CN116854625A - 一种槟榔碱人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用 - Google Patents

一种槟榔碱人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种槟榔碱人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用，以去甲基槟榔碱盐酸盐作为合成人工半抗原的起始原料。本发明的槟榔碱人工半抗原最大程度地保留了槟榔碱的特征结构，且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为抗原决定簇；进一步制备获得的槟榔碱人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高、特异性强的抗槟榔碱人工抗体，经免疫新西兰白兔获得的免疫血清的效价高达1：70000，可用于对槟榔碱进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。

Description

一种槟榔碱人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种槟榔碱人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。
背景技术
槟榔碱是从天然棕榈科植物槟榔的种子中提取的一种胺类生物碱，是槟榔的主要成分，有一定毒性。槟榔碱(Arecoline)化学名为"N-甲基-1,2,5,6-四氢烟酸甲酯"，槟榔碱在医疗上用于治疗青光眼，能使绦虫瘫痪，所以也用作驱绦虫药，与南瓜仁一起使用效果更好。
槟榔碱临床用于治疗产后子宫出血、子宫复旧不良、月经过多等并且具有一定的提神作用但其具有致癌促癌性，随着近年喜食槟榔的人越来越多，因癌症去世的人也越来越多。
但有研究表明槟榔碱不仅具有致癌促癌性，还具有一定的成瘾性并且不同浓度的槟榔碱还会导致胚胎发育迟缓，对哺乳动物具有致突变作用。
目前国内大多采用高效液相色谱、气相色谱、质谱、核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、红外光谱等进行分析测定，由于使用以及维护成本较高，不适用于大批量采样分析，而利用其人工合成抗原进行免疫分析具有操作便捷、特异性强、测定速度快等优点，因此很有必要合成一种槟榔碱人工半抗原、人工抗原来满足免疫分析的需求。
因此很有必要开发一种经济、简单、快速的检测方法以便检测人体内槟榔碱的水平，而槟榔碱人工抗原的制备则是该方法得以实现的基础。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供一种槟榔碱人工半抗原。
一种槟榔碱人工半抗原，其分子结构式如式(Ⅰ)所示：
本发明的第二个目的是提供上述槟榔碱人工半抗原的制备方法。本发明以去甲基槟榔碱盐酸盐作为合成人工半抗原的起始原料，不仅最大程度地保留了槟榔碱的特征结构，而且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为抗原决定簇。
一种槟榔碱人工半抗原的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)、将浓氨水稀释后得到DAS溶液；
步骤(2)、将去甲基槟榔碱盐酸盐溶于去离子水，加入步骤(1)所得DAS溶液调pH至溶液呈碱性，再用二氯甲烷萃取多次，收集二氯甲烷相，干燥、过滤、转干，得到无色油状物A；
作为优选，步骤(2)中加入DAS溶液调pH＝9。
作为优选，步骤(2)中二氯甲烷萃取的次数为三次，在该反应条件下，无色油状产物A的得率较高，后处理程序较为简单，较易提纯。
步骤(3)、将步骤(2)所得无色油状物A与丁二酸酐按摩尔比1：(1.5～2.5)混合于溶剂中，加入4-二甲氨基吡啶作为催化剂，于100～110℃下搅拌回流反应20～21h，反应完全后经薄层色谱分离得到槟榔碱人工半抗原。
作为优选，步骤(3)中所述溶剂为吡啶或二氯甲烷中的一种。
作为优选，步骤(3)中无色油状物A与丁二酸酐摩尔比为1：2。
作为优选，步骤(3)中所述薄层色谱采用的展开剂中二氯甲烷、95％乙醇、1,4-二氧六环、浓氨水的体积比为8：10：1：1。在该反应条件下，槟榔碱人工半抗原的产率较高，后续处理程序较为简单，较易提纯。
通过上述方法，在槟榔碱的N位上引入连接臂，在该修饰位点上引入连接臂能最大程度地保留槟榔碱征结构。
