KR102478897B1 - T세포 및 마크로파지를 이용한 항암제 효능 평가 방법 - Google Patents
T세포 및 마크로파지를 이용한 항암제 효능 평가 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지의 혼합물에 항암제 또는 항암제 후보물질을 처리하는 단계를 포함하는 항암제의 효능 평가 방법, 또는 항암제 스크리닝 방법에 관한 것이다. 또한, 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지를 포함하는 항암제의 효능 평가 시스템 또는 항암제의 스크리닝 시스템에 관한 것이다.
본 발명에 따른 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지 혼합물은 특정 비율로 혼합되어 암세포가 생체 내에서 존재하고 있는 형태인 종양 미세 환경을 매우 유사하게 재현할 수 있다. 따라서, 이를 활용하는 경우 약물이 생체 내 투여되었을 때의 효능을 정확하게 예측할 수 있다.
본 발명에 따른 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지 혼합물은 특정 비율로 혼합되어 암세포가 생체 내에서 존재하고 있는 형태인 종양 미세 환경을 매우 유사하게 재현할 수 있다. 따라서, 이를 활용하는 경우 약물이 생체 내 투여되었을 때의 효능을 정확하게 예측할 수 있다.
Description
본 발명은 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지의 혼합물에 항암제 또는 항암제 후보물질을 처리하는 단계를 포함하는 항암제의 효능 평가 방법, 또는 항암제 스크리닝 방법에 관한 것이다. 또한, 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지를 포함하는 항암제의 효능 평가 시스템 또는 항암제의 스크리닝 시스템에 관한 것이다.
오가노이드는 조직 또는 기관에서 유래한 세포를 3차원 배양하여 제조한 장기 유사체이다. 오가노이드는 장기배양, 동결보존이 가능하고 조작과 관찰이 용이하다는 장점을 가진다. 동시에 불멸화가 필요 없어 그에 따른 세포의 본래 특성이 유지됨은 물론 생체 내에서만 볼 수 있었던 세포 계층적, 조직학적 구조를 재현함으로써 세포보다 한 단계 높은 차원의 생리현상을 연구할 수 있는 실험모델이다. 이러한 특성으로 인해 오가노이드는 세포의 내재적 특성이 변화된 불멸화된 세포주, 또는 인체와 구조가 다른 동물 모델에 비해 높은 정확도로 약물 평가를 할 수 있고, 특히 환자 유래 조직을 이용하므로, 사람을 대상으로 한 임상에 앞서 약물의 안전성은 물론 효능까지 미리 확인할 수 있는 장점이 있다. 다만, 기존에 약물 평가 모델로서 개발된 암 오가노이드는 종양 미세 환경을 반영하지 못하는 한계점을 지니고 있었던바, 다양한 종양 미세 환경을 갖춘 오가노이드를 개발하고, 이를 약물 평가 모델로서 사용하기 위한 노력이 수행될 필요가 있다.
종양 미세 환경은 암세포 주위에 혈관, 면역세포, 섬유아세포(fibroblast), 림프구, 신호전달분자, 세포외 기질(extracellular matrix, ECM) 등이 둘러 싸여 있는 세포환경이다. 종양 미세 환경에서 암세포는 세포외 신호 방출, 암세포 신생혈관 촉진, 말초 면역관용 등을 유도하여 미세환경에 영향을 준다. 따라서 암세포는 미세환경을 변화시키기도 하고 미세환경이 암세포의 성장 또는 전이에 영향을 미치기도 하는데, 특히 림프구 등과 관련된 종양 미세 환경은 암의 발생 및 전이 뿐만 아니라, 항암제에 의한 치료 반응에 영향을 미친다고 알려져 있다.
예를 들어, 종양 미세 환경에 존재하는 세포 독성 T 세포(cytotoxic T cell), 조절 T 세포(regulatory T cell, Treg), 골수유래 억제세포(myeloid-derived suppressor cell, MDSC), 종양 관련 대식세포(tumor-associated macrophage, TAM), 암-연관 섬유아세포(cancer-associated fibroblast, CAF) 등의 세포가 면역항암제의 효능에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 이들은 암 조직 내로의 T세포 침투를 제한할 뿐만 아니라, 종양 침투 림프구의 증식과 생존을 감소시킴으로써 면역항암제의 치료 효과를 저해한다(Hanahan D et al., Cancer Cell. 2012, 20, 21(3):309-22; Munn DH et al., J Immunother. May-Jun 2006, 29(3):233-40.; Oliver AJ et al., Front Immunol. 2018 Jan 31,9:70.).
이에, 본 발명자들은 종양 미세 환경을 갖춘 암 오가노이드를 개발하고, 이를 약물 평가의 플랫폼으로 사용하기 위한 다양한 연구를 진행하였다. 그 결과, 종양 미세 환경을 구성하는 다양한 세포 중에서도, T세포 및 마크로파지를 사용하여, 이를 암 오가노이드와 특정 비율로 공배양하는 시스템을 확립하였고, 상기 시스템에서는 암 오가노이드의 성장이 저해되지 않고, 마크로파지의 세포 사멸이 야기되지 않으며, 동시에 서로 다른 항암제의 효능을 고루 확인할 수 있음을 실험적으로 입증함에 따라, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 본 명세서에서 특별히 정의되지 않은 용어들에 대해서는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것으로 이해되어야 할 것이다. 또한, 문맥상 특별히 정의하지 않은 경우라면, 단수는 복수를 포함하며, 복수는 단수를 포함한다.
