KR102249987B1 - 돌연변이 마우스 유래 췌장 오거노이드 및 표준화된 약물 효과 확인 방법 - Google Patents

돌연변이 마우스 유래 췌장 오거노이드 및 표준화된 약물 효과 확인 방법 Download PDF

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Abstract

유전자 변이 마우스의 췌장 유래의 3차원 췌장 오거노이드, 상기 3차원 췌장 오거노이드의 제조 방법, 상기 3차원 췌장 오거노이드의 약물 효과 검증 및/또는 약물 스크리닝을 위한 용도, 및 범용적으로 사용 가능한 표준화된 약물 효과 확인 방법/약물 스크리닝 방법이 제공된다.

Description

돌연변이 마우스 유래 췌장 오거노이드 및 표준화된 약물 효과 확인 방법{Pancreatic Organoid Derived from Mutant Mouse and Use thereof and Standardized Method for Identifying Drug Efficacy}
유전자 변이 마우스의 췌장 유래의 3차원 췌장 오거노이드, 상기 3차원 췌장 오거노이드의 제조 방법, 상기 3차원 췌장 오거노이드의 약물 효과 검증 및/또는 약물 스크리닝을 위한 용도, 및 범용적으로 사용 가능한 표준화된 약물 효과 확인 방법/약물 스크리닝 방법이 제공된다.
기존의 신약개발 연구를 통해 개발된 대부분의 항암치료제들은 임상에서 부작용이나 낮은 효용성에 의해 실제 암환자들에게 활발하게 활용되지 못하고 있다. 또한 같은 암환자라 하더라도 동일한 항암치료제에 대한 반응성이 상이한 경우가 많아 이에 대한 연구가 절실하다. 인간 게놈 프로젝트의 완성을 통해 사람의 유전자 정보에 대한 염기서열분석 참고 정보가 축적되었고(Lander E. S., Linton L. M., Birren B., Nusbaum C., Zody M. C., Baldwin J., et al. (2001). Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409, 860-921. 10.1038/35057062), 이로 인해 인간에 대한 총유전체(Whole Genome Sequencing; WGS)가 규명되어 점차 접근 가능한 수준에 이르렀기에 향후 암 연구에 더욱 활발히 이용될 것으로 기대된다. 그러나 종전의 이차원적 세포 배양 방법을 통해서는 유래된 암세포 조직에 대한 정보들이 정확하게 in vivo 상황을 반영하지 못하여 새로운 세포 배양 방법에 대한 수요가 확장되고 있다. 이러한 수요를 충족할 수 있는 세포배양 방법이 본 발명의 근간이 되는 삼차원 오거노이드 배양 방법이다. 이 삼차원 오거노이드는 줄기세포로부터 유래하여 삼차원적인 구조를 이루며 자라나는, 특정 장기를 모사하고 스스로 형태를 이루는 세포들을 말한다(Clevers, H. 2016. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165:1586-1597. http://dx.doi.org/10.1016/j .cell .2016 .05 .082). 이러한 삼차원 오거노이드는 유전자 정보를 온전하게 담고 있어 실제 암을 더욱 in vivo에 가깝게 모델링 할 수 있는 시스템이다.
항암 치료 연구에 있어서 가장 중요한 것은 암을 모사하는 in vitro 와 in vivo 동물 모델일 것이다. 구축한 모델을 통해 연구자는 항암 치료에 관련한 이해와 연구를 수행할 수 있다. 암 모델링을 위해 가장 기본적으로 사용되는 방법은 세포배양이다. 쥐나 사람의 조직에서 유래한 암세포주를 단분자층 상태로 지속적으로 배양하여 in vitro 상에서 관찰 및 실험을 수행할 수 있도록 구축하는 방법은 현재까지 가장 활발하게 이용되고 있다. 그러나 이러한 이차원적 배양 방법은 세포들이 실제로 삼차원적으로 존재하는 in vivo 상황을 반영하지 못한다는 단점이 있다(Lee et al., 2008 ; Vunjak-Novakovic and Freed, 1998). 반면 삼차원 오거노이드 배양 방법을 통해 배양된 세포들은 실제 유래된 환자의 암세포 조직과 거의 유사한 유전자 정보를 가지고 있다(Dong Gao et al., 2014. Organoid Cultures Derived from Patients with Advanced Prostate Cancer, Cell, 176-187, https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.08.016). 따라서 이러한 삼차원 오거노이드를 이용한 응용연구는 실제 환자에게 맞춤형 의료를 제공하는 발판이 될 것이다.
본 발명은 상기와 같은 종래의 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 유전자 변이 마우스 유래 췌장의 3차원 오거노이드 및 표준화된 약물 효과 확인 방법에 관한 것이다.
이러한 삼차원 오거노이드를 이용한 응용연구는 세포들이 실제로 삼차원적으로 존재하는 in vivo 상황을 반영하여 실제 환자에게 맞춤형 의료를 제공하는 발판이 될 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
일 예는 유전자 변이 마우스의 췌장 유래의 3차원 췌장 오거노이드를 제공한다.
다른 예는 유전자 변이 마우스의 췌장 세포를 3차원 배양하는 단계를 포함하는, 3차원 췌장 오거노이드 제조 방법을 제공한다.
다른 예는 상기 유전자 변이 마우스의 췌장 유래의 3차원 췌장 오거노이드를 포함하는 약물 효과 검증용 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 유전자 변이 마우스의 췌장 유래의 3차원 췌장 오거노이드에 약물을 처리하는 단계를 포함하는, 약물 효과 검증 방법 또는 약물 반응성 검증에 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
다른 예는 상기 유전자 변이 마우스의 췌장 유래의 3차원 췌장 오거노이드를 포함하는 약물 스크리닝용 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 유전자 변이 마우스의 췌장 유래의 3차원 췌장 오거노이드에 후보 물질을 처리하는 단계를 포함하는, 약물 스크리닝 방법을 제공한다.
다른 예는 상기 유전자 변이 마우스의 췌장 유래의 3차원 췌장 오거노이드의 핵형을 분석하여 유전형에 따른 오거노이드 핵형 양상을 야생형과 비교하는 단계를 포함하는, 암화 모델로서 오거노이드의 용도 (또는 사용 방법)을 제공한다.
다른 예는 상기 유전자 변이 마우스의 췌장 유래의 3차원 췌장 오거노이드의 분열속도 및 양상을 관찰하는 단계를 포함하는, 유전자형에 따른 오거노이드의 성장 확인 방법을 제공한다.
다른 예는 약물 반응성 측정 또는 약물 스크리닝에 사용하기 위한 오거노이드 제조 방법을 제공한다. 상기 오거노이드 제조 방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다:
(1) 줄기세포를 생체 기질 물질과 함께 배양하여 오거노이드를 생성시키는 단계;
(2) 상기 생성된 오거노이드 중 평균 직경이 1000㎛ 이하인 오거노이드를 수집하는 단계; 및
(3) 상기 수집된 오거노이드를 성장시키는 단계
를 포함할 수 있다.
다른 예는 상기 약물 반응성 측정 또는 약물 스크리닝에 사용하기 위한 오거노이드 제조 방법에 의하여 준비된 오거노이드를 포함하는 약물 반응성 측정 (예측 또는 검증) 또는 약물 스크리닝용 조성물 또는 키트를 제공한다.
다른 예는 상기 약물 반응성 측정 또는 약물 스크리닝에 사용하기 위한 오거노이드 제조 방법에 의하여 준비된 오거노이드에 약물을 처리하는 단계를 포함하는 약물 반응성 측정 (예측 또는 검증) 또는 약물 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 약물을 처리하는 단계 이전에, 앞서 설명한 오거노이드 제조 방법의 단계 (1) 내지 (3)을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 약물 반응성 측정 (예측 또는 검증) 또는 약물 스크리닝용 조성물 또는 키트 또는 방법은 오거노이드의 유래, 형태 등에 관계없이 모든 오거노이드에 범용적으로 적용 가능한 표준화된 기술인 것을 특징으로 한다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세 사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명은 총유전체(WGS)와 같은 유전자 분석 방법과 유전자 변이 마우스의 일반 조직과 암 조직에서 얻은 오거노이드를 이용해, 암을 in vivo에 가깝게 모델링하고, 유전자 변이에 따른 약물 효용성 검증에 유용하게 적용하는 것을 목표로 하고 있다. 본 발명은 총유전체(WGS)와 유전자 조작 쥐, 사람 환자 유래 오거노이드를 이용해 유전자형에 맞는 약물 처리를 통해 신규한 항암 치료제 검증 방법을 제시하고자 한다. 본 명세서에서 제공되는 유전자 변이 마우스 유래 췌장 오거노이드에서 총유전체(WGS)를 통해 각각의 유전형을 가진 오거노이드를 장기적으로 배양하여 다른 유전적 변이를 수반하는지 확인하여 암화되는 과정에서의 유전적 변이 축적을 비교할 수 있다.
본 발명은 생체에서 3차원으로 존재하는 생체 조직, 특히 암 조직을 생체와 유사하게 모사 가능한 유전자 변이 마우스의 췌장 유래의 3차원 오거노이드를 제공하는 것을 목적으로 한다.
오거노이드는 성체줄기세포(adult stem cell, ASC), 배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC), 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC) 등으로부터 자가 재생 및 자가 조직화를 통해 형성된 3차원 세포집합체를 의미한다. 세포를 3차원 배양법으로 다시 응집 재조합하여 생체 환경과 유사하게 만듦으로써, 2D 배양법으로 배양된 2D 세포주의 한계를 극복하여 생체의 생리활성기능을 유사하게 재현할 수 있어서, 질병 모델링, 약물 스크리닝 등에 적용 가능하다.
본 명세서에 사용된 바로서, 췌장 오거노이드는 췌장 세포 (예컨대, 췌장 성체줄기세포)를 3차원 배양법으로 배양하여 얻어진 3차원 세포 집합체를 의미한다.
일 예는 유전자 변이 마우스의 췌장 유래의 3차원 췌장 오거노이드를 제공한다.
