CN113795263A - 包含可负载抗原呈递多肽的工程化红系细胞及使用方法 - Google Patents

包含可负载抗原呈递多肽的工程化红系细胞及使用方法 Download PDF

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T.J.威克汉姆
C.L.摩尔
S.R.达斯塔吉尔
D.C.麦克劳克林
R.S.萨尔瓦特
A.R.南纳
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Abstract

本公开提供了可定制的去核红系细胞或去核细胞，它们可工程化成在其表面上包含可负载外源性抗原呈递多肽，其中可负载外源性抗原呈递多肽包含一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代使细胞表面上的可负载外源性抗原呈递多肽稳定化。在一些实施方案中，在不存在与可负载外源性抗原呈递多肽结合的多肽的情况下，可负载外源性抗原呈递多肽在细胞表面上是稳定化的。在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽包含外源性可置换多肽，该外源性可置换多肽与可负载外源性抗原呈递多肽结合。在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽在释放可置换多肽后在细胞表面上是稳定化的。

Description

包含可负载抗原呈递多肽的工程化红系细胞及使用方法
相关申请
本申请要求于2019年2月20日提交的美国临时专利申请No.62/808,253、2019年7月22日提交的美国临时专利申请No.62/877,190、2019年10月25日提交的美国临时专利申请No.62/926,222，以及2019年11月21日提交的美国临时专利申请No.62/938,839的权益。这些申请中每者的内容全文以引用方式并入本文。
序列表
本申请包含以ASCII格式电子提交的序列表，并且据此全文以引用方式并入。所述ASCII副本创建于2020年2月20日，名称为129267-01205_SL.txt，并且大小为680,946字节。
背景技术
主动免疫应答取决于抗原呈递细胞(APC)对抗原和共刺激信号的有效呈递。在抗原被内化后，APC可在膜上展示抗原-I和II类主要组织相容性复合物(MHC)连同共刺激信号以活化抗原特异性T细胞，其在适应性免疫应答中发挥关键作用。在体内，T细胞应答的诱导高度取决于与呈递例如肿瘤特异性抗原的专职性APC，特别是树突细胞(DC)的相互作用。通常，可使抗原特异性T细胞离体激发和扩增，然后将它们转移回受试者中。例如，在过继性细胞转移(ACT)中，分离肿瘤特异性T细胞，然后离体扩增，获得大量细胞以供输注。作为APC之一，DC通常用于离体使T细胞刺激最大化。然而，天然APC如DC的使用遇到了某些挑战，包括对最佳的负载抗原的DC认识不足，并且在临床试验中发现了好坏参半的结果(Steenblock等人(2009)Expert Opin.Biol.Ther.9:451-64；Melief(2008)Immunity 29:372-83；Palucka和Banchereau(2013)Immunity 39:38-48)。此外，自体DC的分离和离体刺激耗时且昂贵，并且离体生成的DC的质量可能是可变的(Steenblock等人(2009)；Kim等人(2004)Nat.Biotechnol.22:403-10)。因此，使用受试者衍生的自体DC限制了基于DC的治疗方案的标准化(参见Steenblock等人(2009)；以及Kim等人(2004))。
人工APC(aAPC)是T细胞活化和扩增的工程化平台，目的是避免前述障碍，而模拟DC与T细胞之间的相互作用。它们包括多个系统，包括已工程化改造成用于活化和/或扩增期望的免疫细胞群(例如T细胞)的合成生物材料。这些系统可以通过模拟DC与T细胞之间的相互作用而起作用。例如，已经开发出几种细胞大小的刚性珠，如乳胶微珠、聚苯乙烯包被的磁性微珠和可生物降解的聚(乳酸-共-乙醇酸)微粒。这些珠在诱导免疫细胞活化和/或扩增中的功效似乎高度取决于所用材料的特性。例如，大于200nm的珠通常保留在接种部位，而较小颗粒可被DC吸收(参见例如Reddy等人(2006)J.Control.Release112:26-34)。相比之下，天然APC的膜比这些珠的外表面更具活力。
仍然需要改进的方式来刺激T细胞并散播足以用于过继性免疫疗法的数量的治疗性T细胞。特别地，需要能够呈递外源性抗原性多肽的aAPC，该aAPC可定制以便呈递任何所关注的抗原性多肽来诱导期望的应答。
发明内容
本公开涉及可定制工程化红系细胞(例如工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如经修饰的去核细胞)，这些细胞经工程化改造成在其表面上(例如在质膜上)包含可负载外源性抗原呈递多肽，并且尤其能够活化、扩增或分化/去分化T细胞，阻抑T细胞活性，阻抑T效应细胞，和/或刺激并扩增T调节细胞。与呈递抗原以活化免疫应答的其他细胞相比，本文所述的工程化红系细胞或去核细胞提供许多优点。例如，本文提供了用于向有此需要的受试者给药的工程化红系细胞或去核细胞，它们可容易地定制成在可负载外源性抗原呈递多肽上呈递所关注的选定外源性抗原性多肽。
在一些方面，本公开提供了工程化去核红系细胞，其在细胞表面上包含可负载外源性抗原呈递多肽，其中可负载外源性抗原呈递多肽包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代使细胞表面上的可负载外源性抗原呈递多肽稳定化。在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽在不存在与外源性抗原呈递多肽(例如其抗原结合槽)结合的多肽的情况下是稳定化的。
在一些实施方案中，工程化去核红系细胞还包含与可负载外源性抗原呈递多肽结合的外源性抗原性多肽。
在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽对外源性抗原性多肽比对外源性可置换多肽具有更高的亲和力。
在一些实施方案中，外源性抗原性多肽以约1皮摩尔至约100纳摩尔的KD与可负载外源性抗原呈递多肽结合。
在一些实施方案中，外源性抗原性多肽包含表7-8、16-26或B中任一项所提供的氨基酸序列。在一些实施方案中，外源性抗原性多肽包含表7所提供的氨基酸序列。
在一些实施方案中，外源性抗原性多肽与可负载外源性抗原呈递多肽非共价附接。在其他实施方案中，外源性抗原性多肽与可负载外源性抗原呈递多肽共价附接。
在一些实施方案中，外源性抗原性多肽通过接头与可负载外源性抗原呈递多肽共价附接。
在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽包含接头，其中接头包含用于缀合外源性抗原性多肽的受体序列。
在一些实施方案中，接头为约10个氨基酸至30个氨基酸长度。在其他实施方案中，接头为约15个氨基酸残基长度。
在一些实施方案中，其中可负载外源性抗原呈递多肽包含跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包括1型膜蛋白的跨膜结构域。在一些实施方案中，1型膜蛋白包括血型糖蛋白A(GPA)。
在一些实施方案中，工程化去核红系细胞还包含与可负载外源性抗原呈递多肽结合的可置换外源性多肽。
在一些实施方案中，外源性可置换多肽能够由外源性抗原性多肽从可负载外源性抗原呈递多肽置换。
在一些实施方案中，外源性可置换多肽为约6个氨基酸长度至约30个氨基酸长度。
在一些实施方案中，外源性可置换多肽以约1nM至约100μM的KD与可负载外源性抗原呈递多肽结合。
在一些实施方案中，外源性可置换多肽包含表6所提供的氨基酸序列。
在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽和外源性可置换多肽包含在单链融合蛋白中。在一些实施方案中，单链融合蛋白包含设置在可负载外源性抗原呈递多肽与外源性可置换多肽之间的接头。
在一些实施方案中，接头包含酶切割位点。在一些实施方案中，酶切割位点包含氨基酸序列LEVLFQGP(SEQ ID NO:1)。在一些实施方案中，酶切割位点包含氨基酸序列ENLYFQG(SEQ ID NO:2)。在一些实施方案中，酶切割位点在距GGG基序的10个氨基酸或更少之内。在一些实施方案中，酶切割位点在距LPTXG基序(SEQ ID NO:3)的10个氨基酸或更少之内。在一些实施方案中，酶切割位点在距氨基酸序列AHIVMVDAYKPTK(SEQ ID NO:4)的10个氨基酸或更少之内。在一些实施方案中，酶切割位点在距氨基酸序列ATHIKFSKRD(SEQ IDNO:5)的10个氨基酸或更少之内。
在一些实施方案中，接头为约10个氨基酸至30个氨基酸长度。在一些实施方案中，接头为约15个氨基酸残基长度。
在一些实施方案中，单链融合蛋白包含跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包括1型膜蛋白的跨膜结构域。在一些实施方案中，1型膜蛋白包括血型糖蛋白A(GPA)。
在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽包含人类白细胞抗原α(HLA)重链多肽和β-2-微球蛋白(β2M)多肽，或其片段。
在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽包含设置在HLAα重链多肽与β2M多肽之间的接头。
在一些实施方案中，接头是GlySer接头。
在一些实施方案中，接头为约2至约30个氨基酸残基长度。在一些实施方案中，接头为约18个氨基酸残基长度。
在一些实施方案中，HLA重链多肽衍生自HLA I类多肽。
在一些实施方案中，HLA I类多肽选自：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E和HLA-G。
在一些实施方案中，HLA-A多肽包含选自以下的HLA-A等位基因：A*01:01、A*02:01、A*03:01、A*24:02、A*11:01、A*29:02、A*32:01、A*68:01、A*31:01、A*25:01、A*26:01、A*23:01和A*30:01。
在一些实施方案中，HLA-B多肽包含选自以下的HLA-B等位基因：B*08:01、B*07:02、B*44:02、B*15:01、B*40:01、B*44:03、B*35:01、B*51:01、B*27:05、B*57:01、B*18:01、B*14:02、B*13:02、B*55:01、B*14:01、B*49:01、B*37:01、B*38:01、B*39:01、B*35:03和B*40:02。
在一些实施方案中，HLA-C多肽包含选自以下的HLA-C等位基因：C*07:01、C*07:02、C*05:01、C*06:02、C*04:01、C*03:04、C*03:03、C*02:02、C*16:01、C*08:02、C*12:03、C*01:02、C*15:02、C*07:04和C*14:02。
在一些实施方案中，HLA-E多肽包含选自以下的HLA-E等位基因：E*01:01:01:01、E*01:01:01:02、E*01:01:01:03、E*01:01:01:04、E*01:01:01:05、E*01:01:01:06、E*01:01:01:07、E*01:01:01:08、E*01:01:01:09、E*01:01:01:10、E*01:01:02、E*01:03:01:01、E*01:03:01:02、E*01:03:01:03、E*01:03:01:04、E*01:03:02:01、E*01:03:02:02、E*01:03:03、E*01:03:04、E*01:03:05、E*01:04、E*01:05、E*01:06、E*01:07、E*01:08N、E*01:09和E*01:10。
在一些实施方案中，HLA-G多肽包含选自以下的HLA-G等位基因：G*01:01:01:01、G*01:01:01:02、G*01:01:01:03、G*01:01:01:04、G*01:01:01:05、G*01:01:01:06、G*01:01:01:07、G*01:01:01:08、G*01:01:02:01、G*01:01:02:02、G*01:01:03:01、G*01:01:03:02、G*01:01:03:03、G*01:01:03:04、G*01:01:04、G*01:01:05、G*01:01:06、G*01:01:07、G*01:01:08、G*01:01:09、G*01:01:11、G*01:01:12、G*01:01:13、G*01:01:14、G*01:01:15、G*01:01:16、G*01:01:17、G*01:01:18、G*01:01:19、G*01:01:20、G*01:01:21、G*01:01:22、G*01:02、G*01:03:01:01、G*01:03:01:02、G*01:04:01:01、G*01:04:01:02、G*01:04:02、G*01:04:03、G*01:04:04、G*01:04:05、G*01:04:06、G*01:05N、G*01:06、G*01:07、G*01:08:01、G*01:08:02、G*01:09、G*01:10和G*01:11。
在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽包含在对应于α链的位置84的氨基酸残基处氨基酸取代为丙氨酸。
在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽包含在对应于α链的位置84和139的各氨基酸残基处氨基酸取代为半胱氨酸。
在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽包含在对应于α链的位置51和175的各氨基酸残基处氨基酸取代为半胱氨酸。
在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽包含在对应于α链的以下位置的氨基酸残基处至少一对氨基酸取代为半胱氨酸：84和139；51和175；5和168；130和157；135和140；11和74；45和63；以及33和49。
在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽包含在对应于α链的位置84的氨基酸残基处氨基酸取代为半胱氨酸，以及在设置在β2M多肽与可置换外源性多肽之间的接头的第二氨基酸残基处的半胱氨酸。
在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽包含衍生自HLA-A*02:01等位基因的α链，并且其中α链包含在对应于位置115的氨基酸残基处氨基酸取代为谷氨酸。
在其他实施方案中，HLA重链多肽衍生自HLAII类多肽。
在一些实施方案中，HLA II类多肽选自：HLA-DPα、HLA-DPβ、HLA-DMA、HLA-DMB、HLADOA、HLA DOB、HLA DQα、HLA DQβ、HLA DRα和HLA DRβ。
在一些实施方案中，HLA-DPα多肽包含选自以下的等位基因：DPA1*01:03、DPA1*02:01、DPA1*02:07。
在一些实施方案中，HLA-DPβ多肽包含选自以下的等位基因：DPB1*04:01、DPB1*02:01、DPB1*04:02、DPB1*03:01、DPB1*01:01、DPB1*11:01、DPB1*05:01、DPB1*10:01、DPB1*06:01、DPB1*13:01、DPB1*14:01和DPB1*17:01。
在一些实施方案中，HLA-DQα多肽包含选自以下的等位基因：DQA1*05:01、DQA1*03:01、DQA1*01:02、DQA1*02:01、DQA1*01:01、DQA1*01:03和DQA1*04:01。
在一些实施方案中，HLA-DQβ多肽包含选自以下的等位基因：DQB1*03:01、DQB1*02:01、DQB1*06:02、DQB1*05:01、DQB1*02:02、DQB1*03:02、DQB1*06:03、DQB1*03:03、DQB1*06:04、DQB1*05:03和DQB1*04:02。
在一些实施方案中，HLA-DRβ多肽包含选自以下的等位基因：DRB1*07:01、DRB1*03:01、DRB1*15:01、DRB1*04:01、DRB1*01:01、DRB1*13:01、DRB1*11:01、DRB1*04:04、DRB1*13:02、DRB1*08:01、DRB1*12:01、DRB1*11:04、DRB1*09:01、DRB1*14:01、DRB1*04:07和DRB1*14:04。
在一些方面，本公开提供了治疗需要改变的免疫应答的受试者的方法，该方法包括：确定受试者的HLA状态；选择工程化去核红系细胞，该工程化去核红系细胞在细胞表面上包含可负载外源性抗原呈递多肽，其中抗原呈递多肽与受试者免疫相容，并且其中外源性抗原呈递多肽包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代使细胞表面上的可负载外源性抗原呈递多肽稳定化；使工程化去核红系细胞与外源性抗原性多肽接触，并且将工程化去核红系细胞给药于受试者，从而治疗受试者。
在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽在不存在与外源性抗原呈递多肽结合的多肽的情况下是稳定化的。
在一些实施方案中，该方法还包括使外源性抗原性多肽与可负载外源性抗原呈递多肽缀合。
在一些实施方案中，可置换外源性多肽与可负载外源性抗原呈递多肽结合。
在其他实施方案中，该方法还包括在将工程化去核红系细胞给药于受试者之前，用外源性抗原性多肽将可置换外源性多肽从可负载外源性抗原呈递多肽置换。
在其他实施方案中，该方法还包括使外源性抗原性多肽与可负载外源性抗原呈递多肽缀合。
在其他实施方案中，该方法还包括选择外源性抗原性多肽。
在一些实施方案中，受试者患有癌症或处于发展癌症的风险中。在其他实施方案中，受试者患有自身免疫疾病或处于发展自身免疫疾病的风险中。在其他实施方案中，受试者患有感染性疾病或处于发展感染性疾病的风险中。
在一些方面，本公开提供了制备包含负载抗原的外源性抗原呈递多肽的工程化去核红系细胞的方法，该方法包括：获得工程化去核红系细胞，该工程化去核红系细胞在细胞表面上包含可负载外源性抗原呈递多肽，其中可负载外源性抗原呈递多肽包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代使细胞表面上的可负载外源性抗原呈递多肽稳定化；以及使工程化去核红系细胞与外源性抗原性多肽接触，从而制备包含负载抗原的外源性抗原呈递多肽的工程化去核红系细胞。
在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽在不存在与外源性抗原呈递多肽结合的多肽的情况下是稳定化的。
在一些实施方案中，该方法还包括使外源性抗原性多肽与可负载外源性抗原呈递多肽缀合。
在一些实施方案中，该方法还包括选择外源性抗原性多肽。
在一些实施方案中，可置换外源性多肽与可负载外源性抗原呈递多肽结合。
在一些实施方案中，该方法还包括用外源性抗原性多肽将可置换外源性多肽从可负载外源性抗原呈递多肽置换。
在一些方面，本公开提供了制备工程化去核红系细胞的方法，该工程化去核红系细胞在细胞表面上包含可负载外源性抗原呈递多肽，该方法包括：将编码可负载外源性抗原呈递多肽的外源性核酸引入有核红系前体细胞中，其中可负载外源性抗原呈递多肽包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代使细胞表面上的可负载外源性抗原呈递多肽稳定化；以及在适于去核和产生可负载外源性抗原呈递多肽的条件下培养有核红系前体细胞，从而制备在细胞表面上包含可负载外源性抗原呈递多肽的工程化去核红系细胞，从而制备工程化去核红系细胞。
在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽在不存在与外源性抗原呈递多肽结合的多肽的情况下是稳定化的。
在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽包含接头，其中接头包含用于缀合外源性抗原性多肽的受体序列。
在一些实施方案中，接头为约10个氨基酸至30个氨基酸长度。在一些实施方案中，接头为约15个氨基酸残基长度。
在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽包含跨膜结构域。
在一些实施方案中，接头设置在跨膜结构域与可负载外源性抗原呈递多肽之间。
在一些实施方案中，跨膜结构域包括1型膜蛋白的跨膜结构域。在一些实施方案中，I型膜蛋白包括GPA。
在一些实施方案中，该方法还包括使工程化去核红系细胞与至少一种外源性抗原性多肽接触。
在一些实施方案中，该方法还包括使外源性抗原性多肽与可负载外源性抗原呈递多肽缀合。
在一些实施方案中，外源性核酸还编码外源性可置换多肽。
在一些实施方案中，外源性可负载抗原呈递多肽和外源性可置换多肽包含在单链融合蛋白中。
在一些实施方案中，单链融合蛋白包含设置在可负载外源性抗原呈递多肽与外源性可置换多肽之间的接头。
在一些实施方案中，接头包含酶切割位点。
在一些实施方案中，酶切割位点包含氨基酸序列LEVLFQGP(SEQ ID NO:1)。在其他实施方案中，酶切割位点包含氨基酸序列ENLYFQG(SEQ ID NO:2)。在其他实施方案中，酶切割位点在距GGG基序的10个氨基酸或更少之内。在其他实施方案中，酶切割位点在距LPTXG基序(SEQ ID NO:3)的10个氨基酸或更少之内。在其他实施方案中，酶切割位点在距氨基酸序列AHIVMVDAYKPTK(SEQ ID NO:4)的10个氨基酸或更少之内。
在其他实施方案中，酶切割位点在距氨基酸序列ATHIKFSKRD(SEQ ID NO:5)的10个氨基酸或更少之内。
在一些实施方案中，接头为约10个氨基酸至30个氨基酸长度。在其他实施方案中，接头为约15个氨基酸残基长度。
在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽包含跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包括1型膜蛋白的跨膜结构域。在一些实施方案中，I型膜蛋白包括GPA。
在一些实施方案中，该方法还包括使工程化去核红系细胞与外源性抗原性多肽接触，该外源性抗原性多肽与可负载外源性抗原呈递多肽的结合亲和力比可置换外源性多肽更大。
在一些实施方案中，该方法还包括使工程化去核红系细胞与二肽接触。
在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽包含HLA-A:02:01、HLA-A1:01、HLA-A3:01、HLA-A24:02、HLA-A26:01、HLA-B7:02、HLA-B08:01、HLA-B27:05、HLA-B27:05、HLA-B39:01、HLA-B40:01、HLA-B58:01、HLA-B15:01、或HLA-E01:01，并且二肽为甘氨酰-亮氨酸(GL)、甘氨酰-甲硫氨酸(GM)、GG、甘氨酰-丙氨酸(GA)、甘氨酰-缬氨酸(GV)、甘氨酰-苯丙氨酸(GF)、亮氨酰-甘氨酸(LG)、甘氨酰-环己基丙氨酸(G-Cha)、甘氨酰-高亮氨酸(GHLe)、乙酰化亮氨酸、或甘氨酰-精氨酸(GR)。
在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽包含HLA-B:27:05，并且二肽为GR或G-Cha。
在一些实施方案中，该方法还包括在适于酶切割位点切割的条件下使细胞与酶接触。
在一些实施方案中，该方法还包括使外源性抗原性多肽与可负载外源性抗原呈递多肽缀合。
在一些实施方案中，外源性抗原性多肽利用点击化学与可负载外源性抗原性多肽缀合。
在一些实施方案中，可使本文所述的工程化去核红系细胞与多种外源性抗原性多肽接触，以允许多种外源性抗原性多肽结合在可负载外源性抗原呈递多肽上。在一些实施方案中，可使本文所述的工程化去核红系细胞与一种或多种外源性抗原性多肽接触，以允许一种或多种外源性抗原性多肽结合在可负载外源性抗原呈递多肽上。在一些实施方案中，可使本文所述的工程化去核红系细胞与两种或更多种外源性抗原性多肽接触，以允许两种或更多种外源性抗原性多肽结合在可负载外源性抗原呈递多肽上。在一些实施方案中，可使本文所述的工程化去核红系细胞与三种或更多种外源性抗原性多肽接触，以允许三种或更多种外源性抗原性多肽结合在可负载外源性抗原呈递多肽上。在一些实施方案中，可使本文所述的工程化去核红系细胞与四种或更多种外源性抗原性多肽接触，以允许四种或更多种外源性抗原性多肽结合在可负载外源性抗原呈递多肽上。在一些实施方案中，可使本文所述的工程化去核红系细胞与五种或更多种外源性抗原性多肽接触，以允许五种或更多种外源性抗原性多肽结合在可负载外源性抗原呈递多肽上。在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽包含MHC I类多肽。在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽包含MHC II类多肽。
在一些方面，本公开提供了活化抗原特异性T细胞群的方法，该方法包括使T细胞群与本文所述的工程化去核红系细胞接触，从而活化抗原特异性T细胞群。
在一些实施方案中，可使本文所述的工程化去核红系细胞与多种抗原特异性T细胞群接触，以允许多种抗原特异性T细胞群活化。在一些实施方案中，可使包含一种或多种外源性抗原性多肽的工程化去核红系细胞与一种或多种抗原特异性T细胞群接触，以允许一种或多种抗原特异性T细胞群活化。在一些实施方案中，可使包含两种或更多种外源性抗原性多肽的工程化去核红系细胞与两种或更多种抗原特异性T细胞群接触，以允许两种或更多种抗原特异性T细胞群活化。在一些实施方案中，可使包含三种或更多种外源性抗原性多肽的工程化去核红系细胞与三种或更多种抗原特异性T细胞群接触，以允许三种或更多种抗原特异性T细胞群活化。在一些实施方案中，可使包含四种或更多种外源性抗原性多肽的工程化去核红系细胞与四种或更多种抗原特异性T细胞群接触，以允许四种或更多种抗原特异性T细胞群活化。在一些实施方案中，可使包含五种或更多种外源性抗原性多肽的工程化去核红系细胞与五种或更多种抗原特异性T细胞群接触，以允许五种或更多种抗原特异性T细胞群活化。
附图说明
附图意在说明本文所提供的一个或多个特征、方面或实施方案，而非旨在进行限制。
图1示出HLA-A(即HLA-A*01:01)(SEQ ID NO:1593)、HLA-B(即HLA-B*51:01)(SEQID NO:1594)、HLA-C(即HLA-C*12:02)(SEQ ID NO:1595)、HLA-E(即HLA-E*01:03)(SEQ IDNO:1596)和HLA-G(即HLA-G*01:01)(SEQ ID NO:922)的示例性野生型等位基因的氨基酸序列比对。所示出的氨基酸序列中的每者为不包括N-末端前导序列的成熟蛋白质。在方框中突出显示了预计取代为半胱氨酸时稳定化蛋白质的氨基酸残基。共有序列显示在所示的示例性野生型等位基因的超过一半中的保守氨基酸残基。
图2A-B示出了显示如本文所述的示例性构建体的示意图。图2A示出构建体，其包含可负载外源性抗原呈递多肽，例如HLA I类分子，其中HLA I类分子包含与HLA α亚单位连接的HLAβ2M亚单位，其包含跨膜结构域，如1型膜蛋白跨膜结构域(例如GPA跨膜结构域)，其中HLA I类分子包含一个或多个突变，所述一个或多个突变允许HLA I类分子在不存在结合的多肽的情况下以稳定构象存在于细胞表面上，并且其中HLA I类分子能够结合外源性抗原性多肽。图2B示出了图2A的示例性构建体，其还包含与可负载外源性抗原呈递多肽结合的外源性可置换多肽。在一些实施方案中，外源性可置换多肽可以被置换，例如通过切割如本文所述的酶切割位点，以允许结合外源性抗原性多肽。
图3A-3C是显示在与工程化去核红系细胞接触之后包含HPV E7特异性T细胞受体的报告T淋巴细胞系的活化的线形图，该工程化去核红系细胞包括(1)抗原呈递多肽，其包含野生型HLA*02:01多肽、β2M多肽、GPA和FLAG-标签(“wt HLA-A2”)；(2)可负载抗原呈递多肽，其包含具有氨基酸取代Y84C和A139C的突变体HLA*02:01多肽、β2M多肽、GPA和FLAG-标签(“ds HLA-A2”)；或者(3)融合多肽，其包含HPV E7肽、具有氨基酸取代Y84A的突变体HLA*02:01多肽、β2M多肽、GPA和FLAG-标签(“sc三聚体”)。图3A是显示在与已经培养0天的工程化去核红系细胞接触之后报告T淋巴细胞系的活化的线形图。图3B是显示在与已经培养3天的工程化去核红系细胞接触之后报告T淋巴细胞系的活化的线形图。图3C是显示在与已经培养6天的工程化去核红系细胞接触之后报告T淋巴细胞系的活化的线形图。RLU＝相对光单位。
图4A和4B示出在10天时段内抗原呈递多肽在工程化红系细胞上的稳定性。图4A是显示使用抗β2M抗体染色和流式细胞术检测的工程化去核红系细胞的平均荧光强度(MFI)的柱形图，该工程化去核红系细胞包括：(1)可负载抗原呈递多肽，其包含具有氨基酸取代Y84C和A139C的突变体HLA*02:01多肽、β2M多肽、GPA和FLAG-标签，其负载有HPV E7肽(“ds+肽”)；(2)抗原呈递多肽，其包含野生型HLA*02:01多肽、β2M多肽、GPA和FLAG-标签，其负载有HPV E7肽(“wt+肽”)；(3)可负载抗原呈递多肽，其包含具有氨基酸取代Y84C和A139C的突变体HLA*02:01多肽、β2M多肽、GPA和FLAG-标签，无负载(“ds”)；或者(4)抗原呈递多肽，其包含野生型HLA*02:01多肽、β2M多肽、GPA和FLAG-标签，无负载(“wt”)。图4B是显示使用抗HLA-A2抗体染色和流式细胞术检测的工程化去核红系细胞的MFI的柱形图，该工程化去核红系细胞包括：(1)可负载抗原呈递多肽，其包含具有氨基酸取代Y84C和A139C的突变体HLA*02:01多肽、β2M多肽、GPA和FLAG-标签，其负载有HPV E7肽(“ds+肽”)；(2)抗原呈递多肽，其包含野生型HLA*02:01多肽、β2M多肽、GPA和FLAG-标签，其负载有HPV E7肽(“wt+肽”)；(3)可负载抗原呈递多肽，其包含具有氨基酸取代Y84C和A139C的突变体HLA*02:01多肽、β2M多肽、GPA和FLAG-标签，无负载(“ds”)；或者(4)抗原呈递多肽，其包含野生型HLA*02:01多肽、β2M多肽、GPA和FLAG-标签，无负载(“wt”)。显示了在0、3、5、7、或10天期间培养的细胞的MFI。
图5A-5F是显示在与包括(1)融合多肽，其包含HPV E7肽、具有氨基酸取代Y84A的突变体HLA*02:01多肽、β2M多肽、GPA和FLAG-标签(“sc三聚体”)；(2)可负载抗原呈递多肽，其包含具有氨基酸取代Y84C和A139C的突变体HLA*02:01多肽、β2M多肽和GPA(没有FLAG-标签)(“ds”)；(3)可负载抗原呈递多肽，其包含具有氨基酸取代Y84C和A139C的突变体HLA*02:01多肽、β2M多肽、GPA和FLAG-标签(“ds+FLAG”)；(4)抗原呈递多肽，其包含野生型HLA*02:01多肽、β2M多肽、GPA和FLAG-标签(“wt+FLAG”)的工程化去核红系细胞或者(5)由未转导的红系前体细胞生成的工程化去核红系细胞(“未转导的”)接触之后，包含HPV E7特异性TCR(图5A-5C)或HPV E6特异性TCR(图5D-5F)的报告T淋巴细胞系的活化的线形图，该工程化去核红系细胞。使包含抗原呈递多肽的去核红系细胞与HPV E7和HPV E6抗原多肽两者接触，以指定浓度对抗原呈递多肽进行负载。图5A是显示在与指定去核红系细胞接触之后包含HPV E7特异性TCR的报告T淋巴细胞系的活化的线形图。使用10μg/mL的HPV E6抗原多肽和HPV E7抗原多肽中的每者对包含ds、ds+FLAG、或wt+FLAG抗原呈递多肽的细胞进行负载。图5B是显示在与指定去核红系细胞接触之后包含HPV E7特异性TCR的报告T淋巴细胞系的活化的线形图。使用1μg/mL的HPV E6抗原多肽和HPV E7抗原多肽中的每者对包含ds、ds+FLAG、或wt+FLAG抗原呈递多肽的细胞进行负载。图5C是显示在与指定去核红系细胞接触之后包含HPV E7特异性TCR的报告T淋巴细胞系的活化的线形图。使用100ng/mL的HPV E6抗原多肽和HPV E7抗原多肽中的每者对包含ds、ds+FLAG、或wt+FLAG抗原呈递多肽的细胞进行负载。图5D是显示在与指定去核红系细胞接触之后包含HPV E6特异性TCR的报告T淋巴细胞系的活化的线形图。使用10μg/mL的HPV E6抗原多肽和HPV E7抗原多肽中的每者对包含ds、ds+FLAG、或wt+FLAG抗原呈递多肽的细胞进行负载。图5E是显示在与指定去核红系细胞接触之后包含HPV E6特异性TCR的报告T淋巴细胞系的活化的线形图。使用1μg/mL的HPV E6抗原多肽和HPV E7抗原多肽中的每者对包含ds、ds+FLAG、或wt+FLAG抗原呈递多肽的细胞进行负载。图5F是显示在与指定去核红系细胞接触之后包含HPV E6特异性TCR的报告T淋巴细胞系的活化的线形图。使用100ng/mL的HPV E6抗原多肽和HPV E7抗原多肽中的每者对包含ds、ds+FLAG、或wt+FLAG抗原呈递多肽的细胞进行负载。RLU＝相对光单位。
图6是显示在与包括(1)融合多肽，其包含HPV E7肽、具有氨基酸取代Y84A的突变体HLA*02:01多肽、β2M多肽、GPA和FLAG-标签(“sc三聚体(E7)”)；(2)可负载抗原呈递多肽，其包含具有氨基酸取代Y84C和A139C的突变体HLA*02:01多肽、β2M多肽和GPA(没有FLAG-标签)(“ds”)；(3)可负载抗原呈递多肽，其包含具有氨基酸取代Y84C和A139C的突变体HLA*02:01多肽、β2M多肽、GPA和FLAG-标签(“ds+FLAG”)；或者(4)抗原呈递多肽，其包含野生型HLA*02:01多肽、β2M多肽、GPA和FLAG-标签(“wt+FLAG”)的工程化去核红系细胞；或具有未转导的K562细胞(“UNT K562s”)接触之后包含HPV E7特异性TCR或HPV E6特异性TCR的报告T淋巴细胞系的活化的图。
图7A-7C是示出HPV E7荧光抗原多肽到工程化去核红系细胞上的结合动力学的线形图，该工程化去核红系细胞包括(1)可负载抗原呈递多肽，其包含具有氨基酸取代Y84C和A139C的突变体HLA*02:01多肽、β2M多肽、GPA和FLAG-标签(“ds”)；或者(2)抗原呈递多肽，其包含野生型HLA*02:01多肽、β2M多肽、GPA和FLAG-标签(“wt”)。细胞负载有10ng/mL的HPVE7抗原多肽的四甲基罗丹明(TAMRA)标记的形式之一：HPV E7-GGK或HPV E7-E18K。图7A是显示在4℃下90分钟内HPV E7-GGK或HPV E7-E18K到工程化红系细胞上的结合动力学的线形图，该工程化红系细胞包含ds可负载抗原呈递多肽或wt抗原呈递多肽。图7B是显示在室温下90分钟内HPV E7-GGK或HPV E7-E18K到工程化红系细胞上的结合动力学的线形图，该工程化红系细胞包含ds可负载抗原呈递多肽或wt抗原呈递多肽。图7C是显示在37℃下90分钟内HPV E7-GGK或HPV E7-E18K到工程化红系细胞上的结合动力学的线形图，该工程化红系细胞包含ds可负载抗原呈递多肽或wt抗原呈递多肽。
图8A-8C是显示在与包括(1)抗原呈递多肽，其包含野生型HLA*02:01多肽、β2M多肽、GPA和FLAG-标签(“wt HLA-A2”)；或者(2)可负载抗原呈递多肽，其包含具有氨基酸取代Y84C和A139C的突变体HLA*02:01多肽、β2M多肽、GPA和FLAG-标签(“ds HLA-A2”)，其负载有CMV抗原多肽的工程化去核红系细胞，(3)与CMV抗原多肽接触的由未转导红系前体细胞生成的红系细胞(UNT-脉冲的)；或者(4)未与CMV抗原多肽接触的由未转导红系前体细生成的红系细胞(UNT-非脉冲的)接触之后CMV特异性T细胞的活化或扩增的柱形图。图8A是显示在与指定的红系细胞以特定红系细胞:T细胞比率接触4小时之后CMV特异性CD8+T细胞的活化的柱形图，如由NFAT上调所指示。图8C是显示在与指定的去核红系细胞以特定红系细胞:T细胞比率接触4小时之后CMV特异性CD8+T细胞的活化的柱形图，如由Nur77上调所指示。图8D是显示在5天期间来自与指定的去核红系细胞接触的PBMC的T淋巴细胞扩增的柱形图。
图9A示出外源性可负载抗原呈递多肽，其包含HLA II类α多肽链(不包括天然跨膜结构域和胞质区域)以及HLA II类β多肽链(不包括天然跨膜结构域和胞质区域)和GPA跨膜结构域。
图9B和9C是显示外源性抗原呈递多肽在K562细胞中表达的图，该外源性可负载抗原呈递多肽包含：(1)HLA-DRA*01:01多肽(不包括天然跨膜结构域和胞质区域)、GlySer接头、HLA-DRB1*01:01多肽(不包括天然跨膜结构域和胞质区域)和GPA跨膜结构域(图9B)，或者(2)HLA-DPA1*01:03多肽(不包括天然跨膜结构域和胞质区域)、GlySer接头、HLA-DPB1*04:01多肽(不包括天然跨膜结构域和胞质区域)和GPA跨膜结构域(图9C)。
具体实施方式
本公开基于可容易定制的去核红系细胞或去核细胞的开发，这些细胞可工程化改造成在其表面上(例如在质膜上)包含可负载外源性抗原呈递多肽，例如HLA多肽，并且尤其能够活化、扩增或分化/去分化T细胞，阻抑T细胞活性，阻抑T效应细胞，和/或刺激并扩增T调节细胞。特别地，本文所提供的工程化红系细胞或去核细胞在细胞表面上包含可负载外源性抗原呈递多肽，该可负载外源性抗原呈递多肽包含一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代使细胞表面上的可负载外源性抗原呈递多肽稳定化。在一些实施方案中，在不存在与外源性抗原呈递多肽结合的多肽的情况下，在细胞表面上的可负载外源性抗原呈递多肽是稳定化的。
本公开还提供了去核红系细胞或去核细胞，这些细胞可工程化改造成在其表面上(例如在质膜上)包含野生型外源性抗原呈递多肽，例如HLA多肽，并且尤其能够活化、扩增或分化/去分化T细胞，阻抑T细胞活性，阻抑T效应细胞，和/或刺激并扩增T调节细胞。
在一些实施方案中，可以选择所关注的外源性抗原性多肽，并且将其与可负载外源性抗原呈递多肽或野生型外源性抗原呈递多肽结合，然后给药于受试者，因此允许针对特定受试者特异的可定制疗法。
在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽包含与可负载外源性抗原呈递多肽(例如，在可负载外源性抗原呈递多肽的抗原结合槽处)结合的外源性可置换多肽。在一些实施方案中，在给药于受试者之前，外源性可置换多肽可由所关注的选定外源性抗原性多肽置换。
在本公开的一些实施方案中，工程化红系细胞是工程化去核红系细胞，例如网织红细胞或红细胞。在本公开的一些实施方案中，去核细胞(例如，经修饰去核细胞)是网织红细胞、红细胞或血小板。
定义
如在本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代，除非内容另有明确规定。
替代方案(例如“或”)的使用应理解为意指替代方案中的任一者、两者或它们的任何组合。
如本文所用，术语“约”当涉及到可测量的值如量、时间长度等时，涵盖指定值的±20％或±10％，更优选地±5％，甚至更优选地±1％，并且还更优选地±0.1％的变化，因此变化适于执行所公开的方法。
如本文所用，除非另外指明，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数的值，并且在适当时包括其分数(例如整数的十分之一和百分之一)。
如本文所用，“包含”和“由……组成”意在与“包括”、“包括”或“含有”同义，并且是包括性或开放性术语，其指定了所跟随的例如组分的存在，并非不包括或排除本领域已知或其中公开的额外未列举的组分、特征、元素、成员、步骤的存在。
如本文所用，术语“如”、“例如”等旨在是指示例性实施方案并且不限制本公开的范围。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语都具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料均可在测试本文所提供的实施方案的实践中使用，本文描述了优选的材料和方法。
如本文所用，术语“活化”、“刺激”、“增强”、“提高”和/或“诱导”(以及类似术语)可互换使用，通常指相对于天然的、预期的、或平均的，或者相对于对照条件，直接或间接地改善或提高浓度、水平、功能、活性或表现的行为。“活化”是指通过细胞表面部分的连接而诱导的初次应答。例如，在受体的语境中，此类刺激需要受体的连接和后续信号转导事件。对于T细胞的刺激，此类刺激是指T细胞表面部分的连接，在一些实施方案中，其随后诱导信号转导事件，如结合TCR/CD3复合物。另外，刺激事件可活化细胞并且上调或下调分子的表达或分泌。因此，即使在不存在直接信号转导事件的情况下，细胞表面部分的连接也可导致细胞骨架结构的重构，或者导致细胞表面部分的融合，它们各自可用于增强、更改或改变后续细胞应答。“活化”包括CD8+T细胞的活化、CD4+T细胞的活化、T细胞的细胞毒活性的刺激、刺激T细胞分泌细胞因子、可检测效应子功能、T细胞分化状态的更改(例如，促进T效应细胞扩增并向T记忆细胞分化)，和/或它们的任何组合。术语“活化T细胞”尤其是指正在经历细胞分裂的T细胞。
如本文所用，“改变的免疫应答”是指改变免疫应答的形式或特性，例如免疫应答的刺激或抑制，例如，如通过ELISPOT测定(细胞免疫应答)、ICS(细胞内细胞因子染色测定)和主要组织相容性复合物(MHC)四聚体测定测量以检测和定量抗原特异性T细胞，从而以可测量的量来定量血液抗原特异性CD4+T细胞群，或者定量血液抗原特异性CD8+T细胞群，或者其中当相比于合适的对照(例如，对照组合物，其中DC未负载肿瘤特异性细胞，或者未负载衍生自肿瘤特异性细胞的肽)时提高至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少100％。
如本文所用，术语“阻抑”、“减少”、“干扰”、“抑制”和/或“降低”(以及类似术语)通常是指相对于天然的、预期的、或平均的，或者相对于对照条件，直接或间接地降低浓度、水平、功能、活性、或表现的行为。
如本文所用，术语“阻抑免疫细胞”或“抑制免疫细胞”是指引起或导致抑制或阻抑免疫细胞的一种或多种细胞应答或活性的过程(例如信号转导事件)，所述细胞应答或活性选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒活性以及活化标记的表达，或者导致免疫细胞无应答或诱导免疫细胞的细胞凋亡。用于测量免疫细胞抑制或阻抑的合适测定是本领域已知的并且在本文中有所描述。
如本文所用，术语“特异性结合”是指多肽或多肽复合物能够在体外或体内识别并结合配体，而基本上不识别或结合周围环境中的其他分子。在一些实施方案中，多肽(例如外源性抗原性多肽或可置换外源性多肽)与可负载外源性抗原呈递多肽的抗原结合槽结合。确定两个分子是否特异性结合的方法是本领域公知的，并且包括例如平衡透析、表面等离振子共振等。
如本文所用，术语“外源性抗原呈递多肽”是指包含在融合构建体中的细胞表面蛋白：其选自HLA I类多肽(例如，HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、或HLA-G)、或HLA II类多肽(例如，HLA-DPα、HLA-DPβ、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA DOA、HLADOB、HLA DQα、HLA DQβ、HLADRα和HLADRβ)，能够结合抗原并使抗原显示于细胞表面上以由适当的免疫细胞识别。如本文所用，HLA I类多肽包括经典和非经典HLA I类多肽。HLA I类分子包括β2亚单位，并因此仅由CD8共受体识别。HLA II类分子包括β1和β2亚单位，并因此可由CD4共受体识别。
术语“野生型外源性抗原呈递多肽”是指如本文所述的外源性抗原呈递多肽，其不包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代使细胞表面上的外源性抗原呈递多肽稳定化。
如本文所用，术语“可负载外源性抗原呈递多肽”或“可负载抗原呈递多肽”是指包含在融合构建体中的外源性抗原呈递多肽，与衍生其的野生型外源性抗原呈递多肽相比，在融合构建体的胞外域中包含一个或多个氨基酸取代(包括一对或多对氨基酸取代)，所述一个或多个氨基酸取代使细胞表面上的可负载外源性抗原呈递多肽稳定化。在一些实施方案中，在不存在结合的多肽的情况下，在细胞表面上的可负载外源性抗原呈递多肽是稳定化的。在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽结合外源性多肽，例如外源性抗原性多肽，并且使外源性多肽显示于细胞表面上以由适当的T-细胞识别。在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽结合外源性可置换多肽。在一些实施方案中，外源性可置换多肽从可负载外源性抗原呈递多肽上置换，并且由外源性抗原性多肽替代。在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽在释放可置换多肽后在细胞表面上是稳定化的。
如本文所用，提及到多肽(例如，“外源性多肽”)时的术语“外源性”是指这样的多肽：其被引入细胞之中或之上，或者通过将编码外源性多肽的外源性核酸引入细胞中或祖细胞中而导致由细胞表达。在一些实施方案中，外源性多肽是由引入细胞或祖细胞中的外源性核酸编码的多肽，该核酸任选地不被细胞保留。在一些实施方案中，外源性多肽是可负载外源性抗原呈递多肽、野生型外源性抗原呈递多肽、外源性抗原性多肽、外源性可置换多肽、细胞因子、共抑制多肽或Treg共刺激多肽。在一些实施方案中，外源性多肽是通过化学或酶方式缀合至细胞表面的多肽。
如本文所用，术语“外源性抗原性多肽”是指能够与外源性抗原呈递多肽一起诱导免疫应答的外源性多肽。在一些实施方案中，外源性抗原性多肽与可负载外源性抗原呈递多肽结合。在一些实施方案中，外源性抗原性多肽与野生型外源性抗原呈递多肽结合。在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽对外源性抗原性多肽具有比对外源性可置换多肽更高的亲和力。在一些实施方案中，外源性抗原性多肽以约1皮摩尔至约100纳摩尔的KD与可负载外源性抗原呈递多肽结合。在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽对外源性抗原性多肽具有比对外源性可置换多肽更高的亲和力。在一些实施方案中，外源性抗原性多肽以约1皮摩尔至约100纳摩尔的KD与可负载外源性抗原呈递多肽结合。
如本文所用，术语“外源性可置换多肽”是指能够与可负载外源性抗原呈递多肽的抗原结合槽结合和解结合(unbinding)的外源性多肽。在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽对外源性可置换多肽具有比对外源性抗原性多肽更低的亲和力。在一些实施方案中，外源性可置换多肽以约1nM至约100μM的KD与可负载外源性抗原呈递多肽结合。在一些实施方案中，外源性可置换多肽以约10nM至约100μM的KD与可负载外源性抗原呈递多肽结合。
如本文所用，术语“外源性T细胞共刺激多肽”包括工程化红系细胞或去核细胞上的多肽，其特异性结合T细胞上的同源共刺激分子(例如，HLA分子、B和T淋巴细胞弱化子(attenuator)(CD272)和Toll样受体)，从而除了通过例如TCR/CD3复合物与野生型或负载有肽的可负载外源性抗原呈递多肽的结合所提供的初级信号之外，还提供介导T细胞应答的信号，所述T细胞应答包括但不限于增殖、活化、分化等。共刺激多肽还尤其涵盖与T细胞上存在的共刺激分子特异性结合的抗体。示例性外源性共刺激多肽在下文有更详细地描述。
如本文所用，“外源性T细胞共抑制多肽”是指阻抑T细胞的任何多肽，包括T细胞活性的抑制、T细胞增殖的抑制、使T细胞无应答、或T细胞的细胞凋亡的诱导。示例性外源性共抑制多肽在下文有更详细地描述。
如本文所用，术语“Treg共刺激多肽”是指扩增调节性T细胞(Treg)的外源性多肽。在一些实施方案中，Treg共刺激多肽通过刺激参与Treg细胞发育的三种信号中的至少一种来刺激Treg细胞。示例性外源性Treg共刺激多肽在下文有更详细地描述。
如本文所用，术语“点击反应”或“点击化学”可互换地用于指用于共价附接第一和第二部分以方便产生连接产物的一系列反应。其通常具有以下特征中的一者或多者：其快速，具特异性，高产率，高效，自发，不显著改变连接实体的生物相容性，具有高反应速率，产生稳定产物，有利于产生单一反应产物，具有高原子经济性，具化学选择性，模块化，具立体选择性，对氧不敏感，对水不敏感，高纯度，仅生成可通过非色谱法(例如结晶或蒸馏)除去的无害或相对无毒的副产物，不需要溶剂或者可在良性或生理学上相容的溶剂(例如，生理学条件下稳定的水)中进行。实例包括炔/叠氮化物反应、二烯/亲二烯体反应、或硫醇/烯反应。可以使用其他反应。在一些实施方案中，点击反应是快速的、具特异性和高产率的。
如本文所用，术语“点击柄部(click handle)”或“点击化学柄部”是指能够在点击反应中与第二点击化学柄部反应以产生点击标记的化学部分。在实施方案中，偶联试剂包含点击化学柄部，并且偶联试剂还可包含底物反应性部分。
如本文所用，术语“细胞因子”是指由细胞分泌的对其他细胞具有多种效应的小可溶性蛋白物质。细胞因子介导许多重要的生理功能，包括生长、发育、伤口愈合和免疫应答。细胞因子可以在局部和远离释放位点起作用。它们包括I型细胞因子，其涵盖许多白介素，以及几种造血生长因子；II型细胞因子，包括干扰素和白介素-10；肿瘤坏死因子(“TNF”)相关分子，包括TNFα和淋巴毒素；免疫球蛋白超家族成员，包括白介素1(“IL-1”)；以及趋化因子，即在各种各样的免疫和炎症功能中发挥关键作用的分子家族。取决于细胞的状态，相同的细胞因子可以对细胞具有不同的效应。细胞因子通常调节其他细胞因子的表达，并触发其他细胞因子的级联。细胞因子的非限制性实例包括例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12/IL-23P40、IL13、IL-15、IL-15/IL-15-RA、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、TGF-β、IFNγ、GM-CSF、Groα、MCP-1和TNF-α。
如本文所用，术语“内源性”意在指化合物的天然形式(例如，小分子)或过程。例如，在一些实施方案中，术语“内源性”是指核酸或多肽在生物体或细胞中或者生物体或细胞的基因组中天然位置处的天然形式。
如本文所用，术语“外源性核酸”是指对于细胞并非天然的但引入细胞或祖细胞中的核酸(例如基因)。外源性核酸可包括与细胞天然的内源性核酸同源或相同的区域或开放阅读框(例如基因)。在一些实施方案中，外源性核酸包括RNA。在一些实施方案中，外源性核酸包括DNA。在一些实施方案中，外源性核酸整合进细胞的基因组中。在一些实施方案中，外源性核酸由细胞机器加工以产生外源性多肽。在一些实施方案中，外源性核酸不被细胞或者作为引入外源性核酸的细胞后代的细胞保留。
如本文所用，术语“稳定化”是指与不结合外源性抗原性多肽时对应的野生型抗原呈递多肽的存在相比，不结合外源性抗原性多肽时细胞表面上可负载外源性抗原呈递多肽的存在增加或延长。例如，当不结合外源性抗原性多肽时可负载外源性抗原呈递多肽可以在表面上显示一定时间量，该时间量与结合外源性多肽时细胞表面上野生型外源性抗原呈递多肽的存在相当。在一些实施方案中，当不结合外源性多肽时可负载外源性抗原呈递多肽可以在表面上显示结合外源性多肽时野生型外源性抗原呈递多肽在细胞表面上存在的时间量的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。测定外源性抗原呈递多肽的水平的方法在本领域中是已知的，并且包括例如流式细胞术。
如本文所用，术语“免疫相容”是指由受试者的免疫系统识别为自身，或者不能在受试者中引发免疫应答的核酸、多肽、细胞、或它们的任何组合。
如本文所用，术语“免疫不相容”是指由受试者的免疫系统识别为非自身，或者能够在受试者中引发免疫应答的核酸、多肽、细胞、或它们的任何组合。
如本文所用，术语“受体序列”是指条件性地改变另一聚合物序列的状态的聚合物序列。受体序列可包括多肽序列、核酸序列(DNA序列、适体序列、RNA序列、核酶序列、杂交序列、修饰或类似核酸序列等)、碳水化合物序列等。用作受体序列的核酸和氨基酸序列可以是天然存在的序列、工程化序列(例如，经修饰天然序列)、或从头设计的序列。
如本文所用，术语“工程化细胞”是指经基因修饰的细胞或其后代。
如本文所用，术语“去核细胞”是指缺乏核(例如，由于分化过程，如红血球生成)的细胞。在一些实施方案中，去核细胞不能表达多肽。在一些实施方案中，去核细胞是红细胞、网织红细胞、或血小板。
如本文所用，“工程化去核细胞”是指源自经基因修饰的有核细胞或其后代并且缺乏核(例如，由于分化)的细胞。在一些实施方案中，工程化去核细胞包含由工程化去核细胞所起源的经基因修饰的有核细胞或其后代(例如，在去核之前)产生的外源性多肽。
如本文所用，“工程化红系细胞”是指经基因修饰的红系细胞或其后代。工程化红系细胞包括工程化有核红系细胞(例如，经基因修饰的红系前体细胞)和工程化去核红系细胞(例如，源自经基因修饰的红系前体细胞的网织红细胞和红细胞)。
如本文所用，“工程化去核红系细胞”是指源自经基因修饰的有核红系细胞或其后代并且缺乏核(例如，由于分化)的红系细胞。在一些实施方案中，工程化去核红系细胞包括源自经基因修饰的有核红系细胞或其后代的红细胞或网织红细胞。在一些实施方案中，工程化去核红系细胞不源自永生化有核红系细胞或其后代。
如本文所用，“红系前体细胞”是指能够分化成网织红细胞或红细胞的细胞。通常，红系前体细胞是有核的。红系前体细胞包括脐带血干细胞、CD34+细胞、造血干细胞(HSC)、脾集落形成(CFU-S)细胞、共同髓系祖(CMP)细胞、胚细胞集落形成细胞、爆式红系集落形成单位(BFU-E)、巨核细胞-红系祖(MEP)细胞、红系集落形成单位(CFU-E)、诱导多能干细胞(iPSC)、间充质干细胞(MSC)、中幼红细胞和晚幼红细胞。在一些实施方案中，红系前体细胞是永生化或无限增殖化细胞。例如，可以通过CD34+造血祖细胞的逆转录转导以表达Oct4、Sox2、Klf4、cMyc和阻抑TP53来生成无限增殖化成红细胞(例如，如Huang等人(2014)Mol.Ther.22(2):451-63所述，其全部内容以引用方式并入本文)。
如本文所用，术语“表达”是指细胞产生多肽的过程，包括转录和翻译。可以使用几种不同的方法，包括但不限于增加编码多肽的基因的拷贝数，增加基因的转录，以及增加编码多肽的mRNA的翻译，提高细胞中特定多肽的表达。
如本文所用，当存在多于一种类型的外源性多肽或核酸时，关于外源性多肽或核酸的术语“第一”、“第二”和“第三”等用于方便的区分。这些术语的使用不旨在赋予外源性多肽或核酸特定的顺序或方向，除非明确地如此陈述。
如本文所用，术语“基因”用于广泛地指与给定RNA或蛋白质的表达相关联的核酸的任何片段。因此，基因包括编码表达的RNA的区域(其通常包括多肽编码序列)，并且通常包括其表达所需的调控序列。基因可以从多种来源获得，包括从所关注来源克隆或者由已知或预测的序列信息合成，并且可以包括设计成具有特定期望参数的序列。
如本文所用，术语“核酸分子”是指脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸碱基的单或双链聚合物。其包括但不限于染色体DNA、质粒、载体、mRNA、tRNA、siRNA等，其可为重组的，并且当核酸引入细胞中时可由其表达外源性多肽。
如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中互换地用于指氨基酸残基的聚合物。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”也包括修饰，包括但不限于糖基化、磷酸化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、羟基化和ADP-核糖基化。应当理解，如所公知且如上所述，多肽可能不是完全线性的。例如，作为泛素化的结果，多肽可为支化的，并且通常作为翻译后事件，包括天然加工事件和非天然发生的由人为操作引起的事件的结果，它们可为环状的(具有或不具有分支)。
如本文所用，本文中称为“重组”的多肽是指通过重组DNA方法产生的多肽，包括通过依赖于人工重组方法(如聚合酶链反应(PCR)和/或使用限制性酶克隆到载体中)的程序生成的那些。
如本文所用，术语多肽的“变体”是指与参考多肽相比具有至少一个氨基酸残基差异的多肽，例如一个或多个取代、插入或缺失。在一些实施方案中，变体具有与该多肽至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％95％、96％、97％、98％、或99％的同一性。变体可包括多肽(例如酶)的片段(例如，酶活性片段)。在一些实施方案中，与全长多肽相比，片段可在多肽的N末端、C末端或两端(各自独立地)缺少多至约1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、或100个氨基酸残基。变体可以是天然存在的或非天然存在的。非天然存在的变体可以使用本领域已知的诱变方法生成。变体多肽可包含保守或非保守氨基酸取代、缺失或添加。
如本文所用，提及到核酸和氨基酸序列时的术语“序列同一性”或“同一性”是指在比对序列并引入空位(根据需要)以实现最大百分比序列同一性之后，候选序列中与参考序列中的氨基酸残基或核苷酸相同的氨基酸残基或核苷酸的百分比，而不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分。除了人工之外，可以如下产生用于比较的序列的最佳比对：通过Smith和Waterman,1981,Ads App.Math.2,482的局部同源性算法；通过Neddleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48,443的局部同源性算法；通过Pearson和Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,2444的相似性搜索方法；或者通过使用这些算法的计算机程序(GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA，Wisconsin Genetics软件包,Genetics Computer Group,575Science Drive,Madison,Wis.)。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括在所采用的剂量和/或浓度下对暴露于其的哺乳动物无毒或无害的任何标准药物赋形剂、载体或稳定剂。