본 발명의 하나의 양태는 하기 단계를 포함하는, 항암제의 효능 평가 방법을 제공한다:
(a) 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지를 혼합하여 공배양하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지 혼합물에 항암제를 처리하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 항암제가 처리된 군이 항암제 미처리 군 또는 양성 대조군에 비해 암 오가노이드의 성장 저해 또는 사멸이 증가한 경우, 상기 항암제의 효능이 우수한 것으로 판단하는 단계.
구체적으로, 상기 단계 (a)는 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지를 혼합하여 공배양하는 단계로서, 생체 내 종양 미세 환경을 인비트로(in vitro)에서 재현하는 단계이다.
용어, "오가노이드"는 3차원 입체구조를 가지는 세포의 덩어리를 의미하며, 기관 또는 조직에서 분리한 세포를 3차원 배양을 통해 제조한 장기 유사체를 의미한다. 오가노이드는 기관 또는 조직을 구성하는 특이적 세포 집단들을 포함하고 있고, 실제 조직 또는 기관과 유사한 형태로 구조적 조직화가 이루어져 있으므로, 각 조직 또는 기관이 갖는 특수한 형태 및 기능을 재현할 수 있다.
용어, "암 오가노이드"는 종양에서 분리한 세포로부터 유래된 오가노이드를 의미한다.
용어, "T세포(T cell)"는 "T림프구(T lymphocyte)"로도 불리며, 항원 특이적 후천 면역(acquired immunity, adaptive immunity)을 수행하는 림프구를 의미한다. T세포는 항원의 접촉에 따라 성숙 및 활성화되며, 이에 따라 나이브 T세포(naive T cell), 도움 T세포(helper T cell, Th cell), 조절 T세포(regulatory T cell, Treg cell), 세포독성 T세포(cytotoxic T cell), 자연살상 T세포(Natural killer T cell), 기억 T세포(memory T cell) 등으로 분류되는데, 본 발명에 따른 T세포는 나이브 T세포, 도움 T세포, 조절 T세포, 세포독성 T세포, 자연살상 T세포 및 기억 T세포를 모두 포함한다.
용어, "마크로파지(Macrophage)"는 "대식세포"로도 불리며, 선천 면역(innate immunity)을 수행하는 세포를 의미한다. 마크로파지는 면역식균작용, 항원 제시 기능(antigen presentation function), 인터루킨 1(Interleukin 1) 생산, 대식작용(식세포작용, phagocytosis) 등을 수행하며, 이를 통해 병원균이나 손상된 세포 또는 암세포 등을 제거하는 역할을 수행한다. 마크로파지는 생체 내 존재하는 위치에 따라 분류되는데, 구체적으로 골수 또는 혈액에 존재하는 단핵구(monocyte) 또는 종양 미세 환경에 존재하는 종양 관련 대식세포(tumor-associated macrophage, TAM) 등으로 분류되며, 본 발명에서는 이들을 모두 포함한다.
본 발명에서, 상기 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지는 각각 1 : 0.5 : 0.5 내지 3의 세포수 비율로 혼합되는 것일 수 있다. 상기 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지가 상기 비율로 혼합되어 공배양되는 경우에만 생체 내 종양 미세 환경을 모사할 수 있다. 상기 비율 이외의 비율로 공배양되는 경우에는 약물 처리 전임에도 불구하고 암 오가노이드가 성장하지 않아 약물의 항암 효과를 확인할 수 없으며, 또는 마크로파지가 자연적으로 사멸하여 종양 미세 환경을 재현해낼 수 없는 문제가 발생한다. 또한, 상기 비율 이외의 비율로 공배양되는 경우에는 서로 다른 메커니즘으로 작용하는 약물의 효능이 고르게 나타나지 않는 문제가 발생하므로, 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지를 전술한 바와 같은 세포수 비율로 혼합하는 것이 중요하다.
본 발명에 따른 항암제의 효능 평가 방법은 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지를 상기 비율로 혼합한 혼합물에 항암제를 처리한다. 즉, 암세포가 생체 내에서 존재하고 있는 형태인 종양 미세 환경을 매우 유사하게 재현한 시스템을 통해 항암제의 효능을 평가한다. 따라서, 항암제가 생체 내 투여되었을 때의 효능을 정확하게 예측할 수 있다.
본 발명에 따른 항암제의 효능 평가 방법에서, 상기 단계 (b)는 상기 (a) 단계에 따라 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지가 공배양된 혼합물에 항암제를 처리하는 단계이다.
용어, "항암제"는 암의 예방 또는 치료 효과를 나타내는 물질로서, 구체적으로 암세포, 암 오가노이드 또는 종양 등을 사멸시키거나, 또는 이의 성장을 억제할 수 있는 물질을 의미한다.