본 명세서에서, 상기 유전자 변이 마우스는 다음의 변이 중에서 선택된 하나 이상의 변이를 갖는 마우스를 의미한다:
(1) BRCA2 유전자의 변이;
(2) 텔로머레이스 RNA 성분 (Telomerase RNA component; TERC)의 넉아웃;
(3) BubR1 단백질의 아세틸화 잔기의 변이를 유도하는 유전자 변이; 및
(4) KRAS 유전자의 변이.
일 구체예에서, 상기 유전자 변이 마우스는
(1) BRCA2 유전자의 변이,
(2) BRCA2 유전자의 변이 및 텔로머레이스 RNA 성분(Telomerase RNA component; TERC)의 넉아웃,
(3) BubR1 단백질의 아세틸화 잔기의 변형을 유도하는 유전자 변이, 또는
(4) KRAS 유전자의 변이;를 포함하는 것일 수 있다.
BRCA2 (breast cancer 2) 유전자는 마우스(Mus musculus)의 5번 염색체 (Chr 5: 150.52 - 150.57 Mb)에 위치하는 유전자로서, GenBank Accession No. NM_001081001.2 (NP_001074470.1 암호화 유전자), GenBank Accession No. NM_009765.3 (NP_033895.2 암호화 유전자) 등에서 선택된 것일 수 있다. 상기 유전자 변이 마우스에 있어서, BRCA2 유전자의 변이는 BRCA2 유전자의 엑손 11의 전부 결실을 의미할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 유전자 변이 마우스는 특정 조건 결실 마우스, 예컨대, 대립유전자에서 Cre 재조합효소(recombinase) 매개 엑손 11 결실이 유도(예컨대, 4-히드록시타목시펜과 같은 타목시펜(tamoxifen)류 화합물에 의하여 조건 결실 유도)되는 마우스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 Cre 재조합효소 매개 엑손 11 결실 유도를 위하여, 상기 유전자 변이 마우스는 Cre 재조합효소 유전자가 도입된 것일 수 있으며, 예컨대, 상기 Cre 재조합효소 유전자 도입은 BRCA2 유전자의 엑손 11 결실 마우스와 Cre 재조합효소 유전자 삽입 마우스의 교배, Cre 재조합효소 유전자를 포함하는 통상적인 벡터(예컨대 아데노바이러스 벡터 등)의 통상적인 방법으로의 도입 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 Cre 재조합효소는 박테리오파지 P1 유래의 것일 수 있으며, UniProtKB P06956 (GenBank Accession No. YP_006472.1; 암호화 유전자 (mRNA): NC_005856.1의 CDS (436..1467))로 표현될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
텔로머레이스 RNA 성분 (Telomerase RNA component; TERC)은 진핵세포에 존재하는 ncRNA(non-coding RNA)로서, 텔로미어의 연장 활성을 갖는 텔로머레이스 (ribonucleoprotein)의 RNA 성분을 의미한다. 상기의 텔로미어란 염색체의 말단에 반복적으로 존재하는 유전물질의 특이한 형태로, 종말체라고도 한다. 염색체의 손상이나 다른 염색체와의 결합을 방지하는 기능을 가지고 있다. 텔로미어는 세포가 한 번 분열할 때마다 그 길이가 조금씩 짧아지며, 세포분열이 일정한 횟수를 넘어서면 그 길이가 아주 짧아지면서 해당 세포는 분열을 멈추고 죽게 된다.　이는 늙거나 손상된 세포가 문제를 일으키지 않기 위해 스스로 자살하는 이른바 '세포소멸'이라고 불리는 자연적인 현상으로,　따라서 텔로미어를 '생명시계'라 부르기도 한다.　이에 반해 체세포를 제외한 생식세포와 암세포는 텔로미어가 줄어들지 않아 무한증식이 가능하다. 특히　암세포의 경우 텔로머레이스가 분비되면서 텔로미어가 짧아지는 것을 막기 때문에 암세포가 죽지 않고 계속 증식하게 된다.　따라서 텔로머레이스를 넉아웃 시키게 되면 텔로미어의 연장 활성이 억제되어 암화가 진행되지 않게 되고, 정상 세포화된다. 즉, TERC가 정상인 경우 암화가 진행되며, TERC를 넉아웃시킨 경우 정상세포화된다. 일예로 WRN유전자는 노화 촉진과 관련된 유전자이며 암에서 그 수치가 증가한다. 다른 예로 BLM 유전자는 돌연변이가 일어나면 게놈 불안정성을 일으키며, 암을 특징으로 하는 블룸 증후군(Bloom syndrome)을 일으키는 암 관련 유전자이다. TERC의 넉아웃을 통해 정상세포화된 상태에서, 추가로 WRN, BLM 유전자를 넉아웃 또는 돌연변이 시키더라도 암화가 진행되지 않고 여전히 정상세포화된 상태를 유지한 연구 결과가 있다(Telomere Shortening Exposes Functions for the Mouse Werner and Bloom Syndrome Genes, 2004).
본 발명에 있어서, 상기 유전자 변이 마우스 중 텔로머레이스 RNA 성분의 넉아웃은 상기 텔로머레이스 RNA 성분의 전장 RNA 서열 (397nt) 중 하나 이상의 RNA의 결실 또는 원래 염기와 다른 종류로의 치환을 의미하는 것일 수 있으며, 예컨대, 전장 RNA 서열의 넉아웃(결실), 타겟팅 벡터를 이용한 TERC 유전자의 대체(replacement) 등일 수 있다.
상기 본 발명의 TERC, 및 BRCA2 유전자가 모두 결실된 마우스는 종래의 일반적인 TERC 결실 마우스와는 다르게 암화가 유도되었다.
상기 BubR1 (mitotic checkpoint serine/threonine kinase; Bub1b)은 방추 검문점(spindle checkpoint) 작용 및 염색체 분리에 수반되는 카이네이즈를 암호화하는 유전자로서, 동원체(kinetochore)에 위치하고, 세포분열후기 촉진복합체(anaphase-promoting complex/cyclosome; APC/C)의 억제 및 세포분열 후기(anaphase) 진입을 지연시키는 작용을 하고, 방추 검문점(spindle checkpoint) 기능 이상이 다양한 암에서 관찰된다. 마우스(Mus musculus) BubR1 유전자는 GenBank Accession No. NM_009773.3 (NP_033903.2 암호화 유전자)일 수 있다. 마우스 BubR1 단백질의 구조를 도 11에 모식적으로 나타내었다.
상기 유전자 변이 마우스에 있어서, 상기 BubR1 유전자는 아세틸화 잔기가 치환된 BubR1 단백질을 암호화하도록 변형된 것일 수 있으며, 상기 아세틸화 잔기는 예컨대, NP_033903.2의 아미노산 서열 중 243번째 아미노산 잔기 라이신(K) (K243)일 수 있으며, 상기 변이는 상기 아세틸화 잔기(예컨대, K243)의 아세틸화를 억제하는 변이일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 BubR1 유전자 변이는 BubR1 단백질의 K243이 아르기닌(R)로 변형된 변형 BubR1 단백질을 암호화하도록 변이된 것일 수 있다.
상기 KRAS는 세포 신호 전달에서 스위치 역할을 하는 유전자이다. 정상적으로 기능할 때세포증식을 조절하는 반면, 돌연변이가 발생하면 신호전달이 중단되면서 세포가 지속적으로 증식을 하게 되어 보통 암으로 진행이 된다. 따라서, 이러한 KRAS 유전자는 원 발암 유전자라고 불린다(proto-oncogene). KRASG12D 변이의 경우가 빈번하게 관찰된다. 마우스(Mus musculus) KRAS 유전자는 GenBank Accession No. NM_021284.6 (NP_067259.4 암호화 유전자)일 수 있다.
상기와 같은 유전자 변이 마우스의 췌장으로부터 생성된 오거노이드는 야생형 마우스 (상기 변형을 갖지 않는 마우스)와 비교하여 생체 환경 모사 능력이 우수하며, 특히 생체 내 암 환경을 보다 유사하게 모사할 수 있어서, 항암제 등의 다양한 약물 효과(반응성) 시험 및/또는 약물 스크리닝에 보다 유리하게 적용될 수 있다.
다른 예는 유전자 변이 마우스의 췌장 세포를 3차원 배양하는 단계를 포함하는, 3차원 췌장 오거노이드 제조 방법을 제공한다.
상기 유전자 변이 마우스는 앞서 설명한 바와 같다.
상기 3차원 배양 단계는 다음의 단계를 포함할 수 있다:
(i) 유전자 변이 마우스로부터 분리한 췌장 조직을 해리시키는 단계;
(ii) 상기 해리된 췌장 조직으로부터 췌관세포(ductal cell)를 포함하는 세포 펠렛을 수집하는 단계; 및
(iii) 상기 수집된 세포 펠렛을 생체 기질 물질과 함께 배양하는 단계.
상기 췌장 조직을 해리시키는 단계 (단계 (i))은 췌장 조직에 해리 용액을 처리하여 사용하여 수행할 수 있다. 상기 해리 용액은 HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) (예컨대, 1ml 내지 10ml, 1ml 내지 5ml, 3ml 내지 10ml, 또는 3 내지 5ml), 콜라게나아제 (예컨대, 콜라게나아제 P) (예컨대, 0.1mg/ml 내지 5mg/ml, 0.1mg/ml 내지 3mg/ml, 0.5mg/ml 내지 5mg/ml, 0.5mg/ml 내지 5mg/ml, 0.5mg/ml 내지 2mg/ml, 또는 0.8mg/ml 내지 1.5mg/ml), DNase (예컨대, DNase 1) (예컨대, 0.01mg/ml 내지 1mg/ml, 0.01mg/ml 내지 0.5mg/ml, 0.01mg/ml 내지 0.2mg/ml, 0.05mg/ml 내지 1mg/ml, 0.05mg/ml 내지 0.5mg/ml, 0.05mg/ml 내지 0.2mg/ml, 또는 0.08mg/ml 내지 0.15mg/ml) 등을 포함하는 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 해리 용액은 췌장 조직 (Vpan= 약 1.08mg/mm3)에 대하여 0.5 내지 5 ml, 0.5 내지 4 ml, 0.5 내지 3 ml, 1 내지 5 ml, 1 내지 4 ml, 또는 1 내지 3ml의 양으로 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 췌장 조직의 양에 따라 적절히 조절하여 사용할 수 있다. 이 때, 조직의 해리를 보다 용이하게 하기 위하여, 물리적 해리 (예컨대, 가위, 나이프 등으로 잘게 절단하는 단계 등)를 해리 용액 처리와 동시에 또는 순서에 관계없이 이시적으로 수행할 수 있다.
