CN113881630B - 一种肿瘤特异性til细胞的培育分离方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种肿瘤特异性TIL细胞的培育分离方法，包括以下步骤：步骤1，获取胸腹水中的肿瘤细胞团和免疫细胞液；步骤2，将肿瘤细胞团进行肿瘤类器官培养；步骤3，将免疫细胞进行扩增培养；步骤4，将培养获得的肿瘤类器官处理成单细胞后与扩增培养的免疫细胞进行共培养；步骤5：分离共培养细胞中的特定免疫细胞群。本发明利用同一来源的样本同时分离培养肿瘤类器官以及肿瘤相关免疫细胞，再将肿瘤类器官和免疫细胞进行共培养，得到的肿瘤特异性的TIL细胞可以保留类器官的生物学效应，并且数量多，培养周期明显缩短。此外，利用本方法分离培养得到的TIL细胞肿瘤特异性更强，由此肿瘤杀伤活性会更强。

Description

一种肿瘤特异性TIL细胞的培育分离方法
技术领域
本发明涉及细胞培育技术领域，具体涉及一种肿瘤特异性TIL细胞的培育分离方法。
背景技术
肿瘤浸润性淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocytes，TILs)是存在于肿瘤组织、肿瘤转移淋巴结以及肿瘤相关恶性胸腹水的淋巴细胞。相较于血液或其他器官中的淋巴细胞，TIL细胞中含有较高比例的肿瘤特异性淋巴细胞。这一类淋巴细胞通过体外分离、扩增、活化后已作为一种临床治疗手段可用于肿瘤的过继性细胞免疫治疗，并在恶性黑色素瘤(melanoma)，急性淋巴性白血病(Acute lymphoblastic leukemia，ALL)等癌种中取得不菲的效果。然而这种过继性细胞免疫治疗手段在其他癌种中取得的疗效并不大，其中一个重要原因就是如何寻找到精准的已经识别肿瘤的TILs，同时从原理上来说：要是肿瘤的免疫原性很低，并不能够激活T细胞，那么这个疗法的效果就会大打折扣。基于此，找到或者激活并扩增肿瘤特异性TIL将是推进过继性细胞免疫治疗的一个重要进步。目前虽然已有人提出自肿瘤相关恶性胸腹水中提取TIL细胞分离、扩增，但是由于肿瘤特异性靶点不明确，筛选扩增得到的恶性胸水中肿瘤特异性TIL的生物学特性报道较少，已有报道的则满足不了要求。此外，培育过程的繁琐性和不稳定性也是阻碍研究进展的难题。
类器官(Organoids)是衍生于干细胞或前体细胞的器官特异性细胞集合。体外培养的类器官在细胞成分和组织架构上与对应器官高度相似，并具备相应的功能学特征。与常规细跑培养在二维环境中培养单一细胞类群不同，类器官培养是在三维环境中培养出特定组织器官包含的多种细胞类群，其培养体系与体内微环境更为相似。肿瘤类器官(tumoroid)是由肿瘤组织或肿瘤相关胸腹水培育而成的类器官，因此肿瘤类器官或可为激活、扩增肿瘤特异性TIL细胞提供需要的靶点刺激。如果能将类器官的生物学效应和TIL细胞进行有机结合，势必推动TILs识别肿瘤研究的巨大进展。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明提供一种肿瘤特异性TIL细胞的培育分离方法。本发明的技术方案为：
一种肿瘤特异性TIL细胞的培育分离方法，包括以下步骤：
步骤1，获取胸腹水中的肿瘤细胞团和免疫细胞；
步骤2，将肿瘤细胞团进行肿瘤类器官培养；
步骤3，将免疫细胞进行扩增培养；
步骤4，将培养获得的肿瘤类器官处理成单细胞后与扩增培养的免疫细胞进行共培养；
步骤5：分离共培养细胞中的特定免疫细胞群，即得。
进一步地，所述步骤1中获取胸腹水中的肿瘤细胞团和免疫细胞的过程包括：获取胸腹水后，先50g–200g低速离心分离出肿瘤细胞团，再800g–1200g高速离心分离出免疫细胞。
进一步地，所述步骤2中将肿瘤细胞团进行肿瘤类器官培养的具体过程包括：
步骤2-1，将肿瘤细胞团用HBSS清洗后，加入等量Matrigel混匀；
步骤2-2，待细胞液凝固后，加入肿瘤类器官培养基于37℃、5％CO2浓度下培养6～10天。
