CN117916371A - 用于加工的装置、系统和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明总体上涉及制备和加工环状多核糖核苷酸的装置、系统、以及方法，包括使用加压装置，该加压装置包括储器，该储器包括(a)滤液腔室和(b)废物收集腔室，滤液腔室和废物收集腔室由(c)过滤器隔开；储器进一步包括与压力进入端口接触的(d)可拆卸盖帽；其中，该装置与正压源流体连通。
Description
背景技术
需要用于生产和加工环状多核糖核苷酸的方法。
发明内容
本发明总体上涉及用于制备和加工环状多核糖核苷酸的装置、系统、以及方法。
在一方面，本发明的特征在于一种加工环状多核糖核苷酸的方法。该方法包括以下步骤：(a)提供一种装置，该装置包括储器，该储器具有(i)设置在(ii)滤液腔室与(iii)废物收集腔室之间的过滤器，该储器进一步包括具有压力进入端口的可拆卸盖帽；其中，该装置通过压力进入端口与正压源流体连通；(b)向该滤液腔室中的第一流体中提供环状多核糖核苷酸；(c)用正压源对储器进行加压，使得第一流体穿过过滤器而环状多核糖核苷酸不穿过过滤器；(d)将第二流体施用至储器；以及(e)用正压源对储器进行加压，使得第二缓冲液穿过过滤器而环状多核糖核苷酸不穿过过滤器。
在一些实施例中，该方法进一步包括重复步骤(d)和步骤(e)1至5次的步骤。在一些实施例中，该方法进一步包括在步骤(e)之后从过滤器抽吸环状多核苷酸的步骤(f)。在一些实施例中，从过滤器抽吸1mg至1000mg环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，从过滤器抽吸50mg至150mg环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，从过滤器抽吸约100mg环状多核糖核苷酸。
在一些实施例中，第二流体通过流体进入端口被施用到盖帽中。在一些实施例中，流体进入端口与流体源流体连通。在一些实施例中，第一和/或第二流体是液体。在一些实施例中，液体是溶液。在一些实施例中，溶液是缓冲液。在一些实施例中，缓冲液是配制缓冲液、储存缓冲液、或纯化缓冲液。
在一些实施例中，加压步骤(c)和步骤(d)包括将该储器加压至10PSI至100PSI之间。在一些实施例中，应用步骤(d)包括将5mL至15mL流体施用至该储器。
在另一方面，本发明的特征在于一种装置，该装置包括：储器，该储器具有由过滤器隔开的滤液腔室和废物收集腔室；以及与压力进入端口接触的可拆卸盖帽；其中，该装置与正压源流体连通。
在一些实施例中，储器是管。在一些实施例中，管是离心管。在一些实施例中，滤液腔室是漏斗状的。在一些实施例中，盖帽进一步包括流体进入端口。在一些实施例中，储器的容积为5mL至100mL。在一些实施例中，滤液腔室的容积为5mL至15mL。在一些实施例中，过滤器为2kDa至200kDa。在一些实施例中，滤液腔室和过滤器堆叠在储器上、拧入储器中、或嵌套在储器中。在一些实施例中，压力进入端口是密封的。
在一些实施例中，装置进一步包括传感器(例如，液体检测传感器)。在一些实施例中，液体检测传感器选自由以下组成的列表：光学传感器、振动传感器、超声传感器、浮子传感器、电容传感器、雷达传感器、电导率传感器、或电阻传感器。在一些实施例中，传感器是光学传感器。
在另一方面，本发明的特征在于一种系统，该系统包括(i)过滤托盘、(ii)具有压力进入端口的盖、(iii)废物储器，该过滤托盘具有样本储器，该样本储器包括具有过滤器的滤液腔室，该过滤托盘设置在该盖与废物储器之间；其中，压力进入端口与(iv)正压源流体连通。
在一些实施例中，滤液腔室是漏斗状的。在一些实施例中，滤液腔室的容积为5mL至15mL。在一些实施例中，废物储器包括重力或真空排放口。在一些实施例中，系统进一步包括液体检测传感器。在一些实施例中，系统进一步包括通气口。在一些实施例中，过滤托盘、盖、以及废物储器密封地连接在一起。在一些实施例中，滤液腔室堆叠在样本储器上、拧入样本储器中、或嵌套在样本储器中。在一些实施例中，盖进一步包括流体进入端口。在一些实施例中，过滤托盘包括多个样本储器。
定义
本发明将针对特定实施例并参考某些附图进行描述，但是本发明不限于此，而是仅由权利要求来限定。除非另有说明，否则通常应以其常见意义来理解下文中所阐述的术语。
