CN111944765A - 杂交瘤细胞株及其分泌的抗利他林单克隆抗体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开杂交瘤细胞株及其分泌的抗利他林单克隆抗体和应用。一种分泌抗利他林的杂交瘤细胞株3G12.7，保藏编号为CCTCC No.C202069；抗利他林单克隆抗体，由上述杂交瘤细胞株3G12.7或其传代细胞株分泌产生。该抗体为IgG1型,轻链为kappa型。上述抗利他林单克隆抗体用于制备利他林检测试剂盒中的应用或用于制备检测利他林的胶体金免疫诊断试纸条中的应用。本发明抗利他林单克隆抗体效价高，特异性强，可用于对利他林进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。

Description

杂交瘤细胞株及其分泌的抗利他林单克隆抗体和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种杂交瘤细胞株及其分泌的抗利他林单克隆抗体和应用。

背景技术

利他林，即盐酸哌甲酯片，是一种中枢神经兴奋药物，主要用于治疗注意缺陷多动障碍(即儿童多动综合征)、发作性睡病，以及巴比妥类、水合氯醛等中枢抑制药过量引起的昏迷，也有人尝试用于小儿遗尿。对于儿童注意力缺陷及多动症，利他林可减轻多动症状，提高注意力，让孩子的精神集中，一定程度上提高学习能力。但是，长期服用利他林具有成瘾性，属于国家严格管制的一类精神药品，因此只能在医院凭医生的处方调配，并根据患者的病理生理情况和疗程限量供应。

滥用利他林的危害很大。利他林能广泛兴奋大脑皮层，因此其不良反应多见，主要包括失眠(中枢兴奋作用引起)、头晕、头痛(可能是血压升高引起)、恶心、厌食、心跳加快等。此外，长期应用利他林可产生药物依赖。曾有研究报道，利他林可抑制儿童的生长发育，因此建议6岁以下儿童应避免使用。利他林中毒症状包括焦虑、紧张、精神错乱、谵妄、幻觉等精神症状，严重者可出现昏迷、惊厥甚至死亡。

即使是在临床上，以治疗为目的使用利他林都特别谨慎。一般通过剂量滴定的方法确定用药剂量，医生通过观察患者对治疗的耐受情况，以及治疗效果来确定给药剂量和疗程。患者要在早餐或午餐前服用药物，傍晚后不宜服药，以免引起失眠。癫痫儿童应避免使用，以免诱发癫痫。服用单胺氧化酶抑制剂(如抗结核药物异烟肼)的患者应禁用利他林，以免引起严重高血压。

利他林对于轻微脑功能紊乱的患儿有效，能促使患儿增强自我控制能力，集中注意力，减少小动作，增加学习兴趣，从而提高学习成绩。但是对于未患病的普通儿童，利他林提高其注意力的作用极其有限，而且还会发生毒副反应，因此通过服用利他林来提高学习成绩，几乎不可能。考试期间，学生精神压力大、神经紧张，如果此时服用利他林等中枢兴奋药物，可能导致考生兴奋过度，甚至发生狂躁。

口服利他林后，约80％的剂量会在24小时内通过尿液排出体外，其中约60％转化为利他林酸。2008年国际反兴奋剂机构已将利他林列为特定刺激剂，禁止选手在比赛中使用。

通过杂交瘤技术可以制备抗利他林杂交瘤细胞株。通过此杂交瘤细胞株纸制备出的抗体能用于制备胶体金免疫诊断试纸条，实现了在现场对人员快速检测的要求。

发明内容

本发明的第一个目的是提供了一种分泌抗利他林单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株能产生高效价的抗利他林单克隆抗体。

一种分泌抗利他林的杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株3G12.7，已于2020年6月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)，保藏编号为CCTCC No.C202069；中国典型培养物保藏中心的地址为：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)。

本发明采用小剂量肌肉注射免疫方法和尾静脉免疫相结合的方法，用利他林注射小鼠，获得免疫的小鼠脾细胞，进而将免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，用利他林进行筛选，从而获得所述杂交瘤细胞株。