进一步地，所述肿瘤类器官培养基按照终浓度的组成包括：Glutamine，1～10mM；Nicotinamide，1～10mM；A83–01，0.1～5μM；Penicillin,20～200U/mL；Streptomycin，20～200μg/mL；SB-202190，1～10μM；EGF，20～200ng/mL；L-WRN细胞培养上清液，20-60％；溶剂为DMEM/F12培养基。
可选地，所述肿瘤类器官培养基按照终浓度的组成还包括：Gastrin，2～20nM；N-acetylcysteine，1～10mM；FGF-10，20～200ng/mL。
进一步地，所述步骤3中将免疫细胞液进行扩增培养的具体过程包括：
步骤3-1，将免疫细胞用D–Hanks平衡盐溶液清洗后，加入人外周血淋巴细胞分离液分离单核细胞，得到包括免疫细胞的单细胞悬液；
步骤3-2，将单细胞悬液过40目滤网后加入含有1000-8000IU/mL的IL-2的X-VIVOTM15培养基混匀，于37℃、5％CO2浓度下扩增培养，扩增免疫细胞至5×10^6-5×10^8。
进一步地，所述步骤4中将培养获得的肿瘤类器官处理成单细胞后与扩增培养的免疫细胞进行共培养，具体过程包括：
步骤4-1，将肿瘤类器官通过消化液消化得到单细胞悬液；
步骤4-2，将肿瘤类器官单细胞与扩增培养得到的免疫细胞按照1：(2-20)细胞比例混匀，加入含有1000-8000IU/mL的IL-2的X-VIVOTM 15培养基，于37℃、5％CO2浓度下培养3-9天，分离后获得一次培养的免疫细胞；
步骤4-3，转移一次培养的免疫细胞至新的培养皿，按照1：(2-20)细胞比例添加肿瘤类器官单细胞混匀，加入含有1000-8000IU/mL的IL-2的X-VIVOTM 15培养基，于37℃、5％CO2浓度下培养3-9天。
进一步地，所述步骤5是采用细胞磁珠分选方法分离共培养细胞中的特定免疫细胞群，具体包括：
步骤5-1，将步骤4获得的共培养物中的免疫细胞沉淀分离出来，采用D–Hanks平衡盐溶液重悬免疫细胞，加入X-VIVOTM 15培养基混匀；
步骤5-2，采用生物素标记试剂标记细胞混合液中的CD45+细胞；
步骤5-3，标记完毕，将细胞混合液加入细胞分选柱中，利用磁性分离器收集CD45+免疫细胞。
本发明还提供上述培育分离方法获得的肿瘤特异性TIL细胞在肿瘤免疫治疗、肿瘤免疫抑制中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明利用同一来源的样本同时分离培养肿瘤类器官以及肿瘤相关免疫细胞，再将肿瘤类器官和免疫细胞进行共培养，得到的肿瘤特异性的CD45+T细胞可以保留类器官的生物学效应，并且数量多，较比目前采用的IL-2刺激TIL细胞扩增方法的培养周期明显缩短。此外，利用本方法分离培养得到的CD45+T细胞通过杀伤实验证实本发明的TIL细胞肿瘤特异性更强，肿瘤细胞杀伤力更强。
附图说明
图1为本发明实施例1培育分离的肿瘤特异性TIL细胞(CD45+免疫细胞)。
图2为本发明实施例2培育分离的肿瘤特异性TIL细胞(CD45+免疫细胞)。
图3为本发明实施例3培育分离的肿瘤特异性TIL细胞(CD45+免疫细胞)。
图4为本发明实施例2培育分离的肿瘤特异性TIL细胞(CD45+免疫细胞)与原始免疫细胞的CD137免疫荧光染色结果对比。
具体实施方式
本发明实施例采用的人外周血淋巴细胞分离液购自Cedarlane公司。
本发明实施例采用的Glutamax、Glutamine、EGF购自Invitrogen公司。
本发明实施例采用的Nicotinamide、SB-202190购自Sigma公司。
本发明实施例采用的A83–01购自Tocris公司。
本发明实施例采用的CD45+分选试剂盒生物素标记试剂购自STEMCELLTechnologies，型号为100-0105。
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
本实施例提供一种胃癌腹水来源肿瘤特异性TIL细胞的培育分离方法，包括以下步骤：