본 명세서에서, 상기 '항암제'는 '약물'과 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 또한 상기 '처리'는 '첨가' 또는 '투여'와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
구체적으로, 상기 항암제는 암 오가노이드, T세포 및/또는 마크로파지를 타겟하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 항암제는 암 오가노이드만을 타겟하는 것이거나, T세포만을 타겟하는 것이거나, 마크로파지만을 타겟하는 것이거나, 암 오가노이드 및 T세포를 동시에 타겟하는 것이거나, 암 오가노이드 및 마크로파지를 동시에 타겟하는 것이거나, T세포 및 마크로파지를 동시에 타겟하는 것이거나, 또는 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지를 동시에 타겟하는 것일 수 있다. 예를 들어, 암 오가노이드를 타겟하는 항암제는 아테졸리주맙(atezolizumab)일 수 있고, T세포를 타겟하는 항암제는 펨브롤리주맙(Pembrolizumab)일 수 있다.
바람직하게, 상기 항암제는 화합물, 단백질, 융합 단백질, 화합물-단백질 복합체, 약물-단백질 복합체, 항체, 화합물-항체 복합체, 약물-항체 복합체, 아미노산, 펩티드, 바이러스, 탄수화물, 지질, 핵산, 추출물, 분획물 등을 제한 없이 포함한다.
예로서, 상기 항암제는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 융합 단백질, 항체, 앱타머, 항체-약물 복합체(ADC; Antibody Drug Conjugate) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게, 상기 항암제는 항체이거나, 또는 면역항암제일 수 있다.
용어, "항체"는 단일클론 항체, 다클론 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체를 포함하며, 신규 항체 외에 이미 당해 기술분야에서 공지되거나 시판되는 항체들도 포함된다. 상기 항체는 2개의 중쇄와 2개의 경쇄를 포함하는 전체 길이의 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 상기 항체 분자의 기능적인 단편은 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, 여기에는 Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어, "펩티드 미메틱스(Peptide Mimetics)"는 호르몬, 사이토카인, 효소 기질, 바이러스 또는 다른 생물학적 분자의 활성 리간드를 생물학적으로 모사하는 펩티드, 또는 변형된 펩티드를 의미한다.
용어, "앱타머(Aptamer)"는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)을 의미한다.
또다른 예로서, 상기 항암제는 DNA 또는 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어, "안티센스 핵산"은 특정 mRNA의 서열에 대해 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA, RNA, 또는 이들의 단편 또는 유도체를 의미하며, mRNA의 서열에 상보적으로 결합 또는 혼성화하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다.
용어, "siRNA(small interfering RNA)"는 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통해 RNAi(RNA interference)를 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. siRNA는 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 갖는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 갖는 안티센스 RNA 가닥을 포함한다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있으므로, 유전자 넉다운 방법 또는 유전자치료 방법 등에 사용된다.
용어, "shRNA(short hairpin RNA)"는 단일가닥 RNA로서 수소결합에 의해 이중가닥 부분을 형성하는 줄기(stem) 부분과 고리 형태를 띄는 루프(loop) 부분으로 구분되는 RNA를 의미한다. 다이서(Dicer) 등의 단백질에 의해 프로세싱되어 siRNA로 변환되고 siRNA와 동일한 기능을 수행할 수 있다.
용어, "miRNA(micro RNA)"는 표적 RNA의 분해를 촉진시키거나 또는 이들의 번역을 억제시킴으로써 유전자 발현을 전사 후에 조절하는 21 내지 23 nt의 비코딩 RNA를 의미한다.
용어, "리보자임(ribozyme)"은 특정 염기 서열을 인식하여 자체적으로 이를 절단하는 효소와 같은 기능을 가진 RNA 분자를 의미한다. 리보자임은 타겟 전령 RNA 가닥의 상보적인 염기서열로 특이성을 가지고 결합하는 영역과 타겟 RNA를 절단하는 영역으로 구성된다.
본 발명의 방법에 따라 효능이 평가되거나 스크리닝되는 항암제는 예를 들면, 담도암, 위암, 폐암, 간암, 대장암, 결장암, 소장암, 췌장암, 뇌암, 뼈암, 흑색종, 유방암, 경화성선증, 자궁암, 자궁경부암, 두경부암, 식도암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 육종, 전립선암, 요도암, 방광암, 혈액암, 백혈병, 림프종, 섬유선종 등을 예방 또는 치료하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 항암제의 효능 평가 방법에서, 상기 단계 (c)는 상기 (b) 단계의 항암제가 처리된 군이 항암제 미처리 군 또는 양성 대조군에 비해 암 오가노이드의 성장 저해 또는 사멸이 증가한 경우, 상기 항암제의 효능이 우수한 것으로 판단하는 단계이다.
용어, "양성 대조군"은 당업계에서 항암제로 사용되고 있는 약물을 처리한 군을 의미한다.
구체적으로, 상기 암 오가노이드의 성장 저해 또는 사멸은 암 오가노이드의 면적 증감을 통해 확인하는 것일 수 있다. 또한, 상기 암 오가노이드의 면적이 감소하는 경우, 암 오가노이드의 성장 저해 또는 사멸이 증가된 것으로 판단하는 것일 수 있다. 또한, 상기 암 오가노이드의 면적 증감은 당업계에 공지된 방법으로 확인할 수 있으며, 예로서 HCS (High-Content Screening), 유세포 분석(Flow-cytometer) 등의 분석 방법을 통해 확인할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 하기의 단계를 포함하는, 항암제의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지를 혼합하여 공배양하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지 혼합물에 항암제 후보물질을 처리하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 항암제 후보물질이 처리된 군에서 항암제 후보물질 미처리 군에 비해 암 오가노이드의 성장 저해 또는 사멸이 증가한 경우, 상기 후보물질을 항암제로 결정하는 단계.
