MXPA02004294A

MXPA02004294A - Gen de esfingosina cinasa de humano.

Info

Publication number: MXPA02004294A
Application number: MXPA02004294A
Authority: MX
Inventors: Gosink Mark
Original assignee: Warner Lambert Co
Priority date: 1999-10-28
Filing date: 2000-10-27
Publication date: 2002-10-31
Also published as: BR0015138A; WO2001031029A2; JP2003512072A; AU1020201A; CA2389127A1; EP1228221A2; WO2001031029A3

Abstract

La presente invencion se refiere al gen de esfingosina cinasa tipo 1 de humano; mas precisamente la invencion se refiere a un acido nucleico purificado o aislado de dicha esfingosina cinasa o a una secuencia complementaria al mismo, o fragmentos del mismo; la invencion incluye oligonucleotidos, polipeptido recombinante, efectores recombinantes, celulas hospedera recombinantes que comprende dicho acido nucieico, asl como a la produccion de anticuerpo, metodos de seleccion, oligonucleotido antisentido, mamiferos knock out.

Description

GEN DE ESFINGOSINA CINASA DE HUMANO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al gen de esfingosina cinasa de humano tipo 1. Más precisamente la invención se refiere a un ácido nucleico purificado o aislado de dicha esfingosina cinasa de una secuencia complementaria al mismo, fragmentos del mismo. La invención incluye oligonucleótidos, polipéptidos recombinantes, vectores recombinantes, células hospederas recombinantes que comprende dicho ácido nucleico, así como a la producción de anticuerpo, métodos de selección, oligonucleótidos antisentido, mamíferos knock out.

ANTECEDENTES DE LA INVENCiON El esfingosin-1 -fosfato, el producto de la esfingosina cinasa, es una molécula de señalización importante con funciones intra y extracelulares. El ADNc a partir de la esfingosina cinasa de ratón se ha reportado recientemente y se describe en la solicitud de patente número WO 99/61581. Los SK1A y SK1B de ratón presumiblemente son formas procesadas alternativas. El procesamiento diferencial probablemente resulta en dos variantes de la secuencia del péptido N-terminal y la consecuencia del uso alternativo del exón codificante (Kohama et al., 1998).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION La presente invención se refiere al ácido nucleico purificado o aislado que codifica un ADNc de esfingosina cinasa de humano (en adelante hSK) o una secuencia complementaria al mismo. La sondas oligonucleótídos con iniciadores específicamente hibridan con un ácido nucleico que codifica hSK, a fragmentos del mismo o a una secuencia complementaria del mismo que también son parte de la invención así como la amplificación de ADN y los métodos de detección que utilizan dichos iniciadores y sondas. Un objetivo adicional de la presente invención se refiere a vectores recombinantes que comprenden cualesquiera de las secuencias de ácidos nucleicos descritas en la presente, y en particular vectores recombinantes que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una hSK recombinante. La invención también incluye vectores recombinantes de expresión que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica hSK recombinante. La invención también abarca células hospederas y mamíferos transgénicos no-humanos que comprenden en dichas secuencias de ácido nucleico a vectores recombinantes. La invención también se refiere a una hSK aislada recombinante.

La invención también se refiere polipéptido hSK o fragmentos peptídicos del mismo así como a anticuerpos específicamente dirigidos en contra de un péptido de hSK. La invención además se refiere a un método para la selección de moléculas candidatas las cuales son inhibidores de hSK. El método comprende los pasos de: -mezclar una hSK recombinante con una esfingosina, marcada con ATP y una molécula candidato de interés; y -medir el nivel de conversión de esfingosina a esfingosina-1-fosfato marcada (S1 P). La invención también se refiere a un equipo para la selección de moléculas candidato las cuales son inhibidores de hSK. El equipo comprende: -hSK recombinante; y, opcionalmente - ATP marcado y esfingosina. La invención también se refiere a inhibidores de hSK1 obtenidos a través del método de selección descrito anteriormente, análogos estructurales de los mismos, y su uso en el tratamiento o prevención de uno y/o varios estados de enfermedad seleccionados a partir de: procesos de enfermedades degenerativas tales como ateroesclerosis y fibrosis; trastornos neurodegenerativos; enfermedades cardiovasculares incluyendo ateroesclerosis, trombosis y dislipidemia; diabetes incluyendo la diabetes tipo I y tipo II y particularmente la diabetes tipo I; evento cerebrovascular; enfermedades autoinmunes e inflamatorias tales como esclerosis múltiple, psoriasis, epidermodisplasia verruciformis y artritis inflamatoria; enfermedades relacionadas con las células ayudadoras T-1; enfermedad pulmonar obstructiva crónica; asma; cáncer; hemostasia, evento cerebrovascular, enfermedad coronaria arterial, trastornos hematopoiéticos tales como leucemia, el proceso natural de cicatrización de heridas, infarto del miocardio, embriogénesis.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 ilustra el ADNc y secuencia pronosticada de aminoácidos de una esfingosina cinasa 1 de humano. Las figuras 2A y 2B muestran respectivamente la estructura secundaria pronosticada y regiones conservadas de la esfingosina cinasa tipo 1 de humano. La figura 3 ilustra el reconocimiento del sustrato hSK1. Las figuras 4A (4A1 , 4A2) y 4B (4B1 , 4B2) muestran que hSK1 tiene una alta especificidad para D-eritro-esfingosina e ilustran que hSK1 se inhibe por D,L-treo-dihidroesfingosina y N,N,diMetil-esfingosina. La figura 5A describe la expresión y localización celular de hSK1 fusionada con EGPF en el extremo N-terminal. La figura 5B ¡lustra la expresión y localización celular de hSK1 fusionada con EGPF en el extremo C-terminal.

La figura 6 muestran la actividad cinasa de proteínas hSK1 de fusión. La figura 7 describe los niveles de expresión de proteínas hSK1 de fusión. La figuras 8 muestran la distribución tisular del ARN mensajero de hSKL La figura 9 ilustra la comparación de la actividad hSK1 a partir de diferentes fuentes: células Cos7, células de bacterias, hSK1 parcialmente purificado a partir de células de insecto. La figura 10 ilustra la comparación de la actividad hSK1 a partir de diferentes fuentes: células Cos7, células bacterianas, células de insecto. La figura 11 describe las condiciones de crecimiento bacteriano para la optimización de hSK1 activamente expresado. La figura 12 muestra la comparación de la actividad de hSK1 expresado bajo diferentes condiciones de crecimiento bacteriano y expresado en células Cos. La actividad hSK1 bajo crecimiento bacteriano óptimo y condiciones de inducción (50 µM IPTG por 20 horas) es 40% de la actividad observada para los extractos de células Cos7 transfectadas. La figura 13 ¡lustra el papel fisiológico relevante de hSK1 probado mediante el uso de un oligonucleótido antisentido. La figura 14 muestra el vector para la construcción de la fusión hSK-EGFP (N-terminal) para la expresión en células de mamífero.

La figura 15 ilustra el vector para la construcción de la fusión hSK-EGFP (C-terminai) para la expresión en células de mamíferos. La figura 16 ilustra el sector para la construcción de hSK marcada con GST para la expresión en células bacterianas. La figura 17 muestra una electroforesis en gel de la purificación parcial de hSK1 a partir de células Sf21 de insecto. La figura 18 ¡lustra la subregulación antisentido de los niveles de proteína hSK1.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A) ADNc de esfinqosina cinasa de humano Un primer objetivo de la presente invención es un ácido nucleico purificado o aislado que codifica hSK, una secuencia complementaria al mismo. Otro objetivo de invención es un ácido nucleico purificado o aislado que tiene al menos 90%, preferiblemente 95%, más preferiblemente 98% y más preferiblemente 99% de entidad de nucleótidos con la secuencia nucleotídica de SEQ ID N°1 o de SEQ ID N°2, una secuencia complementaria a la misma. Un objetivo adicional de la presente invención es un ácido nucleico purificado o aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos 80%, preferiblemente 90%, más preferiblemente 95%, y más preferiblemente 98 o 99% de entidad de aminoácidos con el polipéptido de humano de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N°3 o con un fragmento peptídicos del mismo, una secuencia complementaria al mismo. Los polipéptidos que tienen identidad de aminoácidos con el hSK de la invención abarcan polipéptidos: -que tienen estructuras primarias que están relacionadas con el hSK de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N°3, debido a la alta identidad de secuencia entre las secuencias de aminoácidos; o -que están biológicamente relacionados a los polipéptidos de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N°3, ya sea debido a que estos polipéptidos homólogos se reconocen mediante anticuerpos específicamente dirigidos en contra de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N°3 y/o debido a que estos polipéptidos homólogos tienen la misma actividad biológica que los polipéptidos de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N°3, tal como por ejemplo la capacidad de convertir esfingosina hacia S1 P. El término "aislado", cuando se utiliza en la presente, requiere que el material se remueva a partir de su ambiente original (por ejemplo, el ambiente natural si éste ocurre de manera natural). Por ejemplo, un polinucleótido o un péptido que ocurre de manera natural presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o péptido, separado partir de algunos o de todos los materiales que coexisten en el sistema natural, está aislado. Dicho polinucleótido puede ser parte de un vector y/o dicho polinucleótido o péptido puede ser parte de una composición, e incluso estar aislado. Esto es así debido a que el vector o composición no es parte del ambiente original de la secuencia nucleotídica que contiene. El término "purificado" no requiere de pureza absoluta; más bien, se pretende como una definición relativa. La purificación de materiales iniciales o materiales naturales es de al menos un orden de magnitud, preferiblemente dos o tres órdenes, y más preferiblemente cuatro o cinco órdenes de magnitud se contemplan expresamente. A lo largo de la presente especificación, la expresión "secuencia nucleotídica" se utiliza para designar de manera indiferente un polinucleótido o un ácido nucleico. Más precisamente, la expresión "secuencia nucleotídica" abarca el material nucleico y la información de secuencia y no se restringe a la información de secuencia (es decir la sucesión de letras elegidas entre las cuatro letras de las bases) que bioquímicamente caracterizan una molécula específica de ADN, ARN. Puesto que se utilizan de manera intercambiable en la presente, los términos "oligonucleótidos", "ácidos nucleicos" y "polinucleótidos" incluyen ARN, cualquier tipo de ADN tal como ADN genómico, ADNc o secuencias híbridas de ARN/ADN de más de un nucleótido ya sea en forma de cadena sencilla o dúplex. Además de su significado general entendido por un experto en la técnica, el término "nucleótido" también se utiliza la presente para abarcar nucleótidos modificados los cuales comprenden al menos una de las siguientes modificaciones: (a) o de unión alternativa, (b) una forma análoga de purina, (c) una forma análoga de pirimidina, o (d) un azúcar análogo; (e) nucleótidos modificados tales como nucleótidos metilados, fosforilados, ubiquitinados. Para ejemplo de análogos de grupos de unión, purínas, pirimidinas, y azúcares, véase por ejemplo la publicación PCT N° WO 95/04064. Las secuencias polinucleotídicas de la invención pueden prepararse mediante cualquier método conocido, incluyendo métodos sintéticos, recombinantes, una combinación de estos así como a través de cualesquiera métodos de purificación conocidos en la técnica.

B) polinucleótidos hSK recombinantes La invención también abarca fragmentos polinucleótidos de un ácido nucleico que codifica el hSK1 de la invención. Estos fragmentos particularmente incluyen pero no se restringen a 1 ) aquéllos fragmentos que codifican un polipéptido de hSK el cual preferiblemente retiene su afinidad para esfingosina y 2) fragmentos nucleotídicos útiles tales como iniciadores o sondas de ácidos nucleicos para propósitos de amplificación o detección. Una modalidad más preferida de esta invención para un fragmento que codifica un polipéptido de hSK es un polinucleótido de secuencia SEQ ID NO: 8 que corresponde a una región de SK conservada entre las especies. De hecho los inventores han demostrado de una región de 80 aminoácidos de largo de hsK1 está conservada entre las especies (figura 8).

-Iniciadores o sondas Más particularmente, la presente invención se refiere a un polinucleótido purificado o aislado que comprende al menos 10 nucleótidos consecutivos de un ácido nucleico que codifica hSK descrito en la presente, preferiblemente al menos 10 nucleótidos consecutivos de la secuencia nucleptídica de SEQ ID N° 1 o de SEQ ID N° 2, o una secuencia complementaria a la misma. Estos ácido nucleicos consisten de una extensión continua que tiene un intervalo en longitud de 10, 12, 15, 18 o 20 a 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 250, 500 o 1000 nucleótidos, o se especifica como siendo de 10 ,12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 100, 200, 250, 500 o 1000 nucleótidos en longitud. En una modalidad particular de esta invención estos ácidos nucleicos son útiles como sondas con el objeto de detectar la presencia de al menos una copia de una secuencia nucleotídica que codifica hSK, más particularmente la presencia del menos una copia de una secuencia nucleotídica de SEQ ID N° 1 o de SEQ ID N° 2 una secuencia complementaria a las mismas un fragmento una variante de las mismas en una muestra. La secuencia de dichos ácidos nucleicos puede modificarse ligeramente (por ejemplo al sustituir un nucleótido por otro) sin afectar substancialmente la capacidad de dicha secuencia modificada para hibridar con la secuencia blanco de interés. Las sondas más preferidas son las siguientes: SK extremo 5' 49 (proximal al gen) CTGGGTCTTGTAGAAGAGCAGCAAGTGCT (SEQ ID NO: 14) SK extremo 5' 48 (proximal al gen) AGTTCACTGCAATCCTTTCTTATCTGGGTTCG (SEQ ID NO:15) SK extremo 3' (distal al gen) TTCTGTGGATGGAGAGCTGATGGTATGG (SEQ ID NO: 16) CAJA SK (región conservada) ATGAAGTGGTGAATGGGCTAATGGAACG (SEQ ID NO:17). Las sondas de ácidos nucleicos de la invención también pueden utilizarse para el análisis de los niveles de expresión y patrón de hSK, tal como los descritos en la solicitud PCT N° WO 97/05 277, el contenido total de la cual se incorpora en la presente como referencia. En otra modalidad de la invención estos ácidos nucleicos son útiles como iniciadores. Los iniciadores más preferidos son los siguientes: A = extremo 5' TAT GCT AGC ATG GAT CCA GAG GGC GGC (SEQ ID NO: 4) B = extremo 3' AAT GAA TTC TCA TAA GGG CTC TTC TGG (SEQ ID NO: 5) C = extremo 5' TTA GAA TTC CAC CAT GGA TCC AGC GGG CGG C (SEQ ID NO: 6) D = extremo 3' ATT ATC GTC GAC TAA GGG CTC TTC TGG CGG (SE ID NO: 7) E = extremo 5' TTA GAA TTC CAC CAT GGA TCC AGC GGG CGG C (SEQ ID NO: 10) F = extremo 3' AGT CGA GGC TGA TCA GCG AG (SEQ ID NO: 11 ).

