KR102578640B1 - 미세유체 칩을 활용한 오가노이드의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 미세유체 칩에서 프리-오가노이드(pre-organoid)를 배양하는 단계를 포함하는, 오가노이드의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공되는 미세유체 칩을 활용하여 오가노이드를 제조하는 방법을 이용하는 경우 생체 기질 물질 없이도 배양이 가능하도록 함으로써 실제 생체 내 세포 미세 환경에 가까운 환경을 제공하여 보다 정확한 약물 처리 전의 약물 효능 예측, 약물 처리 후의 약물 효용성 검증, 유전자형에 따른 핵형 분석, 분열 속도 및 양상 관찰 등의 연구에 유용하게 적용될 수 있다.

Description

미세유체 칩을 활용한 오가노이드의 제조 방법{Method for preparing organoids using microfluidic chip}
본 발명은 미세유체 칩을 활용하여 오가노이드를 제조하는 방법에 관한 것으로 신약 테스트, 암화 과정 기작 규명, 조직이식 연구 등 다양한 오가노이드를 활용하는 연구에 이용될 수 있다.
기존 오가노이드 배양법은 Corning 사의 매트리젤(Matrigel)과 같은 세포외 기질(Extraceullar matrix; ECM)을 대체할 수 있는 지지체가 반드시 필요하다. 그러나, 매트리젤(Matrigel) 같은 경우 마우스 육종(sarcoma)에서 유래하였으며 Corning 사에서 매트리젤의 모든 성분을 공개하지 않아 실험자가 정확하게 매트리젤의 어떤 성분이 오가노이드 배양에 영향을 끼치는지 파악할 수 없었다. 또한, 매트리젤에 내포(embedding)되어 배양되는 오가노이드가 실제 사람이나 쥐의 장기가 존재하는 본연의 상태를 모사한다고 말할 수는 없기 때문에 매트리젤과 같은 ECM 모사 지지체 없이 오가노이드를 배양하는 것은 기존 배양법을 획기적으로 개선시킬 수 있을 것이다. 실제 시험하고자 하는 약물의 반응성 확인을 위해 매트리젤에서 자라는 오가노이드에 약물을 처리할 경우 매트리젤을 투과(penetration) 하기 어려워 이차원 세포 배양 시 사용되는 농도보다 5 배에서 많게는 10 배 가까이 많은 농도의 약물을 사용하여야 하는 문제점이 존재한다. 이는 오가노이드에서의 약물 반응성 결과가 실제 임상에 적용되는데 있어 한계로 작용된다. 또한, 실험자가 유전자 변형을 위해 small interfering RNA(siRNA)나 CRISPR/Cas9과 같은 유전자 조작 기술을 사용할 때에도 마찬가지로 매트리젤을 투과하기 어려워 반드시 이를 제거한 후 실험을 해야 하는 번거로움이 있다. 이 외에도 분자세포생물학적 분석을 위한 면역염색분석(Immunofluorescence assay) 등과 같은 실험의 수행 시에도 또한 매트리젤이 존재할 경우 제한되는 부분들이 많다. 이렇듯 사람이나 쥐 같은 동물 모델의 장기를 보다 가깝게 모사하기 위해서는 매트리젤 없이 줄기세포능을 지닌 오가노이드가 자기 구조화를 이루어 유래한 장기의 특성을 보다 더 잘 재현할 수 있는 새로운 배양법이 필수적으로 요구된다.
본 발명은 매트리젤과 같은 ECM 모사 지지체 기반의 오가노이드 배양의 단점을 획기적으로 개선한 내용을 담고 있다. 본 발명에서 개발된 미세유체 칩 기반의 matrigel free organoid 배양법은 별도의 ECM 지지체인 생체 기질 물질 없이도 유래된 기관의 줄기세포능을 가진 오가노이드의 배양이 가능한 배양법이다. 따라서, 이러한 삼차원 오가노이드를 이용한 응용 연구는 실제 환자에게 맞춤형 의료를 제공하는 발판이 될 것으로 기대된다.
본 발명의 일 목적은 생체 기질 물질 없이 배양이 가능한 미세유체 칩을 활용하여 3차원 오가노이드를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 미세유체 칩을 이용하여 제조된 오가노이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 오가노이드를 이용하여 후보 약물의 효과를 검증하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 오가노이드를 이용하여 유전자 조작된 오가노이드를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
본 발명 내 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 미세유체 칩을 이용하여 오가노이드(organoid)를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 "오가노이드(Organoid)"는 성체줄기세포(adult stem cell, ASC), 배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC), 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC) 등으로부터 자가 재생 및 자가 조직화를 통해 형성된 3 차원 세포집합체를 의미하는 것으로, 서스펜션 세포 배양물로부터 형성된 오가노이드 또는 세포 클러스터를 포함할 수 있다. 상기 오가노이드는 소형 유사 장기, 장기 유사체, 유사 장기로도 명명될 수 있다. 상기 오가노이드는 구체적으로 기관 또는 조직을 구성하는 여러 종류의 세포들 중 하나 이상의 세포 종류를 포함하며, 조직 또는 기관의 형태와 기능을 재현할 수 있어야 한다. 또한, 세포를 3 차원 배양법으로 다시 응집 재조합하여 생체 환경과 유사하게 만듦으로써, 2D 배양법으로 배양된 2D 세포주의 한계를 극복하여 생체의 생리활성기능을 유사하게 재현할 수 있어서, 질병 모델링, 약물 스크리닝 등에 적용이 가능하다.
본 명세서에 사용된 오가노이드는 유전자 변이 마우스의 췌장과 환자 유래 췌장 세포(예컨대, 췌장 성체줄기세포)를 3 차원 배양법으로 배양하여 얻어진 3 차원 세포 집합체를 의미할 수 있다. 또한 상기 오가노이드는 단일 성체 줄기 세포 또는 배아 줄기 세포로부터 유래된 시료로 이용하여 배양된 세포 집합체일 수 있으며, 단일 세포 유형 또는 다세포 혼합물(예컨대, 일반 조직 유래)로부터 단순히 응집된 세포 응집체로서의 스페로이드와는 차별점이 있다고 할 것이다.
본 발명의 제조 방법은, 우선 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료를 생체 기질 물질과 혼합하여 프리-오가노이드(pre-organoid)로 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "개체"는 인간을 포함하는 포유 동물로, 예를 들면, 인간, 래트, 마우스, 모르모트, 햄스터, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 양 및 염소로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 인간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 개체는 목적하는 질환, 바람직하게는 암이 발병하였거나 발병 가능성이 있을 수 있다.
