WO2012002274A1 - 培養細胞を用いたｓ１ｐリアーゼ阻害剤のスクリーニング方法 - Google Patents

培養細胞を用いたｓ１ｐリアーゼ阻害剤のスクリーニング方法 Download PDF

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WO2012002274A1
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spl
vitamin
compound
disease
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衛 大豊
正和 田村
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Definitions

  • the present invention relates to a high-speed multi-sample screening method for an S1P lyase inhibitor useful as a novel immunosuppressive agent based on the circulating blood lymphocyte depletion effect.
  • S1P Sphingosine 1-phosphate
  • SPL S1P lyase
  • SPL inhibitors may be novel immunosuppressive agents based on circulating lymphocyte depletion action against avoidance of graft rejection and various autoimmune diseases.
  • the present invention relates to a cultured cell for the purpose of finding a compound that increases the amount of S1P or dihydrosphingosine 1-phosphate (hereinafter referred to as dhS1P) by direct or indirect SPL inhibitory action quickly, conveniently and with high sensitivity. It is to provide a screening method used.
  • dhS1P dihydrosphingosine 1-phosphate
  • the present inventor measures the effect of increasing the amount of intracellular S1P of a test compound quickly and simply by a scintillation proximity assay (SPA) using radioisotope-labeled S1P such as tritium ( 3 H) or dhS1P. methods and found that are greatly improved the detection sensitivity of SPL inhibitory action of the test compound by adjusting the vitamin B 6 such concentration in the medium for use in the assay at, and completed the present invention.
  • SPA scintillation proximity assay
  • a cell-free assay method for sphingosine kinase inhibitors using the above-described SPA is known (International Publication Pamphlet WO02 / 027318). S1P obtained by allowing a compound to act on the cultured cells shown in the present invention.
  • the present invention includes the following inventions.
  • a method for identifying, selecting or testing a compound that inhibits the activity of sphingosine 1-phosphate lyase comprising: (i) seeding and culturing cells expressing sphingosine 1-phosphate lyase, (ii) ) A step of mixing the cells with a labeled lipid substrate and a test compound and culturing; (iii) a step of lysing the cells; or a step of collecting the culture supernatant of the cells; (iv) being phosphorylated (Iii) contacting the cell lysate or culture supernatant of (iii) with a carrier material that binds to the lipid but not to the unphosphorylated lipid, and (v) phosphorylation bound to the carrier.
  • concentration of vitamin B 6 compound is equal to or less than 1 [mu] M, as described in (3) methods.
  • concentration of vitamin B 6 compound is equal to or less than 100 nM, according to (3) methods.
  • cells prior to addition of the test compound is washed with medium without vitamin B 6 compound, wherein the medium in step (ii) is substantially free of vitamin B 6 compound, ( The method according to 3).
  • the SPA beads are RNA-bound yttrium silicate SPA beads.
  • Autoimmune diseases are rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, antiphospholipid antibody syndrome, polymyositis, dermatomyositis, systemic sclerosis, Sjogren's syndrome, polyarteritis nodosa, microscopic polyarteritis, allergy
  • the method according to (12), wherein the disease is granulomatous vasculitis, Wegener's granulomatosis, or mixed connective tissue disease.
  • the allergic disease is atopic dermatitis, allergic rhinitis, hay fever, allergic conjunctivitis, allergic gastroenteritis, bronchial asthma, childhood asthma, food allergy, drug allergy or urticaria The method described.
  • the screening method of the present invention makes it possible to find a compound that increases the amount of S1P or dhS1P by SPL inhibitory action quickly, conveniently, and with high sensitivity.
  • FIG. 3 is a diagram showing that 3 H-dhS1P can be selectively detected by SPA with the same efficiency as the conventional alkali-chloroform extraction method.
  • (1) shows the total radioactivity
  • (2) the radioactivity by alkali-chloroform extraction
  • (3) the radioactivity measured using SPA beads.
  • FIG. 9 shows various effects of siRNA introduction on IT-79MTNC3 cells.
  • (1) shows changes in SPL mRNA expression level due to siRNA introduction
  • (2) shows changes in SPL activity in IT-79MTNC3 cell lysate due to siRNA introduction
  • -Accumulation of dhS1P is shown respectively.
  • FIG. 4 shows the SPL inhibitory action in IT-79MTNC3 cells by 4-deoxypyridoxine (DOP) under normal conditions.
  • FIG. 6 is a graph showing the SPL inhibitory action in IT-79MTNC3 cells by 4-deoxypyridoxine or 2-acetyl-4-tetrahydroxybutylimidazole (THI) under the condition of removing vitamin B 6 compounds.
  • (1) shows the results of the SPA bead assay
  • (2) shows the results of measuring the amount of intracellular S1P by LC-MS
  • (3) shows the results of measuring the SPL activity in the cell lysate.
  • the concentration of DOP or THI in (1) is 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 ⁇ M, 10 ⁇ M, 100 ⁇ M, and 1 mM from the left of the graph, respectively.
  • the concentrations of DOP in (2) and (3) are not added, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 ⁇ M, and 10 ⁇ M, respectively, from the left of the graph.
  • FIG. 3 is a graph showing that the addition of fumonisin B1 (FB1) improves the signal / background ratio for detection of SPL inhibitory action (intracellular 3 H-dhS1P accumulation) by 4-deoxypyridoxine.
  • FB1 fumonisin B1
  • the screening method in the present specification means a method for identifying, selecting or testing a compound that inhibits the activity of sphingosine 1-phosphate lyase.
  • a labeled lipid substrate such as 3 H-labeled sphingosine ( 3 H-Sph) or 3 H-labeled dihydrosphingosine ( 3 H-dhSph)
  • 3 H-Sph 3 H-labeled sphingosine
  • 3 H-dhSph 3 H-labeled dihydrosphingosine
  • SPHKs sphingosine kinases
  • SPPs S1P phosphatases
  • 3 H-S1P or a part of 3 H-dhS1P accumulated inside is secreted extracellularly. Therefore, if the amount of 3 H-S1P or 3 H-dhS1P in the culture supernatant is increased, it can be determined that the test compound also has SPL inhibitory activity.
  • a ceramide synthase inhibitor for example, fumonisin B1 or an inhibitor of SPPs
  • an improvement in signal / background ratio and an improvement in the acquisition probability of an SPL-specific compound can be expected.
  • the same effect can be expected by knocking out or knocking down the S1P phosphatase gene or the ceramide synthase gene.
  • the S1P phosphatase gene include S1P phosphatase-1 and S1P phosphatase-2, and examples of the ceramide synthase gene include LAG1 homolog, ceramide synthase 1 to 6.
  • the cultured cells used in the present invention can be appropriately selected from cells such as IT-79MTNC3 cells, which are mouse thymic epithelium-derived cell lines, using SPL protein expression as an indicator. It is also possible to use cells in which an expression vector incorporating the SPL gene is introduced into cultured cells such as 293 cells, CHO cells, NIH-3T3 cells, and COS7 cells.
  • the genes used as SPL genes are the human SPL gene registered with GenBank with accession number: NM_003901, the mouse SPL gene registered with accession number: NM_009163, or the rat SPL gene registered with accession number: NM_173116 As long as it is a gene encoding a protein having SPL activity, it is not limited to the above gene group.
  • the radioactivity of 3 H-S1P or 3 H-dhS1P accumulated in the cells is mixed with a scintillation reagent (eg, RNA Binding YSi SPA Scintillation Beads, PerkinElmer) as a carrier after lysis of the cells using an appropriate solution. Then, it is detected by using a scintillation measuring machine.
  • a scintillation reagent eg, RNA Binding YSi SPA Scintillation Beads, PerkinElmer
  • the radioactivity of 3 H-S1P or 3 H-dhS1P in the culture supernatant can be measured by adding the above carrier to the culture supernatant.
  • 3 H-S1P or 3 H-dhS1P is not affected by 3 H-Sph / 3 H-dhSph coexisting in the cell lysate or culture supernatant or various degradation products generated by the SPL reaction. Only radioactivity is selectively detected.
  • the amount of 3 H-S1P or 3 H-dhS1P accumulated in the cells or secreted into the culture supernatant can be measured easily and quickly without the need for an extraction operation using an organic solvent. Compared with the existing method that required the lipid extraction operation, the specimen processing ability is greatly improved.
  • the common properties of the solutions used for lysis of cells in the present invention are that they have the ability to lyse cells and do not interfere with the binding of carriers to 3 H-S1P / 3 H-dhS1P (and scintillation luminescence). Can be mentioned. Therefore, the above solution needs to contain a surfactant such as Triton or Nonidet.
  • a commercially available buffer mixture is used as the buffer used for cell lysis, but the usable solution is not limited to this.
  • the cells of the present invention are used. It has been confirmed that the phosphorylated labeled lipid accumulated in the cell can be measured.
  • vitamin B 6 such in the medium used during the assay
  • the medium used for normal cell culture contains about 5 to 20 ⁇ M of pyridoxine, which is a vitamin B 6 class, but the sensitivity can be improved by selecting a concentration lower than this.
  • To increase the most sensitive uses medium was completely removed vitamin B 6 compound. This makes it possible to detect the action of a compound (for example, THI) for which an in vitro SPL inhibitory action has not been found by the conventional method.
  • THI in vitro SPL inhibitory action has not been found by the conventional method.
  • a preferable medium in the assay system of the present invention is a medium having a vitamin B 6 class concentration of 1 ⁇ M or less, more preferably a medium having a vitamin B 6 class concentration of 100 nM or less, and more preferably a test compound. and cells are washed with medium without vitamin B 6 such before the addition, a medium without vitamin B 6 such substantially.
  • this assay can be performed using a 96-well, 384-well, etc. multiwell plate, it can be easily automated. Accordingly, a compound that directly or indirectly inhibits intracellular SPL can be selected by high-speed multi-analyte screening.
  • test compound examples include compounds, microbial metabolites, extracts of plants and animal tissues, derivatives thereof or mixtures thereof.
  • nucleic acids or derivatives thereof including antisense oligonucleotides, ribozymes, dsRNA, siRNA, etc.
  • the dose and concentration of the test compound can be set as appropriate, or multiple doses can be set, for example, by preparing a dilution series, and can be administered in an appropriate state such as solid or liquid. May be dissolved in a suitable buffer, or a stabilizer may be added.
  • cultured cells are used, and a test compound is added to a medium for use.
  • the test compound may be added from the beginning of the culture or may be added during the culture, and the number of additions is not limited to one.
  • the period of culturing in the presence of the test compound may be appropriately set, but is preferably 30 minutes to 2 weeks, more preferably 2 hours to 72 hours, and further preferably 5 hours to 24 hours.
  • the compound processing time in an Example is 5 hours, it is not limited to this processing time.
  • a preferred assay format is a scintillation assay such as a scintillation proximity assay (SPA).
  • SPA scintillation proximity assay
  • PPO organic scintillant
  • Assays are usually performed in aqueous buffers using radioactive isotopes such as 3 H, 125 I, 14 C, 35 S or 33 P that emit low energy radiation whose energy is easily lost in an aqueous environment. Is called. For example, electrons emitted by 3 H only have an average energy of 6 keV and have a very short path length in water.
  • the emitted radiation causes The scintillant is activated and light is generated.
  • the amount of light generated is proportional to the amount of labeled molecules bound to the beads and can be conveniently measured with a liquid scintillation (LS) counter. If the labeled molecule is not bound to the bead, its radiant energy is absorbed by the surrounding aqueous solvent before reaching the bead and no light is generated.
  • LS liquid scintillation