상기 췌관세포(ductal cell)를 포함하는 세포 펠렛을 수집하는 단계 (ii)는 해리된 췌장 조직으로부터 췌관세포(ductal cell)를 분리하는 단계 (ii-1) 및 상기 분리된 췌관세포를 원심분리하여 세포 펠렛을 수집하는 단계(ii-2)를 포함할 수 있다. 상기 해리된 췌장 조직으로부터 췌관세포를 분리하는 단계 (ii-1)은 상기 단계 (i)에서 얻어진 해리된 췌장 조직을 여과시켜 통과하지 못한 세포들 중에서 췌관세포를 분리하여 취하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 여과는 췌관세포를 통과시키지 않는 크기 (예컨대, 50㎛ 내지 200㎛, 50㎛ 내지 170㎛, 50㎛ 내지 150㎛, 50㎛ 내지 120㎛, 80㎛ 내지 200㎛, 80㎛ 내지 170㎛, 80㎛ 내지 150㎛, 80㎛ 내지 120㎛, 또는 90㎛ 내지 110㎛)의 공극(pore)을 갖는 통상의 세포 여과기를 사용하여 수행할 수 있다. 상기 췌관 세포의 분리는 현미경 관찰 등 통상의 세포 확인 수단에 의하여 수행될 수 있다. 상기 세포 펠렛을 수집하는 단계 (ii-2)는 상기 (ii-1)에서 분리된 췌관세포를, 예컨대, 1000rpm 내지 2000rpm, 1000rpm 내지 1800rpm, 1000rpm 내지 1600rpm, 1200rpm 내지 2000rpm, 1200rpm 내지 1800rpm, 1200rpm 내지 1600rpm, 1400rpm 내지 2000rpm, 1400rpm 내지 1800rpm, 또는 1400rpm 내지 1600rpm으로 1 내지 20분, 1 내지 15분, 1 내지 12분, 5 내지 20분, 5 내지 15분, 5 내지 12분, 8 내지 20분, 8 내지 15분, 또는 8 내지 12분 동안 원심분리하여 펠렛을 수집하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 수집된 세포 펠렛을 생체 기질과 함께 배양하는 단계 (iii)에서 상기 생체 기질은 매트리젤(Matrigel), 세포외기질(Extracellular matrix; ECM), 기저막 추출물(Basement Membrane Extract; BME), 히알루론산(hyaluronic acid) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 상기 매트리젤은 엥겔브레스트 홀름 스웜(Engelbreth-Holm-Swarm;EHS) 마우스 육종 세포에서 분비되는 젤라틴 유사 단백질 혼합물을 의미한다. 상기 세포외기질은 세포에서 합성되고 세포외에 분비, 축적된 분자들을 포함하는 생체 고분자의 집합체로서, 콜라겐, 엘라스틴 등의 섬유성 단백질, 글리코사미노글리칸 등의 복합 단백질, 피브로넥틴, 라미닌 등의 세포 부착성 단백질 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 단계 (iii)의 배양은 통상적인 세포 배양 조건, 예컨대, 35 내지 36℃ 및 8 내지 12% CO2 조건에서 1 내지 10일, 1 내지 7일, 3 내지 10일 또는 3 내지 7일 동안 수행될 수 있다.
상기 (iii)단계의 배양을 거친 오거노이드 조직의 일부를 취하여 기계적 응력(mechanical stress)을 가하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서 기계적 응력이란, 물체가 외부로부터 힘을 받게 되면 이 힘에 저항하려는 내부 저항력이 발생하게 되는데, 물체 내 각 지점에서 단위 면적당 크기를 말한다. 상기 기계적 응력(mechanical stress)을 가하는 단계란 1차 배양하는 단계에서 선별된 오거노이드 조직을 2단계에 거쳐 물리적 해리 후 오거노이드를 재배양하는 것을 특징으로 하는 것을 말한다.
앞서 설명한 유전자 변이 마우스의 췌장 유래의 3차원 췌장 오거노이드는 상기 3차원 췌장 오거노이드 제조 방법에 의하여 제조된 것일 수 있다.
다른 예는 상기 유전자 변이 마우스의 췌장 유래의 3차원 췌장 오거노이드를 포함하는 약물 효과 검증용 조성물을 제공한다. 다른 예는 상기 유전자 변이 마우스의 췌장 유래의 3차원 췌장 오거노이드에 약물을 처리하는 단계를 포함하는, 약물 효과 검증 방법 또는 약물 효과 검증에 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 약물은 췌장 질환의 치료 약물, 예컨대, 앞서 설명한 BRCA2 변이, 텔로머레이스 RNA 성분(Telomerase RNA component; TERC) 변이, BubR1 변이, 및/또는 KRAS 변이와 관련된 췌장 질환에 대한 치료 약물일 수 있으며, 예컨대 췌장암에 대한 항암제일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 약물은 히스톤 디아세틸라아제 억제제 (histone deacetylase inhibitor; HDACi; 예컨대, 트리코스타틴 A (TSA), 사하(suberoylanilide hydroxamic acid;SAHA), LMK-235, FK-228 (Romidepsin) 등), PARP-1 (폴리 [ADP-리보오스] 폴리머레이즈 1) 억제제 (예컨대, 올라파립(Olaparib), 베리파립(Veliparib) (ABT-888), 이니파립(Iniparib) (BSI-201) 등), plk1 (polo-like kinase 1) 억제제 (예컨대, BI2536, 볼라세티브(Volasertib) (BI 6727), 리고세티브(Rigosertib) (ON-01910) 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 약물 효과는 약물이 달성하고자 하는 생체 작용을 의미하는 것으로, 상기 췌장 질환 (예컨대, 췌장암)의 경감, 완화, 치료 등의 효과를 의미할 수 있고, 상기 췌장 질환이 췌장암인 경우, 상기 약물 효과는 췌장암의 경감, 제거, 진행 또는 전이 억제 등을 의미하는 것일 수 있다.
상기 3차원 췌장 오거노이드에 약물 처리시 그 크기 및/또는 개수가 감소한 경우, 상기 약물은 췌장 질환 (예컨대, 췌장암)에 효과가 있는 것으로 결정(또는 판단)할 수 있다. 따라서, 상기 검증 방법 또는 검증에 정보를 제공하는 방법은, 상기 약물을 처리하는 단계 이후에, 약물 처리된 3차원 췌장 오거노이드의 크기 및/또는 개수를 측정하여, 상기 약물이 처리되지 않은 3차원 췌장 오거노이드와 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 이를 위하여, 상기 비교하는 단계는, 상기 약물이 처리되지 않은 3차원 췌장 오거노이드의 크기 및/또는 개수를 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 이 단계는 약물 처리된 3차원 췌장 오거노이드의 크기 및/또는 개수를 측정하는 단계와 동시에 또는 순서에 상관없이 이시적으로 수행될 수 있다. 상기 약물이 처리되지 않은 3차원 췌장 오거노이드는 상기 약물 처리 전의 3차원 췌장 오거노이드 또는 3차원 췌장 오거노이드 중 일부에 약물을 처리하고 남은 일부의 3차원 췌장 오거노이드일 수 있다. 또한, 상기 검증 방법 또는 검증에 정보를 제공하는 방법은, 상기 비교하는 단계 이후에, 상기 약물이 처리된 3차원 췌장 오거노이드의 크기 및/또는 개수가 상기 약물이 처리되지 않은 3차원 췌장 오거노이드와 비교하여 감소한 경우, 상기 약물을 췌장 질환 (예컨대, 췌장암)에 효과가 있는 것으로 결정(또는 판단)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
다른 예는 상기 유전자 변이 마우스의 췌장 유래의 3차원 췌장 오거노이드를 포함하는 약물 스크리닝용 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 유전자 변이 마우스의 췌장 유래의 3차원 췌장 오거노이드에 후보 물질을 처리하는 단계를 포함하는, 약물 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 후보 물질은 모든 생체 활성 물질 중에서 선택될 수 있으며, 예컨대, 생체활성의 소분자 화합물 (small molecular chemical), 펩타이드, 단백질 (예컨대, 항체, 기타 단백질 약물 등), 핵산분자, 추출물 (예컨대, 동물 또는 식물 추출물) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 약물 스크리닝 방법은 췌장 질환에 대하여 치료 효과를 갖는 약물을 스크리닝하기 위한 것일 수 있다. 상기 췌장 질환은 앞서 설명한 BRCA2 변이, 텔로머레이스 RNA 성분 (Telomerase RNA component; TERC) 변이, BubR1 변이, 및/또는 KRAS 변이와 관련된 췌장 질환일 수 있으며, 예컨대 췌장암일 수 있다.
상기 3차원 췌장 오거노이드에 후보 물질 처리시 그 크기 및/또는 개수가 감소한 경우, 상기 후보 물질은 췌장 질환 (예컨대, 췌장암)에 효과가 있는 약물로 결정 (또는 판단)할 수 있다. 따라서, 상기 스크리닝 방법은, 상기 후보 물질을 처리하는 단계 이후에, 후보 물질 처리된 3차원 췌장 오거노이드의 크기 및/또는 개수를 측정하여, 상기 후보 물질이 처리되지 않은 3차원 췌장 오거노이드와 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 이를 위하여, 상기 비교하는 단계는, 상기 후보 물질이 처리되지 않은 3차원 췌장 오거노이드의 크기 및/또는 개수를 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 이 단계는 후보 물질 처리된 3차원 췌장 오거노이드의 크기 및/또는 개수를 측정하는 단계와 동시에 또는 순서에 상관없이 이시적으로 수행될 수 있다. 상기 후보 물질이 처리되지 않은 3차원 췌장 오거노이드는 상기 후보 물질 처리 전의 3차원 췌장 오거노이드 또는 3차원 췌장 오거노이드 중 일부에 후보 물질을 처리하고 남은 일부의 3차원 췌장 오거노이드일 수 있다. 또한, 상기 스크리닝 방법은, 상기 비교하는 단계 이후에, 상기 후보 물질이 처리된 3차원 췌장 오거노이드의 크기 및/또는 개수가 상기 후보 물질이 처리되지 않은 3차원 췌장 오거노이드와 비교하여 감소한 경우, 상기 약물을 췌장 질환(예컨대, 췌장암)에 효과가 있는 후보 약물로 결정(또는 판단)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
다른 예는 상기 유전자 변이 마우스의 췌장 유래의 3차원 췌장 오거노이드의 핵형을 분석하여 유전형에 따른 오거노이드 핵형 양상을 야생형과 비교하는 단계를 포함하는, 암화 모델로서 오거노이드의 용도(또는 사용 방법)를 제공한다.