본 발명에 따른 항암제의 스크리닝 방법에서, 각 용어는 특별히 언급하지 않는 한 상기 항암제의 효능 평가 방법에서 설명한 바와 같다.
구체적으로, 상기 단계 (a)는 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지를 혼합하여 공배양하는 단계로서, 생체 내 종양 미세 환경을 인비트로(in vitro)에서 재현하는 단계이다.
본 발명에서, 상기 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지는 각각 1 : 0.5 : 0.5 내지 3의 세포수 비율로 혼합되는 것일 수 있다. 상기 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지가 상기 비율로 혼합되어 공배양되는 경우에만 생체 내 종양 미세 환경을 모사할 수 있다. 상기 비율 이외의 비율로 공배양되는 경우에는 약물 처리 전임에도 불구하고 암 오가노이드의 성장 저해가 관찰되어 약물의 항암 효과를 확인할 수 없으며, 또는 마크로파지가 자연적으로 사멸하여 종양 미세 환경을 재현해낼 수 없는 문제가 발생한다. 또한, 상기 비율 이외의 비율로 공배양되는 경우에는 서로 다른 메커니즘으로 작용하는 약물의 효능이 고르게 나타나지 않는 문제가 발생하므로, 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지를 전술한 바와 같은 세포수 비율로 혼합하는 것이 중요하다.
본 발명에 따른 항암제의 스크리닝 방법은 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지를 상기 비율로 혼합한 혼합물에 항암제 후보물질을 처리한다. 즉, 암세포가 생체 내에서 존재하고 있는 형태인 종양 미세 환경을 매우 유사하게 재현한 시스템을 통해 항암제 후보물질의 효능을 평가한다. 따라서, 항암제가 생체 내 투여되었을 때의 효능을 정확하게 예측할 수 있고, 아울러 생체 내 투여되었을 때 우수한 효능을 나타낼 수 있는 항암제를 스크리닝할 수 있다.
본 발명에 따른 항암제의 스크리닝 방법에서, 상기 단계 (b)는 상기 (a) 단계에 따라 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지가 공배양된 혼합물에 항암제 후보물질을 처리하는 단계이다.
용어, "항암제"는 암의 예방 또는 치료 효과를 나타내는 물질로서, 구체적으로 암세포, 암 오가노이드 또는 종양 등을 사멸시키거나, 또는 이의 성장을 억제할 수 있는 물질을 의미한다.
본 명세서에서, 상기 '항암제'는 '약물'과 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 또한 상기 '처리'는 '첨가' 또는 '투여'와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
용어, "항암제 후보물질"은 암의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 것으로 예상되는 물질을 의미하며, 구체적으로 암세포, 암 오가노이드 또는 종양 등을 사멸시키거나, 또는 이의 성장을 억제할 것으로 예상되는 물질을 의미한다.
본 명세서에서, 상기 '항암제'는 '약물'과 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 또한 상기 '처리'는 '첨가' 또는 '투여'와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
바람직하게, 상기 항암제 또는 항암제 후보물질은 화합물, 단백질, 융합 단백질, 화합물-단백질 복합체, 약물-단백질 복합체, 항체, 화합물-항체 복합체, 약물-항체 복합체, 아미노산, 펩티드, 바이러스, 탄수화물, 지질, 핵산, 추출물, 분획물 등을 제한 없이 포함한다.
예로서, 상기 항암제 또는 항암제 후보물질은 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 융합 단백질, 항체, 앱타머, 항체-약물 복합체(ADC; Antibody Drug Conjugate) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게, 상기 항암제 또는 항암제 후보물질은 항체이거나, 또는 면역항암제일 수 있다.
본 발명에 따른 항암제의 스크리닝 방법에서, 상기 단계 (c)는 상기 (b) 단계의 항암제 후보물질이 처리된 군에서 항암제 후보물질 미처리 군에 비해 암 오가노이드의 성장 저해 또는 사멸이 증가한 경우, 상기 후보물질을 항암제로 결정하는 단계이다.
본 발명의 또다른 하나의 양태는 상기 항암제의 효능 평가 방법을 사용하기 위한 항암제의 효능 평가 시스템으로서, 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지를 포함하는 항암제의 효능 평가 시스템을 제공한다.
본 발명에 따른 항암제의 효능 평가 시스템에서, 각 용어는 특별히 언급하지 않는 한 상기 항암제의 효능 평가 방법에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 항암제의 효능 평가 시스템은 종양 미세 환경을 모사한 것으로, 생체 내 종양 미세 환경을 구성하는 종양으로서 암 오가노이드, 및 면역세포로서 T세포 및 마크로파지를 포함한다.