与采用环状连接臂相比，本发明所采用的是直链作为连接臂，可减少免疫分析时的非特异性结合，还可减少免疫时产生的针对连接臂的免疫反应，从中提高产生特异性抗体的概率。
本发明的第三个目的是提供一种槟榔碱人工抗原，其分子结构式如式(Ⅱ)所示：
其中，BSA为牛血清蛋白。
本发明的第四个目的是提供上述槟榔碱人工抗原的制备方法，包括：通过活泼酯法使所述槟榔碱人工半抗原与牛血清蛋白结合，获得所述槟榔碱人工抗原。
具体地，采用活泼酯法制备槟榔碱人工抗原时，包括以下步骤：
步骤(1)、将槟榔碱人工半抗原、N,N-二环己基碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺按摩尔比1：(1.35～1.5)：(1.35～1.5)混合于N,N-二甲基甲酰胺中，于20～30℃下搅拌反应18～20小时，结束反应后离心，取上清液；
步骤(2)、将所述上清液加入牛血清蛋白溶液中，所得混合液置于3～5℃，静置过夜，经透析、离心取上清液，获得所述槟榔碱人工抗原。
如未作特殊说明，本发明中所述牛血清蛋白溶液是将牛血清蛋白溶于0.01M的PBS缓冲液(pH 7.2～7.4)中制成的。
作为优选，步骤(2)中，所述牛血清蛋白溶液的浓度为5mg/mL，上清液与牛血清蛋白溶液的体积比为1：5。
本发明选用牛血清蛋白(BSA)作为大分子载体，与牛丙种球蛋白(BGG)相比具有以下优点：①牛血清蛋白能够更好更多地结合槟榔碱人工半抗原，从而制备不同偶联比率的人工抗原；②从实验看，牛丙种球蛋白与槟榔碱人工半抗原结合后，槟榔碱人工半抗原不易长时间保存受温度影响较大且容易在后续处理中脱离，稳定性差。而牛血清蛋白与槟榔碱人工半抗原的结合在不同的pH和温度下都能长时间保存并且不易脱离更具稳定性；③牛血清蛋白相较于牛丙种蛋白，价格便宜，易得，可在一定程度上降低成本。
本发明的第五个目的是提供所述槟榔碱人工抗原在制备抗槟榔碱抗体中的应用。
本发明的第六个目的是提供一种抗槟榔碱人工抗体，由所述槟榔碱人工抗原经动物免疫得到，可与槟榔碱发生特异性免疫反应。
试验发现，将所述槟榔碱人工抗原免疫新西兰白兔，获得的免疫血清的效价为1：70000。表明本发明的槟榔碱人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高、特异性强的抗槟榔碱抗体，该抗槟榔碱抗体可用于槟榔碱的免疫检测和分析。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的槟榔碱人工半抗原最大程度地保留了槟榔碱的特征结构，且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为抗原决定簇；进一步制备获得的槟榔碱人工抗原可免疫获得价效高、灵敏度高、特异性强的抗槟榔碱抗体，经免疫新西兰白兔获得的多克隆抗体，可用于对槟榔碱进行快速、准确的免疫检测和分析。
附图说明
图1为本发明槟榔碱人工半抗原I的液相色谱图；其中，mV表示信号强度，min表示分钟；
图2为本发明槟榔碱人工半抗原I的质谱图；其中，Intens表示强度，m/z表示质荷比；
图3为牛血清蛋白、槟榔碱人工半抗原I、槟榔碱人工抗原II的紫外扫描图；其中，Abs表示紫外-可见吸收光谱，WL(nm)表示波长(nm)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
在本发明实施例中，所述MOP的配方如下：
体积比为8：10：1：1的二氯甲烷、95％乙醇、1,4-二氧六环、浓氨水。
实施例1
本实施例提供一种槟榔碱人工抗原II的制备方法，包括以下步骤：
(1)槟榔碱人工半抗原I的制备：
①将5ml浓氨水用去离子水稀释到13ml，得到DAS溶液。
②称取150mg(0.845mmol)去甲基槟榔碱盐酸盐，用10ml去离子水溶解，再用DAS溶液调节pH＝9，无明显变化，水相用15ml×3二氯甲烷萃取，收集二氯甲烷相，用无水硫酸镁干燥，过滤，转干得到98mg(0.695mmol)无色透明油状物A，对该无色油状物A进行TLC检测，层析液为MOP，产物Rf＝0.8～0.9；
③将该无色油状物A用4ml吡啶溶解，加入10mg(0.082mmol)4-二甲氨基吡啶和139mg(1.39mmol)丁二酸酐100℃反应20h，TLC检测表明反应基本完全，产物Rf＝0.2～0.3，经TLC(展开剂为MOP，溶剂和洗脱剂为无水乙醇)分离后得到150mg(0.622mmol)槟榔碱人工半抗原I(如式I)。