如本文使用的，术语“环状多核糖核苷酸”或“circRNA”或“环状RNA”可互换使用，并且意指具有无游离端(即，没有游离3'和/或5'端)的结构的多核糖核苷酸分子，例如通过共价键或非共价键形成环状或无端结构的多核糖核苷酸分子。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸是通过共价键形成环状或无端结构的“共价闭合的多核糖核苷酸”。
如本文使用的，术语“环状多核糖核苷酸样本”、“circRNA样本”、以及“环状RNA样本”可互换使用并且意指包含circRNA分子和溶液的组合物。
如本文使用的，术语“表达序列”是指对产物(例如肽或多肽或调控核酸)进行编码的核酸序列。
“多肽”和“蛋白”可互换使用并且是指通过共价键(例如酰胺键)连接的两个或更多个氨基酸的聚合物。如本文所述的多肽可以包括全长蛋白(例如，完全加工的蛋白)以及较短的氨基酸序列(例如，天然存在的蛋白的片段或合成的多肽片段)。多肽可以包括天然存在的氨基酸(例如，天然合成的肽中常见并且已知以一个字母缩写(A、R、N、C、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V)的二十种氨基酸之一)和非天然存在的氨基酸(例如，不是天然合成的肽中常见的二十种氨基酸之一的氨基酸，包括合成的氨基酸、氨基酸类似物和氨基酸模拟物)。
如本文使用的，术语“适配体序列”或“适配体”是指特异性结合至靶分子的非天然存在、或合成的寡核苷酸。典型地，适配体是20至250个核苷酸。典型地，适配体通过二级结构而非序列同源性结合至其靶。
如本文所用，术语“结合位点”是指环状多核糖核苷酸的与另一实体(例如化合物、蛋白、核酸等)相互作用的区域。结合位点可以包含适配体序列。
如本文使用的，“缓冲液”是在添加酸性或碱性成分后可抵抗pH值变化的溶液。“缓冲液”的示例包括用于配制组合物的“配制缓冲液”、用于储存组合物的“储存缓冲液”、以及用于纯化的“纯化缓冲液”等。
如本文使用的术语“缓冲液交换”是指从第一缓冲液移除分子或颗粒(比如多核糖核苷酸)以掺入第二缓冲液中的过程。
如本文使用的术语“流体连通”是指在至少两个装置元件(例如储器、压力源等)之间的连接，这允许流体在这样的装置元件之间移动，不论穿过还是不穿过一个或多个中间装置元件。
如本文使用的“溶液”是两种更多种物质的均匀混合物，包括溶剂和溶质。
通过援引并入
本说明书中提到的所有公开、专利和专利申请通过援引并入本文，其程度如同明确地和单独地指明将各篇公开、专利或者专利申请通过援引并入本文。
例如在美国专利公开号US2020/0306286、以及在PCT专利公开号WO 2020/181013和WO 2020/023655中描述了环状多核糖核苷酸，将其通过援引并入本文。
附图说明
当结合附图阅读时，将会更好地理解以下对本发明实施例的详细描述。出于图解说明本发明的目的，在附图中示出了目前示例的实施例。然而，应该理解的是，本发明不限于附图中所示实施例的精确布置及手段。
图1示出了加压装置，该加压装置包括储器，该储器具有设置在滤液腔室与废物收集腔室之间的过滤器；以及具有压力进入端口的盖帽，其中，加压装置处于正压下，并且通过正压端口施加压力。
图2示出了加压装置，该加压装置包括储器，该储器具有设置在滤液腔室与废物收集腔室之间的过滤器；以及具有压力进入端口和流体进入端口两者的盖帽，其中，加压装置处于正压下，并且通过压力进入端口施加压力；并且其中，新鲜流体可以通过流体进入端口被施用至滤液腔室。
图3A至图3C示出了加压系统或加压机器人组件，该加压系统或加压机器人组件包括盖，该盖具有至少一个端口；过滤托盘，该过滤托盘具有多个具有过滤器的样本储器；以及废物储器。
具体实施方式