如本文所用，术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用，并且是指期望诊断、治疗、或疗法的任何哺乳动物受试者，尤其是人类。本文所述的方法适用于人类疗法和兽医应用两者。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物(例如人类受试者)。
如本文所用，“给药”及其变体是指将组合物或试剂引入受试者中，并且包括组合物或试剂的同时和顺序引入。“给药”可指例如治疗、药代动力学、诊断、研究、安慰剂和实验方法。“给药”也涵盖体外和离体治疗。组合物或试剂在受试者中的引入通过任何合适的途径，包括口服、肺部、鼻内、肠胃外(静脉内、肌内、腹膜内、或皮下)、直肠、淋巴内、或局部。给药包括自身给药以及由另一者给药。给药可通过任何合适的途径进行。合适的给药途径允许组合物或试剂执行其预期功能。例如，如果合适的途径是静脉内，则通过将组合物或试剂引入受试者的静脉中来给药组合物。
如本文所用，术语“剂量”可互换地用于指在给定时间内给药于受试者的药理活性物质的特定量。除非另外指明，所列举的剂量是指包含如本文所述的一种或多种所关注多肽的多个工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞的剂量是指工程化红系细胞或去核细胞的有效量。当涉及到给药的剂量时，在本文所提供的任何一种方法、组合物或试剂盒的实施方案中，本文所提供的任何一种剂量是在标签/标签剂量上出现的剂量。
如本文所用，术语“治疗有效量”和“有效量”可互换地用于指足以提供预期有益效果(例如，防止、预防、延缓症状发作，或者改善病症(例如，癌症、自身免疫疾病、或感染性疾病)的症状)的活性剂(例如，本文所述的工程化红系细胞或去核细胞)的量。在预防性或防止性应用中，可以向容易感染或以其他方式处于发展疾病、障碍或病症(例如，癌症、自身免疫疾病、或感染性疾病)的风险的受试者给药有效量，以消除或降低疾病、障碍或病症的风险，减轻严重程度，或延缓发作，包括疾病、障碍或病症的生物化学、组织学和/或行为症状、其并发症和中间病理表型。
如本文所用，术语“治疗效果”是指治疗的结果，其结果认为是期望和有益的。治疗效果可包括直接或间接地阻止、减少或消除疾病表现。治疗效果还可包括直接或间接地阻止、减少或消除疾病表现的进展。
如本文所用，术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转障碍、疾病或病症(例如，癌症、自身免疫疾病、或感染性疾病)的进展，基本上改善障碍、疾病或病症的临床症状，或者基本上防止障碍、疾病或病症的临床症状的出现，获得有益或期望的临床结果。治疗还指实现以下中的一者或多者：(a)减少障碍、疾病或病症(例如，癌症、自身免疫疾病、或感染性疾病)的严重程度；(b)限制所治疗的一种或多种障碍、疾病或病症的特征性症状的发展；(c)限制所治疗的一种或多种障碍、疾病或病症的特征性症状的恶化；(d)限制先前患有一种或多种障碍、疾病或病症的受试者中的一种或多种障碍、疾病或病症的复发；以及(e)限制先前对于一种或多种障碍、疾病或病症无症状的受试者中的症状的复发。
有益或期望的临床结果，如药理和/或生理效应包括但不限于防止疾病、障碍或病症在可能易患疾病、障碍或病症但尚未经历或表现出疾病的症状的受试者中发生(预防性治疗)，缓解疾病、障碍或病症的症状，减轻疾病、障碍或病症的程度，稳定(即，不恶化)疾病、障碍或病症，防止疾病、障碍或病症的传播，延缓或减缓疾病、障碍或病症的进展，改善或缓和疾病、障碍或病症，以及它们的组合，以及与未接受治疗的预期存活相比存活延长。
如本文所用，术语“癌症”是指异常细胞不受控制地分裂的疾病。在某些实施方案中，癌症选自包括但不限于以下的癌症：急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、肠癌、脑肿瘤、乳腺癌、原发灶不明转移癌、扩散至骨的癌症、扩散至脑的癌症、扩散至肝的癌症、扩散至肺的癌症、类癌瘤、宫颈癌、绒毛膜癌、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、眼癌、胆囊癌、胃癌、滋养细胞肿瘤(GTT)、毛细胞白血病、头颈癌、霍奇金淋巴瘤、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤皮肤癌、间皮瘤、男性的癌症、葡萄胎妊娠、口腔口咽癌、骨髓瘤、鼻和鼻窦癌、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、食管癌、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、前列腺癌、罕见癌症、直肠癌、唾液腺癌、续发性癌症、皮肤癌(非黑素瘤)、软组织肉瘤、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、原发灶不明转移癌、子宫癌、阴道癌和外阴癌。
如本文所用，术语“自身免疫疾病”通常是指受试者的免疫系统攻击身体自身细胞，引起组织破坏或损伤的疾病或病症。在一些实施方案中，术语“自身免疫疾病”包括由滤泡辅助T细胞(Tfh)、Th1细胞、和/或T辅助性17(Th17)T细胞调节的任何自身免疫疾病(参见例如Zhang等人(2017)J.Immunol.198(1增刊)55.13；Jeon等人(2016)Immune Netw.16(4):219-32；和Noack等人(2014)Autoimmunity Reviews13(6):668-77；其每者的内容以引用方式并入本文)。例如，自身免疫疾病包括但不限于类风湿性关节炎(RA)、幼年特发性关节炎、类风湿性脊椎炎、强直性脊柱炎、骨关节炎、风性关节炎、银屑病性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、I型糖尿病(T1D)、多发性硬化症(MS)、混合性结蒂组织障碍、移植物抗宿主病(GVHD)、自身免疫性葡萄膜炎、肾炎、银屑癣、系统性红斑狼疮(SLE)、疱疹性角膜基质炎(HSK)、哮喘、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、脊椎关节炎、活动性中轴型脊柱关节炎(活动性axSpA)和非放射学中轴型脊柱关节炎(nr-axSpA)、寻常型天疱疮、大疱性类天疱疮、膜性肾小球肾炎、视神经脊髓炎、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性肝炎、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病、皮肌炎、巨细胞动脉炎、肉芽肿性多血管炎、川崎氏病、狼疮性肾炎、结节性多动脉炎、坏疽性脓皮病和高安氏动脉炎。可以使用血液测试、脑脊液分析、肌电图(测量肌肉功能)和脑的磁共振成像来诊断自身免疫疾病，但是血液中的抗体测试对于自身抗体(或自体抗体)是特别有用的。通常，IgG类抗体与自身免疫疾病相关联。
I.包括外源性抗原呈递多肽的工程化红系细胞或去核细胞
本公开的特征为工程化成包含野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰的去核细胞)。在一些实施方案中，本文所提供的工程化红系细胞或去核细胞在细胞表面上包含可负载外源性抗原呈递多肽，该可负载外源性抗原呈递多肽包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代使细胞表面上的可负载外源性抗原呈递多肽稳定化。在一些实施方案中，在不存在与外源性抗原呈递多肽(例如其抗原结合槽)结合的多肽的情况下，可负载外源性抗原呈递多肽在细胞表面上是稳定化的。
在一些实施方案中，可以选择所关注的外源性抗原性多肽，并且将其负载到本文所述的工程化红系或去核细胞上存在的野生型或可负载外源性抗原呈递多肽上，然后给药于受试者，因此允许针对特定受试者特异的可定制疗法。
在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽包含可置换多肽，该可置换多肽与可负载外源性抗原呈递多肽结合。在一些实施方案中，在给药于受试者之前，可置换多肽可由所关注的选定外源性抗原性多肽替代。
基于本文所提供的公开内容，熟练技术人员将理解，一旦拥有本文所提供的教导内容，许多免疫调节分子可用于产生几乎无限种类的工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)。也就是说，在参与免疫细胞活化和诱导的事件和分子方面，例如T调节性细胞的活化，或免疫细胞例如自然杀伤(NK)细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞和/或DC的阻抑的抑制，本领域有广泛的知识。
在一些方面，本公开提供了包含外源性多肽(例如，在细胞表面上呈递外源性多肽)的工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰的去核细胞)。外源性多肽包括但不限于野生型外源性抗原呈递多肽、可负载外源性抗原呈递多肽、外源性抗原性多肽、外源性可置换多肽、外源性共刺激多肽、外源性共抑制多肽和外源性Treg共刺激多肽。
外源性抗原呈递多肽
在一个方面，本公开提供了包含可负载外源性抗原呈递多肽的工程化红系细胞或去核细胞。本公开的可负载外源性抗原呈递多肽包括多肽，该多肽包括与对应的野生型外源性抗原呈递多肽相比包含一个或多个氨基酸取代的人类白细胞抗原(HLA)I类和HLAII类多肽，所述一个或多个氨基酸取代使细胞表面上的可负载外源性抗原呈递多肽稳定化，例如在不存在结合的外源性多肽的情况下。
在一些实施方案中，如本文所述的野生型或可负载外源性抗原呈递多肽与外源性抗原性多肽结合。在其他实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽与外源性可置换多肽结合。在其他实施方案中，将外源性可置换多肽移除并且由外源性抗原性多肽替代，并且可负载外源性抗原呈递多肽在细胞表面上维持稳定的构象。
HLA I类多肽是由两条多肽链即α链和β2-微球蛋白(β2M)链组成的异源二聚体。HLA I类α链由单个多肽组成，该单个多肽由称为α1、α2和α3的三个胞外结构域、使其锚定在质膜中的跨膜结构域，以及较短的胞质内尾构成。β2M链是与α链非共价结合的单个多肽。仅α链为多态性并且由HLA基因编码，而β2m亚单位不为多态性并且由β2M基因编码。HLA I类多肽具有β2亚单位并且仅由CD8共受体识别。如本文所用，HLA I类多肽包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E和HLA-G。
在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含HLA α重链多肽和β2M多肽、或它们的片段。在一些实施方案中，HLA α重链包含一个或多个HLAα重链结构域(例如，α1、α2和α3结构域中的一者或多者)。
在本公开的一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含HLA I类多肽，并且包括信号序列。在一些实施方案中，HLA重链多肽衍生自HLA I类多肽。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽衍生自I类HLA多肽，并且不包括信号序列。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含来自I类HLA多肽的胞外域。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含来自I类HLA多肽的α1、α2和α3结构域中的一者或多者。
HLA II类多肽也为由α和β多肽链组成的异源二聚体。链的亚命名(即例如α1、α2以及β1和β2)是指HLA α基因和β多肽内的独立结构域(或亚单位)。CD4结合至β2区域。如本文所用，HLA II类多肽包括HLA-DPα、HLA-DPβ、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA DOA、HLA DOB、HLA DQα、HLA DQβ、HLA DRα和HLA DRβ。
在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含HLA II类多肽，并且包括信号序列。在一些实施方案中，HLA重链多肽衍生自HLA II类多肽。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽衍生自HLAII类多肽，并且不包括信号序列。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含来自HLAII类多肽的胞外域。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含来自HLA II类α链的α1结构域和α2结构域中的一者或多者。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含来自HLAII类β链的β1结构域和β2结构域中的一者或多者。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含来自HLAII类α链的α1结构域和α2结构域中的一者或多者，以及来自HLAII类β链的β1结构域和β2结构域中的一者或多者。
本公开的野生型或可负载外源性抗原呈递多肽可包括细胞表面复合物或细胞表面分子(例如HLA I类或HLA II类多肽)的亚单位，并且与外源性抗原性多肽结合。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包括HLAII类多肽的亚单位，并且结合至外源性抗原性多肽。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包括HLA I类的亚单位，并且结合至外源性抗原性多肽。在一些实施方案中，外源性抗原呈递多肽包含前导(信号)序列。在一些实施方案中，外源性抗原呈递多肽不包含前导(即信号)序列。在一些实施方案中，前导序列融合至野生型或可负载外源性抗原呈递多肽(例如，包括缺乏其前导序列(即信号序列)的HLA I类或HLA II类多肽)。在一些实施方案中，外源性野生型或可负载抗原呈递多肽是包含前导序列和HLA I类多肽的融合多肽。在一些实施方案中，外源性野生型或可负载抗原呈递多肽是包含前导序列和HLA II类多肽的融合多肽。在一些实施方案中，前导序列选自表1所示的序列。
表1：前导序列
SEQ ID NO: 序列描述 氨基酸序列
6 β2m前导序列 MSRSVALAVLALLSLSGLEA
7 GPA信号肽 MYGKIIFVLLLSEIVSISA
在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含HLAI类多肽的α结构域1-3以及β2m多肽、或它们的片段或变体中的一种或多种。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含I型膜蛋白(例如，GPA)的跨膜结构域、HLAI类多肽的胞外域，以及β2m多肽。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含I型膜蛋白(例如，GPA)的跨膜结构域；HLA I类多肽的以下胞外结构域：α结构域1、α结构域2和α结构域3；以及β2m多肽。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含I型膜蛋白(例如，GPA)的跨膜结构域、截短成不包括天然跨膜结构域和天然胞质区域两者的HLA I类多肽，并且还包括β2m多肽。
在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含HLA II类α链或其片段(例如，α结构域1和2中的一者或多者)，以及HLA II类β链或其片段(例如，β结构域1和2中的一者或多者)、或它们的片段或变体。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含I型膜蛋白(例如，GPA)的跨膜结构域、HLAII类α链的胞外域(例如，α结构域1和2中的一者或多者)，以及HLA II类β链的胞外域(例如，β结构域1和2中的一者或多者)。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含I型膜蛋白(例如，GPA)的跨膜结构域、截短成不包括天然跨膜结构域和天然胞质区域两者的HLAII类α链，以及截短成不包括天然跨膜结构域和天然胞质区域两者的HLA II类β链。
在一些实施方案中，工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰的去核细胞)包含融合至外源性抗原性多肽的野生型或可负载抗原呈递多肽(例如，作为单链构建体)。
在一些实施方案中，工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)包含融合至外源性可置换多肽的野生型或可负载抗原呈递多肽。
在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含HLA I类α链和β2M多肽两者。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽仅包含HLA I类α链。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽仅包含β2M多肽。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含HLAI类α链和β2M多肽两者，并且HLA I类α链和β2m多肽是非共价附接的。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含HLA I类α链和β2M多肽两者，并且HLAI类α链和β2m多肽是共价附接或融合的。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含与HLAI类α链连接的外源性抗原性多肽。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含与β2M多肽连接的外源性抗原性多肽。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含与β2M多肽连接的外源性抗原性多肽，该β2M多肽与HLA I类α链连接。
在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含HLAII类α链和HLAII类β链两者。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽仅包含HLAII类α链。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽仅包含HLAII类β链。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含HLA II类α链和HLAII类β链两者，并且HLA II类α链和HLAII类β链是非共价附接的。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含HLAII类α链和HLAII类β链两者，并且HLA II类α链和HLA II类β链是共价附接或融合的。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含与HLA II类α链连接的外源性抗原性多肽。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含与HLAII类β链连接的外源性抗原性多肽。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含与HLA II类β链连接的外源性抗原性多肽，该HLA II类β链与HLA II类α链连接。
在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含锚或跨膜结构域。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含来自I型膜蛋白的锚或跨膜结构域。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含HLA I类多肽，该HLAI类多肽既不包含天然跨膜结构域又不包含天然胞质区域，而是包含非天然跨膜结构域(例如，I型膜蛋白的跨膜结构域)。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含HLAII类α链和HLA II类β链，它们各自缺乏天然跨膜结构域和/或天然胞质区域，相反，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含非天然跨膜结构域(例如，I型膜蛋白的跨膜结构域)。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含I型膜蛋白的跨膜结构域，该I型膜蛋白选自血型糖蛋白A(GPA)；血型糖蛋白B(GPB)；基础免疫球蛋白(也称为CD147)；CD44；CD58(也称为LFA3)；细胞间粘附分子4(ICAM4)；基底细胞粘附分子(BCAM)；CR1；CD99；成红细胞膜相关蛋白(ERMAP)；连接粘附分子A(JAM-A)；神经弹性蛋白(neuroplastin)(NPTN)；AMIGO2；以及DS细胞粘附分子样1(DSCAML1)。在一些实施方案中，1型膜蛋白包括GPA。在一些实施方案中，跨膜结构域是血型糖蛋白锚，特别是GPA，或其片段。在一些实施方案中，跨膜结构域包含表2所列的氨基酸序列。
表2：跨膜结构域序列
Figure BDA0003302151970000331
在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含经由接头连接至跨膜结构域(例如，非内源性跨膜结构域，例如GPA)的HLA I类或HLAII类多肽(或其片段)。在一些实施方案中，接头设置在HLAI类多肽的α3链与跨膜结构域之间。在一些实施方案中，接头是GlySer接头。在一些实施方案中，接头为约18个氨基酸长度。在其他实施方案中，接头为约2个氨基酸长度至30个氨基酸长度。在一些实施方案中，接头为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个或更多个氨基酸长度。在一些实施方案中，接头是可剪切接头。在一些实施方案中，接头选自表3所列的氨基酸序列。
在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含设置在一个或多个HLAα重链多肽与β2M多肽之间的接头。在一些实施方案中，接头是GlySer接头。在一些实施方案中，接头为约20个氨基酸长度。在其他实施方案中，接头为约2个氨基酸长度至30个氨基酸长度。在一些实施方案中，接头为约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个或更多个氨基酸长度。在一些实施方案中，接头为约18个氨基酸残基长度。在一些实施方案中，接头是可剪切接头。在一些实施方案中，接头选自表3所列的氨基酸序列。
表3：接头序列
Figure BDA0003302151970000341
在一些实施方案中，外源性抗原性多肽或外源性可置换多肽经由接头与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽连接。在一些实施方案中，接头为约15个氨基酸长度。在其他实施方案中，接头为约10个氨基酸长度至30个氨基酸长度。在一些实施方案中，接头为约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个或更多个氨基酸长度。
在一些实施方案中，酶切割位点设置在使野生型或可负载外源性抗原呈递多肽与外源性抗原性多肽或外源性可置换多肽连接的接头中。在一些实施方案中，切割位点可用于释放外源性可置换多肽(例如，在从HLA多肽置换时)。在其他实施方案中，切割位点可在切割时暴露可用于缀合部分(例如，点击柄部)或肽的N末端氨基酸序列。在一些实施方案中，酶切割位点是人鼻病毒(HRV)3C蛋白酶切割位点。在一些实施方案中，酶切割位点包含氨基酸序列LEVLFQ/GP(SEQ ID NO:1)，其中反斜杠指示切割位点。在一些实施方案中，酶切割位点是烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶切割位点。在一些实施方案中，酶切割位点包含氨基酸序列ENLYFQ/G(SEQ ID NO:2)，其中反斜杠指示切割位点。
在一些实施方案中，酶切割位点在距接头中的GGG基序的10个氨基酸或更少之内，并且位于GGG基序与可置换多肽之间。在一些实施方案中，GGG基序为酶切割位点的C末端。在一些实施方案中，酶切割位点在距LPTXG基序(SEQ ID NO:3)的10个氨基酸或更少之内，并且位于LPTXG基序(SEQ ID NO:3)与可置换多肽之间。在一些实施方案中，LPTXG基序(SEQID NO:3)为酶切割位点的C末端。
在一些实施方案中，酶切割位点靠近SpyTag序列(AHIVMVDAYKPTK(SEQ ID NO:4))，并且位于SpyTag序列与可置换多肽之间。在一些实施方案中，SpyTag序列为酶切割位点的C末端。在一些实施方案中，酶切割位点在距氨基酸序列AHIVMVDAYKPTK(SEQ ID NO:4)的10个氨基酸或更少之内。
在一些实施方案中，酶切割位点靠近KTag序列(ATHIKFSKRD(SEQ ID NO:5))，并且位于KTag序列与可置换多肽之间。在一些实施方案中，KTag序列为酶切割位点的C末端。在一些实施方案中，酶切割位点在距氨基酸序列ATHIKFSKRD(SEQ ID NO:5)的10个氨基酸或更少之内。
在一些实施方案中，本文所提供的可负载外源性抗原呈递多肽包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代使细胞表面上的可负载外源性抗原呈递多肽稳定化。在一些实施方案中，在不存在与可负载外源性抗原呈递多肽(例如其抗原结合槽)结合的多肽(例如，外源性抗原性多肽或外源性可置换多肽)的情况下，可负载外源性抗原呈递多肽在细胞(例如，包含可负载外源性抗原呈递多肽的工程化红系细胞或去核细胞)的细胞表面上是稳定化的。
在一些实施方案中，外源性抗原性多肽或外源性可置换多肽负载在本文所述的野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的抗原结合槽上。在一些实施方案中，外源性抗原性多肽或外源性可置换多肽存在于野生型或可负载外源性抗原呈递多肽上，例如，外源性抗原性多肽或外源性可置换多肽与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽结合。外源性抗原性多肽或外源性可置换多肽可共价或非共价地连接至野生型或可负载外源性抗原呈递多肽。在一些实施方案中，外源性抗原性多肽或外源性可置换多肽是游离的，并且可以与存在于工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)的细胞表面上的野生型或可负载外源性抗原呈递多肽结合。在一些实施方案中，偶联试剂可用于连接(例如共价附接)外源性多肽或外源性可置换多肽与存在于细胞表面上的野生型或可负载外源性抗原呈递多肽。
在一些实施方案中，如本文所详述的点击化学可用于连接外源性抗原性多肽或外源性可置换多肽与存在于细胞表面上的野生型或可负载外源性抗原呈递多肽。
用于评估结合亲和力和/或确定外源性抗原性多肽或外源性可置换多肽是否特异性结合至(或者被特异性地结合至)特定配体(例如，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽)的多种测定是本领域已知的。例如，表面等离子共振
Figure BDA0003302151970000361
可用于测定两种多肽之间的复合物的结合常数。在该测定中，当缓冲液经过芯片时，可以通过监测折射率随时间的变化来测定复合物的解离常数。用于测量一种多肽与另一种多肽的结合的其他合适的测定包括例如免疫测定，如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射性免疫测定(RIA)，或通过使用荧光、UV吸收、圆二向色性、或核磁共振(NMR)监测蛋白质的光谱或光学特性的变化的结合测定。其他示例性测定包括但不限于Western印迹、分析超速离心和光谱学(参见例如Scatchard等人(1949)Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660；Wilson(2002)Science 295:2103；Woffi等人(1993)Cancer Res.53:2560-5；美国专利No.5,283,173和5,468,614；以及国际专利公开No.WO 2018/005559)。或者，可使用预测性算法来确定多肽与特定配体(例如，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽)的结合。例如，用于预测HLA II类和II类表位的方法在本领域中是公知的，并且包括TEPITOPE(参见例如Meister等人(1995)Vaccine 13:581-91)、EpiMatrix(De Groot等人(1997)AIDS Res Hum Retroviruses 13:529-31)、预测方法(Yu等人(2002)Mol.Med.8:137-48)、SYFPEITHI表位预测算法(Schuler等人(2007)MethodsMol Biol.409:75-93)，以及Rankpep(Reche等人(2002)Hum.Immunol.63(9):701-9)。用于预测HLA I类和II类表位的额外算法描述于例如Kessler和Melief(2007)Leukemia 21(9):1859-74。
在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-G、HLA-DRB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1和/或HLA-DPB1多肽、或它们的片段，并且能够结合至外源性抗原性多肽且能够使其显示在细胞表面上。
在图2A和2B中描述了包含野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的一些示例性构建体。
在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含HLA I类多肽(或其片段)，以及任选地β2M多肽，其中HLA I类多肽是HLA-A多肽。在一些实施方案中，HLA-A多肽包含选自A*01:01、A*02:01、A*03:01、A*24:02、A*11:01、A*29:02、A*32:01、A*68:01、A*31:01、A*25:01、A*26:01、A*23:01和A*30:01的HLA-A等位基因。在一些实施方案中，HLA-A多肽连接至外源性抗原性多肽或外源性可置换多肽作为单链融合多肽。在一些实施方案中，单链融合多肽包含跨膜结构域(例如，表2所示的跨膜结构域)。在一些实施方案中，单链融合多肽包含HLA-A多肽，该HLA-A多肽既不包含天然跨膜结构域又不包含天然胞质区域，而是包含非天然跨膜结构域(例如，I型膜蛋白的跨膜结构域)。在一些实施方案中，单链融合多肽包含接头(例如，介于外源性抗原性多肽或外源性可置换多肽与β2M多肽之间，介于β2M多肽与HLA-Aα链(或其片段)之间，或者介于HLA-Aα链(或其片段)与跨膜结构域之间)。在一些实施方案中，接头选自表3所示的序列。在一些实施方案中，单链融合多肽包含前导序列(例如，表1所示的接头序列)。在一些实施方案中，HLA-A前导序列融合至包含跨膜结构域的本文所提供的野生型或可负载外源性抗原呈递多肽。
在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含HLAI类多肽(或其片段)，以及任选地β2M多肽，其中HLA I类多肽是HLA-B多肽。在一些实施方案中，HLA-B多肽包含选自B*08:01、B*07:02、B*44:02、B*15:01、B*40:01、B*44:03、B*35:01、B*51:01、B*27:05、B*57:01、B*18:01、B*14:02、B*13:02、B*55:01、B*14:01、B*49:01、B*37:01、B*38:01、B*39:01、B*35:03和B*40:02的HLA-B等位基因。在一些实施方案中，HLA-B多肽连接至外源性抗原性多肽或外源性可置换多肽作为单链多肽。在一些实施方案中，单链融合多肽包含跨膜结构域(例如，表2所示的跨膜结构域)。在一些实施方案中，单链融合物包含HLA-B多肽，该HLA-B多肽既不包含天然跨膜结构域又不包含天然胞质区域，而是包含非天然跨膜结构域(例如，I型膜蛋白的跨膜结构域)。在一些实施方案中，单链融合多肽包含接头(例如，介于外源性抗原性多肽或外源性可置换多肽与β2M多肽之间，介于β2M多肽与HLA-Bα链(或其片段)之间，或者介于HLA-Bα链(或其片段)与跨膜结构域之间)。在一些实施方案中，接头选自表3所示的序列。在一些实施方案中，单链融合多肽包含前导序列(例如，表1所示的前导序列)。在一些实施方案中，HLA-B前导序列融合至包含跨膜结构域的本文所提供的野生型或可负载外源性抗原呈递多肽。
在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含HLA I类多肽(或其片段)，以及任选地β2M多肽，其中HLA I类多肽是HLA-C多肽。在一些实施方案中，HLA-C多肽包含选自C*07:01、C*07:02、C*05:01、C*06:02、C*04:01、C*03:04、C*03:03、C*02:02、C*16:01、C*08:02、C*12:03、C*01:02、C*15:02、C*07:04和C*14:02的HLA-C等位基因。在一些实施方案中，HLA-C多肽连接至外源性抗原性多肽或外源性可置换多肽作为单链融合多肽。在一些实施方案中，单链融合多肽包含跨膜结构域(例如，表2所示的跨膜结构域)。在一些实施方案中，单链融合物包含HLA-C多肽，该HLA-C多肽既不包含天然跨膜结构域又不包含天然胞质区域，而是包含非天然跨膜结构域(例如，I型膜蛋白的跨膜结构域)。在一些实施方案中，单链融合多肽包含接头(例如，介于外源性抗原性多肽或外源性可置换多肽与β2M多肽之间，介于β2M多肽与HLA-Cα链(或其片段)之间，或者介于HLA-Cα链(或其片段)与跨膜结构域之间)。在一些实施方案中，接头选自表3所示的序列。在一些实施方案中，单链融合多肽包含前导序列(例如，表1所示的前导序列)。在一些实施方案中，HLA-C前导序列融合至包含跨膜结构域的本文所述的野生型或可负载外源性抗原呈递多肽。
在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含HLA I类多肽(或其片段)，以及任选地β2M多肽，其中HLA I类多肽是HLA-E多肽。在一些实施方案中，HLA-E多肽包含HLA-E等位基因，即E*01:01:01:01、E*01:01:01:02、E*01:01:01:03、E*01:01:01:04、E*01:01:01:05、E*01:01:01:06、E*01:01:01:07、E*01:01:01:08、E*01:01:01:09、E*01:01:01:10、E*01:01:02、E*01:03:01:01、E*01:03:01:02、E*01:03:01:03、E*01:03:01:04、E*01:03:02:01、E*01:03:02:02、E*01:03:03、E*01:03:04、E*01:03:05、E*01:04、E*01:05、E*01:06、E*01:07、E*01:08N、E*01:09或E*01:10等位基因。在一些实施方案中，HLA-E多肽连接至外源性抗原性多肽或外源性可置换多肽作为单链融合多肽。在一些实施方案中，单链融合多肽包含跨膜结构域(例如，表2所示的跨膜结构域)。在一些实施方案中，单链融合多肽包含HLA-E多肽，该HLA-E多肽既不包含天然跨膜结构域又不包含天然胞质区域，而是包含非天然跨膜结构域(例如，I型膜蛋白的跨膜结构域)。在一些实施方案中，单链融合多肽包含接头(例如，介于外源性抗原性多肽或外源性可置换多肽与β2M多肽之间，介于β2M多肽与HLA-Eα链(或其片段)之间，或者介于HLA-Eα链(或其片段)与跨膜结构域之间)。在一些实施方案中，接头选自表3所示的序列。在一些实施方案中，HLA-E单链融合多肽包含前导序列。在一些实施方案中，前导序列选自表1所示的序列。在一些实施方案中，HLA-E前导序列融合至包含跨膜结构域的本文所述的野生型或可负载外源性抗原呈递多肽。
在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含HLA I类多肽(或其片段)，以及任选地β2M多肽，其中HLA I类多肽是HLA-G多肽。在一些实施方案中，HLA-G多肽选自：HLA-G1、HLA-G2、HLA-G3、HLA-G4、HLA-G5、HLA-G6和HLA-G7。在一些实施方案中，HLA-G是HLA-G多聚体，例如二聚体。在一些实施方案中，HLA-G多肽包含选自G*01:01:01:01、G*01:01:01:02、G*01:01:01:03、G*01:01:01:04、G*01:01:01:05、G*01:01:01:06、G*01:01:01:07、G*01:01:01:08、G*01:01:02:01、G*01:01:02:02、G*01:01:03:01、G*01:01:03:02、G*01:01:03:03、G*01:01:03:04、G*01:01:04、G*01:01:05、G*01:01:06、G*01:01:07、G*01:01:08、G*01:01:09、G*01:01:11、G*01:01:12、G*01:01:13、G*01:01:14、G*01:01:15、G*01:01:16、G*01:01:17、G*01:01:18、G*01:01:19、G*01:01:20、G*01:01:21、G*01:01:22、G*01:02、G*01:03:01:01、G*01:03:01:02、G*01:04:01:01、G*01:04:01:02、G*01:04:02、G*01:04:03、G*01:04:04、G*01:04:05、G*01:04:06、G*01:05N、G*01:06、G*01:07、G*01:08:01、G*01:08:02、G*01:09、G*01:10和G*01:11的HLA-G等位基因。在一些实施方案中，HLA-G多肽包含残基42处未配对的半胱氨酸。在一些实施方案中，HLA-G多肽连接至外源性抗原性多肽或外源性可置换多肽作为单链融合多肽。在一些实施方案中，单链融合多肽包含跨膜结构域(例如，表2所示的跨膜结构域)。在一些实施方案中，单链融合物包含HLA-G多肽，该HLA-G多肽既不包含跨膜结构域又不包含胞质区域，而是包含非天然跨膜结构域(例如，I型膜蛋白的跨膜结构域)。在一些实施方案中，单链融合多肽包含接头(例如，介于外源性抗原性多肽或外源性可置换多肽与β2M多肽之间，介于β2M多肽与HLA-Gα链(或其片段)之间，或者介于HLA-Gα链(或其片段)与跨膜结构域之间)。在一些实施方案中，单链融合多肽包含前导序列(例如，表1所示的前导序列)。在一些实施方案中，HLA-G前导序列融合至包含跨膜结构域的本文所述的野生型或可负载外源性抗原呈递多肽。
在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含至少一种(例如，一种、两种或三种)HLA II类多肽，或它们的片段，选自HLA-DPα、HLA-DPβ、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA DOA、HLA-DOB、HLA-DQα、HLA-DQβ、HLA-DRα和HLA-DRβ多肽、或它们的片段。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含：HLA-DPα多肽或其片段，以及HLA-DPβ多肽或其片段；HLA-DMA多肽或其片段，以及HLA-DMB多肽或其片段；HLA DOA多肽或其片段，以及HLA-DOB多肽或其片段；HLA-DQα多肽或其片段，以及HLA-DQβ多肽或其片段；或HLA-DRα多肽或其片段，以及HLA-DRβ多肽或其片段。在一些实施方案中，HLA-DPα多肽包含选自DPA1*01:03、DPA1*02:01和DPA1*02:07的等位基因。在一些实施方案中，HLA-DPβ多肽包含选自DPB1*04:01、DPB1*02:01、DPB1*04:02、DPB1*03:01、DPB1*01:01、DPB1*11:01、DPB1*05:01、DPB1*10:01、DPB1*06:01、DPB1*13:01、DPB1*14:01和DPB1*17:01的等位基因。在一些实施方案中，HLA-DQα多肽包含选自DQA1*05:01、DQA1*05:03、DQA1*05:05、DQA1*03:01、DQA1*03:02、DQA1*03:03、DQA1*01:02、DQA1*02:01、DQA1*01:01、DQA1*01:03、DQA1*01:04、DQA1*04:01和DQA1*06:01的等位基因。在一些实施方案中，HLA-DQβ多肽包含选自DQB1*03:01、DQB1*02:01、DQB1*06:01、DQB1*06:02、DQB1*06:03、DQB1*05:01、DQB1*05:02、DQB1*02:02、DQB1*03:02、DQB1*06:03、DQB1*03:03、DQB1*03:04、DQB1*06:04、DQB1*06:09、DQB1*05:03、DQB1*05:04和DQB1*04:02的等位基因。在一些实施方案中，HLA-DRβ多肽包含选自DRB1*07:01、DRB1*03:01、DRB1*15:01、DRB1*04:01、DRB1*01:01、DRB1*13:01、DRB1*11:01、DRB1*04:04、DRB1*13:02、DRB1*08:01、DRB1*12:01、DRB1*11:04、DRB1*09:01、DRB1*14:01、DRB1*04:07和DRB1*14:04的等位基因。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含HLA-DQα多肽或其片段，以及HLA-DQβ多肽或其片段，其中HLA-DQα多肽和HLA-DQβ多肽包含以下等位基因的组合，以HLA-DQα等位基因：HLA-DQβ等位基因表示：DQA1*05:01:DQB1*2:01；DQA1*2:01:DQB1*2:02；DQA1*03:02:DQB1*2:02；DQA1*3:01:DQB1*4:02；DQA1*03:02:DQB1*4:02；DQA1*4:01:DQB1*4:02；DQA1*1:01:DQB1*5:01；DQA1*1:02:DQB1*5:01；DQA1*1:03:DQB1*5:01；DQA1*1:04:DQB1*5:01；DQA1*1:02:DQB1*5:02；DQA1*1:03:DQB1*5:02；DQA1*1:04:DQB1*5:03；DQA1*1:02:DQB1*5:04；DQA1*1:03:DQB1*6:01；DQA1*1:02:DQB1*6:02；DQA1*1:03:DQB1*6:02；DQA1*1:04:DQB1*6:02；DQA1*1:02:DQB1*6:03；DQA1*1:03:DQB1*6:03；DQA1*1:02:DQB1*6:04；DQA1*1:02:DQB1*6:09；DQA1*2:01:DQB1*3:01；DQA1*3:01:DQB1*3:01；DQA1*03:03:DQB1*3:01；DQA1*3:01:DQB1*3:04；DQA1*03:02:DQB1*3:04；DQA1*4:01:DQB1*3:01；DQA1*05:05:DQB1*3:01；DQA1*6:01:DQB1*3:01；DQA1*3:01:DQB1*3:02；DQA1*03:02:DQB1*3:02；DQA1*2:01:DQB1*3:03；DQA1*03:01:DQB1*03:02；DQA1*03:02:DQB1*03:02；DQA1*04:01:DQB1*03:02；DQA1*05:03:DQB1*03:02和DQA1*3:02:DQB1*3:03。在一些实施方案中，一种或多种HLA II类多肽连接至外源性抗原性多肽或外源性可置换多肽作为单链融合多肽。在一些实施方案中，单链融合多肽包含HLA II类多肽，该HLA II类多肽既不包含天然跨膜结构域又不包含天然胞质结构域，相反，单链融合多肽包含非天然跨膜结构域(例如，I型膜蛋白的跨膜结构域)。在一些实施方案中，单链融合多肽包含接头(例如，介于外源性抗原性多肽或外源性可置换多肽与HLA II类多肽(或其片段)之间，介于第一HLA II类多肽(或其片段)与第二HLA II类多肽(或其片段)之间，或者介于HLA II类多肽与跨膜结构域之间)。在一些实施方案中，接头是表3所示的接头序列。在一些实施方案中，单链融合多肽包含前导序列(例如，表1所示的前导序列)。在一些实施方案中，HLA II类多肽前导序列融合至包含跨膜结构域的本文所述的野生型或可负载外源性抗原呈递多肽。
在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含HLA II类α链(或其片段)和HLA II类β链(或其片段)，它们各自缺乏天然跨膜结构域和/或天然胞质区域，相反，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含非天然跨膜结构域(例如，I型膜蛋白的跨膜结构域)。在一些实施方案中，跨膜结构域选自表2所示的序列。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含接头(例如，表3所示的接头序列)。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含前导序列(例如，表1所示的前导序列)。
在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含HLA等位基因多肽，该HLA等位基因多肽包含或由表4所示的氨基酸序列组成。本领域的技术人员将易于理解，可负载外源性抗原呈递多肽可包含表4所示的氨基酸序列，其修饰成包括本文所示的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，HLA等位基因多肽包含信号肽。在其他实施方案中，HLA等位基因多肽不包含信号肽。因此，在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含表4所示的任一序列的氨基酸序列，其不包括信号肽氨基酸序列(在表4的序列中加下划线显示)。在其他实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含表4所示的任一序列的氨基酸序列，其包括信号肽氨基酸序列(在表4中加下划线显示)。
表4：HLA等位基因
Figure BDA0003302151970000431
Figure BDA0003302151970000441
Figure BDA0003302151970000451
Figure BDA0003302151970000461
Figure BDA0003302151970000471
Figure BDA0003302151970000481
Figure BDA0003302151970000491
Figure BDA0003302151970000501
Figure BDA0003302151970000511
Figure BDA0003302151970000521
Figure BDA0003302151970000531
Figure BDA0003302151970000541
Figure BDA0003302151970000551
Figure BDA0003302151970000561
Figure BDA0003302151970000571
Figure BDA0003302151970000581
Figure BDA0003302151970000591
Figure BDA0003302151970000601
Figure BDA0003302151970000611
Figure BDA0003302151970000621
Figure BDA0003302151970000631
额外的HLA等位基因氨基酸序列在本领域中是已知的并且可获得于例如IMGT/HLA数据库(可获得于万维网，ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/；参见Robinson等人(2015)Nucl.Acids Res.43:D423-31)。
在一些实施方案中，工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)衍生自红系前体细胞，该红系前体细胞被基因修饰成缺失内源性抗原呈递多肽(例如HLA I类或HLA II类多肽)和/或改变内源性抗原呈递多肽(例如HLA I类或HLA II类多肽)的表达。在一些实施方案中，工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)衍生自红系前体细胞，该红系前体细胞未经基因修饰成缺失内源性抗原呈递多肽(例如HLA I类或HLAII类多肽)和/或改变内源性抗原呈递多肽(例如HLA I类或HLAII类多肽)的表达。
可负载外源性抗原呈递多肽中的氨基酸取代
在一些实施方案中，本文所述的可负载外源性抗原呈递多肽包含一个或多个氨基酸取代(与衍生其的野生型蛋白相比)，所述一个或多个氨基酸取代使细胞表面上的可负载外源性抗原呈递多肽稳定化。在一些实施方案中，在不存在与外源性抗原呈递多肽结合的多肽的情况下，可负载外源性抗原呈递多肽在细胞表面上是稳定化的。
在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代包括取代为半胱氨酸残基，其形成使外源性抗原呈递多肽稳定化的一个或多个二硫键(参见例如Hein等人(2014)J.CellSci.127:2885-97)。
在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽衍生自野生型HLAI类多肽，例如HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、或HLA-G多肽，并且HLA多肽的下列特定位置处的氨基酸残基取代为下列对中的半胱氨酸：84和139；51和175；5和168；130和157；135和140；11和74；45和63；33和49，其中这些位置涉及成熟HLA I类多肽的α链，而无N末端前导序列。
关于示例性HLA I类(例如，HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G和HLA-E)等位基因，氨基酸取代的示例性对如下表5中所示。这些氨基酸取代也如图1所示，其示出HLA-A(即，HLA-A*01:01)、HLA-B(即，HLA-B*51:01)、HLA-C(即，HLA-C*12:02)、HLA-E(即，HLA-E*01:03)和HLA-G(即，HLA-G*01:01)的示例性野生型等位基因的氨基酸序列比对。
在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽包含衍生自HLA I类多肽的氨基酸序列，其包含在成熟HLA I类多肽的α链中的氨基酸残基84和139处氨基酸取代为半胱氨酸。在其他实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽包含HLA I类多肽，并且包含在成熟HLAI类多肽的α链中的氨基酸残基51和175处氨基酸取代为半胱氨酸。在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽包含衍生自HLA I类多肽的氨基酸序列，其不包含在成熟HLA I类多肽的α链中的氨基酸残基84和139处氨基酸取代为半胱氨酸。
在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽(例如HLA多肽)包含至少1、2、3、4、5、6、7、或8个下表5所示的氨基酸取代对。
表5：示例性HLA I类氨基酸取代对
Figure BDA0003302151970000641
Figure BDA0003302151970000651
在其他实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽包含HLA I类多肽，并且包含在成熟HLA I类多肽的α链中的氨基酸残基84处突变为丙氨酸。在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽包含衍生自HLA I类多肽的氨基酸序列，其不包含在成熟HLA I类多肽的α链中的氨基酸残基84处突变为丙氨酸或半胱氨酸。
在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽包含HLA I类多肽，并且包含在成熟HLA I类多肽的α链中的氨基酸残基84处突变为半胱氨酸，并且还包含设置在β2M多肽与可置换外源性多肽之间的接头的第二氨基酸残基处的半胱氨酸。
在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽包含HLA-A*02-01等位基因，并且包含成熟HLAI类多肽的α链中的Q115E突变。
图1所示的野生型蛋白质的序列在上表4中示出。
本公开也涵盖了在其他HLA等位基因中的氨基酸取代，但其对应于本文所述的氨基酸位置。
在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代增加可负载外源性抗原呈递多肽(例如HLA I类多肽)对CD8 TCR的亲和力。在一些实施方案中，本文所述的可负载外源性抗原呈递多肽包含衍生自HLA I类多肽的氨基酸序列，其中HLA I类多肽包含至少一个氨基酸取代(与衍生其的野生型蛋白相比)，所述至少一个氨基酸取代增加可负载MHC蛋白对CD8的亲和力。在一些实施方案中，HLAI类多肽为HLA-A等位基因。在一些实施方案中，HLAI类多肽为HLA-A*02-01等位基因。在一些实施方案中，氨基酸取代是Q115E(例如，MHCI HLA-A*02-01Q115E；参见例如Wooldridge等人(2005)J.Biol.Chem.280:27491-501，其内容据此以引用方式并入本文)。
在一些实施方案中，本文提供了编码本文所述的可负载外源性抗原呈递多肽的核酸分子，其中核酸分子编码本文所述的突变体可负载外源性抗原呈递多肽中的一种或多种。
在一些实施方案中，包含例如HLA II类多肽的本文所述的可负载外源性抗原呈递多肽包含一个或多个氨基酸取代(与衍生其的野生型蛋白相比)，所述一个或多个氨基酸取代使细胞表面上的可负载外源性抗原呈递多肽稳定化。在一些实施方案中，在不存在与外源性抗原呈递多肽结合的多肽的情况下，可负载外源性抗原呈递多肽在细胞表面上是稳定化的。鉴定包含一个或多个所关注的氨基酸取代的HLAII类多肽的方法在本领域中是已知的，并且包括例如通过酵母展示的定向进化(参见例如Esteban等人(2004)J.Mol.Biol.340:81-95；美国专利No.7,442,773；Starwalt等人(2003)Protein Eng.16(2):147-56；美国专利申请No.2002/0165149；Brophy等人(2003)J.Immunol.Methods 272:235-46；美国专利申请公开No.2003/0036506；其每者全文以引用的方式并入本文)。
外源性可置换多肽
在一些实施方案中，本文所述的可负载外源性抗原呈递多肽与外源性可置换多肽结合。在一些实施方案中，相对于可负载外源性抗原呈递多肽对外源性抗原性多肽的结合亲和力(KD)而言，可负载外源性抗原呈递多肽对外源性可置换多肽的结合亲和力(KD)更低。在一些实施方案中，外源性可置换多肽以约1nM至约100μM、约10nm至约100μm、约50nm至约100μm、约100nm至约100μm、约150nm至约100μm、约200nm至约100μm、约250nm至约100μm、约300nm至约100μm、约400nm至约100μm、约500nm至约100μm、约600nm至约100μm、约700nm至约100μm、约800nm至约100μm、约900nm至约100μm、约1μM至约100μm、约5uM至约100μm、约10μm至约100μm、约20μm至约100μm、约30μm至约100μm、约40μm至约100μm、约50μm至约100μm、约60μm至约100μm、约70μm至约100μm、约80μm至约100μm、或约90μm至约100μm的KD与可负载外源性抗原呈递多肽结合。
在一些实施方案中，外源性可置换多肽为约8个氨基酸长度至约30个氨基酸长度，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个氨基酸长度。在另一个实施方案中，外源性可置换多肽包含可剪切位点(例如，酶切割位点(例如，如本文所述))。
在一些实施方案中，外源性可置换多肽与可负载外源性抗原呈递多肽共价附接。在一些实施方案中，外源性可置换多肽与可负载外源性抗原呈递多肽非共价附接。共价附接的进一步细节描述于以下方法中。