다른 예는 상기 유전자 변이 마우스의 췌장 유래의 3차원 췌장 오거노이드의 분열속도 및 양상을 관찰하는 단계를 포함하는, 유전자형에 따른 오거노이드의 성장 확인 방법을 제공한다.
다른 예는 약물 반응성 측정 또는 약물 스크리닝에 사용하기 위한 오거노이드 제조 방법을 제공한다. 상기 오거노이드 제조 방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다:
(1) 줄기세포를 생체 기질 물질과 함께 배양하여 오거노이드를 생성시키는 단계;
(2) 상기 생성된 오거노이드 중 평균 직경이 1000㎛ 이하, 900㎛ 이하, 800㎛ 이하, 700㎛ 이하, 600㎛ 이하, 500㎛ 이하, 400㎛ 이하, 300㎛ 이하, 또는 200㎛ 이하인 오거노이드를 수집하는 단계; 및
(3) 상기 수집된 오거노이드를 성장시키는 단계
를 포함할 수 있다.
상기 단계 (1)에서, 줄기세포는 자가 재생 및 자가 조직화 등을 통하여 3차원 오거노이드를 형성할 수 있는 모든 줄기세포들 중에서 선택될 수 있으며, 예컨대, 성체줄기세포(adult stem cell, ASC), 배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC), 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC), 전발생세포 (progenitor cells) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 배아줄기세포 (embryonic stem cells)는 수정란에서 유래하는 줄기세포로서, 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 특성을 갖는 줄기세포이다. 상기 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells; iPS cells)는 역분화 줄기세포라고도 불리며, 분화가 끝난 체세포에 세포 분화 관련 유전자를 주입하여 분화 이전의 세포 단계로 되돌림으로써, 배아줄기세포처럼 만능성을 유도해 낸 세포를 의미한다. 상기 전발생세포 (progenitor cells)는 줄기세포와 유사하게 특정 유형의 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖지만, 줄기세포보다 특이적이고 표적화 되어 있으며, 줄기세포와 달리 분열 횟수가 유한하다. 상기 전발생 세포는 중간엽 유래의 전발생세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에서 전발생세포는 줄기세포 범주에 포함되며, 특별한 언급이 없는 한 '줄기세포'는 전발생세포도 포함하는 개념으로 해석된다.
상기 성체줄기세포 (adult stem cell)는 제대, 제대혈(탯줄혈액), 또는 성인의 골수, 혈액, 신경, 장기, 상피, 근육 등에서 추출해낸 줄기세포로, 구체적 장기의 세포로 분화되기 직전의 원시세포를 의미한다. 상기 성체줄기세포는 조혈모세포(hematopoietic stem cell), 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell), 신경줄기세포(neural stem cell) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell; MSC)는 중간엽기질세(mesenchymal stromal cell; MSC)라고도 불리며, 골모세포(osteoblasts), 연골모세포(chondrocytes), 근육세포(myocytes), 지방세포(adipocytes), 상피세포, 신경세포 등과 같은 다양한 형태의 세포로 분화할 수 있는 다분화능을 가진 기질세포 (multipotent stromal cell)를 의미한다. 중간엽줄기세포는 상피 조직, 태반 (placenta), 제대(umbilical cord), 제대혈(umbilical cord blood), 지방 조직(adipose tissue), 성체 근육(adult muscle), 각막 기질(corneal stroma), 젖니의 치아 속질(dental pulp) 등과 같은 비골수 조직(non-marrow tissues)으로부터 유래하는 다능성 세포들 중에서 선택된 것일 수 있다.
상기 줄기세포는 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등과 같은 포유 동물로부터 유래한 것일 수 있으며, 생체 내 기관(장기) 또는 조직의 정상 부위 또는 질병 부위로부터 분리된 것일 수 있다.
상기 단계 (1)의 줄기세포는 포유동물로부터 분리된 조직(예컨대, 췌장, 위, 장 등과 같은 특정 장기의 조직)을 해리시켜서 얻어진 것일 수 있다. 따라서 상기 단계 (1) 전에, 조직을 해리시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기와 같은 해리 단계 조직에 해리 용액을 처리하여 수행될 수 있다. 상기 해리 용액은 HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) (예컨대, 1ml 내지 10ml, 1ml 내지 5ml, 3ml 내지 10ml, 또는 3 내지 5ml), 콜라게나아제 (예컨대, 콜라게나아제 P) (예컨대, 0.1mg/ml 내지 5mg/ml, 0.1mg/ml 내지 3mg/ml, 0.5mg/ml 내지 5mg/ml, 0.5mg/ml 내지 5mg/ml, 0.5mg/ml 내지 2mg/ml, 또는 0.8mg/ml 내지 1.5mg/ml), DNase (예컨대, DNase 1) (예컨대, 0.01mg/ml 내지 1mg/ml, 0.01mg/ml 내지 0.5mg/ml, 0.01mg/ml 내지 0.2mg/ml, 0.05mg/ml 내지 1mg/ml, 0.05mg/ml 내지 0.5mg/ml, 0.05mg/ml 내지 0.2mg/ml, 또는 0.08mg/ml 내지 0.15mg/ml) 등을 포함하는 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 해리 용액은 조직 (Vpan= 약 1.08mg/mm3)에 대하여 0.5 내지 5 ml, 0.5 내지 4 ml, 0.5 내지 3 ml, 1 내지 5 ml, 1 내지 4 ml, 또는 1 내지 3ml의 양으로 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 췌장 조직의 양에 따라 적절히 조절하여 사용할 수 있다. 이 때, 조직의 해리를 보다 용이하게 하기 위하여, 기계적 해리 (mechanical dissociation; 예컨대, 가위, 나이프 등으로 잘게 절단하는 단계 등)를 해리 용액 처리와 동시에 또는 순서에 관계없이 순차적으로 수행할 수 있다.
상기 줄기세포는 상기 조직을 해리시키는 단계에서 얻어진 해리된 조직으로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 줄기세포는 상기 해리된 조직을 소정의 크기 (예컨대, 50㎛ 내지 200㎛, 50㎛ 내지 170㎛, 50㎛ 내지 150㎛, 50㎛ 내지 120㎛, 80㎛ 내지 200㎛, 80㎛ 내지 170㎛, 80㎛ 내지 150㎛, 80㎛ 내지 120㎛, 또는 90㎛ 내지 110㎛)의 공극(pore)을 갖는 통상의 세포 여과기에 통과시켜, 이를 통과하지 못하는 여과잔류물을 원심분리하여 얻어진 펠렛에 포함되어 있을 수 있다. 상기 원심분리는 1000rpm 내지 2000rpm, 1000rpm 내지 1800rpm, 1000rpm 내지 1600rpm, 1200rpm 내지 2000rpm, 1200rpm 내지 1800rpm, 1200rpm 내지 1600rpm, 1400rpm 내지 2000rpm, 1400rpm 내지 1800rpm, 또는 1400rpm 내지 1600rpm으로 1 내지 20분, 1 내지 15분, 1 내지 12분, 5 내지 20분, 5 내지 15분, 5 내지 12분, 8 내지 20분, 8 내지 15분, 또는 8 내지 12분 동안 수행할 수 있다.
따라서, 상기 방법은 단계 (1) 전 및 상기 조직을 해리시키는 단계 이후에, 앞서 설명한 바와 같이, 상기 해리된 조직을 여과 및 원심분리하여 펠렛을 수집하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 단계 (1)의 줄기세포는 포유동물로부터 분리된 조직을 해리시키고, 해리된 조직을 여과시켜 얻어진 여과잔류물(여과되지 않고 남아있는 잔류물)을 원심분리하여 얻어진 세포 펠렛의 형태로 사용될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 줄기세포는 앞서 설명한 유전자 변이 마우스 또는 상기 유전자 변이 마우스의 장기(예컨대, 췌장)에서 분리된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 유래와 관계없이 모든 오거노이드들 중에서 선택될 수 있다.