본 발명에서 상기 생물학적 시료는 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포를 의미하는 것으로, 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 조직(tissue), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 및 뇌척수액(cerebrospinal fluid) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 바람직하게는 조직일 수 있으며, 보다 바람직하게는 병변 조직 또는 정상 조직일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 프리-오가노이드로 배양하는 단계는, (a) 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료를 해리시키는 단계; (b) 해리된 시료로부터 세포 펠렛을 수집하는 단계; 및 (c) 수집된 세포 펠렛을 생체 기질 물질과 함께 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 생물학적 시료를 해리시키는 단계는, 상기 생물학적 시료에 해리 용액을 처리하여 수행될 수 있으며, 여기서 상기 해리 용액은 HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) (예컨대, 1 ml 내지 10 ml, 1 ml 내지 5 ml, 3 ml 내지 10 ml, 또는 3 ml 내지 5 ml), 콜라게나아제 (예컨대, 콜라게나아제 P) (예컨대, 0.1 mg/ml 내지 5 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 3 mg/ml, 0.5 mg/ml 내지 5 mg/ml, 0.5 mg/ml 내지 5mg/ml, 0.5 mg/ml 내지 2 mg/ml, 또는 0.8 mg/ml 내지 1.5 mg/ml) 및 DNase (예컨대, DNase 1) (예컨대, 0.01 mg/ml 내지 1 mg/ml, 0.01 mg/ml 내지 0.5 mg/ml, 0.01 mg/ml 내지 0.2 mg/ml, 0.05 mg/ml 내지 1 mg/ml, 0.05 mg/ml 내지 0.5 mg/ml, 0.05 mg/ml 내지 0.2 mg/ml, 또는 0.08 mg/ml 내지 0.15 mg/ml) 등을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 해리 용액은 수득한 시료, 바람직하게는 조직(Vpan = 약 1.08 mg/mm3)에 대하여 0.5 ml 내지 5 ml, 0.5 ml 내지 4 ml, 0.5 ml 내지 3 ml, 1 ml 내지 5 ml, 1 ml 내지 4 ml, 또는 1 ml 내지 3 ml의 양으로 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 해당 조직의 양에 따라 적절히 조절하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 시료의 해리를 보다 용이하게 하기 위하여, 물리적 해리 (예컨대, 가위, 나이프 등으로 잘게 절단하는 단계 등)를 추가로 수행할 수 있고, 상기한 물리적 해리는 해리 용액의 처리와 동시에, 또는 순서와 관계없이 이시에 수행할 수 있다.
본 발명에서는 상기와 같이 해리된 시료로부터 세포 펠렛을 수집하는 단계를 수행할 수 있다. 여기서 상기 세포 펠렛을 수집하는 단계는, 해리된 시료로부터 세포를 분리하는 단계 및 상기 분리된 세포를 원심 분리하여 세포 펠렛을 수집하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 해리된 시료로부터 세포를 분리하는 단계는 해리된 시료를 여과기에 여과시켜 통과하지 못한 세포를 분리하여 취하거나, 현미경 관찰 등 통상의 세포 확인 수단에 의하여 수행될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 분리되는 세포는 자가 재생 및 자가 조직화 등을 통하여 3차원 오가노이드를 형성할 수 있는 모든 줄기세포들 중에서 선택될 수 있으며, 예컨대, 성체줄기세포(adult stem cell; ASC), 배아줄기세포(embryonic stem cell; ESC), 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC), 전발생세포 (progenitor cells) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상일 수 있다.
본 발명에서 상기 성체줄기세포(adult stem cell)는 제대, 제대혈(탯줄혈액), 또는 성인의 골수, 혈액, 신경, 장기, 상피, 근육 등에서 추출해낸 줄기세포로, 구체적 장기의 세포로 분화되기 직전의 원시세포를 의미한다. 상기 성체줄기세포는 조혈모세포(hematopoietic stem cell), 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell), 신경줄기세포(neural stem cell) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상일 수 있다. 상기 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell; MSC)는 중간엽기질세포(mesenchymal stromal cell; MSC)라고도 불리며, 골모세포(osteoblasts), 연골모세포(chondrocytes), 근육세포(myocytes), 지방세포(adipocytes), 상피세포, 신경세포 등과 같은 다양한 형태의 세포로 분화할 수 있는 다분화능을 가진 기질세포 (multipotent stromal cell)를 의미한다. 중간엽줄기세포는 상피 조직, 태반 (placenta), 제대(umbilical cord), 제대혈(umbilical cord blood), 지방 조직(adipose tissue), 성체 근육(adult muscle), 각막 기질(corneal stroma), 젖니의 치아 속질(dental pulp) 등과 같은 비골수 조직(non-marrow tissues)으로부터 유래하는 다능성 세포들 중에서 선택된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 배아줄기세포(embryonic stem cells)는 수정란에서 유래하는 줄기세포로서, 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 특성을 갖는 줄기세포이다.
본 발명에서 상기 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells; iPS cells)는 역분화 줄기세포라고도 불리며, 분화가 끝난 체세포에 세포 분화 관련 유전자를 주입하여 분화 이전의 세포 단계로 되돌림으로써, 배아줄기세포처럼 만능성을 유도해 낸 세포를 의미한다.
본 발명에서 상기 전발생세포(progenitor cells)는 줄기세포와 유사하게 특정 유형의 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖지만, 줄기세포보다 특이적이고 표적화 되어 있으며, 줄기세포와 달리 분열 횟수가 유한하다. 상기 전발생 세포는 중간엽 유래의 전발생세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에서 전발생세포는 줄기세포 범주에 포함되며, 특별한 언급이 없는 한 '줄기세포'는 전발생세포도 포함하는 개념으로 해석된다.
본 발명에서 상기 여과기는 세포를 통과시키지 않는 크기로, 예컨대, 50 ㎛ 내지 200 ㎛, 50 ㎛ 내지 170 ㎛, 50 ㎛ 내지 150 ㎛, 50 ㎛ 내지 120 ㎛, 80 ㎛ 내지 200 ㎛, 80 ㎛ 내지 170 ㎛, 80 ㎛ 내지 150 ㎛, 80 ㎛ 내지 120 ㎛, 또는 90 ㎛ 내지 110 ㎛)의 공극(pore)을 갖는 통상의 세포 여과기일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서는 상기와 같이 분리된 세포를 원심 분리하여 세포 펠렛을 수집하는 단계를 수행할 수 있다. 여기서 상기 원심 분리의 조건은 특별히 제한하지 않으나, 예컨대, 1000 rpm 내지 2000 rpm, 1000 rpm 내지 1800 rpm, 1000 rpm 내지 1600 rpm, 1200 rpm 내지 2000 rpm, 1200 rpm 내지 1800 rpm, 1200 rpm 내지 1600 rpm, 1400 rpm 내지 2000 rpm, 1400 rpm 내지 1800 rpm, 또는 1400 rpm 내지 1600 rpm으로 1 내지 20 분, 1 내지 15 분, 1 내지 12 분, 5 내지 20 분, 5 내지 15 분, 5 내지 12 분, 8 내지 20 분, 8 내지 15 분, 또는 8 내지 12 분 동안 수행될 수 있다.
본 발명에서는 상기와 같이 수집된 세포 펠렛을 생체 기질 물질과 함께 배양하는 단계를 수행할 수 있다.
본 발명에서, 상기 생체 기질 물질은 매트리젤(Matrigel), 기저막 추출물(Basement Membrane Extract; BME), 히알루론산(hyaluronic acid) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 상기 매트리젤은 엥겔브레스트 홀름 스웜(Engelbreth-Holm-Swarm;EHS) 마우스 육종 세포에서 분비되는 젤라틴 유사 단백질 혼합물을 의미한다. 상기 세포외 기질은 세포에서 합성되고 세포외에 분비, 축적된 분자들을 포함하는 생체 고분자의 집합체로서, 콜라겐, 엘라스틴 등의 섬유성 단백질, 글리코사미노글리칸 등의 복합 단백질, 피브로넥틴, 라미닌 등의 세포 부착성 단백질 등으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 세포 펠렛의 배양 조건은 특별히 제한하지 않으며, 통상적인 세포 배양 조건 하에서 수행될 수 있으나, 예컨대, 35 내지 37 ℃의 온도 및 8 내지 12 부피% CO2 조건 하에서, 1 내지 10 일, 1 내지 7 일, 3 내지 10 일 또는 3 내지 7 일 동안 수행될 수 있다.
본 발명에서는 상기와 같이 배양된 프리-오가노이드(pre-organoid)로부터 생체 기질 물질을 제거하는 후처리 단계를 추가로 더 수행할 수 있다.