  • the bound ligand provides a scintillation signal, while the free ligand provides a very low background, thus eliminating the need for time-consuming separation steps that are characteristic of conventional radioligand binding assays.
  • the operations required in the assay are reduced to a few simple pipetting steps, which results in better accuracy and reproducibility and greater throughput.
  • the method of the invention comprises binding a radiolabeled phospholipid (eg, sphingosine-1-P) to SPA beads.
  • the binding is preferably via chemical or physical interaction with yttrium silicate beads or yttrium oxide beads, although other binding means may be envisaged. More specifically, the binding is due to the interaction between the phosphate group of the phosphorylated substrate and the support surface (ie, a bond different from the covalent bond).
  • Labeled unphosphorylated lipids eg 3 H-Sph or 3 H-dhSph
  • SPHKs labeled phosphorylated lipids
  • labeled phosphorylated lipids eg 3 H-S1P or 3 H-dhS1P
  • the resulting phospholipid is normally rapidly degraded by SPL, but by adding a compound that inhibits the action of SPL, an increase in the amount of labeled phospholipid is observed.
  • the present invention discloses a novel method for screening for a compound that inhibits SPL activity using a specific carrier material.
  • the carrier material has the ability to bind to a substrate of an SPL reaction, such as a phosphorylated lipid, but does not have the ability to bind to a substrate, such as a non-phosphorylated lipid. Therefore, the amount of lipid bound to the carrier shows a negative correlation with the SPL activity of the cultured cells.
  • the carrier may contain a functional group (such as an antibody or other reactive group) that allows the discrimination between phosphorylated and non-phosphorylated lipids, or from a substance that has the ability to distinguish the lipid. Can be configured (or can include such materials).
  • the carrier can be at least partially composed of silicate, polyvinyltoluene (PVT), (poly) acrylamide, agarose, sepharose, polystyrene, and the like.
  • carrier materials include PVT or silicate materials optionally coated with a ligand such as WGA, streptavidin, polylysine. More preferred materials include yttrium oxide or yttrium silicate (YtSi), which are optionally coated or functionalized, or PVT.
  • the carrier contains scintillant (ie, organic scintillant).
  • the scintillant is preferably insoluble in water and can be excited to a higher energy state when the labeled lipid is bound to the carrier.
  • the scintillant must provide sufficient light energy that can be detected using a suitable device (eg, a scintillation counter).
  • a suitable device eg, a scintillation counter.
  • a typical example of scintillant is diphenyloxazole (PPO). This scintillant is efficiently excited by a radioisotope that emits beta rays.
  • Suitable carrier materials for use in the present invention can be found in commercial products, for example, PerkinElmer products WGA coated PVT beads (RPNQ0001), PEI treated WGA PVT beads (RPNQ0003), streptavidin coated PVT beads (RPNQ0007). ), Polylysine-coated yttrium silicate beads (RPNQ0010), WGA-coated yttrium silicate beads (RPNQ0011), streptavidin-coated yttrium silicate beads (RPNQ0012) and RNA-bound yttrium silicate SPA beads (RPNQ0013) or membrane-bound yttrium oxide SPA beads. (RPNQ0280).
  • the labeled lipid used in the present invention is preferably radiolabeled. Radiolabeling can be performed using a variety of radioisotopes including 3 H, 125 I, 14 C, 35 S, 33 P or 32 P.
  • the radioisotope preferably emits low energy radiation whose energy is readily lost in an aqueous environment. It is necessary that the unbound labeled substrate essentially does not activate the scintillant contained in the carrier material.
  • the nature of the isotope can also be selected depending on the type of scintillant. For example, when PPO is used as the scintillant, the isotope is preferably one that emits beta rays, such as 3 H.
  • the amount of labeled lipid used for the assay can be adjusted by one skilled in the art. In a typical experiment, 0.01-10 ⁇ M, preferably 0.02-1 ⁇ M lipid and 0.01-0.5 ⁇ Ci of 3 H-Sph or 3 H-dhSph are used for each assay. In Examples of the present specification, 0.05 ⁇ Ci of labeled substrate is used at a concentration of 1 ⁇ M, but the radioactivity and concentration of labeled lipid used in the assay are not limited to this. Absent. The number of cells used in the assay depends on the SPL activity of the cells and can be adjusted by those skilled in the art.
  • Medicament containing SPL inhibitor The compound found by the screening method of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof has an excellent ability to inhibit S1P lyase, and therefore can suppress the activity of the immune system. Therefore, inflammatory bowel disease (IBD) (eg, ulcerative colitis, Crohn's disease, etc.), autoimmune disease (eg, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, antiphospholipid antibody syndrome, polymyositis, dermatomyositis, systemic Skin sclerosis, Sjogren's syndrome, polyarteritis nodosa, microscopic polyarteritis, allergic granulomatous vasculitis, Wegener's granulomatosis, mixed connective tissue disease), multiple sclerosis (MS), allergic To prevent or treat diseases such as atopic dermatitis, allergic rhinitis (hay fever), allergic conjunctivitis, allergic gastroenteritis, bronchial asthma, childhood asthma,
  • a pharmaceutical composition containing a compound found by the screening method of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient is administered to a mammal (eg, human, horse, cow, pig, etc., preferably human). In this case, it can be administered systemically or locally, orally or parenterally.
  • a mammal eg, human, horse, cow, pig, etc., preferably human.
  • it can be administered systemically or locally, orally or parenterally.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared by selecting an appropriate form according to the administration method and preparing various preparations usually used.
  • Examples of the form of an oral pharmaceutical composition include tablets, pills, powders, granules, capsules, liquids, suspensions, emulsions, syrups, elixirs and the like.
  • the preparation of such a pharmaceutical composition includes excipients, binders, disintegrants, lubricants, swelling agents, swelling aids, coating agents, plasticizers, stabilizers, antiseptics, anti-fouling agents, ordinarily used as additives.
  • An oxidizing agent, a coloring agent, a solubilizing agent, a suspending agent, an emulsifying agent, a sweetening agent, a preservative, a buffering agent, a diluent, a wetting agent and the like are appropriately selected as necessary, and can be produced according to a conventional method.
  • parenteral pharmaceutical compositions include injections, ointments, gels, creams, poultices, patches, sprays, inhalants, sprays, eye drops, nasal drops, suppositories, and inhalations. Agents and the like.
  • Preparation of the pharmaceutical composition in such a form involves the use of stabilizers, preservatives, solubilizers, moisturizers, preservatives, antioxidants, flavoring agents, gelling agents, neutralizing agents, and dissolution agents that are commonly used as additives
  • Adjuvants, buffers, isotonic agents, surfactants, colorants, buffering agents, thickeners, wetting agents, fillers, absorption enhancers, suspending agents, binders, etc. are selected as needed. However, it can be produced according to a conventional method.
  • the dose of the compound found by the screening method of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof varies depending on symptoms, age, body weight, etc., but in the case of oral administration, it is 1 to several times a day for each adult.
  • the amount in terms of compound is 1 to 2000 mg, preferably 1 to 400 mg per administration.
  • the amount in terms of compound is 0.01 to 500 mg, preferably 1 to several times a day for each adult. Is 0.1 to 300 mg.
  • RNA Binding YSi SPA Scintillation Beads (SPA beads, PerkinElmer, RPNQ0013) was diluted 8-fold to contain glycerol at a final concentration of 50%. Dispense 20 ⁇ L each into a 96-well white plate (OptiPlate-96 (white, 96-well), PerkinElmer), add 50 ⁇ L of each of the above 3 H-labeled compound dilutions, mix, and add a clear plate seal Covered with (TopSeal-A, PerkinElmer) and allowed to stand overnight at room temperature and protected from light. The next day, radioactivity was measured with a microplate scintillation counter (TopCount NXT, PerkinElmer).
  • DMEM DMEM-0.1% BSA
  • BSA bovine serum albumin
  • BSA bovine serum albumin
  • siRNA transfection Three types of siRNA against mouse SPL (Silencer select Pre-designed siRNA, Ambion, s 73643-s7434) were prepared in IT-79MTNC3 cells prepared at 1 ⁇ 10 6 cells / 100 ⁇ L with Nucleofector Solution L (Lonza). Alternatively, 200 pmol of negative control siRNA (QIAGEN) was added and transfected with program T-030 using Nucleofector II (Amaxa).
  • sonication with a sonicator HandySonic, Tommy Seiko
  • a negative control was prepared by reacting for 1 hour on ice.
  • SPA of siRNA transfected cells In order to detect the accumulation of 3 H-dhS1P in IT-79MTNC3 cells knocked down with the SPL gene by SPA, the transfected cells were suspended in DMEM-10% FBS containing 25 ⁇ M fumonisin B1 (Enzo Life Sciences). A 96-well plate for cell culture (Sumitomo Bakelite) was seeded at 1 ⁇ 10 4 cells / well and cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for 24 hours or 48 hours.
  • DMEM-0.1% BSA containing 8.3 nM 3 H-dhSph and 1 ⁇ M dhSph (Enzo Life Sciences) was added, and the mixture was added at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2. Incubated for 1 minute. After removing the culture supernatant, 70 ⁇ L of cell lysis buffer was added and left at room temperature for 2 hours. 50 ⁇ L of this was mixed with 20 ⁇ L of SPA beads (diluted 8 times so as to contain a final concentration of 50% glycerol) in a 96-well white plate, covered with a transparent plate seal, and protected from light at room temperature. Left overnight. The next day, radioactivity was measured with a microplate scintillation counter.
  • DMEM-0.1% BSA or VB 6 -free DMEM-0.1% BSA
  • a serially diluted test compound is added, and then 37 ° C., 5% CO
  • IT-79MTNC3 cells were suspended in DMEM-10% FBS containing 25 ⁇ M fumonisin B1, and 5 ⁇ in a 24-well plate for cell culture. The cells were seeded at 10 4 cells / well and cultured overnight at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 .
  • DMEM-0.1% BSA or VB 6 -free DMEM-0.1% BSA
  • a serially diluted test compound was added, and the culture supernatant was added at 37 ° C., 5% CO
  • 50 ⁇ L of DMEM-0.1% BSA (or VB 6 -free DMEM-0.1% BSA) containing 10 ⁇ M Sph (Enzo Life Sciences) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. The cells were cultured for 30 minutes in the presence of 5% CO 2 .
  • DMEM-0.1% BSA or VB 6 -free DMEM-0.1% BSA
  • a serially diluted test compound is added, and then 37 ° C., 5% CO
  • 55 ⁇ L of DMEM-0.1% BSA (or VB 6 -free DMEM-0.1% BSA) containing 10 ⁇ M dhSph was added, and the mixture was incubated at 37 ° C., 5% CO 2. Incubated for 30 minutes in the presence.
  • FIG. 4 shows the results of various assays under normal conditions.
  • the non-specific SPL inhibitor 4-deoxypyridoxine (DOP) showed a concentration-dependent response with SPA. Similarly, the action of DOP was detected in almost the same concentration range for intracellular S1P amount and SPL activity in lysate.
  • FIG. 5 shows the results of various assays under the conditions of using VB 6 -free DMEM.
  • the effective concentration of 4-deoxypyridoxine (DOP), a non-specific SPL inhibitor, in SPA was greatly reduced as compared to the normal use of DMEM. Furthermore, a concentration-dependent effect was also detected on THI.
  • DOP 4-deoxypyridoxine
  • These test compounds also acted in substantially the same concentration range with respect to intracellular S1P amount and SPL activity in lysate.
  • IT-79MTNC3 cells were suspended in DMEM-10% FBS containing 0 or 25 ⁇ M fumonisin B1, and 96-wells for cell culture were used. The plate was seeded at 1 ⁇ 10 4 cells / well and cultured overnight at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 . On the next day, after removing the culture supernatant once, 40 ⁇ L of DMEM-0.1% BSA containing (or not containing) DOP was added and cultured in the presence of 37 ° C.
  • the screening method of the present invention makes it possible to quickly, easily and highly sensitively detect a compound exhibiting an immunosuppressive action due to an SPL inhibitory action.