-Polinucleótidos de hibridación La invención también se refiere a secuencias de ácidos nucleicos purificadas o aisladas que hibridan, bajo condiciones de hibridación severa, con un polinucleótido que codifica hSK o una secuencia complementaria a éste. Una modalidad preferida de la invención es una secuencia de ácido nucleico purificada o aislada que hibrida, bajo condiciones severas, con el ácido nucleico de 270 nucleótidos (SEQ ID NO: 22) que codifica la región conservada de 80 aminoácidos de hSK1. Como una modalidad ilustrativa, las condiciones de hibridación severas pueden definirse como sigue: -el paso de hibridación se conduce a 65°C en la presencia de amortiguador SSC 6x, solución de Denhardt 5x, SDS al 0.5% y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón.

El paso de hibridación se sigue por cuatro pasos de lavado: -dos lavados durante 5 minutos, preferiblemente a 65°C en amortiguador SSC 2x y SDS al 0.1 %; -un lavado durante 30 minutos, preferiblemente a 65°C en amortiguador SSC 2x y SDS al 0.1 %; -un lavado durante 10 minutos, preferiblemente a 35°C en amortiguador SSC 0.1x y SDS al 0.1%, debe entenderse que las condiciones de hibridación definidas anteriormente son adecuadas para ácidos nucleicos de aproximadamente 20 nucleótidos en longitud y que estas condiciones también pueden adaptarse para ácidos nucleicos más cortos o más largos, de conformidad con las técnicas bien conocidas en la técnica, por ejemplo aquellas descritas por Sambrook et al. (1989). La longitud apropiada para las sondas bajo una serie particular de condiciones de ensayo puede determinarse empíricamente por un experto en la técnica. Las sondas pueden prepararse mediante cualquier método conocido incluyendo, por ejemplo, clonación y restricción de secuencias apropiadas y síntesis química directa mediante un método tal como el método de fosfodiéster de Narang et al. (1979), el método de fosfodiéster de Brown et al., (1979), el método de dietilfosforamidita de Beaucage et al. (1981 ) y el método de soporte sólido descrito en la solicitud N° EP-0 707 792. La descripción de todos estos documentos se incorpora en la presente como referencia.

Cualesquiera de los ácidos nucleicos de la presente invención puede marcarse, si se desea, mediante la incorporación de una marca detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, autorradiográficos, radioquímicos, inmunoquímicos, o químicos. Por ejemplo, las marcas útiles ¡ncluyen sustancias radioactivas (32P, 35S, 3H, 125l), colorantes fluorescentes (5-bromodesoxiuridina, fluoresceína, acetaminofluoreno, digoxigenina) o biotina. Los ejemplos de marcado no radiactivo de fragmentos de ácidos nucleicos se describen en la patente francesa N° FR-78 10975 o por Urdea et al. (1988) o Sánchez-Pescador et al. (1988). De manera ventajosa, las sondas de conformidad con la presente invención pueden tener estructuras y características tales que permitan la amplificación de la señal, dichas características estructurales siendo, por ejemplo, aquellas de sondas de ADN ramificadas como se describen por Urdea et al. (1991 ). Cualesquiera de las sondas de ácidos nucleicos de la presente invención pueden ser convenientemente inmovilizadas sobre un soporte sólido. Los soportes sólidos se conocen por los expertos en la técnica e incluyen las paredes de pozos de una charola de reacción, tubos de ensayo, glóbulos de poliestireno, glóbulos magnéticos, tiras de nitrocelulosa, membranas, micropartículas tales como particular de látex, eritrocitos de oveja, duracitos y otros.

Los ácidos nucleicos de la invención y particularmente las sondas nucleotídicas descritas anteriormente pueden entonces unirse a o inmovilizarse sobre un soporte sólido individualmente un grupo de al menos 2, 5, 8, 10, 12, 15, 20 o 25 ácidos nucleicos distintos de la invención a un soporte sólido particular. En una modalidad específica de un soporte en el cual las sondas de ácidos nucleicos de la invención se inmovilizan, dicho soporte también puede contener otras sondas inmovilizadas, preferiblemente sondas que hibridan específicamente con un ácido nucleico que codifica hSK, una variante del mismo, o una secuencia complementaria al mismo, más preferiblemente sondas que hibridan específicamente con el ácido nucleico de 240 nucleótidos (SEQ ID NO: 22) que codifica la región conservada de 80 aminoácidos de hSK1.

C) amplificación del ADNc de hSK Otro objetivo de la invención consiste de un método para la amplificación de un ácido nucleico que codifica una hSK, dicho método comprende los pasos de: (a) mezclar una muestra prueba que se sospecha que contiene el ácido nucleico blanco hSK, un fragmento o una variable del mismo, o una secuencia complementaria del mismo, con un reactivo para reacción de amplificación que comprende un par de iniciadores de amplificación como se describen la presente los cuales pueden hibridar bajo condiciones severas, a la región del ácido nucleico hSK a ser amplificada, y (b) opcionalmente, detectar los productos de amplificación. En una primera modalidad preferida del método anteriormente mencionado, el ácido nucleico codifica un polipéptido hSK de SEQ ID N° 3. En una segunda modalidad preferida del método de amplificación anteriormente mencionado, el producto de amplificación se detecta mediante hibridación con una sonda marcada en una secuencia la cual es complementaria a la región amplificada. La invención también se refiere a un equipo para la amplificación de un ácido nucleico que codifica hSK, un fragmento o una variante del mismo, o una secuencia complementaria al mismo en una muestra prueba, en donde dicho equipo comprende: (a) un par de iniciadores oligonucleótidos como se describe en la presente invención ios cuales pueden hibridar, bajo condiciones severas al ácido nucleico hSK a ser amplificado; (b) opcionalmente, los reactivos necesarios para llevar a cabo la reacción de amplificación. En una primera modalidad preferida del equipo descrito anteriormente, el ácido nucleico a ser amplificado codifica el polipéptido hSK de SEQ ID N° 3. En una segunda modalidad preferida del equipo de amplificación anteriormente mencionado, el producto de amplificación se detecta mediante hibridación con una sonda marcada que tiene una secuencia que es complementaria a la región amplificada. D) Vectores recombinantes y células hospederas para la expresión de un hSK recombinante 1 ) Vectores recombinantes La presente invención también abarca una familia de vectores recombinantes que comprenden cualesquiera de los ácidos nucleicos descritos en la presente. Principalmente, la invención trata de un vector recombinante que comprende un ácido nucleico seleccionado a partir del grupo que consiste de: (a) un ácido nucleico purificado o aislado que codifica el polipéptido hSK, y más preferiblemente un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de aminoácidos con el polipéptido de SEQ ID N° 3, una secuencia complementaria al mismo; o (b) un polinucleótido purificado o aislado que comprende al menos 10 nucleótidos consecutivos de un ácido nucleico descrito en (a) o una secuencia complementaria al mismo. En una primera modalidad preferida un vector recombinante de la invención se utiliza para introducir el polinucleótido insertado derivado a partir del ácido nucleico que codifica el polipéptido hSK en una célula hospederas adecuada, este polinucleótido siendo amplificado cada vez que el vector recombinante se replica.

Los vectores recombinantes de expresión comprenden un ácido nucleico que codifica polipéptidos hSK que se describen en la presente especificación y también son parte de la invención. Otra modalidad preferida de los vectores recombinantes de conformidad con la invención consiste de vectores de expresión que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido hSK de la invención, y más preferiblemente un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 3. Los vectores preferidos comprenden una secuencia de ácido nucleico como se muestra en SEQ ID N° 1 o SEQ ID N° 2. Dentro de ciertas modalidades, los vectores de expresión pueden emplearse para expresar un polipéptido recombinante hSK el cual puede ser entonces purificado y por ejemplo, ser utilizado como un inmunógeno con el objeto de generar anticuerpos específicos. Los vectores eucariontes preferidos de la invención se listan a continuación como ejemplos ilustrativos pero no limitantes: pcDNA3, pFLAG, pCMV-Script, pIND, pMCI NEO, pHIL, pGAPZA, pMT?/5-His-TOPO, pMT?/5-His, pAc5.1/V5-HisA, pDS47/V5-His, pcDNA4, pcDNA6, pEF1 , pEF4, pEF6, pUB6, pZeoSV2, pRc/CMv2, pcDMd, pCR3.1 , pDisplay, pSecTag2, pCP22, pEMZ, pCMV/Zeo, pSinRepd, pCEP, pREP, pHook-1. Los vectores pcDNA3, pFLAG, y pCMV (particularmente pCMV5) son más preferidos.

Los vectores recombinantes bacteriófagos preferidos de la invención son los vectores bacteriófagos P1 tales como se describen por Stemberg N. L. (1992; 1994). Un vector adecuado para la expresión de un hSK recombinante es un vector baculovirus que puede propagarse en células de insecto y en líneas celulares de insecto tales como Sf9 y Sf21. Los vectores hospederos específicos adecuados incluyen, pero no se restringen a pFastBac-1 , plZ?/5-His, pBacMan-1 , pBlueBacHis2, pMelBacA, pVL1392, pVL1393. El vector baculovirus preferido es pFastBacHTa. Un vector bacteriano preferido es pGEX. a) Secuencias reguladoras de expresión La expresión requiere que las señales apropiadas se provean en los vectores, dicha señales incluyen varios elementos reguladores tales como potenciadores/promotores a partir tanto de fuentes virales como de mamífero que dirigen la expresión de los genes de interés en células hospederas. La secuencias reguladoras de los vectores de expresión de la invención están operativamente unidas al ácido nucleico que codifica el hSK recombinante. Como se utiliza la presente, el término "operativamente unido" se refiere a una unión de elementos polinucleótidos en una relación funcional.

Por ejemplo, un promotor o un potenciador está operativamente unido a una secuencia codificante si éste afecta la transcripción de la secuencia codificante.

Más precisamente, dos moléculas de ADN (tales como un polinucleótido que contiene una región promotora y un polinucleótido que codifica un péptido o polinucleótido deseado) se dice que están "operativamente unidas" si la naturaleza de la unión entre los dos polinucleótidos no: (1 ) resulta en la introducción de una mutación de cambio de marco o (2) interfiere con la capacidad del polinucleótido que contiene el promotor para dirigir la transcripción del polinucleótido codificado. Generalmente, los vectores recombinantes de expresión incluyen orígenes de replicación, marcadores de selección que permiten la transformación de la célula hospedera, y un promotor derivado a partir de un gen altamente expresado para dirigir la transcripción de una secuencia estructural hacia abajo de la cascada de procesamiento. La secuencia estructural heteróloga se ensambla en un marco apropiado con las secuencias de traducción, inicio y terminación, y preferiblemente una secuencia líder capaz de dirigir la secuencia de la proteína traducida dentro del espacio periplásmico o al medio extracelular. En una modalidad específica en donde el vector se adapta para transfectar y expresar secuencias deseadas en células hospederas eucariontes, los vectores preferidos comprenden un origen de replicación a partir del hospedero deseado, un promotor adecuado y un potenciador, y también cualquier sitio necesario de unión al ribosoma, sitio de poliadenilación, secuencia de terminación transcripcional, y opcionalmente secuencias no transcritas flanqueadas hacia 5'.

Las secuencias de ADN derivadas a partir del genoma viral SV 40, por ejemplo promotor temprano del origen de SV 40, potenciador, y sitios de poliadenilación pueden utilizarse para proveer los elementos genéticos requeridos no transcritos, otro promotor adecuado es el promotor CMV. b) Secuencias promotoras Las regiones promotoras adecuadas utilizadas en los vectores de expresión de conformidad con la invención se dirigen tomando en cuenta la célula hospedera en la que los ácido nucleicos heterólogos tienen que expresarse. Un promotor adecuado puede ser heterólogo con respecto al ácido nucleico para el cual éste controla la expresión, o alternativamente puede ser endógeno al polinucleótido nativo que contiene la secuencia codificante a ser expresada. Adicionalmente, el promotor generalmente es heterólogo con respecto a la secuencias de vectores recombinantes dentro de las cuales la construcción promotor/secuencia codificante ha sido insertada. 2) células hospederas recombinantes La células hospederas que han sido transformadas o transfectadas con uno de los ácido nucleicos escritos en la presente invención, o con uno de los vectores recombinantes, particularmente el vector recombinante de expresión, descrito en la presente también son parte de la presente invención. Se incluyen las células hospederas que están transformadas (células procariontes) o están transfectadas (células procariontes) con un vector recombinante tal como uno de aquellos descritos anteriormente. La células hospederas preferidas utilizadas como recipientes para los vectores de expresión de la invención son las siguientes: (1) células hospederas procariontes: células bacterianas y más particularmente cepas de Escherichia coli (es decir cepas BL21 , DH10 Bac). Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y cepas a partir especies tales como Pseudomonas, Streptomices y Staphylococcus; células Sf-9 (ATCC N° CRL 1711), células Sf 21. (2) células hospederas eucariontes: células HeLa (ATCC N° CCL 2; N° CCL 2.1 ; N° CCL 2.2), células Cv 1 (ATCC N° CCL 70), células COS (ATCC N° CRL 1650; N° CRL 1651), células C127 (ATCC N° CRL-1804), células 3T3 (ATCC N° CRL-6361), células CHO (ATCC N° CCL-61), células de riñon humano 293 (ATCC N° 45504; N° CRL-1573), BHK (ECACC N° 84100 501 ; N° 84111301 ) y células hi-5. Más particularmente, la expresión del hSK recombinante de la invención en células COS-7 o en células bacterianas es una modalidad preferida de la invención.