1、获取胃癌腹水后，100g低速离心10分钟，分离肿瘤细胞团与免疫细胞。沉淀为肿瘤细胞团，上清为免疫细胞，吸取上清至新的离心管，然后1000g离心10分钟，获得免疫细胞沉淀。
2、将步骤1获得的肿瘤细胞团用HBSS清洗后，加入等量Matrigel混匀。
3、待细胞液凝固后，加入肿瘤类器官培养基(按照终浓度的组成为：Glutamine，5mM；Nicotinamide，10mM；A83–01，0.5μM；Penicillin，100U/mL；Streptomycin，100μg/mL；SB-202190，10μM；EGF，50ng/mL；L-WRN细胞培养上清液，50％；溶剂为DMEM/F12培养基)，于37℃、5％CO2浓度下培养7天。
4、将步骤1获得的免疫细胞用D–Hanks平衡盐溶液清洗后，加入人外周血淋巴细胞分离液分离单核细胞，得到包括免疫细胞的单细胞悬液。
5、将单细胞悬液过40目滤网后加入含有1000IU/mL的IL-2的X-VIVOTM15培养基混匀，于37℃、5％CO2浓度下扩增培养，扩增培养7天至免疫细胞的总量在5×10^6-5×10^8范围内。
6、将步骤3培养获得的肿瘤类器官使用TrypLE Express消化5-10分钟得到单细胞悬液。
7、将步骤6得到的肿瘤类器官单细胞与步骤5扩增培养得到的免疫细胞按照1：2细胞比例混匀，加入含有1000IU/mL的IL-2的X-VIVOTM 15培养基，于37℃、5％CO2浓度下培养7天。
8、100g低速离心10分钟，离心后转移上清至新的培养皿，按照1：2细胞比例添加步骤6的肿瘤类器官单细胞混匀，加入含有1000IU/mL的IL-2的X-VIVOTM 15培养基，于37℃、5％CO2浓度下培养7天。
9、100g低速离心10分钟，离心后转移上清至新的离心管，然后1000g离心10分钟，获得免疫细胞沉淀。
10、用D–Hanks平衡盐溶液重悬洗涤免疫细胞，离心后去除上清，再加入X-VIVOTM15培养基混匀；
11、使用CD45+分选试剂盒生物素标记试剂标记混合液中的CD45+细胞。
12、标记完毕，将细胞混合液加入细胞分选柱中，利用磁力架收集CD45+免疫细胞如图1所示。
实施例2
本实施例提供一种卵巢癌腹水来源肿瘤特异性CD45+TIL细胞的培育分离方法，包括以下步骤：
1、获取卵巢癌腹水后，100g低速离心10分钟，分离肿瘤细胞团与免疫细胞。沉淀为肿瘤细胞团，上清为免疫细胞，吸取上清至新的离心管，然后1000g离心10分钟，获得免疫细胞沉淀。
2、将步骤1获得的肿瘤细胞团用HBSS清洗后，加入等量Matrigel混匀；
3、待细胞液凝固后，加入肿瘤类器官培养基(Glutamine，2.5mM；Nicotinamide，5mM；A83–01，1μM；Penicillin，100U/mL；Streptomycin，100μg/mL；SB-202190，5μM；EGF，75ng/mL，Gastrin，10nM；N-acetylcysteine，2.5mM；FGF-10，100ng/mL；L-WRN细胞培养上清液，40％；溶剂为DMEM/F12培养基)，于37℃、5％CO2浓度下培养6天。
4、将步骤1获得的免疫细胞用D–Hanks平衡盐溶液清洗后，加入人外周血淋巴细胞分离液分离单核细胞，得到包括免疫细胞的单细胞悬液。
5、将单细胞悬液过40目滤网后加入含有4000IU/mL的IL-2的X-VIVOTM15培养基混匀，于37℃、5％CO2浓度下扩增培养，扩增培养7天至免疫细胞的总量在5×10^6-5×10^8范围内。
6、将步骤3培养获得的肿瘤类器官使用TrypLE Express消化5-10分钟得到单细胞悬液。
7、将步骤6得到的肿瘤类器官单细胞与步骤5扩增培养得到的免疫细胞按照1：10细胞比例混匀，加入含有4000IU/mL的IL-2的X-VIVOTM 15培养基，于37℃、5％CO2浓度下培养7天。
8、100g低速离心10分钟，离心后转移上清至新的培养皿，按照1：10细胞比例添加步骤6肿瘤类器官单细胞混匀，加入含有2000IU/mL的IL-2的X-VIVOTM 15培养基，于37℃、5％CO2浓度下培养7天。