구체적으로, 상기 항암제의 효능 평가 시스템은 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지를 각각 1 : 0.5 : 0.5 내지 3의 세포수 비율로 포함하는 것일 수 있다. 상기 암 오가노이드 및 면역세포가 상기 비율로 혼합되어 공배양되는 경우에만 생체 내 종양 미세 환경을 모사할 수 있다. 상기 비율 이외의 비율로 공배양되는 경우에는 약물 처리 전임에도 불구하고 암 오가노이드의 성장 저해 또는 사멸이 관찰되어 약물의 항암 효과를 확인할 수 없으며, 또는 마크로파지가 자연적으로 사멸하여 종양 미세 환경을 재현해낼 수 없는 문제가 발생한다. 또한, 상기 비율 이외의 비율로 공배양되는 경우에는 서로 다른 메커니즘으로 작용하는 약물의 효능이 고르게 나타나지 않는 문제가 발생하므로, 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지를 전술한 바와 같은 세포수 비율로 혼합하는 것이 중요하다.
본 발명에 따른 항암제의 효능 평가 시스템은 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지를 상기 비율로 혼합한 혼합물을 포함하므로, 암세포가 생체 내에서 존재하고 있는 형태인 종양 미세 환경을 매우 유사하게 재현할 수 있다. 따라서, 항암제가 생체 내 투여되었을 때의 효능을 정확하게 예측할 수 있으므로, 항암제의 효능 평가 방법에 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명의 또다른 하나의 양태는 상기 항암제의 스크리닝 방법을 사용하기 위한 항암제의 스크리닝 시스템으로서, 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지를 포함하는 항암제의 스크리닝 시스템을 제공한다.
본 발명에 따른 항암제의 스크리닝 시스템에서, 각 용어는 특별히 언급하지 않는 한 상기 항암제의 효능 평가 방법에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 항암제의 스크리닝 시스템은 종양 미세 환경을 모사한 것으로, 생체 내 종양 미세 환경을 구성하는 종양으로서 암 오가노이드, 및 면역세포로서 T세포 및 마크로파지를 포함한다.
구체적으로, 상기 항암제의 스크리닝 시스템은 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지를 각각 1 : 0.5 : 0.5 내지 3의 세포수 비율로 포함하는 것일 수 있다. 상기 암 오가노이드 및 면역세포가 상기 비율로 혼합되어 공배양되는 경우에만 생체 내 종양 미세 환경을 모사할 수 있다. 상기 비율 이외의 비율로 공배양되는 경우에는 약물 처리 전임에도 불구하고 암 오가노이드의 성장 저해 또는 사멸이 관찰되어 약물의 항암 효과를 확인할 수 없으며, 또는 마크로파지가 자연적으로 사멸하여 종양 미세 환경을 재현해낼 수 없는 문제가 발생한다. 또한, 상기 비율 이외의 비율로 공배양되는 경우에는 서로 다른 메커니즘으로 작용하는 약물의 효능이 고르게 나타나지 않는 문제가 발생하므로, 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지를 전술한 바와 같은 세포수 비율로 혼합하는 것이 중요하다.
본 발명에 따른 항암제의 스크리닝 시스템은 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지를 상기 비율로 혼합한 혼합물을 포함하므로, 암세포가 생체 내에서 존재하고 있는 형태인 종양 미세 환경을 매우 유사하게 재현할 수 있다. 따라서, 항암제가 생체 내 투여되었을 때의 효능을 정확하게 예측할 수 있으므로, 항암제의 스크리닝 방법에 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명에 따른 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지 혼합물은 특정 비율로 혼합되어 암세포가 생체 내에서 존재하고 있는 형태인 종양 미세 환경을 매우 유사하게 재현할 수 있다. 따라서, 이를 활용하는 경우 약물이 생체 내 투여되었을 때의 효능을 정확하게 예측할 수 있다.
도 1은 T세포 및 마크로파지 비율에 따른 암 오가노이드(A)와 마크로파지(B)의 사멸 정도를 보여주는 그래프이다.
도 2는 T세포 및 마크로파지 비율에 따른 암 오가노이드의 성장 저해 정도를 보여주는 그래프로서, 0시간, 24시간, 48시간 및 72시간 동안 공배양한 결과에 관한 것이다.
도 3은 항-CD47 항체 처리에 의한 대식작용(Phagocytosis) 활성화 정도를 보여주는 그래프이다.
도 4는 T세포 비율 증가에 따른 암 오가노이드 사멸에 대한 약물의 전반적인 효능(overall efficacy)을 보여주는 그래프이다.
도 5는 마크로파지 비율 증가에 따른 암 오가노이드 사멸에 대한 약물의 전반적인 효능(overall efficacy)을 보여주는 그래프이다.
도 6은 암 오가노이드 사멸에 대한 약물의 전반적인 효능(overall efficacy)을 보여주는 그래프이다.
도 2는 T세포 및 마크로파지 비율에 따른 암 오가노이드의 성장 저해 정도를 보여주는 그래프로서, 0시간, 24시간, 48시간 및 72시간 동안 공배양한 결과에 관한 것이다.
도 3은 항-CD47 항체 처리에 의한 대식작용(Phagocytosis) 활성화 정도를 보여주는 그래프이다.
도 4는 T세포 비율 증가에 따른 암 오가노이드 사멸에 대한 약물의 전반적인 효능(overall efficacy)을 보여주는 그래프이다.