본 발명에서, 상기 프리-오가노이드로부터 생체 기질 물질을 제거하는 후처리 단계는, 배양된 프리-오가노이드에 기계적으로 응력을 가하여 파쇄하는 단계; 리커버리 용액(recovery solution, Corning product number 354253, USA)의 존재 하에서 배양하는 단계; 및 원심 분리하여 프리-오가노이드 펠렛을 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 배양하는 단계는 저온의 조건으로, 바람직하게는 3 내지 7 ℃에서 30 분 내지 72 시간, 1 내지 48 시간, 1 내지 24 시간 또는 1 내지 12 시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 배양하는 단계에 앞서, 세척하는 단계를 추가로 더 포함할 수 있다. 여기서, 상기 세척은 인산완충생리식염수(Phosphate-buffered saline; PBS)를 이용하여 수행될 수 있고, 적어도 1 회, 바람직하게는 1 내지 10 회 반복하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 원심 분리하여 프리-오가노이드 펠렛을 수득하는 단계의 수행 조건은 특별히 제한하지는 않으나, 예를 들면, 2 내지 6 ℃, 바람직하게는 3 내지 5 ℃에서, 1000 내지 1500 rpm, 바람직하게는 1100 내지 1300 rpm으로, 3 내지 10 분, 바람직하게는 4 내지 7 분 동안 수행할 수 있다.
본 발명에서는 상기와 같이 얻어진 프리-오가노이드, 바람직하게는 배양 후 생체 기질 물질이 제거된 프리-오가노이드 펠렛을 미세유체 칩에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "미세유체 칩(microfluidic chip)"은 3D 세포 배양 디바이스의 일종으로 접종(seeding)된 세포의 지지 플레이트로 사용되며 응집, 증식 및 이동을 통하여 궁극적으로 오가노이드의 3 차원 배양을 가능하게 하는 배양 플레이트에 해당한다.
본 발명의 미세유체 칩은 챔버가 구비된 플레이트를 포함하고, 상기 챔버는 사각 기둥의 형상으로 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 챔버는 세포, 바람직하게는 프리-오가노이드를 수용하여 오가노이드로 3 차원 배양할 수 있는 쉘을 적어도 1 개 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 쉘은 상기 프리-오가노이드가 수용되도록 개방된 유입부와, 상기 프리-오가노이드가 담지되어 배양이 이루어지는 폐쇄된 수용부를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 유입부는 단면이 육각 구조를 이룰 수 있다.
본 발명에서 상기 수용부는, 프리-오가노이드 또는 배양된 오가노이드가 수용되는 공간이 형성되며, 상기 유입부로부터 소정의 깊이를 갖도록 기둥 형태로 구성되고, 바닥면은 하부로 돌출된 반구형을 이룰 수 있다.
본 발명에서 상기 챔버 내에 쉘은 20 내지 1000 개가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 쉘은 상기 챔버 내에 복수 개 포함되며, 상기 쉘의 유입부의 어느 일 모서리로부터 이웃하는 쉘의 어느 일 모서리 사이의 간격은 0.01 mm 내지 1.0 mm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 미세유체 칩의 재질은 PDMS (Polydimethylsiloxane), Polycarbonate, PTMSP (poly(1-trimethylsilyl-1-propyne)), PTFE (Polytetrafluoroethylene), 우레탄, PET (Polyethylene terephthalate) 및 아가로스 (Agarose)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 물질에 해당할 수 있으며, 외부와의 차단을 유지할 수 있는 통상의 재질에 해당한다면 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서는 상기한 미세유체 칩을 사용함으로써 생체 기질 물질 없이도 특이적으로 프리-오가노이드를 오가노이드로 3 차원 배양이 가능한 장점이 있다.
본 발명에서는 상기 생체 기질 물질이 제거된 프리-오가노이드를 미세유체 칩에서 배양하는 단계에 앞서, 상기 미세유체 칩을 전처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 미세유체 칩을 전처리하는 단계는, 미세유체 칩에 배지를 추가하여 배양하는 단계; 및 상기 배지를 제거하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 미세유체 칩에 배지를 추가하여 배양하는 단계를 수행하기에 앞서, 상기 미세유체 칩을 알코올로 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다. 여기서, 상기 알코올로 에탄올, 바람직하게는 용매에 60 내지 80 중량%로 희석된 에탄올, 보다 바람직하게는 65 내지 75 중량% 로 희석된 에탄올을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 미세유체 칩에 추가되는 배지는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium, Advanced DMEM, advanced DMEM), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI-1640 및 GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium)으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 미세유체 칩에 배지를 추가한 뒤 수행되는 배양은 35 내지 40 ℃에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서는 상기 미세유체 칩에 배지를 추가하여 배양한 뒤 배지를 제거하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서는 상기와 같이 전처리된 미세유체 칩에 상기 프리-오가노이드 펠렛을 접종하여 배양하는 단계를 수행할 수 있다.
본 발명에서 상기 프리-오가노이드 펠렛을 접종하여 배양하는 단계는 1 차로 배양하여 오가노이드를 수득한 뒤, 수득된 오가노이드를 미세유체 칩에 재접종하여 2 차로 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 2 차로 배양하는 단계는 1 회 이상, 바람직하게는 2 회 이상, 보다 바람직하게는 2 회 내지 10 회 반복하여 계대 배양으로 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 1 차 또는 2 차 배양 조건은 특별히 제한하지 않으며, 통상적인 세포 배양 조건 하에서 수행될 수 있으나, 예컨대, 35 내지 37 ℃ 및 8 내지 12 부피% CO2 조건에서 1 내지 10 일, 1 내지 7 일, 3 내지 10 일 또는 3 내지 7 일 동안 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 2 차 배양하는 단계에 앞서, 상기 1 차 배양하여 수득된 오가노이드를 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 2 차 배양하는 단계에 앞서, 상기와 같이 세척된 오가노이드를 원심 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 여기서, 상기 원심 분리의 수행 조건은 특별히 제한하지는 않으나, 예를 들면, 1000 내지 1500 rpm, 바람직하게는 1150 내지 1300 rpm으로, 3 내지 10 분, 바람직하게는 4 내지 7 분 동안 수행할 수 있다.
본 발명에서 상기 2 차 배양하는 단계에 앞서, 상기와 같이 원심 분리된 오가노이드를 새로운 배양 배지에 재부유(resuspension)하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 새로운 배양 배지는 생체 기질 물질을 포함하는 배지일 수 있으며, 상기 생체 기질 물질은 매트리젤 (Matrigel), 기저막 추출물 (Basement Membrane Extract; BME), 히알루론산 (hyaluronic acid) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 매트리젤은 콜라겐, 엘라스틴 등의 섬유성 단백질, 글리코사미노글리칸 등의 복합 단백질, 피브로넥틴, 라미닌 등의 세포 부착성 단백질 등으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 계대 배양은 미세 유체 칩 상에서 이루어지는 것에 특징이 있다고 할 것이다.
본 발명에서 상기와 같이 미세유체 칩을 활용하여 제조된 오가노이드는 기존 오가노이드와 비교하여 생체 환경 모사 능력이 우수하며, 배양 성장 조건을 최적화함으로써 장기 생존력을 보장하므로 항암제 등의 다양한 후보 약물 반응성 시험 및/또는 약물 스크리닝에 보다 유리하게 적용될 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 방법으로 제조된 오가노이드에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 오가노이드는 생체 기질 물질이 제거된 상태에서 배양된 오가노이드 또는 생체 기질 물질 프리 오가노이드일 수 있으며, 보다 바람직하게는 매트리젤 프리 오가노이드(Matrigel free organoid)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 오가노이드를 이용하여 후보 약물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 "스크리닝"이란, 여러 물질로 이루어진 후보군으로부터 목적으로 하는 어떤 특정한 성질을 갖는 물질을 특정한 조작 또는 평가 방법으로 선별하는 것이다.