在某些实施方案中，外源性可置换多肽包含或由选自表6的抗原多肽、或其片段或变体组成。
表6：示例性外源性可置换多肽
Figure BDA0003302151970000671
*使用NetMHCpan 4.0所测定的预测结合亲和力(可获得于万维网，cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/；另参见Jurtz等人(2017)J.Immunol.199:3360-8)
确定多肽(例如，外源性可置换多肽)与可负载外源性抗原呈递多肽(例如，HLA分子)的亲和力的方法在本领域中是已知的，并且包括例如表面等离子共振(SPR)。
可以使用本领域已知的方法来鉴定合适的外源性可置换多肽，即可特异性地结合至可负载外源性抗原呈递多肽并且可由所关注的外源性抗原性多肽替换的多肽。在一些实施方案中，多肽从可负载外源性抗原呈递多肽上替换可置换多肽的能力可以使用重组蛋白在体外检测，如使用通过色氨酸荧光(TDTF)测量的热变性所测量，如Saini等人(2015)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA112:202-7所述，其内容以引用方式并入本文。此外，外源性可取代肽与所关注肽的交换可以例如通过使用荧光标记的肽(例如，用FITC或TAMRA标记的)的荧光各向异性来测量。
外源性抗原性多肽
在一些实施方案中，本文所述的工程化去核红系细胞或去核细胞包含与外源性抗原性多肽结合的野生型或可负载外源性抗原呈递多肽。在一些实施方案中，本文所提供的一种或多种外源性抗原性多肽的呈递能够活化一种或多种抗原特异性T细胞群(例如，在体外或体内)。在一些实施方案中，本文所述的一种或多种外源性抗原性多肽能够诱导免疫应答以抑制癌症(例如，减少或缓解癌症的病因或症状，或者改善与癌症相关的参数的值)。在一些实施方案中，本文所述的一种或多种外源性抗原性多肽能够诱导免疫应答，抑制感染性疾病(例如，减少或缓解感染性疾病的病因或症状，或者改善与感染性疾病相关的参数的值)。在一些实施方案中，本文所述的一种或多种外源性抗原性多肽能够诱导免疫应答以抑制自身免疫疾病(例如，减少或缓解自身免疫疾病的病因或症状，或者改善与自身免疫疾病相关的参数的值)。
在本公开中，一种或多种外源性抗原性多肽可以基于受试者的具体需要来选择，并且可以与预选的野生型或可负载外源性抗原呈递多肽结合，因此允许用特定外源性抗原性多肽对受试者进行可定制的治疗。在一些实施方案中，多种不同的(例如，两种、三种、四种、五种或更多种)外源性抗原性多肽可以基于受试者的具体需要来选择，并且可以与相同的工程化红系细胞或去核细胞上或者工程化红系细胞或去核细胞的群体内的不同细胞上的野生型或可负载外源性抗原呈递多肽结合，因此允许用多种特定外源性抗原性多肽对受试者进行可定制的治疗。
外源性抗原性多肽可包括能够诱导免疫应答的任何抗原多肽。在一些实施方案中，外源性抗原性多肽包含或由选自表7的抗原多肽、或其片段或变体、或针对它们的抗体分子组成。表7还提供了HLA I类多肽等位基因的非限制性实例，其可引入本文所述的野生型或可负载外源性抗原结合多肽中，以结合至指定的抗原多肽。
表7外源性抗原性多肽
Figure BDA0003302151970000691
Figure BDA0003302151970000701
在其他实施方案中，外源性抗原性多肽包含或由选自表8的抗原多肽、或其片段或变体、或针对它们的抗体分子组成。表8提供了HLA多肽等位基因的非限制性实例，其可引入本文所述的野生型或可负载外源性抗原呈递多肽中，以结合至指定的抗原多肽。
Figure BDA0003302151970000711
Figure BDA0003302151970000721
Figure BDA0003302151970000731
Figure BDA0003302151970000741
Figure BDA0003302151970000751
Figure BDA0003302151970000761
Figure BDA0003302151970000771
Figure BDA0003302151970000781
Figure BDA0003302151970000791
Figure BDA0003302151970000801
Figure BDA0003302151970000811
Figure BDA0003302151970000821
Figure BDA0003302151970000831
Figure BDA0003302151970000841
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Figure BDA0003302151970000881
Figure BDA0003302151970000891
Figure BDA0003302151970000901
Figure BDA0003302151970000911
Figure BDA0003302151970000921
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Figure BDA0003302151970000941
Figure BDA0003302151970000951
Figure BDA0003302151970000961
Figure BDA0003302151970000971
Figure BDA0003302151970000981
Figure BDA0003302151970000991
Figure BDA0003302151970001001
在一些实施方案中，外源性抗原性多肽包含表16和17所提供的新抗原多肽、或其片段或变体、或针对它们的抗体分子或由表16和17所提供的新抗原多肽、或其片段或变体、或针对它们的抗体分子组成。表17提供了HLA多肽等位基因的非限制性实例，所述HLA多肽等位基因可引入本文所述的野生型或可负载外源性抗原呈递多肽中，以结合至指定的新抗原多肽。
在其他实施方案中，外源性抗原性多肽是衍生自本文所公开的任一种抗原的外源性抗原性多肽。例如，在一些实施方案中，外源性抗原性多肽是来自抗原的外源性抗原性多肽，该抗原选自表7-8和16-26以及表B所公开的抗原。在一些实施方案中，外源性抗原性多肽是来自抗原的抗原多肽，该抗原选自表16所公开的抗原。在一些实施方案中，外源性抗原性多肽是来自抗原的抗原多肽，该抗原选自表17所公开的抗原。在一些实施方案中，外源性抗原性多肽是来自抗原的抗原多肽，该抗原选自表18所公开的抗原。在一些实施方案中，外源性抗原性多肽是来自抗原的抗原多肽，该抗原选自表19所公开的抗原。在一些实施方案中，外源性抗原性多肽是来自抗原的抗原多肽，该抗原选自表20所公开的抗原。在一些实施方案中，外源性抗原性多肽是来自抗原的抗原多肽，该抗原选自表21所公开的抗原。在一些实施方案中，外源性抗原性多肽是来自抗原的抗原多肽，该抗原选自表22所公开的抗原。在一些实施方案中，外源性抗原性多肽是来自抗原的抗原多肽，该抗原选自表23所公开的抗原。在一些实施方案中，外源性抗原性多肽是来自抗原的抗原多肽，该抗原选自表24所公开的抗原。在一些实施方案中，外源性抗原性多肽是来自抗原的抗原多肽，该抗原选自表25所公开的抗原。在一些实施方案中，外源性抗原性多肽是来自抗原的抗原多肽，该抗原选自表26所公开的抗原。在一些实施方案中，外源性抗原性多肽是来自抗原的抗原多肽，该抗原选自表B所公开的抗原。
在一些实施方案中，本公开的工程化红系细胞或去核细胞包含一种或多种外源性抗原性多肽，其中一种或多种外源性抗原性多肽是HPV抗原。在一些实施方案中，本公开的工程化红系细胞或去核细胞包含一种或多种外源性抗原性多肽，其中一种或多种外源性抗原性多肽是HPV-E7抗原。在一些实施方案中，本公开的工程化红系细胞或去核细胞包含一种或多种外源性抗原性多肽，其中一种或多种外源性抗原性多肽是HPV-E6抗原。在一些实施方案中，本公开的工程化红系细胞或去核细胞包含两种或更多种外源性抗原性多肽，其中两种或更多种外源性抗原性多肽包括HPV-E6抗原和HPV-E7抗原。
在某些实施方案中，外源性抗原性多肽在野生型或可负载外源性抗原呈递多肽上呈递，例如，外源性抗原性多肽与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽结合。
在一些实施方案中，外源性抗原性多肽为8个氨基酸长度至24个氨基酸长度，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、或24个氨基酸长度。在另一个实施方案中，将可剪切位点引入外源性抗原性多肽中。
在一些实施方案中，外源性抗原性多肽与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽共价附接。在一些实施方案中，外源性抗原性多肽与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽非共价附接。共价附接的进一步细节描述于以下方法中。
在一些实施方案中，本文所提供的工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)包含两种类型的外源性多肽：至少一种(一种、两种、三种、或更多种)野生型或可负载外源性抗原呈递多肽，以及至少一种(一种、两种、三种、或更多种)外源性抗原性多肽(例如第一和/或第二外源性抗原性多肽)。在一些实施方案中，外源性抗原性多肽的一部分能够结合至野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的抗原结合槽。在一些实施方案中，至少一种外源性抗原性多肽包含跨膜结构域如I型膜蛋白跨膜结构域(例如，GPA跨膜结构域)、或II型膜蛋白跨膜结构域(例如，小整合膜蛋白1(SMIM1)跨膜结构域)作为N末端或C末端融合物，例如，使得能够结合至本文所述的野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的抗原多肽的部分存在于工程化红系细胞或去核细胞的表面的外侧。在一些实施方案中，外源性抗原性多肽包含跨膜结构域、接头，以及能够结合至野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的抗原结合槽的氨基酸序列(例如，抗原)。在一些实施方案中，接头是GlySer接头。在一些实施方案中，接头为约30至约100个氨基酸残基长度。在其他实施方案中，接头为约40个氨基酸残基长度至70个氨基酸长度。在一些实施方案中，接头是可剪切接头(例如，包含本文所述的酶切割位点)。在一些实施方案中，外源性抗原性多肽可以与如本文所述的外源性抗原呈递多肽共价附接。
在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽对外源性抗原性多肽具有比对外源性可置换多肽更高的亲和力。在一些实施方案中，外源性抗原性多肽以约1皮摩尔至约100纳摩尔、约5皮摩尔至约100纳摩尔、约10皮摩尔至约100纳摩尔、约20皮摩尔至约100纳摩尔、约30皮摩尔至约100纳摩尔、约50皮摩尔至约100纳摩尔、约100皮摩尔至约100纳摩尔、约200皮摩尔至约100纳摩尔、约300皮摩尔至约100纳摩尔、约400皮摩尔至约100纳摩尔、约500皮摩尔至约100纳摩尔、约600皮摩尔至约100纳摩尔、约700皮摩尔至约100纳摩尔、约800皮摩尔至约100纳摩尔、约900皮摩尔至约100纳摩尔、约1纳摩尔至约100纳摩尔、约2纳摩尔至约100纳摩尔、约5纳摩尔至约100纳摩尔、约10纳摩尔至约100纳摩尔、约20纳摩尔至约100纳摩尔、约30纳摩尔至约100纳摩尔、约40纳摩尔至约100纳摩尔、约50纳摩尔至约100纳摩尔、约60纳摩尔至约100纳摩尔、约70纳摩尔至约100纳摩尔、约80纳摩尔至约100纳摩尔、或约90纳摩尔至约100纳摩尔的KD与可负载外源性抗原呈递多肽结合。
本文描述了检测特异性结合至特定HLA多肽的肽的方法以及确定肽对HLA多肽的亲和力的方法。
从可负载外源性抗原呈递多肽置换可置换多肽的方法
在一些实施方案中，本公开提供了包含可负载外源性抗原呈递多肽的工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)，该可负载外源性抗原呈递多肽包含可置换外源性多肽。在一些实施方案中，可置换外源性多肽从野生型或可负载外源性抗原呈递多肽上(例如，从外源性抗原呈递多肽中存在的HLAI类或II类多肽的抗原结合槽上)置换，并且所选定的外源性抗原性多肽可以与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽结合。
在一些实施方案中，可置换外源性多肽从野生型或可负载外源性抗原呈递多肽置换以及外源性抗原性多肽与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽特异性地结合包括使工程化红系细胞或去核细胞在体外与外源性抗原性多肽接触，其中野生型或可负载外源性抗原呈递多肽对外源性抗原性多肽具有比对外源性可置换多肽更高的亲和力。在一些实施方案中，外源性可置换多肽以约1nM至约100μM的KD与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽结合。在一些实施方案中，外源性抗原性多肽以约1皮摩尔至约100纳摩尔的KD与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽结合。
以上描述了多种可置换外源性多肽。在一些实施方案中，可置换外源性多肽包含表6所提供的氨基酸序列。在一些实施方案中，可置换外源性多肽包含氨基酸序列ILKEPVHGV(SEQ ID NO:138)或由氨基酸序列ILKEPVHGV(SEQ ID NO:138)组成。在一些实施方案中，可置换外源性多肽为IAKEPVHGV(SEQ ID NO:139)。在一些实施方案中，可置换外源性多肽包含氨基酸序列ILKEPVHGA(SEQ ID NO:140)或由氨基酸序列ILKEPVHGA(SEQ IDNO:140)组成。在一些实施方案中，可置换外源性多肽包含氨基酸序列IAKEPVHGA(SEQ IDNO:141)或由氨基酸序列IAKEPVHGA(SEQ ID NO:141)组成。在一些实施方案中，可置换外源性多肽包含氨基酸序列GLKEPQIQV(SEQ ID NO:142)或由氨基酸序列GLKEPQIQV(SEQ IDNO:142)组成。在一些实施方案中，可置换外源性多肽包含氨基酸序列NLVPMVATA(SEQ IDNO:143)或由氨基酸序列NLVPMVATA(SEQ ID NO:143)组成。在一些实施方案中，可置换外源性多肽包含氨基酸序列IRAAPPPLA(SEQ ID NO:144)或由氨基酸序列IRAAPPPLA(SEQ IDNO:144)组成。
在一些实施方案中，使本文所述的野生型或可负载外源性抗原呈递多肽、或包含其的工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰的去核细胞)与二肽接触，以加速预结合的外源性可置换多肽的解离(参见例如Saini等人(2015)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 112:202-7，其全文以引用方式并入本文)。在一些实施方案中，使本文所述的野生型或可负载外源性抗原呈递多肽或包含其的工程化红系细胞或去核细胞与二肽和外源性抗原性多肽同时接触。在一些实施方案中，工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)以任何顺序依次与二肽和外源性抗原性多肽接触。在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽包含衍生自HLAI类等位基因的氨基酸序列，并且二肽选自甘氨酰-亮氨酸(GL)、甘氨酰-甲硫氨酸(GM)、GG、甘氨酰-丙氨酸(GA)、甘氨酰-缬氨酸(GV)、甘氨酰-苯丙氨酸(GF)、亮氨酰-甘氨酸(LG)、甘氨酰-环己基丙氨酸(G-Cha)、甘氨酰-高亮氨酸(GHLe)、乙酰化亮氨酸和甘氨酰-精氨酸(GR)、或它们的组合。在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽包含衍生自选自HLA-A:02:01、HLA-A1:01、HLA-A3:01、HLA-A24:02、HLA-A26:01、HLA-B7:02、HLA-B08:01、HLA-B27:05、HLA-B39:01、HLA-B40:01、HLA-B58:01、HLA-B15:01和HLA-E01:01的等位基因的氨基酸序列，并且二肽选自甘氨酰-亮氨酸(GL)、甘氨酰-甲硫氨酸(GM)、GG、甘氨酰-丙氨酸(GA)、甘氨酰-缬氨酸(GV)、甘氨酰-苯丙氨酸(GF)、亮氨酰-甘氨酸(LG)、甘氨酰-环己基丙氨酸(G-Cha)、甘氨酰-高亮氨酸(GHLe)、乙酰化亮氨酸和甘氨酰-精氨酸(GR)、或它们的组合。在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽包含HLA-B:27:05，并且二肽为GR或G-Cha。
用于确定二肽是否特异性结合特定配体(例如，外源性抗原呈递多肽)的多种测定在本领域中是已知的。例如，在一些实施方案中，可以使用荧光各向异性测定来观察结合动力学并且确定多肽复合物中的肽缔合和解离率(参见例如Saini等人(2015))。可通过TDTF实验来测量HLA I类多肽复合物的热稳定性，如Saini等人(2013)Mol.Immunol54(3-4):386-96中所述，其全文以引用方式并入本文。此外，可通过流式细胞术来测定细胞表面肽交换(参见例如Saini等人(2015))。
在一些实施方案中，可置换外源性多肽从可负载外源性抗原呈递多肽置换包括酶促切割设置在外源性可置换多肽序列与可置换外源性多肽序列之间的接头。接头的切割有利于外源性可置换多肽从可负载外源性抗原呈递多肽中释放和移除。因此，在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽和外源性可置换多肽经由接头连接，并且接头包含酶切割位点。合适的酶切割位点包括但不限于人鼻病毒(HRV)3C蛋白酶切割位点和烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶切割位点。在一些实施方案中，可以使可负载外源性抗原呈递多肽或包含其的细胞与对酶切割位点特异的酶接触。在一些实施方案中，酶切割位点包含氨基酸序列LEVLFQGP(SEQ ID NO:1)。在一些实施方案中，酶切割位点包含氨基酸序列ENLYFQG(SEQ IDNO:2)。
在一些实施方案中，接头的酶促切割暴露出可用于使期望的外源性抗原性多肽与接头缀合的基序，从而有利于外源性抗原性多肽负载(例如，特异性结合)到可负载外源性抗原呈递多肽上。可将由催化多肽缀合的酶识别的任何基序引入接头和/或期望的外源性抗原性多肽中，只要它们相容以利于缀合反应即可。例如，可以使用由酶识别的基序，如分选酶(例如，GGG、GG、G以及LPTXG(SEQ ID NO:3)、IPKTG(SEQ ID NO:881)、MPXTG(SEQ IDNO:882)、LAETG(SEQ ID NO:883)、LPXAG(SEQ ID NO:884)、LPESG(SEQ ID NO:885)、LPELG(SEQ ID NO:886)、LPEVG(SEQ ID NO:887)中的任一者)(参见例如Antos等人(2016)Curr.Opin.Struct.Biol.38:111-8)、蝶豆粘酶(butelase)1(例如，C末端NHV以及N末端X1X2氨基酸序列中的任一者，其中X1为任何氨基酸且X2为I、L、V、或C(参见例如Nguyen等人2016Nat Protocols 11:1977-88))，或SpyCatcher(AHIVMVDAYKPTK(SEQ ID NO:4)或ATHIKFSKRD(SEQ ID NO:5))。
在一些实施方案中，本领域已知的任何分选酶可用于使外源性抗原性多肽与本文所述的抗原呈递多肽缀合。基于序列比对和遗传进化分析，分选酶分为4类，命名为A、B、C和D(参见例如Dramsi等人(2005)Res.Microbiol.156(3):289-97)。术语“分选酶A”在本文中用于指A类分选酶，通常在任何特定的细菌物种中命名为SrtA，例如来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或酿脓链球菌(S pyogenes)的SrtA。同样，“分选酶B”在本文中用于指B类分选酶，通常在任何特定的细菌物种中命名为SrtB，例如来自金黄色葡萄球菌(S.aureus)的SrtB。本公开涵盖了涉及本领域已知的任何分选酶类别的实施方案(例如，来自任何细菌物种或菌株的分选酶A，来自任何细菌物种或菌株的分选酶B，来自任何细菌物种或菌株的C类分选酶，以及来自任何细菌物种或菌株的D类分选酶)。在一些实施方案中，使用利用具有N末端甘氨酸(例如1-5个N末端甘氨酸)的亲核受体序列的分选酶，如来自金黄色葡萄球菌的SrtA。在一些实施方案中，预期使用两种或更多种分选酶。在一些实施方案中，分选酶可以利用不同的分选酶识别序列和/或不同的亲核受体序列。例如，来自酿脓链球菌的SrtA可以利用具有一个或多个N末端丙氨酸(例如1-5个N末端丙氨酸)的亲核受体序列，并且/或者可以利用包含LPXTA(SEQ ID NO:37)的分选酶识别基序。
示例性野生型金黄色葡萄球菌SrtA序列(基因ID:1125243，NCBI RefSeq登录号NP_375640.1)如下示于SEQ ID NO:888MKKWTNRLMTIAGVVLILVAAYLFAKPHIDNYLHDKDKDEKIEQYDKNVKEQASKDNKQQAKPQIPKDKSKVAGYIEIPDADIKEPVYPGPATPEQLNRGVSFAEENESLDDQNISIAGHTFIDRPNYQFTNLKAAKKGSMVYFKVGNETRKYKMTSIRDVKPTDVEVLDEQKGKDKQLTLITCDDYNEKTGVWEKRKIFVATEVK。
本领域的普通技术人员将理解，不同亚种、菌株和分离物可以在不显著影响活性的位置的序列上有所不同。例如，另一种示例性野生型金黄色葡萄球菌SrtA序列(基因ID:3238307，NCBI RefSeq登录号YP_187332.1；GenBank登录号AAD48437)具有位置57处的K残基以及位置167处的G残基，如下示于SEQ ID NO:889
MKKWTNRLMTIAGVVLILVAAYLFAKPHIDNYLHDKDKDEKIEQYDKNVKEQASKDKKQQAKPQIPKDKSKVAGYIEIPDADIKEPVYPGPATPEQLNRGVSFAEENESLDDQNISIAGHTFIDRPNYQFTNLKAAKKGSMVYFKVGNETRKYKMTSIRDVKPTDVGVLDEQKGKDKQLTLITCDDYNEKTGVWEKRKIFVATEVK。
在一些实施方案中，钙非依赖性分选酶A变体可以如本文所述使用，并且相对于野生型分选酶A而言包含至少三个氨基酸取代，其中氨基酸取代包括：a)位置105处的K残基；b)位置108处的Q或A残基；以及c)选自以下的至少一个氨基酸取代：i)位置94处的R残基；ii)位置94处的S残基；iii)位置160处的N残基；iv)位置165处的A残基；v)位置190处的E残基；以及vi)位置196处的T残基。在一些实施方案中，钙非依赖性分选酶A变体相对于野生型分选酶A而言包含以下氨基酸取代：a)位置105处的K残基；b)位置108处的Q或A残基；c)位置94处的S残基或位置94处的R残基；d)位置160处的N残基；e)位置165处的A残基，以及位置196处的T残基。在一些实施方案中，钙非依赖性分选酶A变体相对于野生型分选酶A而言包含以下氨基酸取代：a)位置105处的K残基；b)位置108处的Q或A残基；c)位置94处的R或S残基；d)位置160处的N残基；e)位置165处的A残基；f)位置190处的E残基；以及g)位置196处的T残基。在一些实施方案中，分选酶包含以下序列，其中相对于全长金黄色葡萄球菌SrtA序列而言在位置94、105、108、160、165、190和196处的氨基酸以粗体显示：(SEQ ID NO:890)
Figure BDA0003302151970001071
在一些实施方案中，可以使用与天然存在的分选酶相比具有改变的底物选择性的转酰胺酶。例如，已经鉴定了在分选酶识别基序的位置1处(代替L)的接受芳族氨基酸(例如，苯丙氨酸)以及具有小侧链的氨基酸如Ala、Asp、Ser、Pro和Gly的金黄色葡萄球菌分选酶A的变体(Piotukh等人(2011)J.Am.Chem.Soc.133(44):17536-9，其全部内容以引用方式并入本文)。在一些实施方案中，此类分选酶用于本发明的组合物或方法中。关于分选酶识别基序具有改变的底物选择性的分选酶可以通过在分选酶中，例如在参与分选酶识别基序的识别和/或结合的蛋白质的区域，例如推定底物识别环(例如，SrtA(Va1161-Asp176)中的连接链P6和P7的环(β6/β7环))中工程化一个或多个突变而生成。在一些实施方案中，可以进行噬菌体展示、酵母展示、或底物识别环中随机化的突变体分选酶文库的其他筛选，并且可以鉴定具有改变的底物特异性的变体。
在一些实施方案中，分选酶是分选酶B(SrtB)，例如金黄色葡萄球菌、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、或单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)的分选酶B。由B类分选酶(SrtB)识别的基序通常属于共有序列NPXTX，例如NP[Q/K]-[T/sHN/G/s]，如NPQTN(SEQ ID NO:891)或NPKTG(SEQ ID NO:892)，并且可适于如本文所述使用。例如，金黄色葡萄球菌或炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)的分选酶B切割相应细菌中IsdC的NPQTN(SEQID NO:891)或NPKTG基序(SEQ ID NO:892)(参见例如Marraffini和Schneewind(2007)J.Bact.189(17):6425-36)。在B类分选酶的推定底物中发现的其他识别基序是NSKTA(SEQID NO:893)、NPQTG(SEQ ID NO:894)、NAKTN(SEQ ID NO:895)和NPQSS(SEQ ID NO:896)。例如，来自单核细胞增多性李斯特菌(L.monocytogenes)的SrtB识别在位置2处缺乏P和/或在位置3处缺乏Q或K的特定基序，如NAKTN(SEQ ID NO:895)和NPQSS(SEQ ID NO:896)。
在一些实施方案中，分选酶是C类分选酶。C类分选酶可利用LPXTG(SEQ ID NO:36)作为识别基序。
在一些实施方案中，分选酶是D类分选酶。预测该类分选酶识别具有共有序列NA-[E/A/S/H]-TG(SEQ ID NO:897)的基序。D类分选酶存在于例如链霉菌属(Streptomycesspp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium spp.)、惠普尔养障体(Tropheryma whipplei)、褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)和长双歧杆菌(Bifidobacterium longhum)。LPXTA(SEQID NO:37)或LAXTG(SEQ ID NO:898)可充当D类分选酶的识别序列。
可由分选酶识别的基序是本领域公知的，并且可以利用任何此类已知基序。可由分选酶，特别是分选酶A识别的一种示例性基序是LPXTG(SEQ ID NO:36)，其中X可为任何氨基酸残基(天然存在或非天然存在的)，例如在活生物体中存在的蛋白质中最常见的20种标准氨基酸中的任一种。在一些实施方案中，识别基序为LPXTG(SEQ ID NO:36)或LPXT，其中X为D、E、A、N、Q、K、或R。在一些实施方案中，在可由分选酶A识别的LPXTG(SEQ ID NO:36)或LPXT基序中，X选自K、E、N、Q、A。在一些实施方案中，在可由C类分选酶识别的LPXTG(SEQ IDNO:36)或LPXT基序中，X选自K、S、E、L、A、N。示例性分选酶识别基序包括但不限于LPKTG(SEQID NO:899)、LPITG(SEQ ID NO:900)、LPDTA(SEQ ID NO:901)、SPKTG(SEQ ID NO:902)、LAETG(SEQ ID NO:883)、LAATG(SEQ ID NO:903)、LAHTG(SEQ ID NO:904)、LASTG(SEQ IDNO:905)、LPLTG(SEQ ID NO:906)、LSRTG(SEQ ID NO:907)、LPETG(SEQ ID NO:908)、VPDTG(SEQ ID NO:909)、IPQTG(SEQ ID NO:910)、YPRRG(SEQ ID NO:911)、LPMTG(SEQ ID NO:912)、LAFTG(SEQ ID NO:913)、LPQTS(SEQ ID NO:914)、LPXT、LAXT、LPXA、LGXT、IPXT、NPXT、NPQS(SEQ ID NO:915)、LPST(SEQ ID NO:916)、NSKT(SEQ ID NO:917)、NPQT(SEQ ID NO:918)、NAKT(SEQ ID NO:919)、LPIT(SEQ ID NO:920)、LAET(SEQ ID NO:921)、LPXTX、LPKTG(SEQ ID NO:899)、LPATG(SEQ ID NO:923)、LPNTG(SEQ ID NO:924)或LPETG(SEQ ID NO:908)；其中每次出现的X独立地表示任何氨基酸残基。在一些实施方案中，基序在位置4处包含“A”而非“T”，例如LPXAG(SEQ ID NO:884)，例如LPNAG(SEQ ID NO:925)，其中每次出现的X独立地表示任何氨基酸残基。在一些实施方案中，基序在位置5处包含“A”而非“G”，例如LPXTA(SEQ ID NO:37)，例如LPNTA(SEQ ID NO:926)，其中每次出现的X独立地表示任何氨基酸残基。在一些实施方案中，基序在位置2处包含“G”而非“P”，例如LGXTG(SEQ ID NO:927)，例如LGATG(SEQ ID NO:928)，其中每次出现的X独立地表示任何氨基酸残基。在一些实施方案中，基序在位置1处包含“I”而非“L”，例如IPXTG(SEQ ID NO:929)，例如IPNTG(SEQID NO:930)或IPETG(SEQ ID NO:931)，其中每次出现的X独立地表示任何氨基酸残基。基序可以紧邻酶切割位点存在，或者在使得它们被缀合酶识别的氨基酸范围内存在。
在一些实施方案中，酶切割位点在距接头中的GGG基序的10个氨基酸或更少之内，并且位于GGG基序与外源性可置换多肽之间。在一些实施方案中，GGG基序为酶切割位点的C末端。
在一些实施方案中，酶切割位点在距LPTXG基序(SEQ ID NO:3)的10个氨基酸或更少之内，并且位于LPTXG基序(SEQ ID NO:3)与外源性可置换多肽之间。在一些实施方案中，LPTXG基序(SEQ ID NO:3)为酶切割位点的C末端。
在一些实施方案中，酶切割位点在距NHV基序的10个氨基酸或更少之内，并且位于NHV基序与外源性可置换多肽之间。在一些实施方案中，NHV基序为酶切割位点的C末端。在一些实施方案中，酶切割位点靠近SpyTag序列(AHIVMVDAYKPTK(SEQ ID NO:4))，并且位于SpyTag序列与外源性可置换多肽之间。在一些实施方案中，SpyTag序列为酶切割位点的C末端。在一些实施方案中，酶切割位点在距氨基酸序列AHIVMVDAYKPTK(SEQ ID NO:4)的10个氨基酸或更少之内。
在一些实施方案中，酶切割位点靠近KTag序列(ATHIKFSKRD(SEQ ID NO:5))，并且位于KTag序列与外源性可置换多肽之间。在一些实施方案中，KTag序列为酶切割位点的C末端。在一些实施方案中，酶切割位点在距氨基酸序列ATHIKFSKRD(SEQ ID NO:5)的10个氨基酸或更少之内。
使外源性抗原性多肽与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽缀合的方法
在一些实施方案中，本公开提供了工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)，其在细胞表面上包含野生型或可负载外源性抗原呈递多肽，其中可负载外源性抗原呈递多肽包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代使细胞表面上的可负载外源性抗原呈递多肽稳定化。在一些实施方案中，在不存在与外源性抗原呈递多肽结合的多肽的情况下，可负载外源性抗原呈递多肽在细胞表面上是稳定化的。在一些实施方案中，外源性抗原性多肽与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽结合。在其他实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽包含可置换外源性多肽，该可置换外源性多肽从可负载外源性抗原呈递多肽上置换，并且所选定的外源性抗原性多肽与可负载外源性抗原呈递多肽结合。
在一些实施方案中，特异性结合外源性抗原性多肽与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包括使外源性抗原性多肽与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽缀合。例如，在一些实施方案中，可使用点击化学使外源性抗原性多肽与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽缀合，如本文所详述。
在一些实施方案中，偶联试剂可用于偶联外源性抗原性多肽与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽。用于功能化红系细胞的点击化学和其他缀合方法描述于国际专利公开No.WO 2018/151829中，其全部内容以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，本文所述的工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)包含每细胞多达、至少、大于、或约5,000、10,000、50,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000单位偶联试剂。在一些实施方案中，工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)通过如下方法制备，该方法包括：a)使第一偶联试剂与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽偶联,从而制备药物制剂、产品、或中间体。在一个实施方案中，该方法还包括：b)例如，在适于第一偶联试剂与第二偶联试剂反应的条件下，使野生型或可负载外源性抗原呈递多肽与偶联至第二偶联试剂的外源性抗原性多肽接触。在一些实施方案中，两种或更多种外源性抗原性多肽与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽偶联(例如，使用点击化学)。
在一些实施方案中，偶联试剂包括叠氮化物偶联试剂。在一些实施方案中，叠氮化物偶联试剂包含叠氮基烷基部分、叠氮基芳基部分、或叠氮基杂芳基部分。示例性叠氮化物偶联试剂包括3-叠氮基丙酸磺基-NHS酯、叠氮基乙酸NHS酯,叠氮基-PEG-NHS酯、叠氮基丙胺、叠氮基-PEG-胺、叠氮基-PEG-马来酰亚胺、双-砜-PEG-叠氮化物、或它们的衍生物。偶联试剂还可包含烯烃部分，例如反环烯烃部分、氧杂降冰片二烯部分、或四嗪部分。额外的偶联试剂可见于Click Chemistry Tools(可获得于万维网，clickchemistrytools.com)或Lahann,J.(编辑)(2009)Click Chemistry for Biotechnology and Materials Science，其各自全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，外源性抗原性多肽经由共价附接与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽连接，以生成工程化红系细胞或去核细胞，包括呈递一种或多种外源性抗原性多肽(例如，第一外源性抗原性多肽、或第一抗原多肽和第二外源性抗原性多肽)的工程化红系细胞或去核细胞。例如，可使用含有亲电子基团的偶联化合物使外源性抗原性多肽衍生化并与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽结合，该亲电子基团将与工程化红系细胞或去核细胞上的亲核体(例如，细胞上的野生型或可负载外源性抗原呈递多肽上存在的亲核体)反应，以形成相互结合的关系。这些亲电子基团的代表是αβ不饱和羰基、烷基卤化物和硫醇试剂，如取代的马来酰亚胺。此外，偶联化合物可以经由多肽中的一个或多个官能团如氨基、羧基和酪氨酸基团与抗原多肽偶联。为此，偶联化合物应当含有游离羧基、游离氨基、芳族氨基，以及能够与酶官能团反应的其他基团。还可制备高电荷抗原多肽以通过静电结合固定在例如外源性野生型或可负载抗原呈递多肽上，从而生成经修饰去核细胞。这些衍生物的实例将包括聚赖氨酰和聚谷氨酰酶。
衍生物中包含的反应性基团的选择取决于用于使亲电子体与外源性野生型或可负载抗原呈递多肽上的亲核基团偶联以进行固定化的反应条件。控制因素是在使通过连接固定的外源性抗原性多肽与外源性野生型或可负载抗原呈递多肽偶联之前，不希望偶联试剂失活。此类偶联固定反应可以以多种方式进行。通常，偶联试剂可用于在外源性抗原性多肽与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽之间形成桥。在这种情况下，偶联试剂应当具有能与外源性抗原性多肽反应的官能团，如羧基。制备用于缀合的外源性抗原性多肽的一种方式包括利用偶联试剂中的羧基形成混合酸酐，该混合酸酐与外源性抗原性多肽反应，其中使用能够形成混合酸酐的活化剂。代表性的此类活化剂是氯甲酸异丁酯或其他氯甲酸酯，其与偶联试剂如5,5'-(二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、对氯汞苯甲酸酯(CMB)、或间马来酰亚胺基苯甲酸(MBA)给出混合酸酐。偶联试剂的混合酸酐与外源性抗原性多肽反应产生反应性衍生物，该反应性衍生物继而可与工程化红系细胞或去核细胞上(例如，细胞表面上存在的外源性野生型或可负载抗原呈递多肽上)的亲核基团反应，以固定化外源性抗原性多肽。
抗原多肽上的官能团如羧基可以用碳二亚胺等活化剂活化。随后，桥联试剂上的官能团(如氨基)将与外源性抗原性多肽上的活化基团反应以形成反应性衍生物。此外，偶联试剂应当具有第二反应性基团，该第二反应性基团将与野生型或可负载抗原呈递多肽上的适当亲核基团反应以形成桥。典型的此类反应性基团是烷基化剂如碘乙酸、αβ不饱和羰基化合物如丙烯酸等、硫醇试剂如汞制剂、取代的马来酰亚胺等。
或者，外源性抗原性多肽上的官能团可活化成以便与例如野生型或可负载外源性抗原呈递多肽上的亲核体直接反应，以避免对桥形成化合物的需求。为此，使用活化剂如伍德沃德氏试剂K或类似试剂，其导致外源性抗原性多肽中的羧基形成烯醇酯，如区别于混合酸酐。外源性抗原性多肽的烯醇酯衍生物随后与例如野生型或可负载外源性抗原呈递多肽上的亲核基团反应，以实现外源性抗原性多肽的固定化，从而将外源性抗原性多肽缀合到野生型或可负载抗原呈递多肽上。
在一些实施方案中，外源性抗原性多肽可以如上所述衍生化或活化，以产生携带一个或多个反应性官能团的外源性抗原性多肽，所述反应性官能团可以与位于工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)的野生型或可负载外源性抗原呈递多肽上的一个或多个氨基酸残基反应。
在一些实施方案中，外源性抗原性多肽包含一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个等)硫醇反应性基团，所述硫醇反应性基团可以与位于工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)的野生型或可负载外源性抗原呈递多肽上的一个或多个半胱氨酸硫醇基团反应。
如本文所用，硫醇反应性官能团是可易于与硫醇基团(例如，半胱氨酸残基的硫醇基团)反应形成共价键的官能团。可使用任何合适的硫醇反应性官能团。
在一些实施方案中，硫醇反应性基团包括但不限于(i)2-氰基苯并噻唑(CBT)(参见Ren等人(2009)Agnew.Chem.Int.Ed.48:9658-62；Chen等人(2018)Chemistry Open 7:256-61；Zhang和Liang(2018)Sci.China Chem.61:1-11)；(ii)马来酰亚胺或马来酰亚胺衍生物(Ravasco等人(2019)Chem.Eur.J.25:43-59)(例如，N-芳基马来酰亚胺、β氨基马来酰亚胺、含缩醛的马来酰亚胺、环外马来酰亚胺、二烷基马来酰亚胺、卤代马来酰亚胺(例如，溴马来酰亚胺、二溴马来酰亚胺、二碘马来酰亚胺(Behrens等人(2015)Mol.Pharm.12(11):3986-98))或芳基二硫代马来酰亚胺(例如，二硫代苯基马来酰亚胺(Nunes等人(2015)Chem.Commun.(Camb).51(53):10624-7)))；(iii)芳基丙腈(例如，3-芳基丙炔腈(Koniev等人(2014)Bioconjug.Chem.25(2):202-6)或3,3’-亚芳基-二丙炔腈(Koniev等人(2018)Medchemcomm.9(5):827-30)；(iv)砜(例如，苯基噁二唑基砜(Patterson等人(2014)Bioconjugate Chem.25,1402-7)，苯并噻唑基砜(Toda等人(2013)AgnewChem.Int.Ed.Engl.52(48):12592-6)，或双砜(Badescu等人(2014)Bioconjug.Chem.25(6):1124-36)；(v)丙二烯酰胺(例如，苄基丙二烯酰胺、环己基丙二烯酰胺、萘基丙二烯酰胺、氨乙基丙二烯酰胺等(Abbas等人(2014)Angew Chem.Int.Ed.Engl.53(29):7491-4))；(vi)二溴哒嗪二酮(例如，4,5-二溴-1,2-二氢-哒嗪-3,6-二酮(Bahou等人(2018)Org.Biomol.Chem.16(8):1359-66))，(vii)二硫化物(例如，硝基吡啶基二硫化物(Sadowsky等人(2017)Bioconjug.Chem.28(8):2086-98))，以及(viii)卤代乙酰胺(例如，碘乙酰胺、溴乙酰胺或氯乙酰胺(Free等人(2006)Org.Biomol.Chem.4(9):1817-30))。
表A列出了具有硫醇反应性官能团的示例性外源性抗原性多肽以及所得的经修饰工程化红系细胞或去核细胞。P1表示外源性抗原性多肽；L不存在或者表示连接反应性官能团和肽的间隔物；P2表示位于工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)的表面上的野生型或可负载外源性抗原呈递多肽。Cys-SH表示野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的N或C末端半胱氨酸。
在一些实施方案中，位于工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)的表面上的野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的半胱氨酸是野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的N末端半胱氨酸，例如，其中野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含I型膜蛋白跨膜结构域(例如，GPA)。在一些实施方案中，N末端半胱氨酸位于接头中，例如临近例如β2M多肽的N末端设置的接头。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的半胱氨酸是野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的C末端半胱氨酸，例如，其中野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含II型膜蛋白跨膜结构域(例如，SMIM1)。在一些实施方案中，C末端半胱氨酸位于接头中，例如临近例如β2M多肽的C末端设置的接头。例如，接头可为表3中提供的接头中的任一种，其中N末端或C末端氨基酸残基由半胱氨酸替代。
在一些实施方案中，在野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含外源性可置换多肽的情况下，可以在连接HLA多肽与外源性可置换多肽的接头中设置酶切割位点，其中接头的酶促切割暴露出N末端或C末端半胱氨酸，所述半胱氨酸可用于使期望的外源性抗原性多肽与接头缀合，从而有利于外源性抗原性多肽负载(例如，特异性结合)到野生型或可负载外源性抗原呈递多肽上。
表A：
Figure BDA0003302151970001151
Figure BDA0003302151970001161
在一些实施方案中，具有一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个等)硫醇反应性基团的外源性抗原性多肽与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的N末端半胱氨酸和/或C末端半胱氨酸共价附接。在一些实施方案中，具有一个或多个氰基苯并噻唑基团的外源性抗原性多肽衍生物与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的N末端半胱氨酸共价附接。在一些实施方案中，具有一个或多个马来酰亚胺或马来酰亚胺衍生物基团的外源性抗原性多肽与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的N末端半胱氨酸和/或C末端半胱氨酸共价附接。在一些实施方案中，马来酰亚胺或马来酰亚胺衍生物是N-芳基马来酰亚胺。在一些实施方案中，马来酰亚胺或马来酰亚胺衍生物是β氨基马来酰亚胺。在一些实施方案中，马来酰亚胺或马来酰亚胺衍生物是含缩醛的马来酰亚胺。在一些实施方案中，马来酰亚胺或马来酰亚胺衍生物是环外马来酰亚胺。在一些实施方案中，马来酰亚胺或马来酰亚胺衍生物是二烷基马来酰亚胺。在一些实施方案中，马来酰亚胺或马来酰亚胺衍生物是卤化马来酰亚胺，例如溴马来酰亚胺、二溴马来酰亚胺、或二碘马来酰亚胺。在一些实施方案中，马来酰亚胺或马来酰亚胺衍生物是芳基二硫代马来酰亚胺，例如二硫代苯基马来酰亚胺。在一些实施方案中，具有一个或多个芳基丙腈基团的外源性抗原性多肽与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的N末端半胱氨酸和/或C末端半胱氨酸共价附接。在一些实施方案中，芳基丙腈是3-芳基丙炔腈。在一些实施方案中，芳基丙腈是3,3’-亚芳基-二丙炔腈。
在一些实施方案中，具有一个或多个砜基团的外源性抗原性多肽与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的N末端半胱氨酸和/或C末端半胱氨酸共价附接。在一些实施方案中，砜是苯基噁二唑基砜。在一些实施方案中，砜是苯并噻唑基砜。在一些实施方案中，砜是双砜。在一些实施方案中，具有一个或多个丙二烯酰胺基团的外源性抗原性多肽与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的N末端半胱氨酸和/或C末端半胱氨酸共价附接。在一些实施方案中，丙二烯酰胺是苄基丙二烯酰胺。在一些实施方案中，丙二烯酰胺是环己基丙二烯酰胺。在一些实施方案中，丙二烯酰胺是萘基丙二烯酰胺。在一些实施方案中，丙二烯酰胺是氨乙基丙二烯酰胺。在一些实施方案中，具有一个或多个二溴哒嗪二酮基团的外源性抗原性多肽与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的N末端半胱氨酸和/或C末端半胱氨酸共价附接。在一些实施方案中，二溴哒嗪二酮是4,5-二溴-1,2-二氢-哒嗪-3,6-二酮。在一些实施方案中，具有一个或多个二硫化物基团的外源性抗原性多肽与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的N末端半胱氨酸和/或C末端半胱氨酸共价附接。在一些实施方案中，二硫化物是硝基吡啶基二硫化物。在一些实施方案中，具有一个或多个卤代乙酰胺基团的外源性抗原性多肽与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的N末端半胱氨酸和/或C末端半胱氨酸共价附接。在一些实施方案中，卤代乙酰胺是碘乙酰胺。在一些实施方案中，卤代乙酰胺是溴乙酰胺。在一些实施方案中，卤代乙酰胺的氯乙酰胺。
在一些实施方案中，外源性抗原性多肽包含一个或多个(例如，两个、三个、四个等)二氮杂环丙烯(diazirine)基团(Yang等人(2015)Chem.Sci.6:1011-7；Yang等人(2016)Nat.Chem.Biol.12(2):70-2)，其可以与位于工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)的野生型或可负载外源性抗原呈递多肽中的一个或多个氨基酸残基反应。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸残基位于野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的抗原结合槽中。在一些实施方案中，携带一个或多个二氮杂环丙烯基团的经修饰外源性抗原性多肽与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽在UV辐射下反应，以使外源性抗原性多肽与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽共价附接。
在一些实施方案中，携带上述反应性官能团(例如，硫醇反应性基团或二氮杂环丙烯基团)的外源性抗原性多肽还包含介于多肽与反应性基团(例如，硫醇反应性基团或二氮杂环丙烯基团)之间的间隔物。可以使用共价附接外源性抗原性多肽和反应性官能团的任何合适的间隔物。示例性间隔物包括但不限于PEG间隔物、二胺(例如，乙二胺)、氨基酸和肽(例如，具有1至40个氨基酸残基的肽)。
在一些实施方案中，工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)呈递一种或多种外源性抗原性多肽，其中一种或多种外源性抗原性多肽与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽酶促缀合。
在具体的实施方案中，外源性抗原性多肽可以通过各种化学和酶方式与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽缀合，包括但不限于与例如双官能交联剂，如NHS酯-马来酰亚胺异双官能交联剂化学缀合以连接伯胺基团与还原的硫醇基团。
还可使用本文所述的分选酶(例如，分选酶A)将外源性抗原性多肽与本文所提供的工程化红系细胞或去核细胞上的野生型或可负载外源性抗原呈递多肽缀合。例如，第一外源性多肽(例如，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽或者一种或多种外源性抗原性多肽)包含或者工程化成包含受体序列(例如，LPXTG(SEQ ID NO:36)或LPXTA(SEQ ID NO:37))，并且第二外源性多肽(例如，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽或者一种或多种外源性抗原性多肽)包含或者工程化成包含N末端供体序列(例如，G、GG、GGG、A、AA和AAA)。
当与合适的分选酶(例如，金黄色葡萄球菌分选酶A或酿脓链球菌分选酶A)接触时发生转肽反应，使得野生型或可负载外源性抗原呈递多肽和一种或多种外源性抗原性多肽缀合(参见例如Swee等人(2013)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 110(4):1428-33，其以引用方式并入本文)。在一些实施方案中，外源性野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的N末端包含N末端供体序列G、GG、GGG、A、AA、或AAA。在一些实施方案中，经由分选酶介导的反应(例如，分选酶A介导的反应)，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的N末端供体序列(例如，GG、GGG)与含有受体序列LPXTG(SEQ ID NO:36)或LPXTA(SEQ ID NO:37)的外源性抗原性多肽缀合。可用于分选酶介导的缀合反应的额外受体序列和供体序列以及利用分拣标记的方法描述于Antos等人(2016)Curr Opin Struct Biol.38:111-8，其内容据此以引用方式并入本文。
使用蝶豆粘酶(butelase)1，例如蓝蝴蝶(Clitoria ternatea)蝶豆粘酶1(UniProtKB登录号A0A060D9Z7)，可使一种或多种外源性抗原性多肽与工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)上的野生型或可负载外源性抗原呈递多肽缀合，如例如Nguyen等人(2016)所述。例如，第一外源性多肽(例如，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽或者一种或多种外源性抗原性多肽)包含或者工程化成包含C末端蝶豆粘酶-1三肽识别序列Asx-His-Val(其中Asx为Asp或Asn)。第二外源性多肽(例如，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽或者一种或多种外源性抗原性多肽)工程化成包含N末端X1X2，其中X1为任何氨基酸并且X2为I、L、V、或C。当与蝶豆粘酶1接触时，两种外源性多肽(例如，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽和一种或多种外源性抗原性多肽)通过酶缀合(参见例如Nguyen等人(2016))。
或者，使用催化键形成多肽(例如，SpyTag/SpyCatcher系统)，外源性多肽可缀合到本文所述的工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)上，或者外源性多肽可彼此缀合。例如，本文所提供的工程化红系细胞或去核细胞可工程化成包含含有SpyTag或SpyCatcher多肽(例如，外源性多肽的胞外部分)的外源性多肽。或者，本文所述的外源性多肽(例如，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽或者一种或多种外源性抗原性多肽)可工程化成包含SpyTag或SpyCatcher多肽。例如，在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含N末端SpyCatcher多肽，并且外源性抗原性多肽包含SpyTag多肽。在SpyTag和SpyCatcher多肽接触时，可形成共价键(参见例如Zakeri等人(2012)Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.109:E690-7。
使用组合方法(例如，酶缀合与点击化学结合)，本文所提供的外源性多肽(例如，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽或者一种或多种外源性抗原性多肽)可缀合到本文所述的工程化红系细胞或去核细胞上，并且/或者外源性多肽(例如，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽或者一种或多种外源性抗原性多肽)可彼此缀合。例如，分选酶介导的缀合可用于将点击化学柄部(例如叠氮化物或炔)连接到细胞或外源性多肽上。随后，点击化学(例如，环加成反应)可用于使额外的外源性多肽缀合到细胞上，或者外源性多肽上(例如，外源性抗原性多肽到野生型或可负载外源性抗原呈递多肽上)；参见例如Neves等人(2013)Bioconjugate Chemistry 24(6):934-41。分选酶介导的蛋白质和细胞修饰描述于国际公开No.WO 2014/183066和WO 2014/183071中，这两者全文以引用方式并入本文。
也可以使用如本文对例如点击化学所述的一种或多种偶联试剂将外源性多肽(例如，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽)连接至细胞的表面，产生本文所述的工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)。在一些实施方案中，用于例如转谷氨酰胺酶介导的缀合和岩藻糖基化介导的缀合的偶联试剂可以用于使外源性抗原性多肽与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽偶联，其中此后可使用本文例如对点击化学所述的偶联试剂之一，将与外源性抗原性多肽结合的野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的复合物连接到细胞的表面。
在一些实施方案中，在先前与可负载外源性抗原呈递多肽结合的可置换外源性多肽从可负载外源性抗原呈递多肽置换(例如，使用本文所述的方法)之后，可以进行如本文所述的使外源性抗原性多肽与可负载外源性抗原呈递多肽缀合的方法。
在一些实施方案中，如本文所述的使外源性抗原性多肽与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽缀合的方法可以使用野生型或可负载外源性抗原呈递多肽进行，其中可置换外源性多肽先前未与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽结合。