本发明总体上涉及用于加工环状多核糖核苷酸样本(例如用于这种样本的缓冲液交换)的装置、系统、以及方法。本发明人已经发现，对包含环状多核苷酸的流体(比如溶液(例如缓冲液))加压使得简化并加快液体交换。本发明的一个实施例是配置成使用加压(例如加压和过滤的组合)将环状多核糖核苷酸从第一流体转移到第二流体的装置。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸是环状的多核糖核苷酸，即没有游离端的多核糖核苷酸。例如在美国专利公开号US2020/0306286、以及在PCT专利公开号WO 2020/181013和WO 2020/023655中描述了环状多核糖核苷酸，将其通过援引并入本文。例如在WO2015/034925、WO 2016/011222、US10407683、WO 2017/222911、WO 2021/041541、WO 2019/236673、WO 2020/237227、WO 2016/197121、WO 2018/191722、以及WO 2020/023595中描述了环状多核糖核苷酸，这些文件通过援引并入本文。在一些实施例中，与对应的线性多核糖核苷酸相比，环状多核糖核苷酸稳定性改善、半衰期延长、免疫原性降低、和/或功能性改善(例如，本文所述的功能)。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸是至少约20个碱基对、至少约30个碱基对、至少约40个碱基对、至少约50个碱基对、至少约75个碱基对、至少约100个碱基对、至少约200个碱基对、至少约300个碱基对、至少约400个碱基对、至少约500个碱基对或至少约1,000个碱基对。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的长度为至少100个核苷酸、至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少1,000个核苷酸、至少2,000个核苷酸、至少3,000个核苷酸、至少4,000个核苷酸、至少5,000个核苷酸、至少7,500个核苷酸、至少10,000个核苷酸、至少15,000个核苷酸、至少20,000个核苷酸会是有用的。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含至少一个表达序列，例如，对多肽进行编码。在一些实施例中，表达序列对肽或多核苷酸进行编码。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含多个相同或不同的表达序列。在一些实施例中，表达序列的长度少于5000bp(例如，少于约5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp、50bp、40bp、30bp、20bp、10bp或更少)。在一些实施例中，表达序列的长度独立地或另外地大于10bp(例如，至少约10bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000kb、1.1kb、1.2kb、1.3kb、1.4kb、1.5kb、1.6kb、1.7kb、1.8kb、1.9kb、2kb、2.1kb、2.2kb、2.3kb、2.4kb、2.5kb、2.6kb、2.7kb、2.8kb、2.9kb、3kb、3.1kb、3.2kb、3.3kb、3.4kb、3.5kb、3.6kb、3.7kb、3.8kb、3.9kb、4kb、4.1kb、4.2kb、4.3kb、4.4kb、4.5kb、4.6kb、4.7kb、4.8kb、4.9kb、5kb或更大)。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个元件(比如表达序列)，并且这些一个或多个元件可以被间隔序列或接头彼此隔开。在一些实施例中，元件可以被1个核苷酸、2个核苷酸、约5个核苷酸、约10个核苷酸、约15个核苷酸、约20个核苷酸、约30个核苷酸、约40个核苷酸、约50个核苷酸、约60个核苷酸、约80个核苷酸、约100个核苷酸、约150个核苷酸、约200个核苷酸、约250个核苷酸、约300个核苷酸、约400个核苷酸、约500个核苷酸、约600个核苷酸、约700个核苷酸、约800个核苷酸、约900个核苷酸、或约1000个核苷酸彼此隔开。在一些实施例中，一个或多个元件彼此邻接，例如缺少间隔元件。