본 발명에서 제공하는 스크리닝 방법은 우선, 본 발명에서 제공하는 오가노이드에 후보 약물을 처리하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 방법은 상기 약물을 처리하기 전에 앞서 설명한 오가노이드 제조 방법의 단계들을 추가로 포함할 수 있다.
여기서, 상기 후보 물질은 천연 화합물, 합성 화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사 산물 및 생활성 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 방법으로 제조된 오가노이드에 목적하는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 목적하는 유전자를 조작하는 단계를 포함하는 유전자 조작된 오가노이드의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 유전자 조작은 미세유체 칩 상에서 이루어지는 것일 수 있다. 일반 배지에서 유전자 조작이 이루어지는 통상적인 경우와는 달리 본 발명에서는 미세유체 칩 상에서 오가노이드에 유전자 조작이 가능한 것에 특징이 있다고 할 것이다.
본 발명에서 상기 "유전자 조작(genetic engineering)"이란 숙주 세포에 외래 유전 물질을 도입하는 과정을 말하는 것으로, 유전 물질의 예로는 DNA 또는 RNA 등일 수 있다. 유전자 발현을 유도하기 위하여 상기 유전 물질은 숙주 세포의 핵에 전달하는 과정이 필수적으로 요구되며, 성공적인 유전자 조작을 위하여 외래 유전 물질이 숙주 세포 내에서 안정적으로 유지될 수 있을 것이 요구된다.
본 발명에서 상기 유전자 조작은 목적하는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 목적하는 유전자를 특이적으로 타겟하여 절단하는 유전자 편집(gene editing)이 이루어지고, 편집된 유전자의 전달이 이루어지는 일련의 과정으로 이루어질 수 있다. 상기 유전자 편집은 인공적으로 조작된 핵산분해효소 혹은 유전자 가위를 이용해 유전체로부터 DNA가 삽입, 대체 혹은 결실되는 유전 공학의 일종을 말한다.
본 발명에서 상기 유전자 조작 시 숙주 세포의 유형에 따라 외부의 유전 물질을 진핵 세포(eukaryotic cell)로 주입하는 형질 주입과 원핵 세포에 플라스미드 등으로 핵산을 주입하는 형질전환(transformation) 및 바이러스를 이용하여 원핵 세포에 핵산을 주입하는 형질도입(transduction)이 존재한다. 본 발명은 진핵 세포에 형질을 주입하는 방식으로 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 유전자 조작은 목적하는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 목적하는 유전자를 상기 오가노이드에 형질 주입하는 방식으로 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 형질 주입하는 방법은 바이러스성 벡터 또는 비바이러스성 벡터를 사용하여 수행될 수 있다. 여기서 상기 바이러스성 벡터는 전달 효율이 높고 지속 시간이 긴 이점이 있고, 레트로바이러스 벡터(retroviral vector), 아데노바이러스 벡터 (adenoviral vector), 백시니아바이러스 벡터, 아데노 부속 바이러스 벡터 (adeno-associated viral vector), 암세포 용해성 바이러스 벡터 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 비바이러스 벡터 (nonviral vector)는 플라스미드를 포함할 수 있고, 그 외에도 리포좀, 양이온성 고분자, 미셀 (micelle), 에멀젼, 지질 나노입자 (solid lipid nanoparticles) 등의 다양한 제형이 사용될 수 있으며, 핵산 전달을 위한 양이온성 고분자에는 키토산, 아텔로콜라겐 (atelocollagen), 양이온성 폴리펩타이드 (cationic polypeptide) 등과 같은 천연고분자와 poly (L-lysin), 선형 또는 분지형 PEI (polyethylene imine), 사이클로덱스트린계열 다가양이온 (cyclodextrin-based polycation), 덴드리머 (dendrimer) 등과 같은 합성 고분자 또한 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 벡터의 형질 주입 시 미세주사, 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질 주입 (liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질 주입 (DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질 주입 (polybrene-mediated transfection), 전기침공법 (electroporation), 유전자 총 (gene gun) 또는 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 세포 내로 도입할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다(Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem.,263:14621-14624, 1988).
또한, 본 발명에서 상기 유전자 조작은 목적하는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 목적하는 유전자를 편집할 수 있도록 하는 유전자 가위 기술을 이용할 수 있다. 이때, 표적 서열을 인지하는 물질이 단백질인지 가이드 RNA인지에 따라 표적 유전자 서열에 결합하는 유전자 가위를 단백질의 형태로 이용하는 징크 핑거 뉴클레이즈 (zinc finger nuclease; ZFN), 탈렌 (transcription activator-like effector nuclease; TALEN) 방법과, CRISPR 유전자 가위 단백질은 한 종류의 단백질을 사용하면서 표적 유전자의 서열에 따라 가이드 RNA만을 제작하여 이루어지는 CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat) 방법 등에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 당해 기술 분야에서 일반적으로 수행되는 유전자 편집 방법이라면 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명의 일 예시로, 상기 유전자 편집 기술 중 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 방식, CRISPR 클래스의 유전자 가위 단백질로서 Cas9 또는 Cpf 단백질을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 Cas9 단백질을 이용한 CRISPR/Cas9 방식을 이용할 수 있으며, 이때 뉴클레아제 및 gRNA 유전자의 오가노이드 세포 내로 도입 시, 다양한 도입 방법과 형태를 사용할 수 있으나, 예를 들면, 상기 뉴클레아제 및 gRNA 유전자를 포함하는 벡터를 상기 오가노이드에 형질 주입하며 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 gRNA (guide RNA)는 sgRNA (single-guide RNA)로도 명명하며, 편집하고자 하는 부위의 DNA와 상보적으로 결합하는 RNA를 말한다. 목적 유전자 서열과 상보적으로 결합하는 sgRNA를 디자인하여 형질 주입에 활용될 수 있고, 예를 들면, 목적 유전자로 PLK1, p53 등의 유전자에 상보적으로 결합하는 서열을 가진 sgRNA로, 바람직하게는 PLK1 유전자에 상보적으로 결합하는 서열번호 1로 표시되는 sgRNA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 편집을 요하는 타겟 유전자를 선별하여 그에 상보적으로 결합하는 sgRNA 서열이면 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명에서 상기 뉴클레아제로는 Cas 단백질, DNA 서열 특이적 엔도뉴클레아제, RNA 가이드된 DNA 엔도뉴클레아제(예컨대, Cpf1), 제한 엔도뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 호밍 엔도뉴클레아제, TAL 이펙터 뉴클레아제, 및 아연 핑거 뉴클레아제를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적인 예로는 뉴클레아제로는 타입 I, 타입 II, 타입 III, 타입 IV, 및 타입 V 엔도뉴클레아제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, CRISPR 뉴클레아제로 Cas 뉴클레아제 또는 Cpf1 뉴클레아제일 수 있다. 보다 바람직하게는, Cas9, 예를 들어, 박테리아 (예컨대, S. 피오게네스(S. pyogenes), S. 뉴모니아에(S. pneumoniae), S. 아우레우스(S. aureus), 또는 S. 써모필루스(S. thermophilus))로부터 클로닝 또는 유래된 Cas9일 수 있다.
