CN102749461A - 游离β人绒毛膜促性腺激素化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种游离β人绒毛膜促性腺激素化学发光免疫定量检测试剂盒，所述试剂盒包括：free β-hCG抗体包被板，free β-hCG抗体酶结合物，free β-hCG校准品，free β-hCG质控品、20倍浓缩洗液，发光液A液和B液，本发明试剂盒具有检测灵敏度高，成本低，操作简单快速的优点，有较高的临床应用价值，本发明提供了这种试剂盒的制备方法。

Description

游离β人绒毛膜促性腺激素化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明属于免疫分析医学领域，具体涉及游离β人绒毛膜促性腺激素（free β-hCG）化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法，可用于定量测定人血清、血浆中的游离β人绒毛膜促性腺激素含量。 

背景技术

人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）由胎盘的滋养层细胞分泌的一种糖蛋白激素，由两个非共价键结合的糖蛋白亚单位，亚基和β亚基。亚基由垂体前叶激素共有，而β亚基是HCG所特有的。与FSH、LH和TSH等不会发生交叉反应，虽然与β-LH的结构相近，但其末端的24个氨基酸是β-LH所没有的，β-亚单位是人绒毛膜促性腺激素所特异的。游离β人绒毛膜促性腺激素（free β-hCG）是非结合状态的HCG的β亚单位，对早期妊娠诊断有重要意义，对与妊娠相关疾病、滋养细胞肿瘤等疾病的诊断、鉴别和病程观察等有一定价值。在临床上可作为测定正常妊娠和妊娠滋养细胞疾病的重要指标。有研究表明，free β-hCG在正常妊娠、异位妊娠、葡萄胎、侵蚀性葡萄、绒癌中依次呈增长趋势，故free β-hCG可作为妊娠滋养细胞肿瘤的另一种敏感而特异的指标，可为判断葡萄胎恶变提供依据。目前free β-hCG更多的用于唐氏综合征的筛查，但其单独使用时存在检出率低，假阳性和假阴性率高的缺点，故常使用几种血清标志物联检来增大检出率。最广泛的组合为妊娠中期的血清三联检测，即AFP、free β-hCG和μE3，阳性检出率为65%~75%。 

目前临床上游离β人绒毛膜促性腺激素定量检测常用方法有：胶 乳集抑制试验和血凝抑制试验、放射免疫试验（RIA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、单克隆抗体胶体金试验、化学发光免疫分析（CLSA）法，其中化学发光免疫分析为当今最为敏感的微量免疫测定法，具有灵敏度高、稳定性好，无污染等优点，目前已广泛应用到基础和临床医学的各个领域，成为取代RIA和ELISA的首选技术。 

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种游离β人绒毛膜促性腺激素（free β-hCG化学发光定量检测试剂盒及其制备方法，解决了灵敏度低，成本高的问题。 

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：游离β人绒毛膜促性腺激素化学发光免疫定量检测试剂盒，包括： 

free β-hCG抗体包被板 

free β-hCG抗体酶结合物 

free β-hCG校准品 

free β-hCG质控品； 

20倍浓缩洗液 

发光液A和发光液B 

其中，所述的free β-hCG抗体包被板为包被含有free β-hCG抗体的96孔或48孔白色微孔板。所述的free β-hCG酶结合物使用的酶是辣根过氧化物酶（HRP），要求纯度RZ≥3.0，活性≥250U/mL。所述的发光液A包含鲁米诺和对碘酚，发光液B包含过氧化脲。所述的20倍浓缩洗液包括75.5g/L Tris，120g/L NaCl，5mL/L Tween-20，1g/LProclin300。溶液澄清、透明、无不溶性颗粒，pH为7.4±0.2。 

本发明还提供了一种制备上述试剂盒的方法，其特征在于包括 以下步骤： 

1）free β-hCG抗体包被板的制备 

将free β-hCG抗体用0.02M pH7.4磷酸盐缓冲液稀释至1~10ug/mL，加入到白色微孔板中，2~8℃包被20~24小时；弃去孔内液体，用pH7.4PBS-T缓冲液洗板，然后加入含有0.5%BSA的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，2～8℃封闭20～24小时；弃去孔内液体，甩干后于30~37℃烘干16~30小时；装入铝箔袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于2~8℃； 

free β-hCG抗体购自Fitzgerald公司，在外观上应澄清透明，无沉淀，蛋白纯度应≥90%，效价应不低于10⁵倍稀释，灵敏度、特异性和稳定性良好。 

2）用酶标记free β-hCG抗体，得free β-hCG抗体酶结合物 

用高碘酸钠氧化法将free β-hCG抗体和辣根过氧化物酶连结在一起； 

3）配制不同浓度的free β-hCG校准品 

将free β-hCG抗原用含有牛血清的校准品稀释液配制成不同浓度的标准品（浓度分别为0，2，5，15，50，200ng/mL）；分装，贴标签，储存于2~8℃； 

4）质控品的配制：在正常人血清中加入适量的free β-hCG纯品，配制低值质控品（QcL）和高值质控品（QcH），其浓度的平均值分别为4.67ng/mL和105.41ng/mL。 