Los resultados reportados en los ejemplos a continuación muestran que la expresión en Cos 7 y en bacteria es adecuada para la producción de una cantidad importante de esfingosina cinasa.

E) Producción de hSK recombinante La presente invención también se refiere a un método para producir una de la secuencias de aminoácidos descritas en la presente y especialmente el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 3, en donde dicho método comprende los pasos de: (a) insertar el ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos deseada en un vector apropiado; o en una célula hospedera; (b) cultivar, en un medio de cultivo apropiado, una célula hospedera previamente transformada o transfectada con el vector recombinante del paso (a); (c) cosechar el medio de cultivo así obtenido o lisar la célula hospedera, por ejemplo mediante sonicación o choque osmótico; (d) separar o purificar, a partir de dicho medio de cultivo, o a partir del concentrado del lisado resultante de célula hospedera, el polipéptido recombinante de interés así producido. En algunos casos, puede requerirse marcar el hSK antes de su purificación. La marca entonces en la mayoría de los casos se codifica dentro de la secuencia nucleotídica que se necesita para expresar el polipéptido. Los ejemplos de dichas marcas incluyen, pero no se limitan a secuencias que codifican C-myc, BANDERA, una secuencia de residuos de histidina, hemaglutinina A, V5, Xpress o GST. La mayoría de estas marcas puede incorporarse directamente dentro de la secuencia, por ejemplo mediante amplificación de PCR al incorporar la secuencia codificante apropiada en uno de los iniciadores de amplificación mediante PCR. Una marca preferida es el octapéptido BANDERA (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, SEQ ID NO: 23) la cual se utiliza para expresar el hSK recombinante del invención como una proteína de fusión. Ambas proteínas de fusión amino-terminal y carboxilo-terminal BANDERA caen dentro del alcance de la presente invención. En modalidades preferidas, las proteínas de fusión BANDERA se producen a través de vectores que son derivados a partir del vector pCMV-5. Más particularmente, un vector pFLAG-CMV-1 o pFLAG-CMV-2 puede ser utilizado para marcar el amino terminal mientras que un vector pFLAG-CMV-5a, 5b o 5c puede ser utilizado para marcar el carboxilo terminal. Sin embargo, la marca también puede introducirse por otros medios tales como uniones covalentes de la secuencia de ácido nucleico apropiada que codifica la porción de marca con el extremo 3' o 5' de la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia del polipéptido. Este es el caso para GST. La purificación del hSK recombinante de conformidad con la presente invención se lleva a cabo entonces al pasar la muestra sobre una columna de cromatografía de níquel o columna de cromatografía por afinidad a cobre, tal como una columna Ni NTA. En otra modalidad del método anteriormente mencionado, el polipéptido así producido se caracteriza adicionalmente, por ejemplo mediante la unión sobre una columna de cromatografía de inmunoafinidad sobre la cual los anticuerpos policlonales o monoclonales dirigidos al hSK se han inmovilizado previamente. De conformidad con los resultados de velocidad de producción es mayor para la expresión en células bacterianas que para la expresión en células de insecto.

F) hSK recombinante purificado Otro objetivo de la presente invención consiste de un polipéptido recombinante purificado o aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de hSK. Los polipéptido recombinantes aislados preferidos de la invención incluyen aquellos que tienen ai menos 80%, preferiblemente 90%, más preferiblemente 95%, y más preferiblemente 98 o 99%, de identidad de aminoácidos con el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 3. El extracto de células de insecto infectadas expresar un hSK1 marcado puede purificarse a través de una columna de resina que tiene afinidad por la marca.

En una modalidad particular, el extracto de células de insecto infectadas expresar un hSK1 marcado con 6His se corre a través de una columna de resina NI-NTA. En otra modalidad, el extracto de células de insecto infectadas expresar un hSK1 marcado con GST se purifica a través de una resina de glutatión.

G) hSK recombinante modificado La invención también se refiere a un polipéptido hSK recombinante que comprende cambios de aminoácidos en el intervalo de 1 , 2, 3, 4, 5, 10, 20, 25, 30, 35, 40 sustituciones, adiciones o deleciones de un aminoácido con respecto a los polipéptidos de cualesquiera de las secuencias de aminoácidos de la presente invención. Las secuencias preferidas son aquellas de SEQ ID N° 3. Los cambios de aminoácidos abarcados son aquellos que no eliminan la actividad biológica del polipéptido modificado resultante. Estos aminoácidos equivalentes pueden determinarse ya sea por su homología estructural con los aminoácidos iniciales a ser reemplazados, mediante la similitud de su carga neta o de su hidrofobicidad, y opcionalmente mediante los resultados de la inmunogenicidad cruzada entre el tejido parental y las contrapartes modificadas. Alternativamente, en el caso de una sustitución de aminoácido en la secuencia de aminoácidos del polipéptido de conformidad con la invención, uno o varios aminoácidos consecutivos o no consecutivos se reemplazan por aminoácidos "equivalentes". La expresión aminoácido "equivalente" se utiliza en la presente para designar cualquier aminoácido que puede ser sustituido por uno de los aminoácidos que pertenecen a la estructura proteica nativa sin disminuir las propiedades de unión de los péptidos correspondientes a los anticuerpos generados en contra de los polipéptidos de la invención. En otras palabras, los aminoácidos "equivalentes" son aquellos que permiten la generación de la síntesis de un polipéptido con una secuencia modificadas cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos hSK recombinantes de interés, dicho polipéptido modificado siendo capaz de unir los anticuerpos generados en contra del hSK recombinante de interés y/o de inducir anticuerpos que reconocen el polipéptido parental. Los péptidos que contienen uno o varios aminoácidos "equivalentes" deben retener sus propiedades de especificidad y afinidad a los blancos biológicos de la proteína parental, como esto se puede evaluar mediante un ensayo de unión a ligando o un ensayo ELISA. Los ejemplos de aminoácidos que pertenecen a las clases específicas incluyen aminoácidos Ácidos (Asp, Glu), Básicos (Lys, Arg, His), No polares (Ala, Val, Leu, lie, Pro, Met, Phe, Trp) o Polares no cargados (Gly, Ser, Thr, Lys, Tyr, Asn, Gln). Preferiblemente, una sustitución de un aminoácido en un hSK recombinante de la invención, o en un fragmento peptídico del mismo, consiste en el reemplazo de un aminoácido de una clase particular por otro aminoácido que pertenecen a la misma clase. Mediante un aminoácido equivalente de conformidad con la presente invención también se contempla el reemplazo de un residuo en la forma L por un residuo en la forma D o el reemplazo de un residuo de ácido Glutámico (E) por un compuesto de ácido Piro-glutámico. La síntesis de péptidos que contienen al menos un residuo en la forma D se describe, por ejemplo, por Koch (1977). Una modalidad específica de un péptido modificado de interés de conformidad con la presente invención, incluye, pero no se limita, una molécula peptídica, la cual es resistente a la proteólisis. Este es un péptido en el que en enlace peptídíco -CONH-0 modificado y se reemplaza por un enlace reducido (CH2NH), un enlace retro inverso (NHCO) un enlace metilen-oxi (CH2-0), un enlace tiometileno (CH2S), un enlace de carbono (CH2CH2), un enlace cetometileno (CO-CH2), un enlace hidroxietileno (CHOH-CH2), un enlace (N-N) un enlace E-alceno o también un enlace -CH=CH-. La invención también abarca un hSK recombinante en el que al menos un enlace peptídico ha sido modificado como se describió anteriormente. Los polipéptidos de conformidad con la invención también pueden prepararse mediante los métodos convencionales de síntesis química, ya sea en una solución homogénea o en una fase sólida. Como una modalidad ilustrativa de dichas técnicas de síntesis química de polipéptidos, se puede citar la técnica de solución homogénea descrita por Houbenweyl (1974). El hSK recombinante de interés, un fragmento del mismo puede entonces prepararse mediante síntesis química en fase líquida o sólida mediante acoplamientos sucesivos de los diferentes residuos de aminoácidos a ser incorporados (a partir del extremo N- terminal al extremo C-terminal en la fase líquida, o a partir del extremo C-terminal al extremo N-terminal en la fase sólida) en donde los extremos N-terminales y las cadenas laterales reactivas se bloquean previamente mediante grupos convencionales. Para la síntesis en fase sólida, la técnica descrita por Merrifield (1965a; 1965b) puede ser utilizada en particular.

H) Producción de anticuerpos El hSK recombinante de interés de la invención y sus fragmentos peptídicos pueden ser utilizados para la preparación de anticuerpos. Los anticuerpos policlonales pueden prepararse mediante la inmunización de un mamífero, especialmente un conejo, una oveja, un mono, un caballo o una cabra con un polipéptido de conformidad con la invención que se combina con un adyuvante de inmunidad, y entonces se purifican los anticuerpos específicos contenidos en el suero del animal inmunizado sobre una columna de cromatografía por afinidad sobre la cual ha sido inmovilizado previamente el polipéptido que se ha utilizado como el antígeno.

Los anticuerpos monoclonales a partir de mamíferos especialmente partir de ratón o de rata pueden prepararse de hibridomas de conformidad con la técnica descrita por Kohler y Milstein (1975). La presente invención también trata de anticuerpos producidos mediante la técnica trioma y mediante la técnica de hibridoma en células B de humano, tal como la descrita por Kozbor et al. (1983). Los anticuerpos de la invención también incluyen fragmentos de anticuerpos Fv quiméricos de cadena sencilla (patente de E.U.A. N° 4,946,778; Martineau et al., (1998), fragmentos de anticuerpos obtenidos a través de librerías de exhibición del fago por Ridder et al. (1995) y anticuerpos humanizados (Leger et al., 1997)).

I) ensayo para la selección de inhibidores de hSK La esfingosina cinasa convierte sustrato esfingosina a esfingosina-1 -fosfato (S1 P). S1 P se quede que desempeña varios papeles en procesos fisiológicos. Algunos de los papeles fisiológicos potenciales de S1 P ¡ncluyen: 1) dentro de las células: liberación de calcio a partir de los almacenes; activación de las cinasas dependientes ciclina; intermediario de señalización clave en las cascadas iniciadas por el receptor Fc; liberación de enzima inducida porfMLP; expresión de la molécula de adhesión inducida por TNF-ALFA (células endoteliales); y depresión de la excitabilidad en los miocitos ventriculares. La esfingosina cinasa parece desempeñar un papel pivotal en activación de la cascada de señalización iniciada en Fc? Rl mediante la modulación del balance de los lípidos contrarreguladores (Prieschl et al., 1999). Además, PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas) induce altos niveles de actividad de esfingosina cinasa y generación de S1 P en plaquetas (Yatomi et al., 1997; Yatomi et al., 1995). En la células endoteliales de vena umbilical de humano, TNF a, una citosina pleiotrópica, induce el activación de la esfingosina cinasa y la generación de S1 P el cual a su vez puede servir como un segundo mensajero para mediar la activación de la célula endotelial inducida por TNF a y la expresión de la molécula de adhesión (Xia et al., 1998). También, en los osteoclastos el monofosfato de esfingosina desempeña un papel de segundo mensajero para la síntesis de IL-6 (¡nterleucina 6) inducida por TNF a (Tokuda et al., 1999). Estas propiedades indican fuertemente un papel potencialmente importantes de S1 P y por lo tanto de la esfingosina cinasa misma en el dolor, así como en la inflamación, particularmente herida seguida por inflamación. Se ha mostrado adicionalmente que S1 P protege de la apoptosis. Más particularmente, S1 P previene la aparición de la fragmentación del ADN ¡ntranucleosomal y los cambios morfológicos es una característica principal de la apoptosis (Spiegel et al, 1998). Además, se ha demostrado que S1P es mediador clave del efecto mitogénico de LDLox (lipoproteína de baja densidad oxidada) el cual ha sido implicado en diversos eventos biológicos que llevan al desarrollo de lesiones ateroescleróticas (Auge et al., 1999). Como resultado, la esfingosina cinasa puede desempeñar un papel en condiciones tales como hemostasia, trombosis, evento cerebrovascular, ateroesclerosis, enfermedad arterial coronaria y dislipidemia. Una alta concentración celular de esfingosina actúa como un inhibidor potente de la síntesis de leucotrieno mediada por antígeno a ¡nmunoglobulina (lg)E+ y producción de citosína al prevenir la activación de la ruta de protein cinasa activada por el mitógeno. En contraste, altos niveles intracelulares de esfingosina-1 -fosfato, también secretados por la células cebadas estimuladas alérgicamente, activan la ruta de la proteín cinasa activada por el mitógeno, resultando en liberación de hexosaminidasa y leucotrieno o, en combinación con ionomicina, la producción de citosina. Por lo tanto, el balance entre la esfingosina y el S1 P modular la respuesta alérgica de la células cebadas (Prieschl et al., 1999). Como un resultado, los inhibidores de esfingosina cinasa puede ser útiles para prevenir reacciones alérgicas. Se ha demostrado previamente que la actividad de esfingosina cinasa se estimula mediante promotores tumorales tales como 12-0- tetradecanoilforbol-13-acetato. Por lo tanto, uno puede inferir que la estimulación excesiva de la actividad esfingosina cinasa puede llevar al desarrollo de enfermedades proliferan activas. Por otra parte, la inhibición de la esfingosina cinasa previno el efecto de supervivencia de 1 ALFA, 25-dihidroxivitamina D3 (1 ,25-(OH)2D3), un agente citoprotector, en células HL-60 de leucemia promielocítica de humano (Kleuser et al., 1998). Por lo tanto, los inhibidores de esfingosina cinasa pueden ser útiles en la prevención y tratamiento de enfermedades proliferativas incluyendo cáncer, trastornos hematopoiéticos tales como leucemia. 2) cuando se libera a partir de las células: proliferación; quimotaxis (atracción y activación de macrófagos); cambios citoesqueléticos (formación de fibras de tensión y contracción de la forma celular, agregación y secreción); medios de unión: ensamblaje de la matriz de fibronectina; y ensamblaje y fosforilación de paxilina y p125-FAK. Más particularmente, la esfingosina cinasa desempeña un papel en la liberación de Ca2+ a través de la señalización de Ca2+ inducida por GPCR (receptores acoplados a la proteína G). (Meyer et al, 1998). S1 P se libera a partir de plaquetas activadas en grandes cantidades. (Yatomi et al., 1995). Esto podría indicar un papel potencial de S1 P en la trombosis, hemostasis, el proceso de cicatrización natural de heridas, ateroesclerosis, evento cerebrovascular, infarto del miocardio.