虽然本文提供了用于使外源性抗原性多肽与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽缀合的一些示例性方法，但这些是示例性的，而并未意在限制本公开的范围。用于使外源性抗原性多肽与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽缀合的额外合适的方法将对于本领域的技术人员是显而易见的。
外源性共刺激多肽
在一些实施方案中，本文所提供的工程化红系细胞或去核细胞包含外源性共刺激多肽。在一些实施方案中，外源性共刺激多肽能够特异性结合至T细胞上的同源共刺激分子(例如，HLA分子、B和T淋巴细胞弱化子(CD272)和Toll配体受体)，从而提供介导T细胞应答的信号，包括但不限于增殖、活化、分化等。外源性共刺激多肽也可包括特异性结合T细胞上存在的共刺激分子的抗体。此类抗体优选地结合T细胞上的共刺激分子并且充当激动剂。
在一些实施方案中，期望的应答是例如受感染细胞的细胞死亡。在一些实施方案中，共刺激多肽触发多个T细胞活化途径以诱导免疫应答。在一些实施方案中，本文所述的工程化红系细胞或去核细胞尤其包含能够促进T细胞增殖的一种或多种外源性共刺激多肽。在一些实施方案中，一种或多种(例如，2种、3种、4种、或5种或更多种)共刺激多肽包括下表9的活化多肽，或其T细胞活化变体(例如，片段)。在一些实施方案中，一种或多种(例如，2种、3种、4种、或5种或更多种)共刺激多肽包括结合表9的靶受体的抗体分子(例如激动性抗体)或其T细胞活化变体(例如，片段)。在一些实施方案中，共刺激多肽包括不同的T细胞活化配体，例如表9的一种或多种活化多肽(以它们的任何组合)，以刺激T细胞。在一些实施方案中，在包含4-1BBL、OX40L和CD40L、或其片段或变体的细胞表面上，工程化红系细胞或去核细胞包含至少一种外源性共刺激多肽。在一些实施方案中，这些外源性共刺激多肽能够通过互补活化途径信号转导。外源性共刺激多肽可以衍生自内源性T细胞活化配体或者针对靶受体的抗体分子。
表9：共刺激多肽
活化多肽(配体) 靶受体
B7-H2(例如登录号NP_056074.1) ICOS，CD28(例如登录号NP_006130.1)
B7-1(例如登录号NP_005182.1) CD28(例如登录号NP_006130.1)
B7-2(例如登录号AAA86473) CD28(例如登录号NP_006130.1)
CD70(例如登录号NP_001243.1) CD27(例如登录号NP_001233.1)
LIGHT(例如登录号NP_003798.2) HVEM(例如登录号AAQ89238.1)
HVEM(例如登录号AAQ89238.1) LIGHT(例如登录号NP_003798.2)
CD40L(例如登录号BAA06599.1) CD40(例如登录号NP_001241.1)
4-1BBL(例如登录号NP_003802.1) 4-1BB(例如登录NP_001552.2)
OX40L(例如登录号NP_003317.1) OX40(例如登录号NP_003318.1)
TL1A(例如登录号NP_005109.2) DR3(例如登录号NP_683866.1)
GITRL(例如登录号NP_005083.2) GITR(例如登录号NP_004186.1)
CD30L(例如登录号NP_001235.1)， CD30(例如登录号NP_001234.3)
TIM4(例如登录号NP_612388.2) TIM1(例如登录号NP_036338.2)
SLAM(例如登录号AAK77968.1) SLAM(例如登录号AAK77968.1)
CD48(例如登录号CAG33293.1) CD2(例如登录号NP_001315538.1)
CD58(例如登录号CAG33220.1) CD2(例如登录号NP_001315538.1)
CD155(例如登录号NP_001129240.1) CD226(例如登录号NP_006557.2)
CD112(例如登录号NP_001036189.1) CD226(例如登录号NP_006557.2)
CD137L(例如登录号NP_003802.1) CD137(例如登录NP_001552.2)
在一些实施方案中，外源性共刺激多肽包括N末端截短4-1BBL。在一些实施方案中，外源性共刺激多肽包括全长4-1BBL。
在一些实施方案中，一种或多种外源性共刺激多肽包括活化细胞因子、干扰素或TNF家族成员，例如IFNα、IL2、IL6或它们的任何组合。在一些实施方案中，一种或多种外源性共刺激多肽包括一种或多种活化细胞因子、干扰素或TNF家族成员，并且还包括(例如表9的)一种或多种活化多肽或配体或其T细胞活化变体(例如，片段)、或结合(例如表9的)靶共刺激T细胞受体的一种或多种抗体分子(例如激动性抗体)或其T细胞活化变体(例如片段)。
在某些实施方案中，本公开的特征为工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)，其可用于特异性地诱导表达已知共刺激分子的T细胞的增殖。与呈递(例如，在细胞表面上包含)外源性共刺激多肽的工程化红系细胞或去核细胞接触(例如，在体内或体外)的T细胞可以进行扩增、刺激和/或诱导增殖，使得可易于产生较大数量的特异性T细胞，该外源性共刺激多肽特异性地结合至T细胞表达的共刺激分子。工程化红系细胞或去核细胞可以特异性地扩增T细胞，因为仅表达特定共刺激分子的T细胞扩增。因此，在待扩增的T细胞存在于细胞混合物中的情况下，仅所关注的T细胞将诱导为增殖和扩增。可使用各种各样的细胞分离和纯化技术对T细胞进一步纯化，如本领域已知并且/或者本文别处描述的那些。
如技术人员所理解，基于本文所提供的公开内容，在用工程化红系细胞或去核细胞扩增之前不需要对所关注的T细胞进行鉴定或分离，因为可诱导仅表达同源共刺激分子的T细胞扩增。
在一些实施方案中，例如，利用工程化红系细胞或去核细胞上共表达(或共呈递)的外源性共刺激多肽(包括配体或抗体分子、或两者)，工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)组合地靶向多个T细胞活化途径(例如，如上表9所述)。
在一些实施方案中，至少一种外源性共刺激多肽包括4-1BBL、LIGHT、CD80、CD86、CD70、IL-7、IL-12、OX40L、GITRL、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD83、CD155、CD112、融合于IL-15的IL-15Rα、IL-2、IL-21、ICAM-1的配体、LFA-1的配体、它们的功能片段，以及它们的组合。在一些实施方案中，至少一种外源性共刺激多肽是针对同源共刺激配体受体的激动剂抗体。例如，在某些实施方案中，共刺激多肽包括针对以下的抗体(例如，激动剂抗体)或其抗原结合片段(例如，scFV)：4-1BB(例如，乌瑞芦单抗(Bristol-Myers Squibb)、utomilumab(Pfizer)、ATOR-1017(Alligator Bioscience)、AGEN2373(Agenus)、CTX-471(CompassTherapeutics)、ADG106(Adagene)和LVGN6051(Lyvgen Biopharma))、LIGHT受体(HVEM)、CD80受体、CD86受体、OX40(例如，MEDI6469(Medimmune)、艾沃利单抗(Pfizer)、GSK3174998(GlaxoSmithKline)、BMS-986178(Bristol-Myers Squibb)、vonlerizumab(Genentech)、KHK4083(Kirin Pharma)、他利昔珠单抗(Medimmune)、INCAGN1949(Agenus)、GBR 830(Ichnos)、MEDI6383(Medimmune)、IBI101(Innovent)、BGB-A445(BeiGene)和INBRX-106(Inhibrx))、ICOS(例如，GSK3359609(GlaxoSmithKline)、MEDI-570(Medimmune)、vopratelimab(Jounce Therapeutics)、KY1044(Kymab))、GITR、TIM4受体(TIM1)、SLAM受体、CD28(例如，鲁利珠单抗(Bristol-Myers Squibb)、TAB08(TheraMab)、FR104(OSEImmunotherapeutics)、TGN1412(Tegenero))、CD40(例如，达西珠单抗(Genentech)、APX005(Apexigen)、iscalimab(Novartis)、塞鲁单抗(Hoffmann-La Roche)、BI655064(Boehringer)、布来鲁单抗(Astellas)、卢卡木单抗(Novartis)、RG7876(Genentech)、FFP104(Fast Forward Pharma)、mitazalimab(Alligator Bioscience)、Chi Lob 7/4(Cancer Research UK)、2141-V11(Bristol-Myers Squibb)、SEA-CD40(SeattleGenetics)、CDX-1140(Celldex)、NG-350A(PsiOxus)、XmAb 5485(Xencor)、PG120(PanGenetics)、替奈昔单抗(Bristol-Myers Squibb)、SBT-040(Opi Vi)、ravagalimab(Abbvie))、CD48受体(CD2)、CD58受体(CD2)、CD83受体、CD155受体(CD226)、CD112受体(CD226)、IL-2受体(CD25、CD122、CD132)、IL-21受体、ICAM、以及它们的组合。在一些实施方案中，至少一种外源性共刺激多肽包括抗CD3抗体、抗CD38抗体，以及它们的组合、或它们的抗原结合片段。
在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞呈递(例如在细胞表面上包含)至少2种、至少3种、至少4种、或至少5种外源性共刺激多肽。在一些实施方案中，外源性共刺激多肽彼此融合，例如融合至IL-2的IL-21。
在一些实施方案中，一种或多种外源性共刺激多肽包含或者融合至跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域选自表2所示的序列。在一些实施方案中，一种或多种外源性共刺激多肽包含或者融合至前导序列。在一些实施方案中，前导序列选自表1所示的序列。
外源性共抑制多肽
在一些实施方案中，本文所提供的工程化红系细胞或去核细胞包含外源性共抑制多肽。外源性共抑制多肽是阻抑T细胞的任何多肽，包括T细胞活性的抑制、T细胞增殖的抑制、使T细胞无应答、或T细胞的细胞凋亡的诱导。在一些实施方案中，外源性共抑制多肽能够特异性结合至T细胞上的同源共抑制分子。在一些实施方案中，外源性共抑制多肽配体是表10所示的抑制多肽。
在一些实施方案中，外源性共抑制多肽包含特异性结合T细胞上的共抑制受体的激动剂(例如抗体)。在一些实施方案中，激动剂是结合选自以下的受体的抗体：PD1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160和2B4。在其他实施方案中，激动剂是结合表10所示的T细胞上的靶受体的抗体。
表10：共抑制多肽
抑制多肽 靶受体
B7-1 CTLA4，B7H1
B7-2 CTLA4
B7DC PD1
B7H1 PD1，B7-1
HVEM CD160，BTLA
COLLAGEN LAIR1
GALECTIN9 TIM3
CD48，TIM4 TIM4R
CD48 2B4
CD155，CD112，CD113 TIGIT
PDL1 PD1
LAG3
在一些实施方案中，外源性共抑制多肽包括阻断共刺激多肽与其同源共刺激受体结合的抗体(或其抗原结合片段(例如，scFv))。在各种实施方案中，外源性共抑制多肽包括阻断4-1BBL、LIGHT、CD80、CD86、CD70、OX40L、GITRL、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD83、CD155、CD112、与IL-15融合的IL-15Rα、IL-2、IL-21、ICAM、LFA-1的配体、抗CD3抗体或抗CD28抗体与其受体结合的抗体(或其抗原结合片段)。
在一些实施方案中，外源性共抑制多肽包括IL-35、IL-10、或VSIG-3、或它们的功能片段。在一些实施方案中，外源性共抑制多肽包括VSIG-3、或其功能片段。
在一些实施方案中，例如，利用工程化红系细胞或去核细胞上共表达的外源性共抑制多肽(包括配体或抗体分子、或两者)，工程化红系细胞或去核细胞组合地靶向多个T细胞抑制途径(例如，如上表10所述)。
在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞呈递(例如在细胞表面上包含)至少2种、至少3种、至少4种、或至少5种外源性共抑制多肽。
在一些实施方案中，一种或多种外源性共抑制多肽包含或者融合至跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域选自表2所示的序列。在一些实施方案中，一种或多种外源性共抑制多肽包含或者融合至前导序列。在一些实施方案中，前导序列选自表1所示的序列。
T细胞活化信号
为了有效诱导T细胞增殖、活化和扩增，几种信号需要从工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)传递至初始T细胞。这些信号通常称为信号1、信号2和信号3，并且在以下描述。在一些实施方案中，信号1包含细胞表面上的可负载外源性抗原呈递多肽，其中可负载外源性抗原呈递多肽包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代使细胞表面上的可负载外源性抗原呈递多肽稳定化，其还包含与可负载外源性抗原呈递多肽结合的外源性抗原性多肽。在一些实施方案中，信号1包含野生型外源性抗原呈递多肽。在一些实施方案中，本文所述的工程化红系细胞或去核细胞包含如下所示的任何组合的含有信号1的一种或多种外源性多肽、含有信号2的一种或多种外源性多肽、和/或含有信号3的一种或多种外源性多肽。在一些实施方案中，除了信号1、信号2和信号3之外，本文所述的工程化红系细胞或去核细胞还包含一种或多种外源性多肽，所述一种或多种外源性多肽包含一种或多种细胞粘附分子，以进一步促进T细胞与工程化红系细胞或去核细胞之间的相互作用。应当理解，当工程化红系细胞或去核细胞包含含有信号1的一种或多种外源性多肽和/或含有信号2的一种或多种外源性多肽和/或含有信号3的一种或多种外源性多肽(以及任选地含有细胞粘附分子的一种或多种多肽)时，含有信号1和/或信号2和/或信号3和/或细胞粘附分子的外源性多肽均包含在相同的工程化红系细胞或去核细胞上。
相对于使用球形纳米粒子(如刚性的基于珠的APC)，本文所述的工程化红系细胞或去核细胞提供了许多优点。例如，如本文所述的工程化红系细胞或去核细胞的膜比纳米粒子的外表面更具活力和流动性，该纳米粒子的外表面呈刚性且不可移动，并因此限制多肽在其表面上的移动。工程化红系细胞或去核细胞膜的流动性允许分子的移动性更大，分子重构更有效，并且有利于免疫突触形成和T细胞刺激。在一些实施方案中，本文所述的工程化红系细胞或去核细胞提供了对T细胞更受控的刺激，从而允许具有特定表型和活性的T细胞增殖，该工程化红系细胞或去核细胞在细胞表面上包含如下所示的任何组合的含有信号1的一种或多种外源性多肽、含有信号2的一种或多种外源性多肽、和/或含有信号3的一种或多种外源性多肽。在一些实施方案中，通过使工程化红系细胞或去核细胞工程化以在细胞表面上包含信号1和/或信号2和/或信号3，工程化红系细胞或去核细胞对提供给T细胞的信号提供了最佳控制。
通过使T细胞群与工程化去核红系细胞接触，包含例如含有信号1的一种或多种外源性多肽和/或含有信号2的一种或多种外源性多肽和/或含有信号3的一种或多种外源性多肽(以及任选地含有细胞粘附分子的一种或多种多肽)的本文所述的工程化红系细胞或去核细胞可以用于活化抗原特异性T细胞群，从而活化抗原特异性T细胞群。在一些实施方案中，可使本文所述的工程化去核红系细胞与多种抗原特异性T细胞群接触，以允许多种抗原特异性T细胞群活化。在一些实施方案中，可使包含一种或多种外源性抗原性多肽的工程化去核红系细胞与一种或多种抗原特异性T细胞群接触，以允许一种或多种抗原特异性T细胞群活化。在一些实施方案中，可使包含两种或更多种外源性抗原性多肽的工程化去核红系细胞与两种或更多种抗原特异性T细胞群接触，以允许两种或更多种抗原特异性T细胞群活化。在一些实施方案中，可使包含三种或更多种外源性抗原性多肽的工程化去核红系细胞与三种或更多种抗原特异性T细胞群接触，以允许三种或更多种抗原特异性T细胞群活化。在一些实施方案中，可使包含四种或更多种外源性抗原性多肽的工程化去核红系细胞与四种或更多种抗原特异性T细胞群接触，以允许四种或更多种抗原特异性T细胞群活化。在一些实施方案中，可使包含五种或更多种外源性抗原性多肽的工程化去核红系细胞与五种或更多种抗原特异性T细胞群接触，以允许五种或更多种抗原特异性T细胞群活化。在一些实施方案中，一种、两种、三种、四种、五种或更多种外源性抗原性多肽可以存在于相同的工程化去核红系细胞上，或者它们可以存在于不同的工程化去核红系细胞上。
一种或多种外源性抗原性多肽可包含本文所述的任何抗原多肽。在一些实施方案中，一种或多种外源性抗原性多肽包含HPV-E6抗原。在一些实施方案中，一种或多种外源性抗原性多肽包含HPV-E7抗原。在一些实施方案中，两种或更多种外源性抗原性多肽包含HPV-E6抗原和HPV-E7。
信号1-抗原识别
T细胞活化发生在T细胞受体(TCR)识别如本文所述的工程化红系细胞或去核细胞的外源性抗原结合多肽上呈递的特异性肽抗原之后。通常，在包含HLA II类多肽的外源性抗原结合多肽上呈递的外源性抗原性多肽由TCR与CD4 T细胞共受体共同识别。在包含HLAI类多肽的外源性抗原结合多肽上呈递的外源性抗原性多肽由TCR与CD8 T细胞共受体共同识别。TCR与肽-HLA复合物的连接导致T细胞活化所需信号的转导。
在一些实施方案中，信号1包含一种或多种外源性多肽，所述外源性多肽包含野生型或可负载外源性抗原呈递多肽。在一些实施方案中，信号1包含细胞表面上的可负载外源性抗原呈递多肽，其中可负载外源性抗原呈递多肽包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代使细胞表面上的可负载外源性抗原呈递多肽稳定化，其还包含与可负载外源性抗原呈递多肽结合的外源性抗原性多肽。在一些实施方案中，信号1包含野生型外源性抗原呈递多肽，该野生型外源性抗原呈递多肽包含结合到其上的外源性抗原性多肽。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含如上所提供的HLA I类多肽、HLA I类单链融合体、HLA II类多肽、或HLA II类单链融合体。在一些实施方案中，HLA I类多肽选自HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E和HLA-G多肽(或它们的片段)。在一些实施方案中，HLAII类多肽选自HLA-DPα、HLA-DPβ、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA DOA、HLA DOB、HLA DQα、HLA DQβ、HLA DRα和HLA DRβ、或它们的片段，以及它们的组合。
信号2-共刺激
为了变得完全活化，除了TCR介导的抗原识别之外，T细胞还需要第二信号。该第二信号(即，信号2)或共刺激对于适当的T细胞活化很重要。在一些实施方案中，信号2包含本文所提供的一种或多种外源性共刺激多肽。在一些实施方案中，一种或多种外源性共刺激多肽包括4-1BBL、LIGHT、抗CD28、CD80、CD86、CD70、OX40L、GITRL、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD83、CD155、CD112、IL-15、融合于IL-15的IL-15Rα、IL-21、ICAM-1、LFA-1的配体、抗CD3抗体、它们的片段、以及它们的任何组合。在一些实施方案中，信号2包含一种或多种外源性共刺激多肽，所述外源性共刺激多肽包括4-1BBL、CD80、CD86、CD83、CD70、LIGHT、HVEM、CD40L、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、以及它们的片段。
信号3-细胞因子
为了诱导T细胞更有效的扩增和特异性分化，可以使用第三信号(信号3)。因此，本文所提供的工程化红系细胞或去核细胞还可包括包含信号3的外源性多肽(例如，细胞因子、共抑制性多肽、或它们的片段)。在一些实施方案中，信号3包含一种或多种外源性多肽，所述外源性多肽包含一种或多种细胞因子。在一些实施方案中，信号3包含一种或多种外源性多肽，所述外源性多肽选自IL-2、IL-15、IL-7、IL-12、IL-18、IL-21、IL-4、IL-6、IL-23、IL-27、IL-17、IL-10、TGF-β、IFN-γ、IL-1β、GM-CSF、IL-15、融合于IL-15的IL-15Rα、以及IL-25、或它们的片段。
除了免疫刺激细胞因子之外，免疫抑制细胞因子能够抑制免疫应答或者可以导致耐受性。因此，在一些实施方案中，信号3包含一种或多种外源性共抑制多肽。在一些实施方案中，一种或多种外源性共抑制多肽包括IL-35、IL-10、VSIG-3或LAG3激动剂，以及它们的片段。
细胞粘附分子
在一些实施方案中，除了信号1、信号2和/或信号3之外，本文所述的工程化红系细胞或去核细胞还在细胞表面上包含一种或多种外源性多肽，所述外源性多肽包含细胞粘附分子。细胞粘附分子进一步促进T细胞与工程化红系细胞或去核细胞之间的整合。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞包含外源性多肽，该外源性多肽包含介导或促进免疫突触形成的细胞粘附分子。在一些实施方案中，外源性多肽包含一种或多种细胞粘附分子，所述细胞粘附分子选自ICAM4/LW、CD36、CD58/LFA3、CD47、VLA4、BCAM/Lu、CD44、CD99/MIC2、ICAM1、JAM1、CD147、它们的片段、或它们的任何组合。
在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞在细胞表面处包含含有信号1的外源性多肽、含有信号2的外源性多肽，以及含有细胞粘附分子的一种或多种外源性多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞在细胞表面处包含含有信号1的外源性多肽、含有信号2的外源性多肽、含有信号3的外源性多肽，以及含有细胞粘附分子的一种或多种外源性多肽。
在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞在细胞表面处包含含有多于一种信号1的多于一种外源性多肽、含有信号2的外源性多肽，以及含有细胞粘附分子的一种或多种外源性多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞在细胞表面处包含含有多于一种信号1的多于一种外源性多肽、含有信号2的外源性多肽、含有信号3的外源性多肽，以及含有细胞粘附分子的一种或多种外源性多肽。
在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞在细胞表面处包含含有信号1的外源性多肽、含有多于一种信号2的多于一种外源性多肽，以及含有细胞粘附分子的一种或多种外源性多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞在细胞表面处包含含有信号1的外源性多肽、含有多于一种信号2的多于一种外源性多肽、含有信号3的外源性多肽，以及含有细胞粘附分子的一种或多种外源性多肽。
在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞在细胞表面处包含含有信号1的外源性多肽、含有信号2的外源性多肽、含有多于一种信号3的多于一种外源性多肽，以及含有细胞粘附分子的一种或多种外源性多肽。
在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞在细胞表面处包含含有多于一种信号1的多于一种外源性多肽、含有信号2的外源性多肽、含有多于一种信号3的多于一种外源性多肽，以及含有细胞粘附分子的一种或多种外源性多肽。
在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞在细胞表面处包含含有多于一种信号1的多于一种外源性多肽、含有多于一种信号2的多于一种外源性多肽、含有信号3的外源性多肽，以及含有细胞粘附分子的一种或多种外源性多肽。
在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞在细胞表面处包含含有多于一种信号1的多于一种外源性多肽、含有多于一种信号2的多于一种外源性多肽、含有多于一种信号3的多于一种外源性多肽，以及含有细胞粘附分子的一种或多种外源性多肽。
在一些实施方案中，含有信号1的一种或多种外源性多肽、含有信号2的一种或多种外源性多肽、含有信号3的一种或多种外源性多肽、以及含有细胞粘附分子的一种或多种外源性多肽选自表11所示的外源性多肽。
表11：细胞粘附分子
Figure BDA0003302151970001301
免疫突触
如本文所述，相对于使用球形纳米粒子(如刚性的基于珠的工程化红系细胞或去核细胞)，本公开的工程化红系细胞或去核细胞提供了许多优点。分子移动性(例如细胞膜中配体的移动)和分子簇集是免疫突触形成的重要特征。本文所述的工程化红系细胞或去核细胞的膜比纳米粒子的外表面更具活力和流动性，并因此允许在免疫突触形成期间或在介导胞啃(trogocytosis)中更有效的分子重构和MHC簇集。此外，与小尺寸的纳米粒子形成对照，本文所述的工程化红系细胞或去核细胞具有更大表面积以用于在免疫突触中形成功能性微米级簇。在一些实施方案中，如本文所述的工程化红系细胞或去核细胞工程化成用于形成免疫突触，其中免疫突触促进T细胞活化。
免疫突触(或免疫性突触，或IS)是抗原呈递细胞与淋巴细胞如T/B细胞或NK细胞之间的界面。免疫突触可以由参与T细胞活化的分子组成，这些分子构成典型模式，称为活化簇。根据研究最多的模型，免疫突触也称为超分子活化簇(SMAC)(Monks等人(1998)Nature 395(6697):82-6；其全文以引用方式并入本文)，其由同心环(中央、周边或远端区域)构成，每个同心环含有分离的蛋白质簇。免疫突触中的分子包括野生型或可负载外源性抗原呈递多肽、粘附分子、共刺激分子和共抑制分子。
免疫突触是T细胞受体在一起簇集成微簇并最终向免疫突触中心移动后形成的动态结构。T淋巴细胞与APC界面处这些分子的时空变化调节免疫突触的结构和T淋巴细胞的免疫应答。通常，有效的CD4+和CD8+T细胞活化与功能性免疫突触的形成相关联(Kaizuka等人(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104:20296-301，其全文以引用方式并入本文)。
在一些实施方案中，本公开的特征为工程化红系细胞或去核细胞，其可在工程化红系细胞或去核细胞与免疫细胞如T细胞、B细胞或NK细胞之间形成免疫突触。在一些实施方案中，本文所提供的工程化红系细胞或去核细胞具有在免疫突触中组装多于一种外源性抗原呈递多肽的能力。
免疫突触处的初始相互作用发生在T细胞的周边SMAC中存在的淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)与APC上的整联蛋白粘附分子(如ICAM-1或ICAM-2)之间。当与APC结合时，T细胞可随后伸展伪足并扫描靶细胞表面以发现特异性肽-MHC复合物。当T细胞受体(TCR)与APC上的肽-MHC复合物结合并通过形成微簇/脂筏引发信号转导活化时，形成过程开始(Varma等人(2006)Immunity 25(1):117-27；其全文以引用方式并入本文)。
因此，在一些实施方案中，本公开的工程化红系细胞或去核细胞包含一种或多种外源性细胞粘附多肽，以介导或促进免疫突触形成。在一些实施方案中，一种或多种细胞粘附分子选自ICAM4/LW、CD36、CD58/LFA3、CD47、VLA4、BCAM/Lu、CD44、CD99/MIC2、ICAM1、JAM1和CD147、它们的片段、或它们的任何组合。
本文所述的工程化红系细胞或去核细胞的优点是具有提供动态分子移动的流体细胞膜，并因此允许有效的分子重组和MHC簇集，这是T细胞刺激所需的。信号转导在TCR微簇中引发和维持，该TCR微簇在免疫突触周边连续形成，并转运至中央以形成中央SMAC。在中央SMAC的形成期间，微簇可彼此独立地移动，并且可融合形成连续移动的较大簇。需要阈值MHCI簇密度来维持主动免疫信号转导(Anikeeva等人(2012)PLoS One 7(8):e41466；Bullock等人(2000)J.Immunol.164(5):2354-61；Bullock等人(2003)J.Immunol.170(4):1822-9；Jiang等人(2011)Immunity 34(1):13-23；其各自全文以引用方式并入本文)。因此，在一些实施方案中，本文所提供的工程化红系细胞或去核细胞可以以有效形成功能性免疫突触并活化免疫信号转导的密度介导外源性抗原呈递多肽的簇集。
免疫突触形成中的分子重构的另一个结果是APC膜蛋白向T细胞的细胞间转移。T细胞通过称为胞啃的机制获取来自APC的MHC I类和II类糖蛋白，以及共刺激分子和膜片。如本文所述，本文所提供的工程化红系细胞或去核细胞的膜由于其流动性而允许有效的分子重构和MHC簇集。在一些实施方案中，本文所述的工程化红系细胞或去核细胞允许或介导免疫突触形成中的分子重构，使得发生胞啃。
免疫突触的尺寸可以通过本领域已知的多种方法确定，包括显微术，如全内反射荧光显微术(TIRFM)(Varma等人(2006)；Dustin等人(2002)Science298(5594):785-9；其每者全文以引用方式并入本文)。在一些实施方案中，本文所述的工程化红系细胞或去核细胞可形成平均直径为约0.5μm至5.0μm的免疫突触。在一些实施方案中，本文所述的工程化红系细胞或去核细胞可形成平均直径为至少约0.5μm的免疫突触。在一些实施方案中，本文所述的工程化红系细胞或去核细胞可形成平均直径为约0.5μm至4.5μm、约0.5μm至4.0μm、约0.5μm至3.5μm、约0.5μm至3.0μm、约0.5μm至2.5μm、约0.5μm至2.0μm、约0.5μm至1.5μm、约0.5μm至1.0μm、约1.0μm至5.0μm、约1.0μm至4.5μm、约1.0μm至4.0μm、约1.0μm至3.5μm、约1.0μm至3.0μm、约1.0μm至2.5μm、约1.0μm至2.0μm、约1.0μm至1.5μm、约1.5μm至5.0μm、约1.5μm至4.5μm、约1.5μm至4.0μm、约1.5μm至3.5μm、约1.5μm至3.0μm、约1.5μm至2.5μm、约1.5μm至2.0μm、约2.0μm至5.0μm、约2.0μm至4.5μm、约2.0μm至4.0μm、约2.0μm至3.5μm、约2.0μm至3.0μm、约2.0μm至2.5μm、约2.0μm至5.0μm、约2.5μm至4.5μm、约2.5μm至4.0μm、约2.5μm至3.5μm、约2.5μm至3.0μm、约3.0μm至5.0μm、约3.0μm至4.5μm、约3.0μm至4.0μm、约3.0μm至3.5μm、约3.5μm至5.0μm、约3.5μm至4.5μm、约3.5μm至4.0μm、约4.0μm至5.0μm、约4.0μm至4.5μm、约4.5μm至5.0μm的功能性免疫突触。在一些实施方案中，本文所述的工程化红系细胞或去核细胞可形成平均直径为至少0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1.0μm、1.5μm、2.0μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4.0μm或5μm的功能性免疫突触。
如本文所述，本公开的工程化红系细胞或去核细胞的优点是工程化红系细胞或去核细胞膜的流动性，其允许有效的分子重构。特异性信号转导途径通过使T细胞中心体朝向免疫突触部位而导致T细胞极化。肌动蛋白的积聚和极化由TCR/CD3与整联蛋白和小GTP酶的相互作用来触发。这些相互作用促进肌动蛋白聚合，并且由于肌动蛋白积聚和重组，其促进TCR和整联蛋白的簇集。这些高度动态接触的特征在于连续的细胞骨架重构事件，其不仅构成界面而且施加大量的机械力，这影响进入和离开免疫细胞的信息传递(Basu等人(2017)Trends Cell Biol.27(4):241-54；Hivroz等人(2016)Front Immunol.7:46；其每者全文以引用方式并入本文)。在免疫突触部位处TCR与整联蛋白之间的拉伸强度的粘附力可以通过例如原子力显微术、生物膜力探针(BFP)技术、牵引力显微术等确定(参见例如Hivroz等人(2016))。
在一些实施方案中，拉伸强度是T细胞受体与由工程化红系细胞或去核细胞形成的免疫突触的分子(例如，肽-MHC复合物)之间的粘附力的量度。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞能够形成拉伸强度足以活化免疫细胞的免疫突触。在一些实施方案中，本公开的工程化红系细胞或去核细胞可形成拉伸强度为约1pN至30,000pN的突触。在一些实施方案中，本公开的工程化红系细胞或去核细胞可形成拉伸强度为约1pN至20,000pN、约1pN至10,000pN、约1pN至9,000pN、约1pN至8,000pN、约1pN至7,000pN、约1pN至6,000pN、约1pN至5,000pN、约1pN至4,000pN、约1pN至3,000pN、约1pN至2,000pN、约1pN至1,000pN、约1,000pN至30,000pN、约1,000pN至20,000pN、约1,000pN至10,000pN、约1,000pN至9,000pN、约1,000pN至8,000pN、约1,000pN至7,000pN、约1,000pN至6,000pN、约1,000pN至5,000pN、约1,000pN至4,000pN、约1,000pN至3,000pN、约1,000pN至2,000pN的突触。在一些实施方案中，在免疫突触处肽-MHC复合物(即，外源性抗原性多肽-外源性抗原呈递多肽复合物)与TCR之间的最佳机械力为至少1pN、1.5pN、2.0pN、3.0pN、4.0pN、5.0pN、6.0pN、7.0pN、8.0pN、9.0pN、10pN、20pN、30pN、40pN、50pN、60pN、70pN、80pN、90pN、100pN、500pN、1,000pN、2,000pN、3,000pN、4,000pN、5,000pN、6,000pN、7,000pN、8,000pN、9,000pN、10,000pN、11,000pN、12,000pN、13,000pN、14,000pN、15,000pN、或20,000pN。在一些实施方案中，如本文所述的工程化红系细胞或去核细胞可以引发免疫突触处肽-MHC复合物与TCR之间的机械力，以活化免疫细胞。
Treg共刺激和共抑制多肽
在某些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞还包含外源性Treg共刺激多肽(例如，以扩增调节性T细胞(Treg)细胞)。在一些实施方案中，Treg共刺激多肽通过刺激参与Treg细胞发育的三种信号中的至少一种来使Treg细胞扩增。信号1涉及TCR，并且可以用抗体如抗CD3抗体或者用通过TCR发信号的抗原进行刺激。信号2可以由几种不同的分子介导，包括免疫共刺激分子如CD80和4-1BBL。信号3经由细胞因子如IL-2或TGFβ转导。在一些实施方案中，Treg共刺激多肽刺激这些信号中的一种。在另一个实施方案中，Treg共刺激多肽刺激这些信号中的两种。在又一个实施方案中，Treg共刺激多肽刺激这些信号中的三种。
信号1
在一些实施方案中，外源性共刺激多肽包含可用作刺激信号1的Treg共刺激多肽的抗原，包括与目标疾病或病症相关联的抗原。在一些实施方案中，外源性Treg共刺激多肽包含自身抗原、胰岛素(特别适合于治疗1型糖尿病)、胶原蛋白(特别适合于治疗类风湿性关节炎)、髓鞘碱性蛋白(特别适合于治疗多发性硬化症)或MHC(用于治疗和预防外来移植物排斥)。抗原可以作为缀合物的一部分给药。任选地，抗原作为MHC/抗原复合物的一部分提供。在该实施方案中，MHC和抗原可独立地为外源或同源的。例如，可以使用供体MHC以及异源或同源抗原。
信号2
在一些实施方案中，刺激信号2的外源性Treg共刺激多肽包括B7和TNF家族成员，例如下表12所示的B7和CD28家族成员，以及表13所示的TNF家族成员，或它们的片段。
表12：Treg共刺激多肽：B7和CD28家族成员
配体 受体
B7.1(CD80) CD28，CTLA-4(CD 152)
B7.2(CD86) CD28，CTLA-4
ICOSL(B7h，B7-H2，B7RP-1， ICOS(AILIM)
GL5O，LICOS)
PD-L1(B7-H1) PD-1
PD-L2(B7-DC) PD-1
B7-H3 未知
B7-H4(B7x；B7S1) 未知(BTLA？)
未知(HVEM*) BTLA
ICOSL(B7h，B7-H2，B7RP-1， ICOS(AILIM)
表13：Treg共刺激多肽：TNF家族成员
Figure BDA0003302151970001341
Figure BDA0003302151970001351
信号3
在一些实施方案中，刺激信号3的外源性Treg共刺激多肽包括刺激信号3的细胞因子或生长因子，如IL-2、IL-4和TGF-β(包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3)、或它们的片段。可用于免疫治疗方法的IL-2和IL-4部分在本领域中是已知的。参见例如Earle等人(2005)，同上；Thorton等人(2004)J.Immunol.172:6519-23；Thorton等人(2004)Eur.J.Immunol.34:366-76。在一些实施方案中，使用细胞因子的成熟部分。
在一些实施方案中，Treg共刺激多肽包含CD25特异性IL-2或其片段。在一些实施方案中，Treg共刺激多肽包含TNFR2特异性TNF或其片段。在一些实施方案中，Treg共刺激多肽包含抗DR3激动剂(VEGI/TL1A特异性)或其片段。在一些实施方案中，Treg共刺激肽包含4-1BBL或其片段。在一些实施方案中，Treg共刺激肽包含TGFβ或其片段。
在其他实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞包含能够抑制Treg细胞的外源性Treg共抑制多肽。在某些实施方案中，Treg抑制可用于治疗癌症，例如通过靶向参与Treg运输的趋化因子。在一些实施方案中，外源性Treg共抑制多肽可靶向表10或11所列的任何受体，例如抗OX40、抗GITR或抗CTLA4、或TLR配体。
在一些实施方案中，外源性Treg共刺激多肽或外源性Treg共抑制多肽、或其活性片段可以作为融合蛋白与结合对成员连接或表达，以如本文所述使用。示例性结合对是生物素和链霉抗生物素蛋白(SA)或抗生物素蛋白。
在一些实施方案中，外源性Treg共刺激多肽或其活性片段是融合蛋白的一部分，该融合蛋白包含Treg共刺激多肽和结合对成员，如CSA。融合蛋白可以通过本领域已知的许多不同方法中的任一种来制备。例如，融合蛋白的一种或多种组分多肽可以是化学合成的，或者可以使用公知的重组核酸技术生成。
在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞呈递(例如在细胞表面上包含)至少2种、至少3种、至少4种、或至少5种外源性Treg共刺激多肽。
在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞呈递(例如在细胞表面上包含)至少2种、至少3种、至少4种、或至少5种外源性Treg抑制多肽。
在一些实施方案中，一种或多种Treg共刺激或共抑制多肽包括或融合至跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域选自表2所示的序列。在一些实施方案中，一种或多种Treg共刺激或共抑制多肽包括或融合至前导序列。在一些实施方案中，前导序列选自表1所示的序列。
细胞因子/趋化因子
另外，本文所提供的工程化红系细胞或去核细胞还包含含有细胞因子的至少一种外源性多肽、含有趋化因子的至少一种外源性多肽、或两者。
示例性细胞因子包括造血生长因子、白介素、干扰素、免疫球蛋白超家族分子和肿瘤坏死因子家族分子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、肿瘤坏死因子β(TNFβ)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-6(IL-6)、白介素-7(IL-7)、白介素-10(IL-10)、白介素-12(IL-12)、白介素-15(IL-15)、白介素-21(IL-21)、白介素-35(IL-35)、干扰素α(IFN-α)、干扰素β(IFN-β)、干扰素γ(IFN-γ)和IGIF，以及它们的片段。
示例性趋化因子包括α-趋化因子或β-趋化因子，包括但不限于C5a、白介素-8(IL-8)、单核细胞趋化蛋白1α(MIP1α)、单核细胞趋化蛋白1β(MIP1β)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、单核细胞趋化蛋白3(MCP-3)、血小板活化因子(PAFR)、N-甲酰基-甲硫氨酰-亮氨酰-[3H]苯丙氨酸(FMLPR)、白三烯B4(LTB4R)、胃泌激素释放肽(GRP)、RANTES、嗜酸性粒细胞趋化因子、淋巴细胞趋化因子、IP10、1-309、ENA78、GCP-2、NAP-2、和/或MGSA/gro。
在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞上的包含细胞因子的外源性多肽充当用于刺激信号3的多肽。应当理解，在一些实施方案中，本公开的工程化红系细胞或去核细胞可通过刺激参与T细胞发育的所有三种信号来扩增和/或活化T细胞。信号1涉及TCR，并且可以用通过TCR发信号的抗原进行刺激。信号2可以由几种不同的分子介导，包括本文所述的任何免疫共刺激分子，如4-1BBL。信号3可以经由细胞因子如IL-15转导。不受理论的约束，认为除了分别来自第一和第二外源性多肽(例如，如本文所述的抗原和共刺激多肽)的信号1和2之外，工程化红系细胞或去核细胞上的例如来自第三外源性多肽的信号3的存在提高了工程化红系细胞或去核细胞增强记忆T细胞群的能力，并从而提供了更长的功效，例如对抗肿瘤复发或致病原再攻击的功效。在一些实施方案中，用于刺激信号3的多肽是含有IL-15或其片段的外源性多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞包含刺激信号3的第三外源性多肽(例如，IL-15或其片段)。
在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞包含一种或多种(例如，2种、3种、4种、5种或更多种)外源性多肽，所述外源性多肽包含来自表14的细胞因子受体亚单位或细胞因子结合变体或其片段。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞包含两种或三种(例如，所有的)来自表14的单列的细胞因子受体亚单位或细胞因子结合变体或其功能片段。包含细胞因子受体的外源性多肽可存在于工程化红系细胞或去核细胞的表面上。所表达的受体通常具有能够结合并多价螯合其靶配体的野生型人受体序列或其变体或片段。在一些实施方案中，包含细胞因子受体亚单位的两种或更多种外源性多肽彼此连接为例如融合蛋白。
在一些实施方案中，包含细胞因子、趋化因子、或细胞因子受体亚单位的一种或多种外源性多肽包含或者融合至跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域选自表14所示的序列。在一些实施方案中，包含细胞因子、趋化因子、或细胞因子受体亚单位的一种或多种外源性多肽包含或者融合至前导序列。在一些实施方案中，前导序列选自表14所示的序列。
在一些实施方案中，红系细胞还包含靶向部分，例如，在国际公开No.WO 2007/030708中例如其中第34-45页所述的对准部分或靶向部分，该申请全文以引用方式并入本文。
表14：细胞因子和受体
Figure BDA0003302151970001371
Figure BDA0003302151970001381
Figure BDA0003302151970001391
包含野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的工程化红系细胞
本公开的特征为工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)，其包含如本文所述的所关注的野生型或可负载抗原呈递多肽和一种或多种额外多肽(例如，外源性抗原性多肽或外源性可置换多肽)。在一些实施方案中，去核细胞是缺乏核的细胞(例如，由于分化过程，如红血球生成)。在一些实施方案中，去核细胞不能表达多肽。在一些实施方案中，去核细胞是红细胞、网织红细胞、或血小板。工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)可有利地用于治疗例如癌症、自身免疫疾病、或感染性疾病。
在一些方面，本公开提供了工程化成用于活化T细胞的工程化红系细胞或去核细胞，其中细胞呈递(例如在细胞表面上包含)含有一个或多个氨基酸取代的外源性可负载抗原呈递多肽，所述一个或多个氨基酸取代使细胞表面上的可负载外源性抗原呈递多肽稳定化。
在一些实施方案中，野生型或可负载抗原呈递多肽与表7-8中所公开的外源性抗原性多肽或本文所公开的外源性可置换多肽结合。
在一些实施方案中，工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)包含第一外源性多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)还包含第二不同的外源性多肽。工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)任选地还包含第二和第三不同的外源性多肽。工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)任选地还包含第二、第三和第四不同的外源性多肽。工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)任选地还包含第二、第三、第四和第五不同的外源性多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)任选地还包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20种或更多种不同的外源性多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)任选地还包含1-100、1-200种不同的外源性多肽。
外源性抗原性多肽可以由野生型或可负载外源性抗原呈递多肽呈递，即可负载外源性抗原呈递多肽负载有或结合至外源性抗原性多肽。因此，在一些方面，本公开提供了工程化红系细胞或去核细胞，其呈递(例如，在细胞表面上包含)负载的外源性抗原呈递多肽，该外源性抗原呈递多肽包括外源性抗原性多肽。在其他实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽与如本文所述的外源性可置换多肽结合，该外源性可置换多肽可以由外源性抗原性多肽置换和替代。
在其他方面，本公开提供了工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)，其中细胞包含野生型或可负载外源性抗原呈递多肽，具有或不具有外源性可置换多肽，并且还包含外源性抗原性多肽、外源性共抑制多肽、外源性共刺激多肽、和/或含有细胞因子、趋化因子或细胞因子受体亚单位的外源性多肽中的一种或多种。
循环时间
在一些实施方案中，本公开的工程化红系细胞或去核细胞(例如，去核红系细胞)在给药于受试者至少约1天至约240天(例如，至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天、35天、36天、37天、38天、39天、40天、41天、42天、43天、44天、45天、46天、47天、48天、49天、50天、51天、52天、53天、54天、55天、56天、57天、58天、59天、60天、61天、62天、63天、64天、65天、66天、67天、68天、69天、70天、71天、72天、73天、74天、75天、76天、77天、78天、79天、80天、81天、82天、83天、84天、85天、86天、87天、88天、89天、90天、91天、92天、93天、94天、95天、96天、97天、98天、99天、100天、101天、102天、103天、104天、105天、106天、107天、108天、109天、110天、111天、112天、113天、114天、115天、116天、117天、118天、119天、120天、121天、122天、123天、124天、125天、126天、127天、128天、129天、130天、131天、132天、133天、134天、135天、136天、137天、138天、139天、140天、141天、142天、143天、144天、145天、146天、147天、148天、149天、150天、151天、152天、153天、154天、155天、156天、157天、158天、159天、160天、161天、162天、163天、164天、165天、166天、167天、168天、169天、170天、171天、172天、173天、174天、175天、176天、177天、178天、179天、180天、181天、182天、183天、184天、185天、186天、187天、188天、189天、190天、191天、192天、193天、194天、195天、196天、197天、198天、199天、200天、201天、202天、203天、204天、205天、206天、207天、208天、209天、210天、211天、212天、213天、214天、215天、216天、217天、218天、219天、220天、221天、222天、223天、224天、225天、226天、227天、228天、229天、230天、231天、232天、233天、234天、235天、236天、237天、238天、239天、或240天)之后处于循环中。
拷贝数
在一些实施方案中，一种或多种外源性多肽(例如，外源性抗原性多肽、外源性抗原呈递多肽、外源性共刺激多肽和外源性共抑制多肽)具有按重量计或按拷贝数计约1:1、约2:1至1:2、约5:1至1:5、约10:1至1:10、约20:1至1:20、约50:1至1:50、约100:1至1:100的丰度比。
在一些实施方案中，工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)包含至少10个拷贝、100个拷贝、1,000个拷贝、5,000个拷贝、10,000个拷贝、25,000个拷贝、50,000个拷贝、或100,000个拷贝的第一外源性多肽和第二外源性多肽中的每者。在一些实施方案中，第一外源性多肽的拷贝数比第二外源性多肽的拷贝数大不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％，或不超过2、5、10、20、50、100、200、500、或1000倍。在一些实施方案中，第二外源性多肽的拷贝数比第一外源性多肽的拷贝数大不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％，或不超过2、5、10、20、50、100、200、500、或1000倍。
在一些实施方案中，第一外源性多肽包含约50,000至约600,000个拷贝的第一外源性多肽，例如约50,000、60,000、60,000、80,000、90,000、100,000、110,000、120,000、130,000、140,000、150,000、155,000、160,000、165,000、170,000、175,000、180,000、185,000、190,000、195,000、200,000、205,000、210,000、215,000、220,000、225,000、230,000、235,000、240,000、245,000、250,000、255,000、260,000、265,000、270,000、275,000、280,000、285,000、290,000、295,000、300,000、305,000、310,000、315,000、320,000、325,000、330,000、335,000、340,000、345,000、350,000、355,000、360,000、365,000、370,000、375,000、380,000、385,000、390,000、395,000、400,000、450,000、500,000、550,000、600,000个拷贝的第一外源性多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞包含约50,000-600,000、约100,000-600,000、约100,000-500,000、约100,000-400,000、约100,000-150,000、约150,000-300,000、或150,000-200,000个拷贝的第一外源性多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞包含至少约75,000个拷贝、约100,000个拷贝、约125,000个拷贝、约150,000个拷贝、约175,000个拷贝、约200,000个拷贝、约250,000个拷贝、约300,000个拷贝、约400,000、或约500,000个拷贝的第一外源性多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞包含约50,000至约600,000个拷贝的第二外源性多肽，例如约50,000、60,000、60,000、80,000、90,000、100,000、110,000、120,000、130,000、140,000、150,000、155,000、160,000、165,000、170,000、175,000、180,000、185,000、190,000、195,000、200,000、205,000、210,000、215,000、220,000、225,000、230,000、235,000、240,000、245,000、250,000、255,000、260,000、265,000、270,000、275,000、280,000、285,000、290,000、295,000、300,000、305,000、310,000、315,000、320,000、325,000、330,000、335,000、340,000、345,000、350,000、355,000、360,000、365,000、370,000、375,000、380,000、385,000、390,000、395,000、400,000、450,000、500,000、550,000、600,000个拷贝的第二多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含约50,000-600,000、约100,000-600,000、约100,000-500,000、约100,000-400,000、约100,000-150,000、约150,000-300,000、或150,000-200,000个拷贝的第二外源性多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约75,000个拷贝、约100,000个拷贝、约125,000个拷贝、约150,000个拷贝、约175,000个拷贝、约200,000个拷贝、约250,000个拷贝、约300,000个拷贝、约400,000、或约500,000个拷贝的第二外源性多肽。
工程化红系细胞的群体
在一个方面，本公开的特征为本文所述的工程化红系细胞或去核细胞的群体，例如，多个工程化去核红系细胞或工程化去核红系细胞的群体。术语“多个”和“群体”在本文中可互换使用。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞的群体可以包含主要为去核细胞(例如，大于70％)、主要为有核细胞(例如，大于70％)、或去核和有核细胞的任何混合物。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞的群体可以包含网织红细胞、红细胞、或网织红细胞和红细胞的混合物。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞的群体可以主要包含网织红细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞的群体可以主要包含红细胞(例如，未成熟或成熟红细胞)。
在一些实施方案中，工程化红系细胞的群体基本上由去核细胞组成。在一些实施方案中，工程化红系细胞的群体主要或基本上包含去核细胞。例如，在一些实施方案中，工程化红系细胞的群体包含至少约70％或更多的去核细胞。在一些实施方案中，本文所提供的群体包含至少约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99、或约100％的去核细胞。在一些实施方案中，本文所提供的群体包含大于约70％的去核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞的群体包含大于约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％的去核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞的群体包含约80％至约100％的去核细胞，例如约80％至约95％、约80％至约90％、约80％至约85％、约85％至约100％、约85％至约95％、约85％至约90％、约90％至约100％、约90％至约95％、或约95％至约100％的去核细胞。
