、スフィンゴシン感受性を有意に（すなわち、少なくとも２倍）低減させる。
スフィンゴ脂質中間体を検出および測定するアッセイとしては、固相抽出が挙げられる。特定の実施形態において、Ｓｔｒａｔａ Ｃ１８−Ｅ固相抽出カラム（５０ｍｇ／ｍｌ）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）が使用され得る。この文脈において、このカラムは、最初に２００μｌのメタノールで加湿され、その後、１ｍｌの溶媒Ａを用いて平衡化される。溶媒Ａ中のハエ抽出物またはＬＣＢ標準は、平衡化したＳｔｒａｔａ Ｃ１８−Ｅカラムに充填され、その後、１ｍｌの溶媒Ａで洗浄され得る。カラムの２回目の洗浄は、６００μｌのメタノールの添加によって実施される。次いで、ＬＣＢは、メタノール：１０ｍＭ酢酸アンモニウム（９：１（ｖ／ｖ））でカラムから溶出され、そして急速な減圧中で乾燥される。当業者は、上記のパラメータが、使用される抽出物およびＬＣＢに従って最適化および変化され得ることを、容易に理解する。
高速液体クロマトグラフィー分析（ＨＰＬＣ）もまた、本発明の文脈において使用され得る。ＨＰＬＣは、例えば、Ｌｅｓｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．およびＲ．Ｃ．Ｄｉｃｋｓｏｎ．２００１．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９８：２８３−２９２に記載されるように、実施され得る。簡潔には、ＬＣＢは、例えば、Ｃａｌｉｇａｎ，Ｔ．Ｂ．，Ｋ．Ｐｅｔｅｒｓ Ｊ．Ｏｕ，Ｅ．Ｗａｎｇ，Ｊ．ＳａｂａおよびＡ．Ｈ．Ｊｒ．Ｍｅｒｒｉｌｌ．２０００．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８１：３６−４４に記載されるように、オルト−フタルアルデヒド（ＯＰＡ）（Ｓｉｇｍａ Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で誘導体化される。ＯＰＡ誘導体化ＬＣＢは、移動相メタノール／１０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．２）（８２：１８（ｖ／ｖ））を用いて、逆相カラム上で分離される。多数の逆相カラムが、当該分野で公知である。例示的な逆相カラムとしては、Ｌｕｎａ ＲＰ−１８，３μ，４．６×７５ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）が挙げられるが、これに限定されない。流速は、一般に、１ｍｌ／分の範囲である。当業者は、流速が、０．２ｍｌ／分〜３ｍｌ／分の範囲であり得、そしてその間の任意の整数を含むことを理解する。任意の数のＨＰＬＣシステムが使用され得る。例示的なシステムとしては、１２５溶媒モジュールを備えるＢｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄが挙げられる。蛍光ＬＣＢは、種々のシステムを使用して検出され得る。１つの特定の実施形態において、蛍光ＬＣＢは、Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ蛍光検出器（ＳＰ ８４１０）を使用して検出および定量される。
質量分析もまた、本明細書中に記載されるようなスフィンゴ脂質中間体を検出および測定するために、本発明の文脈において使用され得る。１つの特定の実施形態において、Ｓｔｒａｔａ Ｃ１８−Ｅカラム精製した所望の供給源由来の脂質抽出物およびＣ１４スフィンゴ脂質標準が、１０μｌのサンプルの直接注入後に、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｔｒｏ ＬＣＺ機器で分析される。移動相は、一般に、０．１％の蟻酸を含む８０％メタノールの範囲である。当業者は、移動相が最適化され得ることを理解する。流速は、一般に、０．２ｍｌ／分の範囲である。ＬＣＢの構造的確認は、ポジティブエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ＋）質量分析によって得られる。ＬＣＢは、当該分野で記載されるように、特にＳｕｌｌａｒｄｓ，Ｍ．Ｃ．およびＡ．Ｈ．Ｊｒ．Ｍｅｒｒｉｌｌ．２００１．Ｓｃｉ．ＳＴＫＥ．６７：１−１１に記載されるように、構造的に別個のイオンフラグメントの前駆イオン走査によって検出され得る。一般に、３．５ｋＶが、スプレーを開始するためにキャピラリーに印加され、そして衝突により誘導される分解スペクトルが、２０Ｖの円錐電圧（ｃｏｎｅ ｖｏｌｔａｇｅ）において、衝突ガスとしてアルゴンを用いて、１５ｅＶの衝突エネルギーで記録される。当業者は、任意の上記のパラメータが、当該分野で公知であるように測定される異なるサンプルおよび所望の中間体に従って変化し得ることを、容易に理解する。
従って、ＬＣＢは、衝突により誘導される分解および陽イオンエレクトロスプレー質量分析（ＥＳＩ＋）を使用する前駆イオン走査のパターンによって、Ｓｕｌｌａｒｄｓ，Ｍ．Ｃ．，およびＡ．Ｈ．Ｊｒ．Ｍｅｒｒｉｌｌ．２００１．Ｓｃｉ．ＳＴＫＥ．６７：１−１１に記載されるように、同定され得る。それらの独自の分子構造に基づいて、代表的な分解生成物は、２つの水分子の消失から生じる。例えば、ｍ／ｚ ２０８（Ｃ１４スフィンゴシン−２つの水分子）の前駆イオンスペクトルは、ｍ／ｚ ２４４（Ｃｌ４スフィンゴシン）およびｍ／ｚ ２２６（Ｃ１４スフィンゴシン−１つの水分子）としての親を示す。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒにおける、例えばＣ１４ジヒドロスフィンゴシンの存在を検証するために、Ｓｔｒａｔａ Ｃ１８−Ｅカラム精製された脂質抽出物が、ＥＳＩ＋によって分析され得る。さらに、ｍ／ｚ ２３６およびｍ／ｚ ２３８の前駆イオン走査は、サンプル中のＣ１６スフィンゴシンおよびＣ１６ジヒドロスフィンゴシンを同定する。
本発明の文脈において、分析のための脂質抽出物は、任意の数の当該分野で公知の手順を使用して調製され得る。例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ脂質抽出物を調製するために、２５ｍｇの凍結したインタクトなハエ材料を含むサンプルが、ホモジナイザー（例えば、７ｍｌ Ｐｏｔｔｅｒ Ｅｌｖｅｈｊｅｍホモジナイザー）中に配置される。次いで、各ＬＣＢを２５０〜５００ｐｍｏｌ含む、２０μｌの内部ＬＣＢ標準の混合物（例えば、Ｍａｔｒｅｙａ Ｉｎｃ．，Ｐｌｅａｓａｎｔ Ｇａｐ，ＰＡから市販される）が、添加される。ハエを、２ｍｌの氷冷メタノール／水（１：１（ｖ／ｖ））中で粗い（ｌｏｏｓｅ）乳棒で、そしてち密な乳棒で、乳棒が滑らかに動くようになるまでホモジナイズする。抽出物をさらに、先端ソニケータ（３×２０秒）を用いて氷上でホモジナイズし、次いで、ガラス管に移し、そして１５００×ｇで１０分間遠心分離する。上清を回収し、そしてｓｐｅｅｄ ｖａｃで乾燥させる。抽出物を、０．１Ｍの水酸化アンモニウムを含む２００μｌのメタノール中に再懸濁し、次いでボルテックスし、浴超音波処理し、そして３７℃で１時間インキュベーションして、エステル化アシル鎖の加水分解を可能にする。加水分解後、これらのサンプルを室温まで冷却し、ｓｐｅｅｄ ｖａｃで乾燥させ、そして０．１％の氷酢酸を含むメタノール／水（２：３（ｖ／ｖ））（溶媒Ａ）５００μｌ中に再懸濁する。当業者は、上記手順が、哺乳動物細胞、酵母、細菌またはスフィンゴ脂質中間体の任意の他の所望の供給源を含む他のサンプルから脂質抽出物を調製するために相応に改変され得ることを認識する。
本明細書中で留意されるように、スフィンゴ脂質シグナル伝達は、生物学的シグナル伝達（細胞分裂、細胞生存、アポトーシス、増殖および分化に関連するシグナル伝達を含む）に特異的な経路に寄与し、そして「生物学的シグナル伝達経路」または「誘導性シグナル伝達経路」は、本発明の文脈において、細胞におけるこれらのプロセスおよび類似のプロセスの制御に関与する分子成分間の、一過的または安定な会合または相互作用を含む。目的の特定のスフィンゴ脂質シグナル伝達経路（例えば、ＥＤＧレセプターに対するＳ−１−Ｐ結合によって誘導される経路など）に依存して、このような経路の誘導を決定するための適切なパラメータが選択され得る。細胞増殖に関連するシグナル伝達経路について、増殖を定量するための利用可能な種々の周知の方法論が存在する（例えば、トリチウム化チミジンの細胞ＤＮＡへの取り込み、細胞呼吸活性の検出可能な（例えば、蛍光または比色）指標のモニタリングまたは細胞計数などを含む）。同様に、細胞生物学の分野において、細胞生存を評価するため（例えば、生命（ｖｉｔａｌ）色素、代謝指標など）、およびアポトーシスを決定するため（例えば、アネキシンＶ結合、ＤＮＡフラグメント化アッセイ、カスパーゼ活性化など）の公知の複数の技術が存在する。他のシグナル伝達経路は、特定の細胞表現型（例えば、遺伝子発現の特異的誘導（例えば、転写産物もしくは翻訳産物として検出可能であるか、またはこのような産物のバイオアッセイによって検出可能な、または細胞質因子の核局在として検出可能である））、細胞内媒介因子（例えば、活性化されたキナーゼまたはホスファターゼ、環状ヌクレオチドまたは生理学的に活性なイオン性種の変更されたレベルなど）変更された（例えば、統計的に有意な増大または減少）レベル、あるいは変更された細胞形態など）と関連し、その結果、本明細書中に提供されるような特定の刺激に対する細胞の応答性は、特定の細胞応答が特定のスフィンゴ脂質シグナル伝達経路に応答するか否かを決定するために、容易に同定され得る。
（癌を検出するための方法）
他の局面において、本発明は、癌を診断するため、および／あるいは癌を発症する危険性があるか、または平均よりも高いかもしくは低い転移の危険性がある個体を同定するための、方法およびキットを提供する。本発明の文脈において、特定のヒト腫瘍細胞は、変更されたＳＫ発現およびＳＰＬ発現を含むことが見出されている。特に、ＳＰＬ発現の減少は、実施例においてさらに記載されるように、同じ個体由来の対応する正常組織と比較して、特定の腫瘍組織において観察された。さらに、ＳＫ発現の増大は、同じ個体由来の対応する正常組織と比較して、多数の腫瘍組織において観察された。換言すると、このようなポリヌクレオチドまたはこれらのポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、患者における癌の存在または非存在を示すためのマーカーとして使用され得る。
従って、本発明の１局面は、スフィンゴ脂質代謝および／またはシグナル伝達経路の成分（特に、ＳＫおよびＳＰＬ）をコードするポリヌクレオチドの発現レベルの変化を検出することによって癌を検出するための方法を提供する。これに関して、コントロールと比較してＳＰＬの発現の統計的に有意な減少を示す個体は、癌に罹患しているとみなされる。特に、対応する正常組織と比較して癌サンプルにおけるＳＰＬ発現の５０％〜６０％、６１％、６２％、６３％、６４％または６５％の減少は、患者における癌の存在を示す。１実施形態において、対応する正常組織と比較して癌サンプルにおけるＳＰＬ発現の２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、４６％、４７％、４８％または４９％の減少は、患者における癌の存在を示す。同様に、コントロールと比較して、ＳＫの発現における統計的に有意な増大を示す個体は、癌に罹患しているとみなされる。特に、対応する正常組織と比較して癌サンプルにおけるＳＫ発現の５０％〜６０％、６１％、６２％、６３％、６４％または６５％の増大は、患者における癌の存在を示す。１実施形態において、対応する正常組織と比較して癌サンプルにおけるＳＫ発現の２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、４６％、４７％、４８％または４９％の増大は、患者における癌の存在を示す。
癌は、癌を有さないことが既知の正常なコントロール被験体から得られた生物学的サンプルにおいて検出されたｍＲＮＡのレベルと比較して、癌を有することが疑われる個体から得られた生物学的サンプルにおける、スフィンゴ脂質代謝および／またはシグナル伝達に関与するタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルに基づいて、検出され得る。特定の実施形態において、例えば、実施例に記載されるように、同じ患者由来の腫瘍組織および対応する正常組織を示すｃＤＮＡ対を含む生物学的サンプルは、癌の存在を決定するために使用され得る。一人の患者由来のサンプル（例えば、細胞、組織または生物学的流体）対を利用することによって、個人間の多様性に起因し得る、腫瘍組織と正常組織との間の遺伝子発現の差異は、結果の解釈を混乱させるべきではない。特定の他の実施形態において、サンプルは、癌を有するかまたは癌を有する危険性があると疑われる被験体（例えば、患者）ならびに癌（例えば、悪性腫瘍）の存在および／または癌を有する危険性を有さないことが既知の、正常なコントロール被験体の両方から獲得され得る。当業者は、記載もしくは特徴付けられた癌について、１つ以上の兆候または症状が、癌が存在するという疑いが基づき得るレベルで明白である時点を確認するために、臨床的基準が確立されていることを理解する。生物学的サンプルとしては、以下が挙げられ得るが、これらに限定されない：血液、血清、尿、細胞または任意の型の組織（例えば、乳房、肺、結腸など）、生検、腫瘍、リンパ節など。例えば、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーが、生物学的サンプル由来のｃＤＮＡの一部を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースのアッセイ（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ＱＣ−ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲなど）において使用され得、ここで、これらのオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも一方は、このタンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的である（すなわち、当該分野で公知の種々の技術およびコントロールのいずれか１つを使用して決定される場合、特異的にハイブリダイズする）。次いで、増幅されたｃＤＮＡは、当該分野で周知の技術（例えば、ゲル電気泳動）を使用して、分離および検出される。一般に、この文脈において使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、当該分野で公知の指針を使用して生成され得る。特に、オリゴヌクレオチドプライマーは、目的のポリヌクレオチドに特異的であるように設計される。使用されるＰＣＲ条件は、温度、アニーリング時間、伸長時間およびサイクル数に関して、増幅されるべきオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドに依存して、最適化され得る。このような技術は、当該分野で周知であり、そして例えば、Ｍｕｌｌｉｓら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５１：２６３，１９８７；Ｅｒｌｉｃｈ編，ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９）に記載される。オリゴヌクレオチドプライマーは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチド長のいずれかであり得る。特定の実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、３５、４０、４５、５０、５５または６０ヌクレオチド長である。１実施形態において、これらのオリゴヌクレオチドは、本明細書中に記載される配列（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１２、１５、１７および２２〜２７に示される配列またはそれらの相補体）を含む。
同様に、スフィンゴ脂質代謝および／またはシグナル伝達に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブは、癌を有することが疑われる患者から得られた、本明細書中に記載されるような生物学的サンプル（生物学的サンプルとしては、血液、組織、生検、腫瘍、リンパ節などが挙げられ得るが、これらに限定されない）中の、このタンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在を検出するために、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用され得る。オリゴヌクレオチドプローブは、上記の長さのものであり得る。特定の実施形態において、プローブは、配列番号１、３、５、７、９、１２、１５、１７および２２〜２７に示される全長配列またはそれらの相補体を含み得る。
アッセイ条件下でのハイブリダイゼーションを可能にするために、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、少なくとも１０ヌクレオチド長、そして好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長である、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部に対して、少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７５％、そしてより好ましくは少なくとも約９０％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列を含むべきである。好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブは、上記定義のような中程度にストリンジェントな条件下で、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする。本明細書中に記載される診断方法において有用に使用され得るオリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブは、好ましくは、少なくとも１０〜４０ヌクレオチド長である。好ましい実施形態において、これらのオリゴヌクレオチドプライマーは、本明細書中に開示される配列を有するＤＮＡ分子の、少なくとも１０連続するヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５連続するヌクレオチドを含む。ＰＣＲベースのアッセイおよびハイブリダイゼーションアッセイの両方についての技術は、当該分野で周知である（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５１：２６３，１９８７；Ｅｒｌｉｃｈ編、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９を参照のこと）。
１つの好ましいアッセイは、ＲＴ−ＰＣＲを使用し、ここで、ＰＣＲは、逆転写と合わせて適用される。代表的には、ＲＮＡは、生物学的サンプル（例えば、生検組織）から抽出され、そして逆転写されてｃＤＮＡ分子を生じる。少なくとも１つの特異的プライマーを使用するＰＣＲ増幅は、ｃＤＮＡ分子を生成し、このｃＤＮＡ分子は、例えば、ゲル電気泳動を使用して、分離および可視化され得る。増幅は、試験患者および癌に罹患していない個体から採取された生物学的サンプルに対して実施され得る。増幅反応は、２桁の大きさにわたるｃＤＮＡのいくつかの希釈物に対して実施され得る。非癌性サンプルの同じ希釈物と比較した、試験患者サンプルのいくつかの希釈物における発現の統計的に有意な増大または減少は、代表的に、ポジティブとみなされる。あるいは、同じ試験患者由来の対応する正常組織におけるポリヌクレオチドのレベルが、コントロールとして使用され得る。
本発明の１局面は、スフィンゴ脂質代謝および／またはシグナル伝達経路の成分（特に、ＳＫおよびＳＰＬ）をコードするポリヌクレオチドの発現レベルの変化を検出することによって、癌の進行をモニタリングするための方法を提供する。この実施形態において、癌の診断のための上記アッセイは、経時的に実施され得、そして反応性のポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルの変化が評価され得る。例えば、これらのアッセイは、６ヶ月〜１年の間にわたって、２４〜７２時間毎に実施され得、その後必要に応じて実施され得る。一般に、癌は、検出されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルが、経時的に、統計的に有意な増大（例えば、ＳＫについて）または減少（例えば、ＳＰＬについて）を示す患者において、進行している。対照的に、この癌は、反応性のポリペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれかのレベルが経時的に一定のままである場合、進行していない。
他の腫瘍細胞（例えば、乳房、結腸、子宮または他の腫瘍細胞）におけるスフィンゴ脂質代謝に関与する本発明のポリペプチドをコードする遺伝子中に存在する特定の変更は、標準的な技術（例えば、ＰＣＲ）を使用して、容易に同定され得る。特定の腫瘍に関連し得る変更としては、アミノ酸の欠失、挿入、置換およびこれらの組み合わせが挙げられる。このような変更の存在または非存在が決定される方法は、癌を検出するため、そして癌に罹患していることが既知の患者についての予後を評価するために、一般に使用され得る。
変更された遺伝子を検出するために、ＰＣＲおよびハイブリダイゼーション技術が挙げられるがこれらに限定されない種々の周知技術のいずれかが、本発明のポリヌクレオチドまたはその改変体を用いて使用され得る。癌性細胞を含み得る任意のサンプルがアッセイされ得る。一般に、適切なサンプルは、腫瘍生検である。好ましい実施形態において、サンプルは、乳癌生検である。