본 발명에서 상기 방법은 유전자 조작 후 오가노이드의 유전자 조작 여부를 확인하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 유전자 조작 여부, 바람직하게는 형질 주입 여부 확인을 위하여 마커 단백질을 이용할 수 있고, 상기한 마커 단백질은 핵산 서열을 구체적으로 표적화하고, 광학 신호를 발생하여 시각화할 수 있다. 본 발명에서 상기 마커 단백질의 예로는, 형광 리포터 단백질, 보다 구체적으로, 녹색 형광 단백질(GFP), 황색 형광 단백질(YFP), 적색 형광 단백질(RFP), 시안 형광 단백질(CFP) 또는 mCherry 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 유전자 조작 여부의 확인은 웨스턴 블롯(western blot) 또는 간접적인 세포 내 염색 유세포 분석에 의해 확인하는 방식으로 수행될 수 있으며, 당업계에 알려진 여러 가지 대안적인 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기한 바와 같이 sgRNA, Cas9 단백질 또는 상동성 표적 복구(HDR) 주형을 다양한 형태(DNA, RNA, Protein)와 다양한 방법(transfection, electroporation, viral gene delivery, Gesicle 외)으로 목적 세포 또는 조직 내로 도입될 수 있으며, NHEJ Pathway로 인해 발생된 Indel 변이 또는 HDR로 삽입된 유전자 또는 SNP 등을 전기영동 확인 또는 서열 분석을 통해 유전자 조작 여부를 확인할 수 있다.
본 발명에서 제공되는 미세유체 칩을 활용하여 오가노이드를 제조하는 방법을 이용하는 경우 생체 기질 물질 없이도 배양이 가능하도록 함으로써 실제 생체 내 세포 미세 환경에 가까운 환경을 제공하여 보다 정확한 약물 처리 전의 약물 효능 예측, 약물 처리 후의 약물 효용성 검증, 유전자형에 따른 핵형 분석, 분열 속도 및 양상 관찰 등의 연구에 유용하게 적용될 수 있다.
도 1a 내지 도 1c는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체 칩(Microfluidic chip)을 활용하여 마우스 또는 환자 유래 췌장 오가노이드를 1 차 배양 또는 계대 배양한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 A1 칩(A1 chip)을 활용하여 마우스 유래 췌장 오가노이드를 배양한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 2D 유방암 세포주(MCF10A 및 MCF7)에서 약물 스크리닝을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 4a 및 도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 매트리젤이 포함된 마우스 또는 환자 유래 췌장 오가노이드에서 약물 스크리닝을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체 칩을 활용하여 마우스 또는 환자 유래 췌장 오가노이드에서 약물 스크리닝을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 6a 및 도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체 칩을 활용하여 약물 처리 전 후 MTT assay를 수행하여 세포 생존 능력을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체 칩을 활용하여 환자 유래 오가노이드의 면역형광염색 분석 결과를 보여주는 형광 이미지를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 환자 유래 오가노이드의 줄기세포능(stemness)을 확인하기 위해 면역형광염색 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 환자 유래 오가노이드를 이용하여 유전체 분석을 한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체 칩 상에서 환자 유래 오가노이드를 이용하여 형질 주입시킨 후 형광 분석 및 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
<본 발명을 지원한 과제에 대한 설명>
본 발명은 민간기관의 민간지원사업(과제번호: 0413-20190020, 연구과제명: 규격화된 플레이트에서 삼차원 췌장 오거노이드 배양 프로토콜 개발, 주관기관: 주식회사 넥스트앤바이오, 연구기간: 2019-07-01~2020-06-30)의 지원을 받아 개발되었다.
<본 발명의 구체적인 내용>
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 미세유체 칩을 활용한 마우스 및 환자 유래 췌장 오가노이드(organoid)의 계대 배양
1.1 생물학적 시료의 준비
본 발명자들은 미세유체 칩을 활용한 오가노이드의 배양을 위하여 목적하는 개체인 마우스 및 환자로부터 생물학적 시료를 수득하였다.
먼저, 종양 유전자인 KRAS 유전자에 점 돌연변이가 발생한 KRASG12D 마우스 유래 오가노이드를 배양하기 위하여 해당 마우스를 안락사시킨 후 해부하여 췌장 조직을 얻었으며, 해리용액 (Dissociation solution)으로서 HBSS (Hank's Balanced Salt Solution; GIBCO®) 3 내지 5 ml, 콜라게나아제P (Roche) 1 mg/ml 및 DNase 1 (Sigma Aldrich) 0.1 mg/ml를 혼합한 혼합물을 37 ℃ 워터배스에서 데워서 준비하였다. 상기 얻어진 마우스 췌장 조직 전체 (Vpan = 1.08 mg/mm3)를 100 mm 페트리접시에 옮긴 후, 상기 준비된 해리용액 100 ul를 넣고 가위나 나이프를 이용하여 5 내지 10 회 잘게 절단하였다. 잘게 절단된 췌장 조직(Vpan = 1.08 mg/mm3)을 50 ml 코니칼 튜브(conical tube)로 옮기고, 여기에 해리용액 3 내지 5 ml를 넣고, 상기 튜브를 230 rpm 및 37 ℃의 진탕 배양기에 넣어 인큐베이션하고, 10 내지 15 분 후에 꺼내어, 차가운 FBS 10 내지 15 ml를 넣어주었다. 100 um 기공의 세포여과기 (cell strainer)에 상기 얻어진 해리된 췌장조직을 통과시키고, HBSS를 이용해 2 내지 3 번 세척하였다. 세포여과기를 통과하지 못한 췌장 조직을 현미경으로 관찰하여 췌관 세포를 골라 선택하였다. 선택된 췌관 세포를 1500 rpm으로 10 분 동안 원심 분리하여 펠렛을 수집한 후, HBSS로 세척하는 과정을 2 회 반복하였다.
상기와 같은 방법으로 환자 유래 췌장 조직으로부터 수득한 시료로 동일 과정을 반복함으로써 1 차 배양을 위한 단계를 수행하였다.
1.2 각 시료로부터 오가노이드 1 차 배양(pre-organoid 배양)
얻어진 세포 펠렛과 매트리젤(Matrigel, Corning) 200 ul을 펠렛과 매트리젤의 부피비가 1 : 5가 되도록 혼합한 후, 각각 12 웰 또는 24 웰 플레이트에 각 웰당 12 웰 플레이트 기준 100 내지 150 ul의 양으로 세포 접종하였다. 세포 접종 후 약 한 시간 뒤, 매트리젤이 굳으면 배지를 12 웰 플레이트 기준 1 ml, 24 웰 플레이트 기준 500 ul의 양으로 넣고 37 ℃ 및 10 % CO2의 인큐베이터에서 48 내지 72 시간 이상 동안 인큐베이팅하였다. 이 때 DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12; Thermo Fisher Scientific)에 1 % (vol/vol) 페니실린/스트렙토마이신, 10 mM HEPES, 1 % GlutaMAX, 1:50 B27 보충제(Gibco), 1 mM N-아세틸시스테인, 5 % (vol/vol) Rspo1-배양액(Hans Clevers lab), 10 mM 니코틴아마이드, 10 nM 재조합형 인간 [Leu15]-가스트린 I(Sigma Aldrich), 50 ng/ml 재조합형 마우스 EGF(Peptron), 100 ng/ml 인간 재조합형 FGF10(Peptron), 및 25 ng/ml 재조합형 인간 노긴(Peptron) 또는 5 % (vol/vol) 노긴이 포함된 배양액(Hans Clevers lab)이 혼합된 배양 배지 조성을 이용하였다. KRASG12D 마우스 조직으로부터 1 차 배양한 결과를 도립 현미경(inverted microscope; Zeiss)으로 관찰하여 도 1a에 나타내었다.