在一些实施方案中，工程化红系细胞的群体包含小于约30％的有核细胞。例如，在实施方案中，工程化红系细胞的群体包含小于约1％、约2％、约3％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、或小于约30％的有核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞的群体包含小于约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、或约19％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、或约30％的有核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞的群体包含0％至2030％的有核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞的群体包含约0％至20％的有核细胞，例如约0％至19％、约0％至15％、约0％至10％、约0％至5％、约0％至4％、约0％至3％、约0％至2％的有核细胞、或约5％至20％、约10％至20％、或约15％至20％的有核细胞。
在一些实施方案中，本公开的特征为如本文所述的工程化红系细胞的群体，其中工程化红系细胞的群体包含小于30％有核细胞和至少70％去核细胞，或者包含小于20％有核细胞和至少80％去核细胞，或者包含小于15％有核细胞和至少85％有核细胞，或者包含小于10％有核细胞和至少90％去核细胞，或者包含小于5％有核细胞和至少95％去核细胞。在一些实施方案中，本公开的特征为如本文所述的工程化红系细胞的群体，其中工程化红系细胞的群体包含约0％有核细胞和约100％去核细胞、约1％有核细胞和约99％去核细胞、约2％有核细胞和约98％去核细胞、约3％有核细胞和约97％去核细胞、约4％有核细胞和约96％去核细胞、约5％有核细胞和约95％去核细胞、约6％有核细胞和约94％去核细胞、约7％有核细胞和约93％去核细胞、约8％有核细胞和约92％去核细胞、约9％有核细胞和约91％去核细胞、约10％有核细胞和约90％去核细胞、约11％有核细胞和约89％去核细胞、约12％有核细胞和约88％去核细胞、约13％有核细胞和约87％去核细胞、约14％有核细胞和约86％去核细胞、约85％有核细胞和约85％去核细胞、约16％有核细胞和约84％去核细胞、约17％有核细胞和约83％去核细胞、约18％有核细胞和约82％去核细胞、约19％有核细胞和约81％去核细胞、或约20％有核细胞和约80％去核细胞。
在其他实施方案中，工程化红系细胞群体主要或基本上包含有核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞群体基本上由有核细胞组成。在各种实施方案中，工程化红系细胞群体中的有核细胞为红系前体细胞。在一些实施方案中，红系前体细胞选自多能造血干细胞(HSC)、多能骨髓祖细胞、CFU-S细胞、BFU-E细胞、CFU-E细胞、原红细胞、嗜碱性正成红细胞(basophilic normoblast)、多染性正成红细胞(polychromatophilic normoblast)和正染性正成红细胞(orthochromatophilic normoblast)。
在某些实施方案中，工程化红系细胞的群体包含至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％的有核细胞。
应当理解，在如本文所述的工程化红系细胞或去核细胞的制备期间，细胞的一些部分可以不包含外源性多肽(例如，由于缺乏用外源性核酸的表达或转导或缀合)。因此，在一些实施方案中，本文所提供的工程化红系细胞或去核细胞的群体包含工程化红系细胞和未经修饰红系细胞的混合物、或经修饰去核细胞和未经修饰去核细胞的混合物，即群体中细胞的一些部分将不包含(例如，表达)外源性多肽。例如，在各种实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞的群体可包含至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的包含外源性多肽的红系细胞或去核细胞，其中群体中的剩余红系细胞或去核细胞不包含外源性多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞的单一单位剂量包含至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的包含外源性多肽的红系细胞或去核细胞，其中该剂量中剩余的红系细胞或去核细胞不包含外源性多肽。
II.制备工程化红系细胞或去核细胞的方法
本公开设想了制备工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)的各种方法。在一些方面，本公开的特征为制备工程化红系细胞或去核细胞的方法，其中所述细胞包括包含外源性免疫原性多肽，并且在一些实施方案中包含外源性抗原性多肽的工程化红系细胞或去核细胞。
在一些实施方案中，本说明书提供了产生工程化红系细胞或去核细胞的方法，该工程化红系细胞或去核细胞在细胞表面上包含可负载外源性抗原呈递多肽，该方法包括：将编码可负载外源性抗原呈递多肽的外源性核酸引入有核红系前体细胞中，其中可负载外源性抗原呈递多肽包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代使细胞表面上的可负载外源性抗原呈递多肽稳定化；在适于去核和产生可负载外源性抗原呈递多肽的条件下培养有核红系前体细胞，从而制备在细胞表面上包含可负载外源性抗原呈递多肽的工程化去核红系细胞，从而制备工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)。在一些实施方案中，该方法还包括将编码至少一种(例如，一种、两种或三种)外源性抗原性多肽的至少一种(例如，一种、两种或三种)外源性核酸引入红系前体细胞中。在一些实施方案中，至少一种外源性抗原性多肽包含跨膜结构域以及任选地接头。在一些实施方案中，该方法还包括将编码外源性可置换多肽的外源性核酸引入红系前体细胞中。
本公开还提供了使工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)与至少一种外源性抗原性多肽接触的方法，其中至少一种外源性抗原性多肽与工程化去核红系细胞的细胞表面上存在的野生型或可负载外源性抗原呈递多肽特异性地结合。在一些实施方案中，外源性抗原性多肽与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽缀合(例如共价地)。
在一些实施方案中，该方法包括使工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)与多种不同的(例如，两种、三种、四种、五种或更多种)外源性抗原性多肽接触，其中多种不同的(例如，两种、三种、四种、五种或更多种)外源性抗原性多肽与工程化去核红系细胞的细胞表面上存在的野生型或可负载外源性抗原呈递多肽特异性地结合。在一些实施方案中，去核红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)与两种或更多种外源性抗原性多肽接触，其中两种或更多种外源性抗原性多肽与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽特异性地结合。在一些实施方案中，去核红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)与三种或更多种外源性抗原性多肽接触，其中三种或更多种外源性抗原性多肽与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽特异性地结合。在一些实施方案中，去核红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)与四种或更多种外源性抗原性多肽接触，其中四种或更多种外源性抗原性多肽与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽特异性地结合。在一些实施方案中，去核红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)与五种或更多种外源性抗原性多肽接触，其中五种或更多种外源性抗原性多肽与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽特异性地结合。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含MHC I类多肽。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含MHC II类多肽。
在一些实施方案中，外源性核酸还编码外源性可置换多肽。在其他实施方案中，外源性核酸还编码接头。在其他实施方案中，外源性核酸还编码跨膜结构域。在一些实施方案中，外源性野生型或可负载抗原呈递多肽、跨膜结构域、接头和外源性可置换多肽包含在单链融合蛋白中。在一些实施方案中，单链融合蛋白包含设置在野生型或可负载外源性抗原呈递多肽与外源性可置换多肽之间的接头。
在一些实施方案中，本文所述的方法还包括通过使工程化去核红系细胞在体外与外源性抗原性多肽接触，将可置换外源性多肽从可负载外源性抗原呈递多肽置换，其中可负载外源性抗原呈递多肽对外源性抗原性多肽具有比对外源性可置换多肽更高的亲和力。
在一些实施方案中，外源性核酸包括DNA或RNA。在一些实施方案中，引入步骤包括病毒转导。在一些实施方案中，引入步骤包括电穿孔。在一些实施方案中，引入步骤包括利用以下中的一种或多种：脂质体介导的转移、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、基于逆转录病毒的载体、脂质转染和慢病毒载体。
在一些实施方案中，工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)还包含额外的外源性多肽，包括例如外源性共抑制多肽、共刺激多肽、细胞因子或膜锚定多肽。
本文描述了制备工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)的方法，然而，应当理解这些方法是非限制性的。
以下更详细地描述了制备工程化红系细胞和去核细胞的过程。
制造去核红系细胞的方法
制造包含外源性试剂(例如，多肽)的去核红系细胞的方法描述于例如国际申请公开No.WO2015/073587和WO2015/153102中，其各自全文以引用方式并入。
在一些实施方案中，使造血祖细胞，例如CD34+造血祖细胞(例如，人类(例如，成人)或小鼠细胞)与编码一种或多种外源性多肽的一种或多种核酸接触，并且允许培养中的细胞扩增和分化。在一些实施方案中，CD34+细胞是无限增殖化的，例如包含人乳头状瘤病毒(HPV；例如HPV 16型)E6和/或E7基因。在一些实施方案中，无限增殖化CD34+造血祖细胞是BEL-A细胞系细胞(参见Trakarnasanga等人(2017)Nat.Commun.8:14750)。额外的无限增殖化CD34+造血祖细胞描述于美国专利No.9,951,350和8,975,072中。在一些实施方案中，使无限增殖化CD34+造血祖细胞与编码一种或多种外源性多肽的一种或多种核酸接触，并且允许培养中的细胞扩增和分化。
在一些实施方案中，本文所述的红系细胞通过包括使有核红系细胞(例如，红系前体细胞)与外源性核酸接触的方法进行制备。在一些实施方案中，外源性核酸是密码子优化的。例如，外源性核酸可以包含不同于野生型密码子的一个或多个密码子，其方式不改变由该密码子编码的氨基酸，但提高核酸的翻译，例如，通过使用宿主细胞例如哺乳动物细胞(例如红系细胞)优选的密码子。
外源性核酸可为例如DNA或RNA(例如，mRNA)。许多病毒可用作基因转移媒介物，包括例如逆转录病毒、莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)、慢病毒属如人类免疫缺陷病毒1(HIV 1)，以及泡沫病毒属如泡沫病毒。
在一些实施方案中，外源性核酸可操作地连接至组成型启动子。在一些实施方案中，组成型启动子用于驱动靶向部分的表达。
在一些实施方案中，外源性核酸可操作地连接至诱导型或阻抑型启动子，例如，以驱动外源性多肽的表达。例如，启动子可为强力霉素诱导型，例如P-TRE3GS启动子或其活性片段或变体。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白诱导型启动子、糖皮质素诱导型启动子、孕酮诱导型启动子和四环素诱导型启动子(其也可为强力霉素诱导型)。在一些实施方案中，例如，在细胞分化的特定阶段，将诱导物添加到包含含有诱导型启动子的细胞的培养基中。在一些实施方案中，将诱导物(例如，强力霉素)以约1-5、2-4、或3μg/mL的量添加。在一些实施方案中，例如，在细胞分化的特定阶段，将阻遏物从包含含有阻抑型启动子的细胞的培养基中撤除。在一些实施方案中，在成熟期期间，例如成熟期的1-10、2-9、3-8、4-6或约5天，添加诱导物，或者撤除阻遏物。在一些实施方案中，在成熟和去核的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天之间，存在诱导物，或者不存在阻遏物。在一些实施方案中，诱导物存在或者阻遏物不存在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10天。在一些实施方案中，从成熟第5天至分化结束，存在诱导物，或者不存在阻遏物。在一些实施方案中，在成熟第9天时，存在诱导物，或者不存在阻遏物。在一些实施方案中，当红系细胞群体包含多个正常红细胞(例如，嗜碱性、多染性、或正染性正成红细胞或它们的组合)时，例如当群体中细胞的10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、或70-80％是正常红细胞时，添加诱导物，或者撤除阻遏物。在一些实施方案中，当红系细胞群体包含多个原成红细胞时，例如当群体中细胞的10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、或70-80％是原成红细胞时，添加诱导物，或者撤除阻遏物。在一些实施方案中，当红系细胞群体包含多个终末分化的成红细胞时，例如当群体中细胞的10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、或70-80％是终末分化的成红细胞时，添加诱导物，或者撤除阻遏物。在一些实施方案中，红系细胞或红系细胞群体包含额外的外源性蛋白，例如反式激活蛋白，例如Tet-诱导型反式激活蛋白(例如，Tet-on-3G反式激活蛋白)。
在一些实施方案中，当红系细胞群体包含内源性GPA、band 3、或α4整联蛋白中的一种或多种(例如，全部)时，添加诱导物，或撤除阻遏物。在一些实施方案中，当群体中细胞的约84-100％、85-100％、90-100％、或95-100％为GPA阳性时(例如，当群体首次达到该水平时)的时间期间；当群体中细胞的50-100％、60-100％、70-100％、80-100％、90-100％、95-100％、或98-100％为band 3阳性时(例如，当群体首次达到该水平时)的时间期间；并且/或者当群体中细胞的约70-100％、80-90％、或约85％为α4整联蛋白阳性时(例如，当群体首次达到该水平时)的时间期间，添加诱导物，或撤除阻遏物。
GPA、band 3和α4整联蛋白可例如通过流式细胞术测定，例如国际专利公开No.WO2018/009838的实施例10的流式细胞术测定来检测，其以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，细胞使用缀合，例如分拣标记(sortagging)或分选酶介导的缀合来产生，例如，如国际专利公开No.WO2014/183071或WO2014/183066中所述，其各自全文以引用方式并入本文。在一些实施方案中，通过不包括分选酶介导的结合的方法来制备细胞。
在一些实施方案中，通过不包括低渗性负载的方法来制备细胞。在一些实施方案中，通过不包括低渗透析步骤的方法来制备细胞。在一些实施方案中，通过不包括受控细胞变形的方法来制备细胞。
在一些实施方案中，红系细胞扩增至少1000、2000、5000、10,000、20,000、50,000、或100,000倍(并任选地多至100,000、200,000、或500,000倍)。在一些实施方案中，使用自动细胞计数器来测量细胞的数量。
在一些实施方案中，红系细胞群体包含至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％或98％(并任选地多至约80％、90％、或100％)的去核红系细胞。在一些实施方案中，红系细胞群体包含70％-100％、75％-100％、80％-100％、85％-100％、或90％-100％的去核细胞。在一些实施方案中，红系细胞群体包含少于1％的活有核细胞，例如不包含可检测的活有核细胞。在一些实施方案中，通过FACS使用核染色来测量去核。在一些实施方案中，群体中红系细胞的至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％或98％(以及任选地多至约70、80、90、或100％)包含一种或多种(例如，2、3、4种或更多种)的外源性多肽。在一些实施方案中，使用针对多肽的标记抗体，通过红系细胞来测量多肽的水平。在一些实施方案中，群体中红系细胞的至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％或98％(以及任选地多至约70、80、90、或100％)是去核的，并且包含一种或多种(例如，2、3、4种或更多种)的外源性多肽。在一些实施方案中，红系细胞群体包含约1x109-2x109、2x109-5x109、5x109-1x1010、1x1010-2x1010、2x1010-5x1010、5x1010-1x1011、1x1011-2x1011、2x1011-5x1011、5x1011-1x1012、1x1012-2x1012、2x1012-5x1012、或5x1012-1x1013个细胞。
工程化红系细胞的物理特征
在一些实施方案中，本文所述的工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)具有本文所述的一种或多种(例如，2、3、4种、或更多种)物理特征，例如渗透脆性、细胞尺寸、血红蛋白浓度、或磷脂酰丝氨酸含量。不受理论的束缚，在一些实施方案中，包含本文所述的外源性多肽的工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)具有类似于野生型未经处理的红系细胞或去核细胞的物理特征。相比之下，低渗负载的红系细胞可能有时显示异常的物理特征，如渗透脆性增加、细胞尺寸改变、血红蛋白浓度降低、或细胞膜的外小叶上的磷脂酰丝氨酸水平增加。
渗透脆性
在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞表现出与不包含外源性多肽的分离的未培养红系细胞基本上相同的渗透膜脆性。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞的群体在0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、或0.5％NaCl下具有小于50％细胞裂解的渗透脆性。可以使用WO2015/073587的实施例59的方法来测定渗透脆性，其全文以引用方式并入本文。
细胞尺寸
在一些实施方案中，工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)具有与野生型未经处理的去核红系细胞近似的直径或体积。
在一些实施方案中，工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)的群体具有约4、5、6、7、或8微米的平均直径，并且任选地群体的标准偏差小于1、2、或3微米。在一些实施方案中，一种或多种工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)具有约4-8、5-7、或约6微米的直径。在一些实施方案中，红系细胞的直径小于约1微米、大于约20微米、约1微米至约20微米、约2微米至约20微米、约3微米至约20微米、约4微米至约20微米、约5微米至约20微米、约6微米至约20微米、约5微米至约15微米或约10微米至约30微米。在一些实施方案中，使用Advia 120血液系统来测量细胞直径。
在一些实施方案中，红系细胞的平均红细胞体积的体积大于10fL、20fL、30fL、40fL、50fL、60fL、70fL、80fL、90fL、100fL、110fL、120fL、130fL、140fL、150fL、或大于150fL。在一些实施方案中，红系细胞的平均红细胞体积小于30fL、40fL、50fL、60fL、70fL、80fL、90fL、100fL、110fL、120fL、130fL、140fL、150fL、160fL、170fL、180fL、190fL、200fL、或小于200fL。在一些实施方案中，红系细胞的平均红细胞体积为80-100、100-200、200-300、300-400、或400-500飞升(fL)。在一些实施方案中，工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)的群体具有本段中列出的平均红细胞体积，并且群体的标准偏差小于50、40、30、20、10、5、或2fL。在一些实施方案中，使用使用血液学分析仪器，例如Coulter计数器来测量平均红细胞体积。
血红蛋白浓度
在一些实施方案中，工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)具有与野生型未经处理的去核红系细胞或去核细胞类似的血红蛋白含量。在一些实施方案中，工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)包含至少约20、22、24、26、28、或30pg，以及任选地多至约30pg的总血红蛋白。在一些实施方案中，使用国际专利公开No.WO2015/073587的实施例33的Drabkin试剂方法来测定血红蛋白水平，其全文以引用方式并入本文。
磷脂酰丝氨酸含量
在一些实施方案中，工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)在其细胞膜的外小叶上具有与野生型未经处理的红系细胞或去核细胞大致相同的磷脂酰丝氨酸含量。磷脂酰丝氨酸主要处于野生型未经处理的红系细胞的细胞膜的内小叶上，并且低渗性负载可致使磷脂酰丝氨酸分布至外小叶，此处其可触发免疫应答。在一些实施方案中，工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)的群体包含小于约30、25、20、15、10、9、8、6、5、4、3、2、或1％的对膜联蛋白V染色呈阳性的细胞。在一些实施方案中，通过对优先结合至PS的膜联蛋白-V-FITC染色，并且通过流式细胞术测量FITC荧光来评估磷脂酰丝氨酸暴露，例如使用国际专利公开No.WO2015/073587的实施例54的方法，其全文以引用方式并入本文。
其他特征
在一些实施方案中，工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞、或工程化红系细胞或去核细胞的群体包含内源性GPA(C235a)、转铁蛋白受体(CD71)、band 3(CD233)、或整联蛋白α4(C49d)中的一种或多种(例如，全部)。例如，如国际专利公开No.WO2018/009838的实施例10中所述测量这些蛋白质，其全文以引用方式并入本文。GPA阳性细胞和band 3阳性细胞的百分比通常在红系细胞的成熟期间增加，并且整联蛋白α4阳性的百分比通常在整个成熟过程中保持较高。
在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞的群体包含至少约50％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的GPA+(即CD235a+)细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞的群体包含约50％至约100％(例如，约60％至约100％、约65％至约100％、约70％至约100％、约75％至约100％、约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％、约75％至约99％、约80％至约99％、约85％至约99％、约90％至约99％、约95％至约99％、约75％至约95％、约80％至约95％、约85％至约95％、约90％至约95％、约95％至约98％)的GPA+细胞。在一些实施方案中，使用FACS来检测GPA的存在。
在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞的群体包含至少约50％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的CD71+细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞的群体包含约70％至约100％(例如，约75％至约100％、约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％、约75％至约99％、约80％至约99％、约85％至约99％、约90％至约99％、约95％至约99％、约75％至约95％、约80％至约95％、约85％至约95％、约90％至约95％、约95％至约98％)的CD71+细胞。在一些实施方案中，使用FACS来检测CD71(转铁蛋白受体)的存在。
在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞的群体包含至少约50％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的CD233+细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞的群体包含约70％至约100％(例如，约75％至约100％、约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％、约75％至约99％、约80％至约99％、约85％至约99％、约90％至约99％、约95％至约99％、约75％至约95％、约80％至约95％、约85％至约95％、约90％至约95％、约95％至约98％)的CD233+细胞。在一些实施方案中，使用FACS来检测CD233(band 3)的存在。
在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞的群体包含至少约50％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的CD47+细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞的群体包含约70％至约100％(例如，约75％至约100％、约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％、约75％至约99％、约80％至约99％、约85％至约99％、约90％至约99％、约95％至约99％、约75％至约95％、约80％至约95％、约85％至约95％、约90％至约95％、约95％至约98％)的CD47+细胞。在一些实施方案中，使用FACS来检测CD47(整联蛋白缔合蛋白)的存在。
在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞的群体包含至少约50％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的CD36-(CD36-阴性)细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞的群体包含约70％至约100％(例如，约75％至约100％、约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％、约75％至约99％、约80％至约99％、约85％至约99％、约90％至约99％、约95％至约99％、约75％至约95％、约80％至约95％、约85％至约95％、约90％至约95％、约95％至约98％)的CD36-(CD36-阴性)细胞。在一些实施方案中，使用FACS来检测CD36的存在。
在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞的群体包含至少约50％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的CD34-(CD34-阴性)细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞的群体包含约70％至约100％(例如，约75％至约100％、约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％、约75％至约99％、约80％至约99％、约85％至约99％、约90％至约99％、约95％至约99％、约75％至约95％、约80％至约95％、约85％至约95％、约90％至约95％、约95％至约98％)的CD34-(CD34-阴性)细胞。在一些实施方案中，使用FACS来检测CD34的存在。
在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞的群体包含至少约50％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的CD235a+/CD47+/CD233+细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞的群体包含约70％至约100％(例如，约75％至约100％、约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％、约75％至约99％、约80％至约99％、约85％至约99％、约90％至约99％、约95％至约99％、约75％至约95％、约80％至约95％、约85％至约95％、约90％至约95％、约95％至约98％)的CD235a+/CD47+/CD233+细胞。
在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞的群体包含至少约50％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的CD235a+/CD47+/CD233+/CD34-/CD36-细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞的群体包含约70％至约100％(例如，约75％至约100％、约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％、约75％至约99％、约80％至约99％、约85％至约99％、约90％至约99％、约95％至约99％、约75％至约95％、约80％至约95％、约85％至约95％、约90％至约95％、约95％至约98％)的CD235a+/CD47+/CD233+/CD34-/CD36-细胞。
在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞(包括红系细胞)的群体包含小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、或1％的棘状红细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞的群体包含小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、或1％红细胞(pyrenocytes)。
通用型供体红系细胞
在一些实施方案中，本文所述的红系细胞或去核细胞对于细胞所给药的受试者而言是自体的和/或同种异体的。例如，与受试者同种异体的红系细胞包括一种或多种血型特异性红系细胞(例如，细胞可为与受试者相同的血型)或一种或多种通用型供体红系细胞。在一些实施方案中，与参比细胞相比，本文所述的去核红系细胞具有降低的免疫原性，例如具有降低水平的一种或多种血型抗原。
在同种异体细胞用于输血的情况下，可以选择相容的ABO血型以防止急性血管内溶血性输血反应。ABO血型基于血型抗原A和B的存在与否、在与红细胞表面上的糖蛋白和糖脂相关联的寡糖链末端处存在的单糖碳水化合物结构来定义(综述于Liu等人(2007)Nat.Biotech.25:454-64)。由于O型红细胞既不含有A抗原也不含有B抗原，它们可以安全地输入任何ABO血型的接受者，例如A、B、AB或O型接受者。认为O型红细胞是普遍的，并且可用于所有输血。因此，在一些实施方案中，本文所述的红系细胞是O型。相比之下，A型红系细胞可以给予A和AB型接受者，B型红系细胞可以给予B和AB型接受者，并且AB型红系细胞可以给予AB型接受者。
在某些情况下，将非O型红系细胞转化为通用血型可为有益的。A型和B型红细胞表面上免疫显性单糖的酶促移除可用于生成O型样红系细胞群体(参见例如Liu等人(2007))。可以使用来自绿咖啡豆的α-半乳糖苷酶转化B型红系细胞。另选地或除此之外，得自脑膜败血伊丽莎白菌(E.meningosepticumbacteria)的α-N-乙酰基半乳糖氨酶和α-半乳糖苷酶酶活性可分别用于移除免疫显性A和B抗原(Liu等人(2007))，如果存在于红系细胞上的话。在一个实例中，在26℃下，在α-N-乙酰基半乳糖氨酶和α-半乳糖苷酶(约300μg/ml浓集红系细胞)的存在下，将如本文所述分离的浓集红系细胞在200mM甘氨酸(pH 6.8)和3mM NaCl中孵育60分钟。在处理之后，将红系细胞用盐水离心冲洗3-4次来洗涤，并根据标准血库技术进行ABO分型。
虽然ABO血型系统在输血和移植中最为重要，但在一些实施方案中，有用的是匹配待施用的红系细胞与接受者之间的其他血型，或者选择或制备对于一种或多种其他(例如次要)血型通用的红系细胞。第二血型是Rh系统，其中个体可为Rh+或Rh-。因此，在一些实施方案中，本文所述的红系细胞为Rh-。在一些实施方案中，红系细胞为O和Rh-型。
在一些实施方案中，本文所述的红系细胞对于一种或多种次要血型抗原呈阴性，例如Le(a-b-)(对于路易斯抗原系统)、Fy(a-b-)(对于达菲系统)、Jk(a-b-)(对于基德系统f)、M-N-(对于MNS系统)、K-k-(对于凯尔系统)、Lu(a-b-)(对于卢氏系统)，以及H-抗原阴性(孟买表型)、或它们的任何组合。在一些实施方案中，红系细胞也为O和/或Rh-型。次要血型描述于例如Agarwal等人(2013)Blood Res.48(1):51-4和Mitra等人(2014)IndianJAnaesth.58(5):524-8，其各自全文以引用方式并入本文。
分离红细胞
可以使用例如各种方法，如细胞洗涤器、连续流细胞分离器、密度梯度分离、荧光活化细胞分选术(FACS)、Miltenyi免疫磁性消减(MACS)、或这些方法的组合来分离成熟红细胞(参见例如van der Berg等人(1987)Clin.Chem.33:1081-2；Bar-Zvi等人(1987)J.Biol.Chem.262:17719-23；Goodman等人(2007)Exp.Biol.Med.232:1470-6)。
可通过简单离心从全血中分离红细胞(参见例如van der Berg等人(1987))。例如，可将EDTA抗凝全血在4℃下以800xg离心10分钟。移除富血小板血浆和血沉棕黄层，并用等渗盐溶液(NaCl，9g/L)洗涤红血细胞三次。
或者，可使用密度梯度离心，用例如各种分离介质，如Ficoll、Hypaque、Histopaque、Percoll、Sigmacell或它们的组合来分离红细胞。例如，将一定体积的Histopaque-1077铺层在等体积的Histopaque-1119顶部上。将用等体积的等渗盐溶液(NaCl，9g/L)以1:1稀释的EDTA抗凝全血铺层在Histopaque的顶部上，并将样品在室温下以700xg离心30分钟。在这些条件下，粒细胞迁移到1077/1119界面，淋巴细胞、其他单核细胞和血小板保留在血浆/1077界面处，并且红血细胞沉淀。用等渗盐溶液洗涤红血细胞两次。
或者，可通过使用Percoll分级梯度离心来分离红细胞(参见例如Bar-Zvi等人(1987))。例如，将新鲜血液与含有75mM柠檬酸钠和38mM柠檬酸的抗凝剂溶液混合，并将细胞在HEPES缓冲盐水中短暂洗涤。通过用α-纤维素和Sigmacell(1:1)的混合物吸附来移除白细胞和血小板。通过在Sorvall SS34转子中以2500rpm通过45/75％Percoll分级梯度离心10分钟，从网织红细胞和残余白血细胞中进一步分离红细胞。在沉淀中回收红细胞，而网织红细胞带处于45/75％界面，并且剩余白血细胞带处于0/45％界面。通过用Hepes缓冲盐水洗涤数次从红细胞中移除Percoll。可用于生成分离红细胞的密度梯度的其他材料包括OPTIPREP、60％碘克沙醇水溶液(得自Axis-Shield,Dundee,Scotland)。
例如使用流式细胞术，从网织红细胞中分离红细胞(参见例如Goodman等人(2007))。在这种情况下，对全血进行离心(550x g，20分钟，25℃)以从血浆中分离细胞。将细胞沉淀物再悬浮于磷酸盐缓冲盐水溶液中，并例如通过离心(400x g，30分钟，25℃)在Ficoll-Paque(1.077密度)上进一步分级，以从白血细胞中分离红细胞。将所得细胞沉淀物再悬浮于补充有10％胎牛血清的RPMI中，并基于尺寸和颗粒度在例如FACS仪器，如BectonDickinson FACSCalibur(BD Biosciences,Franklin Lakes,N.J.,USA)上分选。
可通过免疫磁性消减来分离红细胞(参见例如Goodman等人(2007))。在这种情况下，使用具有细胞类型特异性抗体的磁珠来消除非红细胞。例如，使用如本文所述的密度梯度从大部分其他血液组分中分离红细胞，继之以任何残余网织红细胞的免疫磁性消减。将细胞用人抗体血清在25℃下预处理20分钟，然后用例如抗网织红细胞特异性抗原如CD71和CD36的抗体来处理。抗体可直接附着至磁珠，或者缀合至PE，例如，具有抗PE抗体的磁珠将与之反应。抗体-磁珠复合物能够例如从红细胞群体中选择性地提取残余网织红细胞。
也可使用单采血液成分法来分离红细胞。单采血液成分法的过程涉及从受试者或供体取出全血，使用离心或细胞分选来分离血液组分，抽出一个或多个分离的部分，并将剩余组分输回到受试者或供体中。例如，目前有许多仪器用于此目的，如得自Baxter(Deerfield,Ill.,USA)的Amicus和Alyx仪器、得自BCT(Lakewood,Colo.,USA)的TrimaAccel仪器，以及得自Haemonetics(Braintree,Mass.,USA)的MCS+9000仪器。可能需要额外的纯化方法以实现适当程度的细胞纯度。
网织红细胞是未成熟红血细胞，并且大约占人体红血细胞的1％。网织红细胞在骨髓中发育和成熟。一旦释放到循环中，网织红细胞就迅速经历终末分化为成熟红细胞。与成熟红细胞一样，网织红细胞没有细胞核。与成熟红细胞不同，网织红细胞保持执行蛋白质合成的能力。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含去核网织红细胞。
基于网织红细胞成熟时细胞密度的差异，可从外周血中分离不同年龄的网织红细胞。可通过各种密度梯度使用差速离心从外周血中分离网织红细胞。例如，Percoll梯度可用于分离网织红细胞(参见例如Noble等人,Blood74:475-481(1989))。密度为1.096和1.058g/ml的无菌等渗Percoll溶液通过将Percoll(Sigma-Aldrich,Saint Louis,Mo.,USA)稀释至10mM三乙醇胺、117mM NaCl、5mM葡萄糖和1.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的最终浓度来制备。这些溶液具有295至310mOsm的摩尔渗透压浓度。将例如五毫升的第一Percoll溶液(密度1.096)添加到无菌15ml锥形离心管中。将例如两毫升的第二Percoll溶液(密度1.058)铺层在较高密度的第一Percoll溶液上。将两至四毫升的全血铺层在管的顶部。将管在具有摆动式管支架的冷冻离心机中以250xg离心30分钟。网织红细胞和一些白细胞迁移到两个Percoll层之间的界面。将界面处的细胞转移到新管中，用含有5mM葡萄糖、0.03mM叠氮化钠和1mg/ml BSA的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次。在尺寸排阻柱上的PBS中通过色谱法移除残余的白血细胞。
或者，网织红细胞可使用免疫磁性分离方法通过阳性选择来分离(参见例如Brun等人(1990)Blood 76:2397-403)。该方法利用的大量的转铁蛋白受体，该转铁蛋白受体关于成熟前的红细胞在网织红细胞表面上表达。包被有转铁蛋白受体抗体的磁珠可用于从混合血细胞群体中选择性地分离网织红细胞。多种哺乳动物物种(包括人类)的转铁蛋白受体抗体可获自商业来源(例如，Affinity BioReagents,Golden,Colo.,USA；Sigma-Aldrich,Saint Louis,Mo.,USA)。转铁蛋白抗体可直接连接至磁珠。或者，转铁蛋白抗体可经由第二抗体间接地连接至磁珠。例如，可将抗人转铁蛋白的小鼠单克隆抗体10D2(AffinityBioReagents,Golden,Colo.,USA)与包被有绵羊抗小鼠免疫球蛋白G(Dynal/Invitrogen,Carlsbad,Calif.,USA)的免疫磁珠混合。然后将免疫磁珠与去除白细胞的红血细胞级分一起孵育。将珠和红血细胞在22℃和温和混合下孵育60-90分钟，然后使用磁场分离具有附着的网织红细胞的珠。可使用例如DETACHaBEAD溶液(得自Invitrogen,Carlsbad,Calif.,USA)从磁珠移除分离的网织红细胞。或者，可使用本文所述的方法从体外生长和成熟的CD34+造血干细胞中分离网织红细胞。
可将终末分化的去核红细胞与其他细胞基于它们的DNA含量分离。在非限制性实例中，首先用活体DNA染料如Hoechst 33342(Invitrogen Corp.)对细胞进行标记。Hoechst33342是渗透细胞的核复染剂，当与双链DNA结合时发出蓝色荧光。培养物中未分化前体细胞、巨噬细胞或其他有核细胞由Hoechst 33342染色，而去核红细胞为Hoechst阴性。通过使用荧光活化细胞分选仪或其他细胞分选技术，可从去核红细胞中分离Hoechst阳性细胞。可通过透析或其他合适的方法从分离的红细胞中移除Hoechst染料。
本文所述的多肽的媒介物
虽然在本文的许多实施方案中，一种或多种(例如，两种或更多种)外源性多肽位于红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)之上或之中，但是应理解，本文所述的任何多肽或外源性多肽的组合也可位于另一种媒介物之上或之中。媒介物可以包括例如细胞、红系细胞、微体、纳米粒子、胶束、脂质体、或外来体。例如，在一些方面，本公开提供了一种媒介物(例如，细胞、红系细胞、微体、纳米粒子、胶束、脂质体、或外来体)，该媒介物例如在其表面上包含本文所述的一种或多种试剂。在一些实施方案中，一种或多种试剂包含选自本文所述的外源性多肽、或其片段或变体的试剂。在一些实施方案中，媒介物包含两种或更多种本文所述的试剂，例如，本文所述的任何试剂对。
在一些实施方案中，媒介物包含工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞。
异质细胞群体
虽然在本文的许多实施方案中，一种或多种(例如，两种或更多种)外源性多肽位于单个细胞之上或之中，但应当理解，本文所述的任何多肽或多肽的组合也可位于多个细胞上。例如，在一些方面，本公开提供了多个红系细胞或去核细胞，其中多个中的第一细胞包含第一外源性多肽(例如，包含第一外源性抗原性多肽、外源性抗原呈递多肽、外源性共刺激多肽、外源性共抑制多肽、细胞因子和外源性Treg共刺激多肽、或它们的组合)，并且多个中的第二细胞包含第二外源性多肽(例如，包含第二外源性抗原性多肽、外源性抗原呈递多肽、外源性共刺激多肽、外源性共抑制多肽、细胞因子和外源性Treg共刺激多肽、或它们的组合)。在一些实施方案中，多个细胞包含本文所述的两种或更多种多肽，例如本文所述的任何多肽对。在一些实施方案中，多个中的小于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％、或1％的细胞包含第一外源性多肽和第二外源性多肽两者。
膜中包封的细胞
在一些实施方案中，工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)、或本文所述的其他媒介物包封在膜(例如，半透膜)中。在一些实施方案中，膜包含多糖，例如阴离子多糖藻酸盐。在一些实施方案中，半透膜不允许细胞通过，但允许小分子或大分子例如代谢物、蛋白质或DNA通过。在一些实施方案中，膜描述于Lienert等人(2014)Nat.Rev.Mol.Cell Biol.15:95-107中，其全文以引用方式并入本文。
红细胞前体细胞
本文提供了工程化红细胞前体细胞，以及制备工程化红细胞前体细胞的方法。
多能干细胞可通过红血球生成过程产生红细胞。干细胞看起来像小淋巴细胞并且缺乏红细胞的功能能力。干细胞具有无限分裂的能力，这是成熟细胞所缺乏的。由干细胞产生的一些子细胞经过数代和时间推移获得红系特性。骨髓中的大多数红系细胞具有不同的形态，但即使在未获得红系谱系特有的形态特征的细胞中，也观察到红系成熟的承诺。这些细胞由它们在体外形成的集落类型识别。两种此类细胞得到识别。爆式红系集落形成单位(BFU-E)由干细胞产生并且产生红系集落形成单位(CFU-E)。CFU-E产生原红细胞，即具有不同形态的最不成熟的红系细胞。BFU-E和CFU-E形成极小比例的骨髓细胞。在用罗曼诺夫斯基(Romanovsky)染色剂染色的骨髓中可鉴定到形态学上的五种红系前体。从最不成熟到最成熟的五个阶段是原成红细胞、嗜碱性正成红细胞(早期成红细胞)、多染性正成红细胞(中期成红细胞)、正染性正成红细胞(晚期成红细胞)和网织红细胞。BFU-E(爆式红系集落形成单位)、CFU-E(红系集落形成单位)、原红细胞(原成红细胞)、嗜碱性正成红细胞、多染性正成红细胞和正染性正成红细胞是谱系限制性的。
下表15汇总了红细胞前体细胞的形态特征。
表15
Figure BDA0003302151970001621
Figure BDA0003302151970001631
正常人红细胞表达CD36、单核细胞、血小板和内皮细胞的粘附分子(vanSchravendijk等人(1992)Blood 80(8):2105-14)。因此，在一些实施方案中，抗CD36抗体可用于鉴定人红细胞。
本领域已知能够分化成红细胞的任何类型的细胞，即任何红细胞前体细胞，可以根据本文所述的方法进行修饰以产生工程化红细胞前体细胞。在某些实施方案中，根据本文所述的方法修饰的红细胞前体细胞是处于分化为红细胞的过程中的细胞，即，细胞是已知在哺乳动物红血球生成期间存在的类型。例如，细胞可为多能造血干细胞(HSC)或CD34+细胞、多能骨髓祖细胞、CFU-S细胞、BFU-E细胞、CFU-E细胞、原红细胞(原成红细胞)、嗜碱性正成红细胞、多染性正成红细胞或正染性正成红细胞。可以使用本领域已知的方法，即，使用已知促进红血球生成的分子，例如下文所述的SCF、促红细胞生成素、IL-3和/或GM-CSF，使本文所提供的经修饰红细胞前体细胞在体外分化为工程化去核红系细胞(例如，网织红细胞或红细胞)。或者，经修饰红细胞前体细胞提供于如本文所述的组合物中，并且在给药于受试者后能够在体内分化为红细胞。
培养
用于生成本文所述的工程化红系细胞的来源包括循环红系细胞。从如本文所述的受试者中，合适的细胞来源可分离自受试者衍生的造血或红系前体细胞，衍生自无限增殖化红系细胞系、或衍生自诱导多能干细胞，任选地培养和分化。使用细胞培养技术生成红细胞的方法在本领域中是公知的，例如Giarratana等人(2011)Blood 118:5071-9，Huang等人(2014)和Kurita等人(2013)PLOS One 8:e59890。方案根据生长因子、起始细胞系、培养期，以及所得细胞的特征即形态性状而变化。针对可替代供体输血的血液制品，也建立了培养系统(Fibach等人(1989)Blood 73:100-3)。
本文提供了红系细胞和工程化红系细胞的培养方法。红系细胞可由造血祖细胞培养，包括例如CD34+造血祖细胞(Giarratana等人(2011))、诱导多能干细胞(Kurita等人(2013))和胚胎干细胞(Hirose等人(2013)Stem Cell Reports1:499-508)。适于扩增和分化祖细胞的生长和分化因子的混合物是本领域已知的。合适的扩增和分化因子的实例包括但不限于干细胞因子(SCF)、白介素(IL)如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、CSF、G-CSF、促血小板生成素(TPO)、GM-CSF、促红细胞生成素(EPO)、Flt3、Flt2、PIXY 321和白血病抑制因子(LIF)。
通过在多步培养过程中使祖细胞与限定因子接触，可以由造血祖细胞如CD34+细胞培养红系细胞。例如，在一些实施方案中，红系细胞可在以下概述的三步过程中由造血祖细胞培养。
第一步骤可包括将培养中的细胞与1-1000ng/mL的干细胞因子(SCF)、1-100U/mL的促红细胞生成素(EPO)和0.1-100ng/mL的白介素-3(IL-3)接触。第一步骤任选地包括使培养中的细胞与结合并活化例如核激素受体(如糖皮质激素受体、雌激素受体、孕酮受体、雄激素受体或孕烷X受体)的配体接触。这些受体的配体包括例如皮质类固醇，如10nM-100μM的地塞米松或10nM-100μM的氢化可的松；例如雌激素，如10nM-100μM的β-雌二醇；例如孕激素，如10nM-100μM的孕酮、10nM-100μM的羟孕酮、10nM-100μM的5a-二氢孕酮、10nM-100μM的11-脱氧皮质酮、或例如合成孕激素，如10nM-100μM的醋酸氯地孕酮；例如雄激素，如10nM-100μM的睾酮、10nM-100μM的二氢睾酮或10nM-100μM的雄烯二酮；或例如孕烷x受体配体，如10nM-100μM的利福平、10nM-100μM贯叶金丝桃素、10nM-100μM的圣约翰草(St.John'sWort)(金丝桃素)、或例如维生素E样分子，如10nM-100μM的生育酚。第一步骤还可任选地包括使培养中的细胞与例如胰岛素样分子，如1-50μ.g/mL的胰岛素、1-50μg/mL的胰岛素样生长因子1(IGF-1)、1-50μg/mL的胰岛素样生长因子2(IGF-2)、或1-50μg/mL的机械生长因子接触。第一步骤还可任选地包括使培养中的细胞与0.1-5mg/mL的转铁蛋白接触。
第一步骤可任选地包括使培养中的细胞与例如一种或多种白介素(IL)或生长因子，如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、促血小板生成素、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-B)、肿瘤坏死因子α(TNF-A)、巨核细胞生长发育因子(MGDF)、白血病抑制因子(LIF)和Flt3配体接触。各白介素或生长因子可通常以0.1-100ng/mL的浓度供应。第一步骤还可任选地包括使培养中的细胞与例如血清蛋白或非蛋白分子，如胎牛血清(1-20％)、人血浆(1-20％)、人血浆蛋白粉(1-20％)、人血清(1-20％)、白蛋白(0.1-100mg/mL)、或肝素(0.1-10U/mL)接触。
第二步骤可包括使培养中的细胞与1-1000ng/mL的干细胞因子(SCF)和1-100U/mL的促红细胞生成素(EPO)接触。第二步骤还可任选地包括使培养中的细胞与例如胰岛素样分子，如1-50μg/mL的胰岛素、1-50μg/mL的胰岛素样生长因子1(IGF-1)、1-50μg/mL的胰岛素样生长因子2(IGF-2)、或1-50μg/mL的机械生长因子接触。第二步骤还可任选地包括使培养中的细胞与0.1-5mg/mL的转铁蛋白接触。第二步骤还可任选地包括使培养中的细胞与例如血清蛋白或非蛋白分子，如胎牛血清(1-20％)、人血浆(1-20％)、人血浆蛋白粉(1-20％)、人血清(1-20％)、白蛋白(0.1-100mg/mL)、或肝素(0.1-10U/mL)接触。
第三步骤可包括使培养中的细胞与1-100U/mL的促红细胞生成素(EPO)接触。第三步骤可任选地包括使培养中的细胞与1-1000ng/mL的干细胞因子(SCF)接触。第三步骤还可任选地包括使培养中的细胞与例如胰岛素样分子，如1-50μg/mL的胰岛素、1-50μg/mL的胰岛素样生长因子1(IGF-1)、1-50μg/mL的胰岛素样生长因子2(IGF-2)、或1-50μg/mL的机械生长因子接触。第三步骤还可任选地包括使培养中的细胞与0.1-5mg/mL的转铁蛋白接触。第三步骤还可任选地包括使培养中的细胞与例如血清蛋白或非蛋白分子，如胎牛血清(1-20％)、人血浆(1-20％)、人血浆蛋白粉(1-20％)、人血清(1-20％)、白蛋白(0.1-100mg/mL)、或肝素(0.1-10U/mL)接触。
在一些实施方案中，扩增和分化呈递一种或多种外源性多肽的工程化红系细胞的方法不包括在包含骨髓增生受体(mpl)配体的培养基中培养工程化红系细胞。
培养过程可任选地包括通过本领域已知的方法使细胞与活化或敲低一个或多个基因的分子，例如DNA分子、RNA分子、mRNA、siRNA、微小RNA、lncRNA、shRNA、激素、或小分子接触。靶基因可包括例如编码转录因子、生长因子或生长因子受体(包括但不限于例如GATA1、GATA2、CMyc、hTERT、p53、EPO、SCF、胰岛素、EPO-R、SCF-R、转铁蛋白-R、胰岛素-R)的基因。
在一些实施方案中，将CD34+细胞置于含有不同量的IMDM、FBS、谷氨酰胺、BSA、全转铁蛋白、胰岛素、地塞米松、β-雌二醇、IL-3、SCF和促红细胞生成素的培养物中，在三个独立的分化阶段中进行共22天。
在一些实施方案中，将CD34+细胞置于含有不同量的IMDM、FBS、谷氨酰胺、BSA、全转铁蛋白、胰岛素、地塞米松、β-雌二醇、IL-3、SCF和促血小板生成素的培养物中，在三个独立的分化阶段中进行共14天。
在一些实施方案中，将CD34+细胞置于含有不同量的IMDM、FBS、谷氨酰胺、BSA、全转铁蛋白、胰岛素、地塞米松、β-雌二醇、IL-3、SCF和GCSF的培养物中，在三个独立的分化阶段中进行共15天。
在一些实施方案中，红系细胞扩增至少100、1000、2000、5000、10,000、20,000、50,000、或100,000倍(并任选地多至100,000、200,000、或500,000倍)。在一些实施方案中，使用自动细胞计数器来测量细胞的数量。
在一些实施方案中，在培养期间可能希望在体外仅部分地分化红系前体细胞，例如造血干细胞，从而允许在引入受试者体内时发生进一步分化，例如分化为网织红细胞或完全成熟的红细胞(参见例如Neildez-Nguyen等人(2002)Nature Biotech.20:467-72)。应当理解，在如本文所述的各种实施方案中，体外成熟和/或分化可在任何期望的阶段停止。例如，分离的CD34+造血干细胞可例如在含有各种因子的培养基中如本文别处所述在体外扩增，以达到期望的分化阶段，所述因子包括例如白介素3、Flt3配体、干细胞因子、促血小板生成素、促红细胞生成素、转铁蛋白和胰岛素生长因子。所得的工程化红系细胞的特征可在于CD36和GPA的表面表达，以及对特定期望的细胞类型特异性的其他特征，并且可输注到受试者中，在该受试者中允许发生向成熟红细胞的终末分化。
在一些实施方案中，工程化红系细胞在去核之前(但不包括去核)由红系前体细胞部分地扩增至任何成熟阶段，并因此保留有核细胞，例如红细胞前体细胞。在某些实施方案中，所得的细胞是有核的并且是红系谱系限制性的。在某些实施方案中，所得的细胞选自多能骨髓祖细胞、CFU-S细胞、BFU-E细胞、CFU-E细胞、原红细胞(原成红细胞)、嗜碱性正成红细胞、多染性正成红细胞和正染性正成红细胞。最终分化步骤(包括去核)仅在将工程化红系细胞给药于受试者之后发生，即在此类实施方案中，去核步骤在体内发生。在其他实施方案中，通过去核阶段，工程化红系细胞在体外扩增和分化成为例如网织红细胞。在工程化红系细胞分化至网织红细胞阶段的此类实施方案中，最终分化成为红细胞的步骤仅在将工程化红系细胞给药于受试者之后发生，即终末分化步骤在体内发生。在其他实施方案中，工程化红系细胞通过终末分化成为红细胞的阶段在体外扩增和分化。
还将认识到，在一些实施方案中，工程化红系细胞可从红系前体细胞(例如造血干细胞)扩增和分化，以变成例如不同谱系的造血细胞，如变成血小板。用于使各种谱系的造血细胞如血小板成熟和分化的方法是本领域的技术人员公知的。表达如本文所述的外源性多肽的此类工程化血小板认为涵盖在本公开内容中。
在一些实施方案中，本文所提供的去核细胞是血小板。在体外制造血小板的方法是本领域已知的(参见例如Wang和Zheng(2016)Springerplus 5(1):787和美国专利No.9,574,178)。制造包含外源性多肽的血小板的方法描述于例如国际专利申请公开No.WO2015/073587和WO2015/153102中，其各自全文以引用方式并入。血小板产生部分地由信号转导机制调节，该信号转导机制由促血小板生成素(TPO)与其细胞受体TPOR/MPUc-MPL之间的相互作用诱导。此外，多种细胞因子(例如，干细胞因子(SCF)、IL-1、IL-3、IL-6、IL-11、白血病抑制因子(LIF)、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、促红细胞生成素(EPO)、kit配体和干扰素)已显示具有血小板生成活性。