癌の予後を診断または評価するためのキットは、一般に、使用されるべき特定のアッセイにおいて使用するための試薬を備える。一般に、本発明のキットは、アッセイにおいて使用されるべきエレメント（例えば、プライマー、プローブ、試薬または緩衝液）を封入する１つ以上の容器を備える。例えば、キットは、スフィンゴ脂質代謝に関与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに相補的な、少なくとも１５ヌクレオチドを含む、１つ以上のポリヌクレオチドプライマーまたはポリヌクレオチドプローブを備え得る。好ましい実施形態において、このポリペプチドはＳＫである。特定の実施形態において、これらのプライマーまたはプローブは、スフィンゴ脂質代謝に関与するポリペプチドをコードするｍＲＮＡまたはポリヌクレオチドに相補的な、少なくとも１０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも１５０または２００ヌクレオチドを含む。このようなプローブは、例えば、ハイブリダイゼーションによって、変更されたＳＫ遺伝子を検出するために使用され得る。例えば、キットは、腫瘍（コントロール）において一般に変更されていないＳＫ遺伝子またはＳＰＬ遺伝子の領域にハイブリダイズする第一のプローブ、および乳癌において一般に欠失されている領域にハイブリダイズする第二のプローブを備え得る。（標準的な技術を使用して）第一のプローブにハイブリダイズし、そして第二のプローブにハイブリダイズしないｍＲＮＡを含むサンプルは、変更されたＳＫ遺伝子またはＳＰＬ遺伝子を含む。適切なコントロールプローブとしては、欠失された領域の外側のＳＫ遺伝子またはＳＰＬ遺伝子の一部にハイブリダイズするプローブが挙げられる。あるいは、キットは、ＰＣＲ分析のための１つ以上のプライマーを備え得、これは、当業者によって、本明細書中に提供される配列に基づいて容易に設計され得る。必要に応じて、キットは、上記のアッセイにおいて使用するための１つ以上の溶液、化合物または検出試薬をさらに備え得る。
本発明の関連の局面において、スフィンゴ脂質代謝に関与するポリペプチドを検出するためのキットが提供される。このようなキットは、サンプル中で、ＳＫまたはＳＰＬのようなタンパク質またはタンパク質をコードする核酸のレベルを検出するために設計され得るか、あるいは本明細書中に記載されるようなＳＫ活性またはＳＰＬ活性のレベルを検出し得る。本明細書中に記載されるような、ＳＫもしくはＳＰＬ、またはＳＫもしくはＳＰＬをコードする核酸、またはスフィンゴ脂質代謝および／もしくはシグナル伝達の他の成分のレベルを検出するためのキットは、代表的に、タンパク質、ＤＮＡまたはＲＮＡに結合する試薬を備える。ＳＫ、ＳＰＬまたは他のタンパク質をコードする核酸を検出するために、この試薬は、核酸プローブまたはＰＣＲプライマーであり得る。ＳＫ、ＳＰＬまたは他のタンパク質を検出するために、この試薬は、代表的には抗体である。このキットはまた、上記のような試薬の直接的または間接的な検出に適切なレポーター基を備え得る。
（変異体およびトランスジェニックのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒの生成）
本発明はさらに、変異体および／またはトランスジェニックのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒを提供する。１実施形態において、変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒは、スフィンゴ脂質代謝および／またはシグナル伝達経路の成分をコードする遺伝子のコード領域中に、Ｐ因子トランスポゾン挿入を含む。特定の実施形態において、Ｐ因子トランスポゾン挿入は、本明細書中に記載されるような少なくとも１つのスフィンゴ脂質中間体のレベルを変更させる。さらなる実施形態において、Ｐ因子トランスポゾンは、本明細書中に記載されるようなスフィンゴ脂質経路の少なくとも１つの成分の活性レベルを変更させる。さらなる実施形態において、本発明の変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒは、スフィンゴ脂質代謝および／またはシグナル伝達経路の成分をコードする１つより多い遺伝子のコード領域中に、Ｐ因子挿入を含む。スフィンゴ脂質代謝および／またはシグナル伝達経路の成分をコードする任意の数の遺伝子中に、任意の数の挿入を含む変異体が、生成され得る。特定の実施形態において、スフィンゴ脂質代謝および／またはシグナル伝達経路の成分をコードする、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの遺伝子が、Ｐ因子挿入を含む。
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒの例示的な系統としては、野生型Ｃａｎｔｏｎ Ｓ、ｌａｃｅ２／ｌａｃｅ０５３０５変異体株およびＳｐｌｙ変異体系統が挙げられる。ハエは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ，ＩＮ）から入手され得る。一般的なハエの飼育（ｈｕｓｂａｎｄｒｙ）は当該分野で公知であり、例えば、Ａｓｈｂｕｒｎｅｒ，ＭおよびＲｏｏｔｅ Ｊ，２０００．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ，Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ５８５−６００に記載される。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒの解剖学的構造の分析は、以下に記載されるものを含む、当該分野の種々の技術を使用して、当業者によって実施され得る：Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｐ．Ｔ．およびＢｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｓ．Ｉ．（１９８８）．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０７，２６０１−１２．；Ｆｙｒｂｅｒｇ，Ｅ．Ａ．，Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｓ．Ｉ．およびＶｉｊａｙＲａｇｈａｖａｎ，Ｋ．（１９９４）．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ４４，２３７−５８。
本発明はさらに、ｆｌｉｇｈｔｌｅｓｓ表現型を示すＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ変異体を提供し、この表現型は、スフィンゴ脂質代謝および／またはシグナル伝達に関与する内因性遺伝子（例えば、本明細書中に詳述されるようなＳＰＬ、ＳＫ、ＳＰＴまたは他の遺伝子）の破壊から生じる。１実施形態において、ｆｌｉｇｈｔｌｅｓｓ表現型とは、本発明の非哺乳動物生物モデルが、背側縦筋肉（ｄｏｒｓａｌ ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｍｕｓｃｌｅｓ（ＤＬＭ））を含む筋繊維の数の減少を自然に発症し、同時に、残存繊維における補償的肥大を有することを意味する。ＤＬＭ形成の分析は、分化の異なる段階に特異的なマーカーおよび成虫原基から発生する筋芽細胞を幼虫テンプレート筋肉（ｌａｒｖａｌ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｍｕｓｃｌｅ）に対して識別するＧＦＰマーカーを使用して、実施される。筋肉発生の一連のマーカーの発現はまた、胚の筋肉分化を評価する際に使用され得る。例えば、Ｄｍｅｆ２は、移動中の筋芽細胞において発現されて、胚の筋発生における初期工程の分析を可能にする。これらの筋芽細胞は分裂し、αＭＨＣを発現し、そして最終的には融合して胚の筋肉を形成する、２つの筋細胞を形成する。従って、ＭＨＣを評価することによって、胚の筋肉融合が評価され得る。
特定の局面において、本発明のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒの変異体はまた、胸筋のＴ２節の異常な発達パターニングを示し得る。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒの解剖的構造の同定は、当該分野で公知の種々の技術（本明細書中実施例、またはＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第６版，Ｓｃｏｔｔ Ｆ．Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡに記載される技術を含む）を使用して、当業者によって容易に実施される。好ましい実施形態において、上記表現型は、飛翔不可能性を生じるか、またはそうでなければ、実施例またはＶｉｇｏｒｅａｕｘら、１９９３ Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｍａｙ；１２１（３）：５８７−９８に記載されるように、飛翔能力が低下する。好ましい実施形態における、本Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒは、スフィンゴ脂質代謝経路および／またはシグナル伝達経路の少なくとも１つの成分（例えば、ＳＰＬ、ＳＫ、ＳＰＴ、セラミダーゼまたは本明細書中に記載される他の成分）の活性の変更を示す。特定の例示的な実施形態において、上記Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒは、内因性ＳＰＬ活性が減少し、そして／またはＳＫの活性が増加するかもしくは減少する。
好ましい実施形態において、この株は、スフィンゴ脂質代謝および／またはシグナル伝達の成分（例えば、ＳＰＬ、ＳＫ、ＳＰＴ、Ｓ−１−ＰＰ、セラミダーゼまたはこれらの任意の組み合わせ）をコードする１つ以上の任意の遺伝子に変異を含む。本発明のさらなる実施形態において、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ株は、配列番号１６に示されるＳＰＬタンパク質をコードする遺伝子の任意の領域に位置するＰ因子トランスポゾンに対して異型接合である。特定の実施形態において、Ｐ因子トランスポゾンは、遺伝子の調節領域に位置する。好ましい実施形態において、ハエは、配列番号１６に示されるＳＰＬタンパク質をコードする遺伝子のコード領域における異型挿入変異体である。本発明のさらなる実施形態において、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ株は、配列番号１８、１９，２０、２８、および２９のいずれか１つまたは全てに示されるＳＫタンパク質をコードする遺伝子のコード領域に存在するＰ因子トランスポゾンについて異型である。好ましい実施形態において、ハエは、配列番号１８、１９，２０、２８、および２９の任意の１つ以上に示されるＳＫタンパク質をコードする遺伝子のコード領域における異型挿入変異体である。本発明のなおさらなる実施形態において、ハエの異型変異体株は、無飛力表現型を有する。特定の実施形態において、変異体ハエは、背側縦筋を含む筋線維の数が減少し、そして残りの線維の代償性肥大を有する。特定の局面において、本発明の変異体ハエはまた、例えば、本明細書中実施例において記載されるように、胸筋のＴ２節の異常な発達パターニングを示し得る。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒの正常な解剖学的構造および異常な解剖学的構造の同定は、当業者に公知の技術および本明細書中に記載される技術（例えば、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第６版、Ｓｃｏｔｔ Ｆ．Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡに記載される技術）を使用して実施され得る。例示的な変異体は、変更されたスフィンゴ脂質代謝を有する。
スフィンゴ脂質代謝および／またはシグナル伝達の成分をコードする遺伝子に位置するＰ因子トランスポゾンについて異型のハエは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａゲノムプロジェクトから得られ得る。異型挿入変異体は、当該分野で公知の技術を使用して、遺伝的交差および異型挿入変異体の存在について（例えば、Ｐ因子上に保持される劣性マーカーによってコードされる赤褐色の眼色の存在に基づいて）の子孫の評価によって、作製され得る。スフィンゴ脂質代謝に関与するＳＰＬまたは他の遺伝子の発現は、当業者に公知の多くのアッセイ（例えば、ノーザンブロット分析）を使用して評価され得る。各遺伝子型のＳＰＬ機能を決定するために、＋／＋ハエ、＋／−ハエおよび−／−ハエは、標準的な技術を使用してホモジナイズされ得、全抽出物は、本明細書中に記載されるようなアッセイを使用してＳＰＬ活性についてアッセイされ得る。トランスポゾンは、活発に転写されるトランスポザーゼ遺伝子を保持するハエとＳＰＬ変異体ハエを交差することによって移動され得、このことは、体細胞株および生殖細胞系の両方の染色体において、Ｐ因子の除去を引き起こすはずである。生殖細胞系トランスポゾンの喪失は、遺伝性であり、そして眼色または他の関連するマーカーによって、子孫中に同定され得る。従って、トランスポザーゼ遺伝子およびＰ因子の両方を喪失した子孫が、単離され得、そして復帰された対立遺伝子が、異型接合され得る。
本明細書中で記載されるような機能性タンパク質の発現を恒久的にブロックするＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ中の変異は、いくつかの方法（例えば、Ｐ因子トンラスポゾンの挿入または化学物質誘導性変異誘発もしくは放射線誘導性変異誘発）によって作製され得る。変異体ハエの例示的な株は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ａｔ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ（Ａｄａｍｓ，Ｍ．ら、２０００．Ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８７：２１８５−２１９５．）を通して入手可能である。あるいは、目的の挿入変異体は、Ｔｏｗｅｒ，Ｊ．ら（Ｔｏｗｅｒ，Ｊ．ら、１９９３．Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｐ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｔｏ ｎｅａｒｂｙ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｓｉｔｅｓ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１３３：３４７−３５９．）に本質的に記載されるような、ローカルホップ（ｌｏｃａｌ ｈｏｐ）戦略を使用することによって得られ得る。トランスポゾンは、トランスポザーゼ遺伝子における交差、続く、トランスポザーゼを外に出す（遺伝的安定性を再導入する）交差をすることによって可動され得る。変異体ハエは、当業者に公知の技術を使用して同定され得る。例えば、変異体ハエは、標的遺伝子をプローブとして使用するスクリーンにおいて生成されるハエからの抽出物から調製されるサザンブロットをプローブすることによって同定され得る。続いて、交差を実施して、目的の変異体対立遺伝子（例えば、ＳＰＬ、ＳＫ、ＳＰＴまたはスフィンゴ脂質代謝および／もしくはシグナル伝達の他の成分）を導入し、両方の変異体対立遺伝子（例えば、ＳＰＬおよび新規トランスポゾン組込み部位）で同型接合性を生成する。変異体は、目的の表現型（例えば、変異導入された対立遺伝子が同型である場合、ＳＰＬ変異体に対して飛翔を復帰させる能力）についてスクリーンされ得る（劣性の表現型を予測する）。
本発明の１つの局面において、ハエ遺伝子操作は、ハエの交配（すなわち「交差」）および種々の表現型マーカーを発現する子孫についての、またはそれに対する選択を必然的に伴い得る。本発明のハエ遺伝子操作についての例示的な技術は、当該分野で公知であり、例えば、Ａｓｈｂｕｒｎｅｒ，Ｍ．およびＪ．Ｒｏｏｔｅ．２０００．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ．Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｗ．Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｍ．ＡｓｈｂｕｒｎｅｒおよびＲ．Ｈａｗｌｅｙ監修、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．５８５−６００に記載される。表現型マーカーは、染色体の遺伝的形質、操作された位置変更可能なエレメント、またはこれらの可動化を容易にするためのトランスポザーゼ遺伝子を同定するために使用され得る。例えば、眼色、剛毛形状、羽形態およびクチクラ色素に影響するマーカー変異は、本発明の変異体ハエに対する交差において使用され得る。本発明の１つの局面において、所望の遺伝子型を示すマーカーの集合を含む個体を選択することが望ましくあり得る。本発明の別の局面において、平均体の染色体は、異型状態において存在する劣性変異を同定する能力を生じるために使用される。平均体の染色体は、雌の減数分裂前期の間に相同組換えを防止するために使用され得る。優性致死遺伝子および劣性致死遺伝子の両方の存在は、平均体の染色体の存在または非存在を決定することを可能にし、同時に相同染色体を追跡し、この相同染色体は、それ自体、優性マーカーを含まなくても良い。本発明の１つの特定の例示的な交差は、本明細書中で実施例において記載されるように、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＳＰＬ遺伝子中のＰ因子挿入を除去することおよび表現型の回復を確立することである。
本明細書中に記載される変異体ハエを作製するために必要とされる遺伝学は、いくつかの連続的な工程を包含し得る。例えば、Ｓｐｌｙ０５０９１対立遺伝子およびｌａｃｅ０５３０５対立遺伝子について同型である株は、減数分裂組換えによって生成されるべきであり得る。Ｓｐｌｙ０５０９１変異体およびｌａｃｅ０５３０５変異体は、イントランスで導入され得、次世代において、安定化され得る。ｌａｃｅ０５３０５対立遺伝子を保持するハエは、ｗ＋の存在によって選択され得る。本発明のＳｐｌｙ０５０９１および他の変異の存在は、ＰＣＲによって証明され得る。類似の戦略が、本発明によって構想される他の戦略的交差を生じるために使用される。例えば、両ＳＫ遺伝子に対するヌル対立遺伝子を含む株が、作製され得る。スフィンゴ脂質代謝および／またはシグナル伝達経路の１つ以上の成分についてのヌル対立遺伝子を含む株は、本発明によって想定される。例えば、ＳＫおよびＳＰＬについてのヌル対立遺伝子を含む株が、想定される。ＳＰＴおよびＳＫについてのヌル対立遺伝子を含む株は、スフィンゴ脂質代謝および／またはシグナル伝達経路における実質的に任意の成分の、他の二重変異体、三重変異体、および四重変異体として想定される。
変異体ハエの選択を可能にする選択的マーカーは、本発明において提供される。本発明の例示的な選択的マーカーは、トランスポゾン上に保持される野生型赤褐色（ｒｙ＋）対立遺伝子を含み、安定なトランスポゾンについて、またはそれに対する選択を可能にし得る。活性なトランスポゾンの導入は、例えば、第１の交差における優性マーカー（Ｓｔｕｂｂｌｅ（短い剛毛表現型））の存在によって選択され、そして、第２の交差において遺伝的安定性を回復し、トランスポザーゼを喪失した子孫を同定するために選択される。他の例示的なマーカーとしては、Ｃｕｒｌｙ Ｏ（ＣｙＯ）（これは２コピーで存在する場合、致死である）が挙げられ、これは、ＣｙＯ平均体を含む異型接合および元々トランスポゾンを含む別の目的の対立遺伝子（例えば、ＳＰＬ）の選択を可能にする。赤褐色の眼色に対して選択することによって、目的の遺伝子座（例えば、ＳＰＬ、ＳＫ、またはスフィンゴ脂質代謝および／もしくはシグナル伝達の他の成分）からトランスポゾンが除去された子孫が、同定され得る。集団中のこの「復帰した」対立遺伝子の拡大は、第３の交差において達成され得、所望の対立遺伝子が、最終交差において同型接合され得、目的のインタクトな対立遺伝子（例えば、ＳＰＬおよび／またはＳＫ）の復帰が、所望の目的の表現型（例えば、飛翔の復帰）に関連するかどうかを決定し得る。
トランスジェニックＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒはまた、本発明において提供される。トランスジェニックＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒを調製する関連する方法は、Ｓｐｒａｄｌｉｎｇ，Ａ．Ｃ．，およびＲｕｂｉｎ，Ｇ．Ｍ．（１９８２）．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１８，３４１−３４７；Ｂｒａｎｄ ＆ Ｐｅｒｒｉｍｏｎ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１９９３）１１８：４０１−４１５；ならびにＰｈｅｌｐｓ ＆ Ｂｒａｎｄ，Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９８年４月）１４：３６７−３７９に開示される。Ｓｐｒａｄｌｉｎｇ ＡＣ，Ｐ Ｅｌｅｍｅｎｔ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｄ．Ｒｏｂｅｒｔｓ編，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）（１９８６）第１７５頁−第１７９頁；および米国特許第６，３１６，６９０号もまた参照のこと。
本トランスジェニックハエは、任意の簡便なプロトコルを使用して調製され得、このプロトコルは、導入遺伝子の必要な空間的発現を提供するのに十分な様式で、導入遺伝子のハエゲノムへの安定な組み込みを提供する。多くの異なる戦略が、必要な発現パターンを有する導入遺伝子の組込みを得るために使用され得る。一般的に、本トランスジェニックハエを産生する方法は、導入遺伝子のハエゲノムへの安定な組込みを包含する。安定な組込みは、ハエの細胞（例えば、ハエ胚）に導入遺伝子を組込むことによって達成される。導入遺伝子は、一般的に、適切なベクター（例えば、プラスミド）上に存在する。導入遺伝子導入は、任意の都合の良いプロトコルを使用して達成され得、ここで、適切なプロトコルは、以下を含む：エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、小胞送達（例えば、リポソーム送達小胞）など。導入遺伝子の細胞への導入後、導入遺伝子は、細胞のゲノムに安定に組込まれる。安定な組み込みは、部位特異的またはランダムのいずれかであり得るが、一般的にランダムである。