상기 단계 (1)에서, 생체 기질 물질은 생체와 유사한 환경을 조성하여 줄기세포를 생체와 유사한 환경에서 3차원 배양 가능하도록 하는 물질을 의미하는 것으로, 매트리젤(Matrigel), 세포외기질(Extracellular matrix; ECM), 기저막 추출물(Basement Membrane Extract; BME), 히알루론산(hyaluronic acid) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 상기 매트리젤은 엥겔브레스트 홀름 스웜(Engelbreth-Holm-Swarm;EHS) 마우스 육종 세포에서 분비되는 젤라틴 유사 단백질 혼합물을 의미한다. 상기 세포외기질은 세포에서 합성되고 세포외에 분비, 축적된 분자들을 포함하는 생체 고분자의 집합체로서, 콜라겐, 엘라스틴 등의 섬유성 단백질, 글리코사미노글리칸 등의 복합 단백질, 피브로넥틴, 라미닌 등의 세포 부착성 단백질 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 단계 (1)의 배양은 통상적인 세포 배양 조건, 예컨대, 35 내지 38℃ 및 3 내지 10% CO2 조건에서 진행될 수 있다. 또한, 상기 배양 기간은 오거노이드의 평균 직경이 1000㎛ 이하, 900㎛ 이하, 800㎛ 이하, 700㎛ 이하, 600㎛ 이하, 500㎛ 이하, 400㎛ 이하, 300㎛ 이하, 또는 200㎛ 이하가 될 때까지의 기간일 수 있으며, 예컨대, 계대 배양 전까지 1 내지 14일, 1 내지 10일, 1 내지 7일, 3 내지 14일, 3 내지 10일 또는 3 내지 7일 동안 수행할 수 있으며, 그 이후, 1 계대 당 1 내지 14일, 1 내지 10일, 1 내지 7일, 3 내지 14일, 3 내지 10일 또는 3 내지 7일씩 계대배양을 1회 또는 2회 이상 반복하여 최대 12개월, 9개월, 또는 6개월까지 지속적으로 배양하는 것도 가능하다. 상기 배양에 사용되는 배지는 DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12), 페니실린(penicillin)/스트렙토마이신(streptomycin), HEPES(Hank's Balanced Salt Solution), GlutaMAX, N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine), 조건배지 (예컨대, Rspo1-conditioned medium), 니코틴아미드(nicotinamide), 가스트린 (예컨대, 가스트린 I), 성장인자 (예컨대, EGF, FGF 등), 노긴(Noggin), 노긴-조건배지 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 오거노이드는 평균 직경이 약 30㎛ 이상, 약 40㎛ 이상, 약 50㎛ 이상, 약 60㎛ 이상, 약 70㎛ 이상, 약 80㎛ 이상, 약 90㎛ 이상, 또는 약 100㎛ 이상인 세포집합체를 의미할 수 있다. 오거노이드의 크기가 커지면, 오거노이드 내부에 약물이 전달되는데 한계가 있고, 약물에 대한 반응성을 나타내는데 한계가 있다. 또한, 수집된 오거노이드의 평균 직경의 최대값이 커질수록, 포함된 오거노이드들의 크기(평균직경) 간의 오차가 커져서, 동일한 약물에 대하여 각각의 오거노이드가 나타내는 반응성의 차이가 커지게 되므로, 균질한 약물 반응성 결과를 얻기 위하여, 오거노이드의 크기(평균 직경)의 상한값을 결정하는 것이 중요하다. 본 발명은 상기 오거노이드에 기계적 응력을 가하여 2스텝으로 후처리하여, 수득된 오거노이드 크기를 균일화함으로써 약물반응성 분석 결과의 정확성을 높이는 현저한 효과가 있다. 이는 췌장뿐만 아니라 다른 조직의 오거노이드 배양시 균일한 수득률을 획득하는데 이용 가능할 것으로 기대된다.
따라서, 최종적으로 얻어지는 오거노이드의 생체의 약물 반응성의 모사도를 높이고 보다 오거노이드 간 반응성 차이를 줄여서 균질한 결과를 얻기 위하여, 상기 단계 (2)의 오거노이드 수집 단계는 평균 직경이 소정의 크기 이하인, 예컨대, 1000㎛ 이하, 900㎛ 이하, 800㎛ 이하, 700㎛ 이하, 600㎛ 이하, 500㎛ 이하, 400㎛ 이하, 300㎛ 이하, 또는 200㎛ 인 오거노이드를 선택적으로 수집하는 것을 특징으로 한다. 상기 단계 (2)에서 수집된 오거노이드는 평균 직경이 30 내지 1000㎛, 40 내지 1000㎛, 50 내지 1000㎛, 60 내지 1000㎛, 70 내지 1000㎛, 80 내지 1000㎛, 90 내지 1000㎛, 100 내지 1000㎛, 30 내지 900㎛, 40 내지 900㎛,50 내지 900㎛, 60 내지 900㎛, 70 내지 900㎛, 80 내지 900㎛, 90 내지 900㎛, 100 내지 900㎛, 30 내지 800㎛, 40 내지 800㎛, 50 내지 800㎛, 60 내지 800㎛, 70 내지 800㎛, 80 내지 800㎛, 90 내지 800㎛, 100 내지 800㎛, 30 내지 700㎛, 40 내지 700㎛, 50 내지 700㎛, 60 내지 700㎛, 70 내지 700㎛, 80 내지 700㎛, 90 내지 700㎛, 100 내지 700㎛, 30 내지 600㎛, 40 내지 600㎛, 50 내지 600㎛, 60 내지 600㎛, 70 내지 600㎛, 80 내지 600㎛, 90 내지 600㎛, 100 내지 600㎛, 30 내지 500㎛, 40 내지 500㎛, 50 내지 500㎛, 60 내지 500㎛, 70 내지 500㎛, 80 내지 500㎛, 90 내지 500㎛, 100 내지 500㎛, 30 내지 400㎛, 40 내지 400㎛, 50 내지 400㎛, 60 내지 400㎛, 70 내지 400㎛, 80 내지 400㎛, 90 내지 400㎛, 100 내지 400㎛, 30 내지 300㎛, 40 내지 300㎛, 50 내지 300㎛, 60 내지 300㎛, 70 내지 300㎛, 80 내지 300㎛, 90 내지 300㎛, 100 내지 300㎛, 30 내지 200㎛, 40 내지 200㎛, 50 내지 200㎛, 60 내지 200㎛, 70 내지 200㎛, 80 내지 200㎛, 90 내지 200㎛, 또는 100 내지 200㎛인 것일 수 있다.
상기 단계 (2)의 오거노이드 수집 단계는 특정 크기 (평균 직경이 1000㎛, 900㎛, 800㎛, 700㎛, 600㎛, 500㎛, 400㎛, 300㎛, 또는 200㎛) 이하의 오거노이드의 선별에 사용 가능한 통상적인 모든 수단에 의하여 수행될 수 있다. 예컨대, 상기 단계 (2)의 오거노이드 수집은 공극(pore)이 1000㎛, 900㎛, 800㎛, 700㎛, 600㎛, 500㎛, 400㎛, 300㎛, 또는 200㎛인 세포여과기(Strainer)를 사용하여, 이를 통과한 오거노이드를 수집하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 단계 (3)에서 오거노이드를 성장시키는 단계는 오거노이드를 30%(v/v) 내지 95%(v/v), 30%(v/v) 내지 약 90%(v/v), 30%(v/v) 내지 약 85%(v/v), 30%(v/v) 내지 약 80%(v/v), 30%(v/v) 내지 약 75%(v/v), 30%(v/v) 내지 약 70%(v/v), 40%(v/v) 내지 95%(v/v), 40%(v/v) 내지 약 90%(v/v), 40%(v/v) 내지 약 85%(v/v), 40%(v/v) 내지 약 80%(v/v), 40%(v/v) 내지 약 75%(v/v), 40%(v/v) 내지 약 70%(v/v), 50%(v/v) 내지 95%(v/v), 50%(v/v) 내지 약 90%(v/v), 50%(v/v) 내지 약 85%(v/v), 50%(v/v) 내지 약 80%(v/v), 50%(v/v) 내지 약 75%(v/v), 50%(v/v) 내지 약 70%(v/v))의 접종 밀도(confluency)로 접종하여 12 내지 36 시간, 12 내지 30 시간, 12 내지 25 시간, 18 내지 36 시간, 18 내지 30 시간, 18 내지 24 시간, 23 내지 36 시간, 23 내지 30 시간, 또는 23 내지 25 시간 동안 성장시키는 단계를 포함할 수 있다. 접종된 오거노이드의 분포가 균일하여야 오거노이드 성장의 제어가 가능 또는 용이하고, 약물 처리시 약물이 균일한 수준으로 오거노이드 내부로 전달될 수 있으므로, 접종 밀도(오거노이드 성장 배지 중의 오거노이드가 차지하는 부피 비율 (%(v/v)) = [(오거노이드 부피)/(오거노이드 부피 + 배지 부피)]*100)를 소정의 범위로 조절하는 것이 유리할 수 있다. 접종 밀도가 30%(v/v)보다 낮은 경우, 오거노이드 간 상호작용이 부족하여 오거노이드 성장에 불리한 영향을 미칠 수 있으며, 접종 밀도가 95%보다 높은 경우, 용기 내 오거노이드의 밀도가 높아져서 각각의 오거노이드가 배지와 접촉하는 면적이 감소하여 오거노이드 성장뿐 아니라 배지를 통하여 약물 처리시 약물 전달률에 불리한 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 상기 단계 (3)에서 오거노이드를 성장시키는 단계에서 오거노이드의 접종 밀도는 앞서 설명한 범위로 조절하는 것이 좋다. 상기 배양을 거친 오거노이드 조직의 일부를 취하여 기계적 응력(mechanical stress)을 가하는 단계를 포함할 수 있다.
다른 예는 상기 약물 반응성 측정 또는 약물 스크리닝에 사용하기 위한 오거노이드 제조 방법에 의하여 준비된 오거노이드를 포함하는 약물 반응성 측정 (예측 또는 검증) 또는 약물 스크리닝용 조성물 또는 키트를 제공한다.