9、100g低速离心10分钟，离心后转移上清至新的离心管，然后1000g离心10分钟，获得免疫细胞沉淀。
10、用D–Hanks平衡盐溶液重悬洗涤免疫细胞，离心后去除上清，再加入X-VIVOTM15培养基混匀；
11、使用CD45+分选试剂盒生物素标记试剂标记混合液中的CD45+细胞。
12、标记完毕，将细胞混合液加入细胞分选柱中，利用磁力架收集CD45+免疫细胞如图2所示，实施例2的肿瘤类器官培养基中加入了Gastrin、N-acetylcysteine和FGF-10，最终获得的培养效果比实施例1要稍微好一些。
实施例3
本实施例提供一种肺癌胸水来源肿瘤特异性TIL细胞的培育分离方法，包括以下步骤：
1、获取肺癌胸水后，100g低速离心10分钟，分离肿瘤细胞团与免疫细胞。沉淀为肿瘤细胞团，上清为免疫细胞，吸取上清至新的离心管，然后1000g离心10分钟，获得免疫细胞沉淀。
2、将步骤1获得的肿瘤细胞团用HBSS清洗后，加入等量Matrigel混匀；
3、待细胞液凝固后，加入肿瘤类器官培养基(Glutamine，8mM；Nicotinamide，2.5mM；A83–01，2.5μM；Penicillin，150U/mL；Streptomycin，150μg/mL；SB-202190，2.5μM；EGF，150ng/mL，Gastrin，15nM；N-acetylcysteine，7.5mM；FGF-10，50ng/mL；L-WRN细胞培养上清液，30％；溶剂为DMEM/F12培养基)，于37℃、5％CO2浓度下培养6天。
4、将步骤1获得的免疫细胞用D–Hanks平衡盐溶液清洗后，加入人外周血淋巴细胞分离液分离单核细胞，得到包括免疫细胞的单细胞悬液；
5、将单细胞悬液过40目滤网后加入含有4000IU/mL的IL-2的X-VIVOTM15培养基混匀，于37℃、5％CO2浓度下扩增培养，扩增培养7天至免疫细胞的总量在5×10^6-5×10^8范围内。
6、将步骤3培养获得的肿瘤类器官使用TrypLE Express消化5-10分钟得到单细胞悬液。
7、将步骤6得到的肿瘤类器官单细胞与步骤5扩增培养得到的免疫细胞按照1：10细胞比例混匀，加入含有4000IU/mL的IL-2的X-VIVOTM 15培养基，于37℃、5％CO2浓度下培养4天。
8、100g低速离心10分钟，离心后转移上清至新的培养皿，按照1：10细胞比例添加步骤6肿瘤类器官单细胞混匀，加入含有2000IU/mL的IL-2的X-VIVOTM 15培养基，于37℃、5％CO2浓度下培养4天。
9、100g低速离心10分钟，离心后转移上清至新的离心管，然后1000g离心10分钟，获得免疫细胞沉淀。
10、用D–Hanks平衡盐溶液重悬洗涤免疫细胞，离心后去除上清，再加入X-VIVOTM15培养基混匀；
11、使用CD45+分选试剂盒生物素标记试剂标记混合液中的CD45+细胞。
12、标记完毕，将细胞混合液加入细胞分选柱中，利用磁力架收集CD45+免疫细胞如图3所示，实施例3的肿瘤类器官培养基中加入了Gastrin、N-acetylcysteine和FGF-10，最终获得的培养效果比实施例1要稍微好一些。
实施例4
将实施例1得到的TIL细胞按效靶比例5：1与胃癌细胞接种培养了24小时的96孔板内，共同培养24小时后，250g离心4分钟，吸弃上清液，每孔加50μl CellTiter-GloLuminescent Cell Viability Assay振荡溶解10分钟，用化学发光检测仪测定发光值。同时设空白对照、靶细胞对照、效应细胞对照。同时，将实施例1步骤1获得的原始免疫细胞也按照上述方法进行测试。每孔数值减去空白对照孔，求出3个复孔的平均A值，以杀伤率计算TIL细胞对肿瘤细胞杀伤活性，杀伤活性(％)＝[靶细胞对照A值-(实验孔A值-效应细胞对照A值)]/靶细胞对照A值×100％。本发明对胃癌细胞的杀伤活性为67.84％，原始免疫细胞对胃癌细胞的杀伤活性为34.17％，这说明实施例1制备的TIL细胞对肿瘤特异性更强，由此肿瘤杀伤活性会更强。
实施例5