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Abstract

　ＳＰＬ阻害作用によってスフィンゴシン１－リン酸またはジヒドロスフィンゴシン１－リン酸量を増加させる化合物を迅速、簡便、そして高感度に見出すことを目的とする、培養細胞を用いたスクリーニング法を提供すること。　シンチレーション近接アッセイ（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ　ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ　ａｓｓａｙ；　ＳＰＡ）で迅速、簡便に測定する方法、およびアッセイ時に使用する培地中のビタミンＢ６類濃度を調節することによって、化合物作用の検出感度を大幅に向上させた方法の提供等。

Description

培養細胞を用いたＳ１Ｐリアーゼ阻害剤のスクリーニング方法
本発明は、循環血中リンパ球減少作用に基づく新規免疫抑制剤として有用な、Ｓ１Ｐリアーゼ阻害剤の高速多検体スクリーニング法に係る。
　スフィンゴシン１－リン酸（以下、Ｓ１Ｐ）は、細胞増殖、生存、遊走などを制御する生理活性脂質であり、血管新生やリンパ球遊走に重要な役割を果たすことが知られている（例えば非特許文献１を参照）。循環血中および各組織中におけるＳ１Ｐ濃度は複数の酵素によって厳密に制御されており、とりわけＳ１Ｐを非可逆的に切断する酵素であるＳ１Ｐリアーゼ（以下、ＳＰＬ）は、リンパ球循環に必要な血中－リンパ組織間のＳ１Ｐ濃度勾配の形成に必須の因子と考えられている。事実、ＳＰＬノックアウトマウスを用いた解析では、リンパ組織中におけるＳ１Ｐ濃度の飛躍的な上昇とともに、循環血中のリンパ球数の大幅な減少が観察されている（例えば非特許文献２参照）。また、末梢血中リンパ球数減少作用を有する２－アセチル－４－テトラヒドロキシブチルイミダゾール（以下、ＴＨＩ）は、ｉｎ　ｖｉｖｏでリンパ組織中のＳＰＬ活性を低下させることにより、Ｓ１Ｐ濃度勾配の形成を阻害すると報告されている（例えば非特許文献３参照）。これらの知見から、移植片拒絶反応の回避や各種自己免疫疾患に対して、ＳＰＬ阻害剤が循環血中リンパ球減少作用に基づく新規免疫抑制剤となる可能性が期待されている。
　ＳＰＬ阻害剤をスクリーニングするにあたっては、これまでに、無細胞系でのＳＰＬ酵素活性を指標としたアッセイ方法がいくつか報告されている（例えば非特許文献４乃至６参照）。しかし、現在までにＳＰＬ特異的な阻害剤は報告されていない。前述のＴＨＩについても、ｉｎ　ｖｉｖｏではＳＰＬ阻害作用を示すにもかかわらず、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでは作用が確認されていない。一方、ＳＰＬを阻害することによって細胞内Ｓ１Ｐが蓄積することが知られているが、これを指標とした細胞系スクリーニングの実施例は見当たらない。細胞内のＳ１Ｐ量を測定する方法は既にいくつか知られている（例えば非特許文献７乃至１０参照）ものの、いずれも煩雑な脂質抽出操作が必要であり、検体処理能力が低いことが問題と考えられる。また、上述のＴＨＩについては、培養細胞を用いた実験系でも作用は確認されていない。これについては、既存の実験条件が最適化されていないために、作用を検出できていないものと考えられる。
Ｅｘｐｅｒｔ　Ｏｐｉｎ　Ｔｈｅｒ　Ｔａｒｇｅｔｓ．　２００９；１３（８）：１０１３－１０２５． ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ．　２００９；４（１）：ｅ４１１２． Ｓｃｉｅｎｃｅ．　２００５；３０９（５７４１）：１７３５－１７３９． Ｊ　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ．　２００７；４８（１２）：２７６９－２７７８． Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ．　２００９；３８０（２）：３６６－３７０． Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．　２００９；１０（５）：８２０－８２２． Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１９９５；２３０：３１５－３２０． Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１９９９；２７２：８０－８６． Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２０００；２８２：１１５－１２０． Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ　＆　Ｏｈｔｅｒ　Ｌｉｐｉｄ　Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ．　２００７；８４：１５４－１６２．
　本発明は、直接または間接的なＳＰＬ阻害作用によってＳ１Ｐまたはジヒドロスフィンゴシン１－リン酸（以下、ｄｈＳ１Ｐ）量を増加させる化合物を迅速、簡便、そして高感度に見出すことを目的とする、培養細胞を用いたスクリーニング法を提供することにある。
　本発明者は、被験化合物の細胞内Ｓ１Ｐ量増加作用を、トリチウム（３Ｈ）などのラジオアイソトープ標識Ｓ１ＰまたはｄｈＳ１Ｐを用いて、シンチレーション近接アッセイ（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ　ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ　ａｓｓａｙ；　ＳＰＡ）で迅速、簡便に測定する方法、およびアッセイ時に使用する培地中のビタミンＢ６類濃度を調節することによって被験化合物のＳＰＬ阻害作用の検出感度を大幅に向上させられることを見出し、本発明を完成させた。なお、上記のＳＰＡを応用したスフィンゴシンキナーゼ阻害剤の無細胞系でのアッセイ方法が知られている（国際公開パンフレットＷＯ０２／０２７３１８）が、本発明で示される培養細胞に化合物を作用させてのＳ１Ｐ量を測定するものではなく、被験化合物のＳＰＬ阻害作用の検出感度の向上を示すものでもない。また、ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるＴＨＩの効果がビタミンＢ６類の投与によって解除されることが知られていた（Ｓｃｉｅｎｃｅ．　２００５；３０９（５７４１）：１７３５－１７３９．）が、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいてビタミンＢ６類の除去によってＴＨＩ等のＳＰＬ阻害作用の検出感度が向上可能であることは確認されておらず、本発明に記載のアッセイ法を使用することによって初めて達成された。
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）　スフィンゴシン１－リン酸リアーゼの活性を阻害する化合物を同定、選択または試験する方法であって、（ｉ）スフィンゴシン１－リン酸リアーゼを発現する細胞を播種して培養する工程、（ｉｉ）該細胞に、標識された脂質基質および被験化合物を混合して培養する工程、（ｉｉｉ）該細胞を溶解する工程、または該細胞の培養上清を分取する工程、（ｉｖ）リン酸化された脂質と結合するが、リン酸化されていない脂質とは結合しない担体材料に（ｉｉｉ）の細胞溶解物、または培養上清を接触させる工程、および（ｖ）該担体に結合しているリン酸化されている脂質量を測定する工程、（ｖｉ）被験化合物を含まない場合と比較してリン酸化された脂質量が増加していることを指標としてスフィンゴシン１－リン酸リアーゼの活性が阻害されていると判断する工程、を含む方法。
（２）　脂質基質がスフィンゴシンまたはジヒドロスフィンゴシンであることを特徴とする（１）に記載の方法。
（３）　工程（ｉ）および／または（ｉｉ）において、ビタミンＢ６類の濃度が通常の培地よりも低い培地を用いて細胞を培養することを特徴とする、（１）または（２）に記載の方法。
（４）　ビタミンＢ６類の濃度が２０μＭ以下であることを特徴とする、（３）に記載の方法。
（５）　ビタミンＢ６類の濃度が１μＭ以下であることを特徴とする、（３）に記載の方法。
（６）　ビタミンＢ６類の濃度が１００ｎＭ以下であることを特徴とする、（３）に記載の方法。
（７）　被験化合物の添加の前に細胞がビタミンＢ６類を含まない培地で洗浄されており、工程（ｉｉ）において培地がビタミンＢ６類を実質的に含まないことを特徴とする、（３）に記載の方法。
（８）　担体がＳＰＡビーズであることを特徴とする、（１）乃至（７）のいずれか一つに記載の方法。
（９）　ＳＰＡビーズが、ＲＮＡ結合ケイ酸イットリウムＳＰＡビーズであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
（１０）　工程（ｉ）および／または（ｉｉ）において、セラミドシンターゼ阻害剤が添加されることを特徴とする、（１）乃至（９）のいずれか一つに記載の方法。
（１１）　セラミドシンターゼ阻害剤がフモニシンＢ１であることを特徴とする、（１０）に記載の方法。
（１２）　炎症性腸疾患、自己免疫疾患、多発性硬化症もしくはアレルギー性疾患を予防または治療するための化合物を同定、選択または試験するための（１）乃至（１１）のいずれか一つに記載の方法。
（１３）　炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎またはクローン病である、（１２）に記載の方法。
（１４）　自己免疫疾患が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質抗体症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、全身性皮膚硬化症、シェーグレン症候群、結節性多発動脈炎、顕微鏡的多発動脈炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎、ウェゲナー肉芽腫症または混合性結合組織病である、（１２）に記載の方法。
（１５）　アレルギー性疾患が、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、花粉症、アレルギー性結膜炎、アレルギー性胃腸炎、気管支喘息、小児喘息、食物アレルギー、薬物アレルギーまたは蕁麻疹である、（１２）に記載の方法。 
　本発明のスクリーニング法によって、ＳＰＬ阻害作用によってＳ１ＰまたはｄｈＳ１Ｐ量を増加させる化合物を迅速、簡便、そして高感度に見出すことが可能となる。