1.3 미세유체 칩(microfluidic chip)에서의 오가노이드 2 차 배양
본 발명자들은 본 발명인 미세유체 칩 (microfluidic chip) (MicroFIT사, StemFIT 3D®)에서의 2 차 배양 시 오가노이드 배양 효과를 확인하고자 하였다. 먼저, 칩을 준비하기 위하여 70 % 에탄올로 웰을 버블(bubble)이 생기지 않게 세척한 후 에탄올을 제거해주고 Advanced DMEM (오가노이드 배양 배지의 기본 미디어)로 미디어를 교체해준 후 37 ℃ 인큐베이터에서 오가노이드가 준비될 동안 인큐베이션시켰다. 이에 접종할 오가노이드는 기계적 파쇄 (mechanically dissociation) 한 후 on ice 상태로 차가운 1x PBS로 세척 및 12 웰에서 배양한 오가노이드 기준 500 ul 정도의 리커버리 솔루션 (recovery solution)을 넣은 후 4 ℃에서 1 시간 이상 인큐베이션하여 매트리젤을 제거해 주었으며 제거 후 4 ℃에서 1200 rpm으로 5 분 동안 원심 분리하여 셀 펠렛팅하여 준비하였다. 기존의 Advanced DMEM을 제거해 주고 펠렛팅된 오가노이드를 오가노이드 미디어로 칩 1 개 기준 1 ml로 재부유하여 웰에 고르게 들어갈 수 있도록 접종해 주었다.
상기의 방법으로 수집된 오가노이드를 오가노이드 배양 배지에 재부유(resuspension)한 후 준비되어 있는 미세유체 칩에 접종(seeding)하여 하루 동안 오버나이트 한 후 배양된 오가노이드를 도립 현미경(inverted microscope; Zeiss)으로 관찰하여 도 1b에 나타내었다. 도 1b에 나타난 순서대로 마우스 및 환자 유래 췌장 오가노이드로부터 미세유세 칩으로 옮긴 후 계대를 하여 성장 정도를 비교한 결과를 나타내었다.
유전자 변형 마우스 췌장 오가노이드뿐만 아니라 환자 유래 오가노이드 또한 미세유체 칩 내에서 구 형태(morphology)를 잘 형성한 채 균일한 크기로 자라고 있음을 알 수 있다.
1.4 미세유체 칩(microfluidic chip)에서의 오가노이드 계대배양
매트리젤에 배양하고 있는 환자 유래 췌장 오거노이드를 기계적 응력으로 파쇄(mechanically dissociation)한 후 4 ℃의 차가운 1x PBS 또는 리커버리 용액(Recovery solution)으로 세척하고, 1200 rpm으로 5 분 동안 원심 분리하여 매트리젤을 제거하였다. 수집된 오거노이드를 오거노이드 배양 배지에 재부유한 후 준비되어 있는 미세유체 칩에 접종하였으며, 하루 지난 후의 상태가 도 1c의 계대 1(passage 1) - 1 일차(day 1)에 해당한다. 또한, 계대 1(Passage 1) = 2 일차(day 2)의 미세유체 칩 내 오거노이드를 파이펫팅으로 수집하여 1x PBS로 세척하고, 1200 rpm으로 5 분 동안 원심 분리하고, 펠렛팅된 오가노이드를 2 % 매트리젤이 포함된 오가노이드 배양 배지에 재부유한 후 다시 미세유체 칩에 접종하였다. 접종 후 하루가 지난 후의 상태가 도 1c의 계대 2(passage 2) = 1 일차(day 1)에 해당하며 위와 같은 방식으로 한번 더 계대 배양한 후 하루 지난 상태가 도 1c의 계대 3(passage 3) = 1 일차(day 1)에 해당한다. 이처럼 미세유체 칩 상에서의 계대 배양이 수회 반복됨에도 오가노이드가 잘 형성되는 것을 확인할 수 있다(도 1c 참조).
비교예 1: A1 칩(A1 chip)을 활용한 마우스 췌장 오가노이드(organoid)의 계대 배양
1.1 오가노이드 2 차 배양
실시예 1.3의 미세유체 칩(microfluidic chip)의 2 차 배양 시 오가노이드 배양 효과가 뛰어남을 비교 검증하기 위하여, 다른 칩으로, 종래의 세포 집합체 배양에 사용되던 A1 미세유체 칩(A1 chip)을 사용하여 실험을 수행하였다. 본 실험에 사용된 상기 A1 유체 칩은 12 개의 웰로 구성되며, 각각은 입구 원의 둘레 2 mm 형태로 이루어진 웰에, 하부면이 편평한 일자의 구조로 이루어져 있는 형태를 가진다. 본 발명의 입구 육각형 둘레 2.1 mm 구조의 형태, 폭이 0.5 mm 웰에, 하부면이 반구형 구조로 이루어져 있는 것과는 차별점이 존재한다. 마우스 유래 췌장 오가노이드를 실시예 1.3의 방법으로 A1 칩에서 2 차 배양하였다(도 2 참조).
그 결과, 본 발명의 일 실시예에 의한 미세유체 칩에서 배양한 경우와는 다르게, A1 칩에서는 오가노이드의 크기가 균등하게 자라지 않았으며 구 형태(morphology) 및 생존력(viability) 모두에서 좋지 않은 결과가 나타난 것을 확인할 수 있다(도 1b 및 도 2 참조). A1 칩에서는 성장이 크게 저하되어 더 이상 지속 가능한 배양이 불가능한 것을 확인하였으며, 약물 스크리닝에 유용하게 쓰이기 위하여 균일한 크기로 제조되어야 함에도 불구하고 미세유체 칩에서 배양한 결과와 비교하였을 때, 효용성이 크게 저하된 것을 확인하였다.
실시예 2. 마우스 또는 환자 유래 췌장 오가노이드의 약물 반응성 시험
실시예 1을 참조하여, 미세유체칩을 이용하여 마우스 및 환자 유래 췌장 오가노이드를 배양한 후, 하기의 단계를 수행하여 약물 반응성을 시험하였다. 구체적으로 마우스 또는 환자로부터 분리한 췌장 조직을 해리시키고, 해리된 췌장 조직으로부터 췌관 세포를 포함하는 세포 펠렛을 수집한 후, 수집된 세포 펠렛을 생체 기질 물질과 함께 37 ℃, 5 % 탄산 가스 세포 배양기에서 키웠다. 오가노이드로 배양 구축한 후 24 내지 48 시간 경과한 시점부터 하기의 약물 스크리닝을 위한 약물 처리 시점 직전까지, 상기 오가노이드 추가로 배양하였다. 이 후 마우스 또는 환자 유래 오가노이드로부터 약물을 오가노이드 배양 배지에 희석한 후 오가노이드에 처리하였다.
2D 유방암 세포주인 MCF10A와 MCF7, KrasG12D 돌연변이 마우스와 야생형(wild type) 마우스 또는 환자 유래 조직으로부터 제조된 췌장 오가노이드에 항암 약물을 0 uM, 100 uM, 200 uM, 500 uM를 처리한 후 3 내지 5 일째 되는 날 도립 현미경(inverted microscope; Zeiss)으로 관찰한 사진을 도 3 내지 도 5에 나타내었다.
2D 세포주로서 유방암 세포주인 MCF10A와 MCF7에 항암 약물을 미처리 또는 처리한 군을 비교한 결과를 도 3에 나타내었다. 또한, 매트리젤이 있는 상태에서의 KrasG12D 돌연변이 마우스와 야생형(wild type) 마우스 유래 오가노이드의 약물 스크리닝 결과를 도 4a 및 도 4b에 나타내었다. 매트리젤 없이 미세유체 칩을 활용하여 2 차 배양한 KrasG12D 돌연변이 마우스와 야생형(wild type) 마우스와 환자 유래 오가노이드에 상기 약물을 처리한 결과를 도 5에 나타내었다.