按照以下步骤对实施例2获得的TIL细胞和实施例2步骤1获得的原始免疫细胞进行CD137免疫荧光染色，验证TIL细胞中CD137的表达情况：
1.将TIL细胞滴在防脱玻片上制成细胞滴片；
2.用4％的多聚甲醛固定15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min；
3.采用0.5％Triton X-100(PBS配制)室温通透20min；
4.PBS浸洗玻片3次，每次3min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min；
5.吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；
6.加荧光二抗：PBST浸洗玻片3次，每次3min，吸水纸吸干玻片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。
7.复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；
8.用吸水纸吸干玻片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像，统计分析细胞群中表面激活状态抗体的细胞比例。
结果如图4所示，证实本发明制备的TIL细胞CD137表达的比例远高于制备前。
实施例6
将实施例3得到的TIL细胞按效靶比例10：1与肺癌细胞接种培养了24小时的96孔板内，共同培养24小时后，250g离心4分钟，吸弃上清液，每孔加50μl CellTiter-GloLuminescent Cell Viability Assay振荡溶解10分钟，用化学发光检测仪测定发光值。同时设空白对照、靶细胞对照、效应细胞对照。同时，将实施例3步骤1获得也按照上述方法进行测试。每孔数值减去空白对照孔，求出3个复孔的平均A值，以杀伤率计算TIL细胞对肿瘤细胞杀伤活性，杀伤活性(％)＝[靶细胞对照A值-(实验孔A值-效应细胞对照A值)]/靶细胞对照A值×100％。本发明对肺癌细胞的杀伤活性为86.27％，原始免疫细胞对肺癌细胞的杀伤活性为23.75％，这说明本发明制备的TIL细胞对肿瘤特异性更强，由此肿瘤杀伤活性会更强。
对比例1
本对比例提供一种针对胃癌腹水样本的现有TIL细胞培育分离方法，具体操作如下：
1.将收集的胃癌腹水以无血清的RPMI-1640洗2次，1500rmin离心5～10min；
2.用含5％NCS的RPMI-1640完全培养液重悬细胞，将5ml比重为1.077的100％淋巴细胞分层液加入试管底层，其上缓慢加入75％的淋巴细胞分层液(用RPMI-1640配制)然后缓慢加入上述肿瘤细胞悬液3～5ml；
3.经1500～1800r/min离心20min后，分别收集75％和100％淋巴细胞分层液界面层的TIL细胞和其上层的瘤细胞；
4.用RPMI-1640洗涤2次，每次1500r/min离心5～10min。TIL细胞用含20％NCS的RPMI-1640调整细胞浓度为0.5×106/ml；
5.将上述细胞悬液接种于24孔培养板(1ml/孔)，同时分别加入IL-2 1000U/或IL-2和CD3 McAb 1&6g/ml，置37℃，5％CO2温箱培养，其间3d更换新鲜配制的含IL-2的RPMI-1640完全培养液，培养4周后收集TIL细胞。
将对比例1得到的TIL细胞参照实施例4的方法进行癌细胞杀伤实验，结果对胃癌细胞的杀伤活性为35.23％，显著低于实施例1的67.84％。
对比例2
本对比例提供一种针对肺癌胸水样本的现有TIL细胞培育分离方法，具体操作方法同对比例1，将得到的TIL细胞参照实施例6的方法进行癌细胞杀伤实验，结果对肺癌细胞的杀伤活性为39.46％，显著低于实施例6的86.27％。