組込みがランダムである場合、導入遺伝子は、代表的に、トランスポザーゼの使用により組込まれる。このような実施形態において、導入遺伝子は、必要なＰ因子末端３１塩基対逆方向反復を含むベクター内で、細胞に導入される。導入遺伝子が組込まれるべき細胞が、内因性トランスポザーゼを含まない場合、トランスポザーゼをコードするベクター（例えば、トランスポザーゼ遺伝子を含むヘルパープラスミド（例えば、ｐＴＵＲＢＯ））がまた、その細胞に導入される（Ｓｔｅｌｌｅｒ ＆ Ｐｉｒｒｏｔｔａ，「Ｐ Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ」、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８６）６：１６４０−１６４９に開示されるように）。標的Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ細胞のゲノムへの導入遺伝子のランダムな組込みの方法は、米国特許第４，６７０，３８８号に開示される。
導入遺伝子がハエゲノムにランダム様式で安定に組込まれる実施形態において、ハエの成長の間、適当な時間で、導入遺伝子を選択的に発現する手段がまた、提供される。言い換えると、導入遺伝子の標的化された発現を提供する手段が提供される。ランダムに組込まれた導入遺伝子の、所望される標的化された発現を得るために、Ｐ因子ベクター中への単一の単位としての、導入遺伝子の上流の特定のプロモーターの組込みが、使用され得る。あるいは、導入遺伝子の発現を媒介するトランス活性化因子が、使用され得る。Ｂｒａｎｄ ＆ Ｐｅｒｒｉｍｏｎ（上述）に記載されるＧＡＬ４系は、特に興味深い。
本発明の１つの局面において、導入遺伝子ハエは、目的のタンパク質（例えば、ＳＰＬ、ＳＫ、ＳＰＴ、Ｓ−１−ＰＰ、セラミダーゼ、またはこれらの任意の組み合わせ）を、発現するか、過剰発現するか、または誤発現するＰ因子を使用して、作製され得る。本発明の文脈において使用するための導入遺伝子としては、ヒト、マウス、酵母、またはＣ．ｅｌｅｇａｎｓ由来の、ＳＰＬ、ＳＫ、ＳＰＴ、Ｓ−１−ＰＰ、セラミダーゼ、またはスフィンゴ脂質代謝および／もしくはシグナル伝達に関与する任意の他のタンパク質が挙げられ得る。本発明のさらなる実施形態において、目的の導入遺伝子は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。例えば、スフィンゴ脂質代謝経路のポリペプチド成分（例えば、ＳＫ、ＳＰＬ、ＳＰＴ、Ｓ−１−ＰＰなど）をコードするポリヌクレオチドは、本発明の文脈において導入遺伝子として使用するために、目的のタンパク質を、マーカータンパク質（例えば、ＧＦＰ）に融合するように操作され得る。当業者は、多くのマーカータンパク質が、本発明の融合タンパク質において使用され得ることを容易に理解する。
本発明の１つの実施形態において、ＧＡＬ４媒介性エピトープ遺伝子発現は、本質的に記載されるように使用される（ｖａｎ Ｒｏｅｓｓｅｌ，Ｐ．，およびＡ．Ｂｒａｎｄ．２０００．ＧＡＬ４−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｃｔｏｐｉｃ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ．Ｉｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｗ．Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｍ．Ａｓｈｂｕｒｎｅｒ，およびＲ．Ｈａｗｌｅｙ，ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．４３９−４４８．）。他の例示的誘導性プロモーターは、例えば、Ｒｕｂｉｎ，Ｇ，Ｈｏｎｇ Ｌ，Ｂｒｏｋｓｔｅｉｎ Ｐ，Ｅｖａｎｓ−Ｈｏｌｍ Ｍ，Ｆｒｉｓｅ Ｅ，Ｓｔａｐｌｅｔｏｎ ＭおよびＨａｒｖｅｙ Ｄ，２０００ Ａ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ ｒｅｓｏｕｒｃｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：２２２２−２２２４に記載されるように同様に使用され得る。ＧＡＬ４タンパク質は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ遺伝子の転写を活性化し得る酵母転写因子であり、この遺伝子は、ＧＡＬ４タンパク質によって認識される上流配列を含むように操作される。種々の変異体は、特定の組織分布で発現される目的の遺伝子を用いて作製され得、ＧＡＬ４含有プロモーター（ＧＡＬ４ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の調節下に目的の遺伝子（レポーター）を含む構築物は、胚に導入され、そして遺伝子マーカーは、この構築物を含む子孫の同定を可能にする。例示的なＧＡＬ４含有プロモーターとしては、ｐＵＡＳが挙げられるがこれに限定されない。当業者は、他の誘導系が、本発明の文脈において使用され得ることを容易に理解する。活性Ｐ−トランスポザーゼを含む株の胚を使用することによって、導入遺伝子の組込みの効率が上昇するが、多くの胚は死滅する。従って、これらの子孫は、組織特異的プロモーターの制御下で発現されるＧＡＬ４導入遺伝子（駆動体）を含む種々の入手可能な株に対して交差され得る。本発明の１つの実施形態において、胚形成の間の発現を可能にするＧＡＬ４駆動構築物が、使用され得る
ＳＰＬ、ＳＰＴおよび他の変異体表現型の病因を同定するための種々の方法は、当業者に公知であり、そしてまた、本明細書中に提供される。本発明は、ｓＰＬ遺伝子、ＳＫ遺伝子、ＳＰＴ遺伝子およびＳ−１−Ｐホスファターゼ遺伝子を欠損するか、または過剰発現する変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒを提供する。特定の実施形態において、異常なスフィンゴ脂質代謝は、本発明の変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒの表現型である。さらなる実施形態において、異常なスフィンゴ脂質代謝は、変異体ハエにおいて発生プログラムに影響する。特定の実施形態において、本発明の変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒおよび／またはトランスジェニックＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒは、１つ以上の腫瘍を発達させる。腫瘍は、当業者に公知の種々の技術を使用して同定され得、そして測定され得る。特に例示的な技術は、例えば、Ｄｅ Ｌｏｒｅｎｚｏ，Ｃ．，Ｂ．Ｍ．ＭｅｃｈｌｅｒおよびＰ．Ｊ．Ｂｒｙａｎｔ．１９９９．Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．１８：２９５−３１１．；Ｗａｔｓｏｎ，Ｋ．，Ｒ．ＪｕｓｔｉｃｅおよびＰ．Ｂｒｙａｎｔ．１９９４．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ 補遺１８：１９−３３．；Ｇａｔｅｆｆ，Ｅ．およびＨ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒｍａｎ．１９６７．．Ａｍｅｒ Ｚｏｏｌ．７：７６０．；Ｇａｔｅｆｆ，Ｅ．１９９４．Ｉｎｔ Ｊ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．４：５６５−５９０または本明細書中に引用されるいずれかの参考文献に記載される。
正常ハエならびに変異体ハエおよび／またはトランスジェニックハエにおける、発生の間中のスフィンゴ脂質の定量的分析および特徴付けは、当業者に公知の多くの技術を使用して実施され得る。このような技術は、例えば、Ａｓｈｂｕｒｎｅｒ，Ｍ．およびＪ．Ｒｏｏｔｅ．２０００，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ．Ｉｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｗ．Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｍ．ＡｓｈｂｕｒｎｅｒおよびＲ．Ｈａｗｌｅｙ監修、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．第５８５頁−第６００頁；Ｂｌａｉｒ，Ｓ．２０００，Ｉｍａｇｉｎａｌ ｄｉｓｃｓ，Ｉｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｗ．Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｍ．ＡｓｈｂｕｒｎｅｒおよびＲ．Ｈａｗｌｅｙ監修．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．１５９−１７５ならびにＳｔｅｒｎ，Ｄ．およびＥ．Ｓｕｃｅｎａ．２０００．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｒｖａｌ ａｎｄ ａｄｕｌｔ ｃｕｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｌｉｇｈｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｉｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｗ．Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｍ．ＡｓｈｂｕｒｎｅｒおよびＲ．Ｈａｗｌｅｙ監修．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．６０１−６１６に記載される。
さらに、正常な濃度内ではない脂質の同定は、本発明の種々の変異体において変動し、特に、発生の欠損を示す変異体の同定は、標準的な技術を使用してなされ得る。特定の実施形態において、単一または複数のスフィンゴ脂質代謝欠損を含むＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒモデルの発生の胚段階、幼虫段階、蛹段階および成虫段階は、本明細書中に、実施例において特に、記載される技術を使用して試験される。適当な分化の組織特異的マーカーを用いて、光学顕微鏡法および電子顕微鏡法ならびにインサイチュハイブリダイゼーション法は、変更されたスフィンゴ脂質代謝に関連する全体的な欠損および微妙な欠損の両方を同定するはずである。
さらなる局面において、本発明は、スフィンゴ脂質代謝が、野生型生物に比べて変更された他のトランスジェニック生物を提供する。本発明の文脈において、生物としては、マウス、ラット、およびＣ．ｅｌｅｇａｎｓならびにＤｒｏｓｏｐｈｉｌａの他の種が挙げられるがこれらに限定されない。このような生物は、スフィンゴ脂質代謝および／またはシグナル伝達に関与する内因性遺伝子の変更、挿入または欠失を含み得るか、またはスフィンゴ脂質代謝に関与する遺伝子の発現もしくは活性を調節する調節薬剤をコードするＤＮＡを含み得る。１つの実施形態において、変更される内因性遺伝子は、ＳＫを含む。特定の局面において、このような生物は、ＳＫ遺伝子またはＳＰＬ遺伝子の発現または活性を上昇する調節薬剤をコードするＤＮＡを含み得る。トランスジェニック生物は、当業者に公知の技術を使用して作製され得る。例えば、ＳＫ遺伝子またはＳＰＬ遺伝子のコード領域において挿入または欠失を含むトランスジェニック生物は、標準的な技術を使用して、胚性幹細胞から作製され得る。このような幹細胞は、ＳＫ、またはＳＰＬをコードする遺伝子の全ゲノム配列をまず同定し、次いで、胚性幹細胞中のコード領域において挿入または欠失を作成することによって、作製され得る。あるいは、適当に遺伝的に変更された胚性幹細胞は、バンクから同定され得る。変更された幹細胞を使用することによって、ハイブリッド生物は、１つの正常なＳＫ遺伝子またはＳＰＬ遺伝子および１つの顕著に異常な遺伝子を有して、作製され得る。これらのハイブリッドは、交配され得、そして同型子孫が同定される。
トランスジェニック生物は、種々の目的に用いられ得る。この種々の目的は、当業者に明らかである。例えば、このような生物は、周知の技術を用いて、異なる組織から細胞株を調製するために用いられ得る。このような細胞株は、例えば、変更の影響を評価するため、および種々の候補モジュレーターを試験するために用いられ得る。
候補治療薬剤をスクリーニングするための動物モデルとしてのそれらの使用に加えて、対象の変異体ハエおよびトランスジェニックハエはまた、スフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達に関与する遺伝子標的（すなわち、スフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達に関連する疾患を処置するために、発現が有利に調節され得る遺伝子）の同定において用途を見出す。遺伝子に基づく治療は、対象の変異体ハエおよびトランスジェニックハエにおいて従来のエンハンサー／サプレッサー分析を行うことによって同定され得る。これらの分析では、対象の変異体ハエおよび／またはトランスジェニックハエにおける遺伝子は、変異体表現型またはトランスジェニック表現型を悪化させるかまたは軽減するかのいずれかである遺伝子を同定するために変異される。遺伝子を変異させる方法およびエンハンサー／サプレッサー分析を実施する方法は、当業者に周知である（Ｈａｙｓ，Ｔ Ｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｒｃｈ １９８９）９（３）：８７５−８４；Ｄｅｕｒｉｎｇ，Ｒ；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｂ；Ｐｒｏｕｔ，Ｍ；およびＦｕｌｌｅｒ，Ｍ Ｔ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８９ ９：８７５−８４．；Ｆｕｌｌｅｒ，Ｍ Ｔら，Ｃｅｌｌ Ｍｏｔ．Ｃｙｔｏ．（１９８９）１４：１２８−３５；Ｒｏｔｔｇｅｎ Ｇ，Ｗａｇｎｅｒ Ｔ，Ｈｉｎｚ Ｕ Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９８ ２５７：４４２−５１）。
劣性の様式で本発明の変異体ハエおよび／またはトランスジェニックハエの表現型を増強するように変異する遺伝子は、スフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達に関連する状態についての潜在的タンパク質治療を生じる。なぜなら、このような遺伝子の正常な遺伝子産物レベルが上昇することは、このような状態を潜在的に軽減するからである。劣性の様式で成人発症型神経変性表現型を抑制するように変異する遺伝子は、スフィンゴ脂質の代謝またはシグナル伝達に関連した疾患を軽減するための遺伝子破壊標的を生じ、ここで、これらの遺伝子の破壊は、標的遺伝子についてのＤＮＡを欠失させることから、その転写、翻訳、またはタンパク質活性を阻害することまでの範囲の種々の方法を用いて達成され得る。候補薬剤をスクリーニングすることに関して、これらの薬剤に対する低分子アンタゴニストが構築され得、そして経口投与によってハエモデルにおける効力について評価され得る。あるいは、高分子アンタゴニストは、以下に記載のように、遺伝子治療によって送達され得る。
（使用方法および薬学的組成物）
本明細書中に記載されるような、スフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達の成分および／またはスフィンゴ脂質中間体を調節する薬剤は、スフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達の変更に関連した任意の疾患の検出、診断および処置に有用である。例示的な疾患としては、種々の癌（例えば、乳癌、結腸癌、子宮癌、胃癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌および直腸癌）、筋肉の発達欠陥から生じる疾患、心筋症、および遺伝性感覚ニューロパシー１型およびスフィンゴリピドーシスが挙げられるがこれらに限定されない。従って、本発明の組成物は、癌に罹患した個体における癌の発生、転移、または癌の発生と転移との両方を阻害するために用いられ得る。
本発明の組成物は、スフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達の変更に関連した疾患に罹患した個体に投与され得る。ヒトの疾患の処置のためのインビボでの使用に関して、本明細書中に記載されるようなスフィンゴ脂質代謝および／もしくはシグナル伝達の成分ならびに／またはスフィンゴ脂質中間体を調節する薬剤は一般に、投与前に薬学的組成物中に組み込まれ得る。薬学的組成物は、生理学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤と組み合わせた１以上の調節薬剤を含む。薬学的組成物を調製するために、有効量の１以上の調節薬剤は、特定の投与形態に適切であることが当業者に公知の任意の薬学的キャリアまたは賦形剤と混合される。薬学的キャリアは、液体、半液体または固体であり得る。非経口適用、皮内適用、皮下適用、または局所適用に用いられる、溶液または懸濁液としては、例えば、以下が挙げられ得る：無菌の希釈剤（例えば、水）、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールもしくは他の合成溶媒；抗微生物剤（例えば、ベンジルアルコールおよびメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸および重亜硫酸ナトリウム）およびキレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；緩衝剤（例えば、酢酸塩、クエン酸塩およびリン酸塩）。静脈内に投与される場合、適切なキャリアとしては、生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、ならびに増粘剤および可溶化剤（例えば、グルコース、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールおよびそれらの混合物）を含む溶液が挙げられる。さらに、薬学的に活性な他の成分（他の抗癌剤を含む）および／または適切な賦形剤（例えば、塩、緩衝剤および安定剤）は、組成物中に存在し得るが、その必要はない。
調節薬剤は、調節薬剤が身体から迅速に除去されるのを防ぐキャリアを用いて調製され得る（例えば、時限放出処方物またはコーティング）。このようなキャリアとしては、制御放出処方物（例えば、移植物およびマイクロカプセル化送達系が挙げられるがこれらに限定されない）および生分解性の生体適合性ポリマー（例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ乳酸および当業者に公知の他のもの）が挙げられる。
投与は、種々の異なる経路（経口、非経口、鼻腔、静脈内、皮内、皮下または局所が挙げられる）によって達成され得る。好ましい投与形態は、処置または予防されるべき状態の性質に依存する。投与後に、癌の進行および／または転移を阻害、予防または遅延させる量は、有効であるとみなされる。好ましくは、投与される量は、５０％の質量またはスキャン寸法によって示されるように、後退をもたらすに充分である。正確な投薬量および処置の持続期間は、処置されるべき疾患と相関関係にあるものであり、公知の試験プロトコルを用いて、またはこの組成物を当該分野で公知のモデル系において試験してそこから外挿することによって、経験的に決定され得る。制御された臨床試験もまた実施され得る。投薬量はまた、軽減されるべき状態の重篤度に伴って変動し得る。薬学的組成物は一般に、望ましくない副作用を最小にしながらも治療的に有用な効果を発揮するように処方および投与される。この組成物は、１回に投与されてもよく、または時間間隔をおいて投与されるべき多数のより小さな用量に分割されてもよい。任意の特定の被験体について、特定の投与レジメンは、個体の必要性に従って、経時的に調整され得る。
特定の実施形態（特に、調節薬剤がポリヌクレオチドを含む実施形態）では、調節薬剤をコードするポリヌクレオチドが投与され得る。このようなポリヌクレオチドは、当業者に公知の種々の送達系（核酸、細菌発現系およびウイルス発現系、ならびにコロイド状分散系（例えば、リポソーム）が挙げられる）のいずれかにおいて、薬学的組成物中に存在し得る。適切な核酸発現系は、患者における発現に必要なＤＮＡ配列（例えば、上記のような、適切なプロモーターおよび終結シグナル）を含む。このＤＮＡはまた、例えば、Ｕｌｍｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５−４９，１９９３に記載されるように、「裸」であり得る。
標的とされた患者の細胞に核酸配列を導入するために用いられ得る種々のウイルスベクターとしては、ワクシニアまたは他のポックスウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、またはアデノウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。このようなベクター中にＤＮＡを組み込むための技術は、当業者に周知である。ポリヌクレオチドについての別の送達系は、コロイド状分散系である。コロイド状分散系としては、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、および脂質ベースの系（水中油型乳剤、ミセル、混合ミセル、およびリポソームが挙げられる）が挙げられる。リポソームの調製および使用は、当業者に周知である。
本発明の特定の局面では、１以上の調節薬剤を用いて、細胞または哺乳動物における、スフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達経路の成分の発現および／または活性を調節し得る。インビトロでは、スフィンゴ脂質の代謝に関与するポリペプチドは、その活性を上昇または低下させる調節薬剤（例えば、特定の抗体、化学物質、または低分子）と接触され得る。１つの実施形態では、活性は、本明細書中に記載されるようなアッセイを用いて、スフィンゴ脂質中間体のレベルによって測定され得る。さらなる実施形態では、この調節薬剤は、スフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達の成分の活性を上昇または低下させ、そして本明細書に記載されるような方法を用いてアッセイされ得る。細胞または哺乳動物内での使用について、このような調節は、標的細胞を、本明細書中に記載されるように、有効量の調節薬剤と接触させることによって達成され得る。哺乳動物への投与は一般に、本明細書中に記載されるように達成され得る。