Además, S1P estimula la unión de fibronectina o de su fragmento N-terminal de 70 Kd a las células. La organización de la fibronectina hacia la matriz extracelulares es un proceso estrechamente regulado, mediado por la unión reversible inicial por la región N-terminal de 70 Kd de la fibronectina a los sitios de unión específicos en la superficie celular, seguido por la insolubilización hacia fibrillas. La información adhesiva presente después de la insolubilización de la fibronectina se postula que desempeña un papel central en varios procesos fisiológicos y patofisiológicos, ¡ncluyendo embriogénesis, cicatrización, inflamación, y procesos de enfermedades degenerativas tales como ateroesclerosis y fibrosis. (Windh et al., 1999). Más particularmente, S1P puede tener un papel probable en la ateroesclerosis y fibrosis temprana. Como una consecuencia, la inhibición adecuada de esfingosina cinasa puede ser útil en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares incluyendo ateroesclerosis, trombosis y dislipidemia, diabetes incluyendo diabetes tipo I y II y particularmente diabetes tipo I, evento cardiovascular, enfermedades autoinmunes e inflamatorias tales como esclerosis múltiple, psoriasis, epidermodisplasia verruciformis y artritis inflamatorias, enfermedades relacionadas con las células T ayudadoras-1 , enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma, cáncer y trastornos neurodegenerativos. El aislamiento de una secuencia nucleotídica que codifica esfingosina cinasa de humano es útil en tanto que permite que la persona experta seleccione inhibidores adecuados de esfingosina cinasa. Estos inhibidores o análogos estructurales de los mismos pueden entonces utilizarse para tratar o prevenir uno y/o varios de los estados de enfermedad referidos anteriormente. El término "análogo estructural" se pretende que designe compuestos los cuales tienen una estructura base química común con los inhibidores iniciales identificados a través de los ensayos de selección de la invención pero cuyos sustituyentes solos, han sido modificados para fomentar o mejorar las propiedades de los inhibidores iniciales tales como actividad biológica, efectos laterales reducidos, solubilidad mejorada, biodisponibilidad mejorada y similares. Varios formatos de ensayo puede utilizarse para llevar a cabo el método de la presente invención. Los formatos de ensayo referidos incluyen ensayos de centelleo tales como el ensayo de centelleo por proximidad (SPA) o el ensayo de placa instantánea. Otros formatos de ensayo son bien conocidos por los expertos de la técnica tales como el ensayo de unión a filtro y el ensayo de centrifugación que también se contemplan en la presente invención. Los ensayos SPA y de placa instantánea son formatos de ensayos preferidos para la presente invención. Los detalles adicionales sobre estos ensayos se proveen a continuación. La tecnología de ensayo por centelleo implica ya sea el uso de glóbulos centelleantes (para el ensayo SPA) o placas (para el ensayo de placa instantánea). Los glóbulos SPA usualmente se elaboran a partir de ya sea silicato de ¡on de ¡trio impurificado con cerio (y2S¡05:Ce) o poliviniltolueno (PVT) que contiene un centelleante orgánico tal como PPO. Las placas instantáneas comúnmente utilizadas son aquellas tales como las placas instantáneas que quelan Ni aunque otras placas instantáneas también pueden utilizarse. Los ensayos usualmente se llevan a cabo en amortiguadores acuosos que utilizan radioisótopos tales como 3H, 125l, 14C, 35S o 33P que emiten radiación de baja energía, la energía de la cual se disipa fácilmente en un ambiente acuoso. Por ejemplo, los electrones emitidos por 3H tienen una energía promedio de solamente 6 keV y tienen una longitud de ruta muy corta (-1 ~tm) en el agua. Si una molécula marcada con uno de estos isótopos se une a un glóbulos o una superficie de placa instantánea, ya sea directamente o mediante interacción con otra molécula previamente acoplada al glóbulos o placa instantánea, la radiación emitida activará el centelleante y producida luz. La cantidad de luz producida, la cual es proporcional a la cantidad de moléculas marcadas unidas a los glóbulos, puede medirse convenientemente con un contador de centelleo líquido (LS). Si la molécula marcada no está unidad al lóbulo o superficie de placa instantánea, su energía de radiación se absorbe por el solvente acuoso que la rodea antes de que ésta alcance el lóbulo, y no se produce luz. Por lo tanto, los ligandos unidos dan una señal de centelleo, pero los ligandos libres no lo hacen, y la necesidad del paso de separación que consume tiempo, característico de los ensayos de unión a radio ligandos convencionales, se elimina. Las manipulaciones requeridas en los ensayos se reducen a unos cuantos pasos simples de pipeteo que llevan a una mejor precisión y reproductibilidad.

En el contexto de la presente invención, una de las modalidades preferidas del ensayo incluye la unión de esfingosina a glóbulos de SPA o placas instantáneas. La unión se lleva cabo preferiblemente a través de BSA aunque otros medios de unión podrían ser contemplados. El medio de ensayo comprende hSK recombinantes y ATP marcado. Si el ligando candidato inhibe hSK recombinantes, la conversión de esfingosina no ocurrirá y se registrará una señal que no es sustancialmente diferente a partir del ruido de fondo. Por otra parte, si no ocurre inhibición de hSK, la conversión de esfingosina tomará lugar y se registrará una señal resultante a partir de la interacción entre S1 P marcado y la placa instantánea o glóbulos SPA.

J) Antisentido Los oligonucleótidos, es decir ARN, ADN tales como: ADN genómico, ADNc o secuencias híbridas ARN/ADN, que comprenden la hebra antisentido de la esfingosina cinasa tipo 1 de humano se utilizan para inhibir la expresión de esfingosina cinasa in vitro o in vivo. Por lo tanto la inhibición de la expresión de esfingosina cinasa permite el estudio del efecto de hSK1 en células, tejidos o animales.

K) animales Knock Out La determinación por los inventores de los 80 aminoácidos de la región conservada entre las especies presente en SK permite ahora el diseño de construcciones de polinucleótidos en donde la porción de ácido nucleico que codifica la región conservada de 80 aminoácidos; o una porción de éste ha sido deletada. En una modalidad preferida la construcción de polinucleótidos como se definió anteriormente contiene un polinucleótido genómico que codifica una SK a partir de la cual al menos una parte de la porción de ácido nucleico que codifica la región conservada de 80 aminoácidos ha sido deletada y en donde la porción de ácido nucleico se reemplaza por una secuencia polinucleotídica heteróloga. Dichas construcciones pueden incluirse en vectores con el objeto de reemplazar una porción de la secuencia de esfingosina cinasa que ocurre de manera natural dentro del genoma de un mamífero mediante recombinación homologa. De conformidad con esta modalidad específica, dicho vector recombinante de la invención puede utilizarse para generar animales knock-out, preferiblemente mamíferos knock-out, más preferiblemente ratones y ratas knock-out. En una primera modalidad del ácido nucleico anteriormente mencionado, el polinucleótido genómico codifica una SK de humano, de ratón o de rata a partir de la cual la porción de ha sido nucleico que codifica la región conservada de 80 aminoácidos o una porción de ésta ha sido deletada. En una segunda modalidad del ácido nucleico anteriormente mencionado, los polinucleótidos heterólogos comprenden un marcador de selección.

En una tercera modalidad del ácido nucleico anteriormente mencionado, el polinucleótido heterólogos comprende al menos una secuencia loxP en su extremo 5' y al menos una secuencia loxP en su extremo 3'. La secuencia loxP está compuesta de dos secuencias palindrómicas de 13 pb separadas por una secuencia conservada de 8 pb (Hoess et al., 1986). La recombinación de la enzima Cre entre los dos sitios loxP que tienen una orientación idéntica lleva a la deleción del fragmento de ADN. El sistema Cre-loxP usaron combinación con una técnica de recombinación homologa se describe por GU et al. (1993, 1994). El vector que contiene la secuencia genómica SK en el que la secuencia que codifica la región conservada de 80 aminoácidos o una porción de esta ha sido deletada se diseña de tal manera que los marcadores de selección están flanqueados por sitios loxP de la misma orientación. Si es posible, mediante tratamiento del enzima Cre, para eliminar los marcadores de selección mientras que se relocaliza el polinucleótido genómico hSK de interés que ha sido insertado mediante un evento de recombinación homologa. Dos marcadores de selección se necesitan: un marcador de selección positivo para seleccionar el evento de recombinación y un marcador de selección negativo para seleccionar el evento de recombinación homólogo.

Los vectores y métodos que utilizan el sistema Cre-loxP se describe por ZOU et al. (1994). En la modalidad específica de los ácidos nucleicos de la invención en donde dicho ácido nucleico comprende el polinucleótido genómico que codifica la SK de ratón en la cual la porción de ácido nucleico que codifica la región conservada de 80 aminoácidos o una porción de ésta ha sido deletada, la persona experta en la técnica puede referirse ventajosamente a los ejemplos a continuación. En un aspecto adicional de la invención, un ácido nucleico que codifica un polipéptido como se definió anteriormente está operativamente unido a una secuencia reguladora. Preferiblemente, la secuencia reguladora consiste de un promotor inducible. Más preferiblemente, la secuencia reguladora consiste de un promotor simple por Ponasterona.

EJEMPLOS Material v métodos El medio de crecimiento incluyendo todos los suplementos se obtuvieron a partir de Gibco BRL (París, Francia). Los reactivos de transfección fueron a partir de QIAGEN (París, Francia). Todos los lípidos se obtuvieron a partir de Sigma-Aldrich (París, Francia). [ 32P]ATP y [?33P]ATP fueron de Amersham Pharmacia Biotech (Amersham, París, Francia). Los ARN poli A+ de humano de múltiples tejidos para Northern blot, y el vector de expresión de mamífero pcDNA3 se obtuvieron a partir de CLONTECH (Palo Alto, CA, E.U.A.). Las enzimas de restricción se obtuvieron a partir de New England Biolabs (Beverly, MA, E.U.A.). La clona EST-IMAGE 1946069 se obtuvo a partir de UK HGMP Resource Centre (Hinxton Cambridge, UK). Las células COS7 (células de fibroblastos de mono) se crecieron en medio Eagle modificado por Dulbecco que contenían 4, 500 mg/L de suero de bovino fetal al 10% suplementado con glucosa, glutamina 2 mM, penicilina 10 Ul/ml y estreptomicina 10 mg/ml a 37°C, dióxido de carbono al 6.5% en una atmósfera saturada con agua.

EJEMPLO 1 : Aislamiento del ADNc de esfinqosina cinasa de humano (hSK) Las investigaciones utilizando la secuencia de ADNc de esfingosina cinasa de murino recientemente clonada (Kohama et al., 1998) identificó un agrupamiento Est de humano y varias secuencias Est de humano en las bases de datos de agrupamientos de ADNc tanto públicas (Unigene) como locales (Compugen). El inserto de la clona IMAGE 1946069 un miembro del agrupamiento se secuenció y subclonó dentro del vector de expresión de mamífero pcDNA3. El inserto de 1.7 kb mostró un alto nivel de similitud (76%) al ADNc de SK1 de ratón y abarcó la región codificante completa. El alineamiento de la secuencia peptídica de las secuencias de ratón y de humano y la actividad biológica de la enzima expresada sugieren que el inserto de la clona IMAGE 1946069 contiene la región codificante del ADNc de SK de humano. Esto está de acuerdo con la secuencias peptídicas parciales de humano, deducidas a partir de la secuencias Est por Kohama et al (Kohama et al,. 1998). La secuencia de ADNc y secuencias peptídicas de hSK1 se muestran en la figura 1. El marco abierto de lectura del ADNc es de 1155 nucleótidos. El iniciador de la traducción ATG está en una región parcial consenso Kozak (Kozak, 1987). Los iniciadores de PCR son los siguientes: Iniciadores A y B: A = extremo 5' TAT GCT AGC ATG GAT CCA GAG GGC GGC (SEQ ID NO:4) B = extremo 3' AAT GAA TTC TCA TAA GGG CTC TTC TGG (SEQ ID NO: 5) Iniciadores C y D: C = extremo 5' TTA GAA TTC CAC CAT GGA TCC AGC GGG CGG C (SEQ ID NO: 6) D = extremo 3' ATT ATC GTC GAC TAA GGG CTC TTC TGG CGG (SE ID NO: 7) Estos iniciadores se utilizan para la amplificación de ADNc tal como amplificación por PCR.

EJEMPLO 2: Caracterización de esfingosina cinasa La secuencia peptídica pronosticada es de 384 aa (SEQ ID N° 3), con una masa pronosticada de 42.5 kD y un pl de 6.9 a pH neutral. La similitud de la SK1a de ratón es del 85% (índice de similitud Needleman Wunsch). Con excepción del C terminal, la similitud con la SK de ratón es contigua. La búsqueda de similitud peptídica identifica una región conservada de 80 aa (Arg16-Pro95) (SEQ ID N° 8) presente en varios péptidos conocidos e hipotéticos desde las bacterias hasta los humanos. (CAB14972 Bacillus subtilis; CAA18718 Arabidopsis thaliana; CAB11477 Saccharomyces pombe; S51398 Saccharomyces cerevisiae; SS67059 Saccharomyces cerevisiae; CAA91259 Caenorhabditis elegans; AAC67466 Caenorhabditis elegans; SK1a de ratón (SPHK 1a de ratón); hSK1 (huSPHK)). Los aminoácidos conservados se muestran en negro (figura 2B). Esta secuencia incluye una región distantemente relacionada a un péptidos señal corto, LVRSEELGRWDALWM (SEQ ID N° 9) de la familia de enzimas aldo-ceto reductasa dependiente de NADPH. Dentro de la región conservada de 80 aa, los residuos altamente conservados marcan características de similitud y características pronosticadas de las estructuras peptídicas secundarias en tres bloques. (Figura 2A). Los residuos conservados Asn22-Pro23 y Gly26 presentan un probable giro beta y una estructura en espiral, próxima a la secuencia GGKGK (SEQ ID NO: 24) la cual puede ser parte del sitio de unión a ATP también sugerido para la SK1 de ratón (Kohama et al., 1998). His59-Ala60 están indicados como expuesto sobre la superficie, mientras que Gly80-Asp81-Gly82 sugieren la presencia de una región flexible. El espaciamiento de Ans22-Pro23, y Gly26, en el bloque uno, Thr50, His59-Ala60, en el bloque dos y los residuos Gly80-Asp81-Gly82, Glu86 y Gly90 en el bloque tres de la región conservada son idénticos desde Bacillus subtílis hasta humanos.