综上，本发明利用同一来源的样本同时分离培养肿瘤类器官以及肿瘤相关免疫细胞，再将肿瘤类器官和免疫细胞进行共培养，得到的肿瘤特异性的CD45+T细胞可以保留类器官的生物学效应，并且数量多，通过杀伤实验也证实了本发明的TIL细胞肿瘤特异性更强，肿瘤细胞杀伤力更强。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种肿瘤特异性TIL细胞的培育分离方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，获取胸腹水中的肿瘤细胞团和免疫细胞；
步骤2，将肿瘤细胞团进行肿瘤类器官培养；
步骤3，将免疫细胞进行扩增培养；
步骤4，将培养获得的肿瘤类器官处理成单细胞后与扩增培养的免疫细胞进行共培养；
步骤5：分离共培养细胞中的特定免疫细胞群，即得。
2.根据权利要求1所述的一种肿瘤特异性TIL细胞的培育分离方法，其特征在于：所述步骤1中获取胸腹水中的肿瘤细胞团和免疫细胞的过程包括：获取胸腹水后，先50g-200g低速离心分离出肿瘤细胞团，再800g-1200g高速离心分离出免疫细胞。
3.根据权利要求1所述的一种肿瘤特异性TIL细胞的培育分离方法，其特征在于：所述步骤2中将肿瘤细胞团进行肿瘤类器官培养的具体过程包括：
步骤2-1，将肿瘤细胞团用HBSS清洗后，加入等量Matrigel混匀；
步骤2-2，待细胞液凝固后，加入肿瘤类器官培养基于37℃、5％CO2浓度下培养6～10天。
4.根据权利要求3所述的一种肿瘤特异性TIL细胞的培育分离方法，其特征在于：所述肿瘤类器官培养基按照终浓度的组成包括：Glutamine，1～10mM；Nicotinamide，1～10mM；A83-01，0.1～5μM；Penicillin，20～200U/mL；Streptomycin，20～200μg/mL；SB-202190，1～10μM；EGF，20～200ng/mL；L-WRN细胞培养上清液，20-60％；溶剂为DMEM/F12培养基。
5.根据权利要求4所述的一种肿瘤特异性TIL细胞的培育分离方法，其特征在于：所述肿瘤类器官培养基按照终浓度的组成还包括：Gastrin，2～20nM；N-acetylcysteine，1～10mM；FGF-10，20～200ng/mL。
6.根据权利要求1所述的一种肿瘤特异性TIL细胞的培育分离方法，其特征在于：所述步骤3中将免疫细胞液进行扩增培养的具体过程包括：
步骤3-1，将免疫细胞用D-Hanks平衡盐溶液清洗后，加入人外周血淋巴细胞分离液分离单核细胞，得到包括免疫细胞的单细胞悬液；
步骤3-2，将单细胞悬液过40目滤网后加入含有1000-8000IU/mL的IL-2的X-VIVOTM15培养基混匀，于37℃、5％CO2浓度下扩增培养，扩增免疫细胞至5×10^6-5×10^8。
7.根据权利要求1所述的一种肿瘤特异性TIL细胞的培育分离方法，其特征在于：所述步骤4中将培养获得的肿瘤类器官处理成单细胞后与扩增培养的免疫细胞进行共培养，具体过程包括：
步骤4-1，将肿瘤类器官通过消化液消化得到单细胞悬液；
步骤4-2，将肿瘤类器官单细胞与扩增培养得到的免疫细胞按照1∶2-1∶20细胞比例混匀，加入含有1000-8000IU/mL的IL-2的X-VIVOTM15培养基，于37℃、5％CO2浓度下培养3-9天，分离后获得一次培养的免疫细胞；
步骤4-3，转移一次培养的免疫细胞至新的培养皿，按照1∶2-1∶20细胞比例添加肿瘤类器官单细胞混匀，加入含有1000-8000IU/mL的IL-2的X-VIVOTM15培养基，于37℃、5％CO2浓度下培养3-9天。
8.根据权利要求1或7所述的一种肿瘤特异性TIL细胞的培育分离方法，其特征在于：所述步骤5是采用细胞磁珠分选方法分离共培养细胞中的特定免疫细胞群，具体包括：
步骤5-1，将步骤4获得的共培养物中的免疫细胞沉淀分离出来，采用D-Hanks平衡盐溶液重悬免疫细胞，加入X-VIVOTM15培养基混匀；
步骤5-2，采用生物素标记试剂标记细胞混合液中的CD45+细胞；
步骤5-3，标记完毕，将细胞混合液加入细胞分选柱中，利用磁性分离器收集CD45+免疫细胞。
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