上記のように、発現および／または活性の変更は、培養中または癌に罹患した哺乳動物のいずれかにおける癌細胞の増殖（すなわち、繁殖）を阻害する方法を提供する。インビボでは、このようは変更または調節はまた、癌の発生、進行および／または転移を阻害するために用いられ得る。従って、本明細書中に提供されるような１以上の調節薬剤は、抗癌治療の必要性がある哺乳動物に上記のように投与され得る。調節薬剤の投与によって利益を受け得る患者は、癌に罹患した患者である。このような患者は、当該分野で周知の標準的基準に基づいて同定され得る。好ましい実施形態では、患者は、当該分野で周知の技術を用いて組織生検および顕微鏡評価に基づいて同定された場合、乳癌に罹患している。特に、腫瘍細胞が、スフィンゴ脂質の代謝および／またはシグナル伝達経路の成分をコードする内因性遺伝子内に組織特異的欠失および／または変更を含む患者は、本明細書中に提供されるような、調節薬剤の投与から利益を受け得る。さらなる実施形態では、この患者は、乳癌、子宮癌、胃癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌および直腸癌に罹患し得る。
以下の実施例は、例示のために提供され、そして限定のために提供するわけではない。
以下の実施例のいくつかにおいて用いられる材料および方法は、本明細書中に以下の通りに記載される（Ｄ．Ｈｅｒｒ，Ｈ．Ｆｙｒｓｔら，２００３，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔもまた参照のこと）。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株および増殖条件：本明細書中で用いられる野生型酵母は、株ＪＫ９−３ｄ（ｌｅｕ２−３，１１２ ｕｒａ３−５２ ｒｍｅ１ ｔｒｐ１ ｈｉｓ４ ＨＭＬａ）（Ｈｅｉｔｍａｎ，Ｊ．，Ｍｏｖｖａ，Ｎ．Ｒ．，Ｈｉｅｓｔａｎｄ，Ｐ．Ｃ．およびＨａｌｌ，Ｍ．Ｎ．（１９９１）．ＦＫ ５０６−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｌｉｎｅ ｒｏｔａｍａｓｅ ｉｓ ａ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ａｇｅｎｔ ＦＫ ５０６ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８，１９４８−５２）であった。酵母株ＪＳＫ３８６（ｄｐｌ１Δ）は、ＤＰＬ１遺伝子がＧ４１８耐性マーカーによって置換されている、株ＪＫ９−３ｄの同系誘導体である（Ｋｉｍ，Ｓ．，Ｆｙｒｓｔ，Ｈ．およびＳａｂａ，Ｊ．（２０００）．Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｓｐｈｉｎｇｏｉｄ ｌｏｎｇ ｃｈａｉｎ ｂａｓｅｓ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５６，１５１９−２９）。株ＪＳ２０４およびＪＳ２０５は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＥＳＴであるＬＰ０４４１３およびＧＨ３７８３を発現ベクターｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）内にそれぞれ含む、ＪＳＫ３８６の誘導体である。ｐＹＥＳ２は、ＵＲＡ３遺伝子（これは、形質転換体に、ウラシルを含まないバイ地中で増殖する能力を提供する）、ならびにアンピシリン耐性マーカーおよびＥｓｃｈｅｒｉｓｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて機能する複製起点を含む、酵母発現ベクターである。この系を用いて発現される遺伝子は、ＧＡＬ１，１０プロモーターの制御下で調節される。このプロモーターは、ガラクトースの存在下での発現を可能にし、グルコースの存在下での発現は可能にしない。細胞を、示されるように、１リットルあたり２０ｇのグルコースまたはガラクトースのいずれかを含む、最少培地またはウラシル培地中で増殖させた。
酵母における機能的相補：目的の株を、２〜３日間、液体培養で飽和するまで増殖させた。次いで、これらを最少培地に再懸濁し、９６ウェルプレートの１列目に配置し、そしてプレートに横切って１：２から１：４０００まで連続希釈した。培養物をＯ．Ｄ．６００＝２になるように正規化し、そしてテンプレートをコントロールプレートおよびＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した５０μＭスフィンゴシンを含むプレートに接種した。スフィンゴシン富化プレートを、０．００１５％ ＮＰ４０および５０μＭ Ｄ−エリトロ−スフィンゴシンを含む最少培地を用いて作製した。この濃度のＮＰ４０では、細胞生存率に対する効果は何も観察されない。プレートを３０℃で２日間インキュベートし、そして増殖の差を目視により評価した。
ＳＰＬアッセイ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ配列ＬＰ０４４１３およびＧＨ３７８３を発現する株からの酵母抽出物のＳＰＬアッセイを、［３Ｈ］標識Ｃ１８ジヒドロスフィンゴシン基質（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より入手）を用いて、以前（Ｓａｂａ，Ｊ．Ｄ．，Ｎａｒａ，Ｆ．，Ｂｉｅｌａｗｓｋａ，Ａ．，Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｓ．およびＨａｎｎｕｎ，Ｙ．Ａ．（１９９７）．Ｔｈｅ ＢＳＴ１ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｉｓ ｔｈｅ ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｌｙａｓｅ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２，２６０８７−２６０９０．Ｖａｎ Ｖｅｌｄｈｏｖｅｎ，Ｐ．Ｐ．およびＭａｎｎａｅｒｔｓ，Ｇ．Ｐ．（１９９１）Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｏｐｏｌｏｇｙ ｏｆ ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｌｙａｓｅ ｉｎ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６６，１２５０２−７）に記載されるとおりに行った。この方法では、長鎖アルデヒド生成物への放射標識Ｃ１８−ジヒドロスフィンゴシンの変換を決定することにより、ＳＰＬ活性を測定する。ホモ接合性Ｓｐｌｙ０５０９ｌハエが内因性ＬＣＢＰを分解する能力を野生型のハエに対して評価するために、ＨＰＬＣ法が開発され、そして野生型成体およびホモ接合性Ｓｐｌｙ０５０９１成体の抽出物を調べるために用いられた。内因性ＬＣＢＰを、「Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ Ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄｓ」の下で記載される通りに最初に単離し、そして１５ｍｇのホモ接合性Ｓｐｌｙ０５０９１ハエ由来の脂質抽出物を、窒素気体を用いて乾燥した。脂質をＳＰＬ反応緩衝液中に再懸濁し、そして種々の時点で３７℃にてインキュベートした。脂質を、以下に記載のように、再度単離し、ｏ−フタルアルデヒドを用いて誘導体化し、そしてＨＰＬＣによって分析した。タンパク質抽出物なしでインキュベートした標準と比較した内因性ＬＣＢＰの分解パーセントを測定することにより、活性を決定した。
Ｓｐｌｙの発生発現：ノーザン分析のために、全長プローブを、［γ−３２Ｐ］ｄＧＴＰを用いたランダムプライミングにより標識した。ハイブリダイゼーションを、異なる発生段階（０〜４時間の胚、４〜８時間の胚、８〜１２時間の胚、１２〜２４時間の胚、１齢幼虫、２齢幼虫、３齢幼虫および成体）で採取したハエの総ＲＮＡから調製したＲＮＡブロットについて、標準的な条件下で実施した。ＲｐＬ３２は、ローディングコントロールとして用いられる、構成的に発現されるリボソーム遺伝子である。
インサイチュハイブリダイゼーションを、ジゴキシゲニン標識プローブ（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１ １７５ ０２５）を用いて実施し、そして本質的に、記載（Ｔａｕｔｚ，Ｄ．およびＰｆｅｉｆｌｅ，Ｃ．（１９８９）Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ ９８，８１−５）された通りに、種々の段階の固定胚にハイブリダイズさせた。
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａスフィンゴ脂質の分析：１００ｍｇのハエを、６ｍｌの氷冷メタノール／水 １：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）中で、緩い乳棒、次いで乳棒が滑らかに動くまで硬い乳棒を用いるＰｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍホモジナイザーを用いて均質化した。抽出物を、２０秒間で３回のチップ超音波処理によりさらに均質化した。抽出物を低速で回転させ、そして上清を取り出し、そしてｓｐｅｅｄ ｖａｃ中で乾燥させた。抽出物を、０．１Ｍ水酸化アンモニウムを含む５００μｌのメタノール中に再懸濁し、そして３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、抽出物をｓｐｅｅｄ ｖａｃ中で乾燥させた。抽出物を、０．１％氷酢酸を含む５０％メタノール（５００μ１）中に再懸濁させ、そしてＣ１８Ｅ ＳＴＲＡＴＡ固相抽出カラムにアプライした。Ｃ１８Ｅ ＳＴＲＡＴＡカラムを、０．１％氷酢酸を含む５０％メタノール、続いて０．１％氷酢酸を含む１００％メタノールを含む洗浄液で洗浄した。目的の脂質を、メタノール／１０ｍＭ酢酸アンモニウム（９：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ））を用いて溶出させた。脂質をｓｐｅｅｄ ｖａｃにおいて乾燥し、そして以前（Ｋｉｍ，Ｓ．，Ｆｙｒｓｔ，Ｈ．およびＳａｂａ，Ｊ．（２０００）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５６，１５１９−２９．）に記載された通りにＨＰＬＣ分析のためにｏ−フタルアルデヒド（ｏ−ｐｔｈａｌａｄｅｈｙｄｅ）標識した。
致死相分析：示した系統由来の１００個の胚を収集し、そして各発生段階で観察した。生存率を、示した段階を通して生存したハエの百分率として表す。
成体の飛行能力：２〜７日齢の成体ハエを、トップライトＰｌｅｘｉｇｌａｓチャンバ中に放った。飛行挙動を、以下の通りにスコア付けした：上方飛行＝３、側方飛行＝２、下方飛行＝１、飛行無し＝０（Ｖｉｇｏｒｅａｕｘら，１９９３ Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５月号；１２１（３）：５８７−９８）。平均飛行スコアを、両側ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定を用いて比較した。
成体および幼虫の顕微鏡法：組織調製、染色、マウントおよび可視化を、標準的技術を用いて実施した（Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｗ．，Ａｓｈｂｕｒｎｅｒ，Ｍ．およびＨａｗｌｅｙ，Ｒ．Ｓ．（２０００）．Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。成体ハエ由来の胸郭を切開し、ホルムアルデヒドおよび四酸化オスミウムで固定し、そしてＥＰＯＮ中に包埋した。次いで、これらのブロックを１μｍの厚さの切片に切断し、メチレンブルーおよびアズールＩＩで染色し、そしてＬｉｅｃａ ＤＭＩＲＢＥ顕微鏡を用いて可視化した。
幼虫を、３齢幼虫の間に縦切りにし、背側のクチクラを下にしてピンで留め、そして内容物を除去して、身体の壁の筋肉の遮るもののない図を得た。この組織を４％ホルムアルデヒドで固定し、１００％アセトン中で透過処理し、そしてフルオレセイン結合体化ファロイジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓカタログ番号Ｆ−４３２）で染色した。
ＤＬＭの電子顕微鏡分析を、本質的に記載（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｐ．Ｔ．ａｎｄ Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｓ．Ｉ．（１９８８）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０７，２６０１−１２）された通りに、成体について行った。
半胸郭を、本質的に記載（Ｆｙｒｂｅｒｇ，Ｅ．Ａ．，Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｓ．Ｉ．およびＶｉｊａｙＲａｇｈａｖａｎ，Ｋ．（１９９４）．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ４４，２３７−５８）されるように可視化した。手短に述べると、成体ハエを液体窒素中で凍結し、剃刀の刃で二等分し、そしてエタノールシリーズ中で脱水した。次いで、クチクラをサリチル酸メチルで清浄にして、偏光下でＬｉｅｃａ ＤＭＩＲＢＥ顕微鏡を用いた筋肉の可視化を可能にした。
（蛍光顕微鏡法）
０〜２４時間胚を、調製し、標準的な技術（Ｒｕｂｉｎ Ｍａｎｕａｌ）で固定し、そして指定される一次抗体により染色するか、またはＴＵＮＥＬベースの染色法（Ｉｎ ｓｉｔｕ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ，Ｒｏｃｈｅ １ ６８４ ７９５）を使用してアポトーシスについてアッセイした。フルオレセインの取り込みを、Ｌｅｉｃａ ＤＭＩＲＢＥ落射蛍光顕微鏡および倒立型Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ−ＮＴ共焦点レーザー走査型顕微鏡にて評価した。
抗体および蛍光試薬は、以下の通りである：ウサギ抗ショウジョウバエミオシン重鎖ポリクローナル抗体（Ｋｉｅｈａｒｔ，Ｄ．Ｐ．およびＦｅｇｈａｌｉ，Ｒ．（１９８６）．Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｍｙｏｓｉｎ ｆｒｏｍ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０３，１５１７−２５．）１：１，０００希釈。ウサギ抗ＤＭＥＦ２ポリクローナル抗体（Ｌｉｌｌｙら，１９９５）１：１０，０００希釈。二次抗体は、フルオレセイン結合体化ヤギ抗ウサギｌｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）１：１，０００希釈、とした。
（遺伝学）
ｒｙ＋ＰＺ Ｐ因子の正確な切除は、Δ２−３トランスポザーゼ対立遺伝子を、挿入株ＢＬ−１１３９３に導入する操作により行った。その後の世代では、トランスポザーゼを取り除き、そして二番染色体を、ＣｙＯでバランスした。Ｐ因子を欠いたこれらのハエの子孫は、ｒｙ＋の消失の評価により選択した。ホモ接合型株を作製し、飛行能力の回復についてアッセイし、そして回復が見られた場合に、ＰＣＲにより正確な切除を評価した。Ｓｐｌｙ０５０９１対立遺伝子およびｌａｃｅｋ０５３０５対立遺伝子に対するホモ接合株を、減数分裂組み換えにより作製した。Ｓｐｌｙ０５０９１およびｌａｃｅｋ０５３０５の変異を、トランスに導入し、次の世代でバランスした。ｌａｃｅｋ０５３０５対立遺伝子を保有するハエを、ｗ＋の存在により選別した。Ｓｐｌｙ０５０９１の存在を、ＰＣＲにより検証した。
（トランスジェニックなＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒの調製）
トランスジェニックなＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒの調製の関連する方法は、以下に公開される：Ｓｐｒａｄｌｉｎｇ，Ａ．Ｃ．およびＲｕｂｉｎ，Ｇ．Ｍ．（１９８２）．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１８，３４１−３４７；ＢｒａｎｄおよびＰｅｒｒｉｍｏｎ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１９９３）１１８：４０１−４１５；およびＰｈｅｌｐｓおよびＢｒａｎｄ，Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ａｐｒｉｌ １９９８）１４：３６７−３７９。Ｓｐｒａｄｌｉｎｇ Ａ Ｃ，Ｐ Ｅｌｅｍｅｎｔ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｄ．Ｒｏｂｅｒｔｓ編，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）（１９８６）ｐｐ１７５−１７９も参照のこと。
一般に、本明細書に記載の実験に使用されるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのストックは、以下の通りである：野生型Ｃａｎｔｏｎ−Ｓ（ＢＬ−１）、Ｓｐｌｙ０５０９１（ＢＬ−１１３９３）、ｌａｃｅ２（ＢＬ−３１５６）およびｌａｃｅｋ０５３０５（ＢＬ−１２１７６）株、Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｉｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ，ＩＮ）より入手。一般的なハエの管理を、記載されるように行った（Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｗ．，Ａｓｈｂｕｒｎｅｒ，Ｍ．およびＨａｗｌｅｙ，Ｒ．Ｓ．（２０００）．Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。変異体のおよび／またはトランスジェニックのハエの作製に有用な他の技術は、Ｒｕｂｉｎ，Ｇ，Ｈｏｎｇ Ｌ，Ｂｒｏｋｓｔｅｉｎ Ｐ，Ｅｖａｎｓ−Ｈｏｌｍ Ｍ，Ｆｒｉｓｅ Ｅ，Ｓｔａｐｌｅｔｏｎ ＭおよびＨａｒｖｅｙ Ｄ， ２０００．Ａ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ ｒｅｓｏｕｒｃｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：２２２２−２２２４に記載される。
（実施例１）
（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（Ｓｐｌｙ）からのＳＰＬ ｃＤＮＡの単離および特徴付け）
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＳＰＬ ｃＤＮＡおよびゲノムの配列を見出すために、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒゲノムデータベースを、ヒトＳＰＬ ｃＤＮＡと顕著な相同性を呈示する配列について検索した。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒゲノムデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｆｌｙｂａｓｅ．ｂｉｏ．ｉｎｄｉａｎａ．ｅｄｕ）を、マウス（登録番号ＡＡＨ２６１３５；配列番号：６に示されるアミノ酸配列）およびヒト（登録番号ＸＰ＿１６６１１３；配列番号：１８に示されるアミノ酸配列）のＳＰＬ配列を使用して、予想されるタンパク質について検索した。ＤＮＡ相同性検索は、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔウェブサイトを通じて、ＢＬＡＳＴ検索プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を使用して行った。予想されるＳＰＬ遺伝子に相当する、１つの算出された遺伝子（ＣＧ８９４６）を、同定した。続いて、２つの予想されるスプライシング改変体に相当するオープンリーディングフレームを含む、２つのＥＳＴ（ＬＰ０４４１３，配列番号：２７に示されるｃＤＮＡおよびＧＨ１３７８３，配列番号：２６に開示されるｃＤＮＡ）を、同定した。その２つのクローンは、選択的な５’エクソン使用に基づいて予想され、異なる細胞下での位置で発現され得る。予想されるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＳＰＬは、２番染色体の右腕上、５３Ｆ８−１２の位置に位置する。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＳＰＬのコード領域に対するｃＤＮＡ配列は、配列番号：１５に示され、配列番号：１６に示されるＳＰＬタンパク質をコードする。配列番号：１６に示されるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳＰＬ予想タンパク質の配列は、ヒト、マウスおよび酵母のＳＰＬタンパク質配列に対し、それぞれ４９％、４９％および４３％の同一性を持つ。これらのクローンが、機能的なＳＰＬ遺伝子を含むかどうかを評価するために、これらを、酵母発現ベクターである、ｐＹＥＳ２（その中では、遺伝子発現が、ガラクトース誘導性プロモーターにより駆動される）の中に再びクローニングした。ＬＰ０４４１３（配列番号：に示されるポリヌクレオチド配列）に含まれるオープンリーディングフレームを、プライマー、ＬＰＥｃｏＲＩ５＝５’−ＴＧＧＡＡＴＴＣＧＡＴＧＣＧＴＣＣＧＴＴＣＴＣＣＧＧＣＡＧＣ−３’およびＬＰＸｈｏＩ３’＝５’−ＣＴＣＣＴＣＧＡＧＴＣＴＡＴＴＴＣＴＧＧＣＴＧＧＧＡＧＴ−３’、を使用して増幅し、酵母発現ベクターである、ｐＹＥＳ２の中に、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ制限酵素部位にて、クローニングした。この構築物を、酢酸リチウム法（Ｉｔｏ，Ｈ．，Ｆｕｋｕｄａ，Ｙ．，Ｍｕｒａｔａ，Ｋ．およびＫｉｍｕｒａ，Ａ．（１９８３）．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １５３，１６３−８．）を使用してｄｐｌ１Δ株に形質転換した。これらの構築物を、単一の内因性Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＰＬ遺伝子が欠損しているｄｐｌ１Δ株（Ｓａｂａ，Ｊ．Ｄ．，Ｎａｒａ，Ｆ．，Ｂｉｅｌａｗｓｋａ，Ａ．，Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｓ．およびＨａｎｎｕｎ，Ｙ．Ａ．（１９９７）．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２，２６０８７−２６０９０．）に形質転換した。ｄｐｌ１Δ株は、ＬＣＢＰを異化する能力がなく、そして、低濃度のＤ−エリトロ−スフィンゴシンを含む倍地上で増殖し得ない。
