CN116515938A - 基于肿瘤类器官模型筛选个体化肿瘤新抗原疫苗的方法 - Google Patents

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Cell Ecology Haihe Laboratory
Tianjin Cancer Hospital Airport Hospital
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Abstract

基于肿瘤类器官模型筛选个体化肿瘤新抗原疫苗的方法，包括以下步骤：S1、肿瘤类器官建立；S2对候选新抗原疫苗进行初步筛选；S3免疫微环境肿瘤类器官模型建立；S4通过杀伤实验筛选能引起免疫细胞杀伤效果的个体化新抗原疫苗，包括利用步骤S3中构建的免疫微环境肿瘤类器官模型进行类器官杀伤实验，进一步体外筛选高免疫原性的肿瘤治疗性疫苗。相比较现有技术对候选新抗原疫苗筛选方案只在T细胞水平上进行验证，很难保证新抗原疫苗进入人体后能利用体内的肿瘤免疫微环境激起免疫反应杀灭肿瘤，所以免疫微环境肿瘤类器官模型的建立为验证免疫细胞的免疫杀伤效果并筛选有高免疫原性的新抗原疫苗提供了更加有效的解决方案。

Description

基于肿瘤类器官模型筛选个体化肿瘤新抗原疫苗的方法
技术领域
本申请涉及一种基于肿瘤类器官模型筛选个体化肿瘤新抗原疫苗的方法，具体包括个体化肿瘤类器官模型的建立，个体化肿瘤新抗原疫苗对患者来源PBMC中免疫细胞的激活，以及肿瘤类器官与免疫细胞共培养的肿瘤杀伤体系的建立。
背景技术
近几十年来，人们对肿瘤发生发展的机制的认识有了很大的提高，癌症的诊断和治疗已经取得了很大的进展，但是癌症的治疗仍然是世界性的难题。免疫治疗是癌症治疗中进展最快和最具前景的方案之一。机体免疫系统在患者肿瘤发生发展中起了至关重要的作用，而免疫系统功能异常是引发癌症发病以及发展的重要原因。肿瘤免疫疗法是一种通过激活人体自身免疫系统，恢复机体的抗肿瘤反应，从而识别并清除肿瘤细胞的有效治疗方法。
肿瘤新抗原疫苗是目前最具前沿性及具有治愈癌症潜能的肿瘤免疫疗法之一，主要特点是特异性诱导患者自身免疫系统的免疫应答，有效的抑制肿瘤发展甚至清除肿瘤。肿瘤细胞的非同义体细胞突变可以产生肿瘤特异性的新抗原，在正常组织中不表达，新抗原通过MHC呈递到细胞表面被T细胞特异性识别并激活免疫应答反应，使患者获得动态的、持续的抗肿瘤免疫应答，降低肿瘤复发率，甚至可以真正实现临床治愈。肿瘤新抗原治疗性疫苗有多种形式，主要包括：多肽疫苗、核酸疫苗、肿瘤新抗原装载的树突状细胞（DC）疫苗等。如今临床上通常采用肿瘤新抗原疫苗与其他免疫治疗方案联合治疗，能更有效的增强免疫细胞的肿瘤杀伤效果，使得肿瘤新抗原疫苗研究成为癌症治疗领域研发的热点，而筛选到真正具有高免疫原性的肿瘤新抗原疫苗是个体化肿瘤新抗原疫苗治疗肿瘤临床应用和提高临床治疗效果中至关重要的部分。
随着精准医学、基因组学、高通量测序技术的快速发展，特别是单细胞测序和空间转录组学的出现极大推动了个体化肿瘤新抗原预测的精确性，但从高通量基因测序数据所得到的肿瘤的体细胞突变到可以真正引起T细胞表面受体TCR（T-cell receptor）特异性识别肿瘤新抗原从而产生免疫应答反应，这中间存在着大量的假阳性新抗原，这些候选假阳性新抗原无法激活T细胞的特异性免疫应答，为临床试验以及癌症治疗带来极大的不确定性。由于绝大部分新生抗原都是肿瘤体细胞随机突变产生的，在患者之间或者肿瘤之间完全不同，新生抗原疫苗只能是一对一针对每个患者个体或者针对每个肿瘤进行个性化治疗，属于个体化定制型的“一人一药”，因此筛选真正可以引起T细胞免疫应答的新抗原疫苗是个体化肿瘤新抗原疫苗制备中不可或缺的一环，而有效合理的筛选方案在临床转化研究以及癌症免疫治疗中具有极高的临床应用意义和广泛前景。