在一些实施方案中，血小板由造血祖细胞如CD34+造血干细胞、诱导多能干细胞或胚胎干细胞生成。在一些实施方案中，通过在多步培养过程中使祖细胞与限定因子接触来产生血小板。在一些实施方案中，多步培养方法包括：在适于产生巨核细胞祖细胞群体的条件下培养造血祖细胞群体，并且在适于产生血小板的条件下培养巨核细胞祖细胞群体。适于扩增和分化祖细胞并产生血小板的生长和分化因子的混合物是本领域已知的。合适的扩增和分化因子的实例包括但不限于干细胞因子(SCF)、Flt-3/Flk-2配体(FL)、TPO、IL-11、IL-3、IL-6和IL-9。例如，在一些实施方案中，可通过在无血清培养基中以2-4x104个细胞/mL接种CD34+HSC，并在培养第4天，通过添加等体积的培养基更新培养基来产生血小板。在培养第6天，对细胞计数并分析：将1.5x105个细胞洗涤并置于1mL的补充有包含TPO(30ng/mL)、SCF(1ng/mL)、IL-6(7.5ng/mL)和IL-9(13.5ng/mL)的细胞因子混合物的相同培养基中以诱导巨核细胞分化。在培养第10天，用新鲜培养基替代约四分之一至约二分之一的悬浮培养物。将细胞在潮湿气氛(10％CO2)中于39℃培养前6个培养日，并且在37℃下培养最后8个培养日。在台盼蓝染色后，用血细胞计数器计数活有核细胞。可通过流式细胞术或定量PCR来评估培养中的血小板的分化状态，如国际专利申请公开No.WO2015/073587的实施例44和45中所述，其以引用方式并入本文。
外源性多肽的表达
在一些实施方案中，本文所述的工程化红系细胞通过使合适的分离细胞，例如有核红系细胞、红系前体细胞、或有核血小板前体细胞与编码本公开的多肽(例如，外源性抗原呈递多肽、外源性抗原性多肽、外源性共抑制多肽、细胞因子和外源性Treg共刺激多肽、或它们的组合)的外源性核酸接触而生成。
在一些实施方案中，外源性多肽由DNA编码，该DNA与有核红系前体细胞或有核血小板前体细胞接触。在一些实施方案中，外源性多肽由RNA(例如，mRNA)编码，该RNA与有核红系细胞、红系前体细胞、有核血小板前体细胞接触。
在一些实施方案中，使外源性多肽与血小板、有核红系细胞、红系前体细胞、有核血小板前体细胞、网织红细胞、或红细胞接触。
在一些实施方案中，外源性多肽包含表位标签序列，其可为HA-标签、绿荧光蛋白标签、Myc-标签、几丁质结合蛋白、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、聚(His)标签、硫氧还蛋白、聚(NANP)、FLAG-标签、V5-标签、AviTag、钙调蛋白-标签、多聚谷氨酸盐-标签、E-标签、S-标签、SBP-标签、Softag-1、Softag-3、Strep-标签、TC-标签、VSV-标签、Xpress-标签、Isopeptag、SpyTag、生物素羧基载体蛋白、Nus-标签、Fc-标签、或Ty-标签中的一种或组合。在一些实施方案中，编码外源性多肽的外源性核酸包含与表位标签序列(例如，在N末端C末端)融合的外源性多肽的基因序列的3’端，该表位标签序列可为以下中的一种或组合：HA-标签、绿荧光蛋白标签、Myc-标签、几丁质结合蛋白、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、聚(His)标签、硫氧还蛋白、聚(NANP)、FLAG-标签、V5-标签、AviTag、钙调蛋白-标签、多聚谷氨酸盐-标签、E-标签、S-标签、SBP-标签、Softag-1、Softag-3、Strep-标签、TC-标签、VSV-标签、Xpress-标签、Isopeptag、SpyTag、生物素羧基载体蛋白、Nus-标签、Fc-标签、或Ty-标签。在一些实施方案中，外源性多肽包含表位标签，如HA表位标签(YPYDVPDYA(SEQ IDNO:27))、cMyc标签(EQKLISEEDL(SEQ ID NO:28))、或Flag标签(DYKDDDDK(SEQ ID NO:29))。表位标签可用于使用针对表位标签的抗体通过流式细胞术、Western印迹或免疫沉淀容易地检测和定量表达。
外源性多肽可由通过电穿孔、化学或聚合转染、病毒转导、机械膜破裂、或其他方法引入红系细胞中的转基因表达；外源性多肽由通过电穿孔、化学或聚合转染、病毒转导、机械膜破裂、或其他方法引入细胞中的mRNA表达；外源性多肽通过引入外部因子，例如转录激活因子、转录抑制因子、或分泌途径增强子由天然基因座过表达；并且/或者多肽由生产细胞或其他外部系统合成、提取、或产生并且引入红系细胞中。
在某些实施方案中，引入步骤包括病毒转导。在一些实施方案中，引入步骤包括电穿孔。在其他实施方案中，引入步骤包括利用以下中的一种或多种：脂质体介导的转移、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、基于逆转录病毒的载体、脂质转染和慢病毒载体。
在一些实施方案中，引入步骤包括通过慢病毒载体转染而引入编码第一外源性多肽的第一外源性核酸。
编码外源性多肽(例如，外源性抗原呈递多肽、外源性共刺激多肽、外源性共抑制多肽、细胞因子和外源性Treg共刺激多肽)的外源性核酸(例如，包含DNA或RNA)可通过基因的单拷贝或多拷贝转染、病毒转导、或电穿孔而引入。用于在哺乳动物细胞中表达外源性蛋白的方法是本领域公知的。例如，通过CD34+祖细胞的病毒转导来诱导造血细胞中外源因子IX的表达，参见Chang等人(2006)Nat.Biotechnol.24:1017-21。
在一些实施方案中，DNA或RNA是密码子优化的。
在一些实施方案中，两种或更多种多肽在单一核酸，例如单一载体中编码。在一些实施方案中，单一载体对各基因具有单独的启动子，使得两种蛋白质初始转录成在中间具有蛋白酶切割位点的单一多肽，以便后续蛋白酶解加工产生两种蛋白质、或任何其他合适的构型。在一些实施方案中，当存在多于一种多肽(例如两种或更多种)时，多肽可以在单一核酸，例如单一载体中编码。当外源性免疫原性多肽、外源性抗原呈递多肽、外源性共抑制多肽、细胞因子和外源性Treg共刺激多肽、或它们的组合由相同的外源性核酸(例如，载体)编码时，存在多种可能的可用于共表达多肽的亚策略。在一些实施方案中，单一外源性核酸(例如载体)对于编码外源性核酸的各基因具有单独的启动子。在一些实施方案中，外源性核酸编码两种(或更多种)外源性多肽，由此“自剪切”2A元件设置在编码外源性多肽的顺反子之间。据信2A元件的功能是通过使核糖体跳过2A元件的C末端处肽键的合成，从而导致2A序列末端与下游的下一个多肽之间的分离(参见例如Holst等人(2008)Nat.Immunol.6:658-66)。
对于经由两个启动子的双重表达，MSCV启动子可用作第一启动子，并且EF1启动子用作第二启动子，但本公开不限于这两个示例性启动子。另一种策略是通过在编码多肽的两个基因之间插入内部核糖体进入位点(IRES)来表达两种或更多种外源性多肽。又一种策略是将两种或更多种外源性多肽表达为由接头隔开的直接肽融合物。
在一些实施方案中，两种或更多种多肽由两种或更多种外源性核酸编码，例如，每种载体编码一种外源性多肽。
对于经由两个启动子的双重表达，MSCV启动子可用作第一启动子，并且EF1启动子用作第二启动子，但本公开不限于这两个示例性启动子。另一种策略是通过在编码多肽的两个基因之间插入内部核糖体进入位点(IRES)来表达两种或更多种外源性多肽。又一种策略是将两种或更多种外源性多肽表达为由接头隔开的直接肽融合物。
在一些实施方案中，两种或更多种多肽由两种或更多种外源性核酸编码，例如，每种载体编码一种外源性多肽。
在某些实施方案中，使用慢病毒载体，其包含选自以下的启动子：β-珠蛋白启动子、小鼠干细胞病毒(MSCV)启动子、长臂猿白血病病毒(GALV)启动子、人延长因子1α(EF1α)启动子、CAG CMV即刻早期增强剂和鸡β-肌动蛋白(CAG)，以及人磷酸甘油酸激酶1(PGK)启动子。
在一些实施方案中，两种或更多种多肽在两种或更多种核酸中编码，例如，每种载体编码多肽之一。
可将用于产生外源性多肽的核酸如DNA表达载体或mRNA引入适于产生本文所述的外源性多肽的祖细胞(例如，红系细胞祖细胞或血小板祖细胞等)中。祖细胞可从原始来源分离，或者经由如本文所提供的常规重组技术从扩增的祖细胞群获得。在某些情况下，表达载体可设计成使得它们可通过本领域已知的方法通过同源或非同源重组引入细胞的基因组中。
在一些实施方案中，使造血祖细胞，例如CD34+造血干细胞与编码一种或多种外源性多肽的一种或多种核酸接触，并且允许细胞在培养中扩增和分化。
在某些情况下，例如，对于包含一种或多种外源性多肽(外源性免疫原性多肽、外源性抗原呈递多肽、外源性共抑制多肽、细胞因子和外源性Treg共刺激多肽、或它们的组合)的工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)，可选择性地靶向和切割基因组的编码多肽的核酸，例如，CRISPR/Cas9、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)、或锌指核酸酶，用于引导编码外源性多肽的表达载体的外源性核酸插入特定的基因组位置，例如CR1基因座(1q32.2)、血红蛋白基因座(11p15.4)。
在一些实施方案中，可将一种或多种外源性多肽(例如，外源性免疫原性多肽、外源性抗原呈递多肽、外源性共抑制多肽、细胞因子和外源性Treg共刺激多肽、或它们的组合)克隆到用于转染的质粒构建体中。适于产生本文所述的工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)的使表达载体转移到细胞中的方法包括但不限于病毒介导的基因转移、脂质体介导的转移、转化、基因枪、转染和转导，例如病毒介导的基因转移如使用基于DNA病毒(如腺病毒、腺相关病毒和疱疹病毒)的载体，以及基于逆转录病毒的载体。基因转移模式的实例包括例如裸DNA、CaPO4沉淀、DEAE葡聚糖、电穿孔、原生质体融合、脂质转染和细胞微注射。
在一些实施方案中，可将编码各外源性多肽的重组DNA克隆到慢病毒载体质粒中以整合进红系细胞中。在一些实施方案中，慢病毒载体包含编码单一外源性多肽的DNA以整合进红系细胞中。在其他实施方案中，慢病毒载体包含两种、三种、四种或更多种如本文所述的外源性多肽以整合进红系细胞中。在一些实施方案中，可将编码一种或多种外源性多肽的重组DNA克隆到编码可选择性状如抗生素抗性基因的质粒DNA构建体中。在一些实施方案中，可将编码外源性多肽的重组DNA克隆到适于在红系细胞中稳定表达每种重组蛋白的质粒构建体中。
在一些实施方案中，可以采用慢病毒系统，其中将具有外源性多肽序列(例如，一种、两种、三种、四种或更多种外源性多肽序列)的转移载体、包膜载体和/或一种或多种包装载体各自转染到宿主细胞中以用于病毒产生。在一些实施方案中，可以通过磷酸钙沉淀转染、基于脂质的转染、或电穿孔中的任一种将慢病毒载体转染到宿主细胞中，并且孵育过夜。对于外源性多肽序列可伴有荧光报告子的实施方案，可在孵育过夜后检查宿主细胞的荧光检测。可以每8-12小时收获包含病毒颗粒的宿主细胞的培养基2或3次，并且离心以沉积分离的细胞和碎片。然后，可将培养基根据需要直接使用、冷冻或浓缩。
可在允许分化和去核的合适条件下(例如，本文所述的体外培养方法)培养祖细胞，该祖细胞经受编码外源性多肽的外源性核酸转移。
可将分离的红系前体细胞(例如，CD34+造血干细胞)用编码一种或多种外源性多肽(例如，外源性免疫原性多肽、外源性抗原呈递多肽、外源性共抑制多肽、细胞因子和外源性Treg共刺激多肽、或它们的组合)的mRNA转染，以生成工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)。信使RNA可衍生自cDNA质粒构建体的体外转录，该cDNA质粒构建体含有对应于一种或多种外源性多肽的编码序列。例如，可将对应于外源性多肽的cDNA序列插入到含有与特异性RNA聚合酶相容的启动子序列的克隆载体中。例如，克隆载体ZAP EXPRESS pBK-CMV(Stratagene,La Jolla,Calif.,USA)含有分别与T3和T7 RNA聚合酶相容的T3和T7启动子序列。对于有义mRNA的体外转录，质粒在限制性位点处线性化，该限制性位点处于与外源性多肽的编码序列的末端相对应的终止密码子的下游。使用例如市售试剂盒，如RNAMAXX High Yield转录试剂盒(得自Stratagene,La Jolla,Calif.,USA)，由线性DNA模板转录mRNA。在某些情况下，可能期望生成5'-m7GpppG-加帽的mRNA。因此，可使用例如得自Ambion(Austin,Tex.,USA)的mMESSAGE mMACHINE High YieldCapped RNA转录试剂盒进行线性化cDNA模板的转录。转录可以在20-100μl的反应体积中在37℃下进行30分钟至4小时。通过用脱氧核糖核酸酶I简单处理以消除线性化DNA模板，然后在氯化锂、乙酸钠或乙酸铵存在下在70％乙醇中沉淀，从反应混合物中纯化转录的mRNA。转录的mRNA的完整性可采用琼脂糖甲醛凝胶或市售Novex预制TBE凝胶(例如，Novex,Invitrogen,Carlsbad,Calif.,USA)使用电泳进行评估。
可使用多种方法，包括例如脂质转染和电穿孔，将编码一种或多种外源性多肽(例如，外源性抗原性多肽、外源性抗原呈递多肽、外源性共抑制多肽、细胞因子和外源性Treg共刺激多肽、或它们的组合)的信使RNA引入红系前体细胞(例如，CD34+造血干细胞)中(vanTandeloo等人(2001)Blood 98:49-56)。对于脂质转染，将例如5μg的Opti-MEM(Invitrogen,Carlsbad,Calif.,USA)中的体外转录的mRNA与阳离子脂质DMRIE-C(Invitrogen)以1:4的比率孵育5-15分钟。或者，多种其他阳离子脂质或阳离子聚合物能够用来用mRNA转染细胞，包括例如DOTAP、各种形式的聚乙烯亚胺和聚L-赖氨酸(Sigma-Aldrich,Saint Louis,Mo.,USA)和Superfect(Qiagen,Inc.,Valencia,Calif.,USA；参见例如Bettinger等人(2001)Nucleic Acids Res.29:3882-91)。使所得的mRNA/脂质复合物与细胞(1-2x106个细胞/ml)在37℃下孵育2小时，洗涤并返回培养物。对于电穿孔，例如，将500μl的Opti-MEM(Invitrogen,Carlsbad,Calif.,USA)中的约5至20x106个细胞与约20μg的体外转录的mRNA混合，并且使用例如Easyject Plus装置(EquiBio,Kent,UnitedKingdom)在0.4-cm小槽中电穿孔。在某些情况下，可能需要测试各种电压、电容和电穿孔体积以确定将特定mRNA转染到细胞中的有用条件。通常，用mRNA有效转染细胞所需的电穿孔参数似乎比DNA电穿孔所需的那些对细胞的危害更小(van Tandeloo等人(2001))。
或者，可使用肽介导的RNA递送策略将mRNA转染到红系前体细胞(例如，CD34+细胞)中(参见例如Bettinger等人(2001))。例如，可将阳离子脂质聚乙烯亚胺2kDA(Sigma-Aldrich,Saint Louis,Mo.,USA)与蜂毒肽(Alta Biosciences,Birmingham,UK)组合以提高mRNA转染的效率，特别是在有丝分裂后原代细胞中。可使用例如二硫化物交联剂，如杂-双官能交联剂3-(2-吡啶基二硫)丙酸琥珀酰亚胺酯，使蜂毒肽与PEI缀合。将体外转录的mRNA与蜂毒肽-PEI一起预孵育5至15分钟以形成RNA/肽/脂质复合物。然后在37℃下5％CO2潮湿环境中，将该复合物添加到无血清培养基的细胞中2至4小时，然后移除，并允许转染的细胞继续在培养物中生长。
在一些实施方案中，通过使合适的分离的红系前体细胞或血小板前体细胞与编码一种或多种外源性多肽(例如，外源性抗原呈递多肽、外源性共抑制多肽、细胞因子和外源性Treg共刺激多肽、或它们的组合)的外源性核酸接触，生成工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)。在一些实施方案中，外源性多肽由DNA编码，该DNA与有核红系前体细胞或有核血小板前体细胞接触。在一些实施方案中，外源性多肽由RNA编码，该RNA与血小板、有核红系细胞、或有核血小板前体细胞接触。
可以使用多种DNA技术，包括瞬时或稳定转染和基因治疗方法，在终末分化之前，将一种或多种外源性多肽(例如，外源性抗原呈递多肽、外源性共抑制多肽、细胞因子和外源性Treg共刺激多肽、或它们的组合)遗传引入红系前体细胞、血小板前体、或有核红系细胞中。外源性多肽可表达于红系细胞或血小板的表面上和/或细胞质中。
病毒基因转移能够用来用编码一种或多种外源性多肽(例如，外源性抗原呈递多肽、外源性共抑制多肽、细胞因子和外源性Treg共刺激多肽、或它们的组合)的DNA转染细胞。许多病毒可用作基因转移媒介物，包括例如莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)、慢病毒属如人类免疫缺陷病毒1(HIV 1)，以及泡沫病毒属如泡沫病毒(参见例如Osten等人(2007)Handb.Exp.Pharmacol.178:177-202)。例如，逆转录病毒有效地转导哺乳动物细胞(包括人细胞)并整合进染色体中，从而赋予稳定的基因转移。
可将一种或多种外源性多肽(例如，外源性抗原呈递多肽、外源性共抑制多肽、细胞因子和外源性Treg共刺激多肽、或它们的组合)转染到红系前体细胞、血小板前体、或有核红系细胞中，在如本文所述的工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)中表达并随后保留和呈现。合适的载体是莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)载体骨架(Malik等人(1998)Blood 91:2664-71)。例如，可使用标准分子生物学技术，在MMLV载体骨架中生成包含编码外源性多肽的cDNA的DNA构建体。将构建体转染到例如包装细胞系如PA317细胞中，并使用病毒上清液来转染例如生产细胞，如PG13细胞。将PG13病毒上清液与如本文所述分离和培养或者新鲜分离的红系前体细胞、血小板前体、或有核红系细胞一起孵育。例如，如果外源性多肽位于工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)的表面上，可采用针对外源性多肽的荧光标记的抗体，使用FACS分析(荧光活化细胞分选术)来监测外源性多肽的表达。可使用类似的方法来表达位于工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)内部的外源性多肽。
任选地，可使用基于病毒的方法来转染例如荧光示踪分子，如绿荧光蛋白(GFP)(Tao等人(2007)Stem Cells 25:670-8)。使用例如包装细胞，如Phoenix-Eco细胞系(由Orbigen,San Diego,Calif.分销)来包装含有编码增强的绿色荧光蛋白(EGFP)或红色荧光蛋白(例如，DsRed-Express)的DNA的异位逆转录病毒载体。包装细胞系稳定地表达适当病毒包装所需的病毒蛋白，包括例如gag、pol和env。病毒颗粒脱落在其中的Phoenix-Eco细胞的上清液用于转导例如红系前体细胞、血小板前体、或有核红系细胞。在某些情况下，转导可在例如特别包被的表面上进行，如重组纤粘蛋白的片段，以改善逆转录病毒介导的基因转移的效率(例如，RetroNectin,Takara Bio USA,Madison,Wis.)。将细胞在具有逆转录病毒Phoenix-Eco上清液加合适的辅因子的RetroNectin包被的板中孵育。转导可在次日重复。在这种情况下，可通过FACS评估表达EGFP或DsRed-Express的细胞的百分比。可用于评估转导效率的其他报道基因包括例如β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶和萤光素酶以及低亲和力神经生长因子受体(LNGFR)和人细胞表面CD24抗原(Bierhuizen等人(1999)Leukemia 13:605-13)。
非病毒载体可用于将遗传物质引入合适的红系细胞、血小板或其前体中以生成工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)。非病毒介导的基因转移与病毒介导的基因转移的不同之处在于，质粒载体不含有蛋白质，毒性较低并且易于放大，并且没有宿主细胞偏好。质粒载体的“裸DNA”本身在将编码多肽的遗传物质递送至细胞方面效率低下，因此与能够进入细胞的基因递送方法组合。许多递送方法可用于将非病毒载体转移到合适的红系细胞、血小板或其前体中，包括化学和物理方法。
编码一种或多种外源性多肽(例如，外源性抗原呈递多肽、外源性共抑制多肽、细胞因子和外源性Treg共刺激多肽、或它们的组合)的非病毒载体可以利用合成大分子如阳离子脂质和聚合物引入合适的红系细胞、血小板或其前体中(Papapetrou等人(2005)GeneTherapy 12:S118-30)。阳离子脂质体例如通过电荷相互作用与DNA形成复合物。带正电荷的DNA/脂质复合物结合到阴性细胞表面并且通过内吞由细胞吸收。该方法可用于例如转染造血细胞(参见例如Keller等人(1999)Gene Therapy 6:931-8)。对于红系细胞、血小板或其前体，将质粒DNA(例如，约0.5μg，在25-100μL的无血清培养基如OptiMEM(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)中)与阳离子脂质体(约4μ.g，在25μ.L的无血清培养基中)如市售转染剂Lipofectamine.TM.(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)混合，并允许孵育至少20分钟以形成复合物。将DNA/脂质体复合物添加到合适的红系细胞、血小板或其前体中，并允许孵育5-24小时，此后可测定多肽的转基因表达。或者，可使用其他市售的脂质体转染剂(例如，Invivo GeneSHUTTLE,Qbiogene,Carlsbad,Calif.)。
任选地，例如，阳离子聚合物如聚乙烯亚胺(PEI)可用于有效地转染红系细胞祖细胞，例如造血细胞和脐带血衍生的CD34+细胞(参见例如Shin等人(2005)Biochim.Biophys.Acta 1725:377-84)。从人脐带血中分离人CD34+细胞并在Iscove的改良Dulbecco的培养基中培养，该培养基补充有200ng/ml干细胞因子和20％热灭活胎牛血清。将编码外源性多肽的质粒DNA与大小从0.8K至750K变化的支链或直链PEI(Sigma Aldrich,Saint Louis,Mo.,USA；Fermetas,Hanover,Md.,USA)一起孵育。将PEI以4.2mg/ml蒸馏水制备为储备溶液，并使用HCl轻微酸化至pH 5.0。基于1μg的DNA含有3nmol磷酸盐并且1μl的PEI储备溶液含有10nmol胺氮的计算，可将DNA与PEI以各种氮/磷酸盐比率在室温下混合30分钟。将分离的CD34+细胞用DNA/阳离子复合物接种，以280xg离心5分钟，并且在培养基中孵育4小时或以上，直至评估多肽的基因表达。
可使用物理方法如粒子介导的转染、“基因枪”、生物弹道、或粒子轰击技术，将质粒载体引入合适的红系细胞、血小板或其前体中(Papapetrou等人(2005))。在这种情况下，将编码多肽的DNA吸附到金粒子上并通过粒子枪施用于细胞。该方法可用于例如转染红系前体细胞，例如衍生自脐带血的造血干细胞(参见例如Verma等人(1998)Gene Therapy 5:692-9)。由此，分离脐带血并用磷酸盐缓冲盐水稀释三倍。使用抗CD34单克隆抗体结合包被有第二抗体的磁性微珠和磁性分离系统(例如，Miltenyi MiniMac System,Auburn,Calif.,USA)来纯化CD34+细胞。可如本文所述培养富集CD34+的细胞。对于转染，通过用氯化钙和亚精胺处理，使编码多肽的质粒DNA沉淀到粒子例如金珠上。在用乙醇洗涤DNA包被的珠后，可使用例如Biolistic PDS-1000/He系统(Bio-Rad,Hercules,Calif.,USA)将珠递送到培养的细胞中。例如，报道基因如β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、萤光素酶或绿荧光蛋白可用于评估转染效率。
任选地，可使用电穿孔方法将质粒载体引入合适的红系细胞、血小板或其前体中。电穿孔在细胞膜中形成瞬时孔，从而允许将各种分子引入细胞中，包括例如DNA和RNA以及抗体和药物。由此，如本文所述分离和培养CD34+细胞。在即将电穿孔之前，通过在室温下以250xg离心10分钟来分离细胞，并以0.2-10x106个活细胞/ml再悬浮于例如电穿孔缓冲液中，如补充有1.0％人血清白蛋白(HSA)的X-VIVOTM10培养基。将质粒DNA(1-50μg)与500μl的细胞悬浮液一起添加到适当的电穿孔小槽中。电穿孔可使用例如ECM 600电穿孔仪(Genetronics,San Diego,Calif.,USA)进行，其中电压范围为200V至280V，脉冲长度范围为25至70毫秒。许多替代的电穿孔仪器是可商购的，并且可用于此目的(例如，Gene PulserXCELL,BioRad,Hercules,Calif.；Cellject Duo,Thermo Science,Milford,Mass.)。或者，分离的CD34+细胞的有效电穿孔可使用以下参数执行：4mm小槽，1600μF，550V/cm，以及10μg的DNA/500μl的细胞，1x105个细胞/ml(Oldak等人(2002)Acta Biochimica Polonica 49:625-32)。
核转染(即一种电穿孔形式)也可用于转染合适的红系细胞、血小板或其前体。在这种情况下，转染在细胞类型特异性溶液中使用电参数执行，该细胞类型特异性溶液能够将DNA(或其他试剂)直接转运到核，从而降低细胞质中可能降解的风险。例如，人CD34细胞细胞核试剂盒(Human CD34 CELL NUCLEOFECTOR Kit)(得自Amaxa Inc.)可用于转染合适的红系细胞、血小板或其前体。在这种情况下，将在人CD34细胞核转染溶液(Human CD34Cell NUCLEOFECTOR Solution)中的1-5x106个细胞与1-5μg的DNA混合，并使用如由制造商确定的预编程设置在NUCLEOFECTOR仪器中转染。
红系细胞、血小板或其前体可用常规表达载体非病毒转染，该载体不能在哺乳动物细胞中自我复制，除非其整合进基因组中。或者，可以用附加型载体转染红系细胞、血小板或其前体，该附加型载体可作为自主复制遗传单位存在于宿主核中，而不整合进染色体中(Papapetrou等人(2005))。这些载体利用衍生自例如在潜伏性感染后在细胞中正常染色体外复制的病毒的遗传元件，如EBV、人多瘤病毒BK、牛乳头瘤病毒-1(BPV-1)、单纯疱疹病毒-1(HSV)和猿猴病毒40(SV40)。哺乳动物人工染色体也可用于非病毒基因转移(Vanderbyl等人(2005)Exp.Hematol.33:1470-6)。
可以通过本领域已知的标准分子生物学方法，例如限制性消化、重叠延伸PCR和Gibson装配，将编码一种或多种外源性多肽(例如，外源性抗原呈递多肽、外源性共抑制多肽、细胞因子和外源性Treg共刺激多肽、或它们的组合)的外源性核酸装配到表达载体中。
外源性核酸可包含编码一种或多种在例如红系细胞的细胞表面上不正常表达的外源性多肽(例如，外源性抗原呈递多肽、外源性共抑制多肽、细胞因子和外源性Treg共刺激多肽、或它们的组合)的基因，其与编码内源性或天然膜蛋白的基因融合，使得外源性多肽在细胞表面上表达。例如，可以在1型膜蛋白的前导序列之后的N末端、2型膜蛋白的C末端、或GPI连接的膜蛋白的GPI连接位点的上游处克隆编码外源性抗原性多肽的外源性基因。
可使用标准克隆方法在两个融合基因之间引入柔性氨基酸接头。例如，柔性接头是通常用于由全长抗体生成单链抗体片段的聚-甘氨酸聚-丝氨酸接头，如[Gly4Ser]3(SEQID NO:31)(Antibody Engineering:Methods&Protocols,Lo 2004)、或Ala-Gly-Ser-Thr多肽如用于生成单链Arc阻遏蛋白的那些(Robinson&Sauer,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA1998)。在一些实施方案中，柔性接头为多肽提供了比没有柔性接头的等同构建体更大的柔性和空间自由度。
表位标签可置于例如两个融合基因之间，如编码HA表位标签--氨基酸YPYDVPDYA(SEQ ID NO:32)、CMyc标签--氨基酸EQKLISEEDL(SEQ ID NO:33)、或Flag标签--氨基酸DYKDDDDK(SEQ ID NO:34)的核酸序列。表位标签可用于使用针对表位标签的抗体通过流式细胞术、Western印迹或免疫沉淀方便地检测和定量表达。
在一些实施方案中，工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)包含一种或多种外源性多肽(例如，外源性抗原呈递多肽、外源性共抑制多肽、细胞因子和外源性Treg共刺激多肽、或它们的组合)以及至少一种其他异源多肽。至少一种其他异源多肽可为荧光蛋白。荧光蛋白可用作报告子来评估转导效率。在一些实施方案中，如果两者均由相同的转录物制备，则荧光蛋白用作报告子，以评估外源性多肽的表达水平。在一些实施方案中，至少一种其他多肽是异源的，并且提供功能，如多个抗原、多个捕获靶标、酶级联。在一些实施方案中，重组核酸包含编码抗原多肽的基因和第二基因，其中第二基因由病毒衍生的T2A序列(gagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggsgsstcccggccct(SEQ ID NO:35))与编码抗原多肽的基因隔开，其在翻译后裂解为两种成熟蛋白。
在一些实施方案中，编码外源性抗原呈递多肽的外源性核酸包含HLA细胞表面蛋白的基因序列，其与Kell序列的3'端融合并使用PCR扩增。在一些实施方案中，编码外源性抗原呈递多肽的外源性核酸包含HLA细胞表面蛋白的基因序列，其与聚-甘氨酸/丝氨酸接头融合，继之以Kell序列的3'端，并使用PCR扩增。在一些实施方案中，编码外源性抗原呈递多肽的外源性核酸包含与表位标签序列融合的HLA细胞表面蛋白的基因序列的3’端，该表位标签序列可为以下中的一种或组合：HA-标签、绿荧光蛋白标签、Myc-标签、几丁质结合蛋白、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、聚(His)标签、硫氧还蛋白、聚(NANP)、FLAG-标签、V5-标签、AviTag、钙调蛋白-标签、多聚谷氨酸盐-标签、E-标签、S-标签、SBP-标签、Softag-1、Softag-3、Strep-标签、TC-标签、VSV-标签、Xpress-标签、Isopeptag、SpyTag、生物素羧基载体蛋白、Nus-标签、Fc-标签、或Ty-标签。将整个构建体与Kell序列的3'端融合，然后使用PCR扩增。例如，将编码各种外源性抗原呈递多肽的外源性基因构建体随后负载到慢病毒载体中并用于转导细胞群。
在一些实施方案中，将红系细胞群与包含编码一种或多种外源性多肽(例如，外源性抗原呈递多肽、外源性共刺激多肽、外源性共抑制多肽、细胞因子和外源性Treg共刺激多肽)的外源性核酸的慢病毒载体一起孵育，其特异性质粒可包括；pLKO.1puro、PLKO.1--TRC克隆载体、pSico、FUGW、pLVTHM、pLJM1、pLion11、pMD2.G、pCMV-VSV-G、pCI-VSVG、pCMV-dR8.2dvpr、psPAX2、pRSV-Rev和pMDLg/pRRE，以生成工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)。可将载体以10、100、1,000、10,000pfu施用并孵育12小时。
还可使用偶联试剂将外源性多肽与细胞连接(例如，使用如上所详述的点击化学)来产生本文所述的红系细胞。在一些实施方案中，第一外源性多肽与细胞偶联(例如，使用点击化学)，并且第二外源性多肽包含由外源性核酸表达的多肽。
制造包含(例如，表达)外源性多肽的去核红系细胞的方法描述于例如WO2015/073587和WO2015/153102中，其各自全文以引用方式并入本文。
III.使用工程化红系细胞或去核细胞的方法
本公开设想了使用如本文所述的包含野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(例如，经修饰去核细胞)的各种方法。
本领域的技术人员应当理解，基于本文所提供的公开内容，工程化红系细胞或去核细胞的给药剂量和时间安排可以针对本文所述的每种应用特别定制。实质上，本公开的工程化红系细胞或去核细胞以及本文所公开的方法提供了几乎无限数量的变化，并且本公开不以任何方式限于任何特定组合或方法。技术人员借助本文所提供的教导内容和本领域可获得的知识，可容易地确定针对每个特定受试者、疾病适应症、或目标免疫细胞群的期望方法。
在一些方面，本公开提供了治疗需要改变的免疫应答的受试者的方法，该方法包括：确定受试者的HLA状态；选择工程化红系细胞或去核细胞，该工程化红系细胞或去核细胞在细胞表面上包含可负载外源性抗原呈递多肽，其中抗原呈递多肽与受试者免疫相容，并且其中可负载外源性抗原呈递多肽包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代使细胞表面上的可负载外源性抗原呈递多肽稳定化；使工程化去核红系细胞与针对可负载外源性抗原呈递多肽的外源性抗原性多肽接触；并且将工程化红系细胞或去核细胞给药于受试者，从而治疗受试者。在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽在不存在与外源性抗原呈递多肽结合的多肽的情况下是稳定化的。
在一些方面，本公开提供了治疗需要改变的免疫应答的受试者的方法，该方法包括：确定受试者的HLA状态；选择工程化红系细胞或去核细胞，该工程化红系细胞或去核细胞在细胞表面上包含野生型外源性抗原呈递多肽，其中抗原呈递多肽与受试者免疫相容；使工程化去核红系细胞与针对野生型外源性抗原呈递多肽的外源性抗原性多肽接触；并且将工程化红系细胞或去核细胞给药于受试者，从而治疗受试者。
在一些实施方案中，该方法包括使外源性抗原性多肽与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽缀合。
在一些实施方案中，可置换外源性多肽与可负载外源性抗原呈递多肽结合。在一些实施方案中，在工程化去核红系细胞给药于受试者之前，用外源性抗原性多肽将可置换外源性多肽从可负载外源性抗原呈递多肽置换。在一些实施方案中，该方法还包括使外源性抗原性多肽与可负载外源性抗原呈递多肽缀合。
在一些实施方案中，该方法包括选择外源性抗原性多肽。在一些实施方案中，受试者患有癌症或处于发展癌症的风险中。在一些实施方案中，受试者患有自身免疫疾病或处于发展自身免疫疾病的风险中。在一些实施方案中，受试者患有感染性疾病或处于发展感染性疾病的风险中。
在其他方面，本公开提供了制备包含负载抗原的野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的工程化去核红系细胞的方法，该方法包括：获得工程化去核红系细胞，该工程化去核红系细胞在细胞表面上包含可负载外源性抗原呈递多肽，其中抗原呈递多肽与受试者免疫相容，并且其中可负载外源性抗原呈递多肽包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代使细胞表面上的可负载外源性抗原呈递多肽稳定化；以及使工程化去核红系细胞与针对可负载外源性抗原呈递多肽的外源性抗原性多肽接触；从而制备包含负载抗原的外源性抗原呈递多肽的工程化去核红系细胞。在一些实施方案中，可负载外源性抗原呈递多肽在不存在与外源性抗原呈递多肽结合的多肽的情况下是稳定化的。
在一些实施方案中，该方法包括使外源性抗原性多肽与可负载外源性抗原呈递多肽缀合。在其他实施方案中，该方法还包括选择适用于给药于受试者的外源性抗原性多肽。
在一些实施方案中，可置换外源性多肽与可负载外源性抗原呈递多肽结合。
在一些实施方案中，该方法包括用外源性抗原性多肽将可置换外源性多肽从可负载外源性抗原呈递多肽置换。
将受益于T细胞应答调节的病症的治疗
给药包含(例如，呈递)外源性多肽的工程化红系细胞的方法描述于例如WO2015/073587和WO2015/153102中，其各自全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，将本文所述的工程化红系细胞或去核细胞给药于受试者，例如哺乳动物，例如人类。可治疗的示例性哺乳动物包括但不限于人类、家养动物(例如，狗、猫等)、农用动物(例如，牛、绵羊、猪、马等)和实验动物(例如，猴、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠等)。本文所述的方法适用于人类疗法和兽医应用两者。在一些实施方案中，工程化红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，红系细胞是有核细胞。
在一些实施方案中，将红系细胞每1、2、3、4、5、或6个月给药于受试者。
在一些实施方案中，红系细胞的剂量包含约1x109-2x109、2x109-5x109、5x109-1x1010、1x1010-2x1010、2x1010-5x1010、5x1010-1x1011、1x1011-2x1011、2x1011-5x1011、5x1011-1x1012、1x1012-2x1012、2x1012-5x1012、或5x1012-1x1013个细胞。
在一些实施方案中，红系细胞以足以在2周至一年，例如一个月至一年或更长，例如至少2周、4周、6周、8周、3个月、6个月、一年、2年的时间段内维持受试者血流中所给药的红系细胞的功能的给药方案(剂量和给药周期)给药于受试者。
在一些实施方案中，将如本文所述的工程化红系细胞或去核细胞以两剂或更多剂(例如，2、3、4剂或更多剂)给药于受试者。在另一个实施方案中，将工程化红系细胞或去核细胞以两剂或更多剂给药于受试者，其中第二剂量在第一剂量后T细胞增殖确定处于峰值时的时间给药。在一些实施方案中，将本公开的工程化红系细胞或去核细胞以第一剂量给药，其中第一剂量刺激T细胞增殖和活化。在第一剂量之后，当T细胞活化且增殖处于其峰值时，将本公开的工程化红系细胞或去核细胞以第二剂量给药以刺激T细胞扩增。不受理论的约束，以两剂或更多剂给药本公开的工程化红系细胞或去核细胞提高了工程化红系细胞或去核细胞增强记忆T细胞群的能力，并由此提供了更长功效，例如，对抗肿瘤复发或致病原再攻击的功效。
峰值T细胞增殖可使用技术人员已知的方法确定。例如，峰值T细胞增殖可通过对增殖T细胞掺入3H-胸腺嘧啶核苷，或者通过用荧光染料5,6-羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记增殖T细胞来确定。
在一些方面，本公开提供了治疗本文所述的疾病或病症的方法，包括向有此需要的受试者给药包含本文所述的工程化红系细胞或去核细胞的本文所述的组合物。在一些实施方案中，疾病或病症是癌症。在一些实施方案中，疾病或病症是自身免疫疾病。在一些实施方案中，疾病或病症是与致病原相关或由致病原引发的自身免疫疾病。在一些实施方案中，疾病或病症是感染性疾病。
在一些方面，本公开提供了本文所述的工程化红系细胞或去核细胞用于治疗本文所述的疾病或病症，例如癌症、自身免疫疾病(如由致病原引发的自身免疫疾病)、或感染性疾病的用途。在一些方面，本公开提供了本文所述的工程化红系细胞或去核细胞用于制造药物的用途，该药物用于治疗本文所述的疾病或病症，例如癌症、自身免疫疾病(如由致病原引发的自身免疫疾病)、或感染性疾病。
在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞包含含有野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的第一外源性多肽以及含有外源性抗原性多肽的第二外源性多肽，其中外源性抗原性多肽包含或由肿瘤抗原、与自身免疫病症或病症(例如，由致病原引发的自身免疫疾病)相关的抗原、或与感染性疾病相关的抗原或病原体组成。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽与外源性抗原性多肽结合(例如，共价或非共价附接)。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽不与外源性抗原性多肽结合(例如，共价或非共价附接)(例如为两个独立多肽)。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽和第二外源性多肽为单链融合多肽的部分。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞还包含第三外源性多肽(例如，包含如所本文公开的至少一种共刺激多肽、至少一种共抑制多肽、或至少一种Treg扩增多肽的外源性多肽)。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞还包含第四外源性多肽(例如，包含如所本文公开的至少一种共刺激多肽、至少一种共抑制多肽、或至少一种Treg扩增多肽的外源性多肽)。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞还包含第五外源性多肽(例如，包含如所本文公开的至少一种共刺激多肽、至少一种共抑制多肽、或至少一种Treg扩增多肽的外源性多肽)。
在前述方法的一些实施方案中，可以对受试者给药两种不同的工程化红系细胞或去核细胞的群体。例如，第一工程化红系细胞或去核细胞的群体可包含含有至少一种共刺激多肽、至少一种共抑制多肽、或至少一种Treg扩增多肽的外源性多肽，并且第二工程化红系细胞或去核细胞的群体可包含野生型或可负载外源性抗原呈递多肽和外源性抗原性多肽。在此类实施方案中，可将两种不同的工程化红系细胞或去核细胞的群体例如顺序或同时地给药于受试者。
在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞上的第一和第二外源性多肽、或给药于受试者的工程化红系细胞或去核细胞上的第一、第二和第三外源性多肽的效应是协同的。术语“协同”或“协同作用”意指两种或更多种试剂(例如，作为工程化红系细胞的一部分的多肽)的组合与其单独效应相比多于累加的效应。在某些实施方案中，与给药的两种不同的工程化红系细胞或去核细胞(例如，包含第一多肽的第一工程化红系细胞或去核细胞和包含第二多肽的第二工程化红系细胞或去核细胞)的效应相比，协同活性是给药于受试者的包含第一多肽和第二多肽的工程化红系细胞或去核细胞的多于累加的效应。在一些实施方案中，当第一试剂产生可检测水平的输出X，第二试剂产生可检测水平的输出X，并且第一和第二试剂一起产生多于累加水平的输出X时，存在协同活性。
在一些实施方案中，将至少一种工程化红系细胞或去核细胞给药于受试者(例如，哺乳动物，例如人类)，其中至少一种工程化红系细胞或去核细胞在细胞表面上包含信号1，例如包含野生型或可负载外源性抗原呈递多肽，其中野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含结合的外源性抗原性多肽。在一些实施方案中，至少一种工程化红系细胞或去核细胞还在细胞表面上包含信号2和/或信号3，例如，还包含含有选自表11所示的信号2多肽(例如，4-1BBL)的信号2多肽的外源性多肽和/或含有选自表11所示的信号3多肽(例如，IL-12)的信号3多肽的外源性多肽。在一些实施方案中，至少一种工程化红系细胞或去核细胞还包含含有4-1BBL(信号2)的外源性多肽和/或含有IL-12(信号3)的外源性多肽。
在一些实施方案中，将两种或更多种(例如，两种、三种、四种或更多种)不同的工程化红系细胞或去核细胞(或其群体)给药于受试者(例如，哺乳动物，例如人类)，其中第一工程化红系细胞或去核细胞(或其群体)在细胞表面上包含信号1(例如，包含与外源性抗原性多肽结合的野生型或可负载外源性抗原呈递多肽)，并且第二工程化红系细胞或去核细胞(或其群体)在细胞表面上包含信号2和/或信号3。例如，在一些实施方案中，第二工程化红系细胞或去核细胞(或其群体)包含含有选自表11所示的信号2多肽(例如，4-1BBL)的信号2多肽的外源性多肽和/或含有选自表11所示的信号3多肽(例如，IL-12)的信号3多肽的外源性多肽。在一些实施方案中，第二工程化红系细胞或去核细胞(或其群体)包含含有4-1BBL(信号2)的外源性多肽和/或含有IL-12(信号3)的外源性多肽。
在一些实施方案中，将三种或更多种不同的工程化红系细胞或去核细胞(或其群体)给药于受试者(例如，哺乳动物，例如人类)，其中第一工程化红系细胞或去核细胞在细胞表面上包含信号1(例如，包含与外源性抗原性多肽结合的野生型或可负载外源性抗原呈递多肽)，第二工程化红系细胞或去核细胞(或其群体)在细胞表面上包含信号2(例如，包含含有选自表11所示的信号2多肽(例如，4-1BBL)的信号2多肽的外源性多肽)，并且第三工程化红系细胞或去核细胞(或其群体)在细胞表面上包含信号3(例如，包含含有选自表11所示的信号3多肽(例如，IL-12)的信号3多肽的外源性多肽)。
在一些实施方案中，信号1、信号2或信号3多肽选自表11所示的多肽。
在一些实施方案中，将两种、三种或更多种不同的工程化红系细胞或去核细胞(或其群体)顺序给药于受试者。在一些实施方案中，将两种、三种或更多种不同的工程化红系细胞或去核细胞(或其群体)同时给药于受试者。
癌症
本文所提供的工程化红系细胞或去核细胞可用于在有此需要的受试者中治疗癌症。因此，在一些方面，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，包括向受试者给药对受试者有效的数量或量的本文所述的工程化红系细胞或去核细胞，从而治疗癌症。
在一些实施方案中，本文提供了在有此需要的受试者中治疗癌症的方法，其中该方法包括向受试者给药工程化红系细胞或去核细胞(或包含细胞的药物组合物)，其中工程化红系细胞或去核细胞包含含有野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的第一外源性多肽以及含有外源性抗原性多肽的第二外源性多肽，其中外源性抗原性多肽包含或由肿瘤抗原组成，从而治疗癌症。在一些实施方案中，本文提供了在有此需要的受试者中治疗癌症的方法，其中该方法包括向受试者给药工程化红系细胞或去核细胞(或包含细胞的药物组合物)，其中工程化红系细胞或去核细胞包含含有野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的第一外源性多肽以及含有外源性抗原性多肽的第二外源性多肽，其中外源性抗原性多肽包含或由表7或8所示的氨基酸序列组成，从而治疗癌症。在一些实施方案中，本文提供了在有此需要的受试者中治疗癌症的方法，其中该方法包括向受试者给药工程化红系细胞或去核细胞(或包含细胞的药物组合物)，其中工程化红系细胞或去核细胞包含含有野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的第一外源性多肽以及含有外源性抗原性多肽的第二外源性多肽，其中外源性抗原性多肽包含或由表16和17所示的新抗原多肽组成，从而治疗癌症。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽与外源性抗原性多肽结合(例如，共价或非共价附接)。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽不与外源性抗原性多肽结合(例如，共价或非共价附接)(例如为两个独立多肽)。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞还包含额外的外源性多肽，其中本文提供额外的外源性多肽(例如，包含至少一种共刺激多肽的外源性多肽)。
在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞包含含有野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的第一外源性多肽，并且第二外源性多肽包含外源性抗原性多肽(例如，包含肿瘤相关抗原)。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞包含含有野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的第一外源性多肽、含有第一外源性抗原性多肽(例如，包含第一肿瘤相关抗原)的第二外源性多肽，并且第三外源性多肽包含第二外源性抗原性多肽(例如，包含第二肿瘤相关抗原)。两种外源性抗原性多肽抗原可为衍生自两种不同蛋白质的抗原，或者它们可衍生自相同的蛋白质。在一些实施方案中，第一外源性抗原性多肽或第二外源性抗原性多肽包含HPV-E6抗原。在一些实施方案中，第一外源性抗原性多肽或第二外源性抗原性多肽包含HPV-E7抗原。在一些实施方案中，第一外源性抗原性多肽包含HPV-E6抗原，并且第二外源性抗原性多肽包含HPV-E7抗原。
设想在一些实施方案中，可将扩增和活化肿瘤中的抗原特异性CD8+T细胞的工程化红系细胞或去核细胞(例如，包含与含有HLAI类多肽的外源性抗原呈递多肽结合的外源性抗原性多肽的工程化红系细胞或去核细胞)与活化CD4+T细胞的工程化红系细胞或去核细胞(例如，包含与含有HLA II类多肽的外源性抗原呈递多肽结合的外源性抗原性多肽的工程化红系细胞或去核细胞)一起给药，其活化肿瘤和淋巴结中的抗原特异性和初始CD8+T细胞，从而增强稳健的抗肿瘤应答。在一些实施方案中，可将扩增和活化肿瘤中的抗原特异性CD8+T细胞的工程化红系细胞或去核细胞与活化CD4+T细胞的工程化红系细胞或去核细胞一起给药，其活化肿瘤和淋巴结中的抗原特异性和初始CD8+T细胞，从而协同地增加免疫应答的稳健性。
在一些实施方案中，将第一工程化红系细胞或去核细胞与第二工程化红系细胞或去核细胞一起给药于受试者，该第一工程化红系细胞或去核细胞包含第一野生型或可负载外源性抗原呈递多肽(例如，包含HLA I类或HLA II类多肽)和含有外源性抗原性多肽(例如，含有第一肿瘤相关抗原)的第二外源性多肽作为单链融合多肽，该第二工程化红系细胞或去核细胞包含第二野生型或可负载外源性抗原呈递多肽(例如，包含HLA I类或HLAII类多肽)和含有外源性抗原性多肽(例如，含有第二肿瘤相关抗原)的第二外源性多肽。在一些实施方案中，第一工程化红系细胞或去核细胞包含含有HLAI类多肽的第一野生型或可负载外源性抗原呈递多肽，并且第二工程化红系细胞或去核细胞包含含有HLA II类多肽的第二野生型或可负载外源性抗原呈递多肽。在一些实施方案中，第一工程化红系细胞或去核细胞和/或第二工程化红系细胞或去核细胞包含额外的外源性多肽(例如，本文所提供的外源性共刺激多肽)。不受理论的约束，据信介导MHC I和MHC II肿瘤抗原呈递(分别经由包含HLAI类和HLA II类多肽的抗原呈递多肽)连同有效共刺激的细胞的给药具有生成持续的肿瘤特异性杀伤的潜能。
如技术人员所理解，在一些实施方案中，可以用包含多种，例如两种、三种、四种、五种或更多种不同的外源性抗原性多肽的工程化红系细胞或去核细胞来治疗受试者。在一些实施方案中，多种外源性抗原性多肽存在于相同的工程化去核红系细胞上。在一些实施方案中，多种外源性抗原性多肽存在于两种或更多种不同的工程化去核红系细胞上，其中将不同工程化去核红系细胞的组合给药于受试者以治疗障碍。两种、三种、四种、五种或更多种外源性抗原性多肽可各自来自于不同的蛋白质，或者两种或更多种外源性抗原性多肽可衍生自相同的蛋白质(例如，相同肿瘤抗原或相同新抗原)。
本公开涵盖了外源性抗原性多肽可包括本领域已知的任何肿瘤抗原、或其抗原部分，包括但不限于表7和8所列的外源性抗原性多肽或其抗原部分中的任何一种或多种。可使用这些外源性抗原性多肽治疗的非限制性示例性特定癌症也描述于表7-8。
可使用本文所述的方法治疗多种癌症。本公开不限于特定类型的癌症，而是考虑通过本文所述的工程化红系细胞或去核细胞来治疗任何癌症。在某些实施方案中，癌症包括但不限于急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、肠癌、脑肿瘤、乳腺癌、原发灶不明癌(cancer of unknown primary)、扩散至骨的癌症、扩散至脑的癌症、扩散至肝的癌症、扩散至肺的癌症、类癌瘤、宫颈癌、绒毛膜癌、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、眼癌、胆囊癌、胃癌、滋养细胞肿瘤(GTT)、毛细胞白血病、头颈癌、霍奇金淋巴瘤、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤皮肤癌、间皮瘤、男性的癌症、葡萄胎妊娠、口腔口咽癌、骨髓瘤、鼻和鼻窦癌、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、食管癌、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、前列腺癌、罕见癌症、直肠癌、唾液腺癌、续发性癌症、皮肤癌(非黑素瘤)、软组织肉瘤、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、原发灶不明转移癌、子宫癌、阴道癌和外阴癌。
在某些实施方案中，癌症是白血病，例如AML或ALL。在其他实施方案中，癌症是肝细胞癌。在另一些实施方案中，癌症选自宫颈癌、头颈癌、淋巴瘤和肾透明细胞癌。
新抗原是由改变基因组编码蛋白的氨基酸序列的一个或多个肿瘤特异性突变产生的一类肿瘤抗原。新抗原可包括多肽序列或核苷酸序列。突变可包括移码或非移码插入缺失(插入或缺失)、错义或无义取代、剪接位点改变、基因组重排或基因融合、或产生neoORF的任何基因组或表达改变。突变也可包括剪接变体。肿瘤细胞特异性的翻译后修饰可包括异常磷酸化。肿瘤细胞特异性的翻译后修饰也可包括蛋白酶体生成的剪接抗原(参见例如Liepe等人(2016)Science 354(6310):354-8)。肿瘤新抗原是存在于受试者的肿瘤细胞或组织中但不存在于受试者的相应正常细胞或组织中的新抗原。
对癌症基因组图谱(Cancer Genome Atlas，TCGA)数据集的最近分析已经将肿瘤的基因组景观与肿瘤免疫联系起来，涉及驱动T细胞应答的新抗原负荷(Brown等人(2014)Genome Res.24(5):743-50)以及鉴定与免疫浸润相关联的体细胞突变(Rutledge等人(2013)Clin Cancer Res.19(18):4951-60)。Rooney等人(2015)160(1-2):48-61)表明新抗原和病毒可能驱动细胞溶解活性，并且显示了使肿瘤能够抵抗免疫攻击的已知新型突变。
在一些实施方案中，包括在本文所述的工程化红系细胞或去核细胞中的外源性抗原性多肽包含从受试者中的癌细胞鉴定的新抗原。在一些实施方案中，新抗原是共有新抗原。鉴定新抗原的方法在本领域中是已知的，并且描述于例如美国专利No.10,055,540中，其全文以引用方式并入本文。新抗原多肽和共有新抗原多肽描述于例如国际专利公开No.WO 2016/187508；美国公开No.20180055922；Schumacher和Hacohen等人(2016)Curr.Opin.Immunol.41:98-103；Gubin等人(2014)Nature 515(7528):577-81；Schumacher和Schreiber(2015)Science 348(6230):69-74，Ott等人(2017)Nature 547(7662):217-21；其各自全文以引用方式并入本文。
因此，在一些实施方案中，外源性抗原性多肽包含或由新抗原多肽组成。在一些实施方案中，外源性抗原性多肽包含或由肿瘤特异性新抗原综合数据库(The ComprehensiveTumor-Specific Neoantigen Database，TSNAdb v1.0)所示的新抗原多肽组成；可获得于biopharm.zju.edu.cn/tsnadb，并且描述于Wu等人(2018)Genomics ProteomicsBioinformatics 16:276-82。在一些实施方案中，外源性抗原性多肽是美国专利No.10,055,540中所示的新抗原多肽，其全文以引用方式并入本文。在一些实施方案中，外源性抗原性多肽包含表16所列的新抗原多肽。
表16.新抗原多肽
HLA I类等位基因 新抗原多肽 SEQ ID NO:
HLA-A*01:01 YEMFNDKSF 932
HLA-A*02:01 HROEIFSHDFJ 933
HLA-B*07:02 FJIEJFOESS 934
HLA-B*08:01 NEIOREIREI 935
HLA-C*01:03 JFKSIFEMMSJDSSU 936
HLA-C*01:04 KNFLENFIESOFI 937
在一些实施方案中，外源性抗原性多肽包含或由表17所列的新抗原多肽组成。还描述了可与新抗原多肽结合的HLA多肽等位基因的非限制性实例，并且可用于设计与指定的新抗原多肽一起使用的期望的野生型或可负载抗原呈递多肽。
表17：新抗原多肽
Figure BDA0003302151970001891
Figure BDA0003302151970001901
Figure BDA0003302151970001911
Figure BDA0003302151970001921
Figure BDA0003302151970001931
Figure BDA0003302151970001941
Figure BDA0003302151970001951
Figure BDA0003302151970001961
Figure BDA0003302151970001971
Figure BDA0003302151970001981
Figure BDA0003302151970001991
Figure BDA0003302151970002001
Figure BDA0003302151970002011
Figure BDA0003302151970002021