상기 얻어진 결과를 종합하면, 도 5에 나타난 바와 같이 시험된 약물에 대한 반응성이 본 발명의 미세유체 칩(microfluidic chip)을 사용했는지 여부에 따라 상이하게 나타나는 것을 관찰하였다. 특히 2D 세포주와 비교하였을 때 3D 오가노이드의 약물 반응성이 더 좋게 확인되었으며, 더 나아가 매트리젤이 있는 상태에 비하여 매트리젤이 없는 상태인 경우 비교적 저농도에도 동일한 약물 스크리닝 효과를 얻을 수 있음을 확인하였다. 즉, 다시 말하여 마우스 및 환자 유래 췌장 오가노이드에서 매트리젤이 없는 미세유체 칩을 활용하였을 때 매트리젤이 있는 상태에서의 오가노이드에 약물을 100 uM 처리한 것에 비해 적은 농도인 50 uM로도 같은 효과를 볼 수 있음을 알 수 있다. 이를 통하여 후보 약물의 효과 확인 및/또는 약물 스크리닝에 있어 본 발명의 미세유체 칩이 유용하게 사용될 수 있다.
실시예 3. 미세유체 칩을 활용하여 제조된 오가노이드의 다양한 용도
3.1 미세유체 칩을 활용하여 제조되는 오가노이드에서 세포 생존력 분석(cell viability assay; MTT assay)
MTT assay는 세포의 대사 활동을 측정하는 방법으로 살아있는 세포에서 보라색을 띈다. 실시예 1과 동일한 방법으로, 약물을 처리하지 않은 상태의 환자 유래 오가노이드를 제조한 뒤 MTT 시약으로 생존 능력을 측정하여 도 6a에 나타내었다. 또한, 환자 유래 오가노이드에 각 yap 억제제 (0 uM, 5 uM)와 AP-1 억제제 (0 uM, 200 uM) 약물을 처리한 후 4 일째 되는 날 MTT 시약으로 생존 능력을 측정한 결과를 도 6b에 나타내었다. 상기 도면은 미세유체 칩에 오가노이드를 접종한 후 MTT assay 기법을 적용한 후에 촬영한 사진이다.
그 결과, 본 발명의 미세유체 칩에서 생존력을 갖는 오가노이드의 배양이 가능하다는 것을 확인할 수 있었고(도 6a 참조), 약물을 처리한 오가노이드의 경우 세포가 죽어 오가노이드의 모양을 유지하지 못하며, 보라색으로 염색이 되지 않음을 확인할 수 있다(도 6b 참조). 이처럼, 보통의 일반 오가노이드 배양 방법으로는 시약이 오가노이드 내로 제대로 침투되지 아니하여 염색이 잘 되지 않는 문제점이 존재하였으나, 본 발명에서와 같이 매트리젤이 제거된 2 차 배양이 이루어진 오가노이드는 해당 시약뿐만 아니라 약물의 침투도 용이함을 시사한다. 이러한 기법을 사용하여 미세유체 칩을 약물 테스트 과정에 적용하여 약물 처리 반응에 대한 추적, 균등한 사이즈 상태에서의 약물 처리, 더 나아가 약물 처리 후 정량화를 가능하게 한다.
3.2 면역형광검사(Immunofluorescence assay; IFA)를 통한 줄기세포능(stemness) 확인
상기 3.1에서와 같이 미세유체 칩에 오가노이드를 접종한 다음 날 4 % 파라포름알데하이드(paraformaldehyde; PFA)를 넣어 세포를 고정하고, PFA를 제거한 이후 1x PBS로 3 회 세척하였다. 1 % PBS-T로 RT 조건에서 1 시간 동안 침투 (permeabilize) 시켜준 후 0.2 % PBS-T로 추가로 3 회 세척하였다. 3 % BSA로 RT 조건에서 1 시간 동안 블록킹 해준 이후 1 차 항체(primary antibody)인 알파튜블린, CD44, CD24를 RT 조건에서 하루 동안 붙여주었다. 0.2 % PBS-T로 3 회 세척해준 이후 형광이 달린 2 차 항체(secondary antibody)를 RT 조건에서 하루 동안 붙여주었다. 0.2 % PBS-T로 3 회 세척하고 DAPI 염색 이후 미세유체 칩에서 8 웰 챔버로 오가노이드를 옮겨준 이후 PBS-T를 제거하였다. Vectashield로 마운팅 해준 이후 공초점 현미경으로 촬영하여 형광 이미지를 관찰하였다(도 7 및 도 8 참조). 기존의 오가노이드를 면역형광염색하여 현미경으로 촬영하는 경우 별도의 절차로 매트리젤을 제거하여야 하였으며, 1 차 및/또는 2 차 항체의 처리 기간이 길고, 세척 과정 역시 중력으로 가라앉혀야 하였기 때문에 시간이 오래 걸린다는 단점과 항체의 양을 많이 처리해야 하는 단점 등이 존재하였다. 이러한 불편함을 본 발명의 미세유체 칩을 사용함으로써 염색하였을 경우 시간적, 경제적 효용성이 향상되며, 보다 편리하다는 장점이 있다.
3.3 오가노이드의 유전체 분석
또한, 앞서 제조된 환자 유래 오가노이드를 이용하여 유전체 분석을 수행하였다. 도 9를 참조하면 본 발명의 미세유체 칩을 활용하여 생체 기질 물질 없이 배양한 오가노이드를 이용하여 유전체 분석을 한 결과이다(도 9 참조).
도 9를 참조하면 오가노이드를 사용하여 유전체 분석을 하는 경우, 조직 (fine-needle biopsy; FNB)을 이용한 경우와 비교하였을 때 세포충실성 (cellularity)이 현저히 뛰어난 것을 알 수 있다.
3.4 미세유체 칩을 활용한 오가노이드 형질 주입
상기 실시예 1과 같이 미세유체칩에 오가노이드를 접종하고 하루 지난 후에 상기 오가노이드에 형질 주입(transfection)함으로써 형질 감염시키고자 하였다. 먼저, 인간 PLK1 유전자 부위의 CRISPR/Cas9 효소가 인식할 수 있는 sgRNA을 선정하기 위해 각 엑손 영역을 CRISPR RGEN tools에 삽입하여 가이드 RNA로서의 hPLK1 exon2 gRNA (5'-CGTAGGTAGTATCGGGCCTC-3'시퀀스(서열번호 1))를 디자인하였다. 상기 gRNA는 유전자를 합성한 후 부위-지정 돌연변이 (Site directed mutagenesis) 방법으로 Cas9 효소가 포함된 벡터인 pCMV에 클로닝하여 pCMV-hPLK1-Cas9-RFP 벡터를 제작하였다. 당업계에 공개된 프로토콜에 따라, 제조한 CRISPR/Cas9 재조합 벡터를 미세유체 칩 내 오가노이드 조직에 도입하여 형질 주입시켰다. 이때, Etube A에는 OptiMEM 200 ul와 DNA 5 ug을 포함하고, Etube B에는 OptiMEM 200 ul와 PEI 20 ul을 포함하도록 준비한 후 Etube A와 Etube B를 섞어 5 내지 10 분 인큐베이션시켰다. 그 후 기존에 있던 미디어를 제거하여 새로운 오가노이드 배지 800 내지 1000 ul와 인큐베이션 시켜준 혼합액을 섞어 미세유체 칩에 부어주는 방식으로 CRISPR/Cas9 형질 주입시켰다. CRISPR/Cas9으로 형질 주입시킨 후 이틀째 되는 날 형질 주입 여부의 확인을 위하여 DNA를 붉은색 형광 단백질 (red fluorescent protein; RFP) 검출을 수행하였다.
그 결과, 환자 유래 췌장 오가노이드에 RFP로 인한 붉은색 형광 단백질이 검출됨에 따라 형질 주입이 잘 이루어진 것을 확인하였다(도 10 참조). 또한, 해당 오거노이드들을 모아 10 % SDS-PAGE 겔에 로딩하여 단백질을 분리하였으며, 웨스턴 블롯 분석을 진행한 결과 PDO_SgPLK1 군에서 CRISPR/Cas9으로 PLK1이 줄어든 것을 확인할 수 있었다(도 10 참조).