目前体外筛选个体化肿瘤新抗原疫苗采用的主要方法是检测个体化肿瘤新抗原疫苗激活的T细胞的免疫活性，例如新抗原疫苗与T细胞共刺激后通过流式细胞术、酶联免疫吸附斑点试验(ELI Spot)检测T细胞的活化程度，多色标记的MHC四聚体实验和新抗原活化后的T细胞测序分析等，进而通过验证新抗原疫苗的免疫原性来筛选个体化肿瘤新抗原疫苗。这些筛选方案只能在体外检测个体化肿瘤新抗原疫苗反应的T细胞的免疫活性，而个体化肿瘤新抗原疫苗反应的T细胞是否能真正在体内杀伤肿瘤细胞无法验证，所以有很大的局限性。而患者来源的肿瘤类器官模型能够在体外高效快速的模拟患者体内的肿瘤微环境，因为其可以保留患者体内组织学特征和遗传学特征，越来越多的被用在体外抗肿瘤药物筛选等方案中。在个体化肿瘤新抗原疫苗的筛选中，本申请把个体化肿瘤新抗原疫苗激活的T细胞（分离自同一患者的外周血单核细胞PBMC）与肿瘤类器官共培养后，通过检测个体化肿瘤新抗原疫苗激活的T细胞对类器官的杀伤水平对个体化肿瘤新抗原疫苗进行验证与筛选，很大程度的弥补了之前的筛选方法无法模拟患者体内肿瘤微环境，无法真正检测个体化肿瘤新抗原疫苗激活的T细胞的肿瘤杀伤效果的缺陷。
患者来源的肿瘤类器官模型可以为个体化肿瘤新抗原疫苗的免疫原性和功能鉴定进行快速高效的体外筛选。治疗性肿瘤疫苗的临床应用一个很大的挑战是无法准确的鉴定可以真正引起免疫应答的新抗原靶点，传统的肿瘤模型无法有效的模拟患者体内的免疫微环境及实体肿瘤的高度异质性。近几十年肿瘤研究的模型大多为2D肿瘤细胞系培养、患者来源的异种移植瘤（Patient-derived Xenograft，PDX）或基因工程小鼠，然而随着人们对肿瘤复杂性的深入了解，这几种模型都有很大的局限性。例如从患者肿瘤构建的2D细胞系缺乏肿瘤组织空间结构，难以模拟患者体内微环境的多样性，同时无法保留原始肿瘤细胞的异质性和遗传物质的异质性；动物模型相比体外2D培养能更好的模拟患者肿瘤的生物学特征，但是难以引入患者自身的微环境，而且构建成功率低，周期长，成本高，在临床应用上有很大的困难。而在肿瘤的免疫学研究中，这些传统的体外体内模型最大的缺点是无法充分的模拟患者体内的复杂免疫微环境，都不能作为肿瘤免疫治疗转化研究和临床研究中的理想模型。
近年来体外类器官培养的出现为肿瘤学尤其是肿瘤免疫学的研究提供了新的研究思路。类器官是指在体外三维环境中培养的一群有自我更新和自我组织能力的类似于体内组织排列和功能的细胞团落，通常来源于胚胎干细胞、诱导多能干细胞或成体干细胞。类器官不仅可以来源于正常成体组织，同时也可以来源于肿瘤组织，来源于肿瘤组织建立的类器官称之为患者来源的肿瘤类器官模型（Patient-derived Organoid，PDO）。自2011年Sato等人首次成功构建了患者来源的肠癌类器官后，研究人员陆续实现了肝癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌等类器官模型的建立。相比较于肿瘤原代细胞2D培养和PDX模型，肿瘤类器官模型包含多种特异性细胞类型，空间结构与其对应肿瘤组织相似，组织来源也更加多样，除手术切除，穿刺活检样本外，还可以以循环肿瘤细胞和浆膜腔积液样本为来源建立类器官模型。
肿瘤类器官很好的维持了患者肿瘤的原始生理结构和功能特征。成功构建的肿瘤类器官模型可以长期传代并建立肿瘤类器官样本库，不仅在肿瘤学基础研究、转化研究、高通量药物筛选以及个体化精准医疗中发挥了至关重要的作用，同时也为肿瘤免疫治疗基础研究和转化研究提供了更为理想的模型。一直以来在体外模拟患者肿瘤的免疫微环境是肿瘤免疫学研究的重要挑战，而肿瘤免疫微环境类器官模型可以克服原代肿瘤细胞系无法满足患者肿瘤的异质性和PDX模型难以引入人体的免疫系统的局限性，最大限度的模拟患者肿瘤的免疫微环境。