Figure BDA0003302151970002031
Figure BDA0003302151970002041
Figure BDA0003302151970002051
Figure BDA0003302151970002061
Figure BDA0003302151970002071
Figure BDA0003302151970002081
Figure BDA0003302151970002091
Figure BDA0003302151970002101
Figure BDA0003302151970002111
在高度侵袭性中线神经胶质瘤中，组蛋白-3基因(H3F3A)中的频发点突变致使第27位氨基酸从赖氨酸变为甲硫氨酸(K27M)。Ochs等人(2017)Oncoimmunology 6(7):e1328340，其全文以引用方式并入本文)已显示针对K27M-突变体组蛋白-3的肽疫苗能够在主要组织相容性复合物(MHC)人源化小鼠模型中诱导有效的突变特异性的细胞毒性T细胞和T-辅助性-1-细胞介导的免疫应答。因此，在一些实施方案中，外源性抗原性多肽包含新抗原多肽H3F3A(K27M)。
在一些实施方案中，癌症是与致瘤病毒，例如埃巴病毒(EBV)、乙型肝炎和丙型肝炎(HBV和HCV)、人乳头状瘤病毒(HPV)、卡波西肉瘤病毒(KSV)和多瘤病毒相关联的癌症。在其他某些实施方案中，癌症是鉴定逆转录病毒表位的癌症。与病毒相关且可使用本公开的方法治疗的癌症包括但不限于宫颈癌、头颈癌、淋巴瘤和肾透明细胞癌。
HLA分子是免疫系统免疫识别和后续杀伤赘生性细胞所需的，因为肿瘤抗原必须以HLA限制性方式呈递以由T细胞受体识别。一些肿瘤细胞使用非经典HLA-I分子(HLA-E和HLA-G)的异常表达，其用作免疫感受态细胞的抑制剂配体，以逃避免疫识别并促进肿瘤免疫逃避(Moreau等人(2002)Cell.Mol.Life Sci.59(9):1460-6，其全文以引用方式并入本文)。HLA I类组织相容性抗原α链G(HLA-G)是非经典MHC I类分子，其包含重链α，该重链α包含α1、α2和α3结构域中的一者或多者。
在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞包含野生型或可负载抗原呈递多肽和外源性抗原性多肽，其中外源性抗原性多肽是HLA-G衍生的多肽。在一些实施方案中，HLA-G衍生的多肽选自以下所示的多肽：
HLA-G146-154-DYLALNEDL(SEQ ID NO:1555)
HLA-G194-202-RYLENGKEM(SEQ ID NO:1556)
HLA-G139-148-RYAYDGKDYL(SEQ ID NO:1557)
HLA-G141-150-AYDGKDYLAL(SEQ ID NO:1558)
在一些实施方案中，以上所示的肽结合至特异性HLA-A等位基因：HLA-A*24:02(例如，HLA-A*24:02:01:01)。因此，在一些实施方案中，野生型或可负载抗原呈递多肽包含HLA-A*24:02等位基因(例如，HLA-A*24:02:01:01等位基因)。在一些实施方案中，以上所示的肽结合至本文所述的其他HLAI类或II类等位基因。
在一个具体实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞包含至少一种外源性抗原性多肽PR1(即HLA-A2限制性肽)，其融合至含有HLA-A2多肽的野生型或可负载外源性抗原呈递多肽，该HLA-A2多肽融合至GPA跨膜结构域(PR1-HLA-A2-GPA)。在一些实施方案中，HLA-A2多肽不包含内源性跨膜结构域。在一些实施方案中，红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，红系细胞是有核细胞。
在某些实施方案中，本公开的工程化红系细胞或去核细胞用于治疗高度血管化肿瘤。不受理论的约束，更高血管化使得肿瘤更容易接近工程化红系细胞或去核细胞。例如，可通过毛细血管间距(认为反映肿瘤氧合)和微血管密度(提供肿瘤血管生成的组织学评估)来测量肿瘤血管。高血管性肿瘤可以是血管来源的任何肿瘤，例如血管瘤、淋巴管瘤、血管内皮瘤、卡波西肉瘤、血管肉瘤、成血管细胞瘤。
在其他实施方案中，本公开的工程化红系细胞或去核细胞用于治疗具有渗漏性脉管系统的肿瘤。人们普遍认为肿瘤中的血管是异常的。该异常的一个表现是内皮缺陷和渗漏。血管渗漏不仅影响肿瘤的内部环境并且可能影响血管生成速率，而且其还控制治疗剂的进入。不受理论的约束，更渗漏的血管将提供到达工程化红系细胞或去核细胞的更多通路。
自身免疫疾病
在某些实施方案中，本公开的工程化红系细胞或去核细胞提供了治疗自身免疫疾病的新型改善的方法。所提供用于治疗自身免疫疾病的方法具有许多优点，包括例如在细胞(例如，工程化红系细胞或去核细胞)表面上的抗原与野生型或可负载外源性抗原呈递多肽一起有效呈递，以及工程化红系细胞或去核细胞在循环中的极长半衰期，从而提供对适当呈递的抗原的延长暴露。
在一些实施方案中，本文提供了在有此需要的受试者中治疗自身免疫疾病的方法，其中该方法包括向受试者给药工程化红系细胞或去核细胞(或包含细胞的药物组合物)，其中工程化红系细胞或去核细胞包含含有野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的第一外源性多肽以及含有外源性抗原性多肽的第二外源性多肽，其中外源性抗原性多肽包含或由抗原组成，该抗原与自身免疫疾病相关联或者引起或引发自身免疫疾病，从而治疗自身免疫疾病。在一些实施方案中，本文提供了在有此需要的受试者中治疗自身免疫疾病的方法，其中该方法包括向受试者给药工程化红系细胞或去核细胞(或包含细胞的药物组合物)，其中工程化红系细胞或去核细胞包含含有野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的第一外源性多肽以及含有外源性抗原性多肽的第二外源性多肽，其中外源性抗原性多肽包含或由表18、19、20和B所示的氨基酸序列、或它们的片段组成，从而治疗自身免疫疾病。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽与外源性抗原性多肽结合(例如，共价或非共价附接)。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽不与外源性抗原性多肽结合(例如，共价或非共价附接)(例如为两个独立多肽)。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞还包含额外的外源性多肽，其中本文提供额外的外源性多肽(例如，包含至少一种共刺激多肽的外源性多肽)。
任何与自身免疫病相关联或者引起或引发自身免疫病的抗原(或其片段)可包括在本文所述的细胞上的外源性抗原性多肽中。例如，抗原可以是自身免疫应答所针对的自体抗原。在一些实施方案中，外源性抗原性多肽包含或由自体抗原组成。在一些实施方案中，外源性抗原性多肽包含或由表18所列的抗原、或它们的抗原部分组成。在一些实施方案中，外源性抗原性多肽包含或由表19所列的抗原、或它们的抗原部分组成。在一些实施方案中，外源性抗原性多肽包含或由表20所列的抗原、或它们的抗原部分组成。在所提供用于治疗自身免疫病症的方法中，其中工程化红系细胞或去核细胞包含野生型或可负载外源性抗原呈递多肽以及含有表18、19或20所列的抗原或它们的抗原部分的外源性抗原性多肽，可将工程化红系细胞或去核细胞给药于受试者以治疗对应于如表18、19或20所提供的抗原的自身免疫病症。
在一个方面，工程化红系细胞或去核细胞设计用于阻抑与自身免疫病症相关联或者驱动自身免疫病症的不期望的T细胞活性。因此，在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞还包含至少一种如本文所述的外源性共抑制多肽。在一些实施方案中，外源性共抑制多肽选自表10所列的共抑制多肽、或它们的片段。在一些实施方案中，外源性共抑制多肽选自IL-35、IL-10、VSIG-3和LAG3激动剂、或它们的片段。在一些实施方案中，共抑制多肽阻抑自身反应性T细胞。
在另一方面，工程化红系细胞或去核细胞设计用于刺激T调节细胞，从而使免疫系统偏向回更耐受状态。因此，在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞还包含至少一种如本文所述的外源性共刺激多肽。在一些实施方案中，至少一种外源性共刺激多肽扩增调节性T细胞(Treg)，并且例如是如本文所述的外源性Treg共刺激多肽。在一些实施方案中，外源性共刺激多肽包含或由表12所列的共刺激多肽、或它们的片段组成。在一些实施方案中，外源性共刺激多肽包含或由表13所列的共刺激多肽、或它们的片段组成。
在又一方面，工程化红系细胞或去核细胞设计用于扩增和刺激T细胞，例如细胞毒性CD8+T细胞。在该方面，自身免疫病症优选地为由致病原引起或引发的自身免疫病症。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞还包含至少一种如本文所述的外源性共刺激多肽。在一些实施方案中，至少一种外源性共刺激多肽扩增细胞毒性CD8+T细胞。在一些实施方案中，外源性共刺激多肽包含或由表9所列的共刺激多肽、或它们的片段组成。在一些实施方案中，共刺激多肽选自4-1BBL、LIGHT、抗CD28、CD80、CD86、CD70、OX40L、IL-7、IL-12、GITRL、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD83、CD155、CD112、与IL-15融合的IL-15Rα、IL-21、ICAM-1、LFA-1的配体、抗CD3、以及它们的片段、以及它们的组合。
在一些方面，本公开提供了一种治疗患有自身免疫疾病的受试者的方法，包括向受试者给药有效数量的本文所述的红系细胞，从而治疗自身免疫疾病。在各种实施方案中，自身免疫疾病可为表18、19、20、或B所提供的自身免疫疾病。在此类方法中，可用于治疗自身免疫病症的工程化红系细胞或去核细胞包含野生型或可负载外源性抗原呈递多肽和抗原多肽，其中抗原多肽可为表17、18、19、或B所列的抗原、或它们的抗原部分，其中包含如表17、18、19、或B所提供的抗原的工程化红系细胞或去核细胞用于治疗表17、18、19、或B所列的对应自身免疫病症。
在一些实施方案中，红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，红系细胞是有核细胞。
在一些实施方案中，自身免疫疾病是单抗原疾病。单抗原疾病及其相关抗原的实例显示于下表18中。
表18：自身免疫疾病和相关单抗原
疾病 抗原
视神经脊髓炎(NMO) 水通道蛋白4(AQP4)
重症肌无力(MG) 乙酰胆碱受体(AchR)
膜性肾小球肾炎 磷脂酶A2受体(PLA2R)
寻常型天疱疮(PV) 桥粒芯糖蛋白3(DSG3)
落叶型天疱疮(PF) 桥粒芯糖蛋白1(DSG1)
在另一个实施方案中，自身免疫疾病是多抗原疾病。在其中自身免疫疾病是多抗原疾病的一些实施方案中，可以用靶向多于一种，例如两种、三种、四种或更多种抗原(例如，包括多于一种包含抗原的外源性抗原性多肽)的工程化红系细胞或去核细胞治疗受试者。技术人员将认识到，多种抗原可存在于相同的工程化红系细胞或去核细胞上，或者它们可存在于不同的工程化红系细胞或去核细胞上(例如，两种、三种、四种或更多种不同的工程化红系细胞或去核细胞的组合，这些细胞各自包含含有单抗原的外源性抗原性多肽)，其给药于受试者以治疗障碍。多抗原疾病及其相关抗原的实例显示于下表19中。
表19：自身免疫疾病和相关多抗原
疾病 抗原
I型糖尿病(T1DM) 胰岛素/胰岛素原/前胰岛素原
I型糖尿病(T1DM) 谷氨酸脱羧酶(GAD65)
I型糖尿病(T1DM) 胰岛素瘤抗原-2(IA-2)
多发性硬化症(MS) 髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)
多发性硬化症(MS) 髓鞘碱性蛋白(MBP)
多发性硬化症(MS) 蛋白脂质蛋白(PLP)
抗磷脂综合征(APS)/CAPS β-2糖蛋白1(b2GP1)
乳糜泻 A-麦醇溶蛋白
在某些实施方案中，自身免疫疾病选自寻常型天疱疮、重症肌无力、视神经脊髓炎、大疱性类天疱疮、乳糜泻、多发性硬化症、1型糖尿病、类风湿性关节炎和膜性肾小球肾炎。
在一些实施方案中，还提供了在有此需要的受试者中治疗乳糜泻的方法，其中该方法包括向受试者给药工程化红系细胞或去核细胞(或包含细胞的药物组合物)，其中工程化红系细胞或去核细胞包含含有野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的第一外源性多肽以及含有外源性抗原性多肽的第二外源性多肽，其中外源性抗原性多肽包含或由表B所示的抗原氨基酸序列、或它们的片段组成，从而治疗乳糜泻。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含HLA-DQα多肽或其片段，以及HLA-DQβ多肽或其片段，其中HLA-DQα多肽和HLA-DQβ多肽包含以下等位基因的组合，以HLA-DQα等位基因：HLA-DQβ等位基因表示：DQA1*05:01:DQB1*2:01；DQA1*2:01:DQB1*2:02；DQA1*03:02:DQB1*2:02；DQA1*3:01:DQB1*4:02；DQA1*03:02:DQB1*4:02；DQA1*4:01:DQB1*4:02；DQA1*1:01:DQB1*5:01；DQA1*1:02:DQB1*5:01；DQA1*1:03:DQB1*5:01；DQA1*1:04:DQB1*5:01；DQA1*1:02:DQB1*5:02；DQA1*1:03:DQB1*5:02；DQA1*1:04:DQB1*5:03；DQA1*1:02:DQB1*5:04；DQA1*1:03:DQB1*6:01；DQA1*1:02:DQB1*6:02；DQA1*1:03:DQB1*6:02；DQA1*1:04:DQB1*6:02；DQA1*1:02:DQB1*6:03；DQA1*1:03:DQB1*6:03；DQA1*1:02:DQB1*6:04；DQA1*1:02:DQB1*6:09；DQA1*2:01:DQB1*3:01；DQA1*3:01:DQB1*3:01；DQA1*03:03:DQB1*3:01；DQA1*3:01:DQB1*3:04；DQA1*03:02:DQB1*3:04；DQA1*4:01:DQB1*3:01；DQA1*05:05:DQB1*3:01；DQA1*6:01:DQB1*3:01；DQA1*3:01:DQB1*3:02；DQA1*03:02:DQB1*3:02；DQA1*02:01:DQB1*3:03；DQA1*3:02:DQB1*3:03；DQA1*03:01:DQB1*03:02；DQA1*03:02:DQB1*03:02；DQA1*04:01:DQB1*03:02和DQA1*05:03:DQB1*03:02。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽包含HLA-DQα多肽或其片段，以及HLA-DQβ多肽或其片段，其中HLA-DQα多肽和HLA-DQβ多肽包含表B所提供的等位基因的组合，并且外源性抗原性多肽包含表B所提供的对应抗原氨基酸序列。
表B：乳糜泄的抗原
Figure BDA0003302151970002171
Figure BDA0003302151970002181
在一些实施方案中，自身免疫疾病选自下表20所列的那些。
表20：MS、1型糖尿病、RA和膜性肾炎的抗原
Figure BDA0003302151970002182
Figure BDA0003302151970002191
在某些实施方案中，本文所述的工程化红系细胞或去核细胞用于驱动患有I型糖尿病的受试者中的耐受诱导。在一个具体实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞包含含有野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的第一外源性多肽以及含有外源性抗原性多肽的第二外源性多肽，其中外源性抗原性多肽包含或由胰岛素B-链(特别是胰岛素B-链的一部分)组成。在某些实施方案中，胰岛素B-链的部分为胰岛素B-链的氨基酸9-23。在一些实施方案中，红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，红系细胞是有核细胞。
在一些实施方案中，自身免疫疾病是免疫活化疾病。免疫活化疾病还包括例如炎性疾病，如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、乳糜泻、或其他特发性炎症性肠病。免疫活化疾病还包括例如变应性疾病，如哮喘、花生过敏、贝类过敏、花粉过敏、乳蛋白过敏、昆虫叮咬过敏和乳胶过敏、动物皮毛过敏、黑胡桃和英国胡桃过敏、巴西坚果过敏、腰果过敏、栗子过敏、尘螨过敏、蛋过敏、鱼过敏、榛子过敏、霉菌过敏、花粉过敏、草过敏、贝类过敏、大豆过敏、树坚果过敏和小麦过敏。
免疫活化疾病还包括响应于给药以治疗原发性病症的治疗性蛋白的免疫活化，该免疫活化降低治疗性蛋白如甲型血友病中的凝血因子VIII、乙型血友病中的凝血因子IX、类风湿性关节炎和其他炎性疾病中的抗肿瘤坏死因子α(TNFa)抗体、高歇氏病中的葡糖脑苷脂酶、用于酶替代疗法的任何重组蛋白、或急性成淋巴细胞性白血病(ALL)中的天冬酰胺酶的功效。
在一些实施方案中，受试者患有自身免疫疾病或病症或自身抗体介导的疾病或病症，其中受试者的免疫系统有效对抗内源性(自体)分子(例如蛋白抗原)，使得免疫系统攻击内源性分子，诱导炎症，损伤组织，否则致使自身免疫或自身抗体疾病或病症的症状。免疫应答可以由结合内源性分子的抗体驱动，或者其可以由攻击表达内源性分子的细胞的过度活化T细胞驱动，或者其可以由其他免疫细胞如调节性T细胞、NK细胞、NKT细胞、或B细胞驱动。在这些实施方案中，对应于内源性(自体)分子的抗原蛋白或其片段可以在工程化红系细胞或去核细胞(包括红系细胞)上表达，从而呈递(例如，在细胞表面上包含)一种或多种如本文所述的外源性多肽。工程化红系细胞或去核细胞在一次或多次给药于患有疾病或病症的受试者时将足以诱导对抗原蛋白的耐受性，使得其不再诱导免疫系统的活化，并因此将治疗或改善潜在疾病或病症的症状。在某些实施方案中，使用工程化红系细胞或去核细胞来刺激T调节细胞，从而使免疫系统偏向回针对内源性(自体)分子的更耐受状态。
在一些实施方案中，受试者患有变应性疾病，例如对动物皮毛、黑胡桃、巴西坚果、腰果、栗子、尘螨、蛋、英国胡桃、鱼、榛子、昆虫毒液、乳胶、乳、霉菌、花生、花粉、草、贝类、大豆、树坚果或小麦的过敏症。在与过敏原的抗原片段接触时，例如通过饮食、皮肤接触、注射或环境暴露，患有过敏症的受试者可引起免疫应答。免疫应答可涉及IgE抗体、敏化肥大细胞、脱粒、组胺释放和过敏性反应，以及典型免疫细胞如T细胞、B细胞、DC、T调节细胞、NK细胞、嗜中性粒细胞和NKT细胞。变态反应可引起不适，或者其可严重到足以致死，并因此需要患者以及他或她的家属和看护人持续警觉。在这些实施方案中，抗原蛋白或其片段可存在于工程化红系细胞或去核细胞的红系细胞上(例如，作为本文所述的外源性抗原性多肽的部分)。这些细胞群在一次或多次给药于患有变应性疾病或病症的受试者时将足以诱导对抗原蛋白的耐受性，使得其在暴露时不再诱导免疫系统的活化，并因此将治疗或改善潜在变应性疾病或病症的症状。
与致病原相关联的自身免疫疾病
在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗与致病原相关联或者由致病原引发的自身免疫疾病或障碍的方法。与致病原相关联或者由致病原引发的示例性自身免疫疾病或障碍提供于表21中。
表21：自身免疫疾病和相关致病原：
自身免疫疾病 致病原
变应性脑炎 麻疹病毒
自身免疫肾病 链球菌感染
美洲锥虫病 克氏锥虫
慢性自身免疫性肝炎 丙型肝炎病毒
格-巴二氏综合征 空肠弯曲菌，巨细胞病毒，寨卡病毒
疱疹性角膜基质炎 单纯疱疹病毒
HTLV相关脊髓病 人T细胞白血病病毒
莱姆关节炎 博氏疏螺旋体
混合性冷球蛋白血症 丙型肝炎病毒
心肌炎 柯萨奇病毒B3
儿童自身免疫性神经精神障碍 链球菌感染
结节性多动脉炎 乙型肝炎病毒
原发性胆汁性肝硬化 大肠杆菌
反应性关节炎 小肠结肠炎耶尔森菌
瑞特氏综合征 沙眼衣原体，志贺氏菌属
风湿热 酿脓链球菌
风湿性心脏病 链球菌
类风湿性关节炎 正常肠道菌群
硬皮病 巨细胞病毒
图雷特综合症 链球菌感染
1型糖尿病 肠道病毒，轮状病毒
1型糖尿病 柯萨奇病毒B4
设想用本文所述的工程化红系细胞或去核细胞来治疗与致病原相关联的任何自身免疫病症(包括但不限于表21中呈现的那些障碍)。
如本公开所提供，与致病原相关联的自身免疫疾病可以通过向受试者给药工程化红系细胞或去核细胞来治疗，该工程化红系细胞或去核细胞包含含有野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的第一外源性多肽以及含有外源性抗原性多肽的第二外源性多肽，其中外源性抗原性多肽包含或由来自致病原的抗原或其片段(即靶向引发疾病的特异性致病原)组成。
在一个具体实施方案中，可用于治疗与致病原相关联的自身免疫病症的工程化红系细胞或去核细胞还包含外源性共刺激多肽。在一些实施方案中，外源性共刺激多肽活化细胞毒性CD8+T细胞，从而靶向和消除致病原感染的细胞。例如，细胞毒性CD8+T细胞可靶向、阻抑和/或消除致病原感染的自身反应性B细胞。外源性共刺激多肽可包括本文所述的共刺激多肽。在一些实施方案中，外源性共刺激多肽扩增细胞毒性CD8+T细胞。在一些实施方案中，外源性共刺激多肽包含或由表9所列的共刺激多肽组成。在一些实施方案中，共刺激多肽包含或由4-1BBL、LIGHT、抗CD28、CD80、CD86、CD70、OX40L、IL-7、IL-12、GITRL、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD83、CD155、CD112、与IL-15融合的IL-15Rα、IL-21、ICAM-1、LFA-1的配体、抗CD3、它们的片段、以及它们的组合组成。
在一些实施方案中，与致病原相关联的自身免疫疾病是多发性硬化症(MS)。几种致病原与MS相关联。与MS相关联的示例性致病原提供于表22中。在一些实施方案中，与自身免疫病症相关联的致病原是病毒。在一些实施方案中，用于治疗MS的工程化红系细胞或去核细胞包含含有野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的第一外源性多肽以及含有外源性抗原性多肽的第二外源性多肽，其中外源性抗原性多肽包含或由表22所示的氨基酸序列组成。
表22：与多发性硬化症(MS)相关联的致病原
Figure BDA0003302151970002221
Figure BDA0003302151970002231
在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有MS的受试者的方法，包括向受试者给药有效数量的工程化红系细胞或去核细胞，该工程化红系细胞或去核细胞包含含有野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的第一外源性多肽以及含有外源性抗原性多肽的第二外源性多肽，其中外源性抗原性多肽包含或由来自表22所列的致病原的抗原、或它们的免疫原性肽组成，从而治疗MS。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞还包含外源性共刺激多肽。
在一个具体实施方案中，与MS相关联的致病原是埃巴病毒(EBV)。不受任何具体理论的束缚，据信在原发性感染期间，EBV感染扁桃体中的自身反应性初始B细胞，驱动它们进入生发中心，在其中它们强烈增殖并分化为潜伏感染的自身反应性记忆B细胞，然后它们离开扁桃体并在血液中循环。EBV感染的B细胞的数量通常由EBV特异性细胞毒性CD8+T细胞控制，该EBV特异性细胞毒性CD8+T细胞杀伤增殖和裂解(lytically)感染的B细胞，但如果在该防御机制中存在缺陷则并非如此。存活的EBV感染的自身反应性记忆B细胞进入CNS，在其中它们居留下来并且产生寡克隆IgG和病原性自身抗体，其攻击髓鞘和CNS的其他组分。已在外周淋巴器官中由常见的全身性感染活化的自身反应性T细胞在血液中循环并进入CNS，在其中它们由EBV感染的自身反应性B细胞再活化，从而呈递与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合的CNS肽(Cp)。这些EBV感染的B细胞向自身反应性T细胞上的CD28受体提供共刺激存活信号(B7)，从而抑制活化诱导的T细胞凋亡，这通常发生在自身反应性T细胞进入CNS并且与不表达B7共刺激分子的非专业APC如星形胶质细胞和小胶质细胞相互作用时。在自身反应性T细胞已经由EBV感染的自身反应性B细胞再活化之后，它们产生细胞因子如白介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFNγ)和肿瘤坏死因子(TNF)，并且协调对CNS的自身免疫攻击，导致少突胶质细胞和髓鞘破坏。
如本文所提供，存在几种替代方式，其中工程化红系细胞或去核细胞可设计成并用于治疗受试者中的与致病原相关联或者由致病原引发的自身免疫疾病。例如，与致病原相关联的自身免疫疾病可另选地通过向受试者给药工程化红系细胞或去核细胞来治疗，该工程化红系细胞或去核细胞包含含有野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的第一外源性多肽、含有外源性抗原性多肽的第二外源性多肽，以及任选地含有至少一种共抑制多肽、或至少一种Treg共刺激多肽(本文也称为Treg扩增多肽)的第三外源性多肽。在一些实施方案中，外源性抗原性多肽包含来自致病原的抗原或其抗原片段(即，靶向引发疾病的致病原)。在一些实施方案中，抗原或其抗原片段是与感染诱导的自身免疫病症相关联的抗原(例如，自身多肽)。
在一些实施方案中，如以上对任何自身免疫病症更一般性描述的，可用于治疗与致病原相关联的自身免疫病症的工程化红系细胞或去核细胞还包含外源性Treg共刺激多肽。外源性Treg共刺激多肽可为本文所述的任何Treg扩增多肽。在一个实施方案中，外源性Treg共刺激多肽诱导Treg扩增，其继而阻抑受试者中响应于致病原而生成的T细胞。
在一些实施方案中，如以上对任何自身免疫病症更一般性描述的，可用于治疗与致病原相关联的自身免疫病症的工程化红系细胞或去核细胞包含外源共抑制多肽。外源性共抑制多肽可包含或由本文所述的任何共抑制多肽组成。在一些实施方案中，外源性共抑制多肽阻抑受试者中响应于致病原而生成的T细胞。
在另一个实施方案中，自身免疫疾病与致病原不相关。对于与致病原不相关的自身免疫疾病，本领域的技术人员基于本文别处的公开内容将认识到，可以通过向受试者给药工程化红系细胞或去核细胞来治疗自身免疫疾病，该工程化红系细胞或去核细胞包含含有野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的第一外源性多肽、含有外源性抗原性多肽(包含来自自身免疫活性所针对的内源性(自身)多肽的抗原或其片段)的第二外源性多肽，以及含有至少一种共抑制多肽或至少一种Treg扩增多肽的第三外源性多肽。在这些实施方案中，将工程化红系细胞或去核细胞给药于受试者，从而诱导对引发自身免疫应答的抗原的外周耐受。
感染性疾病
本文所提供的工程化红系细胞或去核细胞可用于在有此需要的受试者中治疗感染性疾病。因此，在一些方面，本公开提供了治疗患有感染性疾病的受试者的方法，包括向受试者给药对受试者有效的数量或量的本文所述的工程化红系细胞或去核细胞，从而治疗感染性疾病。
在一些实施方案中，本文提供了在有此需要的受试者中治疗感染性疾病的方法，其中该方法包括向受试者给药工程化红系细胞或去核细胞(或包含细胞的药物组合物)，其中工程化红系细胞或去核细胞包含含有野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的第一外源性多肽以及含有外源性抗原性多肽的第二外源性多肽，其中外源性抗原性多肽包含或由来自病原体或致病原的抗原组成，从而治疗感染性疾病。在各种实施方案中，抗原是病原体的抗原，例如病毒病原体、细菌病原体、真菌病原体或寄生性病原体。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞包括包含野生型或可负载外源性抗原呈递多肽的第一外源性多肽、包含含有第一抗原(例如，病原体的第一抗原)的外源性抗原性多肽的第二外源性多肽，以及包含含有第二抗原(例如，来自病原体的第二抗原)的第二外源性抗原性多肽的第三外源性多肽。两种抗原可衍生自两种不同的蛋白质，或者它们可衍生自相同的蛋白质。例如，在一些实施方案中，第一抗原或第二抗原是HPV-E6抗原。在一些实施方案中，第一抗原或第二抗原是HPV-E7抗原。在一些实施方案中，第一抗原是HPV-E6抗原，并且第二抗原是HPV-E7抗原。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽与外源性抗原性多肽结合(例如，共价或非共价附接)。在一些实施方案中，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽不与外源性抗原性多肽结合(例如，共价或非共价附接)(例如为两个独立多肽)。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞还包含额外的外源性多肽，其中本文提供额外的外源性多肽(例如，包含至少一种共刺激多肽的外源性多肽)。
在某些实施方案中，本公开提供了包含一种或多种外源性多肽的工程化红系细胞或去核细胞，包括红系细胞(例如去核红系细胞)或去核细胞，其中一种或多种外源性多肽中的一种包含感染性疾病治疗剂。在一些实施方案中，红系细胞是去核红系细胞。在一些实施方案中，红系细胞是有核红系细胞。
如本文所用，“感染性疾病治疗剂”是指这样的外源性多肽，其抑制感染性疾病，例如减少或缓解感染性疾病的病因或症状，或者改善与感染性疾病相关联的参数(例如病毒载量或细菌载量)的值。在一些实施方案中，感染性疾病治疗剂是第一或第二外源性多肽，其在与其他外源性多肽一起存在或表达时抑制感染性疾病。在一个实施方案中，第一或第二感染性疾病治疗剂在不存在另一者的情况下具有活性。在一些实施方案中，感染性疾病治疗剂例如通过杀伤病原体来直接抑制感染性疾病。在一些实施方案中，感染性疾病治疗剂通过刺激受试者的免疫应答来抑制感染性疾病，例如作为疫苗。
在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞包含含有第一感染性疾病治疗剂的第一外源性多肽以及含有第二感染性疾病治疗剂的第二外源性多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞包含含有第一感染性疾病治疗剂的第一外源性多肽、含有第二感染性疾病治疗剂的第二外源性多肽，以及含有第三感染性疾病治疗剂的第三外源性多肽。
第一、第二和第三感染性疾病治疗剂可作用于相同的靶标，例如细胞表面受体和/或内源性人蛋白。或者，第一、第二和第三抗癌治疗剂可作用于不同的靶标。第一、第二或第三靶标可以是相同生物途径的成员，其中任选地靶标是细胞表面受体、内源性人蛋白。第一、第二或第三靶标可处于不同的细胞类型上。在一些实施方案中，第一外源性多肽使工程化红系细胞定位到期望的位点，例如人细胞，并且第二外源性多肽具有治疗活性，例如抗原呈递活性。
在某些优选的实施方案中，感染性疾病治疗剂是抗原，例如来自病原体或致病原(其中“病原体”和“致病原”在本文中互换使用)的抗原。在一些实施方案中，第一治疗剂是抗原，例如来自病原体的抗原。在一些实施方案中，第一治疗剂和第二治疗剂是抗原，例如来自病原体的抗原。在某些实施方案中，第一、第二和第三治疗剂是抗原，例如来自病原体的抗原。
在一些实施方案中，可以用包含多于一种，例如两种、三种、四种、五种或更多种不同的外源性抗原性多肽的工程化红系细胞或去核细胞来治疗受试者。在一些实施方案中，多种外源性抗原性多肽可存在于相同的工程化去核红系细胞上。在一些实施方案中，多种外源性抗原性多肽可存在于两种或更多种不同的工程化去核红系细胞上，其中将不同工程化去核红系细胞的组合给药于受试者以治疗障碍。
外源性抗原性多肽可包括本领域已知的任何病原性抗原或其抗原部分。可包括在本文所述的红系细胞或去核细胞上的一种或多种外源性抗原性多肽中的示例性病原性抗原在以下有详细描述，但并非旨在进行限制。在各种实施方案中，外源性抗原性多肽包括来自下表21、22、23和24中的任一者所提供的病原体的抗原。技术人员将认识到，可将如本文所提供的工程化红系细胞或去核细胞给药于受试者以治疗受试者中由该病原体或致病原引起的感染，该工程化红系细胞或去核细胞包含含有来自特定病原体或致病原的抗原的外源性抗原性多肽。技术人员还将认识到，可将如本文所提供的工程化红系细胞或去核细胞给药于受试者以治疗受试者中的疾病或障碍，其中疾病或障碍直接或间接地由该病原体或致病原的感染引起，该工程化红系细胞或去核细胞包含含有来自特定病原体或致病原的抗原的外源性抗原性多肽。
在一些方面，本公开提供了治疗患有感染性疾病的受试者的方法，包括向受试者给药对受试者有效的数量的本文所述的红系细胞，从而治疗感染性疾病。
在另一方面，本公开提供了治疗患有感染性疾病的受试者的方法，包括向受试者给药有效数量的包含一种或多种外源性多肽的工程化红系细胞或去核细胞，包括红系细胞(例如，去核红系细胞)或去核细胞，其中一种或多种外源性多肽中的一种包含病原性抗原，从而治疗感染性疾病。
在某些实施方案中，感染性疾病治疗剂选自公众可获得的生物信息学数据库上列出的抗微生物多肽，如CAMP、CAMP release 2(抗微生物肽的序列和结构的集合(Collection of sequences and structures of antimicrobial peptides))、抗微生物肽数据库(Antimicrobial Peptide Database)(可获得于万维网，aps.unmc.edu/AP/main.php)、LAMP、BioPD和ADAM(抗微生物肽的数据库(ADatabase of Anti-Microbialpeptides))(可获得于万维网，bioinformatics.cs.ntou.edu.tw/adam/)。抗微生物肽数据库可基于其所含的肽的来源分为两个种类，作为特定数据库和一般数据库。这些数据库具有用于抗微生物肽分析和预测的各种工具。例如，CAMP含有AMP预测、特征计算器、BLAST搜索、clustalW、VAST、PRATT、Helical wheel等。此外，ADAM允许用户搜索或浏览AMP序列-结构关系。
在某些实施方案中，感染性疾病治疗剂选自病毒多肽。在这些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞包括包含一种或多种外源性多肽的红系细胞(例如，去核红系细胞)或去核细胞，其中一种或多种外源性多肽中的一种包含抗原性病毒多肽，并且将工程化红系细胞或去核细胞给药于受试者以治疗病毒感染。
病毒感染包括腺病毒、柯萨基病毒、甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、埃巴病毒、1型单纯疱疹病毒、2型单纯疱疹病毒、人巨细胞病毒、8型人疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、乳头瘤病毒、狂犬病病毒和风疹病毒。其他病毒靶标包括副黏液病毒科(例如，肺炎病毒、麻疹病毒、偏肺病毒、呼吸道病毒或腮腺炎病毒)、腺病毒科(例如，腺病毒)、沙粒病毒科(例如，沙粒病毒，如淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒)、动脉炎病毒科(例如，猪繁殖与呼吸综合征病毒或马动脉炎病毒)、布尼雅病毒科(例如，白蛉病毒或汉坦病毒)、杯状病毒科(例如，诺沃克病毒)、冠状病毒科(例如，冠状病毒或环曲病毒)、丝状病毒科(例如，埃博拉病毒)、黄病毒科(例如，肝炎病毒或黄病毒)、疱疹病毒科(例如，单纯疱疹病毒、水痘病毒、巨细胞病毒、玫瑰疹病毒、或淋巴滤泡病毒)、正黏液病毒科(例如，流感病毒或托高土病毒)、细小病毒科(例如，细小病毒)、小核糖核酸病毒科(例如，肠道病毒或肝病毒)、痘病毒科(例如，正痘病毒、禽痘病毒、或兔痘病毒)、逆转录病毒科(例如，慢病毒或泡沫病毒)、呼肠孤病毒科(例如，轮状病毒)、弹状病毒科(例如，狂犬病病毒、弹状病毒、或水泡病毒)以及披膜病毒科(例如，甲病毒属或风疹病毒)。这些病毒的具体实例包括人呼吸道冠状病毒、甲型-丙型流感病毒、甲型至庚型肝炎病毒以及1-9型单纯疱疹病毒。
示例性病毒病原体显示于下表23中。在某些实施方案中，病毒病原体选自乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、埃巴病毒、巨细胞病毒(CMV)。
表23：病毒病原体
Figure BDA0003302151970002281
Figure BDA0003302151970002291
在某些实施方案中，用于治疗感染性疾病的外源性抗原性多肽包含抗原选自病毒、逆转录病毒和睾丸抗原的抗原。例如，在某些实施方案中，病毒选自埃巴病毒(EBV)、乙型肝炎(HBV)、丙型肝炎(HCV)、人乳头状瘤病毒(HPV)、卡波西肉瘤病毒(KSV)和多瘤病毒。在一些实施方案中，病毒为乙型肝炎(HBV)。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有与致瘤病毒(例如HPV)相关联的癌症的受试者的方法，包括向受试者给药有效数量的包含一种或多种外源性抗原性多肽的工程化红系细胞或去核细胞，其中一种或多种外源性抗原性多肽中的一种包含表8的HPV抗原。在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有与致瘤病毒(例如HPV)相关联的癌症的受试者的方法，包括向受试者给药有效数量的包含一种或多种外源性抗原性多肽的工程化红系细胞或去核细胞，其中一种或多种外源性抗原性多肽中的一种包含HPV-E7抗原。在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有与致瘤病毒(例如HPV)相关联的癌症的受试者的方法，包括向受试者给药有效数量的包含两种或更多种外源性抗原性多肽的工程化红系细胞或去核细胞，其中两种或更多种外源性抗原性多肽包含HPV-E7抗原和HPV-E6抗原。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有病毒感染的受试者的方法，包括向受试者给药有效数量的包含一种或多种外源性抗原性多肽的工程化红系细胞或去核细胞，其中一种或多种外源性抗原性多肽中的一种包含来自表23所列的致病原或其免疫原性肽的抗原，从而治疗病毒感染。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞还包含野生型或可负载外源性抗原呈递多肽，以及任选地外源性共刺激多肽。
在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗乙型肝炎感染，例如慢性HBV感染的方法。据估计全世界有高达2.5亿人患有慢性乙型肝炎，其主要在子宫内或在分娩期间传播。慢性HBV导致硬化症和肝细胞癌。HBV的病理可能是由于乙型肝炎抗原特异性T细胞募集非抗原特异性T细胞，这些非抗原特异性T细胞分泌细胞因子，引起肝损伤。已提出衰竭的T细胞是慢性肝炎的病因学的关键。已经报道HBV特异性T细胞通过PD1阻断，例如通过抗PD1和/或IL-12再活化(Schirdewahn等人(2017)J.Infect.Dis.215(1):139-49；Fisicaro等人(2010)Gastroenterology 138(2):682-93,693.e1-4；和Schurich等人(2013)PLOSPathogens 9(3):e1003208；其每者的全部内容以引用方式并入本文)。因此，本公开设想了本文所提供的工程化红系细胞或去核细胞可用于通过再活化HBV特异性T细胞的例如细胞溶解性或非细胞溶解性抗病毒活性来治疗慢性HBV。
因此，在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有乙型肝炎病毒(HBV)感染的受试者的方法，包括向受试者给药有效数量的包含一种或多种外源性抗原性多肽的工程化红系细胞或去核细胞，其中一种或多种外源性抗原性多肽中的一种包含HBV特异性抗原、或其免疫原性肽，从而治疗HBV感染。在一些实施方案中，HBV感染是慢性HBV感染。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞还包含野生型或可负载外源性抗原呈递多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞还包含至少一种外源性共刺激多肽。在一些实施方案中，至少一种外源性共刺激多肽包含4-1BBL、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、它们的片段、以及它们的任何组合，例如IL-12和IL-15、或4-1BBL和IL-15。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞还包含额外的外源性多肽，其中额外的外源性多肽包含检查点抑制剂。在一些实施方案中，检查点抑制剂是PD1的抗体分子。在一个具体实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞包含含有一种或多种外源性多肽的红系细胞，其中一种或多种外源性多肽包含：含有HBV特异性抗原的外源性抗原性多肽、或其免疫原性肽，野生型或可负载外源性抗原呈递多肽，含有例如IL-12或4-1BBL的外源性共刺激多肽，以及含有检查点抑制剂(例如，PD1抗体)的外源性多肽。
在某些实施方案中，感染性疾病治疗剂选自细菌多肽。在这些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞包括包含一种或多种外源性抗原性多肽的红系细胞(例如，去核红系细胞)或去核细胞，其中一种或多种外源性抗原性多肽中的一种包含抗原性细菌多肽，并且将工程化红系细胞或去核细胞给药于受试者以治疗细菌感染。
细菌感染包括但不限于分枝杆菌属(Mycobacteria)、立克次体属(Rickettsia)、支原体属(Mycoplasma)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)、淋病双球菌(Neisseria gonorrheoeae)、军团菌属(Legionella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、链球菌属(Streptococci)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、白喉杆菌(Corynobacteria diphtheriae)、梭菌属种(Clostridium spp.)、产肠毒素大肠杆菌(Eschericia coli)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、立克次体属(Rickettsia)、汉赛巴尔通体(Bartonella henselae)、五日热巴尔通体(Bartonella quintana)、伯氏考克斯体(Coxiella burnetii)、衣原体属(chlamydia)、麻风分枝杆菌(Mycobacteriumleprae)、沙门氏菌属(Salmonella)；志贺氏菌属(shigella)；小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)；假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)；嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)；结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)；单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)；支原体属种(Mycoplasma spp.)；荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)；霍乱弧菌(Vibrio cholerae)；流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)；炭疽杆菌(Bacillus anthracis)；梅毒螺旋体(Treponemapallidum)；钩端螺旋体属(Leptospira)；疏螺旋体属(Borrelia)；白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)；弗朗西斯氏菌属(Francisella)；马尔他布鲁杆菌(Brucella melitensis)；空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)；肠杆菌属(Enterobacter)；奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)；变形杆菌属(Proteus)；和肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)。
示例性细菌病原体显示于下表24中。
表24：细菌病原体
Figure BDA0003302151970002321
Figure BDA0003302151970002331
Figure BDA0003302151970002341
Figure BDA0003302151970002351
在某些实施方案中，感染性疾病治疗剂选自真菌多肽。在这些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞包括包含一种或多种外源性抗原性多肽的红系细胞(例如，去核红系细胞)或去核细胞，其中一种或多种外源性抗原性多肽中的一种包含抗原性真菌多肽，并且将工程化红系细胞或去核细胞给药于受试者以治疗真菌感染。
示例性真菌病原体显示于下表25中。
表25：真菌病原体
Figure BDA0003302151970002352
Figure BDA0003302151970002361
在某些实施方案中，感染性疾病治疗剂选自寄生虫多肽。在这些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞包括包含一种或多种外源性抗原性多肽的红系细胞(例如，去核红系细胞)或去核细胞，其中一种或多种外源性抗原性多肽中的一种包含抗原性寄生虫多肽，并且将工程化红系细胞或去核细胞给药于受试者以治疗寄生虫感染。
示例性寄生性病原体显示于下表26中。
表26：寄生性病原体
Figure BDA0003302151970002362
Figure BDA0003302151970002371
Figure BDA0003302151970002381
Figure BDA0003302151970002391
在一些实施方案中，感染性疾病是多重耐药性葡萄球菌感染(例如，金黄色葡萄球菌感染)。在另一个实施方案中，感染性疾病是假单胞菌属感染。在另一个实施方案中，感染性疾病是难以治疗的医院获得性感染(即，由致病原或毒素的反应所致的任何全身性或局部病症)，例如由艰难梭状芽胞杆菌引起的感染。
其他
设想通过本公开的工程化红系细胞或去核细胞来治疗其他疾病和障碍。实例包括但不限于心血管疾病和免疫疾病。
受试者
本文所述的方法旨在用于可能经历这些方法的有益效果的任何受试者。因此，“受试者(subject)”和“个体”(可互换使用)包括人类以及非人类受试者，特别是驯养动物。
在一些实施方案中，受试者和/或动物是哺乳动物，例如，人类、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、母牛、猪、兔子、绵羊、或非人灵长类，如猴、黑猩猩或狒狒。在其他实施方案中，受试者和/或动物是非哺乳动物。在一些实施方案中，受试者和/或动物是人类。在一些实施方案中，人类是人类儿童。在其他实施方案中，人类是成人。在其他实施方案中，人类是老年人。在其他实施方案中，人类可称为受试者。
在某些实施方案中，人类的年龄范围为约0月龄至约6月龄、约6至约12月龄、约6至约18月龄、约18至约36月龄、约1至约5年龄、约5至约10年龄、约10至约15年龄、约15至约20年龄、约20至约25年龄、约25至约30年龄、约30至约35年龄、约35至约40年龄、约40至约45年龄、约45至约50年龄、约50至约55年龄、约55至约60年龄、约60至约65年龄、约65至约70年龄、约70至约75年龄、约75至约80年龄、约80至约85年龄、约85至约90年龄、约90至约95年龄或约95至约100年龄。
在其他实施方案中，受试者是非人动物，并因此本公开涉及兽医学用途。在一个具体的实施方案，非人动物是家庭宠物。在另一个具体的实施方案中，非人动物是家畜动物。在某些实施方案中，受试者是不能接受化疗的人类癌症受试者，例如受试者对化疗无反应，或者病得不能对化疗具有合适的治疗窗(例如，经历太多的剂量或方案限制性副作用)。在某些实施方案中，受试者是患有晚期和/或转移性疾病的人类癌症受试者。
在一些实施方案中，选择受试者用于采用本公开的包含一种或多种外源性多肽的工程化红系细胞或去核细胞来治疗。在一些实施方案中，选择受试者用于采用本公开的包含一种或多种外源性多肽的工程化红系细胞或去核细胞来治疗癌症。在一些实施方案中，选择受试者用于采用本公开的包含一种或多种外源性多肽的工程化红系细胞或去核细胞来治疗自身免疫疾病。在一些实施方案中，选择受试者用于采用本公开的包含一种或多种外源性多肽的工程化红系细胞或去核细胞来治疗感染性疾病。
在以上方面和实施方案的一些实施方案中，工程化红系细胞是去核红系细胞。在以上方面和实施方案的一些实施方案中，工程化红系细胞是有核红系细胞。
IV.药物组合物
本公开涵盖了药物组合物的制备和使用，该药物组合物包含本公开的工程化红系细胞或去核细胞作为活性成分。此类药物组合物可由单独的活性成分、适于给药于受试者的形式的至少一种活性成分(例如，有效剂量的工程化红系细胞或去核细胞)的组合组成，或者药物组合物可包含活性成分和一种或多种药学上可接受的载体、一种或多种额外的(活性和/或非活性)成分、或这些的一些组合。
在一些实施方案中，本公开的特征为包含本文所述的多个工程化红系细胞或去核细胞以及药用载体的药物组合物。在其他实施方案中，本公开的特征为包含如本文所述的工程化红系细胞或去核细胞的群体以及药用载体的药物组合物。应当理解，如本文别处所述的任何单一工程化红系细胞或去核细胞、多个工程化红系细胞或去核细胞、或工程化红系细胞或去核细胞的群体可以存在于本公开的药物组合物中。
在一些实施方案中，本文所提供的药物组合物包含工程化(即经修饰)红系细胞和未经修饰的红系细胞。例如，在各种实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞的单一单位剂量可包含约、至少、或不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％的工程化红系细胞，其中组合物中剩余的红系细胞是未经工程化的。
在一些实施方案中，本文所提供的药物组合物包含工程化红系细胞或去核细胞，包括工程化红系细胞或去核细胞和有核红系细胞。例如，在各种实施方案中，工程化红系细胞(例如去核和有核红系细胞)的单一单位剂量可包含约或至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的去核红系细胞，其中组合物中剩余的红系细胞是有核的。
可将本公开的药物组合物以适于待治疗(或预防)疾病的方式给药。给药的量和频率将由诸如受试者的状况以及受试者的疾病的类型和严重程度等因素决定，但适当的剂量可由临床试验决定。
药物组合物的给药可以以任何方便的方式进行，包括通过雾化吸入、注射、摄入、输液、植入或移植。可将本公开的组合物经皮下、皮内、肌内、静脉内(i.v.)注射或腹膜内给药于受试者。可将药物组合物直接注射到肿瘤或淋巴结中。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”意指活性成分可与之组合并且在组合后可用于将活性成分给药于受试者的化学组合物。
本文所述的药物组合物的制剂可通过药理学领域已知或此后开发的任何方法来制备。通常，此类制备方法包括以下步骤：使活性成分与载体或者一种或多种其他辅助成分结合，然后，如果必要或需要，将产物成形或包装成期望的单剂量或多剂量单位。
虽然本文所提供的药物组合物的描述主要涉及适于向人类伦理给药的药物组合物，但是技术人员将理解，此类组合物通常适于给药于所有种类的动物。对适于给药于人类的药物组合物改良以使得组合物适于给药于各种动物是公知的，并且普通的熟练兽医药理学家可以仅仅用普通的(如果有的话)实验来设计和执行此类改良。设想本公开的药物组合物所给药的受试者包括但不限于人和其他灵长类、哺乳动物(包括商业上相关的哺乳动物，如非人灵长类、牛、猪、马、绵羊、猫和狗)、鸟类(包括商业上相关的鸟类，如鸡、鸭、鹅和火鸡)、鱼类(包括农场饲养的鱼类和观赏鱼)，以及甲壳类(如农场饲养的贝类)。
可用于本公开的方法的药物组合物可以以适于口服、直肠、阴道、肠胃外、局部、肺部、鼻内、病灶内、颊面、眼部、静脉内、器官内或另一种给药途径的制剂来制备、包装或出售。其他设想的制剂包括计划的纳米粒子、脂质体制剂、含有本文所述的外源性多肽的再密封红细胞，以及基于免疫学的制剂。
本公开的药物组合物可以作为单一单位剂量或作为多个单一单位剂量来制备、包装或散装出售。如本文所用，“单位剂量”是包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于将给药于受试者的活性成分的剂量，或此类剂量的方便部分，如此类剂量的二分之一或三分之一。
本公开的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的载体和任何额外的成分的相对量将取决于所治疗的受试者的身份、体型和状况，并且进一步取决于组合物所给药的途径而变化。以举例的方式，组合物可包含0.1％至100％(w/w)活性成分。
除活性成分之外，本公开的药物组合物还可包含一种或多种额外的药物活性剂。特别设想的额外试剂包括止吐剂和清除剂，如氰化物和氰酸酯清除剂和AZT、蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、白介素-2、干扰素、细胞因子等。
本公开的药物组合物的控释或缓释制剂可使用常规技术进行制备。
如本文所用，药物组合物的“肠胃外给药”包括以受试者组织的物理破裂为特征的任何给药途径，以及通过组织中的破裂来给药药物组合物。因此，肠胃外给药包括但不限于通过注射组合物，通过手术切口施用组合物，通过组织穿透非手术创伤施用组合物等来给药药物组合物。特别地，预期肠胃外给药包括但不限于皮下、腹膜内、肌内、胸骨内注射和肾透析输注技术。
适于肠胃外给药的药物组合物的制剂包含与药学上可接受的载体(如无菌水或无菌等渗盐水)组合的活性成分。此类制剂可以以适于快速浓注给药或连续给药的形式制备、包装或出售。可注射制剂可以以单位剂量形式制备、包装或出售，如在安瓿中或在含有防腐剂的多剂量容器中。用于肠胃外给药的制剂包括但不限于混悬剂、溶液、油性或水性媒介物中的乳剂、糊剂，以及可植入缓释或可生物降解制剂。此类制剂还可包含一种或多种额外的成分，包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。
药物组合物可以以无菌可注射水性或油性混悬剂或溶液的形式制备、包装或出售。混悬剂或溶液可以根据已知技术配制，并且除了活性成分之外还可包含额外的成分，如本文所述的分散剂、润湿剂、或悬浮剂。此类无菌可注射制剂可使用例如无毒的肠胃外可接受稀释剂或溶剂，如水或1,3-丁二醇进行制备。其他可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于林格氏液、等渗氯化钠溶液，以及固定油如合成单-或二-甘油酯。其他可用的可肠胃外给药制剂包括包含微晶形式、脂质体制剂、或作为可生物降解聚合物体系的组分的活性成分的那些。用于缓释或植入的组合物可包含药学上可接受的聚合物或疏水性材料，如乳液、离子交换树脂、微溶性聚合物、或微溶性盐。
可将本公开的工程化红系细胞或去核细胞和/或使用工程化红系细胞或去核细胞扩增的T细胞给药于动物，优选地人类。当给药使用本公开的工程化红系细胞或去核细胞扩增的T细胞时，所给药的细胞的量可在约1百万至约3000亿个细胞的范围内。当给药工程化红系细胞或去核细胞本身时，无论是否有由此扩增的T细胞，它们均可以以约100,000至约10亿个细胞范围内的量给药，其中将细胞输注到动物，优选地有此需要的人类受试者中。虽然所给药的确切剂量将取决于任何数量的因素而变化，包括但不限于动物的类型和所治疗的疾病状态的类型、动物的年龄和给药途径。
工程化红系细胞或去核细胞可以以每天数次的频率给药于动物，或者其可以以较低的频率给药，如每天一次、每周一次、每两周一次、每月一次、或甚至更低的频率，如每数月一次或甚至每年一次或更少。剂量的频率对于技术人员将是容易显而易见的，并且将取决于任何数量的因素，如但不限于所治疗疾病的类型和严重程度、动物的类型和年龄等。
可将工程化红系细胞或去核细胞(或由此扩增的细胞)与各种其他化合物(细胞因子、化疗和/或抗病毒药物等)共同施用。或者，可在工程化红系细胞或去核细胞(或由此扩增的细胞)或其任何排列之前一小时、一天、一周、一个月或甚至更久给药化合物。另外，可以在给药工程化红系细胞或去核细胞(或由此扩增的细胞)或其任何排列之后一小时、一天、一周或甚至更久给药化合物。频率和给药方案对于技术人员将是容易显而易见的，并且将取决于任何数量的因素，如但不限于所治疗疾病的类型和严重程度、动物的年龄和健康状态、所给药的一种或多种化合物的特性、各种化合物和工程化红系细胞或去核细胞(或由此扩增的细胞)的给药途径等。
另外，本领域的技术人员基于本文所提供的公开内容将理解，在工程化红系细胞或去核细胞给药于哺乳动物的情况下，细胞处理成使得它们处于“无生长状态”；即，当给药于哺乳动物时，细胞不能分裂。如本文别处所公开，可以照射细胞以使它们一旦给药到哺乳动物中就不能生长或分裂。其他方法，包括半抗原化(例如，使用二硝基苯基和其他化合物)在本领域已知用于使待给药于尤其是人类的细胞不能生长，并且这些方法在本文中不作进一步讨论。此外，使用用编码本文所讨论的一些分子的质粒载体转染的工程化红系细胞或去核细胞，在I期临床试验中建立了使得不能在体内分裂的工程化红系细胞或去核细胞的给药安全性。