利他林本身的分子量太小，其不具有免疫原性，即缺乏T细胞表位而无法直接诱导动物机体产生特异性抗体，因此本发明对利他林进行化学修饰，偶联BGG(牛血清丙种球蛋白)获得能诱导B细胞的增殖和分化继而产生特异性抗体的人工抗原(MPD-BGG)。所述的利他林分子结构式(I)所示：

每次注射时，利他林的使用量为25μg。

采用小剂量肌肉注射免疫方法和腹腔免疫相结合的方法免疫小鼠，免疫效价高。

本发明还提供了所述杂交瘤细胞株在制备用于检测利他林的试纸条中的应用。

本发明的第二个目的是提供一种抗利他林单克隆抗体，由上述杂交瘤细胞株3G12.7或其传代细胞株分泌产生。该抗体为IgG1型,轻链为kappa型。

本发明的第三个目的是提供上述抗利他林单克隆抗体用于制备利他林检测试剂盒中的应用或用于制备检测利他林的胶体金免疫诊断试纸条中的应用。

所述检测试剂盒为竞争抑制ELISA检测试剂盒；其内还含有利他林标准品和酶标二抗。由于利他林本身分子结构的限制，本发明的检测试剂盒是以竞争抑制ELISA原理制备的。使用时，先包被利他林标准品，再加入待测样品，然后依次加入所述抗抗利他林单克隆抗体、酶标二抗，进行反应，检测OD450值，计算竞争抑制率。利他林标准品的包被量以所述抗利他林单克隆抗体对利他林的检测阈值为宜。所述酶标二抗可选用羊抗鼠IgG-HRP。

本发明所述检测试剂盒为竞争型酶联免疫试剂盒；其内含有包被有抗利他林单克隆抗体的酶标板、利他林标准品、酶标抗原、底物和终止液。使用时，待检测样品和酶标记的利他林抗原一起加入酶标板反应，若样品中残留有利他林，则会与酶标利他林抗原竞争结合板上的抗体，再加入底物反应，终止显色。显色强度与样品中残留的利他林量成反比。根据利他林标准品做出的标准曲线，计算出样品中的利他林的含量。

本发明所述的用于检测利他林的胶体金免疫诊断试纸条，包括样品垫、标记物垫、反应膜和吸样垫；所述标记物垫包被有胶体金标记的所述抗利他林单克隆抗体，所述反应膜的检测线(T线)处包被有利他林-牛血清白蛋白复合物，所述反应膜的质控线(C线)处包被有二抗。

本发明的试纸条也是以竞争抑制ELISA原理制备的，利他林-牛血清白蛋白复合物的包被量也是以所述抗利他林单克隆抗体对利他林的检测阈值为宜。检测时，若只有C线显色，表示待测样品中含有利他林且检测利他林的含量高于检测限；若C线和T线均显色，表示待测样品中检测利他林的含量低于检测阈值，或待测样品中无利他林；若C线和T线均不显色，表示试纸条已经失效。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明利用MPD-BGG免疫小鼠，利用免疫的小鼠脾细胞制备获得杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株分泌的抗利他林单克隆抗体效价高，特异性强，可用于对利他林进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。

杂交瘤细胞株3G12.7，已于2020年6月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(ChinaCenter for Type Culture Collection，简称CCTCC)，保藏编号为CCTCC No.C202069；中国典型培养物保藏中心的地址为：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)。

说明书附图

图1为本发明一种利他林胶体金检测试纸条的结构示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明做进一步详细说明。