免疫微环境类器官的构建有两种不同的实验方案，一种是直接从患者来源的肿瘤组织样本构建肿瘤类器官同时保留内源性免疫细胞共培养，另一种方案是在肿瘤类器官引入外源免疫细胞（PBMC分离或单独培养）进行共培养。肿瘤类器官内源性免疫细胞共培养方案采用的是气液平面法（Air-liquid interphase，ALI）：肿瘤样本或者活检样本的细胞悬液接种于transwell小室上层的基质胶中，小室下层加入完全培养基，共培养体系建立在气液平面上促进了类器官与内源性免疫细胞的增殖。气液平面法中的内源性免疫细胞保留了原始T细胞受体（T cell receptor，TCR）的异质性，但在此体系中内源性免疫细胞只能存活30天左右且无法在传代中保留。另一种共培养方案是包埋法构建的患者来源的肿瘤类器官与同一患者的外周血单核细胞（PBMC）分离出来的免疫细胞进行共培养。这种方案在单独构建的类器官中引入了患者自身的免疫微环境，还原患者的原代组织和肿瘤细胞微环境，并维持其多样化的细胞群体，这一方案可以对肿瘤类器官进行长期的培养和扩增，随时对其进行免疫学研究，更利于肿瘤免疫学的广泛研究。
发明内容
本发明的目的是提供基于肿瘤类器官模型筛选个体化肿瘤新抗原疫苗的方法，与目前的新抗原免疫原性筛选模型相比，肿瘤免疫微环境类器官模型既能还原肿瘤内部的异质性、也可模拟患者个体化真实的肿瘤免疫微环境，从而能更真实的反映个体化肿瘤新抗原疫苗介导的抗肿瘤免疫反应，筛选出临床有效的个体化肿瘤新抗原疫苗，建立安全有效的个体化免疫治疗方案。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
基于肿瘤类器官模型筛选个体化肿瘤新抗原疫苗的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、肿瘤类器官建立，包括取样及保存、样本酶解、类器官铺板、类器官传代、类器官冻存；
S2、对候选新抗原疫苗进行初步筛选，包括通过流式细胞术和ELISpot，检测被待筛选的候选新抗原疫苗刺激的PBMC中的免疫细胞的活化水平，从而初步验证和筛选高免疫原性的候选新抗原疫苗，形成初步筛选的新抗原疫苗；
S3、免疫微环境肿瘤类器官模型建立，用步骤S2中初步筛选的新抗原疫苗刺激步骤S1病人来源的PBMC的免疫细胞，把刺激后的PBMC与CFSE标记的类器官共培养于T细胞培养基中共培养建立免疫微环境肿瘤类器官模型；
S4、通过杀伤实验筛选能引起免疫细胞杀伤效果的个体化新抗原疫苗，包括利用步骤S3中构建的免疫微环境肿瘤类器官模型进行类器官杀伤实验，进一步体外筛选高免疫原性的肿瘤治疗性疫苗。
进一步地，步骤S1具体包括：
S11：取样及保存，手术室新鲜切除的肿瘤组织或者活检组织放于冰预冷的adDMEM/F12+++培养基中迅速转运到实验室开始分离原代组织；
S12：样本酶解，将S11的组织块切成1-3mm3的小块，用组织解离液进行解离，不同癌组织解离液不同，解离完成的原代细胞用adDMEM/F12+++清洗重悬后用70µm或100µm细胞滤网进行过滤，过滤完成后加入红细胞裂解液4℃处理5min；
S13：类器官铺板，将裂解后的肿瘤原代细胞重悬在培养基稀释的基质胶中，整体浓度不能低于70%，将混有原代肿瘤细胞的基质胶滴加到37℃培养箱预热的6孔板上，待3-5min后迅速放置到培养箱倒置培养20min以形成稳定的dome并使基质胶凝固，待基质胶凝固后在培养皿中加入完全培养基，不同癌组织完全培养基不同；
S4：类器官冻存，待细胞状态较好时进行换液，隔天冻存，取用时复苏即可。
进一步优选地，步骤S2具体包括，
S21、初筛选环境准备：癌患者PBMC来源的免疫细胞获取，候选新抗原疫苗与PBMC共培养，以对PBMC中免疫细胞进行刺激；
S22、ELISpot实验验证对被新抗原疫苗刺激后的免疫细胞的免疫活性：在PBMC被候选新抗原疫苗刺激三个周期后，收集PBMC细胞培养上清液用于酶联免疫吸附实验，通过检测IFNγ的分泌来分析候选新抗原疫苗的免疫原性，根据数值的大小排序筛选出免疫原性较高的候选新抗原疫苗；