槟榔碱人工半抗原I的液相色谱图见图1，槟榔碱人工半抗原I的质谱图见图2。
从图1可以看出经过纯化得到的槟榔碱人工半抗原I的纯度达到99％以上，从图2可以看出本实施例得到的槟榔碱人工半抗原I的M+H离子峰的质荷比(m/z)为242.10，与其理论相对分子质量241吻合，可以确定步骤②得到的最终化合物就是本发明所设计的槟榔碱人工半抗原。
(2)槟榔碱人工抗原II的制备：
④在50ml单口圆底烧瓶中，将150mg(0.622mmol)槟榔碱人工半抗原I溶于7.5mlDMF，加入107mg(0.933mmol)NHS和192mg(0.933mmol)DCC，20～25℃搅拌反应18h，结束反应，反应产物经离心，取上清液，备用。
⑤称取14.5g(40.503mol)十二水磷酸氢二钠，43.875g(750mol)氯化钠，1.495g(9.583mol)二水磷酸二氢钠用去离子水溶解定容至5.0L，得到0.01M、pH为7.4的PBS缓冲液。
⑥称取187.5mg牛血清蛋白溶于37.5ml步骤④的PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的牛血清蛋白溶液。
⑦在快速搅拌下，将步骤④的上清液缓慢滴加到⑥的牛血清蛋白溶液中，上清液与牛血清蛋白溶液的体积比为1：5，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液。
⑧将人工抗原混合液移入透析袋中，用步骤⑤的PBS缓冲液透析7次，透析结束后离心取上清液即得到人工抗原：槟榔碱-牛血清蛋白偶联物(如式II)。其合成路线如下：
其中，DAS表示配制好的氨水溶液，Pyridine表示吡啶，NHS表示N-羟基琥珀酰亚胺，DCC表示环己基碳酰二亚胺，DMF表示N,N-二甲基甲酰胺，DMAP表示4-二甲氨基吡啶，BSA表示牛血清蛋白，下同。
槟榔碱人工抗原II制备前后的紫外扫描图见图3。
图3中，曲线a为槟榔碱人工半抗原I的紫外扫描图，曲线b为槟榔碱人工抗原II的紫外扫描图，曲线c为牛血清蛋白的紫外扫描图。槟榔碱人工半抗原I的最大吸收波长为388nm，槟榔碱人工抗原II的最大吸收波长为368nm，与槟榔碱人工半抗原I、牛血清蛋白相比，槟榔碱人工抗原II的最大吸收波长出现明显变化,表明槟榔碱人工半抗原I于牛血清蛋白偶联成功。
对比例1
本实施例提供一种槟榔碱人工抗原IV的制备方法，包括以下步骤：
(1)槟榔碱人工半抗原III的制备：
①将5ml浓氨水用去离子水稀释到13ml，得到DAS溶液。
②称取150mg(0.845mmol)去甲基槟榔碱盐酸盐，用10ml去离子水溶解，再用DAS溶液调节pH＝9，无明显变化，水相用15ml×3二氯甲烷萃取，收集二氯甲烷相，用无水硫酸镁干燥，过滤，转干得到96mg(0.680mmol)无色透明油状物A，对该无色油状物A进行TLC检测，层析液为MOP，产物Rf＝0.8～0.9。
③将该无色油状物A用3ml乙腈溶解，加入286μL(1.962mmol)溴乙酸叔丁酯和256μL(1.472mmol)N,N-二异丙基乙胺，室温下反应16h以上，TLC(展开剂为乙酸乙酯，产物Rf＝0.8～0.9)检测表明反应基本完全，结束反应，转干得到一黄色不纯油状产物B，直接进入下一步反应。
④将该黄色油状物B用1.27ml二氯甲烷溶解，加入1.27ml三氟乙酸，室温下搅拌反应过夜，TLC(展开剂为甲醇，产物点Rf＝0.3)检测表明反应基本完全，结束反应，用10ml×3甲苯共沸3次将三氟乙酸抽尽，加入20ml去离子水再用20ml×3二氯甲烷萃取，收有机相，用无水硫酸镁干燥，过滤，转干，产物经TLC分离(展开剂为无水甲醇，溶剂和洗脱剂为无水乙醇，产物Rf＝0.3)得到102mg(0.513mmol)槟榔碱人工半抗原III(如式III)。
(2)槟榔碱人工抗原的制备：
⑤在50ml圆底烧瓶中，将102mg(0.513mmol)槟榔碱人工半抗原溶于5.1ml DMF，加入89mg(0.770mmol)NHS和159mg(0.770mmol)DCC，20～25℃搅拌反应18h，结束反应，离心，取上清液备用。
⑥称取14.5g(40.503mol)十二水磷酸氢二钠，43.875g(750mol)氯化钠，1.495g(9.583mol)二水磷酸二氢钠用去离子水溶解定容至5.0L，得到0.01M、pH为7.4的PBS缓冲液。
⑦称取127.5mg牛血清蛋白溶于25.5ml PBS缓冲液中，得牛血清蛋白溶液。
⑧在快速搅拌下，将⑤的上清液缓慢滴加到⑦的牛血清蛋白溶液，上清液与牛血清蛋白溶液的体积比为1：5，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液。