实施例1利他林人工抗原的制备

(1)将10mg利他林、5mgN-羟基琥珀酰亚胺、15mg二环已基碳酰亚胺溶解于1mlN,N-甲基甲酰胺中，冰水浴中搅拌6h，记为A液。

(2)将10mg牛血清丙种球蛋白(BGG)溶于0.01mol/LPBS溶液中，记为B液。

(3)将A液缓慢滴加入搅拌中的B液中，然后室温搅拌反应2h。将混合溶液至于PBS溶液中透析4次，每次时长超过6h，即可得人工抗原MPD-BGG。

实施例2杂交瘤细胞株的制备

(1)小鼠免疫

选择6周龄的BALB/c雌鼠用MPD-BGG抗原25μg与quickantibody-5w佐剂等体积混合成100μl，注射小鼠后小腿肌肉；所述的后小腿肌肉部位为小鼠腿部暴露在外部有大块肌肉的地方，而小鼠的大腿大部分被腹部皮肤包裹，也可找到膝关节区分小腿大腿；两周后同样方式注射第2针；再2周后，用25μg抗原进行腹腔注射。

(2)制备脾脏细胞

取经步骤(1)处理的BALB/c雌鼠的脾脏，研磨脾脏细胞至悬液；脾脏细胞悬液离心，取沉淀；在沉淀中加入含有15％胎牛血清的IMDM培养基，调整脾脏细胞至10ml。

(3)脾脏细胞与骨髓瘤细胞的融合：

(3-1)饲养细胞制备：小鼠摘眼球处死，浸泡于75％酒精中消毒10min，撕开小鼠腹外皮肤，暴露其腹膜，用无菌注射器注入8mL37℃预热的IMDM无血清培养基，轻揉小鼠腹腔，悬浮腹腔细胞，吸出腹腔液；1500rpm下离心3min，沉淀物用1×HAT的IMDM培养液重悬，得到饲养细胞悬液。

(3-2)小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的培养：把小鼠骨髓瘤细胞SP2/0用含体积分数为10％的FBS的IMDM培养基进行传代培养，细胞融合前一天进行传代，以保证小鼠骨髓瘤细胞SP2/0适合生长状态良好用于细胞融合。

(3-3)脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合：将调整浓度后的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按细胞个数比为4：1混合均匀，1500rpm下离心洗涤细胞1次，去除上清液，轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀松动，置于37℃水浴，在90s内缓缓加入1mL37℃预温的1mLPEG1500，边加边轻微摇动；加入25ml37℃预温的IMDM无血清培养基终止PEG作用；1000rpm下离心5min，取沉淀；然后在沉淀中加入步骤(3-1)制备的饲养细胞悬液，接种到96孔细胞培养板中，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

(4).杂交瘤细胞的融合筛选

(4-1)初筛：

步骤(3-3)中融合细胞在5％CO₂培养箱中培养3天后，换用1×HT的IMDM培养液，继续培养4天后，观察96孔细胞培养板里的融合细胞生长情况，在细胞生长到细胞团簇(在16倍物镜和10倍目镜下观察，细胞大小以占满1/3视野为宜)时，吸取融合细胞培养上清液，采用间接ELISA方法筛选阳性克隆。

间接ELISA方法的操作步骤是：

①用pH9.6浓度为0.05M的碳酸盐缓冲液稀释MPD-BGG抗原至1μg/mL，96孔酶标板每孔中分别加入100μl稀释后的抗原，4℃包被过夜，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板3次；

②将PBS缓冲液加入到融合细胞培养上清液稀释至25倍体积，然后在96孔细胞培养板中每孔加入100μl稀释后的融合细胞培养上清液，同时设立阴性对照，37℃反应60分钟后，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板1次；

③将PBS缓冲液加入到羊抗鼠IgG-HRP稀释到5000倍体积，然后在96孔细胞培养板中每孔加入100μl稀释后的羊抗鼠IgG-HRP，37℃反应30分钟后，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板3次；

④每孔加入50μl底物TMB，37℃下反应8分钟；

⑤加入50μl浓度为2M的H2SO4终止反应，在450nm下测定其OD值，以融合细胞培养上清液OD450值/阴性对照OD450值>2.5为阳性克隆，将筛选到的阳性克隆进一步地用竞争抑制ELISA方法进行复筛。