S23、流式细胞术验证被新抗原疫苗刺激后的免疫细胞的免疫活性：在PBMC被候选新抗原疫苗刺激三个周期后，收集PBMC并通过流式细胞术检测T细胞激活标记物评估免疫细胞的免疫活性，检测CD8+T细胞的IFNγ，CD107α，CD137的表达作为T细胞激活的指标，根据测定指标的大小排序并筛选出免疫原性较高的候选新抗原疫苗；
S24、综合评价：对S22和S23筛选出的候选新抗原疫苗，进行综合评价，进一步筛选形成初步筛选的新抗原疫苗。
进一步地，步骤S3具体包括，
S31，利用步骤S1冻存的类器官进行传代培养，复苏S1冻存的类器官，从含有类器官的6孔板中吸出培养基，每孔含有1-5×104个类器官，按类器官传代方式进行消化，待解离成单细胞后，用CFSE标记肿瘤类器官；
S32，免疫微环境肿瘤类器官模型建立，用步骤S2中初步筛选的新抗原疫苗刺激步骤S1病人来源的PBMC的免疫细胞，把刺激后的PBMC与CFSE标记的类器官共培养于T细胞培养基中，按免疫细胞比肿瘤类器官细胞10:1的比例进行混合，铺到24孔板中，每孔加500µL培养基，免疫微环境肿瘤类器官模型建立完成，备用。
更加优选地，步骤S4利用免疫微环境肿瘤类器官模型进行类器官杀伤实验具体为，对用初步筛选肿瘤新抗原刺激的PBMC构建的免疫微环境肿瘤类器官模型培养72h，后收集类器官和T细胞，在室温下用CD45抗体、AnnexinV抗体、7-AAD抗体染色15分钟，用流式细胞仪分析CFSE标记的类器官的凋亡水平，CFSE+CD45-用于定义类器官，AnnexinV-7-AAD-用于检测肿瘤类器官杀伤的细胞凋亡水平，根据不同个体化新抗原疫苗激活的免疫细胞杀伤后的类器官凋亡水平的高低进行排序，筛选出高免疫原性的肿瘤治疗性疫苗，或者，用光学显微成像，分析类器官杀伤实验候选新抗原疫苗激活免疫细胞的免疫杀伤效果，对不同个体化新抗原疫苗激活的免疫细胞杀伤引起的类器官凋亡水平的高低进行排序，筛选出高免疫原性的肿瘤治疗性疫苗。
与现有技术相比本发明具有以下特点和有益效果：
本申请创建了利用患者来源的肿瘤类器官和肿瘤免疫微环境的共培养体系进行个体化肿瘤新抗原疫苗杀伤肿瘤细胞功能的鉴定，分析候选肿瘤新抗原疫苗的免疫原性及被候选肿瘤新抗原疫苗激活的免疫细胞的肿瘤杀伤功能，从而筛选出真正具有高免疫原性和能引起肿瘤细胞杀伤功能的个体化肿瘤新抗原疫苗进入临床治疗应用。
基于基因检测、流式细胞术分析、免疫荧光染色、H&E染色或光学显微成像等检测方法，抗肿瘤效果可以从形态学、组织病理学、细胞生态学以及分子遗传学等多个维度确定候选新抗原疫苗的免疫原性和肿瘤杀伤功能鉴定，可以更准确地评估及预测候选个体化新抗原治疗性疫苗在肿瘤免疫治疗中的疗效，从而选定真正具有高免疫原性的个体化肿瘤新抗原疫苗进入肿瘤免疫治疗阶段，使病人真正受益。
附图说明
图1为本申请基于肿瘤类器官模型筛选个体化肿瘤新抗原疫苗的方法流程图示。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创新特征、达成目的与功效易于明白了解，下面对本发明进一步说明。
在此记载的实施例为本发明的特定的具体实施方式，用于说明本发明的构思，均是解释性和示例性的，不应解释为对本发明实施方式及本发明范围的限制。除在此记载的实施例外，本领域技术人员还能够基于本申请权利要求书和说明书所公开的内容采用显而易见的其它技术方案，这些技术方案包括采用对在此记载的实施例的做出任何显而易见的替换和修改的技术方案。
如图1所示，本申请基于肿瘤类器官模型筛选个体化肿瘤新抗原疫苗的方法具体包括：肿瘤类器官建立；对候选新抗原疫苗进行初步筛选；免疫微环境肿瘤类器官模型建立；通过杀伤实验筛选能引起免疫细胞杀伤效果的个体化新抗原疫苗，包括构建的免疫微环境肿瘤类器官模型进行类器官杀伤实验，进一步体外筛选高免疫原性的肿瘤治疗性疫苗。
肿瘤类器官建立：