潜在的なＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＳＰＬを含むクローンの発現は、ｄｐｌ１Δ株の５０μＭのＤ−エリトロ−スフィンゴシンに対する感受性を完全に相補する。さらに、ｐＹＥＳ２−ＬＰ０４４１３またはｐＹＥＳ２−ＧＨ３７８３のどちらかを含むｄｐｌ１株の全細胞抽出物は、ＤＰＬ１過剰発現株（ＤＰＬ ＯＥ）ほど高くないものの、野生型のレベルまたはそれ以上までの、ＳＰＬ酵素活性の回復を呈示する。さらに、Ｓｐｌｙを過剰発現するｄｐｌ１Δ株の全細胞抽出物は、ＳＰＬ酵素活性の回復を呈示する。
野生型Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒの胚および幼虫のノザン分析により、Ｓｐｌｙの発現が、発生的に調節され、発現の開始が胚発生の８〜１２時間までに起こることが、呈示される。胚の発現は、インサイチュハイブリダイゼーションで呈示されるように、主として腸原基に局在する。
このように、本実施例は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒにおける、Ｓｐｌｙ、スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ遺伝子について記述する。
（実施例２）
（ＳＰＬトランスポゾン変異体Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒの作製および特徴付け）
本明細書に記載の実験に使用されるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのストックは、以下の通りである：野生型Ｃａｎｔｏｎ−Ｓ（ＢＬ−１），Ｓｐｌｙ０５０９１（ＢＬ−１１３９３），ｌａｃｅ２（ＢＬ−３１５６）およびｌａｃｅｋ０５３０５（ＢＬ−１２１７６）株、Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｉｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ，ＩＮ）より入手。一般的なハエの管理を、記載されるように行った（Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｗ．，Ａｓｈｂｕｒｎｅｒ，Ｍ．およびＨａｗｌｅｙ，Ｒ．Ｓ．（２０００）．Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔの遺伝子破壊計画（Ｓｐｒａｄｌｉｎｇ，Ａ．Ｃ．，Ｓｔｅｒｎ，Ｄ．Ｍ．，Ｋｉｓｓ，Ｉ．，Ｒｏｏｔｅ，Ｊ．，Ｌａｖｅｒｔｙ，Ｔ．およびＲｕｂｉｎ，Ｇ．Ｍ．（１９９５）．Ｐ転移性因子を使用しての遺伝子破壊：ショウジョウバエゲノムプロジェクトの不可欠な一要素。Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２，１０８２４−３０．）からの、Ｓｐｌｙオープンリーディングフレームの中にトランスポゾンを持つハエ（Ｓｐｌｙ０５０９１と命名）を、同定した。そのトランスポゾンは、ＬＰ０４４１３の長い方の転写産物（配列番号：２７に示されるｃＤＮＡ）の開始部位に比べて＋２６９ヌクレオチドに位置する。
これらのハエを、通常の当業者に周知の技術を使用して遺伝学的に交配し、子孫を、ホモ接合型の挿入変異体の存在について評価した（そのＰ因子上に保有する劣性マーカーによりコードされる、複眼のバラ色の存在に基づく）。Ｓｐｌｙ０５０９１ホモ接合体より得られるトータルＲＮＡのノザン分析により、Ｓｐｌｙの発現がないことを確認した。
それぞれの遺伝型のＳＰＬの機能を決定するために、＋／＋、＋／−および−／−のハエを、ホモジェナイズし、全抽出物を、ＳＰＬ活性についてアッセイした。ＳＰＬ遺伝型が、＋／＋＞＋／−＞−／−として、ＳＰＬ活性に対応することが、観察された。ホモ接合型変異体の最初の評価により、成虫のＳＰＬ変異体が、飛行不能で、筋肉発生または成虫ハエのエネルギー使用のどちらかにおける潜在的な欠損を示唆することが提示された。飛行分析を、本質的に（Ｖｉｇｏｒｅａｕｘ，Ｊ．，Ｊ．Ｓａｉｄｅ，Ｋ．Ｖａｌｇｅｉｒｄｏｔｔｉｒ，およびＭ．Ｐａｒｄｕｅ．１９９３．Ｆｌｉｇｈｔｉｎ，ａ ｎｏｖｅｌ ｍｙｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｔｒｅｔｃｈ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍｕｓｃｌｅｓ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２１：５８７−５９８）に記載のように、コントロールＣａｎｔｏｎ−Ｓハエにおける、飛行不能であるハエ、または下向き、上向き、または横向きへの飛行を見せるハエの割合を、変異体ハエと比較して、以下のように決定することにより行った：２〜７日齢の成虫ハエを、頂上に光を当てたＰｌｅｘｉｇｌａｓチャンバーの中に放った。飛行能力は、以下のように計測した：上昇飛行＝３、横向き飛行＝２、下降飛行＝１、飛行不能＝０（Ｖｉｇｏｒｅａｕｘら、１９９３）。平均飛行点数を、両側検定ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ−検定を使用して比較した。
（実施例３）
（Ｐ因子挿入Ｓｐｌｙ変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのさらなる特徴付け）
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのスフィンゴ脂質は、Ｃ１４およびＣ１６スフィンゴシンおよびジヒドロスフィンゴシン ＬＣＢを含む（実施例４を参照のこと）。野生型および変異体のハエの抽出物を、内因性のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＬＣＢＰをインビトロで分解する能力について比較した。Ｓｐｌｙ０５０９１変異体の抽出物は、内因性ＬＣＢＰを分解しなかったが、一方、野生型ハエの抽出物は、内因性Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＬＣＢＰを分解し、Ｓｐｌｙ遺伝子産物は、この生物体におけるＬＣＢＰ分解のために重要であることを呈示した。
Ｓｐｌｙの発現の消失が、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒの内因性ＬＣＢおよび相当するＬＣＢＰのレベルに影響を与えるかどうかを決定するために、ホモ接合型Ｓｐｌｙ０５０９１ハエのスフィンゴ脂質プロファイルを、評価し、そして野生型のコントロールに対して比較した。ホモ接合型Ｓｐｌｙ０５０９１成虫は、野生型と比較した場合、ＬＣＢについては８倍の増加を、そしてＬＣＢＰについては２０倍の増加を呈示した（表１）。このことは、スフィンゴ脂質代謝の有意な異常を示す。ＬＣＢおよびＬＣＢＰのこの蓄積は、ホモ接合型Ｓｐｌｙ０５０９１変異体において、胚発生の１２〜１８時間ほどの早い時期で観察され、Ｓｐｌｙの発現の開始と相関した。
（表１：スフィンゴ脂質代謝の変異体モデルの生化学的および生物学的特徴付け）
Figure 2005531285
 成虫野生型ハエおよびスフィンゴ脂質代謝の指定されるモデルを、総量のリン酸化（ＬＣＢＰ）および非リン酸化（ＬＣＢ）長鎖ベースレベル、飛行能力、ヘミソラックスあたりのＤＬＭの数、生殖能力（産卵）、および変態の完了の前の致死率％について分析した。飛行能力およびＬＣＢ／ＬＣＢＰレベルについても、スフィンゴシンキナーゼインヒビター、Ｄ，Ｌ−スレオ−ＤＨＳとともに処理されたＳｐｌｙ０５０９１ホモ接合型ハエにおいて、決定した。インヒビター処理のハエにおけるＬＣＢ／ＬＣＢＰレベルは、非処理のコントロールの百分率として与えられる；これらの決定因子は、別の実験から得られ、スフィンゴ脂質の基線レベルは、その２つの実験の間で匹敵しない。Ｃａｎｔｏｎ−Ｓは、野生型である。Ｓｐｌｙ０５０９１は、ホモ接合型Ｓｐｌｙヌル変異体を呈示する。ｌａｃｅ２およびｌａｃｅｋ０５３０５は、セリンパルミトイルトランスフェラーゼの劣性致死対立遺伝子である。Ｓｐｌｙ１４ａは、ホモ接合型Ｓｐｌｙ０５０９１復帰改変体を呈示する。すべての生化学的、飛行、および線維の計測データを、混合した年齢の成虫から得た。値は、±ｓ．ｅ．ｍ．で呈示した。
ホモ接合型およびヘテロ接合型のＳｐｌｙ０５０９１ハエを、解剖学的、発生学的、および機能的な異常の呈示について検査した。Ｓｐｌｙ０５０９１についてヘテロ接合型のハエは、野生型と区別がつかない。Ｓｐｌｙ０５０９１対立遺伝子についてホモ接合型のハエの初期の評価では、胚期、幼虫期および成虫期において外面上の解剖学的構造に明確な欠損を呈示しなかった。しかしながら、成虫の変異体は、ほとんど一様に飛行不能で、変異体集団の９１％が、標準的な飛行能力アッセイにおいて０点の点数（４％の野生型ハエと比較して）を計測した（表１）。Ｓｐｌｙ０５０９１ホモ接合体における飛行障害の重篤性にかかわらず、跳躍筋および脚の筋肉を含む、他の筋肉グループの機能は、影響を受ける様子がなかった。さらに、電気生理学的分析による巨大線維神経筋経路の評価により、この経路は、機能的にインタクトなままであり、その観察される飛行障害の原因とはならないことが呈示された。
（Ｓｐｌｙ０５０９１ホモ接合体は、異常な飛行筋肉形態を呈示する）
Ｓｐｌｙ０５０９１の飛行障害の原因をさらに追求するため、成虫変異体を、胸部領域を通じて切片化し、筋肉を、光学顕微鏡で検査した。この研究は、飛行に必要なＤＬＭを含む筋肉繊維の数の減少を呈示した。野生型ハエの胸部には、６対の対称的な線維を不変的に含む一方で、Ｓｐｌｙ０５０９１ホモ接合体は、線維の消失、非対称性、および残りの繊維の肥大の一般的なパターンを呈示した。ＤＬＭ線維の定量的分析により、野生型でのヘミソラックスあたり６本から、変異体でのヘミソラックスあたり平均４．１５本への減少が、呈示された（表１）。偏光照射によるヘミソラックスの顕微鏡分析により、異常な筋肉の立体配置が確認された一方、筋肉挿入は、影響を受けないことが、呈示された。
（Ｓｐｌｙ０５０９１変異は、筋肉の超微細構造、鋳型形成または胚期筋肉融合の妨げとならない）
そのＤＬＭ欠損の起源を決定するため、成虫筋肉細胞の超微細構造ならびに幼虫および胚の筋肉発生を調べた。野生型および変異体の初期胚の初期筋肉繊維の筋芽細胞核における、Ｄｍｅｆ２の発現の調査は、筋肉の組織化において明確な変化を呈示しなかった。従って、筋芽細胞は、変異体の胚期体節において、原体節から正確な部位へと首尾良く移動するようである。同様に、野生型および変異体の０〜２４時間胚におけるミオシン重鎖の発現の分析は、野生型に比べて発生中の変異体の筋肉の、全体としての変化は呈示せず、筋肉細胞融合が、損なわれないことを呈示した。
Ｓｐｌｙ０５０９１成虫ホモ接合体において観察されるＤＬＭ欠損が、変態の間におけるそれらの形成に必要とされる鋳型構造の欠失によって起こるかどうかを決定するため、Ｔ２背側斜紋筋（ＤＯＭ）を、変異体幼虫において評価した。後期の変異体幼虫は、ＤＯＭの数および／またはサイズの変化を示さなかった。それゆえ、変異体の筋肉欠損が、ＤＬＭに限定され、そして、変態の間の筋芽細胞融合現象に引き続く成虫筋肉立体配置に影響を与えるようである。この欠損にかかわらず、Ｓｐｌｙ０５０９１変異体に存在するＤＬＭの超微細構造は、透過型電子顕微鏡分析により証明されるように、全般にインタクトであるようである。
（Ｓｐｌｙ０５０９１ホモ接合体は、胚において減少した生殖能力、半致死性および増加したアポトーシスを呈示する）
ホモ接合型Ｓｐｌｙ０５０９１の交配の結果から得られる子の数は、野生型の交配で観測される数のおよそ１０％であった。この子孫の減少は、減少した産卵ならびに／または胚および幼虫の減少した生存の結果であり得た。産卵の分析により、その変異体の生殖能力が、コントロールハエのおよそ１／３であることが、呈示された（表１）。この結果は、雄および／または雌の減少した稔性の結果であり得た。これらの可能性を区別するために、雄および雌の両方のＳｐｌｙ０５０９１ホモ接合体を、野生型ハエと交配し、そして産卵を、野生型対およびホモ接合型変異体対に比較して測定した。産んだ卵の数は、野生型の相手との雄および雌の両方の変異体ハエの交配において、顕著に減少し（データは示さず）、生殖能力へのその効果が、性別特異的でないことが、呈示された。さらに、Ｓｐｌｙ０５０９１ホモ接合型の雄および雌の間での交配は、野生型ハエにおける８０％の生存率に比べて、３３．５％の総体的な生存性（卵から成虫期まで）を持つ子孫の結果となった。Ｓｐｌｙ０５０９１変異体の致死性は、幼虫期の間で高く（４６％、野生型における３％に対して比較）、大部分の幼虫の死は、一齢幼虫期（ｆｉｒｓｔ ｌａｒｖａｌ ｉｎｓｔａｒ）の間に起こった。蛹化の間では、より穏やかな効果が、観測され（致死率２２％、野生型における１％に対して比較）、胚発生の間に、生存における明確な違いは、何もなかった。Ｓｐｌｙ０５０９１変異体胚を、インサイチュＴＵＮＥＬアッセイにより試験し、アポトーシスのパターンを、野生型のパターンに対して比較した。Ｓｐｌｙ０５０９１変異体胚は、野生型コントロールに比べて、特に発生中の生殖器成虫原基に近い後部極の特定の領域で、アポトーシスのはっきりとした増大を呈示した。
（実施例４）
（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒにおけるスフィンゴ脂質類の特徴付け）
理論に束縛されずに、ＳＰＬ変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒの表現形は、発生中におけるＳ−１−Ｐの異常なレベルにより引き起こされると、仮定される。さらに、理論に束縛されずに、リン酸化スフィンゴイドベース類は、細胞増殖、移動および、このモデル生物体における腫瘍形成および通常の発生プロセスの両方のために必要な他の事象を調節するために重要である、というのが、本発明者らの仮定である。それゆえ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒにおけるスフィンゴ脂質類の特徴付けを、決定した。
（方法）
野生型（Ｃａｎｔｏｎ Ｓ）全ハエ抽出物を、機械的破砕により調製した。脂質を、二相式抽出により単離し、本質的にＣａｌｉｇａｎらに記載されるように、蛍光性分子ｏ−フタルアルデヒド（ｐｔｈａｌａｌｄｅｈｙｄｅ）で誘導体化した（Ｃａｌｉｇａｎ，Ｔ．Ｂ．，Ｋ．Ｐｅｔｅｒｓ，Ｊ．Ｏｕ，Ｅ．Ｗａｎｇ，Ｊ．ＳａｂａおよびＡ．Ｈ．Ｍｅｒｒｉｌｌ，Ｊｒ．２０００．Ａ ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ １−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｒｏｍ ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ａｓｓａｙｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２８１：３６−４４）（その全体が本明細書中に参考として援用される））。誘導体化された脂質抽出物を、Ｃ１８ＯＤＳカラム（ＬＵＮＡ４．６×２５０ｍｍ）および移動相ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ／１Ｍ ＴＢＡＰ ８２：１７：０．９，ｐＨ４．８を使用してＨＰＬＣにより分離した。標準物質は、市販のＣ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８およびＣ２０スフィンゴシン、ならびにこれらの標準物質のリン酸化体を含み、これらを、スフィンゴシン標準物質の、主要酵母スフィンゴシンキナーゼ、ＬＣＢ４を過剰発現する酵母株からの抽出物とインキュベーションすることにより調製した。
（結果）
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ抽出物は、定めた条件下でＣ１４スフィンゴシンおよびＣ１４スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ−１−Ｐ）標準物質と共に共移動するスフィンゴ脂質類のみを含んだ。Ｃ１４スフィンゴシンおよびＣ１４Ｓ−１−Ｐ標準物質と共に共移動するハエ抽出物におけるピークの同一性を検証するため、抽出物および標準物質を、４つの異なる移動相緩衝液にて比較した。Ｃ１４スフィンゴシン標準物質と共に共移動するピークを、４つ全ての条件下でＣ１４スフィンゴシンであると同定した（表２）。しかしながら、Ｃ１４Ｓ−１−Ｐであると同定されたピークは、電荷における違いを利用した条件下で（ＭｅＯＨ／１０ｍＭ ＫＰ／１Ｍ ＴＢＡＰ，ｐＨ７．２ ８１：１８：１）、Ｃ１４Ｓ−１−Ｐ標準物質からのわずかな違いを呈示した。
（表２：スフィンゴ脂質の同定）
Figure 2005531285
 この発見は、リン酸基の化学修飾によるものであるようである。なぜなら、Ｃ１４Ｓ−１−Ｐ標準物質を脱リン酸化する能力のあるホスファターゼが、この基質を認識しないからである。質量分析は、このＳ−１−Ｐ類のリン酸期修飾の同定に利用される。本明細書では、このスフィンゴ脂質を、「修飾Ｃ１４Ｓ−１−Ｐ」と呼ぶ。
（実施例５）
（Ｓｐｌｙ０５０９１変異の遺伝学的復帰は、正常な筋肉立体配置を回復させる）
Ｓｐｌｙがその変異株の半致死性、産卵機能欠損および飛行筋肉の表現型を媒介することにおける重要性を確認するために、Ｓｐｌｙ０５０９１遺伝子座でのトランスポゾンを、転移させた。Ｓｐｌｙ０５０９１変異の遺伝学的復帰は、活性化トランスポザーゼの導入後のＳｐｌｙ０５０９１ホモ接合体で正常な筋肉形状を回復させる。トランスポゾンの正確な切除を、引き続いて、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列分析により確定した。ホモ接合型復帰変異株（Ｓｐｌｙ１４ａ）を、材料および方法に記載の通りに産生し、ＳｐｌｙのｍＲＮＡが野生型と等しいレベルで発現されることを見出した。Ｓｐｌｙ１４ａは、その筋肉線維形態欠損の回復を示し、飛行機能が、大部分回復した（表１）。加えて、その復帰変異体胚のアポトーシスは、Ｓｐｌｙ変異体に比べて減少した。ＴＵＮＥＬ陽性細胞のその特異的クラスターの出現は、１２〜１５ステージ胚において、Ｃａｎｔｏｎ−Ｓ、Ｓｐｌｙ１４ａおよびＳｐｌｙ０５０９１でそれぞれ、＜１％（ｎ＝１９７）、４８％（ｎ＝１６０）、７２％（ｎ＝３２４）であった。表現型の復帰は、復帰変異体の抽出物におけるＬＣＢおよびＬＣＢＰのレベルの正常化と相関した（表１）。
（実施例６）
（Ｓｐｌｙ０５０９１の筋肉欠損は、スフィンゴ脂質中間体の減少により抑制される）
そのＳｐｌｙ０５０９１の筋肉の表現型が、ＬＣＢＰの蓄積によって引き起こされる可能性を調査するため、スフィンゴシンキナーゼのひとつの阻害剤である、Ｄ，Ｌ−スレオ−ＤＨＳを、変異体および野生型ハエの増殖培地に導入した。ハエを、その補充培地上で増殖させ、Ｆ２子孫を、調査した。野生型ハエを、１０μＭ Ｄ，Ｌ−スレオ−ＤＨＳを補充した培地上で増殖させた場合、有害な効果は、何も観察されなかった。この培地上で増殖させたＳｐｌｙ０５０９１変異体は、飛行機能におけるわずかだが有意な改善を示した。その飛行改善が、ＬＣＢＰレベルの回復と一致するかどうかを決定するため、ＬＣＢ／ＬＣＢＰレベルを、Ｄ，Ｌ−スレオ−ＤＨＳ上で増殖させた変異体およびコントロールで分析した。スフィンゴシンキナーゼ阻害剤の存在下で増殖させたＳｐｌｙ０５０９１ホモ接合体におけるＬＣＢＰレベルは、およそ２０％減少した（表１）。同様に、野生型ハエにおけるＬＣＢＰレベルは、正常レベルの２０％に減少した。
その変異体の表現型が、ＬＣＢ／ＬＣＢＰの蓄積によって引き起こされると仮定して、本発明者らは、Ｓｐｌｙ０５０９１ホモ接合体におけるＳＰＴ活性の減少が、スフィンゴ脂質中間体の産生の減少によりＳｐｌｙ０５０９１の表現型を抑制する、と予測した。その目的に向けて、ｌａｃｅｋ０５３０５ヌル対立遺伝子を、遺伝子組換えによりＳｐｌｙ０５０９１染色体上に導入し、それにより、Ｓｐｌｙ０５０９１、ｌａｃｅｋ０５３０５／＋株を産生した。Ｓｐｌｙ０５０９１、ｌａｃｅｋ０５３０５／Ｓｐｌｙ０５０９１、ｌａｃｅ＋ハエは、異常な筋肉パターン形成からの復帰を示し、飛行機能が、引き続いて改善した（表１）。加えて、胚のアポトーシスのそのパターンは、野生型のパターンと類似の様相を呈した。表現型の復帰は、ＬＣＢおよびＬＣＢＰの顕著な減少と相関した（表１）。
（実施例７）
（Ｓｐｌｙ発現の損失は、ｌａｃｅヌル表現型を抑制する）
２つのｌａｃｅｋ０５３０５ハイポモルフ対立遺伝子の遺伝形質は、ほとんど完全に致死であり、その一方で、ヘテロ接合型な対立遺伝子の組み合わせ（ｌａｃｅｋ０５３０５／ｌａｃｅ２）は、高頻度で生存するが、眼、剛毛および翅の異常へと導く重篤な発生上の表現型を示すハエを、産生することを報告した（Ａｄａｃｈｉ−Ｙａｍａｄａ，Ｔ．，Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．，Ｓｕｇｉｍｕｒａ，Ｉ．，Ｔａｔｅｎｏ，Ｍ．，Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｙ．，Ｏｎｕｋｉ，Ｔ．およびＤａｔｅ，Ｈ．（１９９９）．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９，７２７６−７２８６．）。本発明者らは、ｌａｃｅ変異体の表現型が、スフィンゴ脂質中間体の減少したレベルに起因する、と予測した。さらに、本発明者らは、ｌａｃｅ変異体におけるスフィンゴ脂質異化の阻害により、餌を通じて得られる、少量のスフィンゴ脂質の十分な蓄積が、重要なスフィンゴ脂質中間体の欠如により誘導される発生上の欠損を改善させ得ると推論した。この可能性を調査するため、Ｓｐｌｙ０５０９１およびｌａｃｅｋ０５３０５の対立遺伝子両方についてホモ接合型のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ株を、産生した。明らかに、Ｓｐｌｙ０５０９１対立遺伝子の存在により、ｌａｃｅホモ接合体の回復が、独立した取り合わせ（ａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）により、予期されていたものの９％から３９％に増加した。さらに、Ｓｐｌｙ０５０９１の導入により、結果として産生されるハエにおいて、眼、剛毛および翅その表現型は、完全に抑制された。従って、スフィンゴ脂質中間体は、この株において、ｌａｃｅ２／ｌａｃｅｋ０５３０５ヘテロ接合体に比べて引き続き増加し、ｌａｃｅ２／ｌａｃｅｋ０５３０５ヘテロ接合体は、比較のために十分な生存性を伴う、使用可能な唯一のｌａｃｅの変異体である（表１）。