다른 예는 상기 약물 반응성 측정 또는 약물 스크리닝에 사용하기 위한 오거노이드 제조 방법에 의하여 준비된 오거노이드에 약물을 처리하는 단계를 포함하는 약물 반응성 측정 (예측 또는 검증) 또는 약물 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 약물을 처리하는 단계 이전에, 앞서 설명한 오거노이드 제조 방법의 단계 (1) 내지 (3)을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 앞서 설명한 약물 효과 검증 방법의 비교하는 단계 및/또는 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 약물 반응성 측정(예측 또는 검증) 또는 약물 스크리닝용 조성물 또는 키트 또는 방법은 오거노이드의 유래, 형태 등에 관계없이 모든 오거노이드에 범용적으로 적용 가능한 표준화된 기술인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구체예에서, 텔로머레이스(telomerase)가 결실된 암 동물 모델을 제공하고, 상기 텔로머레이스 결실은 텔로머레이스 RNA 성분(Telomerase RNA component)의 넉아웃으로 유도되는 것을 특징으로 하는 암 동물 모델을 제공하며, 상기 암 동물 모델은 BRCA2 유전자가 변이된 것을 특징으로 하는 암 동물 모델을 제공하며, 상기 암은 췌장암인 것을 특징으로 하는 암 동물 모델을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기의 동물 모델로부터 제조된 암 오거노이드를 제공하고, 상기 암 오거노이드는 췌장암 오거노이드인 것을 특징으로 하는 암 오거노이드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, (a) 상기의 동물 모델로부터 조직을 수득하는 단계; 및, (b) 상기 조직으로부터 분리된 세포를 매트리젤과 혼합하여 프리-오거노이드(pre-organoid)로 배양하는 단계;를 포함하는 암 오거노이드의 제조방법을 제공하고, 상기 조직은 췌장 조직인 것을 특징으로 하는 암 오거노이드의 제조방법을 제공하며, 상기 (b)단계 이후에, (c) 프리-오거노이드를 50 내지 500 파스칼의 기계적 응력으로 파쇄하는 단계; 및, (d) 파쇄된 오거노이드를 재배양하는 단계;를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 암 오거노이드의 제조방법을 제공하며, 상기 암 오거노이드는 직경 100 내지 200um인 것을 특징으로 하는 암 오거노이드의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, (a) 상기 중 어느 하나의 방법으로 암 오거노이드를 제조하는 단계; (b) 상기 오거노이드에 암 치료용 후보 약물을 처리하는 단계; 및, (c) 상기 오거노이드의 세포생존율(viability)을 측정하는 단계;를 포함하는 암 치료용 후보 약물의 효과를 검증하는 방법을 제공하고, 상기 암은 췌장암인 것을 특징으로 하는 암 치료용 후보 약물의 효과를 검증하는 방법을 제공하며, 상기 약물은 히스톤 디아세틸라아제 억제제(HDACi), PARP-1(Poly [ADP-ribose] polymerase 1) 억제제, 및 plk1 (polo-like kinase 1) 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 암 치료용 후보 약물의 효과를 검증하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, (a) 상기 중 어느 하나의 방법으로 암 오거노이드를 제조하는 단계; (b) 상기 오거노이드에 암 치료용 후보 약물을 처리하는 단계; 및, (c) 종양 억제 유전자 p53을 코딩하는 핵산, 또는 이로부터 합성된 단백질에 특이적으로 결합하는 바이오 마커의 발현을 확인하는 단계;를 포함하는 암 치료용 후보 약물의 반응성을 검증하는 방법을 제공하고, 상기 암은 췌장암인 것을 특징으로 하는 암 치료용 후보 약물의 반응성을 검증하는 방법을 제공하며, 상기 약물은 히스톤 디아세틸라아제 억제제(HDACi), PARP-1(Poly [ADP-ribose] polymerase 1) 억제제, 및 plk1 (polo-like kinase 1) 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 암 치료용 후보 약물의 반응성을 검증하는 방법을 제공한다.
보다 구체적으로, 상기의 바이오 마커는 종양 억제 유전자 p53을 코딩하는 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머, 또는 프로브인 것이 바람직하고, 또는 종양 억제 유전자 p53을 코딩하는 핵산으로부터 합성된 p53 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것이 바람직하다.
이하 상기 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.
본 발명에서 제공되는 BubR1의 한 대립유전자(allele)에서 243번째 리신(Lysine)이 아르기닌(Arginine)으로 치환된 BubR1 K243R/+ 마우스 유래 오거노이드, Brca2 엑손 11 이 조건적으로 타목시펜(tamoxifen) 처리에 의해 넉아웃된 Brca2 F11/F11 마우스 유래 오거노이드, 텔로머레이스 역전사 효소(telomerase reverse transcriptase)의 RNA 성분(Terc, mTR) 유전자가 동일하게 넉아웃된 mTR -/- 마우스 유래 오거노이드, 및 위 두 유전자형을 가진 쥐의 교배로 얻은 Brca2 F11/F11 ; mTR -/- 마우스 유래 오거노이드는 약물 처리 전의 약물 효능 예측, 약물 처리 후의 약물 효용성(효과, 반응성) 검증, 유전자형에 따른 핵형 분석, 분열 속도 및 양상 관찰 등의 연구에 유용하게 적용될 수 있다. 또한, 본 발명은 다양한 오거노이드에 범용 적용 가능한 표준화된 약물 처리 전 후의 약물 반응성 확인 및 약물 스크리닝 기술을 제공한다.
도 1은 BRCA2 및/또는 TERC 유전자 결실 돌연변이 마우스 유래 췌장 오거노이드의 배양 모습을 도립 현미경 (Zeiss)을 통하여 관찰한 이미지이다.
도 2a는 오거노이드에서의 유전자 변이 (BRCA2 유전자의 엑손 11 결실 (Brca2 F11/F11 ), TERC 유전자의 넉아웃 (mTR -/- ), 및 CreERTM 유전자 삽입 (CreER TM )을 확인한 젤 전기영동 결과를 보여주는 사진이다 (M: 밴드 사이즈 구분을 위한 DNA 마커, DW(증류수): PCR 의 음성 대조군(negative control), WT: 야생형(wild-type), Brca2 F11/F11 : Brca2 엑손 11 번에 loxP가 플랭크된 것을 확인한 밴드, mTR -/- : TERC 유전자가 넉아웃된 것을 확인한 밴드, Cre-ER TM : Cre 재조합효소 유전가 삽입된 것을 확인한 밴드).
도 2b는 도 2a에서 BRCA2 F11/F11 유전형을 가진 것으로 확인된 오거노이드에 4-OHT 처리 여부에 따른 PCR 산물을 보여주는 젤 전기영동 결과로서, (-)는 4-OHT를 처리하지 않은 경우의 결과이고, (+)는 4-OHT를 처리하여 BRCA2 유전자의 엑손 11의 결손을 유도한 경우의 결과이다.
도 3은 BubR1의 K243R 변이 유전자 이식된 변이 마우스 유래 췌장 오거노이드 배양 결과를 도립 현미경 (Zeiss)을 통하여 관찰한 이미지이다.
도 4는 유전자 변이 마우스 (BubR1 K243R/+ ) 유래 췌장 오거노이드에서의 BubR1의 K243R 변이 유전자의 삽입 여부를 확인한 젤 전기영동 결과를 보여주는 사진이다 (M: 밴드 사이즈 구분을 위한 DNA 마커, DW(증류수): PCR 의 음성 대조군(negative control)).
도 5a는 BRCA2 유전자가 정상인 오거노이드 (4-OHT 미처리) 및 BRCA2가 부분적으로 결실된 오거노이드(4-OHT 처리)를 확인한 젤 전기영동 결과를 보여주는 사진이다.
도 5b는 BRCA2 유전자 결실 마우스(Brca2 F11/F11 ;CreER TM ) 유래 췌장 오거노이드에 히스톤 디아세틸라아제 억제제 (HDACi)를 처리한 모습을 보여주는 사진이다.
도 6은 BRCA2 유전자 결실 마우스(Brca2 F11/F11 ;CreER TM ) 유래 췌장 오거노이드에 PARP-1 억제제 또는 plk1 억제제를 단독 또는 히스톤 디아세틸라아제 억제제 (HDACi)와 함께 처리한 모습을 보여주는 사진이다.
도 7은 IncuCyte S3 Live-Cell Analysis System (Essen bioscience) 장비를 이용하여 생존 세포 추적을 통해 야생형 유전자를 가진 마우스 췌장 오거노이드에 TSA(Trichostatin A)를 1uM 처리 후 24시간 동안 관찰한 결과이다(Scale bar: 2.1 mm).
도 8은 교배를 통해 3번의 세대를 거친 (G3) Brca2 F11/F11 ; mTR -/- ; Cre-ER TM 마우스로부터 췌장 오거노이드에 4-히드록시타목시펜(4-OHT)를 처리 여부에 따른 오거노이드 성장 정도를 보여주는 사진이다.
도 9는 BubR1 K243R/+ 마우스 유래 췌장 오거노이드의 면역형광분석 결과를 보여주는 형광 이미지로서, 왼쪽은 야생형 마우스 유래 췌장 오거노이드의 결과를, 오른쪽은 BubR1 K243R/+ 마우스 유래 췌장 오거노이드의 결과를 각각 보여준다.
도 10은 BubR1 K243R/+ 마우스 췌장 오거노이드의 AR-42 (상단) 및 ACY-241 (하단)에 대한 약물반응성을 보여주는 현미경 사진이다.
도 11은 마우스 BubR1 단백질의 구조를 보여주는 모식도이다.
도 12는 오거노이드 배양단계에서 기계적 응력(mechanical stress)을 가하여 물리적으로 해리시키는 단계를 더 포함하는지 여부에 따른 오거노이드 크기의 균일성 정도를 비교한 결과이다.
도 13은 K-ras G12D 돌연변이 마우스의 췌장 오거노이드와 야생형(wild type) 오거노이드에 각각 Resveratrone 약물을 100 μM, 200 μM, 500 μM를 처리한 후 5일째 되는 날 도립 현미경(inverted microscope; Zeiss)으로 관찰한 사진이다.
도 14a는 KrasG12D 돌연변이 마우스의 췌장 오거노이드에 레스베라트론 약물을 각각 0 μM, 200 μM, 또는 500 μM를 처리한 후 GFP를 확인한 결과를 보여준다.
도 14b는 KrasG12D 돌연변이 마우스의 췌장 오거노이드에 레스베라트론 약물을 각각 0 μM, 200 μM, 또는 500 μM를 처리한 후 5일째 되는 날 생존 능력을 TUNEL 방법으로 TdT 효소가 포함되어 있는 염색 시약과 DAPI 시약을 각각 처리한 결과를 보여준다.
도 14c는 KrasG12D 돌연변이 마우스의 췌장 오거노이드에 레스베라트론 약물을 각각 0 μM, 200 μM, 또는 500 μM를 처리한 후 5일째 되는 날 생존 능력을 MTT 방법으로 염색 시약(staining solution)을 넣어 측정한 결과를 보여준다.
도 14d는 KrasG12D 돌연변이 마우스의 췌장 오거노이드에 레스베라트론 약물을 각각 0 μM, 200 μM, 또는 500 μM를 처리하여 MTT 방법으로 생존 능력을 측정한 값을 그래프로 나타낸 결과이다.
도 15는 마우스 유래 또는 환자 유래 췌장 오거노이드에 레스베라트론 약물을 처리한 후 약물에 대한 반응성을 보기 위하여 p53 발현정도를 웨스턴 블롯 기법을 통해 확인한 결과이다.
이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하나, 이는 예시적인 것에 불과할 뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 아래 기재된 실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있음은 당업자들에게 있어 자명하다.