（1）取样及保存：手术室新鲜切除的肿瘤组织或者活检组织放于冰预冷的adDMEM/F12+++培养基中，adDMEM/F12+++培养基由adDMEM/F12基础培养基添加10mMHEPES（HEPES缓冲剂），1×GlutaMAX（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽），100U/mLpenicillin-streptomycin（青霉素-链霉素双抗），50mg/mlprimosin（原代细胞抗生素），10µMofY-27632（Rho相关蛋白激酶ROCK抑制剂），迅速转运到实验室开始分离原代组织，组织块至多可在4℃保存72h。
（2）样本酶解，将组织块切成1-3mm3的小块，用组织解离液进行解离（不同组织解离液不同，以肺癌组织解离液为例：0.001%DNase（DNA酶），1mg/ml collagenase/dispase（胶原酶/中性蛋白酶），1×primosin，100U/mLpenicillin-streptomycin，10µMofY-27632，不同类型的肿瘤组织消化时间不同，消化时间不宜过长，在观察到细胞簇由2-10个细胞组成的混合物时，消化即完成。消化（解离）完成的原代细胞用adDMEM/F12+++清洗重悬后用70µm或100µm细胞滤网进行过滤，加入红细胞裂解液4℃处理5min。
（3）类器官铺板：将裂解后的肿瘤原代细胞重悬在培养基稀释的基质胶中，浓度不能低于70%，此步需要在冰上操作，防止基质胶凝固，10000个细胞接种在40µL基质胶中。将混有原代肿瘤细胞的基质胶滴加到37℃培养箱预热的6孔板上，待3-5min后迅速放置到培养箱倒置培养20min以形成稳定的dome并使基质胶凝固。待基质胶凝固后在培养皿中加入完全培养基，不同肿瘤类器官的完全培养基不同，以肺癌类器官为例，完全培养基配方为：adDMEM/F12+++培养基添加5mMNicotinamide（烟酰胺），1.25mMN-Acetylcysteine（N-乙酰半胱氨酸），1×B27supplement（B-27无血清添加剂），500nMSB202190（p38-MAPK抑制剂），500nMA83-01（TGF-βI型受体抑制剂），100ng/mlNoggin，100ng/mlFGF-10，25ng/mlFGF-7，500ng/mlR-Spondin1，每2-3天更换一次培养基。
（4）类器官传代：在前两次传代时，在培养基中添加Y-27632和Primocin。待类器官培养2周左右，数量达到105后可进行传代，用消化缓冲液（含10µMY-27632的TrypLE）室温孵育5-15min，终止缓冲液（adDMEM/F12+++培养基，5%FBS）终止消化，消化完成的类器官重悬于70%的基质胶，按1:3的比例进行传代，重新铺板完全培养基进行培养，肿瘤类器官模型建立完成。
（5）肿瘤类器官冻存：待细胞状态较好时进行换液，隔天冻存。用消化缓冲液对类器官进行消化，用预冷的冻存液（类器官商业化冻存液或90%FBS+10%DMSO）重悬类器官，调整浓度为5×104/mL，把类器官冻存悬液转移到冻存管中，保存入-80℃冰箱，第二天转入液氮中，冻存备用。
（6）复苏类器官：取用复苏类器官时，将含有类器官的冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃水浴锅中孵育1-3分钟，离心后重悬于预热的adDMEM/F12+++培养基混匀，按类器官铺板步骤进行铺板。
2.利用流式细胞术、ELI Spot对候选新抗原疫苗进行初步筛选：
通过高通量基因测序数据获取的候选新抗原疫苗需要在体外对其免疫原性进行初步验证和筛选。主要是利用候选新抗原疫苗刺激患者来源的PBMC，通过流式细胞术和ELISpot实验检测被新抗原疫苗刺激的PBMC中的免疫细胞的活化水平，从而验证和筛选高免疫原性的候选新抗原疫苗。具体包括以下步骤：