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸的间隔序列与非间隔序列(例如，表达序列)的比率为约0.05:1、约0.06:1、约0.07:1、约0.08:1、约0.09:1、约0.1:1、约0.12:1、约0.125:1、约0.15:1、约0.175:1、约0.2:1、约0.225:1、约0.25:1、约0.3:1、约0.35:1、约0.4:1、约0.45:1、约0.5:1、约0.55:1、约0.6:1、约0.65:1、约0.7:1、约0.75:1、约0.8:1、约0.85:1、约0.9:1、约0.95:1、约0.98:1、约1:1、约1.02:1、约1.05:1、约1.1:1、约1.15:1、约1.2:1、约1.25:1、约1.3:1、约1.35:1、约1.4:1、约1.45:1、约1.5:1、约1.55:1、约1.6:1、约1.65:1、约1.7:1、约1.75:1、约1.8:1、约1.85:1、约1.9:1、约1.95:1、约1.975:1、约1.98:1或约2:1。在一个实施例中，间隔序列被配置成在间隔序列的两侧上在环状多核糖核苷酸的元件之间提供构象柔性。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包含一个或多个重复元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个修饰。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸至少包含10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、或80％修饰的核苷酸。
环状多核糖核苷酸可以包含至少一个用于靶(例如靶结合部分)的结合位点。环状多核糖核苷酸可以包含至少一个与靶结合的适配体序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含针对一个或多个靶的一个或多个结合位点。靶包括但不限于核酸(例如RNA、DNA、RNA-DNA杂交体)、小分子(例如药物、荧光团、代谢产物)、适配体、多肽、蛋白、脂质、碳水化合物、抗体、病毒、病毒颗粒、膜、多组分复合物、细胞器、细胞、其他细胞部分，其任何片段及其任何组合。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含与单个靶或多个(例如，两个或更多个)靶的结合位点。在一个实施例中，单个环状多核糖核苷酸包含针对单个靶的2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个不同的结合位点。在一个实施例中，单个环状多核糖核苷酸包含针对单个靶的相同的结合位点中的2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个。在一个实施例中，单个环状多核糖核苷酸包含针对一个或多个不同靶的2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个不同的结合位点。在一个实施例中，样本中有两个或更多个靶，比如靶的混合物或文库，并且样本包含环状多核糖核苷酸，该环状多核糖核苷酸包含两个或更多个与该两个或更多个靶结合的结合位点。
在加工环状核糖核苷酸样本时，可能需要将环状核糖核苷酸从第一流体转移到第二流体，其中，第二流体更适于进一步的加工、配制、储存、纯化等。本发明的流体交换可以在不排空储器的情况下完成，该储器包括具有环状多核糖核苷酸的过滤器，提供了更省事、稳健的方法。在一个实施例中，该过程可以通过流体检测传感器来进一步地加强，以提供受控的过程，从而避免过滤器本身过度干燥。环状多核糖核苷酸样本可以分布于流体中。在一个实施例中，流体是液体或气体。在一个实施例中，流体是溶液。在一个实施例中，溶液是缓冲液。本发明中使用的缓冲液包含使环状多核糖核苷酸维持在稳定pH值和/或稳定结构的任何水溶液。缓冲液可以包含用于配制组合物的配制缓冲液、用于储存组合物的储存缓冲液、以及用于纯化的纯化缓冲液等。缓冲液可以包括柠檬酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、Tris基缓冲液、磷酸钠、水等。本发明可以与多个流体串联(例如，一个接一个地使用)或并联(例如，一起使用)使用。
在一些实施例中，现成的过滤器可以与本装置和系统一起使用。过滤器包括Ultra过滤器、PierceTM蛋白浓缩管PES过滤器等。设想多种过滤器孔径，包括但不限于<2kDa、3kDa、20kDa、30kDa、50kDa、100kDa、200kDa等。设想具有多种截留分子量(MWCO)的过滤器，包括但不限于10MWCO、30MWCO、以及100MWCO。