本発明のスクリーニング法の原理を示した模式図である。 ＳＰＡによって、従来のアルカリ－クロロホルム抽出法と同等の効率で、３Ｈ－ｄｈＳ１Ｐを選択的に検出できることを示した図である。（１）は全放射活性を、（２）はアルカリ‐クロロホルム抽出による放射活性を、（３）ＳＰＡビーズを使用して測定された放射活性を、それぞれ示している。 ｓｉＲＮＡ導入がＩＴ－７９ＭＴＮＣ３細胞に及ぼす各種効果を示した図である。（１）はｓｉＲＮＡ導入によるＳＰＬ　ｍＲＮＡ発現量の変化を、（２）はｓｉＲＮＡ導入によるＩＴ－７９ＭＴＮＣ３細胞ライセート中のＳＰＬ活性の変化を、（３）はｓｉＲＮＡ導入によるＩＴ－７９ＭＴＮＣ３細胞内の３Ｈ－ｄｈＳ１Ｐの蓄積を、それぞれ示している。なお、各グラフの測定結果は、グラフの左から、それぞれネガティブコントロールｓｉＲＮＡ導入細胞２４時間培養時、ｓ７３６４３導入細胞２４時間培養時、ｓ７３６４４導入細胞２４時間培養時、ｓ７３６４５導入細胞２４時間培養時、ネガティブコントロールｓｉＲＮＡ導入細胞４８時間培養時、ｓ７３６４３導入細胞４８時間培養時、ｓ７３６４４導入細胞４８時間培養時、ｓ７３６４５導入細胞４８時間培養時のものである。 通常条件下での４－デオキシピリドキシン（ＤＯＰ）によるＩＴ－７９ＭＴＮＣ３細胞におけるＳＰＬ阻害作用を示した図である。（１）はＳＰＡビーズアッセイの結果を、（２）はＬＣ－ＭＳによる細胞内Ｓ１Ｐ量の測定結果を、（３）は細胞ライセート中のＳＰＬ活性の測定結果を、それぞれ示している。なお、各グラフにおけるＤＯＰ濃度は、グラフの左から、それぞれ０μＭ、１．６μＭ、８μＭ、４０μＭ、２００μＭ、１０００μＭである。 ビタミンＢ６類除去条件下での４－デオキシピリドキシンまたは２－アセチル－４－テトラヒドロキシブチルイミダゾール（ＴＨＩ）によるＩＴ－７９ＭＴＮＣ３細胞におけるＳＰＬ阻害作用を示した図である。（１）はＳＰＡビーズアッセイの結果を、（２）はＬＣ－ＭＳによる細胞内Ｓ１Ｐ量の測定結果を、（３）は細胞ライセート中のＳＰＬ活性の測定結果を、それぞれ示している。なお、（１）におけるＤＯＰまたはＴＨＩの濃度は、グラフの左から、それぞれ未添加、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、１ｍＭである。また、（２）および（３）におけるＤＯＰの濃度は、グラフの左から、それぞれ未添加、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭである。さらに（２）および（３）におけるＴＨＩの濃度は、グラフの左から、それぞれ未添加、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、１ｍＭである。 フモニシンＢ１（ＦＢ１）の添加によって、４－デオキシピリドキシンによるＳＰＬ阻害作用（細胞内の３Ｈ－ｄｈＳ１Ｐの蓄積）検出のシグナル／バックグラウンド比が向上することを示した図である。
１．新規ＳＰＬ活性測定系の構築
　新たに構築したスクリーニング法の原理を図１に示す。なお、本明細書中におけるスクリーニング法とは、スフィンゴシン１－リン酸リアーゼの活性を阻害する化合物を同定、選択または試験する方法を意味する。培養細胞に標識された脂質基質、例えば３Ｈ標識スフィンゴシン（３Ｈ－Ｓｐｈ）または３Ｈ標識ジヒドロスフィンゴシン（３Ｈ－ｄｈＳｐｈ）を添加して細胞内に取り込ませた後、内在的に発現している、または強制発現させたスフィンゴシンキナーゼ（ＳＰＨＫｓ）によって、リン酸化された脂質、例えば３Ｈ標識Ｓ１Ｐ（３Ｈ－Ｓ１Ｐ）または３Ｈ標識ｄｈＳ１Ｐ（３Ｈ－ｄｈＳ１Ｐ）に変換させる。これらのリン酸化脂質は、速やかにＳＰＬによる非可逆的切断またはＳ１Ｐホスファターゼ（ＳＰＰｓ）による脱リン酸化を受けるが、このときＳＰＬ活性を阻害することによって分解速度を遅らせ、これらを細胞内に蓄積させる。すなわち、被験化合物の添加時において、被験化合物の非添加時と比較して３Ｈ－Ｓ１Ｐまたは３Ｈ－ｄｈＳ１Ｐの細胞内における蓄積量が増加していれば、該被験化合物はＳＰＬ阻害活性を有すると判断することができる。また、ある種の細胞株では細胞内で生成されたＳ１ＰまたはｄｈＳ１Ｐは細胞外に分泌されることが示されており（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．２００６；１０３（４４）：１６３９４－１６３９９）、細胞内に蓄積された３Ｈ－Ｓ１Ｐまたは３Ｈ－ｄｈＳ１Ｐの一部は細胞外に分泌されると考えられる。従って、培養上清中の３Ｈ－Ｓ１Ｐまたは３Ｈ－ｄｈＳ１Ｐ量が増加していれば、同じく該被験化合物はＳＰＬ阻害活性を有すると判断することができる。なお、このときセラミドシンターゼ阻害剤（例えば、フモニシンＢ１）やＳＰＰｓの阻害剤を処理しておくことにより、シグナル／バックグラウンド比の向上や、ＳＰＬ特異的な化合物の取得確率向上が期待できる。また、Ｓ１Ｐホスファターゼ遺伝子またはセラミドシンターゼ遺伝子をノックアウトまたはノックダウンすることによっても同様の効果が期待できる。Ｓ１Ｐホスファターゼ遺伝子としては、Ｓ１Ｐ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ－１、Ｓ１Ｐ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ－２を、またセラミドシンターゼ遺伝子としては、ＬＡＧ１　ｈｏｍｏｌｏｇ，ｃｅｒａｍｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　１乃至６を挙げることができる。
　本発明で使用される培養細胞は、マウス胸腺上皮由来細胞株であるＩＴ－７９ＭＴＮＣ３細胞等の細胞をＳＰＬ蛋白質の発現を指標として適宜選択することが可能である。また、２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ－３Ｔ３細胞、ＣＯＳ７細胞などの培養細胞に、ＳＰＬ遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入した細胞を使用することも可能である。ＳＰＬ遺伝子として使用される遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号：ＮＭ＿００３９０１で登録されたヒトＳＰＬ遺伝子、アクセッション番号：ＮＭ＿００９１６３で登録されたマウスＳＰＬ遺伝子、またはアクセッション番号：ＮＭ＿１７３１１６で登録されたラットＳＰＬ遺伝子を挙げることができるが、ＳＰＬ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子である限り、上記の遺伝子群に限定されない。
　細胞内に蓄積した３Ｈ－Ｓ１Ｐまたは３Ｈ－ｄｈＳ１Ｐの放射活性は、適当な溶液を用いて細胞を溶解した後に、担体となるシンチレーション試薬（例えば、ＲＮＡ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　ＹＳｉ　ＳＰＡ　Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ　Ｂｅａｄｓ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）と混合し、シンチレーション測定機を用いることにより検出する。また、培養上清に上記の担体を加えることによって、培養上清中の３Ｈ－Ｓ１Ｐまたは３Ｈ－ｄｈＳ１Ｐの放射活性を測定することが可能である。これにより、細胞溶解液または培養上清中に共存する３Ｈ－Ｓｐｈ／３Ｈ－ｄｈＳｐｈや、ＳＰＬ反応によって生成する各種分解産物の影響を受けずに、３Ｈ－Ｓ１Ｐまたは３Ｈ－ｄｈＳ１Ｐの放射活性のみを選択的に検出する。この方法を用いることによって、有機溶媒を用いる抽出操作を必要とせずに、細胞内に蓄積した、または培養上清に分泌された３Ｈ－Ｓ１Ｐまたは３Ｈ－ｄｈＳ１Ｐ量を簡便、迅速に測定することが可能となり、脂質抽出操作が必要であった既存の方法に比較して、検体処理能力が格段に向上する。
　本発明において細胞の溶解に使用される溶液の共通の性質として、細胞を溶解する能力を有すること、および担体と３Ｈ－Ｓ１Ｐ／３Ｈ－ｄｈＳ１Ｐの結合（およびシンチレーション発光）を妨げないことを挙げることができる。従って、上記の溶液には、Ｔｒｉｔｏｎ、ノニデット等の界面活性剤が含まれていることが必要である。なお、本明細書の実施例では細胞の溶解に使用されるバッファーとして、市販のバッファーの混合物を使用しているが、使用可能な溶液はこれに限定されるものではない。例えば５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝７．５）、１ｍＭ　Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ　ＮａＦ、０．１％ＢＳＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００等の自作バッファーを用いた場合でも、本発明の方法で細胞内に蓄積したリン酸化された標識脂質が測定可能であることが確認されている。
　さらに、アッセイ時に使用する培地中のビタミンＢ６類の濃度を調節することにより、被験化合物の効果濃度を低下させ、アッセイ系としての感度を向上させる。通常の細胞培養に使用される培地には、ビタミンＢ６類であるピリドキシンが５～２０μＭ程度含まれているが、これより低い濃度を選択することによって、感度を向上させることが可能である。最も感度を高めるためには、ビタミンＢ６類を完全に除去した培地を使用する。これにより、従来法ではｉｎ　ｖｉｔｒｏのＳＰＬ阻害作用が見出されていなかった化合物（例えばＴＨＩ）についても、その作用を検出することが可能となる。試験に用いる培養細胞の由来種ごとに適切なビタミンＢ６類の濃度を選択することによって、より生体内に近い条件で被験化合物を評価することが可能となる。本発明のアッセイ系における好適な培地はビタミンＢ６類の濃度が１μＭ以下の培地であり、より好適にはビタミンＢ６類の濃度が１００ｎＭ以下の培地であり、さらに好適には、被験化合物の添加の前に細胞がビタミンＢ６類を含まない培地で洗浄されており、ビタミンＢ６類を実質的に含まない培地である。
　このアッセイ法は９６穴、３８４穴などのマルチウエルプレートを用いて実施できるため、容易にオートメーション化することができる。従って、細胞内ＳＰＬを直接または間接的に阻害する化合物を高速多検体スクリーニングによって選抜することが可能となる。
　被験化合物としては、化合物、微生物の代謝産物、植物や動物組織の抽出物、それらの誘導体またはそれらの混合物等を挙げることができる。また、ＳＰＬの発現量を低下するように設計された核酸またはその誘導体（アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等を含む）を、被験化合物として使用することも可能である。被験化合物の投与量や濃度は適宜設定するか、または例えば希釈系列を作製するなどして複数種の投与量を設定してもよく、固体、液体等適当な状態で投与することができ、適当なバッファーに溶解するか、あるいは安定化剤等を加えてもよい。本発明のスクリーニング法では培養細胞を用いており、被験化合物を培地に添加して使用する。被験化合物ついては、培養開始時から添加してもよいし、培養途中で添加しても良く、また、添加の回数も１回に限らない。被験化合物存在下で培養する期間も適宜設定してよいが、好ましくは３０分乃至２週間であり、より好ましくは、２時間乃至７２時間であり、さらに好ましくは５時間乃至２４時間である。なお、実施例における化合物処理時間は５時間であるが、この処理時間に限定されるものではない。
 