(4-2)复筛：

竞争抑制ELISA方法的操作步骤是：

1先将50μl浓度为100ng/ml的利他林标准品加入酶标孔中，再加入50ul阳性克隆培养上清液，同时设计空白对照，即50μlPBS缓冲液和50μl阳性克隆培养上清液混合加入到酶标孔中，37℃孵育60分钟后，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板1次；

②将PBS缓冲液加入到羊抗鼠IgG-HRP稀释到5000倍体积，然后在96孔细胞培养板中每孔加入100μl稀释后的羊抗鼠IgG-HRP，37℃下孵育30分钟，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板3次；

2每孔加入50μl底物TMB，37℃下反应8分钟；

3加入50μl浓度为2M的H₂SO₄终止反应，在450nm下测定其OD值，计算竞争抑制率，结果如表1所示。

竞争抑制率的计算式为：

表1各杂交瘤细胞株的竞争抑制ELISA结果

由表1可见，杂交瘤细胞株3G12的竞争抑制率最高，故挑取杂交瘤细胞株3G12做克隆培养。

(4-3)杂交瘤细胞株3G12的克隆化

杂交瘤细胞株3G12的克隆化培养按有限稀释法进行，准确计数细胞，用含体积分数为15％的FBS的IMDM培养基稀释成4个/mL的细胞悬液，然后以每孔200μl接种到96孔细胞培养板中，7天后观察细胞生长情况，并检测细胞培养板中细胞培养上清液的抗体水平，选择3个抗体效价最高的单克隆，再次做克隆化培养，直至单克隆孔抗体检测阳性率达到100％；然后挑取单克隆细胞，命名为3G12.7，扩大培养后进行抗利他林单克隆抗体纯化。

(5)抗利他林单克隆抗体纯化

取扩大培养后的杂交瘤细胞株3G12.7，接种1×106细胞于小鼠腹腔，10天后采集腹水。取10ml腹水，用2倍体积的PBS稀释，再加入3倍体积的饱和硫酸铵，将得到混合液离心，取沉淀。沉淀用pH7.4的PBS溶解，然后用pH7.4的PBS透析过夜4次。收集抗体溶液，过滤。用OD280测定蛋白含量,蛋白浓度为6.73mg/ml。

实施例3抗利他林单克隆抗体的反应活性测试

采用间接ELISA方法检测实施例1制备的抗利他林单克隆抗体的反应活性，检测步骤包括：①用pH9.6浓度为0.05M的碳酸盐缓冲液稀释MPD-BGG抗原至50ng/mL，然后在96孔酶标板中分别加入100μl/每孔稀释后的抗原，4℃包被过夜；

④用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板3次；然后加入100μl浓度为0.3μg/ml的抗利他林单克隆抗体溶液，做1:3稀释，同时设立阴性对照，37℃反应60分钟后，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板1次；

⑤将PBS缓冲液加入到羊抗鼠IgG-HRP稀释到5000倍体积，然后在96孔细胞培养板中加入100μl/每孔稀释后的羊抗鼠IgG-HRP，37℃反应30分钟，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板3次；然后每孔加入50μl底物TMB37℃反应8分钟后，浓度为2M的H₂SO₄终止反应，450nm测定其OD值，以抗利他林单克隆抗体溶液OD₄₅₀值/阴性对照OD₄₅₀值>2.5为阳性值；检测结果见表2。

表2不同浓度下抗利他林单克隆抗体的OD₄₅₀值

抗利他林单克隆抗体浓度	OD<sub>450</sub>值
		0.3μg/ml	2.430
0.1μg/ml	2.559
		0.03μg/ml	2.360
0.01μg/ml	1.976
		0.003μg/ml	1.436
0.001μg/ml	0.875
		0.0003μg/ml	0.437
0.0001μg/ml	0.203
		PBS(空白对照)	0.098