（実施例８）
（癌におけるヒトＳＰＬおよびＳＫの発現パターン）
ＳＫおよび／またはＳＰＬの発現が、ヒト腫瘍において変化するかを決定するため、本発明者らは、２４０より多数のｃＤＮＡ対を含む癌プロファイル化アレイを利用した。これらのｃＤＮＡ対は、同一患者からの腫瘍組織および相当する正常組織を示す。一人の患者に由来する組織対の利用により、ヒトからヒトへの多様性が原因となり得る、腫瘍組織における遺伝子発現と正常組織における遺伝子発現との間の違いにより、結果の解釈は混同されないはずである。加えて、各ブロットを、ローディングのために、４つの別々のハウスキーピング遺伝子を使用して正規化した。
当該分野で公知の標準的なハイブリダイゼーション技術を、このｃＤＮＡブロットを、全長ヒトＳＰＨＫ１ ｃＤＮＡ（配列番号２２に示される）でプローブするために利用した（全長ヒトＳＰＨＫ１ ｃＤＮＡを、ヒト臍静脈内皮細胞総ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより入手した）。そのアレイの分析により、ＳＫの発現が、乳、子宮、胃、卵巣、胚、腎臓および直腸の腫瘍を含む数多くのヒトの癌において、有意に増加するようであることが、示される。加えて、いくつかの腫瘍は、腫瘍組織に比べて、転移病巣において増加したＳＫの発現を示した。ＳＫを過剰発現するどの腫瘍も、ＳＰＬの発現の損失を示さない。従って、変化したＳＫの発現は、原発性ヒト腫瘍にて観察される。それゆえ、遺伝子発現を変化させることによるＳＫタンパク質の活性の調節、またはそのタンパク質に対する直接の作用を通じたＳＫタンパク質の活性の調節のどちらかは、ＳＫ関連癌に罹患した個体のための有用な処置を提供し得る。さらに、ＳＫの発現は、ヒトにおいて癌の有用な診断マーカーとして働く。
標準的なハイブリダイゼーション技術を、このｃＤＮＡブロットを、ヒトＳＰＬ ｃＤＮＡ（配列番号２３）の３００ヌクレオチドの３’断片でプローブするために利用した（ヒトＳＰＬ ｃＤＮＡを、米国特許第６，４２３，５２７号に記載のとおり入手した）。そのアレイの分析により、ヒトＳＰＬの発現が、大部分の組織対において近く一致する一方で、結腸癌検体において有意に減少し、結腸の膠質癌における発現では５０％の減少および結腸の腺癌では６１％の減少を伴うことが、示された。減少したＳＰＬの発現は、子宮の腺癌でも見られた。ＳＰＬの発現が減少するどの腫瘍でも、ＳＫの過剰発現が示されない。従って、変化したＳＰＬの発現は、原発性ヒト腫瘍にて観察される。それゆえ、遺伝子発現を変化させることによるＳＰＬタンパク質の活性の調節、またはそのタンパク質に対する直接の作用を通じたＳＫタンパク質の活性の調節のどちらかは、ＳＰＬ関連癌に罹患した個体のための有用な処置を提供し得る。さらに、ＳＰＬの発現は、ヒトにおいて癌の有用な診断マーカーとして働く。
（実施例９）
（スフィンゴ脂質代謝に関与するＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒの遺伝子の単離）
スフィンゴ脂質代謝に関与するＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒの遺伝子を、同定した。配列番号２１に示されるヒトＳＫタンパク質配列を、プローブとして使用して、本発明者らは、ハエＳＫタンパク質を潜在的にコードし得る２つの相同的なＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒの配列を同定した。これらの２つのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＳＫタンパク質を、配列番号１９および２０に示し、図１に示す。ＣＧ１７４７遺伝子に関する注釈ＦＢａｎ０００１７４７は、ＦｌｙＢａｓｅアクセス番号ＦＢｇｎ００３０３００を有し、Ｘ染色体腕上に位置し、２０２０ヌクレオチドの長さの転写単位を有する。この遺伝子は、転写物ＣＴ５０８８を有する。この遺伝子の機能は、保存された脂質キナーゼドメインに基づき、酵素／ジアシルグリセロールキナーゼとして分類されている。ＣＧ２１５９遺伝子に関する注釈ＦＢａｎ０００２１５９は、ＦｌｙＢａｓｅアクセス番号ＦＢｇｎ００３５３９１を有し、３Ｌ染色体腕上に位置し、４４３１ヌクレオチドの長さの転写単位を有する。この遺伝子は、転写物ＣＴ２６５０を有する。これらの２つの配列は、いまだクローニングされておらず、機能的データおよびＥＳＴの両方とも、入手不能である（ＤＳＫ１７４７アミノ酸配列は、配列番号１９に示される；ＤＳＫ２１５９アミノ酸配列は、配列番号２０に示される）。
（実施例１０）
（スフィンゴ脂質代謝に関与する２つのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＳＫ遺伝子の特徴付け）
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒにおける潜在的なＳＫ遺伝子を同定するため、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒゲノムデータベースにて、ｔＢＬＡＳＴｎ調査を使用して、ヒトＳＫ ｃＤＮＡに対して顕著な相同性を示す配列を検索した。このことによって、上記のように、２つの候補ＳＫが同定された。ＣＧ１７４７遺伝子は、Ｘ染色体上に位置し、保存された脂質キナーゼドメインに基づき、酵素／ジアシルグリセロールキナーゼとして分類されている。ＣＧ２１５９遺伝子は、３Ｌ染色体腕上に位置し、４４３１ヌクレオチドの長さの転写単位を有する。これらの２つの遺伝子座に相当するＥＳＴを入手し、それらが無傷であることを、配列決定および制限酵素分析によって確認した（ＳＫ１およびＳＫ２の全長アミノ酸の配列を、配列番号２８および２９に示す；ＳＫ１およびＳＫ２についての全長ｃＤＮＡを、配列番号２４および２５に示す）。それらのＣＧ１７４７およびＣＧ２１５９ ｃＤＮＡクローンを、それから、ガラクトース誘導型プロモーターの調節下の、酵母発現ベクターｐＹＥＳ２の中に再クローニングした（Ｒｕｂｉｎ， Ｇ，Ｈｏｎｇ Ｌ，Ｂｒｏｋｓｔｅｉｎ Ｐ，Ｅｖａｎｓ−Ｈｏｌｍ Ｍ，Ｆｒｉｓｅ Ｅ，Ｓｔａｐｌｅｔｏｎ ＭおよびＨａｒｖｅｙ Ｄ，２０００．Ａ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ ｒｅｓｏｕｒｃｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：２２２２−２２２４．）。これらの構築物を、ＪＳＫ３９２酵母株（Ｋｉｍ，Ｓ，Ｆｙｒｓｔ ＨおよびＳａｂａ Ｊ，２０００．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５６：１５１９−１５２９．）の中に形質転換した。ＪＳＫ３９２において、内因性のＳＰＬ、ＳＫおよびＳ−１−ＰＰ遺伝子（それぞれ、ＤＰＬ１、ＬＣＢ４およびＹＳＲ２）が、欠失されている。この株は、ＬＣＢＰ合成の非存在下で生存し得るが、この背景下における機能的ＳＫ遺伝子の発現は、分解され得ないＬＣＢＰの重篤な蓄積が原因となり、致死となる。ＣＧ１７４７およびＣＧ２１５９の発現を、この背景下においてガラクトース存在下で誘導する場合、酵母の増殖は、まったく起きず、これらのｃＤＮＡが、機能的なＳＫ酵素をコードすることを示す。最後に、ＣＧ２１５９のトランスポゾン変異体を入手し、この遺伝子座からの発現の欠如を示した（Ｒｏｓｅｍａｎｎ，Ｒ，Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｅ，Ｒｏｄｅｓｃｈ Ｃ，Ｂｊｅｒｋｅ Ｍ，Ｎａｇｏｓｈｉ ＲおよびＧｅｙｅｒ Ｐ，１９９５．Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４１：１０６１−ｌ０７４．）。この変異体（Ｓｐｈｋ２ＫＧ０５８９４）を、以前に記述されるように、Ｐ因子をＣＧ２１５９の５’ＵＴＲへ挿入することにより、作製した。予備調査により、この変異体が、Ｓｐｌｙ変異体で見られたのと同様に、ＤＬＭにおける軽度の欠損を有することが、呈示される。
（実施例１１）
（野生型ハエおよびスフィンゴ脂質代謝の欠損を持つハエにおける、スフィンゴ脂質の化学構造の特徴付けおよび濃度）
（材料および方法）
（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ株）
ｌａｃｅ遺伝子は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａセリンパルミトイルトランスフェラーゼの１つのサブユニットをコードする。２つのｌａｃｅｋ０５３０５ヌル対立遺伝子の遺伝形質は、一様に致死であると報告され、一方、これらの実験で使用されたヘテロ接合型の対立遺伝子の組み合わせである、ｌａｃｅｋ０５３０５／ｌａｃｅ２は、重篤な発生上の表現型および生存可能な子孫の割合の低さをもたらす（Ａｄａｃｈｉ−Ｙａｍａｄａ，Ｔ．，Ｔ．Ｇｏｔｏｈ，Ｉ．Ｓｕｇｉｍｕｒａ，Ｍ．Ｔａｔｅｎｏ，Ｙ．Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｔ．Ｏｎｕｋｉ，およびＨ．Ｄａｔｅ．１９９９．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９：７２７６−７２８６．）。２つの予想されるスフィンゴシンキナーゼ（ＳＫ）遺伝子のうちの１つのヌル対立遺伝子についてホモ接合型のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ株も、これらの調査に利用した。この変異体（Ｓｐｈｋ２ＫＧ０５８９４）を、以前に記述されるように、Ｐ因子をＣＧ２１５９の５’ＵＴＲへ挿入することにより、作製した。この遺伝子の産物は、酵母のＳＫ変異体を機能的に補完する。野生型Ｃａｎｔｏｎ−Ｓ（ＢＬ−１）、ｌａｃｅ２（ＢＬ−３１５６）、ｌａｃｅｋ０５３０５（ＢＬ−１２１７６）株およびＳｐｎｋＫＧ０５８９４（ＢＬ−１４１３３）株は、Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｉｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ，ＩＮ）より入手した。
ハエを、標準的なハエ培地上で室温で成育させた。すべての場合において、コントロールおよび変異体のハエを、同一条件下で平行して成育させた。発生学的分析については、成虫ハエに、ブドウ果汁寒天入りプレート上に胚を産みつけさせた。回収時間の後に、プレートを回収チャンバーから取り外し、覆い、室温で加齢させ、適切な段階の胚を得た。例えば、６〜１２時間胚を回収するために、成虫を、プレートに６時間さらし、プレートを取り除き、さらに、胚を回収する前に、さらに６時間加齢させた。胚を、０．７％塩化ナトリウム／０．０３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００による洗浄により、プレートから離脱させ、水で全体にわたってすすぎ、さらに保存のために−７０℃で凍結した。
（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの脂質抽出物の調製）
２５ｍｇの凍結したインタクトなハエ材料を含むサンプルを、７ｍｌのＰｏｔｔｅｒ Ｅｌｖｅｈｊｅｍホモジナイザーに入れた。２５０から５００ｐｍｏｌのそれぞれのＬＣＢを含む、２０μｌの内部ＬＣＢ基準物質混合物（Ｍａｔｒｅｙａ Ｉｎｃ．，Ｐｌｅａｓａｎｔ Ｇａｐ，ＰＡ）を、さらに加えた。ハエを、２ｍｌの氷冷メタノール／水、１：１（ｖ／ｖ）の中で、ゆるいペストルでその後きついペストルで、それが滑らかに動くまでホモジェナイズした。抽出物を、氷上でチップソニケーター（３×２０秒）によりさらにホモジェナイズし、その後ガラス管へと移し、１５００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を、回収し、スピードバック（ｓｐｅｅｄ ｖａｃ）の中で乾燥させた。抽出物を、０．１Ｍの水酸化アンモニウムを含むメタノール２００μｌの中で再懸濁し、その後ボルテックスし、水槽ソニケーションをし、さらに、３７℃で１時間インキュベーションし、エステル化アシル鎖の加水分解を行った。加水分解の後、そのサンプルを、室温まで冷やし、スピードバックの中で乾燥させ、さらに、５００μｌの、０．１％の氷酢酸を含むメタノール／水、２：３（ｖ／ｖ）（溶媒Ａ）の中で再懸濁させた。
（Ｓｔｒａｔａ Ｃ１８−Ｅカラム上での固相抽出）
Ｓｔｒａｔａ Ｃ１８−Ｅ固相抽出カラム（５０ｍｇ／ｍｌ）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）を、最初に２００μｌのメタノールにて湿らせ、その後１ｍｌの溶媒Ａにて平衡化した。溶媒Ａの中のハエ抽出物またはＬＣＢ標準物質を、平衡化Ｓｔｒａｔａ Ｃ１８−Ｅカラムにアプライし、その後１ｍｌの溶媒Ａにて洗浄した。そのカラムの２回目の洗浄を、６００μｌのメタノールの添加により行った。ＬＣＢを、６００μｌのメタノール：１０ｍＭ酢酸アンモニウム、９：１（ｖ／ｖ）によりそのカラムから溶出させ、さらにスピードバックの中で乾燥させた。
（ＨＰＬＣ分析）
ＬＣＢを、以前に記述されるように、オルト−フタルアルデヒド（ＯＰＡ）（Ｓｉｇｍａ Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で誘導化した（Ｃａｌｉｇａｎ，Ｔ．Ｂ．，Ｋ．Ｐｅｔｅｒｓ Ｊ．Ｏｕ，Ｅ．Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｓａｂａ，およびＡ．Ｈ．Ｊｒ．Ｍｅｒｒｉｌｌ．２０００．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８１：３６−４４．）。そのＯＰＡ−誘導化ＬＣＢを、逆相カラム（Ｌｕｎａ ＲＰ−１８，３μ，４．６×７５ｍｍ）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）上で、メタノール：１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ５．２、８２：１８（ｖ／ｖ）の移動相により、分離した。流速は、１ｍｌ／分であった。使用したＨＰＬＣ系は、１２５種類の溶媒モジュールを備えるＢｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄであった。その蛍光性ＬＣＢを検出し、Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ蛍光検出器（ＳＰ ８４１０）を使用して定量した。
（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＬＣＢの質量分析）
成虫Ｓｐｈｋ２ＫＧ０５８９４ハエからＳｔｒａｔａ Ｃ１８−Ｅカラムにより精製された脂質抽出物またはＣ１４Ｓｏ標準物質を、１０μｌの試料の直接注入の後、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｔｒｏ ＬＣＺ装置上で分析した。移動相は、０．１パーセントの蟻酸を含む８０パーセントメタノールであった。流速は、０．２ｍｌ／分であった。ＬＣＢの構造的確証は、陽性電気噴射イオン化（ＥＳＩ＋）質量分析により得られた。ＬＣＢを、記載されるように、構造的に別個のイオン断片の前駆イオン走査により検出した（Ｓｕｌｌａｒｄｓ，Ｍ．Ｃ．，およびＡ．Ｈ．Ｊｒ．Ｍｅｒｒｉｌｌ．２００１．Ｓｃｉ．ＳＴＫＥ．６７：１−１１．）。そのキャピラリーへの３．５ｋＶの印加により、その噴射およびその衝突により誘導される分解スペクトルを、２０Ｖのコーン電圧で開始し、アルゴンを衝突気体として用いて、１５ｅＶの衝突エネルギーで記録した。
略称：Ｓｏ：スフィンゴシン；Ｓａ：ジジドロスフィンゴシン、ＬＣＢ：自由長鎖スフィンゴイドベース；ＬＣＢＰ：リン酸化遊離長鎖スフィンゴイドベース；ＳＰＴ：セリンパルミトイルトランスフェラーゼ；ＯＰＡ：オルト−フタルアルデヒド。
（結果）
（スフィンゴイドベースのＨＰＬＣ分離およびスフィンゴイドベースの固相抽出）
ＨＰＬＣ法を、１４から１８の炭素数を持つＬＣＢの分離のために開発した。成虫ハエからのメタノール／水粗製脂質抽出物の初めのＨＰＬＣ分離は、蛍光物質の高程度の混在により、複雑であった。その結果、ＨＰＬＣ分析に先立ち、Ｓｔｒａｔａ Ｃ１８−Ｅカラムを使用する固相抽出工程を導入した。メタノールを、溶出溶媒として採用した場合、ＬＣＢ標準物質の回収は、２パーセントより少なかった。Ｓｔｒａｔａ Ｃ１８−ＥカラムからのＬＣＢ標準物質のこの不十分な回収は、１０容積％の１０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液をメタノール溶出溶媒に添加することにより、完全に回復した。この溶出系の採用により、Ｃ１４およびＣ１６スフィンゴイドベース標準物質について、６０から９５パーセントの範囲での回復が得られた（表３）。
（表３：ＳＴＲＡＴＡ Ｃ１８−Ｅカラム上での固相抽出の後の、スフィンゴイドベース標準物質の回収率）
Figure 2005531285
 値を、少なくとも３つの独立した測定についての平均値±標準偏差で示す。
（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ由来のＬＣＢのＨＰＬＣ分析）
メタノール／１０ｍＭ酢酸アンモニウム ９：１（ｖ／ｖ）を用いるＳｔｒａｔａ Ｃ１８−Ｅカラムからの成体ハエ脂質の溶出は、なお、望ましくない有意なバックグラウンド蛍光を伴うＨＰＬＣスペクトルを生じた。このバックグラウンドを、メタノール／１０ｍＭ酢酸アンモニウム９：１（ｖ／ｖ）を用いる溶出の前にメタノールを添加することによって最小にした（詳細については、材料および方法を参照のこと）。３つの異なる系統の成体ハエを分析した。野生型ハエの脂質プロフィールを、スフィンゴシンキナーゼ（Ｓｐｈｋ２）変異体およびセリンパルミトイルトランスフェラーゼ（ＳＰＴ，ｌａｃｅ）変異体の脂質プロフィールと比較した（上記の材料および方法を参照のこと）。このＳｐｈｋ２変異体は、ＬＣＢをリン酸化する能力の減少を示すことが推測され、その結果、ＬＣＢレベルの増加を示すはずである。対照的に、ハイポモルフｌａｃｅ変異体は、スフィンゴ脂質新規生合成の第１段階を欠損しており、ＬＣＢレベルの減少またはＬＣＢの完全な欠如を示すと推測される。Ｃ１４ Ｓｏ標準物、Ｃ１６ Ｓｏ標準物、Ｃ１６ Ｓａ標準物と同じ保持時間を示す３つのピークを、野生型ハエ抽出物において同定した。さらに、Ｃ１４ ＳｏとＣ１６ Ｓｏとの間の保持時間で溶出する主要ピークを、同定した。上記４つのピークは、Ｓｐｈｋ２変異体において増加し、ｌａｃｅ変異体において減少した。これは、これらのピークがＬＣＢを示す可能性と一致した。Ｃ１８ ＬＣＢ標準物に対応する保持時間で溶出したピークは、観察されなかった。
Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラムからのアイソクラティック（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）溶出の後、保持時間のｌｏｇに対する誘導体化スフィンゴイドベース標準物の炭素長のプロットは、同じ分子クラスに属するスフィンゴイドベース間で、直線的相関関係を示す（Ｌｅｓｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．およびＲ．Ｃ．Ｄｉｃｋｓｏｎ，２００１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９８：２８３〜２９２）。これは、未知のスフィンゴイドベースの同定のために有用であり得る。このプロットにおいて、未知のピーク２の保持時間と、２つのＳａ標準物の保持時間との間に、直線的相関関係が存在する。この知見は、ピーク２がＣ１４ Ｓａであることを強く示唆する。
（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ由来のＬＣＢの質量分析）
ＬＣＢを、陽イオン電子スプレー質量分析（ＥＳＩ＋）を使用して、その衝突誘導性乖離のパターンおよび前駆イオンスキャンのパターンを介して同定し得る。その独特の分子構造に基づいて、代表的分解産物が、２つの水分子の欠失から生じる。ｍ／ｚ ２０８（Ｃ１４ Ｓｏ−２水分子）の前駆イオンスペクトルは、ｍ／ｚ２４４（Ｃ１４Ｓｏ）およびｍ／ｚ ２２６（Ｃ１４Ｓｏ−１水分子）として、親を示す。ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａにおけるＣ１４ Ｓａの存在を確認するために、本発明者らは、ＥＳＩ＋によるＳｔｒａｔａ Ｃ１８−Ｅカラム精製脂質抽出物を分析した。Ｓｐｈｋ２変異体からの脂質抽出物を、この分析のために選択した。なぜなら、この脂質抽出物は、増加したＬＣＢレベルを示したからである。最初に、本発明者らは、内因性Ｃ１４ Ｓｏの存在を探索した。ｍ／ｚ ２０８の前駆イオンスペクトルは、この抽出物においてＣ１４ Ｓｏ（ｍ／ｚ ２４４）を同定した。その後、本発明者らは、Ｃ１４ Ｓａの存在を探索した。ｍ／ｚ ２１０の前駆イオンスペクトルは、内因性Ｃ１４ Ｓａ（ｍ／ｚ ２４６）を同定した。さらに、ｍ／ｚ ２３６およびｍ／ｚ ２３８の前駆イオンスキャンは、このハエ抽出物において内因性Ｃ１６ Ｓｏおよび内因性Ｃ１６ Ｓａを同定した。ｍ／ｚ ２６４およびｍ／ｚ ２６６の前駆イオンスキャンは、このハエ抽出物においてＣ１８ ＬＣＢを同定しなかった。このことは、上記ＨＰＬＣ分析から得られた結果を支持する。
（スフィンゴ脂質代謝のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａモデルにおけるＣ１４およびＣ１６スフィンゴイドベース）
内因性Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＬＣＢを、Ｓｔｒａｔａ Ｃ１８−Ｅカラム精製抽出物（規定量のＣ１４ Ｓｏ標準物、Ｃ１６ Ｓｏ標準物およびＣ１６ Ｓａ標準物を添加しているもの、または添加していないもののいずれか）のＨＰＬＣ分離を実施することによって、定量した。分離後に、各蛍光ＬＣＢピークについて得られた積分した面積（表４）の比較を行った。興味深いことに、ｌａｃｅ変異体ハエおよびＳｐｈｋ２変異体ハエは、各系統からの脂質抽出物の分析により測定した場合、ＬＣＢ総量およびＬＣＢ比較の両方において、野生型ハエと明らかに異なった。野生型ＬＣＢの総量は、ハエ全体１００ｍｇにつき、約１．５ｎｍｏｌであった。Ｓｐｈｋ２変異体は、野生型ハエと比較して、ＬＣＢ総量において、３．３倍増加を示し、ｌａｃｅ変異体は、２．５分の１の減少を示した。Ｃ１４ Ｓｏは、野生型ハエにおいて、ＬＣＢ総量のうちの約４２％を占め、一方、Ｃ１４ Ｓａは、約４７％を占めた。従って、Ｃ１４ Ｓｏ対Ｃ１４ Ｓａのモル比は、約１：１であった。Ｓｐｈｋ２変異体において、対応する値は、２６％Ｃ１４ Ｓｏおよび６７％Ｃ１４ Ｓａであり、モル比約１：２．５を生じた。一方、ｌａｃｅ変異体において、対応する値は、１６％Ｃ１４ Ｓｏおよび８１％Ｃ１４ Ｓａであり、モル比約１：５を生じた。