EJEMPLO 3: Transfección de hSK1 Las células COS7 se transfectaron de manera transitoria de con el vector pcDNA3 sólo ocurre vector de contiene que el ADNc de esfingosina cinasa de humano, utilizando el reactivo Qiagen, Superfect. Las células se sembraron a 5 x 106 por pozo, en placas de seis pozos. Después de 24 horas, las células se transfectaron con 10 µg de vector (pcDNA3) mezclado con 20 µl de SuperFect, o con 10 µg de vector que contenían el ADNc de esfingosina cinasa de humano (pcDNA3-hSK1) mezclado con 20 µl de SuperFect.

EJEMPLO 4: Actividad esfingosina cinasa v ensayo de especificidad La actividad de esfingosina cinasa se ensayó como previamente se describió (Kohama et al., 1998). Brevemente, el actividad esfingosina cinasa se determinó, al incubar extractos celulares por 30 minutos a 37°C, en la presencia de esfingosina 50 µM, Tritón X-100 al 0.25%, y [33P] ATP (10 µCi, 1 mM), y MgCI2 (10 mM). La actividad cinasa se expresó como nanomoles de SSP/min/mg.

- Actividad hSK1 v caracterización del sustrato Para asegurarse de que hSK era de hecho una esfingosina cinasa funcional, las células COS7 se transfectaron con el ADNc de hSK1 que contiene el vector pcDNA3 y, después de 48 horas, la actividad de esfingosina cinasa se midió. Niveles bajos de actividad endógena de esfingosina cinasa estuvieron presentes en las células control (ya sea no transfectadas o transfectadas con el vector solo). Sin embargo, las células transfectadas con hSK (con 10 µg de ADN) generaron una actividad de esfingosina cinasa incrementada 107 veces (figura 3). La figura 3 muestra que hSK1 fosforila específicamente D-eritro-esfingosina (D-eritro-SPH), en un menor grado D,L-eritro-dihidroesfingosina (D,L-eritro-DHS). Esta cinasa no fosforila: ninguna de las formas "treo" de la dihidroesfingosina (D,L-treo-digidroesfingosina; L-treo-dihidroesfingosina; L-treo-dihidroesfingosina); ceramistas (hidroxi-ceramida; no-hidroxi-ceramida); diacilglicerol (DAG); fosfatidilinositol (Pl); fosfatidilinositol-4-fosfato (PIP); o fosfatidilinositol- 4, 5-bifosfato (PIP2). La especificidad de sustrato de la hSK expresada se encontró que similar a la de esfingosina cinasa de rata purificada (Olivera et al., 1998), y a una esfingosina cinasa de ratón recientemente clonada (Kohama et al., 1998). El mejor sustrato fue D-(+)-eritro-esfingosina, seguida por la D,L-er¡tro-dihidroesfingosina, ia cual se fosforiló al 50% de los niveles de fosforilación observados logrados por la D-(+)-eritro-esfingosina.

-Especificidad de sustrato e inhibición competitiva del hSK1 El hSK1 expresado muestra una cinética Michaelis-Menten típica (vMax = 56 nMoles/min/mg y Km = 5 µM) (figuras 4A (4A1 , 4A2) y 4B (4B1 , 4B2)). D,L-treo-dihidroesfingos¡na (en la figura 4A (4A1 , 4A2), DHS) y N,N-diMetil-esfingosina (N.DdiMS) son inhibidores conocidos de la esfingosina cinasa (Kohama et al., 1998). De conformidad con esto, los inventores muestran en la presente invención que ambos compuestos inhiben la actividad de hSK1 expresada. La cinasa se inhibe por D,L-treo-dihidroesfingosina (Ki = 3 µM), y N,N,diMetil-esfingosina (Ki = 5 µM).

EJEMPLO 5: construcciones de hSK fusionadas a EGFP (proteína fluorescente verde mejorada) Con el objeto de caracterizar y entender los mecanismos potenciales que regulan la actividad y localización células de hSK, los inventores hicieron dos construcciones hSK fusionadas a EGFP (proteína fluorescente verde mejorada), en cualquier extremo de la cinasa.

-Construcción de EGFP-hSK1 (fusión N-termínal) para expresión en mamífero Una reacción de PCR se llevó a cabo utilizando la construcción pcDNA3-hSK1 como un molde y los iniciadores diseñados para amplificar la secuencia codificante de hSK1 al mismo tiempo insertando los sitios de restricción de clonación en ambos extremos (Nhel-EcoRI) con el objeto de alinear el EGFP con la hSK1 y hacer la proteína de fusión en marco. Las construcciones portan el EGFP en el N-terminal de la hSK1. Iniciadores A y B: A = extremo 5' TAT GCT AGC ATG GAT CCA GAG GGC GGC (SEQ ID NO: 4) B = extremo 3' AAT GAA TTC TCA TAA GGG CTC TTC TGG (SEQ ID NO: 5) - construcción de EGFP-hSK1 (fusión C-terminal) para expresión en mamífero Una reacción de PCR se llevó a cabo utilizando la construcción pcDNA3-hSK1 como un molde y los iniciadores diseñados para amplificar la secuencia codificante de hSK1 al mismo tiempo insertando los sitios de restricción de clonación en ambos extremos (EcoRI-Sall) con el objeto de alinear la secuencia hSKIcon el EGFP y hacer la proteína de fusión en marco. Las construcciones portan el EGFP en el C-terminal de la hSK1. Iniciadores C y D: C = extremo 5' TTA GAA TTC CAC CAT GGA TCC AGC GGG CGG C (SEQ ID NO: 6) D = extremo 3' ATT ATC GTC GAC TAA GGG CTC TTC TGG CGG (SE ID NO: 7) - Transfección de hSK1 Las células COS7 se transfectaron de manera transitoriamente con el vector pcDNA3 sólo o con el vector que contiene que el ADNc de esfingosina cinasa de humano, utilizando el reactivo Qiagen, Superfect como se describió en el ejemplo 4.

-Transfección de EGFP-hSK1 (fusión N-terminal) Las células COS7 se transfectaron de manera transitoriamente con el vector pCI-EGFP1 sólo o con el vector que contiene que el ADNc de esfingosina cinasa de humano (véase figura 14), utilizando el reactivo Qiagen, Superfect. Las células se sembraron a 5 x 106 por pozo, en placas de seis pozos. Después de 24 horas, las células se transfectaron con 10 µg de vector (pCI-EGFP1) mezclado con 20 µl de SuperFect, o con 10 µg de vector que contenían el ADNc de esfingosina cinasa de humano (pCI-EGFP1-hSK1) mezclado con 20 µl de SuperFect. La figura 14 muestra el vector para la construcción de la fusión hSK-EGFP (N-terminal) para la expresión en células de mamífero. El tamaño de pCI-EGFP es de 4724 pb. La secuencia codificante de EGFP (716 pb) se amplificó con iniciadores EGFP.Xbal (sentido) y PARO-EGFP (antisentido), se cortó con XBAI/Xhol y se subclonó dentro de pCl mediante Nhel y Xhol. El codón de PARO de EGFP se deletó. El marco para subclonar una secuencia interés sin EGFP fusionado al extremo N-terminal se muestra en la parte inferior de la figura.

- Transfección de hSK1-EGFP (fusión C-terminal) Las células COS7 se transfectaron de manera transitoriamente con el vector pCI-EGFP-1 sólo o con el vector que contiene que el ADNc de esfingosina cinasa de humano (véase figura 15), utilizando el reactivo Qiagen, Superfect. Las células se sembraron a 5 x 106 por pozo, en placas de seis pozos. Después de 24 horas, las células se transfectaron con 10 µg de vector (pCI-EGFP-2) mezclado con 20 µl de SuperFect, o con 10 µg de vector que contenían el ADNc de esfingosina cinasa de humano (pCI-EGFP-2-hSK1 ) mezclado con 20 µl de SuperFect. La figura 15 ¡lustra el vector para la construcción de hSK-EGFP (fusión C-terminal) para la expresión en células de mamífero. El tamaño de pCI-EGFP2 es de 4733 pb. La secuencia codificante de EGFP (725 pb) se amplificó mediante PCR con iniciadores EGFP2-SUPERIOR (sentido) y EGFP2-INFERIOR (antisentido), se cortó con Xhol/Notl y se subclonó dentro de pCl mediante Salí y Notl. Un nuevo sitio Salí se incluyó dentro del producto de PCR. El marco para subclonar una secuencia de interés con EGFP fusionado al C-terminal se muestra en la parte inferior de la figura. Las dos proteínas de fusión se expresan bien en células COS7, la proteína de fusión EGFP/hSK1 se expresa principalmente como una proteína citosólica soluble. (Figuras 5A y 5B). La figura 5A describe la expresión y localización celular de hSK1 fusionada con EGFP en el extremo N-terminal. EGFP-hSK1 (fusión N-terminal) se expresó de una manera citosólica cuando se transfectó dentro de células Cos7, como se muestra por el color verde (colores más claros en la figura 5A). Mientras que, la hSK1-EGFP parece estar parcialmente localizadas en una forma granular, aunque, la expresión citosólica general también se observó (figura 5B). La figura 5B ilustra ia expresión y localización celular de hSK1 fusionada con EGFP en el extremo C-terminal. hSK1-EGFP (fusión C-terminal) se expresó principalmente de una manera cítosólica, con alguna localización granular cuando se transfectó dentro de células Cos7, como se muestra por el color verde (colores más claros en la figura 5B). El ensayo de cinasa, de los extractos celulares a partir de células transfectadas con cualquier construcción, muestra que la proteína de fusión de EGFP-hSK1 es más activa que la hSK1-EGFP. (Figura 6). La figura 6 muestra la actividad cinasa de las proteínas de fusión hSK. La sobreexpresión de hSK-EGFP (fusión N-terminal) (EGFP-hSK1 ) en un actividad similar con la proteína no marcada no fusionada sobreexpresada.

Por otra parte, la fusión C-terminal hSK-EGFP (hSK1-EGFP) se muestra 40% menos de actividad que las proteínas de fusión N-terminales. Este no es un problema con la eficiencia de transfección, puesto que los Southern blot (figura 7), así como las imágenes confocales (figuras 5A y 5B), indica que los niveles expresión de las dos proteínas son similares. Las figuras 5A y 5B muestran intensidad de fluorescencia verde similar sugiriendo que los niveles expresión de ambas proteínas de fusión C-terminal y N-terminal son similares. La figura 7 es un análisis de Western blot con anticuerpo anti-EGFP. La figura 7 demuestra que tanto las proteínas de fusión hSK/EGFP C-terminal (hSK1-EGFP) como la N-terminal (EGFP-hSK1) se expresan a niveles similares en las células Cos7.

EJEMPLO 6: Localización de esfingosina cinasa en tejidos Un Northern blot que contiene aproximadamente 1 µg de ARN poli A+ por línea a partir de 12 tejidos humanos diferentes, se híbrido con el inserto de 1.7 kb de pcDNA3-hSK1 , se purificó a partir del gel y se marcó con [32P]a ATP utilizando el equipo de marcado random primer. La hibridación utilizando amortiguador ExpressHybTM (CLONTECH), se llevó a cabo de conformidad con las instrucciones del fabricante. Las bandas se visualizaron mediante autorradiografía y se cuantificaron mediante densitometría. La distribución en tejidos del ARNm de hSK1 en los tejidos humanos se analizó mediante Northern blot (figura 8). La figura 8 muestra la distribución en tejidos del ARNm de hSK.

El Northern blot pre-realizado que contiene aproximadamente 12 tejidos humanos diferentes, se híbrido como se describió bajo la sección de métodos.

Los números en la parte inferior de cada línea indican los niveles expresión relativos al fondo, y se cuantificaron mediante densitometría. Esto reveló la expresión más altas en pulmón de adulto (46 veces sobre el fondo) y en bazo (38 meses), seguidos por los leucocitos de sangre periférica (30 veces), timo (28 veces) y riñon (24 veces), éste también se expresó el cerebro (12 veces), y en el corazón (11.5 veces). Los niveles bajos expresión se observaron en el músculo esquelético (2.6 veces), colon (2 veces), hígado (1.8 veces), intestino delgado (1.2 veces), placenta (1.3 veces). La distribución en tejido y los niveles expresión del ARNm de hSK1 son en general muy similares a los reportados para los homólogos de murino (Kohama et al 1998). Sin embargo, tanto en ratón como en humano, los niveles de ARNm iniciado son bajos, y esto contrasta con el hallazgo de que la actividad de la enzima SK en el hígado de rata está elevada dos veces en comparación con el cerebro (Olivera et al 1998). Sin embargo, los niveles de ARNm de SK no se han reportado en la rata. Además, la búsqueda en bases de datos, con el marcador stSG2854 sugiere la expresión en células endoteliales, epitelio pigmentario de la retina, y fibroblastos senescentes.