设想多种环状多核糖核苷酸浓度，包括但不限于0.5-2.0mg/mL。
设想用于掺入第二流体(比如缓冲液)所得的环状多核糖核苷酸的多种重量，包括1-200mg，例如1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、150mg、或200mg。
图1示出了加压装置(101)，该加压装置包括储器(103)，该储器具有设置在滤液腔室(104)与废物收集腔室(105)之间的过滤器(102)；以及具有压力进入端口(108)的盖帽(106)，其中，加压装置处于正压下，并且通过压力进入端口(108)施加压力。加压装置(101)可以进一步包括流体连接部件(107)，该流体连接部件可以使储器与压力源流体连通。
图2示出了加压装置(201)的替代实施例，该加压装置包括储器(203)，该储器具有设置在滤液腔室(204)与废物收集腔室(205)之间的过滤器(202)；以及具有压力进入端口(208)和流体进入端口(209)的盖帽(206)，其中，加压装置(201)处于正压下，并且通过压力进入端口(208)施加压力；并且其中，新鲜流体可以通过流体进入端口(209)被施用至滤液腔室(204)。加压装置(201)可以进一步包括流体连接部件(207)，该流体连接部件可以使储器与压力源流体连通。在一些实施例中，盖帽包括压力进入端口。压力进入端口可以通过流体连接部件连接至压力源。在本文所述的特定装置、方法、以及系统中，可以经由压力进入端口由正压源施加正压以推动流体通过过滤器。为环状多核糖核苷酸的流体交换设想的压力范围包括10PSI至100PSI，例如10PSI至20PSI、10PSI至25PSI、10PSI至30PSI、10PSI至40PSI、10PSI至50PSI、10PSI至60PSI、10PSI至70PSI、10PSI至80PSI、10PSI至90PSI、20PSI至25PSI、20PSI至30PSI、20PSI至40PSI、20PSI至50PSI、20PSI至60PSI、20PSI至70PSI、20PSI至75PSI、20PSI至80PSI、20PSI至90PSI、20PSI至100PSI、30PSI至40PSI、30PSI至50PSI、30PSI至60PSI、30PSI至70PSI、30PSI至75PSI、30PSI至80PSI、30PSI至90PSI、30PSI至100PSI、40PSI至50PSI、40PSI至60PSI、40PSI至70PSI、40PSI至75PSI、40PSI至80PSI、40PSI至90PSI、40PSI至100PSI、50PSI至60PSI、50PSI至70PSI、50PSI至75PSI、50PSI至80PSI、50PSI至90PSI、50PSI至100PSI、60PSI至70PSI、60至75PSI、60PSI至80PSI、60PSI至90PSI、60PSI至100PSI、70PSI至75PSI、70PSI至80PSI、70PSI至90PSI、70PSI至100PSI、80PSI至90PSI、80PSI至100PSI、90PSI至100PSI、或约10、20、30、40、50、60、65、70、80、90或100PSI。在一个实施例中，具有压力进入端口和/或流体进入端口的盖帽可以被密封以承受加压。在一个实施例中，本发明的储器、过滤器、盖帽、以及相关的流体连接件连接(例如，夹持)在一起以承受加压。在一个实施例中，金属夹具可以用于将本发明的装置和系统夹持在一起。
正压可以在储器上维持一段时间。储器可以被加压一分钟到几个小时。在一个实施例中，储器被加压不到3小时、更优选地不到一小时。在一个实施例中，储器被加压不到10分钟以用于初始流体清洗，并且被加压10分钟到55分钟以用于确保流体清洗。设想加压过滤时间的范围，包括小于5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟、45分钟、一小时、90分钟、2小时、3小时、10分钟到40分钟、20分钟到40分钟、30分钟到60分钟等。