２．本発明において使用されるアッセイ方法と担体材料
　いくつかのアッセイ形式を、本発明の方法を実施するために使用することができるが、好ましいアッセイ形式は、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）などのシンチレーションアッセイである。ＳＰＡ技術は、ＰＰＯなどの有機シンチラントを含有するシンチラントビーズの使用を伴う。アッセイは通常、水性環境ではそのエネルギーが容易に消失する低エネルギー放射線を放射する、３Ｈ、１２５Ｉ、１４Ｃ、３５Ｓまたは３３Ｐなどの放射性同位体を使用して水性緩衝液中で行われる。例えば、３Ｈにより放射される電子は、６ｋｅＶの平均エネルギーを有するにすぎず、水中では非常に短い経路長を有する。これらの同位体の１つで標識された分子が、直接的に、またはビーズに以前に結合させられた別の分子との相互作用を介してビーズ表面に結合した場合、放射される放射線により、シンチラントが活性化され、光が発生する。発生する光の量は、ビーズに結合している標識された分子の量に比例しており、液体シンチレーション（ＬＳ）カウンターで簡便に測定することができる。標識された分子がビーズに結合していない場合、その放射エネルギーは、ビーズに到達する前に周りの水性溶媒によって吸収され、光が発生しない。したがって、結合したリガンドはシンチレーションシグナルをもたらすが、遊離状態のリガンドは非常に低いバックグラウンドをもたらし、したがって、従来の放射性リガンド結合アッセイの特徴である時間のかかる分離工程の必要性がなくなる。アッセイにおいて必要とされる操作は数回の簡単なピペット操作工程に減らされ、これにより、より良好な正確性および再現性ならびにより大きいスループットが得られる。
　より好ましい態様において、本発明の方法は、放射能標識されたリン酸化脂質（例えば、スフィンゴシン－１－Ｐ）をＳＰＡビーズに結合させることを含む。結合は、他の結合手段も考えられ得るが、好ましくは、ケイ酸イットリウムビーズまたは酸化イットリウムビーズとの化学的または物理的な相互作用を介して行われる。より具体的には、結合は、リン酸化された基質のリン酸基と担体表面との相互作用（すなわち、共有結合的な結合とは異なる結合）による。標識されたリン酸化されていない脂質（例えば、３Ｈ－Ｓｐｈまたは３Ｈ－ｄｈＳｐｈ）がＳＰＨＫｓによってリン酸化を受け、標識されたリン酸化脂質（例えば、３Ｈ－Ｓ１Ｐまたは３Ｈ－ｄｈＳ１Ｐ）が生成される。生じたリン酸化脂質は通常ＳＰＬによって速やかに分解されるが、ＳＰＬの作用を阻害する化合物を添加することによって、標識されたリン酸化脂質量の増加が観察される。
　次に、本発明は、特定の担体材料を使用してＳＰＬ活性を阻害する化合物をスクリーニングする新規な方法を開示する。担体材料は、リン酸化された脂質などのＳＰＬ反応の基質と結合する能力を有するが、リン酸化されていない脂質などの基質と結合する能力を有していない。したがって、担体に結合した脂質の量は、培養細胞のＳＰＬ活性に対して負の相関を示す。担体は、リン酸化された脂質とリン酸化されていない脂質との該識別を可能にする官能基（抗体または他の反応基など）を含み得るか、あるいは該脂質を識別する能力を有する物質から構成され得る（またはそのような物質を含み得る）。
　担体は、少なくとも一部が、ケイ酸塩、ポリビニルトルエン（ＰＶＴ）、（ポリ）アクリルアミド、アガロース、セファロース、ポリスチレンなどから構成され得る。担体材料の具体的な例には、ＷＧＡ、ストレプトアビジン、ポリリシンなどのリガンドで場合によりコーティングされたＰＶＴまたはケイ酸塩物質が挙げられる。より好ましい物質は、酸化イットリウムもしくはケイ酸イットリウム（ＹｔＳｉ）（これらは場合によりコーティングもしくは官能化される）、またはＰＶＴを含む。
　より好ましい態様において、担体はシンチラント（すなわち、有機シンチラント）を含有する。シンチラントは、好ましくは、水に不溶性であり、標識された脂質が担体に結合したときに、より高いエネルギー状態に励起され得る。シンチラントは、好適な装置（例えば、シンチレーションカウンター）を使用して検出される十分な光エネルギーをもたらさなければならない。シンチラントの典型的な例には、ジフェニルオキサゾール（ＰＰＯ）がある。このシンチラントは、β線を放出する放射性同位体によって効率的に励起される。
　本発明において使用される好適な担体材料は市販品の中に見出すことができ、例えば、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製品のＷＧＡコーティングＰＶＴビーズ（ＲＰＮＱ０００１）、ＰＥＩ処理ＷＧＡ　ＰＶＴビーズ（ＲＰＮＱ０００３）、ストレプトアビジンコーティングＰＶＴビーズ（ＲＰＮＱ０００７）、ポリリシンコーティングケイ酸イットリウムビーズ（ＲＰＮＱ００１０）、ＷＧＡコーティングケイ酸イットリウムビーズ（ＲＰＮＱ００１１）、ストレプトアビジンコーティングケイ酸イットリウムビーズ（ＲＰＮＱ００１２）およびＲＮＡ結合ケイ酸イットリウムＳＰＡビーズ（ＲＰＮＱ００１３）または膜結合酸化イットリウムＳＰＡビーズ（ＲＰＮＱ０２８０）などがある。
　本発明で使用される標識された脂質は、好ましくは放射能標識されている。放射能標識は、３Ｈ、１２５Ｉ、１４Ｃ、３５Ｓ、３３Ｐまたは３２Ｐを含む様々な放射性同位体を使用して行うことができる。放射性同位体は、好ましくは、水性環境においてそのエネルギーが容易に消失する低エネルギー放射線を放出するものである。結合していない標識された基質は、担体材料に含有されるシンチラントを本質的には活性化しないことが必要である。同位体の性質は、シンチラントのタイプに依存してもまた選択され得る。例えば、ＰＰＯがシンチラントとして使用される場合、同位体は、好ましくは例えば３Ｈなど、β線を放射するものである。
　アッセイのために使用される標識された脂質の量は当業者によって調節され得る。典型的な実験では、０．０１～１０μＭ、好ましくは０．０２～１μＭの脂質が、０．０１～０．５μＣｉの３Ｈ－Ｓｐｈまたは３Ｈ－ｄｈＳｐｈが各アッセイについて使用される。なお、本明細書の実施例中では、０．０５μＣｉの標識基質を１μＭの濃度で使用しているが、アッセイに使用される標識された脂質の放射活性および濃度はこれに限定されるものではない。アッセイに使用される細胞数は、該細胞の有するＳＰＬ活性に依存し、当業者によって調節され得る。
 