도 5는 마크로파지 비율 증가에 따른 암 오가노이드 사멸에 대한 약물의 전반적인 효능(overall efficacy)을 보여주는 그래프이다.
도 6은 암 오가노이드 사멸에 대한 약물의 전반적인 효능(overall efficacy)을 보여주는 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다.
실시예 1. 항암제 스크리닝 시스템 확립
암이 생체 내 존재하고 있는 환경을 유사하게 재현함으로써, 약물이 생체 내 투여되었을 때의 효능을 정확하게 예측할 수 있는 인비트로(in vitro) 스크리닝 시스템을 확립하고자 하였다.
구체적으로, 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지(macrophage)가 공존하는 공배양(co-culture) 시스템을 이용하였고, 공배양 시 아래의 3개 조건을 충족시키는 각 오가노이드 또는 세포의 비율을 확인하였다:
(ⅰ) 암 오가노이드 및 마크로파지 사멸이 낮은 조건 (상기 오가노이드, T세포 및 마크로파지의 공배양 시, 약물 미처리군에서 암 오가노이드 또는 마크로파지의 사멸이 높게 관찰되는 경우에는 약물의 효능을 정확하게 분석할 수 없음)
(ⅱ) 대식작용(Phagocytosis)이 활성화되는 조건
(ⅲ) 서로 다른 MoA (Mode of Action) 특성을 나타내는 약물의 효능을 평가할 수 있는 조건.
또한, 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지의 비율에서, 오가노이드 또는 세의 수가 5.0×103개인 것을 1로 설정하였으며, 비율에 따른 오가노이드 또는 세포의 구체적인 수는 아래와 같다:
0.2 = 1.0×103개의 오가노이드 또는 세포
0.5 = 2.5×103개의 오가노이드 또는 세포
1 = 5.0×103개의 오가노이드 또는 세포
3 = 15.0×103개의 오가노이드 또는 세포
5 = 25.0×103개의 오가노이드 또는 세포
10 = 50.0×103개의 오가노이드 또는 세포
전술한 바와 같은 조건을 모두 충족하는 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지의 비율은 아래 실시예 1.1 내지 1.3을 통해 확인하였다.
실시예 1.1. 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지가 공존하는 조건 확립
암 오가노이드, T세포 및 마크로파지로 구성된 세포를 공배양하는 경우에서, 1종류의 세포라도 사멸된다면 약물의 효능을 정확하게 평가하기 어려운 문제점이 발생한다. 따라서, 본 실시예 1.1에서는 약물을 처리하지 않은 상태에서 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지 세포를 공배양하였을 때 상기 세포가 모두 생존하는 조건을 확립하고자 하였다.
구체적으로, 암 오가노이드는 대장암 환자 유래 암 오가노이드, T세포는 대장암 환자 유래 T세포 및 마크로파지는 대장암 환자 유래 마크로파지를 사용하였다. 또한, 아래 표 1에 나타낸 바와 같이, 암 오가노이드를 1의 비율로 고정한 후, T세포는 0.1 내지 10의 비율, 및 마크로파지는 0.1 내지 5의 비율로 설정하여 2시간 동안 공배양하였고, 각 비율에 따른 암 오가노이드 또는 세포의 사멸 정도를 분석하였다. 이때, 분석은 유세포 분석(Flow-cytometer)으로 수행하였으며, 암 오가노이드의 마커는 CFSE(+), 마크로파지의 마커는 CD11B(+)를 사용하였다.
| 그룹 | 암 오가노이드 | T세포 | 마크로파지 |
| G1 | 1 | 0.2 | 0.5 |
| G2 | 1 | 0.2 | 1 |
| G3 | 1 | 0.2 | 3 |
| G4 | 1 | 0.5 | 0.5 |
| G5 | 1 | 0.5 | 1 |
| G6 | 1 | 0.5 | 3 |
| G7 | 1 | 3 | 0.5 |
| G8 | 1 | 3 | 1 |
| G9 | 1 | 3 | 3 |
그 결과, 도 1의 A에 나타낸 바와 같이, 그룹 11 및 12의 T세포 비율이 높은 조건(5 이상)과 그룹 9의 마크로파지 비율이 높은 조건(5이상)에서 암 오가노이드의 높은 사멸이 관찰되었다.
또한, 도 1의 B에 나타낸 바와 같이, 그룹 11 및 12의 T세포의 비율이 높은 조건(5 이상)에서도, 마크로파지의 높은 사멸이 발생하는 것을 확인하였다.
이를 종합하면, 약물을 처리하지 않은 상태에서는 그룹 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 10의 조건이 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지가 균형을 이루며 생존할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 암 오가노이드의 비율이 1일 때, T세포의 비율을 3 이내 및 마크로파지의 비율을 3 이내로 설정하는 것이 항암제의 스크리닝 시스템에 가장 최적화된 비율임을 알 수 있었다.
실시예 1.2. 공배양 시간에 따른 암 오가노이드 성장 저해 및 사멸 정도 확인
상기 실시예 1.1에서 확인한 바와 같은, 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지로 구성된 스크리닝 시스템에서는, 암 오가노이드의 성장 저해 및 사멸이 관찰되지되지 않는 세포의 구성비율을 확인하였다. 이에, 공배양 시간을 다르게 설정한 후(24시간, 48시간, 72시간), 암 오가노이드의 성장 정도를 분석하였다.