EJEMPLO 7: Localización genómica de la esfingosina cinasa, enfermedades relacionadas: Varios miembros del agrupamiento Unigen Hs. 68061 se han mapeado. La identidad de secuencia de estos Est con hSK y los datos de mapeo indican que en gen se localiza en el cromosoma 17q banda 25.2 en un intervalo 9 cM entre los marcadores del microsatélite D17S785 y D17S836 (104.7 y 114 cM respectivamente). El intervalo incluye un STS (stSG2854), idéntico con las secuencias Est del agrupamiento del Unigen Hs.68061. La clonación del hSK1 es un paso importante hacia la elucidación del papel que desempeña esta enzima en las rutas de transducción de la señal mediada por una amplio intervalo de mecanismos acoplados al receptor. Además, varios miembros del agrupamiento Unigen Hs.68061 han sido mapeados. Una región de aproximadamente 50 cM, en 17q25, la cual contiene el stSG2854 se ha implicado en varias enfermedades autoinmunes e inflamatorias, tales como esclerosis múltiple (Koukkanen et al., 1997), psoriasis y epidermodisplasia verruciformis (Nair et al., 1977; Tomfohrde et al., 1994; Enlund et al., 1999; Ramoz et al., 1999), y mediante homología de sintenia, en un modelo de rata de artritis inflamatoria (Remmers et al., 1996). El enlace con la psoriasis se ha reportado por múltiples grupos independientes. Juntos, estos datos identifiquen una región autoinmune/inflamatoria compartida descrita recientemente por Becker et al. (Becker et al., 1998). Debido a su patrón de expresión y biología, SK es posiblemente un gen candidato de susceptibilidad a enfermedad en esta región. Como un resultado, la invención también se refiere a un método para detectar la susceptibilidad de un mamífero para desarrollar enfermedades auto-inmunes e inflamatorias que comprende comparar dicha secuencia de ADN del mamífero que codifica SK1 con la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:2 y determinar la presencia de un polimorfismo de un nucleótido particular o región polimórfica en dicha secuencia codificante de mamífero que codifica SK1.

EJEMPLO 8: Expresión de esfingosina cinasa en insectos Aislamiento de la preparación de ADN de Bácmido recombinante El ADNc de esfingosina cinasa subclonó dentro del plásmido donante pFasbac HT de conformidad con las instrucciones de los fabricantes (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). El ADN del plásmido FastBac y el ADN de esfingosina cinasa se prepararon mediante la digestión de 1 µg de ADN con las endonucleasa se restricción seleccionadas bajo condiciones apropiadas. El fragmento del inserto se ligó dentro del vector pFastBac HT preparado hacia el extremo 3' a partir de la marca de histídina bajo condiciones apropiadas. El plásmido recombinante pFastBac plásmido donante se transformó dentro de DHIOBac. (Instrucciones (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) para la transposición dentro del bácmido. El aislamiento del ADN del bácmido recombinante se seleccionó medíante PCR de la secuencia deseada en colonias blancas. La preparación de A tener que bácmido se llevó a cabo bajo condiciones específicamente desarrolladas para aislamiento de plásmidos grandes (>100 Kb) y adaptadas para aislamiento de ADN de bácmido (Quiagen).

- Expresión de la proteína recombinante en células Sf21 Las células Sf21 se transfectaron con el ADN del bácmido recombinante en presencia del reactivo Cellfectin. Se llevaron a cabo cultivo celular, purificación del virus recombinante y titulación del virus de conformidad con las instrucciones de los fabricantes (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Para la expresión de la proteína, las células a una densidad de 2 x 106/ml se infectaron con el virus recombinante a un MOI de 5 a 10. Tres días post-infección, las células se concentraron mediante centrifugación y se cosecharon en amortiguador de homogeneización (Bis Tris 20 mM (pH 6.5), EDTA 10 mM, DTT 2.5 M) suplementado con una mezcla de inhibidores de proteasas (Boehringer). El glicerol se añadió a una concentración final de 20-30% a todos los homogeneizados que se almacenaron entonces a -20°C en alícuotas. El gen había sido clonado dentro de un vector expresión pFastbac HT, la proteína expresada contendría 6X his en su extremo amino permitiendo que la proteína deseada se purificara. La proteína de fusión se purificó con un sistema de amortiguador apropiado basado en la utilizando resina NI-NTA.

-Purificación parcial HSK1 se subclonó dentro del vector de lanzadera de Baculovirus pFastBacHTa el cual incorpora la secuencia para una marca de afinidad a 6x histidina en el N-terminal. Esta construcción de Baculovirus se mezcló con ADN viral y se introdujo dentro de células de insecto Sf21. El Baculovírus novedoso recombinante se aisló mediante purificación en placa y se examinaron cinco aislados para producción de proteína. Se eligió el mejor aislado y se generó una solución de almacenamiento con alto título viral. Las células de insecto Sf21 se infectaron y ias células se cosecharon 60 horas post infección. La expresión de hSK1 se confirmó mediante Western blot. Las células de insecto Sf21 infectadas a partir de un cultivo se utilizaron para purificación parcial de hSK1 utilizando glóbulos de níquel. hSK1 se subclonó dentro de pFastBacHTa (Life Technologies Cat No 50322, lote No. KDW704) utilizando los sitios de restricción BamHl y Pstl. Esta construcción se confirmó mediante secuenciación. La hSK1 en pFastBacHTa se utilizó para transformar E. coli DH101Bac (la cual contiene el vector de lanzadera de bácmido 14272). La transposición a partir del plásmido donante al plásmido de lanzadera aceptor se detectó mediante la selección de colonias blancas/azules en placas de X-gal/IPTG. Las colonias blancas se seleccionaron, crecieron y el Bácmido recombinante se purificó en sistemas de expresión de Baculovirus bac-a-bac (Manual de instrucción GIBCO BRL Life Technologies). Las células Sf21 para las soluciones de almacenamiento viral (NERC, Oxford) se crecieron en TC100 al 47.5% (a partir de Life Technologies; No. de catálogo 13055-025; No. de lote 3031505) + suero bovino fetal Norteamericano al 5% inactivado con calor (FBS; a partir de Life Technologies; No. de catálogo 10085-140; No. de lote 06Q6073A) como cultivos en suspensión en botellas de agitador y se adhirieron utilizando procedimientos estándares (King et al., 1992). Las células Sf21 en ExCell 401 (No. de lote 9N3936) se transfectaron con ADN de bácmido purificado recombinante en la presencia de Lipofectin (Life Technologies) utilizando métodos estándares (King et al., 1992). El medio de cultivo se colectó 7 días post-infección. Una monocapa de células Sf21 (3.5 x 106 células/60 mm cada uno) se infectó con diluciones seriales de solución de almacenamiento viral a partir de la mezcla de transfección descrita anteriormente, sobrepuesta con una mezcla de Medio para Insecto Graces (2x; Life Technologies), FNS al 10% (Life Technologies; Norteamericano inactivado con calor; No. de catálogo 10085-140; No. de lote 06Q6073A); Solución de agarosa SeaPlaque al 1.5% (lowgen) y se tiñó con rojo neutro (al 6% en PBS; Sigma) 4 días postinfección. La figura 17 muestra una electroforesis en gel de la purificación parcial de hSK1 a partir de las células de insecto Sf21. 150 ml de células Sf21 se infectaron a un MOI de 10 y las células se colectaron a las 60 horas post-infeccíón. Las muestras se prepararon y se llevaron a cabo uniéndolas a una columna de Ni. 10 µl a partir de los eluidos de ia muestra de la columna se mezclaron con amortiguador reductor SDS/PAGE'dX y 15 µl se cargaron por pozo en un gel Bis-Tris NuPAGE al 4-12%. La electroforesis en gel se tiñó con azul Coomassie. 1 = Lisado celular total 2 = Lisado después de una centrifugación a baja velocidad 3 = Flujo a través de la columna 4-6 = Fracciones 1-3 del lavado de la columna 7-11 = Fracciones 1-5 del lavado de la columna La banda singular de la línea 8 corresponde la peso molecular pronosticado de hSK, es decir, alrededor de 43 kD. La adición de las fracciones 7 y 8 de la elución de la columna representan la hSK1 parcialmente purificada.

EJEMPLO 9: Expresión de esfingosina cinasa en bacterias Construcción de GST-hSK1 (fusión N-termínal) para expresión bacteriana Una reacción de PCR se llevó a cabo utilizando la construcción pcDNA3-hSK1 como un molde, y los iniciadores diseñados para amplificar la secuencia codificante de hSK1 al mismo tiempo insertando los sitios de restricción de clonación en ambos extremos (EcoRI-Xhol) con el objeto de alinear el vector PGEX que contiene el GST con la hSK1 y hacer la proteína de fusión en marco (figura 16). La construcción porta el GST en el N-terminal de la hSKL Iniciadores E y F: E = extremo 5' TTA GAA TTC CAC CAT GGA TCC AGC GGG CGG C (SEQ ID NO: 10) F = extremo 3' AGT CGA GGC TGA TCA GCG AG (SEQ ID NO: 11). La figura 16 ¡lustra el vector para la construcción de hSK1 marcada con GST para la expresión en células bacterianas. El vector PGEX-SX-3 (a partir de Promega) se utilizó para construir y expresar una proteína de fusión hSK1-GST en bacterias.

- Células E. coli Las células competentes E. coli (cepa BL21) se obtuvieron a partir de Promega. La transformación bacteriana se llevó a cabo conforme el Protocolo de Transformación Estándar abastecido. Las células competentes congeladas se descongelaron en hielo por 5 minutos, 100 µl se transfectaron a un tubo de cultivo pequeño. Se añadieron 50 ng de ADNc de hSK1 y se mezclaron al mover el tubo rápidamente. Los tubos se regresaron al hielo por 10 minutos, después de lo cual se llevó a cabo un choque térmico al colocar los tubos en un baño de agua a 42°C por 45 segundos. Inmediatamente los tubos se colocaron en hielo por 2 minutos. 900 µl de medio SOC frío se añadió a la reacción de transformación y se incubaron por 60 minutos a 37°C por 12-14 horas.

EJEMPLO 10: Fuente optimizada de esfinqosina cinasa para los ensayos de selección -Elección de la fuente de esfinqosina cinasa Varias fuentes de hSK han sido evaluadas. La figura 9 ilustra la comparación de la actividad hSK a partir de diferentes muestras: células CHO, Bacterias, hSK1 parcialmente purificada a partir de células de insecto. Niveles similares se observaron en extractos celulares de mamífero (Cho) y de bacteria (BL21 ). Hay un efecto dosis respuesta en niveles increméntales de hSK parcialmente purificada a partir de transfecciones de células de insecto. Como en la figura 9 (el eje Y es la actividad enzimática en cpm de SPA), 2 µg de proteína total a partir de ias bacterias (BL21) y 0.1 µg de hSK parcialmente purificada de baculovirus/células de insecto dieron una buena señal con respecto a la relación de ruido de fondo (aproximadamente 12 veces). La cantidad total de proteína necesaria es de 400 mg para 2000 placas, lo cual representa alrededor de 10 litros de bacterias transformadas e inducidas. Los experimentos se han llevado a cabo en un esfuerzo para identificar la mejor solución posible para la generación de suficiente hSK recombinante para correr una Selección de Alta Resolución (HST). Puesto que la expresión transitoria en mamíferos presenta muchas dificultades para generar suficiente enzima para la HST completa, diferentes sistemas de expresión bacteriana han sido ensayados, así como, el sistema de expresión de baculovirus en células de insecto. Los resultados se expresan en la figura 10. La figura 10 ¡lustra la comparación de la actividad hSK1 a partir de diferentes fuentes: Cos7, bacterias, células de insecto. BL21 Transf. Basal significa BL21 transfectadas sin inducción de IPTG. BL21 Trans. Inducidas significa BL21 transfectadas con inducción de IPTG. P.Pur.rSPHK significa hSK1 recombinante parcialmente purificada. 40 µg del extracto total de células a partir de las células Cos7 transfectadas muestra 50% más de actividad que 40 µg del extracto total de célula bacteriana transfectada. 40 µg de extracto de célula de insecto muestra actividad hSK1 mínima sobre los niveles básales (Cos7 basal). Sin embargo 6 µg de hSK1 parcialmente purificada a partir de célula de insecto muestra un incremento de 3 veces sobre el extracto de células Cos7 transfectadas. Las células Cos7 transfectadas representan el control positivo de los inventores para actividad óptima. La enzima parcialmente purificada a partir del sistema de baculovirus da la actividad máxima observada hasta ahora. Sin embargo, con cantidades similares de extractos de células control, los extractos bacterianos que sobreexpresan la hSK dan entre 40% a 50% dei total de actividad observado con el sistema de mamífero, lo cual vuelve a este sistema como la solución más atractiva.

-Optimización de la fuente de esfinqosina bacteriana Los experimentos se han llevado a cabo con el objetivo de generar suficiente esfingosina cinasa recombinante de humano para la HTS.

Las bacterias BL21 transfectadas, que se crecen a 25°C durante toda la noche, producen hSK1 recombinante activa, como se muestra por la actividad enzimática del extracto de proteína total. La producción se ha escalado para generar arriba de 400 mg de la proteína bacteriana total que muestra niveles muy buenos de actividad SK. Con el objeto resolver el problema de solubilidad/expresión observado para la hSK1 recombinante marcada con GST, los inventores establecieron un amplio intervalo de condiciones para crecimiento bacteriano y para la inducción de expresión de la proteína. Por lo tanto, el crecimiento de la bacteria a temperatura ambiente por 20 horas, y la inducción dei expresión de la proteína con IPTG 50 µM, parece ser la condición óptima para la expresión de cantidades significativas de hSK recombinante activa/soluble marcada con GST. (figura 11). La figura 11 describe las condiciones de crecimiento bacteriano para la optimización de la hSK1 expresada activamente. Se probaron diferentes concentraciones de IPTG para la inducción, temperatura diferentes para el crecimiento (RT significa temperatura ambiente), diferentes tiempos incubación. Además, el extracto de célula bacteriana bajo crecimiento bacteriano óptimo y condiciones de inducción (IPTG 50 µM por 20 horas) tiene 40% de actividad de la actividad máxima observada para las células de mamífero transfectadas (células Cos) (figura 12). La figura 12 muestra la comparación de la actividad de hSK1 expresada bajo diferentes condiciones de crecimiento bacteriano y expresada en células Cos.

EJEMPLO 11: Oligonucleótidos antisentido esfingosina cinasa Con el objeto demostrar el papel fisiológico de la esfingosina cinasa 1 en rutas de señalización intracelulares en las células inmunes, un oligonucleótido antisentido,, que corresponde a los primeros 21 nucleótídos codificantes de la hSK1 , se diseñaron en un intento de subregular la proteína y por lo tanto su actividad. Las células U937 se transfectaron con el oligonucleótido antisentido, y las señales de calcio se analizaron en un modelo acoplado receptor en el cual los inventores habían mostrado previamente que activa esfingosina cinasa. En la presente los inventores muestran que, en las células tratadas con antisentido la liberación de calcio a partir de los almacenes intracelulares se deteriora, demostrando que la esfingosina cinasa desempeña de hecho un papel significativo en las respuestas fisiológicas disparadas por acoplamiento al receptor.