실시예 1: 유전자 이식 쥐에서 유래한 췌장 오거노이드의 구축
박테리오파지 P1을 이용한 Cre-loxP 재조합을 통하여 BRCA2 유전자의 엑손 11 위치에 loxP 를 측면 위치시켜 CreER 재조합효소를 이용한 조건적인 BRCA2의 결손 유도가 가능한 마우스(Brca2 F11Ff11 ; 엑손 11 결실)(Jos Jonkers, Ralph Meuwissen, Hanneke van der Gulden, Hans Peterse, Martin van der Valk and Anton Berns. 2001. Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer. Nature Genetics. Vol. 29, pages 418-425), 텔로머레이스 RNA 성분(TERC) 유전자를 넉아웃시켜 텔로머레이스의 활성을 상실시킨 마우스(mTR -/- ), 및 CMV 프로모터를 가진 CMV-Cre 마우스(CreER TM )를 준비하였다.
1.1. BRCA2의 엑손 11 타겟팅 벡터 제작
BRCA2 유전자좌위(locus)를 타겟팅하기 위하여, 지노믹 129/Sv 라이브러리(genomic 129/Sv library(Agilent technologies))로부터 마우스 BRCA2 유전자(NM_001081001.2)의 엑손 8-12를 포함하는 13.5-kb 람다 파지 클론을 분리하고, 상기 파지(phage inset)를 NotI로 절제하고 pGEM5 (Promega)에 서브클로닝한 후, loxP-PGKneor-PGKtk-loxP 이중선택 카세트(Thermo fisher scientific)를 마우스 BRCA2 유전자의 인트론 11의 AvrII 위치에 삽입하고, 인트론 10의 NspV 위치에 단일 loxP 부위를 상기 플로팅된 선택 카세트(floxed selection cassette)와 순방향(direct orientation)으로 삽입하였다.
1.2. 텔로머레이스 RNA 성분(Telomerase RNA component;TERC) 유전자 타겟팅 벡터 제작
텔로머레이스RNA 성분 (TERC) 유전자 (GenBank Accession No. NR_001579.1)가 완전히 결실된 마우스로서, Jackson lab (Stock No: 004132, B6.Cg-Terctm1Rdp/J)에서 입수하여 하기 실험에 사용하였다.
1.3. BRCA2의 엑손 11 결실 마우스 ( Brca2 F11/F11 ;CreER TM )의 제작
상기 실시예 1.1에서 준비된 벡터를 분리 및 정제하고 E14 서브클론 IB10의 129/Ola 유래 마우스 배아줄기세포 (ES cells) (The Netherlands Cancer Institute)에 전기천공으로 도입하였다. 서던 블롯에 의하여 플로팅된 선택마커(floxed selection marker)와 loxP 부위가 정확하게 삽입된 콜로니를 선별하고, Cre 발현 플라스미드 pOG231 (Addgene) 및 PGKpuro (Addgene)를 10:1의 몰비로 혼합한 혼합물을 상기 배아줄기세포에 전기천공으로 도입시켜 일시적으로 Cre 재조합효소 활성 및 퓨로마이신 내성을 유도하였다. 전기천공 20시간 후, 퓨로마이신(1.8㎍/ml)을 배지에 첨가하여 48시간 동안 배양하고, 사멸 세포를 제거하고, 생존 배아줄기세포를 비선택적인(non-selective) 배지에서 10일동안 추가 배양하였다. 얻어진 배아줄기세포 클론을 서던블롯팅으로 분석하여 플로팅된 마커의 성공적 결실, 단일 loxP 부위의 삽입, 및 조건적 대립유전자 생성을 확인하였다.
상기 얻어진 돌연변이 129/Ola 배아줄기세포 12 내지 15개를 C57Bl/6 배반포(blastocysts) 내에 주입하여 생식세포계열의 키메라(germline chimera)를 생성시키고, 이를 FVB/N 마우스 (Jackson Laboratory)와 교배하여 비근교계 이종접합 자손(outbred heterozygous offspring)을 생산하였다(BRCA2 conditional mutant). 상기 얻어진 BRCA2 조건 돌연변이를 Cre 마우스 (CMV 프로모터를 가진 CMV-Cre 마우스 (CreER TM ); Jackson Laboratory, Stock No. 004847)와 교배하여 생식세포계열에서 플로팅된 대립유전자의 Cre-매개 결실을 수행하여, BRCA2 조건 결실 마우스(Brca2 F11/F11 ;CreER TM 또는 Brca2 F11/F11 ;mTR +/+ ;CreER TM 로 표시)를 제작하였다.
1.4. BRCA2의 엑손 11 결실 및 TERC 유전자 넉아웃된 마우스 ( Brca2 F11/F11 ;mTR -/- ;CreER TM )의 제작
상기 실시예 1.3에서와 같이 Brca2 F11/F11 마우스를 CreER TM 마우스와 교배하여 나온 자손으로부터 Brca2 F11/F11 ;CreER TM 마우스를 얻고, 이 Brca2 F11/F11 ;CreER TM 마우스를 mTR -/+ 마우스(실시예 1.2)와 교배하여 얻은 자손들로부터 Brca2 F11/F11 ;CreER TM ; mTR -/+ 마우스를 얻고, 이들을 교배하여 멘델리안 확률로 Brca2 F11/F11 ;CreER TM ;mTR -/- 마우스를 얻었다.
1 .5. BubR1의 K243R 변이 유전자가 이식된 마우스 (BubR1 K243R/+ )의 제작
위치 유도 돌연변이를 통해, BubR1 (GenBank NP_033903.2; 코딩 유전자: NM_009773.3)의 243 번째 라이신(K)이 아르기닌(R)으로 치환(K243R)을 유도하도록 변이된 BubR1 유전자를 pBluescript KS (+) 벡터(Addgene)를 사용하여 129/Sv 배아줄기세포 (Agilent Technologies)에 삽입하고, 이것을 C57BL/6 마우스의 배반포에 주입하여, K243R 변이를 갖는 BubR1을 암호화하는 변이 유전자가 이식된 이종접합 변이 마우스 (BubR1 K243R/+ )를 얻었다 (Inai Park et al. 2013. Loss of BubR1 acetylation causes defects in spindle assembly checkpoint signaling and promotes tumor formation. Journal of Cell Biology. 202 (2):295 참조).
실시예 2: BRCA2 및/또는 TERC 유전자 결실 돌연변이 마우스 유래 췌장 오거노이드 제작
상기 실시예 1.3, 및 실시예 1.4에서 제작한 각각의 돌연변이 마우스로부터 하기하는 방법으로 췌장 오거노이드를 제작하였다:
각각의 마우스를 안락사시킨 후 해부하여 췌장 조직을 얻었다. 해리용액(Dissociation solution)으로서 HBSS (Hank's Balanced Salt Solution; GIBCO®) 3~5 ml, 콜라게나아제P (Roche) 1mg/ml 및 DNase 1(Sigma Aldrich) 0.1mg/ml를 혼합한 혼합물을 37℃ 워터배스에서 데워서 준비하였다. 상기 얻어진 마우스 췌장 조직 전체 (Vpan=1.08mg/mm3)를 100 mm 페트리접시에 옮긴 후, 상기 준비된 해리용액 100ul를 넣고 가위나 나이프를 이용하여 5-10회 잘게 절단하였다. 잘게 절단된 췌장 조직 (Vpan=1.08mg/mm3)을 50ml 코니칼 튜브(conical tube)로 옮기고, 여기에 해리용액 3 내지 5ml를 넣고, 상기 튜브를 230 rpm 및 37℃의 진탕배양기에 넣어 인큐베이션하고, 10 내지 15분 후 꺼내어, 여기에 차가운 FBS 10-15 ml를 넣어주었다. 100㎛ 기공의 세포여과기 (cell strainer)에 상기 얻어진 해리된 췌장조직을 통과시키고, HBSS를 이용해 2-3 번 세척하였다. 세포여과기를 통과하지 못한 췌장 조직을 현미경으로 관찰하여 췌관세포를 골라 선택하였다. 선택된 췌관세포를 1500rpm으로 10분 동안 원심분리하여 펠렛을 수집한 후, HBSS로 세척하는 과정을 2회 반복하였다.
얻어진 세포 펠렛과 매트리젤(matrigel Corning) 200ul을 펠렛과 매트리젤의 부피비가 1:5이 되도록 혼합한 후, 각각 12웰 또는 24웰 플레이트에 각 웰당 12웰 플레이트 기준 100 내지 150ul의 양으로 세포 파종하였다. 세포 파종 후 약 한 시간 뒤, 매트리젤이 굳으면 배지를 12 웰 플레이트 기준 1ml, 24 웰 플레이트 기준 500ul의 양으로 넣고 37℃ 및 10% CO2의 인큐베이터에서 48 내지 72시간 이상 동안 인큐베이팅 하였다. 이 때 사용된 배양 배지 조성은 다음과 같다: DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12; Thermo Fisher Scientific)에 1%(vol/vol) 페니실린/스트렙토마이신, 10mM HEPES, 1% GlutaMAX, 1:50 B27 보충제(Gibco), 1 mM N-아세틸시스테인, 5%(vol/vol) Rspo1-배양액(Hans Clevers lab), 10 mM 니코틴아마이드, 10 nM 재조합형 인간 [Leu15]-가스트린 I(Sigma Aldrich), 50 ng/ml 재조합형 마우스 EGF(Peptron), 100 ng/ml 인간 재조합형 FGF10(Peptron), 및 25 ng/ml 재조합형 인간 노긴(Peptron) 또는 5%(vol/vol) 노긴이 포함된 배양액(Hans Clevers lab)을 혼합.
BRCA2 유전자 및/또는 TERC 유전자의 결실을 유도하기 위하여, 오거노이드에 4-히드록시타목시펜 (4-OHT)를 처리하였다. 구체적으로, 마우스에서 최초로 췌장을 분리한 후 오거노이드로 배양 구축 후 24 내지 48시간 경과한 시점부터 하기의(실시예 4 및 5 참조) 약물 스크리닝을 위한 약물 처리 시점 직전까지, 상기 오거노이드 배양액에 4-히드록시타목시펜(4-OHT)를 400nM이 되도록 녹여서 3주 이상 배양하였다.