⑨将人工抗原混合液移入透析袋中，用⑥所述PBS缓冲液透析7次，透析结束后离心取上清液，即得到槟榔碱人工抗原IV。
其合成路线如下所示：
其中DIPEA表示N,N-二异丙基乙胺，MeCN表示乙腈，TFA表示三氟乙酸，DCM表示二氯甲烷，下同。
对比例2
本实施例提供一种槟榔碱人工抗原V的制备方法，包括以下步骤：
(1)槟榔碱人工半抗原I的制备：
①-⑥与实施例1相同。
(2)槟榔碱人工抗原V的制备：
采用牛丙种球蛋白作载体，与槟榔碱人工半抗原I进行偶联，偶联步骤与实施例1相同，得到槟榔碱人工抗原V。
其合成路线如下所示：
其中，BGG表示牛丙种球蛋白，下同。
对比例3
本实施例提供一种槟榔碱人工抗原VI的制备方法，包括以下步骤：
(1)槟榔碱人工半抗原III的制备：
①-④与对比例1相同。
(2)槟榔碱人工抗原VI的制备：
采用牛丙种球蛋白作为载体，与槟榔碱半抗原III进行偶联，偶联步骤于对比例1相同，得到槟榔碱人工抗原VI。
其合成路线如下所示：
对比例4
本实施例提供一种槟榔碱人工抗原VII的制备方法，包括以下步骤：
(1)槟榔碱人工半抗原I的制备：
①-③与实施例1相同。
(2)槟榔碱人工抗原VII的制备：
④称取150mg(0.622mmol)槟榔碱人工半抗原I置于50ml圆底烧瓶中，溶于7.5ml的DMF，随后加入103ul(0.746mmol)的三乙胺和96ul(0.746mmol)的氯甲酸异丁酯，20～25℃搅拌反应18h，反应结束离心，取上清液，备用。
⑤-⑧与实施例1相同，得到槟榔碱人工抗原VII。
其合成路线如下所示：
其中Et3N表示三乙胺，下同。
对比例5
本实施例提供一种槟榔碱人工抗原VIII的制备方法，包括以下步骤：
(1)槟榔碱人工半抗原I的制备：
①-③与实施例1相同。
(2)槟榔碱人工抗原VIII的制备：
④与对比例4相同，⑤-⑧采用牛丙种球蛋白作为载体，与槟榔碱人工半抗原I进行偶联，偶联步骤与实施例1相同，得到槟榔碱人工抗原VIII。
其合成路线如下所示：
对比例6
本实施例提供一种槟榔碱人工抗原IX的制备方法，包括以下步骤：
(1)槟榔碱人工半抗原III的制备：
①-④与对比例1相同。
(2)槟榔碱人工抗原IX的制备：
⑤称取126mg(0.710mmol)人工半抗原于50ml圆底烧瓶中，加入6.3ml的DMF，再加入118ul(0.852mmol)的三乙胺和110ul(0.852mmol)的氯甲酸异丁酯，20～25℃搅拌反应18h，反应结束离心，取上清液，备用。
⑥-⑨与对比例1相同；得到槟榔碱人工抗原IX。
其合成路线如下所示：
对比例7
本实施例提供一种槟榔碱人工抗原X的制备方法，包括以下步骤：
(1)槟榔碱人工半抗原III的制备：
①-④与对比例1相同。
(2)槟榔碱人工抗原X的制备：
⑤与对比例6相同。
⑥-⑨采用牛丙种球蛋白作为载体，与槟榔碱半抗原III进行偶联，偶联步骤与对比例1相同，得到槟榔碱人工抗原X。
其合成路线如下所示：
测试例1：槟榔碱人工抗原的性能测定
(1)槟榔碱人工抗原的鉴定：
摩尔吸收系数ε：用PBS缓冲液配制配制浓度为0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml的槟榔碱人工半抗原溶液，通过紫外扫描图可知槟榔碱半抗原的最大吸收波长为388nm，在388nm处测吸光值，每个浓度做平行样。摩尔吸光系数(即摩尔吸收系数)的计算公式为：ε＝吸光值/摩尔浓度。
偶联物蛋白浓度的测定：PBS缓冲液配制浓度为0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、120μg/ml的牛血清蛋白溶液各1ml，加入3ml考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样，在655nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将人工抗原溶液(用PBS缓冲液配制)按一定比例稀释，在655nm处测得人工抗原的吸光值，从曲线上读取人工抗原溶液的相应蛋白浓度值。
偶联比测定：配制100μg/ml的牛丙种球蛋白PBS溶液，将偶联物(即槟榔碱人工抗原)用PBS稀释到100μg/ml，在368nm处测得吸光值A1，以PBS为空白测得吸光值A2，则偶联比率γ为：γ＝[(A1－A2)/ε]/(100×10-3/66400)。