이처럼, 본 발명에서와 같이 매트리젤이 제거된 미세유체 칩 상에서의 오가노이드 형질 주입 또한 용이함을 시사한다. 이러한 기법을 사용하여 미세유체 칩을 활용한 형질 주입 기법을 적용하여 다양한 용도로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation Next&Bio Inc. <120> Method for preparing organoids using microfluidic chip <130> PDPB201842 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA <400> 1 cgtaggtagt atcgggcctc 20

Claims (32)

  1. 미세유체 칩을 전처리하는 단계; 미세유체 칩에서 생체 기질 물질이 제거된 프리-오가노이드(pre-organoid)를 1차로 배양하는 단계; 1000 내지 1500rpm으로 3 내지 10분 동안 원심 분리하는 단계; 원심 분리된 오가노이드를 새로운 배양 배지에 재부유(resuspension)하는 단계 및 1차로 배양하여 수득한 오가노이드를 미세유체 칩에 재접종하여 2차로 배양하는 단계;를 포함하는, 췌장암 오가노이드의 제조 방법으로,
    상기 미세유체 칩을 전처리하는 단계는, 미세유체 칩에 배지를 추가하여 배양하는 단계; 및 상기 배지를 제거하는 단계를 포함하고,
    상기 미세유체 칩은 챔버가 구비된 플레이트를 포함하고,
    상기 챔버는 프리-오가노이드를 수용 및 배양할 수 있는 쉘을 적어도 1개 포함하고,
    상기 쉘은 상기 프리-오가노이드가 수용되도록 개방된 유입부와, 상기 프리-오가노이드가 담지되어 배양이 이루어지는 폐쇄된 수용부를 포함하고,
    상기 쉘은 상기 챔버 내에 복수 개 포함되며, 상기 쉘의 유입부의 어느 일 모서리로부터 이웃하는 쉘의 어느 일 모서리 사이의 간격은 0.01mm 내지 1.0mm이고,
    상기 유입부는 단면이 육각 구조이고,
    상기 수용부는 프리-오가노이드가 수용되는 공간이 형성되며, 상기 유입부로부터 소정의 깊이를 갖도록 기둥 형태로 구성되고, 바닥면은 하부로 돌출된 반구형을 이루는 것인, 방법.
  2. 삭제
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  5. 삭제
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 미세유체 칩의 재질은 PDMS (Polydimethylsiloxane), Polycarbonate, PTMSP (poly(1-trimethylsilyl-1-propyne)), PTFE (Polytetrafluoroethylene), 우레탄, PET (Polyethylene terephthalate) 및 아가로스 (Agarose)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 췌장암 오가노이드의 제조 방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 프리-오가노이드는 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료를 생체 기질 물질과 혼합하여 배양하는 단계에 의해 얻어진 것인, 췌장암 오가노이드의 제조 방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 프리-오가노이드는,
    (a) 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료를 해리시키는 단계;
    (b) 해리된 시료로부터 세포 펠렛을 수집하는 단계; 및
    (c) 수집된 세포 펠렛을 생체 기질 물질과 함께 배양하는 단계로부터 얻어지는 것인, 췌장암 오가노이드의 제조 방법.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 생체 기질 물질은 콜라젠, 매트리젤, 젤라틴 및 히알루론산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 췌장암 오가노이드의 제조 방법.
  10. 제 7항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 조직(tissue), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 및 뇌척수액(cerebrospinal fluid)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 췌장암 오가노이드의 제조 방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제 1항에 있어서,
    상기 미세유체 칩에서 프리-오가노이드를 배양하는 단계에서의 배양은 35 내지 37℃ 및 8 내지 12 부피% CO2 조건에서 1 내지 10일 동안 수행되는 것인, 췌장암 오가노이드의 제조 방법.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 제 1항에 있어서,
    상기 배지는 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI-1640 및 GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 췌장암 오가노이드의 제조 방법.
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 제 1항에 있어서,
    상기 2차로 배양하는 단계는 1회 이상 반복하여 계대 배양이 가능한, 췌장암 오가노이드의 제조 방법.
  23. 삭제
  24. (a) 제 1항, 제 6항 내지 제 10항, 제 15항, 제 18항 및 제 22항 중 어느 하나의 방법으로 제조된 췌장암 오가노이드에 후보 약물을 처리하는 단계; 및,
    (b) 상기 오가노이드의 세포생존율(viability)을 측정하는 단계;를 포함하는, 후보 약물을 스크리닝하는 방법.
  25. 제 1항, 제 6항 내지 제 10항, 제 15항, 제 18항 및 제 22항 중 어느 하나의 방법으로 제조된 췌장암 오가노이드에 목적하는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 목적하는 유전자를 조작하는 단계를 포함하는, 유전자 조작된 췌장암 오가노이드의 제조 방법.
  26. 제 25항에 있어서,
    상기 방법은 미세유체 칩 상에서 이루어지는 것인, 방법.
  27. 제 25항에 있어서,
    상기 유전자를 조작하는 단계는 목적하는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 목적하는 유전자를 상기 오가노이드에 형질 주입하는 방식으로 수행되는 것인, 방법.
  28. 제 27항에 있어서,
    상기 형질 주입하는 방식은 바이러스성 벡터 또는 비바이러스성 벡터를 이용하여 수행되는 것인, 방법.
  29. 제 28항에 있어서,
    상기 벡터의 형질 주입 시 미세주사, 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질 주입 (liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질 주입 (DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질 주입 (polybrene-mediated transfection), 전기침공법 (electroporation) 및 유전자 총 (gene gun)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법으로 수행되는 것인, 방법.
  30. 제 25항에 있어서,
    상기 유전자 조작은 징크 핑거 뉴클레이즈 (zinc finger nuclease; ZFN), 탈렌 (transcription activator-like effector nuclease; TALEN) 및 크리스퍼 (clustered regularly interspaced short palindromic repeat; CRISPR)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 유전자 편집 방법으로 수행되는 것인, 방법.
  31. 제 30항에 있어서,
    상기 방법은 CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat) 방법으로 수행되는 것인, 방법.
  32. 제 25항에 있어서,
    상기 유전자 조작 여부의 확인은 웨스턴 블롯(western blot) 또는 간접적인 세포 내 염색 유세포 분석에 의해 확인하는 방식으로 수행되는 것인, 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115651909B (zh) * 2022-07-14 2023-09-19 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种骨肉瘤类器官模型、构建方法及应用
CN115354030A (zh) * 2022-07-21 2022-11-18 清华大学深圳国际研究生院 一种类器官高通量培养方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101621211B1 (ko) * 2014-07-15 2016-05-16 고려대학교 산학협력단 항암제 검증용 마이크로 유체칩 및 이의 제조방법
WO2018088856A2 (ko) * 2016-11-10 2018-05-17 재단법인 아산사회복지재단 마이크로유체칩, 삼차원 채널 구조물, 이를 이용한 세포 배양 방법 및 이를 이용한 생리활성 물질의 활성평가 방법
CA3050514A1 (en) * 2017-01-27 2018-08-02 Children's Hospital Medical Center Methods of enhancing engraftment activity of hematopoietic stem cells
GB201721615D0 (en) * 2017-12-21 2018-02-07 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Immune cell organoid co-cultures
KR102249987B1 (ko) * 2018-06-29 2021-05-11 서울대학교 산학협력단 돌연변이 마우스 유래 췌장 오거노이드 및 표준화된 약물 효과 확인 방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chen 등. Short-term organoid culture for drug sensitivity testing of high grade serous carcinoma. Gynecol Onclo. 2020.6. 157(3), 783-792 1부.*
Gopal 등. Exploiting CRISPR Cas9 in three-dimensional stem cell cultures to model disease. frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2020.6.24. vol.8, article692, pp.1-15 1부.*

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