在一些实施例中，除了压力进入端口，盖帽还包括流体进入端口。在一些实施例中，盖帽包括多个流体进入端口，例如1到3个端口、1到5个端口、2到5个端口、或1、2、3、4、5个等端口。在一些实施例中，流体进入端口可以与流体源流体连通。在一些实施例中，可以通过相同的流体进入端口或不同的流体进入端口将多种流体添加至储器。在一些实施例中，在流体进入端口之前可以存在流体接合部，其中流体接合部的分支流体地连接至单独的流体源。在一些实施例中，流体进入端口和缓冲液进入端口是同一个端口。流体进入端口可以经由连接部件连接至流体源。在一些实施例中，连接部件可以是管。在一些实施例中，管是可丢弃的，允许无菌地向每个储器输送流体和洗脱液。
可以在加压后从过滤器移除多核糖核苷酸。可以通过抽吸(例如从过滤器表面抽吸)来移除多核糖核苷酸。在一些实施例中，从过滤器中抽吸1mg至1000mg的环状多核糖核苷酸，例如，1mg至5mg、1mg至10mg、1mg至25mg、1mg至50mg、1mg至75mg、1mg至100mg、1mg至125mg、1mg至150mg、1mg至200mg、5mg至25mg、5mg至50mg、10mg至50mg、25mg至50mg、25mg至50mg、25mg至75mg、25mg至100mg、25mg至125mg、25mg至150mg、50mg至75mg、50mg至100mg、50mg至150mg、50mg至200mg、50mg至250mg、75mg至125mg、75mg至150mg、75mg至200mg、80mg至120mg、90mg至110mg、100mg至150mg、100mg至200mg、100mg至250mg、125mg至175mg、150mg至250mg、250mg至500mg、250mg至750mg、或500mg至1000mg。
本发明的一个实施例是加压系统(301)或加压机器人组件，如图3A至图3C中所见的，该加压系统或加压机器人组件包括盖(302)，该盖具有至少一个端口(303)；过滤托盘(304)，该过滤托盘具有多个具有过滤器的样本储器(305)；以及废物储器(306)。在一些实施例中，加压系统可以同时加工多个储器，比如2个储器至24个储器、优选地8个储器至12个储器、例如8个储器至10个储器、10个储器至12个储器、或2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个储器。加压系统被配置成多种储器容积，例如50mL和15mL储器两者。在一些实施例中，加压系统进一步包括机器人臂。
在一些实施例中，本发明的装置、系统、以及方法可以用于加工多个环状多核糖核苷酸样本，比如10个或更多个、20个或更多个、30个或更多个、40个或更多个、50个或更多个、60个或更多个、70个或更多个、80个或更多个、90个或更多个、或100个或更多个。在一些实施例中，多个加压系统(例如10至12个加压系统)结合使用。
在一些实施例中，本发明的装置和系统包括传感器。传感器可以用于当储器中的液面下降至一定水平时停止加压。在一些实施例中，液体检测传感器选自由以下组成的组：光学传感器、振动传感器、超声传感器、浮子传感器、电容传感器、雷达传感器、电导率传感器、以及电阻传感器。在一些实施例中，传感器是光学传感器。
在一些实施例中，本装置和系统包括至少一个安全部件或至少一个安全特征以避免操作者受伤，比如由于加压造成的储器破裂。例如，可以包括能够承受高压的高压部件(比如储器和连接件)，或固定部件(比如夹具)。
实例
提供以下实例以进一步说明本发明的一些实施例但并非旨在限制本发明的范围；通过它们的示例性性质将理解，可以替换地使用本领域技术人员已知的其他程序、方法或技术。
实例1
该实例演示了加压装置的使用。
具有10kDa的过滤器孔隙率(如图2中所示)的Ultra-15过滤器适用于使用正压进行缓冲液交换。如图1中所示，盖帽被制造成具有压力进入端口，用于与Ultra-15过滤器一起使用。盖帽包括密封部件以便帮助系统承受更高(例如高于15PSI)的压力。连接至正压源的部件系统被设计成用于对缓冲液交换装置(包括具有改装盖帽的/>Ultra-15过滤器)进行加压。
为了环状多核糖核苷酸的缓冲液交换，首先移除具有压力进入端口的盖帽，将5mL5％-10％乙腈/100mM TEAA的初始缓冲液的环状多核糖核苷酸溶液分配到装置的储器中的过滤器上方，然后更换盖帽。使用压缩空气通过压力进入端口将15PSI的压力施加至储器，使得第一缓冲液被推动通过过滤器进入废物收集区，而环状多核糖核苷酸留在过滤器上。第一次加压大约耗时4分钟。然后关闭压缩空气并且缓慢地打开盖帽。接着，将5mL水分配至储器的过滤器上方，更换盖帽，并且恢复加压。暂停加压、拆卸盖帽、添加第二缓冲液、更换盖帽、以及恢复加压的过程重复五次，总共用第二缓冲液进行六次缓冲液清洗。后续的加压过滤耗时在5至40分钟之间。然后打开盖帽，并且从过滤器中抽吸200μL环状多核糖核苷酸以掺入下游加工。