구체적으로, 아래 표 2에 나타낸 바와 같이, 암 오가노이드를 1의 비율로 고정한 후, T세포는 0.2 내지 3의 비율, 및 마크로파지는 0.1 내지 3의 비율로 설정하여 공배양하였고, 각 비율에 따른 대식작용을 분석하였다. 이때, 상기 T세포 및 마크로파지의 비율은 상기 실시예 1.1에서 적용한 비율보다 더 좁은 범위로 테스트하였고, 분석은 HCS (High-Content screening)로 수행하였으며, 초기 오가노이드의 면적을 100%으로 설정하고, 반응 시간에 따른 면적의 변화를 비율로 나타내었다.
| 그룹 | 암 오가노이드 | T세포 | 마크로파지 |
| G1 | 1 | 0 | 1 |
| G2 | 1 | 0.5 | 0 |
| G3 | 1 | 0.1 | 1 |
| G4 | 1 | 0.2 | 1 |
| G5 | 1 | 0.5 | 0.1 |
| G6 | 1 | 0.5 | 0.5 |
| G7 | 1 | 0.5 | 1 |
| G8 | 1 | 0.5 | 3 |
| G9 | 1 | 0.5 | 5 |
| G10 | 1 | 3 | 1 |
| G11 | 1 | 5 | 1 |
| G12 | 1 | 10 | 1 |
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 세포 비율에 따라 성장 정도에 차이는 있지만, 상기 비율에서는 72시간 이상 공배양하더라도 암 오가노이드의 성장이 저해되는 영향은 나타나지 않음을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지를 1 : 0.2 내지 3 : 0.1 내지 3의 비율로 설정하는 것이 항암제의 스크리닝 시스템에 가장 최적화된 비율임을 알 수 있었다.
실시예 1.3. 대식작용(Phagocytosis)이 활성화되는 조건 확립
상기 실시예 1.1에서 확인한 바와 같은, 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지로 구성된 스크리닝 시스템이 마크로파지를 타겟으로 하는 약물의 효능을 평가하는데 사용될 수 있는지 확인하기 위하여, 상기 시스템에 항-CD47 항체를 처리한 후 대식작용에 따른 암 오가노이드의 사멸 정도를 확인하였다.
구체적으로, 암 오가노이드는 대장암 환자 유래 암 오가노이드, T세포는 대장암 환자 유래 T세포 및 마크로파지는 CHA15 세포주를 사용하였다.
또한, 상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 암 오가노이드를 1의 비율로 고정한 후, T세포는 0.2 내지 3의 비율, 및 마크로파지는 0.1 내지 3의 비율로 설정하여 공배양하였고, 각 비율에 따른 대식작용을 분석하였다. 이때, 상기 T세포 및 마크로파지의 비율은 상기 실시예 1.1에서 적용한 비율보다 더 좁은 범위로 테스트하였고, 분석은 유세포 분석(Flow-cytometer)으로 수행하였으며, 암 오가노이드의 마커는 EpCAM(+), 마크로파지의 마커는 CD11B(+)를 사용하였다. 대식작용의 경우, 암 오가노이드 마커와 마크로파지 마커가 중복으로 나타나는(double positive) 비율로 확인하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 마크로파지가 존재하지 않는 그룹 2를 제외한 모든 조건에서 대식작용이 관찰되었고, 특히 그룹 3, 4, 6 및 7에서 마크로파지에 결합하는 항-CD47 항체를 처리하는 경우에는 미처리군에 비하여 대식작용이 활성화됨을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지를 1 : 0.2 내지 0.5 : 0.1 내지 3의 비율로 설정하는 것이 항암제의 스크리닝 시스템에 가장 최적화된 비율임을 알 수 있었다.
실시예 1.4. 서로 다른 MoA (Mode of Action) 특성을 나타내는 약물의 효능을 평가할 수 있는 조건 확립
상기 실시예 1.1에서 확인한 바와 같은, 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지로 구성된 스크리닝 시스템이 약물의 효능을 평가하는데 사용될 수 있는지 확인하기 위하여, 상기 시스템에 기존에 면역항암제로 사용되고 있던 항-PD-L1 항체인 아테졸리주맙(Atezolizumab), 항-CD47 항체, 및 이들의 병용을 처리한 후 대식작용에 의한 암 오가노이드의 사멸 정도를 확인하였다.
아테졸리주맙은 암세포의 PD-L1과 결합하여 PD-1/PD-L1 기작을 막아 T세포를 활성화시키고, 항-CD47 항체는 마크로파지의 CD47과 결합하여 SIRP-a/CD47 기작을 막아 마크로파지를 활성화시킨다. 이에, 본 발명의 스크리닝 시스템이 서로 다른 메커니즘으로 작용하는 두 종류의 약물 모두에 대해 효능을 평가할 수 있는지 확인하고자 하였다.
구체적으로, 암 오가노이드는 대장암 환자 유래 암 오가노이드, T세포는 대장암 환자 유래 T세포 및 마크로파지는 CHA15 세포주를 사용하였다.