由表2可见，实施例1制备的抗利他林单克隆抗体反应活性可以到达0.0003μg/ml。

实施例4抗利他林单克隆抗体的最低检测线测试

采用间接ELISA方法检测实施例1制备的抗利他林单克隆抗体的反应活性，检测步骤包括：

①用pH9.6浓度为0.05M的碳酸盐缓冲液稀释,PD-BGG抗原至1μg/mL，然后在96孔酶标板中分别加入100μl/每孔稀释后的抗原，4℃包被过夜；

②用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板3次；然后分别将50μl浓度为50ng/ml、40ng/ml、30ng/ml、20ng/ml、10ng/ml的利他林标准品加入酶标孔中，再加入加入100μl浓度为0.3μg/ml的抗利他林单克隆抗体溶液同时设计空白对照，即先加入50μlPBS缓冲液再加入50μl阳性克隆培养上清液到酶标孔中，37℃孵育60分钟后，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板1次；

③将PBS缓冲液加入到羊抗鼠IgG-HRP稀释到5000倍体积，然后在96孔细胞培养板中加入100μl/每孔稀释后的羊抗鼠IgG-HRP，37℃反应30分钟，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板3次；然后每孔加入50μl底物TMB37℃反应8分钟后，浓度为2M的H₂SO₄终止反应，450nm测定其OD值，以抗利他林单克隆抗体溶液OD₄₅₀值/阴性对照OD₄₅₀值>2.5为阳性值；检测结果见表3。

表3抗利他林单克隆抗体对不同浓度标准品的竞争抑制ELISA结果

标准品浓度	OD<sub>450</sub>值
		50ng/ml	0.065
40ng/ml	0.064
		30ng/ml	0.050
20ng/ml	0.054
		10ng/ml	0.546
PBS(空白对照)	1.856

由表3可见，实施例1制备的抗利他林单克隆抗体能检测到利他林的最低浓度为20ng/ml。

实施例5

如图1所示，本实施例一种利他林胶体金检测试纸条，包括样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次首尾搭接在底板上。其中，胶体金垫上包被有胶体金标记的实施例1制备的抗利他林单克隆抗体，硝酸纤维素膜的检测线(T)处包被有利他林-牛血清白蛋白复合物，质控线(C)处包被有羊抗鼠IgG。试纸条的制备方法为本领域的常规方法。

检测时，室温下将试纸条样品垫的一端插入待测样品中，注意待测样品的液面不要超过试纸条上的MAX线；肉眼观察，并记录C线和T线的显色情况。

若只有C线显色，表示待测样品中含利他林且利他林的含量高于20ng/ml；若C线和T线均显色，表示待测样品中检测利他林的含量低于20ng/ml；若C线和T线均不显色，表示试纸条已经失效。

上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种抗利他林杂交瘤细胞株，其特征在于命名为杂交瘤细胞株3G12.7，保藏编号为CCTCC No.C202069。

2.一种抗利他林单克隆抗体，其特征在于由权利要求1所述的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。

3.如权利要求2所述的抗利他林单克隆抗体在制备利他林检测试剂盒中的应用。

4.如权利要求2所述的抗利他林单克隆抗体在制备检测利他林的胶体金免疫诊断试纸条中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述的用于检测利他林的胶体金免疫诊断试纸条，包括样品垫、标记物垫、反应膜和吸样垫；所述标记物垫包被有胶体金标记的所述抗利他林的单克隆抗体。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述反应膜的检测线处包被有利他林-牛血清白蛋白复合物，所述反应膜的质控线处包被有二抗。

7.如权利要求1所述的一种抗利他林杂交瘤细胞株，其特征在于在制备杂交瘤细胞株过程中采用的抗原是利他林人工抗原MPD-BGG，具体是对利他林MPD进行化学修饰，偶联BGG(牛血清丙种球蛋白)获得能诱导B细胞的增殖和分化继而产生特异性抗体的人工抗原。

8.如权利要求2所述的一种抗利他林单克隆抗体，其特征在于该抗体为IgG1型,轻链为kappa型。

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