-Construcción de un oliqonucleótido antisentido en contra de hSK1 Una secuencia antisentido para los primeros 24 nucleótidos (decodifican para los primeros 8 aminoácidos) del ADNc de hSK1 , (dicho antisentido teniendo la secuencia: GGG GCC GCC CGC CGC TGG ATC CAT, SEQ ID NO: 12), se sintetizó y se protegió en ambos extremos con uniones de fosforotioato para el primer y los últimos dos pares nucleotídicos. Un control "oligonucleótido revuelto" (CTGGTGGAAGAAGAGGACGTCCAT, SEQ ID NO: 13) se sintetizó y se protegió en ambos extremos con uniones de fosforotioato para el primer y los últimos dos pares nucleotídicos.

-Transfección del oliqonucleótido antisentido a hSK1 Las células U937 se transfectaron de manera transitoria con un oligonucleótido antisentido en contra de los primeros 21 nucleótidos codificantes (que codifican para los primeros 7 aminoácidos) del ADNc esfingosina cinasa de humano, utilizando el reactivo Qiagen, SuperFect. Las células 1 x 106 por ml, en 10 ml. Después 24 horas, las células se transfectaron con 2 µg de oligonucleótídos antísentido revueltos (control) mezclados con 20 µl de SuperFect, o con 2 µg de oligonucleótido antisentído en contra de esfingosina cinasa de humano mezclado con 20 µl de SuperFect.

Análisis de proteína de hSK1 en células U937 y el efecto del antisentido La figura 13 ilustra el papel fisiológico relevante de hSK1 probado mediante el uso de un olígonucleótido antisentido. La señal de calcio disparada por FC?RI en las células U937 (control) se inhibió en las células tratadas por 48 horas con un antisentido en contra de hSK1. La figura 18 ilustra la subrregulación antisentido de los niveles de proteína de hSK1. El blot ha sido probado con un anticuerpo policlonal en contra de hSK1 (Ab 0144). 1 = Señal de fondo 2 = 100 mg de extracto de células U937 no tratadas (tomadas como 100% de ia expresión) 3 = 100 mg de extracto de células U937 tratadas (12% en comparación con las células no tratadas) Esta figura demuestra que el antisentido reduce el nivel de expresión de la proteína hSK1 en el 88%.

EJEMPLO 12: Ratón knock out de esfingosina cinasa Un filtro con una alta densidad de serie de colonias BAC a partir de la librería RPC22 BAC de 129 cepas de ratón (Research Genetics) se ha seleccionado con las siguientes sondas oligonucleotídícas radiomarcadas. SK extremo 5' 49 (proximal al gen) CTGGGTCTTGTAGAAGAGCAGCAAGTGCT (SEQ ID NO: 14) SK extremo 5' 48 (proximal al gen) AGTTCACTGCAATCCTTTCTTATCTGGGTTCG (SEQ ID NO:15) SK extremo 3' (dístal al gen) TTCTGTGGATGGAGAGCTGATGGTATGG (SEQ ID NO:16) CAJA SK (región conservada) ATGAAGTGGTGAATGGGCTAATGGAACG (SEQ ID NO:17). La sondas oligonucleotídicas se derivaron a partir de la secuencia de ADNc de SK1 de ratón (Kohama et al., 1998). Basándose en alineamientos múltiples de las secuencias de ADNc relacionados con SK1 (Melendez et al., 2000), los oligonucleótidos se seleccionaron a partir de los dos extremos de los ADNc (sondas para el gen proximal y para el gen distal) y a partir de la región conservada. Las clonas BAC positivas se obtuvieron (Research Genetics) y han sido seleccionadas con sondas para el gen distal y para la región conservada. Ninguna clona se encontró positiva tanto para la región conservadas como para las sondas 3' oligonucleotídicas radíomarcadas (gen distal) en experimentos de hibridación. Sondas positivas (con sondas para regiones conservadas): 83 B 4, 442 C 20, 424 E 5, 46 M 1 , 270 B 3, 225 D 6. Clonas positivas en el extremo 3' (sondas para gen dístal): 61 K 3, 166 L 16, 126 H 16, 69 D 8, 24 O 6, 203 P 6, 224 A 21 , 84 A 12, 387 G 19, 545 H 5, 431 O 19, 224 A 23. El dominio catalítico de la enzima presumiblemente yace en la región altamente conservada (véase SEQ ID N° 8), la cual está entre aa16 y aa 95 en la secuencia peptídica (SEQ ID NO: 3) hacia el extremo 3' de las secuencias presumiblemente codificadas por el primer exón alternativo, por lo tanto, esta región altamente conservada se dirigirá en las células ES. La región crítica de la catálisis para la SK de humano está determinada por los truncamientos 5' y 3' y las deleciones internas. Las clonas BAC de ratón se identifican por librerías BAC de selección. Las mini-librerías se preparan a partir de clonas positivas verificadas y estas librerías se seleccionan con sondas oligonucleotídicas para obtener fragmentos genómicos que codifican para el dominio catalítico. La secuenciación verifica la presencia de los exones catalíticos críticos en un fragmento genómico. Los fragmentos genómicos que flanquean 5' y 3' con tamaños apropiados (2.5-5 Kb) se clonan con sondas oligonucleótidas, o se amplifican mediante PCR con iniciadores apropiados a partir del ADNc. Estos fragmentos insertan dentro del vector de direccionamiento pSV-loxP, en orientación reversa a la unidad de transcripción NEO (experimento A). En experimentos alternativos (B) los sitios loxP se insertan flanqueando el exón crítico de catálisis que contiene los fragmentos genómicos y éstos también se clonan inmediatamente adyacentes a la unidad transcripcional Neo, la región se flanquea con los brazos de homología 5' y 3' para el direccionamiento. Los sitios de restricción apropiados se insertan con el objeto de crear una situación óptima para la detección de la recombinación mediada por el reemplazamiento de la región de catálisis crítica de tipo silvestre por el fragmento flanqueado por el sitio loxP. Los vectores de direccionamiento se introducen dentro de las células ES mediante electroporación u otros métodos. Las colonias resistentes a neomícina se seleccionan para la identificación de eventos específicos de direccionamiento. En una variante posible experimento la expresión transitoria de recombinasa Cre en las células ES se utiliza para remover el gen de resistencia a neomicina Tn-5 flanqueado por loxP a partir del alelo dirigido en el experimento A. una vez que las colonias de las células ES con los alelos dirigidos son identificadas los blastocistos se inyectarán con células ES a partir de estas colonias. Los ratones con alta contribución en grado de células ES se seleccionan medíante examinación de color de cubiertas, los ratones transmisores de línea germinal se seleccionarán mediante cruza y evaluación de ADN de la cola. Una vez que los ratones hemicigotos dirigidos (SK +/-) se obtienen, éstos se evalúan en experimentos biológicos junto con ratones nulos para alelo homocigoto (SK -/-) (si éstos son viables) generados mediante cruza (Gene targeting, Ed. A.L. Joyner IRL press/Oxford, 1993). En el experimento B; los ratones homocigotos con inserción positivas se generan y se cruzan con ratones transgénicos que expresan recombinasa Cre específica dirigido. El resultado de este experimento es la deleción específica de tejido el gen SK. Si la recombinasa Cre está controlada por un promotor inducible, la deleción de SK es inducible.

EJEMPLO 13: Anticuerpos policlonales a hSK Cuatro secuencias peptídícas se seleccionaron por sus propiedades de hidrofobicidad aparentes, y se sintetizaron. Péptido 1 = FTLMLTERRNHARELVRSEE (SEQ ID NO: 18) Péptido 2 = VNGLMERPDWETAIQKPLCS (SEQ ID NO: 19) Péptido 3 = ADVDLESEKYRRLGEMRFTL (SEQ ID NO: 20) Péptido 4 = SGCVEPPPSWKPPQQMPPPEE (SEQ ID NO: 21) Dos conejos se inmunizaron para cada péptido dando lugar a ocho anticuerpos policlonales derivados de los péptidos (dos a partir de cada péptido). Péptido 1 = Suero # 0140 (conejo 1); Suero # 0141 (conejo 2). Péptído 2 = Suero # 0142 (conejo 1 ); Suero # 0143 (conejo 2). Péptido 3 = Suero # 0144 (conejo 1); Suero # 0145 (conejo 2). Péptido 4 = Suero # 0146 (conejo 1); Suero # 0147 (conejo 2).

Referencias - Beaucage et al., (198 1 ) Tetrahedron Lett, 22: 1859-1862. - Brown E , Belagaje R, Ryan MJ, Khorana HG, Methods Enzymol (1979); 68:109-15 LGene targeting. Ed. A.L. Joyner IRL press /Oxford (1993) - Houbenweyl , (1974), En Methode der Organischen Chemie, E. Wunsch Ed., Volumen 15-1 y 15-11 , Thieme, Stuttgart. - Kohama et. al. (1998) J. Biol. Chem., 273: 23722-23728 - Koch Y. (1977), Biochem. Biophys. Res: Commun., 74:488-491. - Koffier G. y Milstein C, (1975) Nature, 256:495. - Kozbor et al., (1983) Hybridoma, 2(1):7-16. - Leger OJ, et al. (1997) Hum Antibodies, 8(1):3-16. - Martineau P, Jones P, Winter G. (1998), J. Mol Biol, 280(1 ):117-127. - Melendez et al., (2000) Gene, 251 :19-26. - Merrifield RB, (1965a), Nature, 207(996):522-523. - Merrifield RB, (1965b), Nature, 207 (996):522-523. - Narang SA, Hsiung M Brousseau P, Methods Enzymol 1979: 68: 90-98. - Ridder P, Schmítz R, Legay F, Gram H, (1995) Biotechnolqgy (NY), 13(3):255-260. - Stemberg N.L. (1992), Trends Genet, 8: 1-16. - Stemberg N.L. (1994) Mamm. Genome, 5:397-404.