（1）患者PBMC来源的免疫细胞获取与扩增：外周血PBMC分离：取患者的外周血，采用Ficoll梯度离心的方法分离PBMC；免疫细胞扩增培养：将PBMC培养在ImmunoCut™-XFT细胞扩增培养基中，第0天加入25µL/mL ImmunoCult™人CD3/CD28T细胞活化剂和10ng/mL人重组IL-2，在37℃培养箱中培养3-6天培养至1×106细胞/mL，每3天添加新鲜培养基。
（2）候选新抗原疫苗（以多肽疫苗或者DC疫苗为例）与PBMC共培养，激活PBMC来源的免疫细胞。在候选新抗原疫苗刺激前一天，在4℃下用anti-CD28（5µg/mL稀释于PBS），涂覆96孔U形板底部（每孔50µL），用封口膜封口4℃孵育过夜。刺激当天用PBS清洗抗CD28涂层板两次，将1×105扩增后的PBMC与25×10-6M的多肽或者将扩增后的PBMC与新抗原装载的DC疫苗按10:1的比例进行共培养（阴性对照组加DMSO或未装载的DC疫苗刺激），于200µLT扩增细胞培养基，加入100U/mLIL-2、10ng/mLIL-7、10ng/mLIL-15，每隔3天采用半量换液的方式更换包含肽和细胞因子的新鲜培养基。
（3）流式细胞术、ELISpot实验对新抗原疫苗刺激后的免疫细胞免疫活性的验证：PBMC在候选新抗原疫苗三个周期的刺激后，收集细胞培养上清液用于酶联免疫吸附实验（ELISpot），通过检测IFNγ的分泌来分析候选新抗原疫苗的免疫原性，根据数值的大小排序筛选出免疫原性较高的候选新抗原疫苗；在候选新抗原疫苗三个周期的刺激后，收集PBMC并通过流式细胞术检测T细胞激活标记物评估免疫细胞的免疫活性，检测CD8+T细胞的IFNγ,CD107α,CD137等表达作为T细胞激活的指标，根据测定指标的大小排序并筛选出免疫原性较高的候选新抗原疫苗；
整合分析ELISpot和流式细胞术数据结果，得到初步筛选的新抗原疫苗。
免疫微环境肿瘤类器官模型建立：
肿瘤类器官可以更好的模拟患者体内的肿瘤异质性和三维结构，在体外重现患者体内的肿瘤微环境，同时通过肿瘤类器官和免疫细胞的共培养引入肿瘤免疫微环境也可以实现肿瘤免疫相互作用模型，可以更好地在体外模拟肿瘤中的免疫系统功能，现有技术中的候选新抗原疫苗筛选方案只在T细胞水平上进行了验证，很难保证新抗原疫苗进入人体后能利用体内的肿瘤免疫微环境激起免疫反应杀灭肿瘤，所以免疫微环境肿瘤类器官模型的建立为验证免疫细胞的免疫杀伤效果并筛选有高免疫原性的新抗原疫苗提供了更加有效的解决方案。具体包括以下步骤：
（1）共培养前肿瘤类器官传代：从含有类器官的6孔板中吸出培养基（每孔含有1-5×104个类器官），按类器官传代方式进行消化，待解离成单细胞后，用CFSE（BD）标记肿瘤类器官，用于共培养类器官杀伤实验后区分肿瘤类器官与免疫细胞。
（2）免疫细胞与肿瘤类器官共培养（免疫微环境肿瘤类器官模型建立）：用上述初步筛选的新抗原疫苗刺激病人来源的PBMC中的免疫细胞，把刺激后的PBMC与CFSE标记的类器官共培养于T细胞培养基中（也可为T细胞培养基与类器官培养基混合培养基），按免疫细胞比肿瘤类器官细胞10:1的比例进行混合，铺到24孔板中，每孔加500µL培养基（在类器官杀伤实验前一天，选择anti-CD28涂覆孔板底部4℃孵育过夜提供共刺激信号），构建免疫微环境肿瘤类器官模型用于后续类器官杀伤实验。
肿瘤类器官杀伤实验筛选能引起免疫细胞杀伤效果的个体化新抗原疫苗：利用构建的免疫微环境肿瘤类器官模型进行类器官杀伤实验，进一步体外筛选候选个体化肿瘤新抗原疫苗。
免疫细胞来源于被个体化新抗原疫苗激活的患者PBMC，通过候选个体化新抗原疫苗激活的PBMC与肿瘤类器官共培养进行类器官杀伤实验，通过类器官杀伤实验的杀伤效果检测被个体化新抗原疫苗激活的T细胞的免疫杀伤水平，从而筛选出高免疫原性的个体化新抗原疫苗，也即具有高免疫原性的肿瘤治疗性疫苗。