联合疗法
在一些实施方案中，本公开提供了还包括将额外的试剂给药于受试者的方法。在一些实施方案中，本公开涉及共同给药和/或共同配制。
在一些实施方案中，当与另一种试剂共同给药时，给药的工程化红系细胞或去核细胞协同地起作用，并且以低于此类试剂用作单一疗法时通常采用的剂量的剂量给药。
在一些实施方案中，包括但不限于癌症应用，本公开涉及作为额外试剂的化学治疗剂。化学治疗剂的实例包括但不限于烷基化剂如噻替哌和CYTOXAN环磷酰胺；烷基磺酸盐如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺类(ethylenimines)和甲基三聚氰胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯(acetogenins)(例如，布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物拓扑替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin)；卡拉汀(cally statin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻素(cryptophycins)(例如，念珠藻素1和念珠藻素8)；尾海兔素(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CB 1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；软海绵素(spongistatin)；氮芥类如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧化氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、乌拉莫司汀(uracil mustard)；亚硝基脲类，如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司丁(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，如烯二炔类抗生素(例如，卡奇霉素(calicheamicin)，尤其是卡奇霉素gammall和卡奇霉素omegall；dynemicin，包括dynemicin A；二膦酸盐，如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯佩拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)发色团和相关的色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomy sins)、放线菌素、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博莱霉素(bleomycins)、放线菌素C(cactinomycin)、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5--氧代-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢药如甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，如卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺素如氨鲁米特(minoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充物，如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；阿莫司汀(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；秋水仙胺(demecolcine)；亚丝醌(diaziquone)；elformithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓(gallium nitrate)；羟基脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱(maytansinoids)，如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫匹丹莫(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；苯来美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖复合物；雷佐生(razoxane)；利索新(rhizoxin)；西索菲兰(sizofuran)；锗螺胺(spirogermanium)；替奴佐酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯(trichothecenes)(例如，T-2毒素、疣孢菌素(verracurin)A、漆斑菌素(roridin)A和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托新(gacytosine)；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派(thiotepa)；紫杉烷类(taxoids)，例如TAXOL紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-Myers SquibbOncology,Princeton,N.J.)、ABRAXANE无Cremophor的白蛋白工程化纳米粒子紫杉醇制剂和TAXOTERE多西他赛(doxetaxel)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；GEMZAR吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；NAVELBINE长春瑞滨(vinorelbine)；米托蒽醌(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(Camptosar，CPT-11)(包括伊立替康与5-FU和甲酰四氢叶酸的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(difluoromethylornithine,DMFO)；类维生素A(retinoids)，如视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；康普瑞汀(combretastatin)；甲酰四氢叶酸(LV)；奥沙利铂(oxaliplatin)，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；拉帕替尼(lapatinib)(TYKERB)；降低细胞增殖的PKC-α.、Raf、H-Ras、EGFR(例如，埃罗替尼(Tarceva))和VEGF-A的抑制剂，以及任何上述的药学上可接受的盐、酸或衍生物。此外，治疗方法还可包括使用辐射。
一些人肿瘤可以通过受试者的免疫系统消除。例如，给药靶向免疫“检查点”分子的单克隆抗体可以导致完全应答和肿瘤缓解。此类抗体的作用模式是通过抑制免疫调节分子，肿瘤选择该免疫调节分子以抵御抗肿瘤免疫应答。通过抑制这些“检查点”分子(例如，采用拮抗性抗体)，可允许受试者的CD8+T细胞增殖并破坏肿瘤细胞。
例如，给药靶向例如但不限于CTLA-4或PD-1的单克隆抗体可以导致完全应答和肿瘤缓解。此类抗体的作用模式是通过抑制CTLA-4或PD-1，肿瘤选择CTLA-4或PD-1以抵御抗肿瘤免疫应答。通过抑制这些“检查点”分子(例如，采用拮抗性抗体)，可允许受试者的CD8+T细胞增殖并破坏肿瘤细胞。
因此，工程化红系细胞或去核细胞，包括本文所提供的呈递(例如在细胞表面上包含)一种或多种外源性多肽的去核细胞或红系细胞可以与靶向免疫“检查点”分子的一种或多种封闭抗体组合使用。例如，在一些实施方案中，本文所提供的组合物可以与一种或多种靶向分子如CTLA-4或PD-1的封闭抗体组合使用。例如，本文所提供的组合物可以与阻断、降低和/或抑制PD-1和PD-L1或PD-L2和/或PD-1与PD-L1或PD-L2结合的试剂(作为非限制性实例，纳武单抗(ONO-4538/BMS-936558、MDX1106、OPDIVO、BRISTOL MYERS SQUIBB)、派姆单抗(KEYTRUDA、Merck)、匹地利珠单抗(pidilizumab)(CT-011、CURE TECH)、MK-3475(MERCK)、BMS936559(BRISTOL MYERS SQUIBB)、MPDL328OA(ROCHE)中的一种或多种)组合使用。在一个实施方案中，本文所提供的组合物可以与阻断、降低和/或抑制CTLA-4的活性和/或CTLA-4与一种或多种受体(例如CD80、CD86、AP2M1、SHP-2和PPP2R5A)结合的试剂组合使用。例如，在一些实施方案中，免疫调节试剂是抗体，如但不限于易普利姆玛(MDX-010、MDX-101、Yervoy、BMS)和/或替西木单抗(Pfizer)。针对这些分子的封闭抗体可获自例如BristolMyers Squibb(New York,N.Y.)、Merck(Kenilworth,N.J.)、Medlmmune(Gaithersburg,Md.)和Pfizer(New York,N.Y.)。
另外，本文所提供的工程化红系细胞或去核细胞组合物可以与一种或多种封闭抗体组合使用，所述封闭抗体靶向例如免疫“检查点”分子，如BTLA、HVEM、TIM3、GALS、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160(也称为BY55)、CGEN-15049、CHK 1和CHK2激酶、A2aR、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、GITR、GITRL、半乳糖凝集素-9、CD244、CD160、TIGIT、SIRPα、ICOS、CD172a以及TMIGD2和各种B-7家族配体(包括但不限于B7-1、B7-2、B7-DC、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H5、B7-H6和B7-H7)。
在以上方面和实施方案的一些实施方案中，红系细胞是去核红系细胞。在以上方面和实施方案的一些实施方案中，红系细胞是有核红系细胞。
在一些实施方案中，本公开的特征为包含本文所述的多个工程化红系细胞以及药用载体的药物组合物。在其他实施方案中，本公开的特征为包含如本文所述的工程化红系细胞的群体以及药用载体的药物组合物。应当理解，如本文别处所述的任何单一工程化红系细胞、多个工程化红系细胞、或工程化红系细胞的群体可以存在于本公开的药物组合物中。
在一些实施方案中，本文所提供的药物组合物包含工程化(即经修饰)红系细胞和未经修饰的红系细胞。例如，在各种实施方案中，红系细胞(例如，经修饰和未经修饰的红系细胞)的单一单位剂量可包含约、至少、或不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％的工程化红系细胞，其中组合物中剩余的红系细胞是未经工程化的。
在一些实施方案中，本文所提供的药物组合物包含工程化红系细胞或去核细胞以及有核红系细胞。例如，在各种实施方案中，工程化红系细胞(例如，去核和有核红系细胞)的单一单位剂量可包含约或至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的去核红系细胞，其中组合物中剩余的红系细胞是有核的。
实施例
实施例1：包含可负载抗原呈递多肽的工程化去核红系细胞可用抗原多肽负载并活化抗原特异性T细胞受体
为了确定包含外源性可负载抗原呈递多肽的工程化去核红系细胞是否可以负载(例如，特异性地结合至外源性抗原性多肽)，以及一旦负载，它们是否能够活化抗原特异性T细胞受体(TCR)，执行以下实验。
简而言之，生成工程化去核红系细胞，其包括以下项中的任一者：
(1)抗原呈递多肽，其包含野生型HLA*02:01多肽、β2M多肽、GPA和FLAG-标签(“wtHLA-A2”)，如SEQ ID NO:38所示(以下)，
MSRSVALAVLALLSLSGLEAIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQPTIPIGSGSGSGSDYKDDDDKGSGSGSGSLSTTEVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEVSEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSDVKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQ(SEQ ID NO:38)；
(2)可负载抗原呈递多肽，其包含具有氨基酸取代Y84C和A139C的突变体HLA*02:01多肽、β2M多肽、GPA和FLAG-标签(“ds HLA-A2”)，如SEQ ID NO:39所示(以下)，
MSRSVALAVLALLSLSGLEAIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGCYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMCAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQPTIPIGSGSGSGSDYKDDDDKGSGSGSGSLSTTEVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEVSEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSDVKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQ(SEQ ID NO:39)；或者
(3)融合多肽，其包含HPV E7肽、具有氨基酸取代Y84A的突变体HLA*02:01多肽、β2M多肽、GPA和FLAG-标签(“sc三聚体”)，如SEQ ID NO:40所示(以下)，
MSRSVALAVLALLSLSGLEAYMLDLQPETGGGGSGGGGSGGGGSIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGAYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQPTIPIGSGSGSGSEDGSGSGSGSLSTTEVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEVSEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSDVKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQ(SEQID NO:40)，
为了生成工程化去核红系细胞，获得了衍生自正常人供体的动员后外周血细胞的人CD34+红系前体细胞。扩增/分化程序包括3个阶段。在第一阶段，在补充有白蛋白、重组人胰岛素、人转铁蛋白、重组人fms样酪氨酸激酶3配体、重组人干细胞因子、重组人白介素3和重组人白介素6的Iscove的MDM培养基中，将解冻的CD34+红系前体细胞以1E5个细胞/mL的接种密度培养7天。在第二阶段，在补充有重组人胰岛素、人转铁蛋白、地塞米松、脂质混合物、重组人白介素3、人重组干细胞因子、人重组促红细胞生成素和L-谷氨酰胺的Iscove的MDM培养基中，将红系细胞以1E5个细胞/mL的起始密度培养7天。在第三阶段，在补充有人转铁蛋白、重组人胰岛素、人重组促红细胞生成素、重组人干细胞因子、人AB血清、人外周血血浆和肝素钠盐的Iscove的MDM培养基中，将红系细胞以1E5个细胞/mL的起始密度培养9天。在各种天数，将新鲜的分化培养基添加到培养物中。使培养物在5％CO2培养箱中于37℃维持。在上述培养过程的第7天，将前体细胞用慢病毒载体转导，该慢病毒载体包含编码所关注多肽(例如，可负载抗原呈递多肽)的基因。转导反应在37℃下孵育过夜。次日，将红系细胞以2,000rpm轻轻地离心5分钟，除去上清液，并且将细胞再悬浮于新鲜的红系分化培养基中并在37℃下进一步培养。
将以上“(3)”中所述的融合多肽用作对照，因为其已经包括抗原多肽并且不需要负载额外的抗原多肽。为了负载抗原呈递多肽，在37℃下，使上述工程化红系细胞与HPV E7抗原多肽(YMLDLQPET；SEQ ID NO:41)在包含1μg/mL肽的无血清Iscove的改良Dulbecco培养基(IMDM)中接触90分钟。在该时段后，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)短暂洗涤两次，然后用含血清的IMDM单次洗涤，并且在补充有人血清白蛋白、重组人胰岛素、人转铁蛋白、人重组促红细胞生成素和人血浆的Iscove的MDM培养基中培养，然后将细胞在后一培养基中于37℃培养多至6天(如所指定)。
为了评估工程化去核红系细胞活化对负载的HPV E7肽具有特异性的TCR的能力，执行TCR活性测定。简而言之，将工程化成表达HPV E7特异性TCR的NFAT-Luc报告T淋巴细胞系(InvivoGenTM)与不同量的已培养0、3或6天的工程化去核红系细胞接触18-22小时。报告T淋巴细胞系用于评估工程化红系细胞在TCR接合后活化信号转导途径的能力，其通过使用QUANTI-LucTM(InvivogenTM)萤光素酶检测试剂测定细胞培养悬浮液中的萤光素酶水平来评估，如制造商所指示。将所测量的信号相对于T淋巴细胞报告细胞的基线发光活性标准化，并表示为发光的倍数增加。
如图3A所示，当报告T淋巴细胞与已经培养0天的包含wt HLA-A2或ds HLA-A2抗原呈递多肽的负载抗原的工程化去核红系细胞接触时，观察到剂量依赖性应答。
当报告T淋巴细胞与培养3天后的包含wt HLA-A2的负载抗原的工程化去核红系细胞接触时，也观察到剂量依赖性应答(图3B)。然而，当报告T淋巴细胞与培养3天后的包含dsHLA-A2的负载抗原的工程化去核红系细胞接触时，没有观察到活性或观察到最小活性。不希望受任何特定理论的束缚，据信使用已经培养3天的细胞观察到的活性的缺乏可能是归因于HPV E7抗原多肽从ds HLA-A2外源性抗原呈递多肽卸载。
最终，当报告T淋巴细胞与培养6天后的包含ds HLA-A2或wt HLA-A2的负载抗原的工程化去核红系细胞接触时，没有观察到活性或观察到最小活性，而包含sc三聚体的工程化去核红系细胞能够诱导应答(图3C)。
实施例2：抗原呈递多肽细胞表面水平在工程化去核红系细胞上是稳定的，无论多肽的负载状态如何
为了检查工程化去核红系细胞的细胞表面上的抗原呈递多肽随时间推移的稳定性，在未负载状态下或在负载HPV E7肽之后，在包含wt HLA-A2或ds HLA-A2抗原呈递多肽(以上实施例1中所述)的细胞上监测多肽的水平。简而言之，如实施例1所述，工程化去核红系细胞是未负载的或者负载有HPV E7肽。在37℃下，将细胞在补充有人血清白蛋白、重组人胰岛素、人转铁蛋白、人重组促红细胞生成素和人血浆的Iscove的MDM培养基中培养10天的时段。在第0、3、5、7和10天，用抗β2M抗体、或抗HLA-A2抗体染色后，通过流式细胞术分析细胞。
如图4A所示(用抗β2M抗体染色的细胞)，在用抗β2M抗体染色的细胞中，从第0天至第3天观察到信号强度(以平均荧光强度(MFI)表示)的最小限度降低；然而，从第3天到第10天信号强度保持稳定。另外，如图4B所示(用抗HLA-A2抗体染色的细胞)，当用抗HLA-A2抗体对细胞染色时，没有观察到信号强度的降低。该数据表明，wt HLA-A2或ds HLA-A2抗原呈递多肽两者的细胞表面水平在工程化去核红系细胞上是稳定的，而与抗原呈递多肽的负载状态无关。
实施例3：包含抗原呈递多肽的工程化去核红系细胞可用多种抗原多肽负载并特异性地活化TCR
为了确定包含可负载抗原呈递多肽的工程化去核红系细胞是否可负载有多种抗原多肽并且能够活化多种抗原特异性TCR，执行以下实验。简而言之，使用包含以下的工程化去核红系细胞：wt HLA-A2或ds HLA-A2抗原呈递多肽(以上实施例1中所述)，或包含具有氨基酸取代Y84C和A139C的突变体HLA*02:01多肽、β2M多肽和GPA的可负载抗原呈递多肽(“无FLAG的ds HLA-A2”)，如SEQ ID NO:42所示(以下)。
MSRSVALAVLALLSLSGLEAIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGCYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMCAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQPTIPIGSGSGSGSEDGSGSGSGSLSTTEVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEVSEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSDVKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQ(SEQ ID NO:42)
通过将细胞与包含10μg/mL、1μg/mL、或100ng/mL的如实施例1所述的各抗原多肽的无血清IMDM接触，使细胞同时负载HPV E7抗原多肽(YMLDLQPET；SEQ ID NO:41)和HPV E6抗原多肽(TIHDIILECV；SEQ ID NO:43)两者。作为阳性对照，使用包含sc三聚体融合多肽(参见实施例1)的工程化红系细胞。作为阴性对照，使用由未转导的红系前体细胞生成的红系细胞。
使用TCR活性测定来评估工程化去核红系细胞活化TCR的能力，所述TCR对负载的HPV E7肽或负载的HPV E6肽具有特异性。使用工程化成表达HPV E7特异性TCR或HPV E6特异性TCR的NFAT-Luc报告T淋巴细胞系(InvivoGenTM)，如实施例1所述执行TCR活性测定。
如图5A、5B和5C所示，当包含HPV E7特异性TCR的报告T淋巴细胞与工程化红系细胞接触时，观察到剂量依赖性应答，该工程化红系细胞包含以所有使用的抗原多肽负载浓度负载HPV E7抗原多肽的wt HLA-A2、ds HLA-A2、或无FLAG的ds HLA-A2抗原呈递多肽。另外，如图5D、5E和5F所示，在所使用的HPV E6抗原多肽的所有负载浓度下，包含负载HPV E6抗原多肽的wt HLA-A2、ds HLA-A2和无FLAG的ds HLA-A2抗原呈递多肽的工程化红系细胞活化HPV E6特异性TCR。此外，包含sc三聚体融合多肽的工程化红系细胞在表达HPV E6特异性TCR的报告T淋巴细胞中不诱导应答，因为融合多肽包含HPV E7抗原多肽(而不是HPV E6抗原多肽)。
为了证实当报告T淋巴细胞与包含可负载抗原呈递多肽的工程化去核红系细胞接触时观察到的应答是特异性的，使用包含wt HLA-A2、ds HLA-A2、或无FLAG的ds HLA-A2抗原呈递多肽的细胞。细胞是未负载的(即，未与抗原多肽接触以负载抗原呈递多肽)，或者负载有HPV E7抗原多肽(YMLDLQPET；SEQ ID NO:41)或HPV E6抗原多肽(TIHDIILECV；SEQ IDNO:43)，如实施例1所述。采用表达HPV E7特异性TCR或HPV E6特异性TCR的报告T淋巴细胞，使用包含未负载的抗原呈递多肽的细胞来执行TCR活性测定。此外，包含负载有HPV E6抗原多肽的抗原呈递多肽的细胞用于采用表达HPV E7特异性TCR的报告T淋巴细胞来执行TCR活性测定，而负载有HPV E7抗原多肽的细胞用于采用表达HPV E6特异性TCR的报告T淋巴细胞的TCR活性测定中。作为阳性对照，采用表达HPV E7特异性TCR或HPV E6特异性TCR的报告T淋巴细胞，使用包含sc三聚体融合多肽的工程化去核红系细胞来执行TCR活性测定。
如图6所示，当使用包含未负载抗原呈递多肽的细胞时没有观察到活性(参见对应于“非脉冲的+E7 TCR”和“非脉冲的+E6 TCR”的数据)。包含sc三聚体融合多肽的工程化去核红系细胞仅活化表达HPV E7特异性TCR的报告T淋巴细胞，而不活化表达HPV E6特异性TCR的报告T淋巴细胞。另外，当i)包含负载有HPV E6抗原多肽的抗原呈递多肽的细胞与表达HPV E7特异性TCR的报告T淋巴细胞接触；或者ii)包含负载有HPV E7抗原多肽的抗原呈递多肽的细胞与表达HPV E6特异性TCR的报告T淋巴细胞接触时，没有观察到活性。因此，包含可负载抗原呈递多肽的工程化去核细胞能够活化对负载的抗原多肽具有特异性的TCR。
实施例4：与包含野生型HLA*02:01的抗原呈递多肽相比包含突变体HLA*02:01的可负载抗原呈递多肽表现出更快的抗原多肽负载
为了检查可负载抗原呈递多肽的抗原多肽负载动力学，执行以下实验。简而言之，如实施例1所述，在4℃、室温(RT)、或37℃下，将包含wt HLA-A2、或突变体ds HLA-A2抗原呈递多肽的工程化去核红系细胞用10ng/mL的两种四甲基罗丹明(TAMRA)标记的HPV E7抗原多肽形式之一来标记约90分钟：HPV E7-GGK(YMLDLQPETGGK，其中赖氨酸(K)残基是TAMRA标记的(SEQ ID NO:44))或HPV E7-E18K(YMLDLQPKT，其中赖氨酸(K)残基是TAMRA标记的(SEQID NO:45))。通过使用流式细胞术检测抗原多肽负载后细胞上的荧光信号强度来测量结合动力学。
如图7A-7C所示，在所有测试的温度下，HPV E7-E18K荧光肽比HPV E7-GGK荧光肽更快速地负载到包含wt HLA-A2抗原呈递多肽的细胞上，以及负载到包含ds HLA-A2可负载抗原呈递多肽的细胞上。然而，与包含wt HLA-A2抗原呈递多肽的细胞的结合速率(on-rate)动力学相比，观察到在包含ds HLA-A2可负载抗原呈递多肽的细胞上结合速率动力学更快。不希望受任何特定理论的束缚，据信结合速率动力学的差异可能是由于对HPV E7抗原多肽的亲和力增加。
实施例5：包含负载有CMV抗原多肽的可负载抗原呈递多肽的工程化去核红系细胞能够活化和诱导CMV特异性T细胞的扩增
为了评估包含负载有外源性抗原性多肽的可负载抗原呈递多肽的工程化去核红系细胞活化抗原肽特异性T细胞的能力，使用如实施例1所述生成的包含wt HLA-A2或突变体ds HLA-A2抗原呈递多肽的人工程化去核红系细胞来执行以下实验。
首先，为了评估负载CMV抗原多肽的工程化去核红系细胞活化CMV特异性TCR的能力，执行以下实验。通过在37℃下以2x107个细胞/mL再悬浮于补充有含有1μg/ml的CMV抗原多肽(NLVPMVATV；SEQ ID NO:155)的10％胎牛血清的RPMI中90分钟，使工程化去核红系细胞负载CMV抗原多肽。将细胞随后用PBS洗涤两次，并用补充有10％胎牛血清的RPMI洗涤一次。随后，以10:1、2:1、或0.4:1的红系细胞与T细胞比率，将工程化去核红系细胞与从HLA-A2限制性供体获得的CMV特异性CD8+T细胞接触4小时。作为阴性对照，使用与CMV抗原多肽接触的(UNT-脉冲的)或未与CMV抗原多肽接触的(UNT-非脉冲的)由未转导的红系前体细胞生成的红系细胞。
通过执行流式细胞术来测量每个条件的TCR活化程度，以鉴定具有升高的细胞内NFAT(图8B)或细胞内Nur77(图8C)表达水平的T细胞的频率。简而言之，将细胞用ICFixation Buffer(InvitrogenTM)固定，用含有PE抗NFATc1
Figure BDA0003302151970002561
和Alexa
Figure BDA0003302151970002562
647抗Nur77单克隆抗体(BD BIOSCIENCES)两者的Permabilization Buffer(InvitrogenTM)渗透化，并使用流式细胞术进行分析。
如图8A和8B所示，当CMV特异性CD8+T细胞与包含负载CMV抗原多肽的wt HLA-A2、或ds HLA-A2多肽的工程化去核红系细胞接触时观察到NFAT和Nur77的表达水平提高，这指示CMV特异性CD8+T细胞稳健的活化。相比之下，与对照去核红系细胞接触的T细胞表现出NFAT和Nur77的背景表达水平，这指示最小TCR活化。
第二，为了评估负载CMV抗原多肽的工程化去核红系细胞诱导CMV特异性CD8+T细胞扩增的能力，执行以下实验。通过在37℃下以2x106个细胞/mL再悬浮于含有1μg/ml的CMV抗原多肽(NLVPMVATV；SEQ ID NO:155)的无血清X-VIVOTM15培养基中90分钟，使工程化去核细胞负载CMV抗原多肽。将细胞随后用PBS洗涤两次并用无血清X-VIVOTM15洗涤一次。随后，在细胞表面上具有两种外源性多肽，即包含IL-12的第一外源性多肽和包含4-1BBL的第二外源性多肽的工程化去核红系细胞的第二群体的存在下，使负载CMV抗原多肽的工程化去核红系细胞与获自与上述实验相同的HLA-A2限制性供体的PBMC以4:1的红系细胞与T细胞比率接触。作为阴性对照，使用与CMV抗原多肽接触的(UNT-脉冲的)由未转导的红系前体细胞生成的红系细胞。在孵育5天后，将细胞混合物用荧光标记的CMV-HLA-A2四聚体染色，并通过流式细胞术分析以定量CMV特异性T细胞扩增。
如图8D所示，相比于与对照细胞接触的(UNT-脉冲的)PBMC，当PBMC与包含负载CMV抗原多肽的wt HLA-A2、或ds HLA-A2多肽的工程化去核红系细胞接触时，观察到CMV特异性T细胞的稳健扩增。
这些实验表明，包含负载有CMV抗原多肽的可负载抗原呈递多肽的工程化去核红系细胞能够实现原代T细胞的稳健TCR活化和扩增。
实施例6：包含HLA II类多肽的可负载抗原呈递多肽可稳定地表达在哺乳动物细胞的表面上
为了确定包含HLA II类多肽的未负载抗原多肽的外源性可负载抗原呈递多肽是否能够在哺乳动物细胞表面上稳定地表达，执行以下实验。
通过用编码以下的慢病毒转导K562细胞，生成包含含有HLA II类多肽的可负载抗原呈递多肽(如图9A中示出)的K562细胞：
(1)抗原呈递多肽，其包含野生型HLA-DRA*01:01多肽(不包括天然跨膜结构域和胞质区域)、GlySer接头、HLA-DRB1*01:01多肽(不包括天然跨膜结构域和胞质区域)和GPA跨膜结构域，如SEQ ID NO:1591所示(以下)：
MSRSVALAVLALLSLSGLEAGDTRPRFLWQLKFECHFFNGTERVRLLERCIYNQEESVRFDSDVGEYRAVTELGRPDAEYWNSQKDLLEQRRAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRRVEPKVTVYPSKTQPLQHHNLLVCSVSGFYPGSIEVRWFRNGQEEKAGVVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPRSGEVYTCQVEHPSVTSPLTVEWRARSESAQSKTGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGTIKEEHVIIQAEFYLNPDQSGEFMFDFDGDEIFHVDMAKKETVWRLEEFGRFASFEAQGALANIAVDKANLEIMTKRSNYTPITNVPPEVTVLTNSPVELREPNVLICFIDKFTPPVVNVTWLRNGKPVTTGVSETVFLPREDHLFRKFHYLPFLPSTEDVYDCRVEHWGLDEPLLKHWEFDAPSPLPETTELSTTEVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEVSEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSDVKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQ(信号序列加下划线)；或者
(2)可负载抗原呈递多肽，其包含HLA-DPA1*01:03多肽(不包括天然跨膜结构域和胞质区域)、GlySer接头、HLA-DPB1*04:01多肽(不包括天然跨膜结构域和胞质区域)和GPA跨膜结构域，如SEQ ID NO:1592所示(以下)，
MSRSVALAVLALLSLSGLEARATPENYLFQGRQECYAFNGTQRFLERYIYNREEFARFDSDVGEFRAVTELGRPAAEYWNSQKDILEEKRAVPDRMCRHNYELGGPMTLQRRVQPRVNVSPSKKGPLQHHNLLVCHVTDFYPGSIQVRWFLNGQEETAGVVSTNLIRNGDWTFQILVMLEMTPQQGDVYTCQVEHTSLDSPVTVEWKAQSDSARSKTLTGAGGTGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGTAGAIKADHVSTYAAFVQTHRPTGEFMFEFDEDEMFYVDLDKKETVWHLEEFGQAFSFEAQGGLANIAILNNNLNTLIQRSNHTQATNDPPEVTVFPKEPVELGQPNTLICHIDKFFPPVLNVTWLCNGELVTEGVAESLFLPRTDYSFHKFHYLTFVPSAEDFYDCRVEHWGLDQPLLKHWEAQEPIQMPETTELSTTEVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEVSEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSDVKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQ(信号序列加下划线)。
通过用抗HLA-DR/DP单克隆抗体(MEM-136)-APC(Thermo Fisher Scientific)或抗HLA-DR小鼠抗体(LN3)-
Figure BDA0003302151970002581
(ABCAM)对细胞染色来检测包含HLA II类多肽的可负载抗原呈递多肽的表达。如图9B和9C所示，在转导的K562细胞上观察到包含HLA II类多肽的两种可负载抗原呈递多肽的表达。这些结果表明，包含尚未负载抗原多肽的HLA II类多肽的外源性可负载抗原呈递多肽可成功地在哺乳动物细胞的表面上表达。
国际专利公开No.WO 2019/126818的内容据此全文以引用方式并入。
本文提及的所有出版物、专利和专利申请据此全文以引用方式并入，如同每个单独的出版物、专利或专利申请具体和单独地指示以引用方式并入。如发生矛盾，以本申请(包括本文中的任何定义)为准。

Claims (111)

1.一种工程化去核红系细胞，其包含细胞表面上的可负载外源性抗原呈递多肽，其中所述可负载外源性抗原呈递多肽包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代使所述细胞表面上的所述可负载外源性抗原呈递多肽稳定化。
2.根据权利要求1所述的工程化去核红系细胞，其中所述可负载外源性抗原呈递多肽在不存在与所述外源性抗原呈递多肽结合的多肽的情况下是稳定化的。
3.根据权利要求1或2所述的工程化去核红系细胞，其还包含与所述可负载外源性抗原呈递多肽结合的外源性抗原性多肽。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的工程化去核红系细胞，其中所述可负载外源性抗原呈递多肽对所述外源性抗原性多肽比对外源性可置换多肽具有更高的亲和力。
5.根据权利要求3或4所述的工程化去核红系细胞，其中所述外源性抗原性多肽以约1皮摩尔至约100纳摩尔的KD与所述可负载外源性抗原呈递多肽结合。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的工程化去核红系细胞，其中所述外源性抗原性多肽包含表7-8、16-26或B中任一项所提供的氨基酸序列。
7.根据权利要求3-6中任一项所述的工程化去核红系细胞，其中所述外源性抗原性多肽包含表7所提供的氨基酸序列。
8.根据权利要求3-7中任一项所述的工程化去核红系细胞，其中所述外源性抗原性多肽与所述可负载外源性抗原呈递多肽非共价附接。
9.根据权利要求3-7中任一项所述的工程化去核红系细胞，其中所述外源性抗原性多肽与所述可负载外源性抗原呈递多肽共价附接。
10.根据权利要求9所述的工程化去核红系细胞，其中所述外源性抗原性多肽通过接头与所述可负载外源性抗原呈递多肽共价附接。
11.根据权利要求9或10所述的工程化去核红系细胞，其中外源性抗原性多肽包含反应性官能团，所述反应性官能团与所述可负载外源性抗原呈递多肽的氨基酸残基形成共价键，其中所述反应性官能团是选自以下的二氮杂环丙烯基团或硫醇反应性官能团：(i)2-氰基苯并噻唑(CBT)；(ii)马来酰亚胺或马来酰亚胺衍生物；(iii)芳基丙腈；(iv)砜；(v)丙二烯酰胺(allenamide)；(v)二溴哒嗪二酮；(vi)二硫化物；和(vii)卤代乙酰胺。
12.根据权利要求11所述的工程化去核红系细胞，其中所述反应性官能团是硫醇反应性官能团，并且所述外源性抗原性多肽与所述可负载外源性抗原呈递多肽的半胱氨酸残基共价连接。
13.根据权利要求1或2所述的工程化去核红系细胞，其中所述可负载外源性抗原呈递多肽包含接头，其中所述接头包含用于缀合外源性抗原性多肽的受体序列。
14.根据权利要求10-13中任一项所述的工程化去核红系细胞，其中所述接头为约10个氨基酸至30个氨基酸长度。
15.根据权利要求10-14中任一项所述的工程化去核红系细胞，其中所述接头为约15个氨基酸残基长度。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的工程化去核红系细胞，其中所述可负载外源性抗原呈递多肽包含跨膜结构域。
17.根据权利要求16所述的工程化去核红系细胞，其中所述跨膜结构域包含1型膜蛋白的跨膜结构域。
18.根据权利要求17所述的工程化去核红系细胞，其中所述1型膜蛋白包含血型糖蛋白A(GPA)。
19.根据权利要求1所述的工程化去核红系细胞，其还包含与所述可负载外源性抗原呈递多肽结合的可置换外源性多肽。
20.根据权利要求19所述的工程化去核红系细胞，其中所述外源性可置换多肽能够被外源性抗原性多肽从所述可负载外源性抗原呈递多肽替换下来。
21.根据权利要求19或20所述的工程化去核红系细胞，其中所述外源性可置换多肽为约6个氨基酸长度至约30个氨基酸长度。
22.根据权利要求19-21中任一项所述的工程化去核红系细胞，其中所述外源性可置换多肽以约1nM至约100μM的KD与所述可负载外源性抗原呈递多肽结合。
23.根据权利要求19-21中任一项所述的工程化去核红系细胞，其中所述外源性可置换多肽包含表6所提供的氨基酸序列。
24.根据权利要求19-23中任一项所述的工程化去核红系细胞，其中所述可负载外源性抗原呈递多肽和所述外源性可置换多肽包含在单链融合蛋白中。
25.根据权利要求24所述的工程化去核红系细胞，其中所述单链融合蛋白包含设置在所述可负载外源性抗原呈递多肽与所述外源性可置换多肽之间的接头。
26.根据权利要求25所述的工程化去核红系细胞，其中所述接头包含酶切割位点。
27.根据权利要求26所述的工程化去核红系细胞，其中所述酶切割位点包含氨基酸序列LEVLFQGP(SEQ ID NO:1)。
28.根据权利要求26所述的工程化去核红系细胞，其中所述酶切割位点包含氨基酸序列ENLYFQG(SEQ ID NO:2)。
29.根据权利要求26所述的工程化去核红系细胞，其中所述酶切割位点在距GGG基序的10个氨基酸或更少之内。
30.根据权利要求26所述的工程化去核红系细胞，其中所述酶切割位点在距LPTXG基序(SEQ ID NO:3)的10个氨基酸或更少之内。
31.根据权利要求26所述的工程化去核红系细胞，其中所述酶切割位点在距氨基酸序列AHIVMVDAYKPTK(SEQ ID NO:4)的10个氨基酸或更少之内。
32.根据权利要求26所述的工程化去核红系细胞，其中所述酶切割位点在距氨基酸序列ATHIKFSKRD(SEQ ID NO:5)的10个氨基酸或更少之内。
33.根据权利要求25-32中任一项所述的工程化去核红系细胞，其中所述接头为约10个氨基酸至30个氨基酸长度。
34.根据权利要求25-33中任一项所述的工程化去核红系细胞，其中所述接头为约15个氨基酸残基长度。
35.根据权利要求24所述的工程化去核红系细胞，其中所述单链融合蛋白包含跨膜结构域。
36.根据权利要求35所述的工程化去核红系细胞，其中所述跨膜结构域包含1型膜蛋白的跨膜结构域。
37.根据权利要求36所述的工程化去核红系细胞，其中所述1型膜蛋白包含血型糖蛋白A(GPA)。
38.根据权利要求1-37中任一项所述的工程化去核红系细胞，其中所述可负载外源性抗原呈递多肽包含人类白细胞抗原α(HLA)重链多肽和β-2-微球蛋白(β2M)多肽、或它们的片段。
39.根据权利要求1-38中任一项所述的工程化去核红系细胞，其中所述可负载外源性抗原呈递多肽包含设置在所述HLAα重链多肽与所述β2M多肽之间的接头。
40.根据权利要求39所述的工程化去核红系细胞，其中所述接头是GlySer接头。
41.根据权利要求39或40所述的工程化去核红系细胞，其中所述接头为约2至约30个氨基酸残基长度。
42.根据权利要求39-41中任一项所述的工程化去核红系细胞，其中所述接头为约18个氨基酸残基长度。
43.根据权利要求38-42中任一项所述的工程化去核红系细胞，其中所述HLA重链多肽衍生自HLA I类多肽。
44.根据权利要求43所述的工程化去核红系细胞，其中所述HLA I类多肽选自：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E和HLA-G。
45.根据权利要求44所述的工程化去核红系细胞，其中所述HLA-A多肽包含选自以下的HLA-A等位基因：A*01:01、A*02:01、A*03:01、A*24:02、A*11:01、A*29:02、A*32:01、A*68:01、A*31:01、A*25:01、A*26:01、A*23:01和A*30:01。
46.根据权利要求44所述的工程化去核红系细胞，其中所述HLA-B多肽包含选自以下的HLA-B等位基因：B*08:01、B*07:02、B*44:02、B*15:01、B*40:01、B*44:03、B*35:01、B*51:01、B*27:05、B*57:01、B*18:01、B*14:02、B*13:02、B*55:01、B*14:01、B*49:01、B*37:01、B*38:01、B*39:01、B*35:03和B*40:02。
47.根据权利要求44所述的工程化去核红系细胞，其中所述HLA-C多肽包含选自以下的HLA-C等位基因：C*07:01、C*07:02、C*05:01、C*06:02、C*04:01、C*03:04、C*03:03、C*02:02、C*16:01、C*08:02、C*12:03、C*01:02、C*15:02、C*07:04和C*14:02。
48.根据权利要求44所述的工程化去核红系细胞，其中所述HLA-E多肽包含选自以下的HLA-E等位基因：E*01:01:01:01、E*01:01:01:02、E*01:01:01:03、E*01:01:01:04、E*01:01:01:05、E*01:01:01:06、E*01:01:01:07、E*01:01:01:08、E*01:01:01:09、E*01:01:01:10、E*01:01:02、E*01:03:01:01、E*01:03:01:02、E*01:03:01:03、E*01:03:01:04、E*01:03:02:01、E*01:03:02:02、E*01:03:03、E*01:03:04、E*01:03:05、E*01:04、E*01:05、E*01:06、E*01:07、E*01:08N、E*01:09和E*01:10。
49.根据权利要求44所述的工程化去核红系细胞，其中所述HLA-G多肽包含选自以下的HLA-G等位基因：G*01:01:01:01、G*01:01:01:02、G*01:01:01:03、G*01:01:01:04、G*01:01:01:05、G*01:01:01:06、G*01:01:01:07、G*01:01:01:08、G*01:01:02:01、G*01:01:02:02、G*01:01:03:01、G*01:01:03:02、G*01:01:03:03、G*01:01:03:04、G*01:01:04、G*01:01:05、G*01:01:06、G*01:01:07、G*01:01:08、G*01:01:09、G*01:01:11、G*01:01:12、G*01:01:13、G*01:01:14、G*01:01:15、G*01:01:16、G*01:01:17、G*01:01:18、G*01:01:19、G*01:01:20、G*01:01:21、G*01:01:22、G*01:02、G*01:03:01:01、G*01:03:01:02、G*01:04:01:01、G*01:04:01:02、G*01:04:02、G*01:04:03、G*01:04:04、G*01:04:05、G*01:04:06、G*01:05N、G*01:06、G*01:07、G*01:08:01、G*01:08:02、G*01:09、G*01:10和G*01:11。
50.根据权利要求43-49中任一项所述的工程化去核红系细胞，其中所述可负载外源性抗原呈递多肽包含在对应于所述α链的位置84的氨基酸残基处氨基酸取代为丙氨酸。
51.根据权利要求43-49中任一项所述的工程化去核红系细胞，其中所述可负载外源性抗原呈递多肽包含在对应于所述α链的位置84和139的各氨基酸残基处氨基酸取代为半胱氨酸。
52.根据权利要求43-49中任一项所述的工程化去核红系细胞，其中所述可负载外源性抗原呈递多肽包含在对应于所述α链的位置51和175的各氨基酸残基处氨基酸取代为半胱氨酸。
53.根据权利要求43-49中任一项所述的工程化去核红系细胞，其中所述可负载外源性抗原呈递多肽包含在对应于所述α链的以下位置的氨基酸残基处至少一对氨基酸取代为半胱氨酸：84和139；51和175；5和168；130和157；135和140；11和74；45和63；以及33和49。
54.根据权利要求43-49中任一项所述的工程化去核红系细胞，其中所述可负载外源性抗原呈递多肽包含在对应于所述α链的位置84的氨基酸残基处氨基酸取代为半胱氨酸，以及在设置在所述β2M多肽与所述可置换外源性多肽之间的所述接头的第二氨基酸残基处的半胱氨酸。
55.根据权利要求43-49中任一项所述的工程化去核红系细胞，其中所述可负载外源性抗原呈递多肽包含衍生自HLA-A*02:01等位基因的α链，并且其中所述α链包含在对应于位置115的氨基酸残基处氨基酸取代为谷氨酸。
56.根据权利要求38-42中任一项所述的工程化去核红系细胞，其中所述HLA重链多肽衍生自HLAII类多肽。
57.根据权利要求56所述的工程化去核红系细胞，其中所述HLA II类多肽选自：HLA-DPα、HLA-DPβ、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA DOA、HLA DOB、HLA DQα、HLA DQβ、HLA DRα和HLA DRβ。
58.根据权利要求57所述的工程化去核红系细胞，其中所述HLA-DPα多肽包含选自以下的等位基因：DPA1*01:03、DPA1*02:01、DPA1*02:07。
59.根据权利要求57所述的工程化去核红系细胞，其中所述HLA-DPβ多肽包含选自以下的等位基因：DPB1*04:01、DPB1*02:01、DPB1*04:02、DPB1*03:01、DPB1*01:01、DPB1*11:01、DPB1*05:01、DPB1*10:01、DPB1*06:01、DPB1*13:01、DPB1*14:01和DPB1*17:01。
60.根据权利要求57所述的工程化去核红系细胞，其中所述HLA-DQα多肽包含选自以下的等位基因：DQA1*05:01、DQA1*03:01、DQA1*01:02、DQA1*02:01、DQA1*01:01、DQA1*01:03和DQA1*04:01。
61.根据权利要求57所述的工程化去核红系细胞，其中所述HLA-DQβ多肽包含选自以下的等位基因：DQB1*03:01、DQB1*02:01、DQB1*06:02、DQB1*05:01、DQB1*02:02、DQB1*03:02、DQB1*06:03、DQB1*03:03、DQB1*06:04、DQB1*05:03和DQB1*04:02。
62.根据权利要求57所述的工程化去核红系细胞，其中所述HLA-DRβ多肽包含选自以下的等位基因：DRB1*07:01、DRB1*03:01、DRB1*15:01、DRB1*04:01、DRB1*01:01、DRB1*13:01、DRB1*11:01、DRB1*04:04、DRB1*13:02、DRB1*08:01、DRB1*12:01、DRB1*11:04、DRB1*09:01、DRB1*14:01、DRB1*04:07和DRB1*14:04。
63.一种治疗需要改变的免疫应答的受试者的方法，所述方法包括：
a)确定所述受试者的HLA状态，
b)选择工程化去核红系细胞，所述工程化去核红系细胞包含所述细胞表面上的可负载外源性抗原呈递多肽，其中所述抗原呈递多肽与所述受试者免疫相容，并且其中所述外源性抗原呈递多肽包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代使所述细胞表面上的所述可负载外源性抗原呈递多肽稳定化；
c)使所述工程化去核红系细胞与外源性抗原性多肽接触；以及
c)将所述工程化去核红系细胞给药于所述受试者，
从而治疗所述受试者。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述可负载外源性抗原呈递多肽在不存在与所述外源性抗原呈递多肽结合的多肽的情况下是稳定化的。
65.根据权利要求63所述的方法，其还包括使所述外源性抗原性多肽与所述可负载外源性抗原呈递多肽缀合。
66.根据权利要求63所述的方法，其中可置换外源性多肽与所述可负载外源性抗原呈递多肽结合。
67.根据权利要求66所述的方法，其还包括在将所述工程化去核红系细胞给药于所述受试者之前，用所述外源性抗原性多肽将所述可置换外源性多肽从所述可负载外源性抗原呈递多肽置换。
68.根据权利要求66或67所述的方法，其还包括使所述外源性抗原性多肽与所述可负载外源性抗原呈递多肽缀合。
69.根据权利要求63-68中任一项所述的方法，其还包括选择外源性抗原性多肽。
70.根据权利要求63-69中任一项所述的方法，其中所述受试者患有癌症或处于发展癌症的风险中。
71.根据权利要求63-69中任一项所述的方法，其中所述受试者患有自身免疫疾病或处于发展自身免疫疾病的风险中。
72.根据权利要求63-69中任一项所述的方法，其中所述受试者患有感染性疾病或处于发展感染性疾病的风险中。
73.一种制备工程化去核红系细胞的方法，所述工程化去核红系细胞包含负载抗原的外源性抗原呈递多肽，所述方法包括：
a)获得工程化去核红系细胞，所述工程化去核红系细胞包含所述细胞表面上的可负载外源性抗原呈递多肽，其中所述可负载外源性抗原呈递多肽包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代使所述细胞表面上的所述可负载外源性抗原呈递多肽稳定化，以及
b)使所述工程化去核红系细胞与外源性抗原性多肽接触；
从而制备包含负载抗原的外源性抗原呈递多肽的工程化去核红系细胞。
74.根据权利要求73所述的工程化去核红系细胞，其中所述可负载外源性抗原呈递多肽在不存在与所述外源性抗原呈递多肽结合的多肽的情况下是稳定化的。
75.根据权利要求73所述的方法，其还包括使所述外源性抗原性多肽与所述可负载外源性抗原呈递多肽缀合。
76.根据权利要求73所述的方法，其还包括选择外源性抗原性多肽。
77.根据权利要求73所述的方法，其中可置换外源性多肽与所述可负载外源性抗原呈递多肽结合。
78.根据权利要求77所述的方法，其还包括用所述外源性抗原性多肽将所述可置换外源性多肽从所述可负载外源性抗原呈递多肽置换。
79.一种制备工程化去核红系细胞的方法，所述工程化去核红系细胞包含所述细胞表面上的可负载外源性抗原呈递多肽，所述方法包括：
将编码所述可负载外源性抗原呈递多肽的外源性核酸引入有核红系前体细胞中，其中所述可负载外源性抗原呈递多肽包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代使所述细胞表面上的所述可负载外源性抗原呈递多肽稳定化；以及
在适于去核和产生所述可负载外源性抗原呈递多肽的条件下培养所述有核红系前体细胞，从而制备包含所述细胞表面上的可负载外源性抗原呈递多肽的工程化去核红系细胞，
从而制备所述工程化去核红系细胞。
80.根据权利要求79所述的工程化去核红系细胞，其中所述可负载外源性抗原呈递多肽在不存在与所述外源性抗原呈递多肽结合的多肽的情况下是稳定化的。
81.根据权利要求79所述的方法，其中所述可负载外源性抗原呈递多肽包含接头，其中所述接头包含用于缀合外源性抗原性多肽的受体序列。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述接头为约10个氨基酸至30个氨基酸长度。
83.根据权利要求81或82所述的方法，其中所述接头为约15个氨基酸残基长度。
84.根据权利要求79-83中任一项所述的方法，其中所述可负载外源性抗原呈递多肽包含跨膜结构域。
85.根据权利要求84所述的方法，其中接头设置在所述跨膜结构域与所述可负载外源性抗原呈递多肽之间。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述跨膜结构域包含1型膜蛋白的跨膜结构域。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述I型膜蛋白包含血型糖蛋白A(GPA)。
88.根据权利要求79-87中任一项所述的方法，其还包括使所述工程化去核红系细胞与至少一种外源性抗原性多肽接触。
89.根据权利要求88所述的方法，其还包括使所述外源性抗原性多肽与所述可负载外源性抗原呈递多肽缀合。
90.根据权利要求79-89中任一项所述的方法，其中所述外源性核酸还编码外源性可置换多肽。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述外源性可负载抗原呈递多肽和外源性可置换多肽包含在单链融合蛋白中。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述单链融合蛋白包含设置在所述可负载外源性抗原呈递多肽与所述外源性可置换多肽之间的接头。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述接头包含酶切割位点。
94.根据权利要求93所述的方法，其中所述酶切割位点包含氨基酸序列LEVLFQGP(SEQID NO:1)。
95.根据权利要求93所述的方法，其中所述酶切割位点包含氨基酸序列ENLYFQG(SEQID NO:2)。
96.根据权利要求93所述的方法，其中所述酶切割位点在距GGG基序的10个氨基酸或更少之内。
97.根据权利要求93所述的方法，其中所述酶切割位点在距LPTXG基序(SEQ ID NO:3)的10个氨基酸或更少之内。
98.根据权利要求93所述的方法，其中所述酶切割位点在距氨基酸序列AHIVMVDAYKPTK(SEQ ID NO:4)的10个氨基酸或更少之内。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述酶切割位点在距氨基酸序列ATHIKFSKRD(SEQ ID NO:5)的10个氨基酸或更少之内。
100.根据权利要求92-99中任一项所述的方法，其中所述接头为约10个氨基酸至30个氨基酸长度。
101.根据权利要求92-99中任一项所述的方法，其中所述接头为约15个氨基酸残基长度。
102.根据权利要求90-101中任一项所述的方法，其中所述可负载外源性抗原呈递多肽包含跨膜结构域。
103.根据权利要求102所述的方法，其中所述跨膜结构域包含1型膜蛋白的跨膜结构域。
104.根据权利要求103所述的方法，其中所述I型膜蛋白包含血型糖蛋白A(GPA)。
105.根据权利要求90-104中任一项所述的方法，其还包括使所述工程化去核红系细胞与外源性抗原性多肽接触，所述外源性抗原性多肽对所述可负载外源性抗原呈递多肽比对所述可置换外源性多肽具有更大的结合亲和力。
106.根据权利要求105所述的方法，其还包括使所述工程化去核红系细胞与二肽接触。
107.根据权利要求106所述的方法，其中所述可负载外源性抗原呈递多肽包含HLA-A:02:01、HLA-A1:01、HLA-A3:01、HLA-A24:02、HLA-A26:01、HLA-B7:02、HLA-B08:01、HLA-B27:05、HLA-B27:05、HLA-B39:01、HLA-B40:01、HLA-B58:01、HLA-B15:01、或HLA-E01:01，并且所述二肽是甘氨酰-亮氨酸(GL)、甘氨酰-甲硫氨酸(GM)、GG、甘氨酰-丙氨酸(GA)、甘氨酰-缬氨酸(GV)、甘氨酰-苯丙氨酸(GF)、亮氨酰-甘氨酸(LG)、甘氨酰-环己基丙氨酸(G-Cha)、甘氨酰-高亮氨酸(GHLe)、乙酰化亮氨酸、或甘氨酰-精氨酸(GR)。
108.根据权利要求106所述的方法，其中所述可负载外源性抗原呈递多肽包含HLA-B:27:05，并且所述二肽为GR或G-Cha。
109.根据权利要求93所述的方法，其还包括在适于所述酶切割位点切割的条件下使所述细胞与酶接触。
110.根据权利要求105所述的方法，其还包括使所述外源性抗原性多肽与所述可负载外源性抗原呈递多肽缀合。
111.根据权利要求110所述的方法，其中利用点击化学将所述外源性抗原性多肽与所述可负载外源性抗原性多肽缀合。
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