３．ＳＰＬ阻害剤を含有する医薬
　本発明のスクリーニング方法によって見出される化合物またはその薬学的に許容され得る塩は、優れたＳ１Ｐリアーゼ阻害能を有するので、免疫系の活動を抑制することができる。従って、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病など）、自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質抗体症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、全身性皮膚硬化症、シェーグレン症候群、結節性多発動脈炎、顕微鏡的多発動脈炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、混合性結合組織病など）、多発性硬化症（ＭＳ）、アレルギー性疾患（例えば、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎（花粉症）、アレルギー性結膜炎、アレルギー性胃腸炎、気管支喘息、小児喘息、食物アレルギー、薬物アレルギー、蕁麻疹など）を予防または治療するために、あるいは、移植に対する拒絶反応を抑制するための医薬組成物の有効成分として、本発明のスクリーニング方法によって見出される化合物またはその薬学的に許容され得る塩を用いることができる。
　本発明のスクリーニング方法によって見出される化合物またはその薬学的に許容され得る塩を有効成分として含有する医薬組成物は、哺乳動物（例えば、ヒト、ウマ、ウシ、ブタなど、好ましくはヒト）に投与される場合には、全身的または局所的に、経口または非経口で投与され得る。
　本発明の医薬組成物は、投与方法に応じて適切な形態を選択し、通常用いられている各種製剤の調製法によって調製できる。
　経口用の医薬組成物の形態としては、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤などが挙げられる。かかる形態の医薬組成物の調製は、添加剤として通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、膨潤剤、膨潤補助剤、コーティング剤、可塑剤、安定剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、甘味剤、保存剤、緩衝剤、希釈剤、湿潤剤などを必要に応じて適宜選択し、常法に従って製造され得る。
　非経口用の医薬組成物の形態としては、注射剤、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、湿布剤、貼付剤、噴霧剤、吸入剤、スプレー剤、点眼剤、点鼻剤、座剤、吸入剤などが挙げられる。かかる形態の医薬組成物の調製は、添加剤として通常用いられる安定化剤、防腐剤、溶解補助剤、保湿剤、保存剤、抗酸化剤、着香剤、ゲル化剤、中和剤、溶解補助剤、緩衝剤、等張剤、界面活性剤、着色剤、緩衝化剤、増粘剤、湿潤剤、充填剤、吸収促進剤、懸濁化剤、結合剤などを必要に応じて適宜選択し、常法に従って製造され得る。
　本発明のスクリーニング方法によって見出される化合物またはその薬学的に許容され得る塩の投与量は、症状、年齢、体重などにより異なるが、経口投与の場合には、１日１～数回、成人一人一回当たり、化合物換算量で１～２０００ｍｇ、好ましくは１～４００ｍｇであり、非経口投与の場合には、１日１～数回、成人一人一回当たり、化合物換算量０．０１～５００ｍｇ、好ましくは０．１～３００ｍｇである。
 