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LISTADO DE SECUENCIAS <110> Warner-Lambert <120> Qen (jg esfingosina cinasa de humano <130> A000198PCT <140> <141> <160> 24 <170> Patente en Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1719 <212> < 13> Homo sapiens <400> 1 gtcccgggat ttagtcgggc gctcccacct ctggcagctg cggccccgga ctccgccagc 60 gctgtcttct ctccctcagg tccagccgcc gcagggaatg acaccggtgc tcctacagcc 120 acggctccgg gcgggaaggg agccccacag cggccctgcg acgcccgcct gggcaggacc 180 gataaggaac tgaaggcagg agccgccgcc acggcagcgc ccccacagcg ccagggaccc 240 cctggcagcg ggagccgcgg gtcgaggtta tggatcsagc gggcggcccc cggggcgtgc 300 tcccgcggcc ctgccgcgtg ctggtgctgc tgaacccgcg cggcggcaag ggcaaggcct 360 tgcagctctt ccggagtcac gtgcagcccc ttttggctga ggctgaaatc tccttcacgc 420 tgatgctcac tgagcggcgg aaccacgcgc gggagctggt gcggtcggag gagctgggcc 480 gctgggacgc tctggtggtc atgtctggag acgggctgat gcacgaggtg gtgaacgggc "" 540 tcatggagcg gcctgactgg gagaccgcca tccagaagcc cctgtgtagc ctcccagcag 600 gctctggcaa cgcgctggca gcttccttga accattatgc tggctatgag caggtcacca 660 atgaagacct cctgaccaac tgcacgctat tgctgtgccg ccggctgctg tcacccatga 720 acctgctgtc tctgcacacg gcttcggggc tgcgcctctt ctctgtgctc agcctggcct 780 ggggcttcat tgctgatgtg gacctagaga gtgagaagta tcggcgtctg ggggagatgc 840 gcttcactct gggcaccttc ctgcgtctgg cagccctgcg cacctaccgc ggccgactgg 900 cctacctccc tgtaggaaga gtgggttcca agacacctgc ctcccccgtt gtggtccagc 960 agggcccggt agatgcacac cttgtgccac tggaggagcc agtgccctct cactggacag 1020 tggtgcccga cgaggacttt gtgctagtcc tggcactgct gcactcgcac ctgggcagtg 1080 agatgtttgc tgcacccatg ggccgctgtg cagctggcgt catgcatctg ttctacgtgc 1140 gggcgggagt gtctcgtgcc atgctgctgc gcctcttcct ggccatggag aagggcaggc 1200 atatggagta tgaatgcccc tacttggtat atgtgcccgt gg cgcctts cgcttggagc 1260 ccaaggatgg gaaaggtgtg tttgcagtgg atggggaatt gatggttagc gaggccgtgc 1320 agggccaggt gcacccaaac tacttctgga tggtcagcgg ttgcgtggag cccccgccca 1380 gctggaagcc ccagcagatg ccaccgcsag aagagccctt atgacccctg ggccgcgttg 1440 tgccttagtg tctacttgca ggacccttcc tccttcccta gggctgcagg gcctgtccac 1500 agctcctgtg ggggtggagg agactcctct ggagaagggt gagaaggtgg aggctatgct 1560 ttggggggac aggccagaat gaagtcctgg gtcaggagcc cagctggctg ggcccagctg 1620 ccfcatgtaag gccttctagt ttgttttgag acccccaccc cacgaaccaa atccaaataa 1680 agtgacattc ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1719 <210> 2 <211> 1155 <212> $Jj < 13> áomo sapiens <400> 2 atggatccag cgggcggccc ccggggcgtg ctcccgcggc cctgccgcgt gctggtgctg 60 ctgaacccgs gcggcggcaa gggcaaggcc ttgcagctct tccggagtca cgtgcagccc 120 cttttggctg aggctgaaat ctccttcacg ctgatgctca ctgagcggcg gaaccacgcg 180 cgggagctgg tgcggtcgga ggagctgggc cgctgggacg ctctggtggt catgtctgga 240 gacgggctga tgcacgaggt ggtgaacggg ctcatggags ggcctgactg ggagaccgcc 300 atccagaagc ccctgtgtag cctcccagca ggctctggca acgcgctggc agcttccttg 360 aaccattatg ctggctatga gcaggtcacc aatgaagacc tcctgascaa ctgcacgcta 420 ttgctgtgcc gccggctgct gtcacccatg aacctgctgt ctctgcacac ggcttcgggg 480 ctgcgcctct tctctgtgct cagcctggcc tggggcttca ttgctgatgt ggacctagag 540 agtgagaagt atcggcgtct gggggagatg cgcttcactc tgggcacctt cctgcgtctg 600 gcagccctgc gcacctaccg cggccgactg gcctacctcc ctgtaggaag agtgggttcc 660 aagacacctg cctcccccgt tgtggtccag cagggcccgg tagatgcaca ccttgtgcca 720 ctggaggagc cagtgccctc tcactggaca gtggtgcccg acgaggactt tgtgctagtc 780 ctggcactgc tgcactcgca cctgggcagt gagatgtttg ctgcacccat gggccgctgt 840 gcagctggcg tcatgcatct gttctacgtg cgggcgggag tgtctcgtgc catgctgctg 900 cgcctcttcc tggccatgga gaagggcagg catatggagt atgaatgccc ctacttggta 960 tatgtgcccg tggtcgcctt ccgcttggag cccaaggatg ggaaaggtgt gt gcagtg 1020 gatggggaat tgatggttag cgaggccgtg cagggccagg tgcacccaaa ctacttctgg 1080 atggtcagcg gttgcgtgga gcccccgccc agctggaagc cccagcagat gccaccgcca 1140 gaagagccct tatga 1155 <210> 3 <211> 384 <212 > PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Asp Pro Ala Gly Gly Pro Arg Gly Val Leu Pro Arg Pro Cys Arg 1 5 10 15 Val Leu Val Leu Leu Asn Pro Arg Gly Gly Lys Gly Lys Ala Leu Gln 20 25 30 Leu Phe Arg Ser His Val Gln Pro Leu Leu Ala Glu Ala Glu He Ser 35 40 45 Phe Tbr Leu Met Leu Tbr Glu Arg Arg Asn His Ala Arg Glu Leu Val 50 55 60 Arg Ser Glu Glu Leu Gly Arg Trp Asp Ala Leu Val Val Met Ser Gly 65 70 75 80 Asp Gly Leu Met His Glu Val Val Asn Gly Leu Met Glu Arg Pro Asp 85 90 95 Trp Glu Thr Ala He Gln Lys Pro Leu Cys Ser Leu Pro Ala Gly Ser 100 105 110 Gly Asn Ala Leu Ala Ala Ser Leu Asn His Tyr Ala Gly Tyr Glu Gln 11S 120 125 Val Thr Asn Glu Asp Leu Leu Thr Asn Cys Thr Leu Leu Leu Cys Arg 130 135 140 Arg Leu Leu Ser Pro Met Asn Leu Leu Ser Leu His Thr Ala Ser Gly 145 150 155 160 Leu Arg Leu Phe Ser Val Leu Ser Leu Ala Trp Gly Phe He Ala Asp 165 170 175 Val Asp Leu Glu Ser Glu Lys Tyr Arg Arg Leu Gly Glu Met Arg Phe 180 185 190. Thr Leu Gly Thr Phe Leu Arg Leu Ala Ala Leu Arg Thr Tyr Arg Gly 195 200 205 Arg Leu Ala Tyr Leu Pro Val Gly Arg Val Gly Ser Lys Thr Pro Ala 210 215 220 Ser Pro Val Val Val Gln Gln Gly Pro Val Asp Ala His Leu Val Pro 225 230 235 . - , - - 240 Leu Glu Glu Pro Val Pro Ser His Trp Thr Val Val Pro Asp Glu Asp 245 ' 250 _ 255 Phe Val Leu Val Leu Ala Leu Leu His Ser His Leu Gly Ser Glu Met 260 265 270 Phe Ala Ala Pro Met Gly Arg Cys Ala Ala Gly Val Met His Leu Phe 275 280 285 Tyr Val Arg Ala Gly Val Ser Arg Ala- et Leu Leu Arg Leu Phe Leu 290 295 300 Ala Met Glu Lys Gly Arg His Met Glu Tyr Glu Cys Pro Tyr Leu Val 305 310 315 320 Tyr Val Pro Val Val Ala Phe Arg Leu Glu Pro Lys Asp Gly Lys Gly 325 330 335 Val Phe Ala Val Asp Gly Glu Leu Met Val Ser Glu Ala Val Gln Gly 340 345 350 Gln Val His Pro Asn Tyr Phe Trp Met Val Ser Gly Cys Val Glu Pro 355 360 365 Pro Pro Ser Trp Lys Pro Gln Gln Met Pro Pro Pro Glu Glu Pro Leu 370 375 380 <210> 4 <211> 27 <212>ADN <2 3> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador <400> 4 tatgctagca tggatccagc gggcggc 27 <21Q> 5 <211> 27 <212>ADN <213>Secuencia Artificial <220> <223>DescripCi n de la secuencia artificial: iniciador <400> 5 aatgaattct cataagggct cttctgg 27 <210> 6 <211> 31 <21 >A¡?j <213>Secuencia Artificial <220> <223>r Dvescripción de la secuencia artificial: iniciador <400> 6 ttagaattcc accatggatc cagcgggcgg c 31 <210> 7 <211> 30 < 12>ADN <213>Secuencia Artificial <220> <223>Descripción de la secuencia artificial: iniciador <400> 7 attatcgtcg actaagggct cttctggcgg 30 <210> 8 <211> 80 <212> PRT < 13> Homo sapiens <400> 8 ^9 Val Leu Val Leu Leu Asn Pro Arg Gly Gly Lys Gly Lys Ala Leu 1 5 10 15 Gln Leu Phe Arg Ser His Val Gln Pro Leu Leu Ala Glu Ala Glu He 20 25 30 Ser Phe Thr Leu Met Leu Thr Glu Arg Arg Asn His Ala Arg Glu Leu 35 40 45 Val Arg Ser Glu Glu Leu Gly Arg Trp Asp Ala Leu Val Val Met Ser 50 55 60 Gly Aep Gly Leu Met His Glu Val Val Asn Gly Leu Met Glu Arg Pro 65 70 75 80 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <2 3> Secuencia Artificial <220> <223 Descripción de la secuencia artificial: péptido <400> 9 Leu Val Arg Ser Glu Glu Leu Gly Arg Trp Asp Ala Leu Val Val Met 1 5 10 " 15 <210> 10 <211> 31 <212> ADN <2i3> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador <400> 10 ttagaattcc accatggatc cagcgggcgg c 31 <210> 11 <211> 20 <212> .ADN <2 3> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador <400> 11 agtcgaggct gatcagcgag 20 <210> 12 <211> 21 <212> ADN <2i3> Secuencia Artificial <220> <223 Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido <400> 12 ggggccgccs gccgctggat c 21 <210> 13 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligopucleótido <400> 13 ctggtggaag aagaggacgt ccat 24 <210> 14 <211> 29 <212=" ADN < 13> Secuencia Artifici l <220> <223> Descripción de la secuencia,artificial: sendas <400> 14 ctgggtcttg tagaagagea gcaagtgct 29 <210> 15 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: sondéis <400> 15 agttcactgc aatcctttct tatctgggtt cg 32 <210> 16 <211> 28 <212> ADN <2i3> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial:sondas <400 > 16 ttctgtggat ggagagctga tggtatgg 28 <210> 17 <211> 28 <212> ADN <2i3> Secuencia Artificial <220> < 3> Descripción de la secuencia artificial: sondas <400> 17 atgaagtggt gaatgggcta atggaacg 28 <210> 18 <211> 20 <212> PRT <2i3> Secuencia Artificial <220> <2 3> Descripción de la secuencia artificial: péptido <400> 18 Phe Thr Leu Met Leu Thr Glu Arg Arg Asíi His Ala Arg Glu Leu Val 1 5 10 15 Arg Ser Glu Glu 20 <210> 19 <211>_ 20 <212> PRT <2i3> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: péptido <400> 19 Val Asn Gly Leu Met Glu Arg Pro Asp Trp Glu Thr Ala He Gln Lys 1 5, 10 15 Pro Leu Cys Ser 20 <210> 20 <211> 20 <212> PRT <2i3> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: péptido <400> 20 Ala Asp Val Asp Leu Glu Ser Glu Lys Tyr Arg Arg Leu Gly Glu Met 10 15 Arg Phe Thr Leu 20 <210> 21 <211> 21 <212> PRT < i3> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: péptido <400> 21 Ser Gly Cys Val Glu Pro Pro Pro Ser Trp Lys Pro Pro Gln Gln Met 1 5 10 15 Pro Pro Pro Glu Glu 20 <210> 22 <211> 240 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 22 cgcgtgctgg tgctgctgaa cccgcgcggc ggcaagggca aggccttgca gctcttccgg 60 agtcacgtgc agcccctttt ggctgaggct gaaatctcct tcacgstgat gctcactgag 120 cggcggaacc acgcgcggga gctggtgcgg tcggaggagc tgggccgctg ggacgctctg 180 gtggtcatgt ctggagacgg gctgatgcac gaggtggtga acgggctcat ggagcggcct 240 <210> 23 <211> 8 <212> PRT <2i3> secuencia Artificial <220> <223 Descripción de la secuencia artificial: peptido <400> 23 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Secuencia Artificial 220> <223> Descripción de la secuencia artificial: péptido <400> 24 Gly Gly Lys Gly Lys 1 5

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un ácido nucleico purificado o aislado que codifican una esfingosina cinasa de humano.

2.- El ácido nucleico purificado o aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende un polinucleótido que tiene al menos 90% de identidad con la secuencia de SEQ ID NO: 1 , o SEQ ID NO: 2 o una secuencia complementaria a la misma. 3.- Un polinucleótido purificado o aislado que codifica una esfingosina cinasa de humano que tiene al menos 80% de identidad de aminoácido con la secuencia de SEQ ID NO:

3.

4.- Un polinucleótido purificado o aislado de SEQ ID NO: 22 un polinucleótido de hibrida con éste.

5.- Un polinucleótido purificado o aislado que comprende al menos 10 nucleótidos consecutivos de la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 1 , o SEQ ID NO: 2.

6.- Un polinucleótido purificado o aislado que comprende al menos 10 nucieótidos consecutivos de la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 22.

7.- El polinucleótido purificado o aislado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque comprende la secuencia de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17.

8.- Un vector recombinante que comprende un ácido nucleico como se definió en las reivindicaciones 1 a 7.

9.- El vector recombinante que comprende un ácido nucleico de Oonformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque es un vector bacteriano.

10.- El vector recombinante que comprende un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque es un vector pGEX.

11.- El vector recombinante que comprende un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque es un vector baculovirus, preferiblemente pFastBacHTa.

12.- El vector recombinante que comprende un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque es un vector eucarionte.

13.- El vector recombinante que comprende un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque se elige entre pcDNA3, pFLAG y pCMV.

14.- Una célula hospedera recombinante que comprende un ácido nucleico como se define en la reivindicación 1 a 7.

15.- Una célula hospedera recombinante que comprende el vector recombinante de cualesquiera de las reivindicaciones 8 a 13.

16.- Un oligonucleótido que comprende la hebra antisentido de un nucleótidos de conformidad con cualesquiera de la reivindicaciones 1 a 7.

17.- El oligonucleótído de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque tiene la secuencia de SEQ ID NO: 12.

18.- Un mamífero transgénicos que comprende un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1 a 7.

19.- Un ratón transgénico que comprende un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1 a 7.

20.- Un polipéptido purificado o aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de la esfingosina cinasa de humano como se define en la reivindicación 1 a 7.

21.- El polipéptido recombinante de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque tiene al menos 80% de identidad de aminoácido con un polipéptido de SEQ ID N° 3, o una secuencia complementaria el mismo.

22.- Un polipéptido recombinante purificado o aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

23.- Un método para amplificar un ácido nucleico que codifica una hSK como se define en la reivindicación 1 a 7, dicho método comprendiendo los pasos de: (a) poner en contacto una muestra prueba sospechosa de que contenga el ácido nucleico blanco de hSK, un fragmento una variante del mismo, o una secuencia complementaria al mismo, con un reactivo de reacción de amplificación que comprende un par de iniciadores de amplificación como se define en la reivindicación 4 a 7 el cual puede liquidar bajo condiciones severas, la región de ácido nucleico de hSK a ser amplificado, y (b) opcionalmente, detectar los productos de amplificación.

24.- Un equipo para amplificación que comprende: (a) un par de iniciadores oligonucleótidos como se define en la reivindicación 4 a 7 el cual puede hibridar, bajo condiciones severas al ácido nucleico de hSK a ser amplificado; (b) opcionalmente, los reactivos necesarios para llevar a cabo la reacción de amplificación.

25.- Un método para producir una secuencia de aminoácidos, preferiblemente la secuencia de SEQ ID NO: 3, que comprende los pasos de: (a) insertar el ácido nucleico como se define en la reivindicación 1 a 7 que codifica la secuencia de aminoácidos deseada en un vector apropiado como se define en la reivindicación 8 a 13; o en una célula hospedera como se define en la reivindicación 14 a 15; (b) cultivar, en un medio de cultivo apropiado, una célula hospedera previamente transformada o transfectadas con el vector recombinante del paso (a); (c) cosechar el medio de cultivo así obtenido o lisar la célula hospedera, por ejemplo mediante sonicación o choque osmótico; (d) separar o purificar, a partir de dicho medio de cultivo, o partir del concentrado del lisado de la célula hospedera resultante, el polipéptido recombinante de interés así producido, eventualmente marcado.

26.- Un anticuerpo dirigido en contra de un polipéptido como se define en la reivindicación 20 a 22.

27.-Un método para la selección de moléculas candidatas las cuales son inhibidores de hSK; dicho método comprende los pasos de: -mezclar un polipéptido recombinante como se define en ia reivindicación 20 a 22 con esfingosina, ATP marcado y una molécula de interés candidata; y -medir el nivel de conversión de esfingosina a esfingosina-1 -fosfato marcada (S1 P).

28.- Un equipo para la selección de moléculas candidatos las cuales son inhibidores de hSK, dicho equipo comprendiendo: -un polipéptido recombinante como se define la reivindicación 20 a 22; y, opcionalmente, ATP marcado y esfingosina.