（表４：種々の成体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ系統における内因性ＬＣＢのＨＰＬＣ分析）
Figure 2005531285
 値は、３つの独立した実験についての平均±標準偏差として示される。値ｎ．ｄ．とは、分析したハエ物質の量において検出可能なＬＣＢが存在しなかったことを意味する。括弧中の数字は、野生型のパーセントを示す。
ａ Ｓｔｒａｔａ Ｃ１８−ＥカラムからのＣ１４ Ｓａの回収についての推定値は、以下の式：Ｃ１４ Ｓａの回収％＝Ｃ１６ Ｓａの回収％ × （Ｃ１４ Ｓｏの回収％／Ｃ１６ Ｓｏの回収％）
ｂ 野生型と有意に異なる；Ｐ＜０．００１
ｃ 野生型と有意に異なる；Ｐ＜０．００５。
（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ発生におけるＣ１４スフィンゴイドベース）
遺伝子研究によって、スフィンゴ脂質中間体の役割は、発生プロセスに関係付けられている。しかし、発生の間にわたるこれらの分子の定量は、実施されていない。スフィンゴ脂質中間体の潜在的役割についての生化学的基礎が存在するか否かを調査するために、本発明者らは、種々のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ発生段階における内因性Ｃ１４ ＬＣＢを評価した（表５）。Ｃ１４ ＬＣＢの総量は、野生型の発生全体にわたって全く一定のままであった。しかし、初期胚からさなぎまでの発生進行は、Ｃ１４ Ｓｏ対Ｃ１４ Ｓａのモル比における７倍の増加に関係があった。
（表５：種々の野生型Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ発生段階における内因性Ｃ１４ ＬＣＢのＨＰＬＣ分析）
Figure 2005531285
 値は、３つの独立した測定について、平均±標準偏差として示される。
（実施例１２）
（変化したスフィンゴ脂質代謝を有するＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ系統における肉眼および顕微鏡による腫瘍発症の分析）
いくつかのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒスフィンゴ脂質代謝変異体は、腫瘍（特に、Ｓ−１−Ｐの有意な蓄積を示す腫瘍）を発症し得る。ｌｇｌ変異体およびｄｌｇ変異体と関連する以前に特徴付けられたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ腫瘍は、脊椎動物における新生物増殖に関連する特徴（宿主に対する致死性、反復移植能、浸潤性、最終分化の欠如、インビボおよび組織培養での迅速な増殖、ならびに細胞間の相互作用および連絡の欠損を含む）を保有する。変異体において生じる肉眼または顕微鏡により可視可能な腫瘍におけるこれらの特徴の各々の評価を、実施する。成虫原基の過剰増殖を、明白な腫瘍がない場合でさえ、すべての変異体において探索する。致死性変異は、初期発生段階の間における腫瘍形成の存在を示唆し得る。変態の間に正常な分化シグナルに対して、成虫原基腫瘍細胞または成虫原基過剰増殖が応答する能力を、変異体成虫原基を野生型幼生に移植し、その運命を追跡することによって、評価した。インビトロおよび成体雌の腹において多数の転移世代の間、腫瘍または過剰増殖成虫原基が連続培養される能力を、評価する。腫瘍浸潤性および転移能力の証拠を、組織学的分析を使用して上皮鞘に囲まれた組織中への浸潤の存在または非存在を決定することによって、測定した。
（実施例１３）
（変化したスフィンゴ脂質代謝を有するＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ系統における肉眼および顕微鏡による解剖学的欠損の評価）
特定の例示的実験方法が、本明細書中（例えば、実施例１の前の上記の節）に記載される。本発明をさらに規定するために使用され得るさらなる例示的技術（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒの肉眼および顕微鏡による解剖学的欠損の評価のための一般的技術）が、当該分野で公知であり、本明細書中にさらに記載される。各系統の寿命を測定し、野生型ハエと比較して、生存能に対する影響を評価する。気管系および筋肉系の肉眼による解剖学を、偏光を用いて幼生において観察し、そして光学顕微鏡下で標準厚切片を観察することにより成体において観察して、気管もしくは筋肉の数、サイズ、位置または適切な付着に影響を与える明白な欠損を同定する。光学顕微鏡法のための調製は、グリセロール／エタノール溶液中にハエを貯蔵すること、その後、７０％エタノールによって不要な構造物を解体すること、切片化のために標本を再水和し、そして封入もしくは包埋することを包含する。可視化を、明視野、ＤＩＣ照明、位相差、または暗視野照明下で実施する。ＩＦＭの電子顕微鏡分析を、成体、幼生およびさなぎに対して実施する。初期Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ胚は、蛍光二次抗体またはいくつかの場合においては一次抗体を使用して検出される多数の高度に特異的な抗体のいずれかを使用する構造分析をしやすい。多数の段階的胚を、正常ストックおよび変異体ストックから収集し得、そして蛍光分析のために調製し得る。このプロセスは、漂白剤溶液を使用して脱塩素化、ビテリン膜を透過性にすること、（メタノールを用いない）固定およびビテリン膜除去、染色、洗浄、および封入を包含する。ｌａｃｅ変異体は、翅成虫原基の異常なアポトーシスを示すので、本発明者らは、すべての変異体における成虫原基の構造および外転におけるなんらかの変化を調査することを計画する。成虫原基の解体を、生理食塩水溶液中で実施する。この解体は、第三齢の幼生を半分に引き裂くこと、体壁を反転すること、および前部原基または後部原基の塊を体から摘み取ることを包含する。原基を、インサイチュハイブリダイゼーション研究のために体壁に付けたままにしても良いし、または原基を取り出して、他の研究のために固定してもよい。さなぎの成虫原基をまた、一晩固定した後に角質を除去することによって単離し得る。
（実施例１４）
（スフィンゴ脂質と相同性を有する合理的に設計された一群の化学物質を、ＳＰＬ変異体子孫に対して飛行を回復する能力をスクリーニングすることによる、ＳＰＬ変異体が飛行不能であることの薬理学的サプレッサの同定）
Ｓｐｌｙ変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒが飛行不能であることの薬理学的サプレッサを、スフィンゴ脂質と相同性を有する合理的に設計された一群の化学物質を、Ｓｐｌｙ変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒに対して飛行を回復する能力をスクリーニングすることによって、同定する。変異体ＳＰＬハエを、ビヒクルコントロールまたはμＭ濃度のインヒビターのいずれかを補充した培地において、１８℃で増殖させる。種々のインヒビターが飛行を回復させる能力を、標準的スコア付け法（本明細書の他の場所にもまた記載される）を使用して、測定する（Ｖｉｇｏｒｅａｕｘら、１９９３、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２１：５８７〜５９８もまた、参照のこと）。その後、興味深い化合物の効力および生化学的特徴を、１）精製ＳＫ、ＳＰＬ、およびスフィンゴ脂質代謝に関与する他の酵素（例えば、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ、セラミドシンターゼ、スフィンゴシンデサチュラーゼ、セラミダーゼ、セラミドキナーゼ、ホスホエタノールアミンシチジルイルトランスフェラーゼ、ＣＤＰ−エタノールアミンホスホトランスフェラーゼ、酸性スフィンゴミエリナーゼおよび中性スフィンゴミエリナーゼ）に対するそのインヒビターのＩＣ５０を決定することによって、定量する。そのインヒビターのＩＣ５０をまた、組換えヒトＳＫ、ＳＰＬ、および上記に列挙したスフィンゴ脂質代謝に関与する他の酵素に対しても決定し、２）古典的Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ法を使用して阻害の速度論を分析し、そして３）その阻害の可逆性を決定する。合成アナログを、このスクリーニングのために生成する。潜在的ＳＫインヒビターとしてのスクリーニングのために、１−アリール−２−ジメチルアミノプロパン−１，３−ジオール誘導体のライブラリーを、合成する。４つのジアステレオマー（ＤまたはＬ、ｅｒｙｔｈｒｏ−、またはｔｈｒｅｏ−）を、このライブラリーの各メンバーについて合成する。このライブラリーにおいて、その脂肪酸アミド基を、２つのＮ−メチル基で置換し、極性置換基および芳香族置換基において同様の変化を生じる。この合成計画は、出発物質として、周知のＧａｒｎｅｒアルデヒド（図２における１を参照のこと）を利用する。なぜなら、１は、いずれかのエナンチオマー形態において容易に利用可能であるからである。金属、溶媒、および添加Ｌｅｗｉｓ酸触媒の効果をまとめる、１への有機金属添加についての最近の精緻な概説が、刊行されており、それは、ｅｒｙｔｈｒｏ産物が、ほとんどの反応において通常は支持されることを示す。従って、出発物質として１のＤ−エナンチオマーまたはＬ−エナンチオマーを選択することによって、各ライブラリーメンバーの純粋なｅｒｙｔｈｒｏ立体異性体を調製する。対応するｔｈｒｅｏアナログ（４ａ〜ｃ、図２）を構築するための新規かつ柔軟な経路を、ＰＤＭＰアナログを生成するための方法論の簡単な拡張法を使用して実行する。親化合物である４ａは、すでに公知であり、容易に入手可能である。このストラテジーは、特定のスルフィド添加剤およびホスフィン添加剤の存在下での、アリール金属化合物（Ａｒｙｌ−Ｍｅｔ）の１へのｓｙｎ選択的添加に依存する。このｅｒｙｔｈｒｏ合成経路およびｔｈｒｅｏ合成経路の両方とも、一級炭素原子における置換変化形を調製するために改変する。７ａ〜ｃの調製のための代表的合成手順を、図３に示す。広範囲の窒素求核剤、酸素求核剤、および炭素求核剤が、５ａ〜ｃのようなメシレートと反応して、ジメチル化ＰＤＭＰアナログおよびホモログの新規ライブラリーを提供し得た。
（実施例１５）
（ＳＫの阻害が細胞生存を付与するように考案された酵母スクリーニングにおいてヒトＳＫを阻害する能力を試験することによる、候補薬物のさらなる評価）
実施例１４に記載されるハエスクリーニングにおいて同定した化合物を、酵母モデルにおいてヒトＳＫを阻害する能力についてさらに評価する。ヒトＳＫの活性をブロックする化合物は、酵母系統ｄｐｌ１ｙｓｒ２ｌｃｂ４（Ｇａｌ１，１０ｐ：ヒトＳＰＨＫ１）に対して、ガラクトース上での増殖を回復するはずである。この系統は、Ｓ−１−Ｐも内因性酵母Ｓ−１−Ｐアナログも代謝し得ない。それは、ＳＰＬホスファターゼをコードする遺伝子およびＳ−１−Ｐホスファターゼをコードする遺伝子を欠失していることに起因する。内因性酵母ＳＫ遺伝子であるＬＣＢ４もまた欠失しており、その結果、内因性Ｓ−１−Ｐアナログが、基準条件下で生成される。この系統は、ガラクトース誘導性プロモーターの調節下にヒトＳＰＨＫ１遺伝子を含むプラスミドで形質転換されており、その結果、ガラクトース存在下での活性ＳＫの発現は、この系統に対して致死性である。ヒトＳＫの阻害は、ガラクトース誘導性致死性から細胞を保護し、問題となるその化合物の効力を確認する。この系統におけるヒトＳＰＨＫ１遺伝子の活性は、２つの方法により確認されている。第１の方法は、ガラクトース存在下で（制限期間の間）増殖した細胞の全抽出物におけるＳＫ活性のＨＰＬＣ分析であり、第２の方法は、ガラクトース含有プレート上でこの系統がコロニーを形成不能であることである。
Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−スフィンゴシン、Ｎ，Ｎ−ジメチルスフィンゴシン、およびＤ，Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ジヒドロスフィンゴシンを、Ｂｉｏｍｏｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）から得る。モルホリン、ピペラジンおよびｅｒｙｔｈｒｏシリーズのＰＤＭＰアナログを得る。他のアナログを、上記のようにして、そして以前に記載された方法に従って、調製する（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｍ．，Ｌ．Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ，Ｖ．Ｓｒｉｋａｎｔａｎ，Ｌ．Ｆｏｓｓｏｍ，Ｌ．Ｎｏｌａｎ，Ｍ．Ｇｌａｓｍａｎ，Ｘ．Ｌｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｆｅｈｒｌｅ，Ｓ．Ｐｉｔｔａｌｕｇａ，Ｍ．Ｒａｆｆｅｌｄ，Ｐ．Ｋｏｉｖｉｓｔｏ，Ｎ．Ｗｉｌｌｉ，Ｔ．Ｃ．Ｇａｓｓｅｒ，Ｊ．Ｋｏｎｏｎｅｎ，Ｇ．Ｓａｕｔｅｒ，Ｏ．Ｐ．Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ，Ｓ．ＳｒｉｖａｓｔａｖａおよびＨ．Ｂ．Ｐｏｌｌａｒｄ，２００１．ＡＮＸ７，ａ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９８：４５７５〜４５８０；Ｂｏｃｋｍｕｈｌ，Ｕ．，Ｓ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｓ．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，およびＩ．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ．２０００．「Ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １０ｑ−ａ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏｆ ｈｅａｄ−ｎｅｃｋ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ？］．Ｌａｒｙｎｇｏｒｈｉｎｏｏｔｏｌｏｇｉｅ．７９：８１〜８５；Ｍｏｒｉｔａ，Ｒ．，Ｓ．Ｓａｉｔｏ，Ｊ．Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｏ，Ｏｇａｗａ，Ｏ．Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｋ．ＹａｍａｋａｗａおよびＹ．Ｎａｋａｍｕｒａ．１９９１．Ｃｏｍｍｏｎ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ５ｑ，６ｑ，ａｎｄ １０ｑ ｉｎ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：５８１７〜５８２０．；Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｒ．Ｂ．，Ｉ．Ｄ．Ｈａｙ，Ｊ．Ｆ．Ｈｅｒａｔｈ，Ｃ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｊ．Ｌ．Ｓｐｕｒｂｅｃｋ，Ｃ．Ｓ．Ｇｒａｎｔ，Ｊ．Ｒ．ＧｏｅｌｌｎｅｒおよびＧ．Ｗ．Ｄｅｗａｌｄ．１９９０，Ｆｒｅｑｕｅｎｔ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｆ ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ ｉｎ ｓｐｏｒａｄｉｃ ｎｏｎｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ．６６：１２１３〜１２２０；Ｓｈｅｎ．Ｗ．Ｐ．，Ｒ．Ｆ．Ｙｏｕｎｇ，Ｂ．Ｎ．Ｗａｌｔｅｒ，Ｂ．Ｈ．Ｃｈｏｉ，Ｍ．ＳｍｉｔｈおよびＪ．Ｋａｔｚ．１９９０．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｍｙｘｏｉｄ ｃｈｏｎｄｒｏｓａｒｃｏｍａ ｗｉｔｈ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ １０ ａｎｄ ２２．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．４５：２０７〜２１５；Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｎ．Ｅ．，Ｋ．Ｋ．Ｋｉｄｄ，Ｐ．Ｊ．Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ，Ｈ．ＭｃＤｅｒｍｉｄ，Ｓ．Ｍｙｅｒｓ，Ｊ．Ｒ．Ｋｉｄｄ，Ｃ．Ｅ．Ｊａｃｋｓｏｎ，Ａ．Ｍ．Ｄｕｎｃａｎ，Ｌ．Ａ．Ｆａｒｒｅｒ，Ｋ．Ｂｒａｓｃｈら、１９８７．Ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｎｅｏｐｌａｓｉａ ｔｙｐｅ ２Ａ ｔｏ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １０ ｂｙ ｌｉｎｋａｇｅ．Ｎａｔｕｒｅ．３２８：５２８〜５３０；Ｉｃｈｉｍｕｒａ，Ｋ．，Ｅ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ａ．Ｍｉｙａｋａｗａ，Ｈ．ＧｏｉｋｅおよびＶ．Ｃｏｌｌｉｎｓ．１９９８．Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｎ １０ｐ ａｎｄ １０ｑ ｓｕｇｇｅｓｔ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｓｔｒｏｃｙｔｉｃ ｇｌｉｏｍａｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ ｇｒａｄｅｓ．Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ．２２：９〜１５；Ｋｉｍ，Ｓ．，Ｈ．ＦｙｒｓｔおよびＪ．Ｓａｂａ．２０００．Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｓｐｈｉｎｇｏｉｄ ｌｏｎｇ ｃｈａｉｎ ｂａｓｅｓ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１５６：１５１９〜１５２９）。
脂質抽出を、イオン交換クロマトグラフィーおよびＨＰＬＣ分析によって実行する。ＳＫアッセイを、本質的には記載されたように実施する（Ｔａｙｌｏｒ，Ｍ．Ｖ．２０００．Ｍｕｓｃｌｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｏｆ ｍｙｏｂｌａｓｔ ｆｕｓｉｏｎ．Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ．１０：Ｒ６４６〜６４８）。ネイティブＳＫおよび組換えＳＫの精製を、本質的には記載されたように実施する（Ｍａｏ，Ｃ．，Ｍ．Ｗａｄｌｅｉｇｈ，Ｇ．Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｙ．ＨａｎｎｕｎおよびＬ．Ｏｂｅｉｄ．１９９７．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｄｉｈｙｄｒｏｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７２：２８６９０〜２８６９４）。
（実施例１６）
（トランスジェニックＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ発現ヒトＳＰＬおよびヒトＳＰＬ−ＧＦＰ融合物の生成）
ヒトＳＰＬ（配列番号２３に示されるｃＤＮＡ；配列番号１８に示されるアミノ酸配列）およびヒトＳＰＬ−ＧＦＰ融合タンパク質を過剰発現するトランスジェニックＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒを、本明細書中で記載される標準技術を使用して生成した。これらのトランスジーンを、野生型Ｃａｎｔｏｎ−Ｓ（ＢＬ−１）、およびＳｐｌｙ０５０９１（ＢＬ−１１３９３）、変異体ハエバックグラウンド中に導入した。
上記から、本発明の特定の実施形態が例示目的のために本明細書中に記載されているが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、種々の改変がなされ得ることが、認識される。
図１は、２つの潜在的なＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＳＫタンパク質のアミノ酸配列を、ヒトＳＫタンパク質のアミノ酸配列と並べて示す。（ＤＳＫ１７４７は配列番号１９に示される；ＤＳＫ２１５９は配列番号２０に示される）。 図２は、第一の化学合成模式図を示す。 図３は、第二の化学合成模式図を示す。
【配列表】
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Claims (49)

  1. スフィンゴ脂質の代謝を調節する薬剤を同定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
    （ａ）ホモ接合性ヌル変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒにおいて以下：
    （ｉ）少なくとも１つのスフィンゴ脂質中間体、または
    （ｉｉ）スフィンゴ脂質経路の少なくとも１つの成分の活性、
    のいずれかのレベルに対する該薬剤の影響が観察されるのに十分な条件下および時間にわたって、候補薬剤の非存在下または存在下で、該変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒを培養する工程であって、
    ここで、該変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒは、少なくとも１つのスフィンゴ脂質中間体の変更されたレベルおよび少なくとも１つのスフィンゴ脂質経路の成分の変更された活性レベルのうち、少なくとも１つを生じる、スフィンゴ脂質経路の成分をコードする遺伝子中にＰ因子トランスポゾン挿入を含む、工程；ならびに