実施例
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　ＳＰＡによる３Ｈ－ｄｈＳ１Ｐの検出
　３Ｈ－ｄｈＳ１Ｐ（６０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＡＲＴ０６１８）または３Ｈ－ｄｈＳｐｈ（６０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＡＲＴ０４６０）を細胞融解バッファー（Ｃｉｓｂｉｏ社製ＩＰ－Ｏｎｅ　Ｔｂ　Ｋｉｔのコンポーネントである、ＩＰ－Ｏｎｅ　Ｔｂ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　＆　ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒとＩＰ１　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（１×）の３：７混合液）で段階希釈した。
　全放射活性を調べるために、上記の３Ｈ標識化合物の希釈液それぞれ５０μＬを５ｍＬの液体シンチレーター（Ｈｉｏｎｉｃ－Ｆｌｕｏｒ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）と混合して、液体シンチレーションカウンター（Ａｌｏｋａ）により放射活性を測定した。
　既存の分離抽出法の効率を調べるために、上記の３Ｈ標識化合物の希釈液それぞれ５０　μＬに対して、５０μＬの０．２Ｍ水酸化ナトリウム溶液と１００μＬのクロロホルム：メタノール（２：１）混合液を添加し、激しく攪拌した後に８，４００Ｇ、室温で３分間遠心し、水層を７０μＬとって５ｍＬの液体シンチレーターと混合後、液体シンチレーションカウンターで放射活性を測定した。
　ＳＰＡによる３Ｈ－ｄｈＳ１Ｐの検出効率について調べるために、ＲＮＡ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　ＹＳｉ　ＳＰＡ　Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ　Ｂｅａｄｓ（ＳＰＡビーズ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＲＰＮＱ００１３）を終濃度５０％のグリセロールを含むように８倍希釈した。これを９６穴白色プレート（ＯｐｔｉＰｌａｔｅ－９６（ｗｈｉｔｅ，９６－ｗｅｌｌ）、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に２０μＬずつ分注した後、上記の３Ｈ標識化合物の希釈液それぞれ５０μＬを添加して混合し、透明なプレートシール（ＴｏｐＳｅａｌ－Ａ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で覆って室温、遮光下で一晩放置した。翌日、マイクロプレートシンチレーションカウンター（ＴｏｐＣｏｕｎｔ　ＮＸＴ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で放射活性を測定した。
　結果を図２に示す。ＳＰＡによって、従来のアルカリ－クロロホルム抽出法と同等の効率で、３Ｈ－ｄｈＳ１Ｐを選択的に検出できた。
　ｓｉＲＮＡ導入が及ぼす各種効果の確認
　１）細胞培養および培地
　マウス胸腺上皮由来細胞株（ＩＴ－７９ＭＴＮＣ３細胞、ヒューマンサイエンス振興財団細胞バンク）は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＤＭＥＭ－１０％ＦＢＳ）を用いて３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養された。トランスフェクションやアッセイで使用する際には、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて剥離させたのち、遠心して細胞を回収した。化合物を処理したり３Ｈ－ｄｈＳｐｈを取り込ませたりする際には、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ－０．１％ＢＳＡ）または０．１％ＢＳＡを含むビタミンＢ６類除去ダルベッコ変法イーグル培地（ＶＢ６－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭ、細胞科学研究所）（ＶＢ６－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭ－０．１％ＢＳＡ）を使用した。
　２）ｓｉＲＮＡトランスフェクション
　Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｌ（Ｌｏｎｚａ）で１×１０６細胞／１００μＬに調製したＩＴ－７９ＭＴＮＣ３細胞に、マウスＳＰＬに対する３種配列のｓｉＲＮＡ（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ　ｓｅｌｅｃｔ　Ｐｒｅ－ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｓｉＲＮＡ、Ａｍｂｉｏｎ、ｓ７３６４３～ｓ７３６４５）またはネガティブコントロールｓｉＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ）を２００ｐｍｏｌ添加し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ　ＩＩ（Ａｍａｘａ）を用いて、プログラムＴ－０３０でトランスフェクションした。
　３）リアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現解析
　ノックダウン効率を調べるために、トランスフェクションした細胞をＤＭＥＭ－１０％ＦＢＳに懸濁し、細胞培養用６穴プレート（住友ベークライト）に２×１０５細胞／ウエルで播種して、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間または４８時間培養した。培養後のＩＴ－７９ＭＴＮＣ３細胞からＲＮＡ抽出用キット（ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ）を用いて全ＲＮＡを抽出し、さらにＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いてｃＤＮＡを調製した。これを鋳型として、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）と、マウスグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子またはマウスＳＰＬ遺伝子に対する特異的プライマー（Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　Ｐｒｉｍｅｒ、タカラバイオ）を用いて、リアルタイムＰＣＲシステム（Ｍｘ４０００　Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により、各々のサンプルのＳＰＬ　ｍＲＮＡの相対定量解析を行った。結果は、ネガティブコントロールｓｉＲＮＡ導入細胞のＳＰＬ　ｍＲＮＡ発現量に対する比として算出した。
　４）ｓｉＲＮＡトランスフェクションした細胞ライセート中のＳＰＬ活性測定
　ＳＰＬ遺伝子をノックダウンしたＩＴ－７９ＭＴＮＣ３細胞のライセートを調製するために、トランスフェクションした細胞をＤＭＥＭ－１０％　ＦＢＳに懸濁し、細胞培養用１２穴プレート（住友ベークライト）に１．５×１０５細胞／ウエルで播種して、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間または４８時間培養した。培養後のＩＴ－７９ＭＴＮＣ３細胞を回収し、１２０μＬのホモジェナイズバッファー（５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ＝７．４）、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、１０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＤＴＴ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ））を添加し、ソニケーター（ＨａｎｄｙＳｏｎｉｃ、トミー精工）で超音波処理を施した後、１，０００Ｇ、４℃で３分間遠心して得た上清を細胞ライセートとした。このうち一部を用いて、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によるタンパク定量を実施した。
　細胞ライセート中のＳＰＬ活性を測定するために、ホモジェナイズバッファーにて０．６ｍｇタンパク質／ｍＬに希釈し、基質である３Ｈ－ｄｈＳ１Ｐ（３．４ｎＭ）と反応バッファー（０．１Ｍ　リン酸カリウム溶液（ｐＨ＝７．４）、２５ｍＭ　ＮａＦ、５ｍＭ　Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＤＴＴ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００、２μＭｃｏｌｄ　ｄｈＳ１Ｐ）と混合して５０μＬとし、３７℃で１時間反応させた。氷上で１時間反応させたものを陰性対照とした。反応後に５０μＬの０．２Ｍ水酸化ナトリウム溶液と１００μＬのクロロホルム：メタノール（２：１）混合液を添加し、激しく攪拌した後に８，４００Ｇ、室温で３分間遠心し、有機層を３０μＬとって５ｍＬの液体シンチレーターと混合後、液体シンチレーションカウンターで放射活性を測定した。得られたカウントはＳＰＬ反応による分解産物量を反映しているものとし、結果はネガティブコントロールｓｉＲＮＡ導入細胞のＳＰＬ活性に対する比として算出した。
　５）ｓｉＲＮＡトランスフェクションした細胞のＳＰＡ
　ＳＰＬ遺伝子をノックダウンしたＩＴ－７９ＭＴＮＣ３細胞内の３Ｈ－ｄｈＳ１Ｐの蓄積をＳＰＡで検出するために、トランスフェクションした細胞を２５μＭ　フモニシンＢ１（Ｅｎｚｏ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むＤＭＥＭ－１０％ＦＢＳに懸濁し、細胞培養用９６穴プレート（住友ベークライト）に１×１０４細胞／ウエルで播種して、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間または４８時間培養した。培養上清を一旦除去した後、８．３ｎＭ　３Ｈ－ｄｈＳｐｈおよび１μＭ　ｄｈＳｐｈ（Ｅｎｚｏ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むＤＭＥＭ－０．１％ＢＳＡを５０μＬ添加して、３７℃、５％ＣＯ２存在下で３０分間培養した。培養上清を除去した後、７０μＬの細胞融解バッファーを加えて室温で２時間放置した。このうち５０μＬを、予め９６穴白色プレートに２０μＬずつ分注したＳＰＡビーズ（終濃度５０％のグリセロールを含むように８倍希釈したもの）と混合し、透明なプレートシールで覆って室温、遮光下で一晩放置した。翌日、マイクロプレートシンチレーションカウンターで放射活性を測定した。
　結果を図３に示す。ｓｉＲＮＡ導入によって、ＳＰＬ　ｍＲＮＡ発現量は２４時間後で８６％以上、４８時間後で６７％以上抑制された。また、これに応じたライセート中ＳＰＬ活性の低下も確認できた。さらに、構築したＳＰＡによって、細胞内３Ｈ－ｄｈＳ１Ｐの蓄積を検出することができた。
　既知阻害剤を用いたＳＰＬ活性測定
　１）既知ＳＰＬ阻害剤を用いたＳＰＡ
　被験化合物の３Ｈ－ｄｈＳ１Ｐ蓄積作用を評価するために、ＩＴ－７９ＭＴＮＣ３細胞を２５μＭフモニシンＢ１を含むＤＭＥＭ－１０％ＦＢＳに懸濁し、細胞培養用９６穴プレートに１×１０４細胞／ウエルで播種して、３７℃、５％ＣＯ２存在下で一昼夜培養した。翌日、培養上清を一旦除去した後、段階希釈した被験化合物を含むＤＭＥＭ－０．１％ＢＳＡ（またはＶＢ６－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭ－０．１％ＢＳＡ）を４０μＬ添加して３７℃、５％ＣＯ２存在下で４．５時間培養した後、８３ｎＭの３Ｈ－ｄｈＳｐｈおよび５μＭ　ｄｈＳｐｈを含むＤＭＥＭ－０．１％ＢＳＡ（またはＶＢ６－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭ－０．１％ＢＳＡ）を１０μＬ添加して、３７℃、５％ＣＯ２存在下で３０分間培養した。培養上清を除去した後、７０μＬの細胞融解バッファーを加えて室温で２時間放置した。このうち５０μＬを、予め９６穴白色プレートに２０μＬずつ分注したＳＰＡビーズ（終濃度５０％のグリセロールを含むように８倍希釈したもの）と混合し、透明なプレートシールで覆って室温、遮光下で一晩放置した。翌日、マイクロプレートシンチレーションカウンターで放射活性を測定した。なお、ＶＢ６－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭを用いて実施する場合は、被験化合物を含む培地を添加する前に１５０μＬのＶＢ６－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭ－０．１％　ＢＳＡで２回洗浄することにより、播種時に用いたＤＭＥＭに含まれるＶＢ６類のキャリーオーバーを防止した。
　２）細胞内Ｓ１ＰのＬＣ－ＭＳ測定
　被験化合物のＳ１Ｐ蓄積作用を評価するために、ＩＴ－７９ＭＴＮＣ３細胞を２５μＭフモニシンＢ１を含むＤＭＥＭ－１０％ＦＢＳに懸濁し、細胞培養用２４穴プレートに５×１０４細胞／ウエルで播種して、３７℃、５％ＣＯ２存在下で一昼夜培養した。翌日、培養上清を一旦除去した後、段階希釈した被験化合物を含むＤＭＥＭ－０．１％ＢＳＡ（またはＶＢ６－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭ－０．１％ＢＳＡ）を４５０μＬ添加して３７℃、５％ＣＯ２存在下で４．５時間培養した後、１０μＭ　Ｓｐｈ（Ｅｎｚｏ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むＤＭＥＭ－０．１％ＢＳＡ（またはＶＢ６－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭ－０．１％ＢＳＡ）を５０μＬ添加して、３７℃、５％ＣＯ２存在下で３０分間培養した。培養上清を除去し、ＰＢＳで洗浄した後に細胞を回収し、アセトニトリル：１Ｍ塩酸（４：１）混合液を１５０μＬ添加してソニケーターで超音波処理を施した。Ｓ１Ｐ量は、ＬＣ－ＭＳにより三菱化学メディエンス株式会社で測定された。なお、ＶＢ６－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭを用いて実施する場合は、被験化合物を含む培地を添加する前に６００μＬのＶＢ６－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭ－０．１％　ＢＳＡで２回洗浄することにより、播種時に用いたＤＭＥＭに含まれるＶＢ６類のキャリーオーバーを防止した。
　３）化合物処理した細胞ライセート中のＳＰＬ活性の測定
　被験化合物を処理した細胞のライセートを調製するために、ＩＴ－７９ＭＴＮＣ３細胞を２５μＭフモニシンＢ１を含むＤＭＥＭ－１０％ＦＢＳに懸濁し、細胞培養用１２穴プレートに１×１０５細胞／ウエルで播種して、３７℃，５％ＣＯ２存在下で一昼夜培養した。翌日、培養上清を一旦除去した後、段階希釈した被験化合物を含むＤＭＥＭ－０．１％　ＢＳＡ（またはＶＢ６－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭ－０．１％　ＢＳＡ）を５００μＬ添加して３７℃、５％　ＣＯ２存在下で４．５時間培養した後、１０μＭ　ｄｈＳｐｈを含むＤＭＥＭ－０．１％　ＢＳＡ（またはＶＢ６－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭ－０．１％ＢＳＡ）を５５μＬ添加して、３７℃、５％ＣＯ２存在下で３０分間培養した。ＰＢＳで洗浄した後にＩＴ－７９ＭＴＮＣ３細胞を回収し、１５０μＬのホモジェナイズバッファーを添加してソニケーターで超音波処理を施した後、１，０００Ｇ、４℃で３分間遠心して得た上清を細胞ライセートとした。このうち一部を用いて、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によるタンパク定量を実施した。なお、ＶＢ６－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭを用いて実施する場合は、被験化合物を含む培地を添加する前に１ｍＬのＶＢ６－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭ－０．１％　ＢＳＡで２回洗浄することにより、播種時に用いたＤＭＥＭに含まれるＶＢ６類のキャリーオーバーを防止した。
　化合物処理した細胞から調製したライセート中のＳＰＬ活性を測定するために、ホモジェナイズバッファーにて１ｍｇタンパク質／ｍＬに希釈し、基質である３Ｈ－ｄｈＳ１Ｐ（３．４ｎＭ）と反応バッファー（０．１Ｍ　リン酸カリウム溶液（ｐＨ＝７．４）、２５ｍＭ　ＮａＦ、５ｍＭ　Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＤＴＴ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００、２μＭｃｏｌｄ　ｄｈＳ１Ｐ）と混合して５０μＬとし、３７℃で１時間反応させた。氷上で１時間反応させたものを陰性対照とした。反応後に５０μＬの０．２Ｍ水酸化ナトリウム溶液と１００μＬのクロロホルム：メタノール（２：１）混合液を添加し、激しく攪拌した後に８，４００Ｇ、室温で３分間遠心し、有機層を３０μＬとって５ｍＬの液体シンチレーターと混合後、液体シンチレーションカウンターで放射活性を測定した。得られたカウントはＳＰＬ反応による分解産物量を反映しているものとし、各サンプルのＳＰＬ活性は、化合物非処理群に対する比として算出した。
　図４は、通常条件下での各種アッセイ結果を示す。非特異的ＳＰＬ阻害剤である４－デオキシピリドキシン（ＤＯＰ）は、ＳＰＡで濃度依存的なレスポンスを示した。同様に、細胞内Ｓ１Ｐ量や、ライセート中ＳＰＬ活性についても、ほぼ同じ濃度域でＤＯＰの作用を検出した。
　図５は、ＶＢ６－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭ使用条件での各種アッセイ結果を示す。非特異的ＳＰＬ阻害剤である４－デオキシピリドキシン（ＤＯＰ）のＳＰＡにおける効果濃度は、通常ＤＭＥＭ使用時に比べて大幅に低下した。さらに、ＴＨＩにも濃度依存的な作用を検出した。これらの被験化合物は、細胞内Ｓ１Ｐ量や、ライセート中ＳＰＬ活性についても、ほぼ同じ濃度域で作用を示した。
　なお、別途、ビタミンＢ６類のＳＰＬ活性阻害作用に対する影響を確認したところ、通常のＤＭＥＭ（約２０μＭのピリドキシンを含む）を用いた場合のＤＯＰのＥＣ５０は４６μＭであったが、１μＭピリドキシン存在下では１．６μＭ、１００ｎＭピリドキシン存在下では２７ｎＭであった。また、ＴＨＩは通常のＤＭＥＭを用いた場合、または１μＭピリドキシン存在下ではＳＰＬ活性に対する阻害作用は観察できなかったが、１００ｎＭピリドキシン存在下でのＥＣ５０は約２５０μＭであり、ＳＰＬ阻害活性が観察可能であった。このようにビタミンＢ６類の濃度を通常の細胞培養に使用される培地よりも低下させることによって、ＳＰＬ阻害作用測定の感度を向上させることが可能であった。
　フモニシンＢ１処理の影響検討
　フモニシンＢ１処理によるシグナル／バックグラウンド比の向上効果について検討するために、ＩＴ－７９ＭＴＮＣ３細胞を０または２５μＭフモニシンＢ１を含むＤＭＥＭ－１０％ＦＢＳに懸濁し、細胞培養用９６穴プレートに１×１０４細胞／ウエルで播種して、３７℃、５％ＣＯ２存在下で一昼夜培養した。翌日、培養上清を一旦除去した後、ＤＯＰを含む（または含まない）ＤＭＥＭ－０．１％ＢＳＡを４０μＬ添加して３７℃、５％ＣＯ２存在下で４．５時間培養した後、４２ｎＭの３Ｈ－ｄｈＳｐｈおよび５μＭ　ｄｈＳｐｈを含むＤＭＥＭ－０．１％ＢＳＡを１０μＬ添加して、３７℃、５％ＣＯ２存在下で３０分間培養した。培養上清を除去した後、７０μＬの細胞融解バッファーを加えて室温で２時間放置した。このうち５０μＬを、予め９６穴白色プレートに２０μＬずつ分注したＳＰＡビーズ（終濃度５０％のグリセロールを含むように８倍希釈したもの）と混合し、透明なプレートシールで覆って室温、遮光下で一晩放置した。翌日、マイクロプレートシンチレーションカウンターで放射活性を測定した。
　結果を図６に示す。フモニシンＢ１を予め処理しておくことによって、アッセイのシグナル／バックグラウンド比を向上させることが可能であった。
　本発明のスクリーニング法によって、ＳＰＬ阻害作用により免疫抑制作用を示す化合物を迅速、簡便、そして高感度に見出すことが可能となる。