其中ε为摩尔吸光系数(L/mol)，66400为牛血清蛋白的分子量，100×10-3为牛血清蛋白浓度(g/l)。
采用牛丙种球蛋白作载体时，偶联比的计算式为：γ＝[(A1－A2)/ε]/(100×10-3/150000)；其中，150000为牛丙种球蛋白的分子量。
上述检测结果见表1。
表1各槟榔碱人工抗原的偶联比和摩尔吸收系数
编号 人工抗原 偶联比 偶联物蛋白浓度 摩尔吸收系数
实施例1 I 28 3.357mg/ml 5882.63
对比例1 IV 15 2.650mg/ml 5923.61
对比例2 V 22 3.062mg/ml 5882.63
对比例3 VI 17 2.285mg/ml 5923.61
对比例4 VII 23 3.086mg/ml 5882.63
对比例5 VIII 18 2.743mg/ml 5882.63
对比例6 IX 21 3.036mg/ml 5923.61
对比例7 X 2 0.836mg/ml 5923.61
由表1可见，人工半抗原的结构，人工半抗原的活化方法以及载体蛋白的种类对人工半抗原与载体蛋白交联时的偶联比都是有影响的。
(2)动物免疫
将制备的各槟榔碱人工抗原免疫新西兰白兔，得到的免疫血清经ELISA方法检测其效价，检测结果见表2。
表2各免疫血清的效价检测结果
编号 槟榔碱人工抗原 免疫血清效价
实施例1 II 1：70000
对比例1 IV 1：33000
对比例2 V 1：7000
对比例3 VI 1：3000
对比例4 VII 1：36000
对比例5 VIII 1：5000
对比例6 IX 1：6000
对比例7 X 1：4000
由表2可见，与实施例1相比，利用各对比例槟榔碱人工抗原进行动物免疫获得的免疫血清，其效价均偏低，不能用于免疫分析中。而利用槟榔碱人工抗原Ⅱ进行动物免疫获得的免疫血清，其效价达1：70000，完全可用于免疫分析中，能为槟榔碱的检测提供更加方便快速准确的途径。

Claims (10)

1.一种槟榔碱人工半抗原，其特征在于，其分子结构式如式(Ⅰ)所示：
2.权利要求1所述槟榔碱人工半抗原的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
步骤(1)、将浓氨水稀释后得到DAS溶液；
步骤(2)、将去甲基槟榔碱盐酸盐溶于去离子水，加入步骤(1)所得DAS溶液调pH至溶液呈碱性，再用二氯甲烷萃取多次，收集二氯甲烷相，干燥、过滤、转干，得到无色油状物A；
步骤(3)、将步骤(2)所得无色油状物A与丁二酸酐按摩尔比1：(1.5～2.5)混合于溶剂中，加入4-二甲氨基吡啶作为催化剂，于100～110℃下搅拌回流反应20～21h，反应完全后经薄层色谱分离得到槟榔碱人工半抗原。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中调pH值为9。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中无色油状物A与丁二酸酐的摩尔比为1：2。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述溶剂为吡啶或二氯甲烷中的一种。
6.一种槟榔碱人工抗原，其特征在于，由权利要求1所述槟榔碱半抗原偶联牛血清蛋白后纯化得到，其分子结构式如式(Ⅱ)所示：
其中，BSA为牛血清蛋白。
7.权利要求6所述槟榔碱人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)、将槟榔碱人工半抗原、N,N-二环己基碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺按摩尔比1：(1.35～1.5)：(1.35～1.5)混合于N,N-二甲基甲酰胺中，于20～30℃下搅拌反应18～20小时，结束反应后离心，取上清液；
步骤(2)、将所述上清液加入牛血清蛋白溶液中，所得混合液置于3～5℃，静置过夜，经透析、离心取上清液，获得所述槟榔碱人工抗原。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述牛血清蛋白溶液的浓度为5mg/mL，上清液与牛血清蛋白溶液的体积比为1：5。
9.权利要求6所述槟榔碱人工抗原在制备抗槟榔碱抗体中的应用。
10.一种抗槟榔碱人工抗体，其特征在于，由权利要求6所述槟榔碱人工抗原经动物免疫得到，可与槟榔碱发生特异性免疫反应。
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