5）配制发光液A液和B液； 

A液是含有0.7g/L鲁米诺和0.165g/L对碘酚的pH8.6的5mmol/LTris·HCl缓冲液；B液是浓度为0.675g/L的过氧化脲，用工艺用水配制。 

6)配制20倍浓缩洗液； 

20倍浓缩洗液的配制方法如下：75.5g/L Tris，120g/L NaCl，5mL/LTween-20，1g/L Proclin300。 

7）组装：将上述试剂组装成盒，储存于2～8℃； 

8）对采用该方法制得的试剂盒进行物理检查，并对准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品测定值和稳定性进行测定。 

其中，所述的包被板为包被含有free β-hCG抗体的96孔或48孔白色微孔板，微孔板应表面光滑，无划痕、破损、飞边、肮脏，加发光液后要求平均本地发光值≤100。所述的发光液A液包含鲁米诺和对碘酚，发光液B液包含过氧化脲。 

本专利发明的试剂盒的测定原理是夹心法，样本加到包被有发热free β-hCG抗体的白色不透明的条板微孔中，再加入free  β-hCG抗体-辣根过氧化物酶（HRP）结合物，温育一段时间后形成固相抗体-β-hCG-酶标抗体复合物。洗掉游离成分。加入底物工作液，在氧化剂作用下，HRP催化鲁米诺生成处于激发态的氨基邻苯二甲酸离子，其恢复到基态时，释放出425nm的光子，于第5～15分钟测定各加样本孔的发光值RLU。样本的RLU与样本free β-hCG浓度呈正相关。样本中的free β-hCG浓度依据由校准品free β-hCG浓度和对应的RLU建立的数学模型进行定量，从而检测人血清、血浆中的free β-hCG含量。 

具有以下优点：（1）反应快速，可在65分钟内判断检测结果，操作简便，无污染；（2）灵敏度高，本试剂盒的分析灵敏度不高于0.5ng/mL；（3）特异性强，与人绒毛膜促性腺激素（hCG）、促黄体生成素（LH）、促卵泡激素（FSH）、促甲状腺激素（TSH）未出 现交叉反应；（4）精密度良好，批内精密度不高于15%，批间精密度不高于20%；（5）稳定性良好，本产品在37℃可存放7天以上，在2~8℃可存放1年；（6）成本低，与市场上同类产品比较，本试剂盒性能良好，成本低，具有临床应用价值。 

附图说明

图1是本发明的博奥赛斯化学发光试剂盒测定free β-hCG与放免试剂盒测定free β-hCG的测定结果比较图，其中纵坐标为博奥赛斯测得的free β-hCG值，横坐标为放免试剂盒测定free β-hCG值，两种方法相关系数（r）=0.9428，直线方程y＝1.0294x-0.8303。 

具体实施方式

实施例1：制备游离β人绒毛膜促性腺激素化学发光免疫定量检测试剂盒 

游离β人绒毛膜促性腺激素化学发光免疫定量检测试剂盒，包括： 

free β-hCG抗体包被的96孔白色微孔板； 

free β-hCG抗体-辣根过氧化物酶（HRP）结合物； 

free β-hCG校准品； 

free β-hCG质控品； 

发光液A液和B液，A液包含鲁米诺和对碘酚，B液包含过氧化脲； 

20倍浓缩液，配方为75.5g/L Tris，120g/L NaCl，5mL/L Tween-20，1g/LProclin300。Proclin300选自美国sigma公司。 

通过下述方法制备游离β人绒毛膜促性腺激素（free β-hCG） 化学发光免疫定量检测试剂盒 

1）包被：将free β-hCG抗体用0.02M pH7.4磷酸盐缓冲液稀释至1~10ug/mL，加入到白色微孔板中，2~8℃包被20~24小时；弃去孔内液体，用pH7.4PBS-T缓冲液洗板，然后加入含有0.5%BSA的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，2～8℃封闭20～24小时；弃去孔内液体，甩干后于30~37℃烘干16~30小时；装入铝箔袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于2~8℃； 