또한, 상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 암 오가노이드를 1의 비율로 고정한 후, T세포는 0 내지 3의 비율, 및 마크로파지는 0 내지 3의 비율로 설정하여 공배양하였고, 상기 공배양물에 항-PD-L1 항체인 아테졸리주맙(Atezolizumab, Selleck, #A2004) 10 nM 및/또는 항-CD47 항체 10 nM를 처리한 후, 각 비율에 따른 암 오가노이드 또는 마크로파지의 사멸 정도를 분석하였다. 이때, 상기 T세포 및 마크로파지의 비율은 상기 실시예 1.1에서 적용한 비율보다 더 좁은 범위로 테스트하였고, 분석은 약물 처리 후 72시간 동안의 오가노이드 면적의 변화를 HCS (High-Content Screening) 장비를 이용하여 분석하였다. 이후, 전반적인 효능(Overall efficacy)을 약물 처리 72시간 후 비처리군의 오가노이드 면적에 대비하여, 약물 처리군의 면적 변화를 산출함으로써 약물의 효능성을 평가하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 암 오가노이드 및 마크로파지의 비율이 1 및 1로 고정되고, T세포의 비율이 달라지는 그룹 1, 3, 6 및 8의 결과에서는, T세포의 비율이 높아질수록 전반적인 효능이 증가하며, 특히 아테졸리주맙 처리군에서 암 오가노이드의 높은 성장 저해 및 사멸 효과가 나타남을 확인하였다.
또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, 암 오가노이드 및 T세포의 비율이 1 및 0.5로 고정되고, 마크로파지의 비율이 달라지는 그룹 2, 4, 5, 6 및 7의 결과에서는, 마크로파지의 비율이 높아질수록 전반적인 효능이 증가하며, 특히 항-CD47 항체 처리군에서 암 오가노이드의 높은 성장 저해 및 사멸효과가 나타남을 확인하였다.
다만, 도 6에 나타낸 바와 같이, 아테졸리주맙 단독, 항-CD47 항체 단독 및 이들의 병용에 대한 암 오가노이드의 사멸 효과가 유사함과 동시에 높게 나타나는 그룹은 그룹 5, 6 및 7임을 확인하였다.
따라서, 상기 실시예 1.1 내지 1.3의 결과를 종합하면, 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지를 공배양하였을 때, 암 오가노이드의 성장을 저해하지 않으면서, 암 오가노이드 및 마크로파지의 사멸을 야기하지 않고, 서로 다른 약물이 단독으로 또는 병용으로 처리되었을 때 전반적인 효능을 유사하게 나타낼 수 있는 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지의 비율은 그룹 5의 1 : 0.5 : 0.5, 그룹 6의 1 : 0.5 : 1, 및 그룹 7의 1 : 0.5 : 3임을 확인하였다.
Claims (8)
- 하기 단계를 포함하는, 항암제의 효능 평가 방법:
(a) 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지를 각각 1 : 0.5 : 0.5 내지 3의 세포수 비율로 혼합하여 공배양하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지 혼합물에 항암제를 처리하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 항암제가 처리된 군이 항암제 미처리군 또는 양성 대조군에 비해 암 오가노이드의 성장 저해 또는 사멸이 증가한 경우, 상기 항암제의 효능이 우수한 것으로 판단하는 단계. - 하기 단계를 포함하는, 항암제의 스크리닝 방법:
(a) 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지를 각각 1 : 0.5 : 0.5 내지 3의 세포수 비율로 혼합하여 공배양하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지 혼합물에 항암제 후보물질을 처리하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 항암제 후보물질이 처리된 군에서 항암제 후보물질 미처리군에 비해 암 오가노이드의 성장 저해 또는 사멸이 증가한 경우, 상기 후보물질을 항암제로 결정하는 단계. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 항암제는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 융합 단백질, 항체, 앱타머, 항체-약물 복합체(ADC; Antibody Drug Conjugate), DNA 또는 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산, siRNA, shRNA, miRNA 및 리보자임으로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상인, 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 암은 담도암, 위암, 폐암, 간암, 대장암, 결장암, 소장암, 췌장암, 뇌암, 뼈암, 흑색종, 유방암, 경화성선증, 자궁암, 자궁경부암, 두경부암, 식도암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 육종, 전립선암, 요도암, 방광암, 혈액암, 림프종 및 섬유선종으로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상인, 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 암 오가노이드의 성장 저해 또는 사멸은 암 오가노이드의 면적 증감을 통해 확인하는 것인, 방법. - 제1항에 따른 항암제의 효능 평가 방법을 사용하기 위한 항암제의 효능 평가 시스템으로서, 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지를 포함하는 항암제의 효능 평가 시스템.
- 제2항에 따른 항암제의 스크리닝 방법을 사용하기 위한 항암제의 스크리닝 시스템으로서, 암 오가노이드, T세포 및 마크로파지를 포함하는 항암제의 스크리닝 시스템.
- 삭제
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|---|---|---|---|---|
| KR20200105852A (ko) * | 2017-12-21 | 2020-09-09 | 코닌클리즈케 네덜란드세 아카데미 반 베텐샤펜 | 면역세포 오가노이드 공-배양물 |
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