    （ｂ）（ｉ）該生成されたスフィンゴ脂質中間体または（ｉｉ）該スフィンゴ脂質経路の成分の活性、のいずれかのレベルを、該候補薬剤の非存在下でのレベルに対して、該候補薬剤の存在下で比較する工程、
    を包含し、ここで、変更されたレベルは、該薬剤がスフィンゴ脂質代謝を調節することを示す、
    方法。
  2. 請求項１に記載の方法であって、スフィンゴ脂質中間体の前記変更されたレベルが、Ｃ１４／１６長鎖ベースでの増大を含む、方法。
  3. 請求項１に記載の方法であって、スフィンゴ脂質中間体の前記変更されたレベルが、Ｃ１４／１６リン酸化長鎖ベースでの増大を含む、方法。
  4. 請求項１に記載の方法であって、前記スフィンゴ脂質経路の成分をコードする遺伝子が、配列番号１５、配列番号２４および配列番号２５のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む、方法。
  5. 請求項１に記載の方法であって、前記ホモ接合性のヌル変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒが、ｆｌｉｇｈｔｌｅｓｓ表現型を示す、方法。
  6. 請求項１に記載の方法であって、前記ホモ接合性のヌル変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒが、腫瘍を含む、方法。
  7. 請求項１に記載の方法であって、前記ホモ接合性のヌル変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒが、胸部筋肉の異常な発生パターンを含むＴ２分節を含む、方法。
  8. 請求項１に記載の方法であって、前記候補薬剤の存在下で生成された前記スフィンゴ脂質中間体の変更されたレベルが、スフィンゴシン−１−リン酸の減少を含む、方法。
  9. 請求項１に記載の方法であって、前記候補薬剤の存在下で生成された前記スフィンゴ脂質中間体の変更されたレベルが、スフィンゴシン−１−リン酸の増加を含む、方法。
  10. 請求項１に記載の方法であって、前記候補薬剤の存在下での前記スフィンゴ脂質経路の成分の活性の変更されたレベルが、スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ（ＳＰＬ）活性の減少を含む、方法。
  11. 請求項１に記載の方法であって、前記候補薬剤の存在下での前記スフィンゴ脂質経路の成分の活性の変更されたレベルが、スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ（ＳＰＬ）活性の増加を含む、方法。
  12. 請求項１に記載の方法であって、前記候補薬剤の存在下での前記スフィンゴ脂質経路の成分の活性の変更されたレベルが、スフィンゴシンキナーゼ（ＳＫ）活性の減少を含む、方法。
  13. 請求項１に記載の方法であって、前記候補薬剤の存在下での前記スフィンゴ脂質経路の成分の活性の変更されたレベルが、スフィンゴシンキナーゼ（ＳＫ）活性の増加を含む、方法。
  14. 前記薬剤が、ＳＫ活性を阻害する、請求項１に記載の方法。
  15. 前記薬剤が、ＳＰＬ活性を阻害する、請求項１に記載の方法。
  16. 前記薬剤が、１−アリール−２−ジメチルアミノプロパン−１，３−ジオール誘導体を含む、請求項１に記載の方法。
  17. 前記誘導体が、脂肪酸アミド基の置換を含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記置換が、２つのＮ−メチル基を含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記薬剤が、セリンパルミトイルトランスフェラーゼの活性を増大させる、請求項１に記載の方法。
  20. スフィンゴ脂質代謝を調節する薬剤を同定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
    （ａ）ホモ接合性ヌル変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒを、該変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒにおいて、以下：
    （ｉ）少なくとも１種のスフィンゴ脂質中間体、または
    （ｉｉ）スフィンゴ脂質経路の少なくとも１つの成分の活性、
    のいずれかのレベルに対する候補薬剤の影響を観察するのに十分な条件下および時間にわたって、該薬剤の非存在下および存在下で培養する工程であって、
    ここで、該変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒは、少なくとも１つのスフィンゴ脂質経路成分の活性レベルの変更を生じる、スフィンゴ脂質経路成分をコードする遺伝子におけるＰ因子トランスポゾン挿入を含み、ここで、該変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒは、該挿入から生じるｆｌｉｇｈｔｌｅｓｓ表現型を示す、工程；ならびに
    （ｂ）該候補薬剤の非存在下で培養される該変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの飛行能力に対して、該候補薬剤の存在下で培養される該変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの飛行能力を比較する工程であって、ここで、該候補薬剤の存在下で培養される該変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの飛行能力の増大は、該薬剤がスフィンゴ脂質代謝を調節することを示す、方法。
  21. 請求項２０に記載の方法であって、前記変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒが、スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ（ＳＰＬ）をコードする遺伝子におけるホモ接合性変異を含む、方法。
  22. 請求項２０に記載の方法であって、前記ホモ接合性ヌル変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒが、胸部筋肉の異常な発生パターンを含むＴ２分節を含む、方法。
  23. 請求項２０に記載の方法であって、前記スフィンゴ脂質代謝を調節する薬剤が、スフィンゴシンキナーゼ活性を阻害する、方法。
  24. スフィンゴ脂質シグナル伝達を調節する薬剤を同定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
    （ａ）ホモ接合性ヌル変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒを、該変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒにおいて、少なくとも１種のスフィンゴ脂質中間体のレベルに対する候補薬剤の影響を観察するのに十分な条件下および時間にわたって、該薬剤の非存在下および存在下で培養する工程であって、
    ここで、該変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒは、少なくとも１つのスフィンゴ脂質中間体のレベルの変更を生じる、スフィンゴ脂質経路成分をコードする遺伝子におけるＰ因子トランスポゾン挿入を含む、工程；ならびに
    （ｂ）該候補薬剤の非存在下で生成されるスフィンゴ脂質中間体のレベルに対して、該候補薬剤の存在下で生成されるスフィンゴ脂質中間体のレベルを比較する工程であって、ここで、該候補薬剤の存在下で生成されるスフィンゴ脂質中間体のレベルの変更は、該薬剤がスフィンゴ脂質シグナル伝達を調節することを示す、方法。
    請求項１、２０および２４に記載の方法のいずれか１つによって同定された、薬剤。
  25. 生理学的に受容可能な賦形剤と組み合わせて、請求項２５に記載の薬剤を含む、組成物。
  26. ホモ接合性ヌル変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒにおいて飛行能力を増大させる薬剤を含む組成物であって、ここで、該変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒは、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むスフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ（ＳＰＬ）ポリペプチドをコードする遺伝子において、Ｐ因子トランスポゾン挿入を含み、そして該変異体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒは、該挿入から生じるｆｌｉｇｈｔｌｅｓｓ表現型を示す、組成物。
  27. 前記薬剤が、スフィンゴシンキナーゼ活性を示す、請求項２７に記載の組成物。
  28. スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ（ＳＰＬ）ポリペプチドを調節するための方法であって、該方法は、
    配列番号１５に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸構築物で形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞を培養する工程；および
    スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼポリペプチドを回収する工程、
    を包含する、方法。
  29. スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ活性を調節する薬剤を同定するための方法であって、該方法は、以下：
    （ａ）候補薬剤を、以下：
    （ｉ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列；および
    （ｉｉ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
    からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドと接触させる工程であって、
    ここで、該ポリペプチドは、スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ活性を有し、そして該接触させる工程は、該候補薬剤が該ポリペプチドと相互作用することを可能にするのに十分な条件下および時間にわたって、実行される、工程；ならびに
    （ｂ）該候補薬剤の存在下での、該ポリペプチドによるスフィンゴシン−１−リン酸またはそのスフィンゴシン−１−リン酸誘導体の分解を、該候補薬剤の非存在下での、該ポリペプチドによるスフィンゴシン−１−リン酸またはそのスフィンゴシン−１−リン酸誘導体の分解に対して決定し、そこから、スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ活性を調節する薬剤を同定する工程、
    を包含する、方法。
  30. スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ活性を調節する薬剤を同定するための方法であって、該方法は、以下：
    （ａ）候補薬剤を、以下：
    （ｉｉｉ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列；および
    （ｉｖ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
    からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する細胞を含む生物学的サンプルと接触させる工程であって、
    ここで、該ポリペプチドは、スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ活性を有し、そして該接触させる工程は、該候補薬剤が該ポリペプチドと相互作用することを可能にするのに十分な条件下および時間にわたって、実行される、工程；ならびに
    （ｂ）該候補薬剤の存在下での、該ポリペプチドによるスフィンゴシン−１−リン酸またはそのスフィンゴシン−１−リン酸誘導体の分解を、該候補薬剤の非存在下での、該ポリペプチドによるスフィンゴシン−１−リン酸またはそのスフィンゴシン−１−リン酸誘導体の分解に対して決定し、そこから、スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ活性を調節する薬剤を同定する工程、
    を包含する、方法。
  31. 前記決定する工程が、前記細胞由来の抽出物のインビトロアッセイを含む、請求項３１に記載の方法。
  32. 生理学的に受容可能なキャリアと組み合わせて、ポリペプチドのスフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ活性を調節する薬剤を含む組成物であって、該ポリペプチドは、配列番号１６に示される配列を含む、組成物。
  33. 前記薬剤が、ポリヌクレオチドを含む、請求項３３に記載の組成物。
  34. 請求項３３に記載の組成物であって、前記薬剤が、配列番号１６に示される配列を含むスフィンゴシンリン酸リアーゼ（ＳＰＬ）ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、ここで、該抗体が、スフィンゴシン−１−リン酸を分解する該ＳＰＬポリペプチドの能力を増大させる、組成物。
  35. 癌細胞の増殖を阻害するための方法であって、該方法は、配列番号１６に示される配列を含むポリペプチドのスフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ活性を増大させる薬剤と、該癌細胞とを接触させる工程を包含する、方法。
  36. 前記薬剤が、内因性スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ遺伝子の発現を増大させる、請求項３６に記載の方法。
  37. 前記癌細胞が、乳癌細胞である、請求項３６に記載の方法。
  38. 哺乳動物における癌の発症、転移、または癌および転移の両方の発症を阻害するための方法であって、該方法は、配列番号１６に示される配列を含むポリペプチドのスフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ活性を増大させる薬剤を、該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
  39. 前記薬剤が内因性スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ遺伝子の発現を増大させる、請求項３９に記載の方法。
  40. 前記薬剤が、標的化成分に連結されている、請求項４０に記載の方法。
  41. 前記標的化成分が、抗腫瘍抗体である、請求項４１に記載の方法。
  42. 前記標的化成分が、エストロゲンレセプターに結合する、請求項４２に記載の方法。
  43. 前記哺乳動物が乳癌に罹患している、請求項３９に記載の方法。
  44. 患者における癌の存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
    （ａ）少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、かつ癌を有することが疑われる患者から得られた第一の生物学的サンプルを、配列番号２３に示される核酸配列を含むポリヌクレオチドに特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと接触させる工程；
    （ｂ）該第一のサンプル中のポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの量を検出する工程；ならびに
    （ｄ）該第一のサンプル中のポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの量を、癌を有さないことが既知の正常なコントロール被験体から得られた第二の生物学的サンプル中のポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの量と比較する工程であって、
    ここで、該第二のサンプル中のポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの量と比較して、該第一の生物学的サンプル中のポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの量における統計的に有意な増加は、該患者における癌の存在を示す、
    方法。
  45. 変更されたスフィンゴ脂質代謝に関連する疾患を診断するための方法であって、該方法は、以下：
    （ａ）少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、かつ該変更されたスフィンゴ脂質代謝に関連する疾患を有することが疑われる患者から得られた第一の生物学的サンプルを、配列番号２３に示される核酸配列を含むポリヌクレオチドに特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと接触させる工程；
    （ｂ）該第一のサンプル中のポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの量を検出する工程；ならびに
    （ｄ）該第一のサンプル中のポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの量を、変更されたスフィンゴ脂質代謝に関連する疾患を有さないことが既知の正常なコントロール被験体から得られた第二の生物学的サンプル中のポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの量と比較する工程であって、
    ここで、該第二のサンプル中のポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの量と比較して、該第一の生物学的サンプル中のポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの量における統計的に有意な増加は、該患者における変更されたスフィンゴ脂質代謝に関連する疾患の存在を示す、
    方法。
  46. 患者における癌の存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
    （ａ）少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、かつ癌を有することが疑われる患者から得られた第一の生物学的サンプルを、配列番号２２に示される核酸配列を含むポリヌクレオチドに特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと接触させる工程；
    （ｂ）該第一のサンプル中のポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの量を検出する工程；ならびに
    （ｄ）該第一のサンプル中のポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの量を、癌を有さないことが既知の正常なコントロール被験体から得られた第二の生物学的サンプル中のポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの量と比較する工程であって、
    ここで、該第二のサンプル中のポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの量と比較して、該第一の生物学的サンプル中のポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの量における統計的に有意な減少は、該患者における癌の存在を示す、
    方法。
  47. 変更されたスフィンゴ脂質代謝に関連する疾患を診断するための方法であって、該方法は、以下：
    （ａ）少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、かつ該変更されたスフィンゴ脂質代謝に関連する疾患を有することが疑われる患者から得られた第一の生物学的サンプルを、配列番号２２に示される核酸配列を含むポリヌクレオチドに特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと接触させる工程；
    （ｂ）該第一のサンプル中のポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの量を検出する工程；ならびに
    （ｄ）該第一のサンプル中のポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの量を、変更されたスフィンゴ脂質代謝に関連する疾患を有さないことが既知の正常なコントロール被験体から得られた第二の生物学的サンプル中のポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの量と比較する工程であって、
    ここで、該第二のサンプル中のポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの量と比較して、該第一の生物学的サンプル中のポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの量における統計的に有意な減少は、該患者における変更されたスフィンゴ脂質代謝に関連する疾患の存在を示す、
    方法。
  48. 患者において、変更されたスフィンゴ脂質代謝に関連する疾患を処置するための方法であって、請求項１、２０、２４および３０のいずれか１項に記載の方法に従って同定された薬剤を該患者に投与する工程を包含する、方法。
  49. 前記疾患が、結腸癌、乳癌、子宮癌、胃癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、直腸の腺癌、遺伝性感覚ニューロパシー１型、およびスフィンゴリピドーシス（ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄｏｓｅｓ）の任意の１つからなる群より選択される、請求項４９に記載の方法。
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