2）将free β-hCG抗体用高碘酸钠氧化法标记辣根过氧化物酶（HRP），用含牛血清白蛋白的PBS缓冲液稀释至工作浓度，并加入辣根过氧化物酶（HRP）稳定剂；经检验灵敏度、特异性和稳定性均达到测定要求；分装，贴标签，储存于2~8℃。 

3）配制不同浓度的free β-hCG校准品 

将free β-hCG抗原用含有牛血清的校准品稀释液配制成不同浓度的标准品（浓度分别为0，2，5，15，50，200ng/mL）；分装，贴标签，储存于2~8℃； 

4）质控品的配制：在正常人血清中加入适量的free β-hCG纯品，配制低值质控品（QcL）和高值质控品（QcH），其浓度的平均值分别为4.67ng/mL和105.41ng/mL。 

5）配制发光液A液和B液； 

A液是含有0.7g/L鲁米诺和0.165g/L对碘酚的pH8.6的5mmol/LTris·HCl缓冲液；B液是浓度为0.675g/L的过氧化脲，用工艺用水配制。 

6)配制20倍浓缩洗液； 

20倍浓缩洗液的配制方法如下：75.5g/L Tris，120g/L NaCl，5mL/L Tween-20，1g/L Proclin300。 

7）组装：将上述试剂组装成盒，储存于2～8℃；其中包含发光液A、发光液B、20倍浓缩洗液、free β-hCG抗体酶结合物各1瓶，free β-hCG抗体包被板1块，free β-hCG校准品6瓶、free β-hCG质控品2瓶。 

8）对采用该方法制得的试剂盒进行物理检查，并对准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品测定值和稳定性进行测定。 

说明： 

（1）物理检查 

液体组分应澄清，无沉淀或絮状物；其他组分应无包装破损。 

（2）准确性 

试剂盒校准品与企业标准品系列同时进行分析测定，用双对数数学模型拟合，要求两条剂量-反应曲线不显著偏离平行（t检验，|t|<2.447）；以企业标准品为对照品，用双对数数学模型拟合，试剂盒校准品的实测值与标示值比值的平均值应在0.9~1.1范围内。 

企业校准品是将free β-hCG纯品用校准品稀释液配成校准品浓储液，由国家标准品为其定值（free β-hCG纯品国家标准品批号为：150535-9903），浓度分别为0，2，5，15，50，200ng/mL，储存于-20℃。 

（3）剂量-反应曲线的线性 

用双对数数学模型拟合，剂量-反应曲线相关系数r应不低于0.99。 

（4）分析灵敏度 

试剂盒分析灵敏度不高于0.6ng/mL。 

（5）精密度 

批内不精密度（CV%）应不高于15%；批间不精密度（CV%）应不高于20%。 

（6）质控品测定值：平行测定10孔高值和低值的质控品，用Log(X)-Log(Y)数学模型拟合，质控品测值应在允许范围内，QcL和QcH的允许范围分别为3.9074～5.45ng61ng/mL和88.444.33～122.386.49ng/mL。 

（7）特异性 

交叉反应符合下表要求： 

（8）稳定性：37℃放置7天，测定值应符合上述各项要求。 

实施例2：制备游离β人绒毛膜促性腺激素化学发光免疫定量检测试剂盒 

除固相载体为48孔的微孔板外，以与实施例1一样的方法制备本发明试剂盒。 

实施例3：本发明试剂盒的使用方法 

（1）将待检试剂盒在室温（18~25℃）下平衡30分钟。 

（2）配制洗液：用蒸馏水将浓缩洗液按1:20稀释（1mL洗液加19mL蒸馏水）。若浓缩洗液有结晶，可将浓缩洗液置于室温或37℃待结晶溶解后再进行稀释。 

（3）配制发光液：使用前5分钟取适量发光液A与发光液B等体积混合。 

（4）根据实验需要取出适量的包被板条。设置空白对照1孔，校准品各2孔、质控品各10孔。每孔加入free β-hCG校准品、质控品和样本各50μL，空白对照不加校准品、质控品和样本。 

（5）每孔加入free β-hCG酶结合物50μL，空白对照孔除外。 

（6）手工或机器轻轻振荡10秒混匀，用盖板膜将板孔盖好，在37℃下反应60分钟。 

（7）揭去盖板膜，吸出或倒出反应液后，加入洗液洗五次，洗液量每次每孔不少于300μL，浸泡时间10秒，吸出或倒出洗液后拍干。也可用洗板机洗涤。 

（8）每孔加入发光液100μL，包括空白对照孔。 

（9）室温（18~25℃）下暗置5min，在化学发光免疫分析仪上测定发光值，然后采用双对数数学模型拟合，得到校准品剂量-反应曲线，样本中的free β-hCG浓度与RLU之间的关系成正比，可从上述剂量-反应曲线上反推算出样本中free β-hCG的浓度值。 