实例2
该实例演示了加压装置的使用。
具有10kDa的过滤器孔隙率的Ultra-30过滤器单元适用于使用加压而非离心进行缓冲液交换。盖帽被制造成具有压力进入端口，用于与/>Ultra-30过滤器单元一起使用。盖帽包括密封部件以便帮助系统承受更高(例如高于65PSI)的压力。用于连接至正压源的部件系统被设计成用于对装置(包括具有改装盖帽的/>Ultra-30过滤器单元)进行加压。
为了环状多核糖核苷酸的缓冲液交换，首先移除具有压力进入端口的盖帽，将45mL含有3.1mg环状多核糖核苷酸的5％-10％乙腈/100mM TEAA溶液分配到装置的储器中的过滤器上方，然后更换盖帽。通过压力进入端口将65PSI的压力施加至储器，使得第一缓冲液被推动通过过滤器进入废物收集区，而环状多核糖核苷酸留在过滤器上。第一次加压过滤大约耗时4分钟。然后关闭压力并且打开盖帽。接着，将10mL柠檬酸钠添加至储器的过滤器上方，更换盖帽，并且恢复加压。暂停加压、拆卸盖帽、添加第二缓冲液、更换盖帽、以及恢复加压的过程重复五次，总共用第二缓冲液进行六次缓冲液清洗。后续的加压过滤耗时在35至50分钟之间。然后打开盖帽，并且从过滤器中抽吸2mg(1335ng/μL)环状多核糖核苷酸以掺入下游加工。
实例3
该实例演示了加压装置的使用。
具有10kDa的过滤器孔隙率的Ultra-15过滤器适用于使用加压而非离心进行缓冲液交换。如图1中所示，盖帽被制造成具有压力进入端口和缓冲液进入端口，用于与/>Ultra-15过滤器一起使用。盖帽包括密封部件以帮助系统承受更高(例如高于65PSI)的压力。用于连接至正压源和缓冲液源的部件系统被设计成用于对缓冲液交换装置进行加压并且为缓冲液交换供应新鲜缓冲液。
为了环状多核糖核苷酸的缓冲液交换，首先拆卸装置的盖帽，将5％-10％乙腈/100mM TEAA中的4mg环状多核糖核苷酸分配到装置的储器的过滤器上方，然后更换盖帽。通过压力进入端口将65PSI的压力施加至储器，使得第一缓冲液被推动通过过滤器进入废物收集区，而环状多核糖核苷酸留在过滤器上。第一次加压过滤大约耗时12分钟。然后暂停压力，之后经由缓冲液进入端口将15mL柠檬酸钠添加至储器的过滤器上方，并且恢复加压。暂停加压、通过缓冲液进入端口添加第二缓冲液、以及恢复加压的过程重复五次，总共用第二缓冲液进行六次缓冲液清洗。后续的加压耗时在18至50分钟之间。然后打开盖帽，并且从过滤器中抽吸3.42mg(1898.1ng/μL)环状多核糖核苷酸以掺入下游加工。
实例4
该实例演示了自动加压装置的使用。
具有10kDa的过滤器孔隙率的Ultra-15过滤器可以适用于使用加压而非离心自动进行缓冲液交换。如图1中所示，盖帽被制造成具有压力进入端口和缓冲液进入端口，用于与/>Ultra-15过滤器一起使用。盖帽包括密封部件以便帮助系统承受更高(例如高于60PSI)的压力。用于连接至正压源和缓冲液源的部件系统被设计成用于对缓冲液交换装置进行加压并且为缓冲液交换供应新鲜缓冲液。装置可以进一步适配成包括流体检测传感器。
缓冲液交换可以遵循实例1或实例2的过程，只是该过程通过使用液体检测传感器实现自动化。当确定体积的第一缓冲液或第二缓冲液或任何后续缓冲液已经被推动通过过滤器进入废物收集区时，液体检测传感器进行感测。储器中在过滤器区上方的液面达到目标液面后，就暂停加压，并且可以将预定体积的第二缓冲液添加至储器的过滤器上方。然后可以恢复压力。在感测到目标液面时暂停加压、添加第二缓冲液、以及恢复加压可以重复五次，总共用第二缓冲液进行六次缓冲液清洗，之后拆卸盖帽，并且抽吸过滤器上的环状多核糖核苷酸，以掺入第二缓冲液溶液或掺入第三缓冲液溶液。
Claims (34)
1.一种加工环状多核糖核苷酸的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供一种装置，该装置包括：储器，该储器包括设置在滤液腔室与废物收集腔室之间的过滤器；该储器进一步包括具有压力进入端口的可拆卸盖帽；其中，该装置通过该压力进入端口与正压源流体连通；