类器官杀伤实验检测候选新抗原疫苗激活T细胞的免疫杀伤效果筛选出免疫源性高的新抗原疫苗：利用免疫微环境肿瘤类器官模型进行类器官杀伤实验，对用初步筛选新抗原疫苗刺激的PBMC构建的免疫微环境肿瘤类器官模型培养72h，后收集类器官和T细胞，在室温下用CD45抗体、AnnexinV抗体、7-AAD抗体（BD）染色15分钟，用流式细胞仪分析CFSE标记的类器官的凋亡水平，CFSE+CD45-用于定义类器官，AnnexinV-7-AAD-用于检测肿瘤类器官杀伤的细胞凋亡水平，根据不同个体化新抗原疫苗激活的免疫细胞杀伤后的类器官凋亡水平的高低进行排序，筛选出免疫源性高的候选新抗原疫苗，或者，利用光学显微成像检测个体化新抗原疫苗激活的免疫细胞类器官杀伤水平，以筛选出高免疫原性的肿瘤治疗性疫苗。
利用光学显微成像检测个体化新抗原疫苗激活的免疫细胞类器官杀伤水平具体包括：类器官杀伤实验过程中，也即在对用初步筛选新抗原疫苗刺激的PBMC构建的免疫微环境肿瘤类器官模型培养过程中，分别在不同时间点（0h、24h、48h、72h）进行光学显微成像，分析类器官杀伤实验候选新抗原疫苗激活免疫细胞的免疫杀伤效果，对不同个体化新抗原疫苗激活的免疫细胞杀伤引起的类器官凋亡水平的高低进行排序，从而筛选有效的个体化肿瘤新抗原疫苗。通过免疫微环境肿瘤类器官模型进行肿瘤类器官杀伤实验筛选个体化新抗原疫苗能相比于之前的筛选方案能更好的模拟患者体内的肿瘤微环境以及免疫微环境，能够更好的筛选出能够在患者体内有效引起免疫反应的肿瘤治疗性疫苗，从而使新抗原疫苗免疫治疗达到更好的治疗效果乃至治愈效果。
筛选出的新抗原疫苗进入临床试验后，利用免疫微环境类器官模型对病人做疫苗最终疗效的疗效评估，具体包括，基于免疫微环境肿瘤类器官模型对个体化肿瘤新抗原疫苗疗效动态监测：在新抗原疫苗治疗后，利用治疗后患者的外周血PBMC和先前建立的肿瘤类器官构建免疫微环境肿瘤类器官模型，检测治疗后患者体内的免疫细胞是否被个体化新抗原疫苗激活从而评价个体化肿瘤新抗原疫苗疗效，具体步骤如下：
（1）个体化肿瘤新抗原疫苗治疗后患者的外周血PBMC分离：取治疗后患者的外周血，采用Ficoll梯度离心的方法分离PBMC。
（2）ELI Spot和流式细胞术对个体化肿瘤新抗原疫苗治疗后患者免疫疗效初步验证：完全收集PBMC培养上清液用于酶联免疫吸附试验（ELI Spot）分析；收集PBMC并通过流式细胞术检测免疫细胞标记物评估其免疫活性，免疫细胞免疫原性测定的指标包括CD8,CD4,IFNγ,CD107α,CD137等。
（3）基于肿瘤类器官模型，对个体化肿瘤新抗原疫苗治疗后患者的免疫系统动态监测：收集个体化肿瘤新抗原疫苗治疗后患者的外周血PBMC经扩增后与同一患者来源的肿瘤类器官模型共培养进行类器官杀伤实验，分析新抗原免疫治疗后患者免疫细胞对肿瘤类器官杀伤效果进行动态实时监测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.基于肿瘤类器官模型筛选个体化肿瘤新抗原疫苗的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、肿瘤类器官建立，包括取样及保存、样本酶解、类器官铺板、类器官传代、类器官冻存；
S2、对候选新抗原疫苗进行初步筛选，包括通过流式细胞术和ELISpot，检测被待筛选的候选新抗原疫苗刺激的PBMC中的免疫细胞的活化水平，从而初步验证和筛选高免疫原性的候选新抗原疫苗，形成初步筛选的新抗原疫苗；
S3、免疫微环境肿瘤类器官模型建立，用步骤S2中初步筛选的新抗原疫苗刺激步骤S1病人来源的PBMC中的免疫细胞，把刺激后的PBMC与CFSE标记的类器官共培养于T细胞培养基中建立免疫微环境肿瘤类器官模型；
S4、通过杀伤实验筛选能引起免疫细胞杀伤效果的个体化新抗原疫苗，包括利用步骤S3中构建的免疫微环境肿瘤类器官模型进行类器官杀伤实验，进一步体外筛选高免疫原性的肿瘤治疗性疫苗。