实施例4 

本专利发明的试剂盒已进行了临床考核，本次临床试验的样本总数117例，先free β-hCG放射性免疫试剂盒测试后，再利用本专利发明的试剂盒进行测定，并对测定结果进行了配对t检验、线性相关性 分析及卡方检验。结果表明，直线方程为Y=1.0294X-0.8303，线性回归系数为1.0294，相关系数为0.9428。线性回归系数为1.0294接近1，可见这两种测定方法的一致性良好，本发明的试剂盒可用于临床检测中。另外，以SPSS13.0统计分析软件对相关系数进行t检验（检验水准α＝0.05），P<0.001，可见这两种方法测定的free β-hCG值密切相关。本次临床试验的灵敏度100%和特异性98.75%，而假阳性率1.25%、假阴性率0.00%，反映出本试剂盒的测量值与实际值（原测值）的符合程度良好。粗一致性反映试剂盒诊断病人与非病人的能力，这里为99.17%，接近于1，说明试剂盒的诊断能力较强。 

为了确定本试剂盒的临床参考值，对715份血清、血浆样本采用本试剂盒进行了检测，结果表明本试剂盒的参考值（参考范围）为： 

单位换算：1ng/mL=1mIU/mL 

Claims (8)

1.游离β人绒毛膜促性腺激素化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

free β-hCG抗体包被板；

free β-hCG抗体酶结合物；

free β-hCG校准品；

free β-hCG质控品；

20倍浓缩洗液；

发光液A液和B液。

2.根据权利要求1所述的游离β人绒毛膜促性腺激素化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的free β-hCG抗体包被板为包被含有free β-hCG抗体的96孔或48孔的白色微孔板。

3.根据权利要求1所述的游离β人绒毛膜促性腺激素化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的free β-hCG酶结合物使用的酶是辣根过氧化物酶。

4.根据权利要求1所述的游离β人绒毛膜促性腺激素化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的free β-hCG质控品包括低值质控品和高值质控品（，其中低值质控品的浓度范围是3.74～5.61ng/mL，高值质控品的浓度范围是84.33～126.49ng/mL。

5.根据权利要求1所述的游离β人绒毛膜促性腺激素化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的发光液A包含0.7g/L鲁米诺和0.165g/L对碘酚；发光液B包含0.675g/L过氧化脲。

6.根据权利要求1所述的游离β人绒毛膜促性腺激素化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的20倍浓缩洗液包括75.5g/LTris，120g/L NaCl，5mL/L Tween-20，1g/LProclin300。

7.一种制备所述权利要求1的试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）free β-hCG抗体包被板的制备

将free β-hCG抗体用0.02M pH7.4磷酸盐缓冲液稀释至1~10ug/mL，加入到白色微孔板中，2~8℃包被20~24小时；弃去孔内液体，用pH7.4PBS-T缓冲液洗板，然后加入含有0.5%BSA的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，2～8℃封闭20～24小时；弃去孔内液体，甩干后于30~37℃烘干16~30小时；装入铝箔袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于2~8℃；

2）用酶标记free β-hCG抗体，得free β-hCG抗体酶结合物

用高碘酸钠氧化法将free β-hCG抗体和辣根过氧化物酶连结在一起；

3）配制不同浓度的free β-hCG校准品

将free β-hCG抗原用含有牛血清的校准品稀释液配制成不同浓度的标准品，浓度分别为0，2，5，15，50，200ng/mL；分装，贴标签，储存于2~8℃；

4）质控品的配制

在正常人血清中加入适量的free β-hCG纯品，配制低值质控品（QcL）和高值质控品（QcH），其浓度的平均值分别为4.67ng/mL和105.41ng/mL；

5）配制发光液A液和B液

A液是含有0.7g/L鲁米诺和0.165g/L对碘酚的pH8.6的5mmol/LTris·HCl缓冲液；B液是浓度为0.675g/L的过氧化脲，用工艺用水配制；

6)配制20倍浓缩洗液

20倍浓缩洗液的配方如下：75.5g/L Tris，120g/L NaCl，5mL/LTween-20，1g/L Proclin300；

7）组装

将上述试剂组装成盒，储存于2～8℃；

8）对采用该方法制得的试剂盒进行物理检查，并对准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品测定值和稳定性进行测定。

8.根据权利要求7所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述的包被板为包被含有free β-hCG抗体的96孔或48孔白色微孔板。

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