(b)向该滤液腔室中的第一流体中提供环状多核糖核苷酸；
(c)用该正压源对该储器进行加压，其中，该第一流体穿过该过滤器而该环状多核糖核苷酸不穿过该过滤器；
(d)将第二流体施用至该储器；以及
(e)用该正压源对该储器进行加压，其中，该第二缓冲液穿过该过滤器而该环状多核糖核苷酸不穿过该过滤器。
2.如权利要求1所述的方法，该方法进一步包括重复步骤(d)和步骤(e)1至5次的步骤。
3.如权利要求1或2所述的方法，该方法进一步包括在步骤(e)之后从该过滤器抽吸该环状多核苷酸的步骤(f)。
4.如权利要求3所述的方法，其中，从该过滤器抽吸50mg至150mg环状多核糖核苷酸。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，该第二流体通过流体进入端口被施用到该盖帽中。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，该流体进入端口与流体源流体连通。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，加压步骤(c)和步骤(d)包括将该储器加压至10-100PSI之间。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，应用步骤(d)包括将5mL至15mL流体施用至该储器。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，该第一和/或第二流体是液体。
10.如权利要求9所述的方法，其中，该液体是溶液。
11.如权利要求10所述的方法，其中，该溶液是缓冲液。
12.如权利要求11所述的方法，其中，该缓冲液是配制缓冲液、储存缓冲液、或纯化缓冲液。
13.一种装置，该装置包括：储器，该储器包括由过滤器隔开的滤液腔室和废物收集腔室；该储器进一步包括与压力进入端口接触的可拆卸盖帽；其中，该装置与正压源流体连通。
14.如权利要求13所述的装置，其中，该储器是管。
15.如权利要求14所述的装置，其中，该管是离心管。
16.如权利要求13至15中任一项所述的装置，其中，该滤液腔室是漏斗状的。
17.如权利要求13至16中任一项所述的装置，其中，该装置进一步包括传感器。
18.如权利要求17所述的装置，其中，该传感器是液体检测传感器。
19.如权利要求13至18中任一项所述的装置，其中，该盖帽进一步包括流体进入端口。
20.如权利要求13至19中任一项所述的装置，其中，该储器的体积为5至100mL。
21.如权利要求13至20中任一项所述的装置，其中，该滤液腔室的容积为5mL至15mL。
22.如权利要求13至21中任一项所述的装置，其中，该过滤器为2kDa至200kDa。
23.如权利要求13至22中任一项所述的装置，其中，该滤液腔室和该过滤器堆叠在该储器上、拧入该储器中、或嵌套在该储器中。
24.如权利要求13至23中任一项所述的装置，其中，该压力进入端口是密封的。
25.一种系统，该系统包括过滤托盘，该过滤托盘具有样本储器，该样本储器包括具有过滤器的滤液腔室，该过滤托盘设置在具有压力进入端口的盖与废物储器之间；其中，该压力进入端口与正压源流体连通。
26.如权利要求25所述的系统，其中，该滤液腔室是漏斗状的。
27.如权利要求25或26所述的系统，其中，该滤液腔室的容积为5mL至15mL。
28.如权利要求25至27中任一项所述的系统，其中，该废物储器包括重力或真空排放口。
29.如权利要求25至28中任一项所述的系统，其中，该系统进一步包括液体检测传感器。
30.如权利要求25至29中任一项所述的系统，其中，该系统进一步包括通气口。
31.如权利要求25至30中任一项所述的系统，其中，该过滤托盘、该盖、以及该废物储器密封地连接在一起。
32.如权利要求25至31中任一项所述的系统，其中，该滤液腔室堆叠在该样本储器上、拧入该样本储器中、或嵌套在该样本储器中。
33.如权利要求25至32中任一项所述的系统，其中，该盖进一步包括流体进入端口。
34.如权利要求25至33中任一项所述的系统，其中，该过滤托盘包括多个样本储器。
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