Claims (15)

  1. 　スフィンゴシン１－リン酸リアーゼの活性を阻害する化合物を同定、選択または試験する方法であって、（ｉ）スフィンゴシン１－リン酸リアーゼを発現する細胞を播種して培養する工程、（ｉｉ）該細胞に、標識された脂質基質および被験化合物を混合して培養する工程、（ｉｉｉ）該細胞を溶解する工程、または該細胞の培養上清を分取する工程、（ｉｖ）リン酸化された脂質と結合するが、リン酸化されていない脂質とは結合しない担体材料に（ｉｉｉ）の細胞溶解物、または培養上清を接触させる工程、および（ｖ）該担体に結合しているリン酸化されている脂質量を測定する工程、（ｖｉ）被験化合物を含まない場合と比較してリン酸化された脂質量が増加していることを指標としてスフィンゴシン１－リン酸リアーゼの活性が阻害されていると判断する工程、を含む方法。
  2. 　脂質基質がスフィンゴシンまたはジヒドロスフィンゴシンであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 　工程（ｉ）および／または（ｉｉ）において、ビタミンＢ６類の濃度が通常の培地よりも低い培地を用いて細胞を培養することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　ビタミンＢ６類の濃度が２０μＭ以下であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
  5. 　ビタミンＢ６類の濃度が１μＭ以下であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
  6. 　ビタミンＢ６類の濃度が１００ｎＭ以下であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
  7. 　被験化合物の添加の前に細胞がビタミンＢ６類を含まない培地で洗浄されており、工程（ｉｉ）において培地がビタミンＢ６類を実質的に含まないことを特徴とする、請求項３に記載の方法。
  8. 　担体がＳＰＡビーズであることを特徴とする、請求項１乃至７のいずれか一つに記載の方法。
  9. 　ＳＰＡビーズが、ＲＮＡ結合ケイ酸イットリウムＳＰＡビーズであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
  10. 　工程（ｉ）および／または（ｉｉ）において、セラミドシンターゼ阻害剤が添加されることを特徴とする、請求項１乃至９のいずれか一つに記載の方法。
  11. 　セラミドシンターゼ阻害剤がフモニシンＢ１であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
  12. 　炎症性腸疾患、自己免疫疾患、多発性硬化症もしくはアレルギー性疾患を予防または治療するための化合物を同定、選択または試験するための請求項１乃至１１のいずれか一つに記載の方法。
  13. 　炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎またはクローン病である、請求項１２に記載の方法。
  14. 　自己免疫疾患が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質抗体症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、全身性皮膚硬化症、シェーグレン症候群、結節性多発動脈炎、顕微鏡的多発動脈炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎、ウェゲナー肉芽腫症または混合性結合組織病である、請求項１２に記載の方法。
  15. 　アレルギー性疾患が、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、花粉症、アレルギー性結膜炎、アレルギー性胃腸炎、気管支喘息、小児喘息、食物アレルギー、薬物アレルギーまたは蕁麻疹である、請求項１２に記載の方法。
     
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001518303A (ja) * 1997-09-29 2001-10-16 チルドレンズ ホスピタル メディカル センター オブ ノーザン カリフォルニア スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼポリペプチド、ポリヌクレオチド、ならびにそれらについての調節剤および使用方法
WO2002027318A1 (en) 2000-09-29 2002-04-04 Warner-Lambert Company Llc Methods and compositions for screening modulators of lipid kinases
JP2005531285A (ja) * 2002-01-17 2005-10-20 チルドレンズ ホスピタル アンド リサーチ センター アット オークランド スフィンゴ脂質代謝および／またはシグナル伝達の調節のための組成物および方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4567194A (en) 1983-03-10 1986-01-28 The Coca-Cola Company 2-Acylimidazole compounds, their synthesis and use as medicinal agents
AU2881797A (en) 1996-05-31 1998-01-05 University Of Wollongong, The Acetyl derivatives of thiazoles and analogues
JP2008530135A (ja) 2005-02-14 2008-08-07 ユニバーシティ オブ バージニア パテント ファンデーション アミノ基およびフェニル基で置換されたシクロアルカンならびに５員の複素環を含むスフィンゴシン＝１−リン酸アゴニスト
US7649098B2 (en) 2006-02-24 2010-01-19 Lexicon Pharmaceuticals, Inc. Imidazole-based compounds, compositions comprising them and methods of their use
TW200848029A (en) 2007-03-01 2008-12-16 Lexicon Pharmaceuticals Inc Heterocyclic compounds, compositions comprising them and methods of their use
TWI412362B (zh) 2007-04-12 2013-10-21 Lexicon Pharmaceuticals Inc （ｅ）-１-（４-（（１ｒ，２ｓ，３ｒ）-１，２，３，４-四羥丁基）-１ｈ-咪唑-２-基）乙酮肟的固體形式
JP5550644B2 (ja) 2008-06-18 2014-07-16 レクシコン ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド （１ｒ，２ｓ，３ｒ）−１−（２−（イソオキサゾール−３−イル）−１ｈ−イミダゾール−４−イル）ブタン−１，２，３，４−テトラオールの固体形態及びその使用方法
JP5645318B2 (ja) 2010-02-18 2014-12-24 第一三共株式会社 イミダゾール誘導体

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001518303A (ja) * 1997-09-29 2001-10-16 チルドレンズ ホスピタル メディカル センター オブ ノーザン カリフォルニア スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼポリペプチド、ポリヌクレオチド、ならびにそれらについての調節剤および使用方法
WO2002027318A1 (en) 2000-09-29 2002-04-04 Warner-Lambert Company Llc Methods and compositions for screening modulators of lipid kinases
JP2004509638A (ja) * 2000-09-29 2004-04-02 ワーナー−ランバート・カンパニー、リミテッド、ライアビリティ、カンパニー 脂質キナーゼの調節因子をスクリーニングするための方法および組成物
JP2005531285A (ja) * 2002-01-17 2005-10-20 チルドレンズ ホスピタル アンド リサーチ センター アット オークランド スフィンゴ脂質代謝および／またはシグナル伝達の調節のための組成物および方法

Non-Patent Citations (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANAL. BIOCHEM., vol. 230, 1995, pages 315 - 320
ANAL. BIOCHEM., vol. 272, 1999, pages 80 - 86
ANAL. BIOCHEM., vol. 282, 2000, pages 115 - 120
BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 380, no. 2, 2009, pages 366 - 370
CHEMBIOCHEM., vol. 10, no. 5, 2009, pages 820 - 822
EXPERT OPIN. THER. TARGETS., vol. 13, no. 8, 2009, pages 1013 - 1025
J. LIPID RES., vol. 48, no. 12, 2007, pages 2769 - 2778
KIM D.H. ET AL.: "Elevation of sphingoid base 1- phosphate as a potential contributor to hepatotoxicity in fumonisin B1-exposed mice.", ARCH. PHARM. RES., vol. 30, no. 8, 2007, pages 962 - 969, XP055069074 *
LE STUNFF H. ET AL.: "Role of sphingosine- 1-phosphate phosphatase 1 in epidermal growth factor-induced chemotaxis.", J. BIOL. CHEM., vol. 279, no. 33, 2004, pages 34290 - 34297, XP055069067 *
PLOS ONE., vol. 4, no. 1, 2009, pages E4112
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA., vol. 103, no. 44, 2006, pages 16394 - 16399
PROSTAGLANDINS & OTHER LIPID MEDIATORS, vol. 84, 2007, pages 154 - 162
REISS U. ET AL.: "Sphingosine-phosphate lyase enhances stress-induced ceramide generation and apoptosis.", J. BIOL. CHEM., vol. 279, no. 2, 2004, pages 1281 - 1290, XP055069068 *
SCHWAB S.R. ET AL.: "Lymphocyte sequestration through SIP lyase inhibition and disruption of SIP gradients.", SCIENCE, vol. 309, no. 5741, 9 September 2005 (2005-09-09), pages 1735 - 1739, XP002629304 *
SCIENCE, vol. 309, no. 5741, 2005, pages 1735 - 1739
See also references of EP2586874A4
SERRA M. ET AL.: "Sphingosine 1-phosphate lyase, a key regulator of sphingosine 1-phosphate signaling and function.", ADV. ENZYME REGUL., vol. 50, no. 1, 13 November 2009 (2009-11-13), pages 349 - 362, XP027035225 *

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