2.权利要求1所述的基于肿瘤类器官模型筛选个体化肿瘤新抗原疫苗的方法，其特征在于，步骤S1具体包括：
S11：取样及保存，手术室新鲜切除的肿瘤组织或者活检组织放于冰预冷的adDMEM/F12+++培养基中迅速转运到实验室开始分离原代组织；
S12：样本酶解，将S11的组织块切成1-3mm3的小块，用组织解离液进行解离，不同癌组织解离液不同，解离完成的原代细胞用adDMEM/F12+++清洗重悬后用70µm或100µm细胞滤网进行过滤，过滤完成后加入红细胞裂解液4℃处理5min；
S13：类器官铺板，将裂解后的肿瘤原代细胞重悬在培养基稀释的基质胶中，整体浓度不能低于70%，将混有原代肿瘤细胞的基质胶滴加到37℃培养箱预热的6孔板上，待3-5min后迅速放置到培养箱倒置培养20min以形成稳定的dome并使基质胶凝固，待基质胶凝固后在培养皿中加入完全培养基，不同癌组织完全培养基不同；
S4：类器官冻存，待细胞状态较好时进行换液，隔天冻存，取用时复苏即可。
3.权利要求1所述的基于肿瘤类器官模型筛选个体化肿瘤新抗原疫苗的方法，其特征在于，步骤S2具体包括，
S21、初筛选环境准备：癌患者PBMC来源的免疫细胞获取，候选新抗原疫苗与PBMC共培养，以对PBMC中免疫细胞进行刺激；
S22、ELISpot实验验证对被新抗原疫苗刺激后的免疫细胞的免疫活性：在PBMC被候选新抗原疫苗刺激三个周期后，收集PBMC细胞培养上清液用于酶联免疫吸附实验，通过检测IFNγ的分泌来分析候选新抗原疫苗的免疫原性，根据数值的大小排序筛选出免疫原性较高的候选新抗原疫苗；
S23、流式细胞术验证被新抗原疫苗刺激后的免疫细胞的免疫活性：在PBMC被候选新抗原疫苗刺激三个周期后，收集PBMC并通过流式细胞术检测T细胞激活标记物评估免疫细胞的免疫活性，检测CD8+T细胞的IFNγ，CD107α，CD137的表达作为T细胞激活的指标，根据测定指标的大小排序并筛选出免疫原性较高的候选新抗原疫苗；
S24、综合评价：对S22和S23筛选出的候选新抗原疫苗，进行综合评价，进一步筛选形成初步筛选的新抗原疫苗。
4.权利要求2所述的基于肿瘤类器官模型筛选个体化肿瘤新抗原疫苗的方法，其特征在于：步骤S3具体包括，
S31，利用步骤S1冻存的类器官进行传代培养，复苏S1冻存的类器官，从含有类器官的6孔板中吸出培养基，每孔含有1-5×104个类器官，按类器官传代方式进行消化，待解离成单细胞后，用CFSE标记肿瘤类器官；
S32，免疫微环境肿瘤类器官模型建立，用步骤S2中初步筛选的新抗原疫苗刺激步骤S1病人来源的PBMC中的免疫细胞，把刺激后的PBMC与CFSE标记的类器官共培养于T细胞培养基中，按免疫细胞比肿瘤类器官细胞10:1的比例进行混合，铺到24孔板中，每孔加500µL培养基，免疫微环境肿瘤类器官模型建立完成，备用。
5.权利要求4所述的基于肿瘤类器官模型筛选个体化肿瘤新抗原疫苗的方法，其特征在于：步骤S4利用免疫微环境肿瘤类器官模型进行类器官杀伤实验具体为，对免疫微环境肿瘤类器官模型培养72h，后收集类器官和T细胞，在室温下用CD45抗体、AnnexinV抗体、7-AAD抗体染色15分钟，用流式细胞仪分析CFSE标记的类器官的凋亡水平，CFSE+CD45-用于定义类器官，AnnexinV-7-AAD-用于检测肿瘤类器官杀伤的细胞凋亡水平，根据不同个体化新抗原疫苗激活的免疫细胞杀伤后的类器官凋亡水平的高低进行排序，筛选出高免疫原性的肿瘤治疗性疫苗，或者，用光学显微成像，分析类器官杀伤实验候选新抗原疫苗激活免疫细胞的免疫杀伤效果，对不同个体化新抗原疫苗激活的免疫细胞杀伤引起的类器官凋亡水平的高低进行排序，筛选出高免疫原性的肿瘤治疗性疫苗。
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