상기와 같은 췌장 오거노이드 배양 결과를 도립 현미경(Zeiss)으로 관찰한 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타난 바와 같이, BRCA2 유전자 및/또는 TERC 유전자의 결실 여부(4-OHT 처리 여부)와 무관하게, 췌장 오거노이드가 성공적으로 생성됨을 확인할 수 있다. BRCA2 유전자가 결손된 오거노이드는 다소 형태가 작았지만 점차 배양하게 되면서 야생형과 비슷한 양상으로 성장함을 확인할 수 있다.
상기 얻어진 췌장 오거노이드를 용해시켜 추출한 지노믹 DNA에 대하여 지노믹 PCR DNA 젤 전기영동을 수행하여, 상기 오거노이드의 유전자형을 확인하였다. 구체적으로, 95℃에서 변성(denature) 1분, 55℃에서 결합(annealing) 30 초, 72℃에서 신장(elongation) 1분씩 30 사이클을 반복하여 PCR 하였고, 전기영동은 1%(w/v) 아가로스젤에 PCR 프로덕트 5ul를 5ul의 브로모페놀블루 혹은 크실렌(xylene)과 섞어 100mV로 전기영동 하였다. 이 때 사용된 프라이머는 다음과 같다:
프라이머 핵산 서열(5'→ 3') 서열번호
Brca2-11F CTCATCATTTGTTGCCTCACTTC 1
Brca2-11R TGTTGGATACAAGGCATGTAC 2
mTR-WT GCACTCCTTACAAGGGACGA 3
mTR-common CTTCAATTTCCTTGGCTTCG 4
mTR-mutant ATTTGTCACGTCCTGCACGACG 5
CRE-3F CGGCATGGTGCAAGTTGAAT 6
CRE-3R CGGTGCTAACCAGCGTTTTC 7
CRE-internal-F CTAGGCCACAGAATTGAAAGATCT 8
CRE-internal-R GTAGGTGGAAATTCTAGCATCATCC 9
상기 얻어진 결과를 도 2a 및 도 2b에 나타내었다.
도 2a는 오거노이드에서의 유전자 변이 (BRCA2 유전자의 엑손 11 결실 (Brca2 F11/F11 ), TERC 유전자의 넉아웃(mTR -/- ), 및 CreERTM 유전자 삽입 (CreER TM )을 확인한 젤 전기영동 결과를 보여주는 사진이다 (M: 밴드사이즈 구분을 위한 DNA 마커, DW: PCR의 음성 대조군(negative control), WT: 야생형, Brca2 F11/F11 : Brca2 엑손 11 번에 loxP가 플랭크된 것을 확인한 밴드, mTR -/- : TERC 유전자가 넉아웃된 것을 확인한 밴드, Cre-ER TM : Cre 재조합 유전가 삽입된 것을 확인한 밴드).
도 2b는 도 2a에서 BRCA2 F11/F11 유전형을 가진 것으로 확인된 오거노이드에 4-OHT 처리 여부에 따른 PCR 산물을 보여주는 젤 전기영동 결과로서, (-)는 4-OHT를 처리하지 않은 경우의 결과이고, (+)는 4-OHT를 처리하여 BRCA2 유전자의 엑손 11의 결손을 유도한 경우의 결과이다. 도 2b에 나타난 바와 같이, 4-OHT를 처리한 경우, 4-OHT를 처리하지 않은 경우와 비교하여 PCR 산물의 길이가 짧아지는 것을 확인할 수 있으며, 이는 BRCA2 유전자의 엑손 11의 결손을 나타낸다.
실시예 3: BubR1의 K243R 변이 유전자 이식된 heterologous 변이 마우스 유래 췌장 오거노이드 제작
실시예 2의 방법을 참조하여, 상기 실시예 1.5에서 제작한 BubR1의 K243R 변이를 유도하는 변이 유전자가 넉-인된 이종접합 변이 마우스 (BubR1K243R/+)로부터 췌장 오거노이드를 제작하였다. 비교를 위하여, 야생형 마우스 유래의 췌장 오거노이드를 실시예 2를 참조하여 제작하였다.
상기 얻어진 췌장 오거노이드를 도립 현미경(Zeiss)으로 관찰한 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 바와 같이, 아생형 마우스와 마찬가지로, 변이 마우스 (BubR1K243R/+)로부터 성공적으로 췌장 오거노이드를 생성할 수 있음을 확인할 수 있다.
상기 얻어진 췌장 오거노이드를 용해시켜 추출한 지노믹 DNA에 대하여 지노믹 PCR DNA 젤 전기영동을 수행하여, 상기 오거노이드의 유전자형을 확인하였다. 구체적으로, 95℃에서 변성(denature) 1분, 55℃에서 결합(annealing) 30 초, 72℃에서 신장(elongation) 1분씩을 30 사이클을 반복하여 PCR 하였고, 전기영동은 1% 아가로스젤에 PCR 프로덕트 5ul 를 5ul 의 브로모페놀블루 혹은 크실렌과 섞어 100mV로 전기영동 하였다. 이 때 사용된 프라이머는 다음과 같다:
프라이머 핵산서열(5'→ 3') 서열번호
BubR1K243R/+ F GAGGTAAAGGCAGGGGAATC 10
BubR1K243R/+ R GAGAAAGCGGGGGTCATTAT 11
상기 얻어진 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4는 유전자 변이 마우스 (BubR1 K243R/+ ) 유래 췌장 오거노이드에서의 BubR1의 K243R 변이 유전자의 삽입 여부를 확인한 젤 전기영동 결과를 보여주는 사진이다 (M: 밴드사이즈 구분을 위한 DNA 마커, DW: PCR의 음성 대조군(negative control)). 도 4의 BubR1 K243R/+ 으로 표기된 레인에서 확인되는 바와 같이, 145bp 및 219bp에서 밴드가 관찰되며, 이는 해당 유전자의 넉-인이 성공적으로 일어나 있음을 의미한다.
실시예 4: 돌연변이 마우스 유래 췌장 오거노이드의 약물 반응성 시험
상기 실시예 2의 방법을 참조하여, BRCA2 유전자 결실 마우스(Brca2 F11/F11 ;CreER TM ) 유래 췌장 오거노이드를 준비하고, BRCA2 유전자의 부분적 결실 (엑손 11의 결실)을 유도하기 위하여, 4-히드록시타목시펜(4-OHT)를 400nM의 양으로 첨가하여 3주 이상 배양하였다 (상기 실시예 2 참조). 비교를 위하여, 4-OHT 처리되지 않은 오거노이드 (BRCA2 유전자가 정상임)를 함께 준비하였다. 도 5a는 BRCA2 유전자가 정상인 오거노이드 (4-OHT 미처리) 및 BRCA2가 부분적으로 결실된 오거노이드(4-OHT 처리)를 확인한 젤 전기영동 결과를 보여주는 사진이다.
BRCA2 유전자가 정상인 오거노이드 (4-OHT 미처리) 및 BRCA2가 부분적으로 결실된 (엑손 11 결실) 오거노이드를 동일한 양으로 24 웰 플레이트에 세포 파종하였다. 세포 파종한 다음 날, 항암제인 히스톤 디아세틸라아제 억제제(HDACi)를 배양 배지(실시예 2 참조)와 혼합하여 오거노이드에 처리하였다. 이 때 사용된 HDACi 종류와 처리 농도를 아래의 표 3에 나타내었다:
HDACi 종류 처리 농도
Trichostatin A (TSA) 1uM
suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) 17uM
LMK-235 3uM
FK-228, Romidepsin 10nM
이 때 이미 BRCA2 가 넉아웃된 췌장 오거노이드에 HDACi와 4-OHT의 처리는 동시에 수행하지 않았다.
HDACi 처리(1차 처리) 3일 후에 배양 배지를 새 배지로 교체하고 각 HDACi를 표 3에 기재된 농도로 다시 처리(2차 처리)하였다. 다만 오거노이드 세포 파종 후 24 내지 48 시간 정도 시간이 지난 후 첫 번째 HDACi 를 처리하였고 그로부터 3일 뒤 2차 처리를 하였습니다. HDACi의 1차 처리 후 6일 되는 시점에 도립 현미경을 이용하여 상기 HDACi 처리된 오거노이드의 모습을 관찰하였다.
상기 얻어진 결과를 도 5b에 나타내었다. 도 5b에 나타난 바와 같이, 시험된 약물에 대한 반응성이 BRCA2 유전자 유무에 따라 상이하게 나타나는 것을 관찰하였고, 이를 통해 Brca2 F11/F11 마우스 췌장 오거노이드가 BRCA2 유전자와 관련된 약물의 효과 확인 및/또는 약물 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있음을 확인할 수 있다.
또한, 상기한 방법으로, PARP-1 억제제인 Olaparib (10uM), 또는 plk1 억제제인 BI2536(10nM)을 단독 또는 HDACi(TSA 200nM)와 조합하여 처리한 경우의 오거노이드의 모습을 관찰하여 그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타난 바와 같이, 시험된 약물에 대한 반응성이 BRCA2 유전자 유무에 따라 상이하게 나타나는 것을 관찰하였고, 이를 통해 Brca2 F11/F11 마우스 췌장 오거노이드가 BRCA2 유전자와 관련된 약물의 효과 확인 및/또는 약물 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있음을 확인할 수 있다.
또한, IncuCyte S3 Live-Cell Analysis System (Essen bioscience) 장비를 이용하여 생존세포 추적을 통해 야생형 유전자를 가진 마우스 췌장 오거노이드에 TSA(Trichostatin A)를 1uM 처리 후 24시간 동안 관찰한 결과를 도 7에 나타내었다. 각각의 이미지는 4시간 단위로 촬영된 이미지이다. 스케일 바는 2.1 mm를 나타낸다.
실시예 5. Brca2 F11/F11 ;mTR -/- ;Cre-ER TM 마우스 췌장 오거노이드를 지속 배양하여 텔로머레이스 결손 암화 모델( telomerase knock out cancer model; TKCM) 구축
Brca2 F11/F11 ;mTR -/- ;Cre-ER TM 마우스끼리 교배를 통해 3번의 세대를 거쳐 얻어진 Brca2 F11/F11 ;mTR -/- ;Cre-ER TM generation 3 (G3) 마우스의 췌장 오거노이드를 통해 텔로머레이스 없이도 텔로미어의 길이를 유지하여 지속 분열하는 텔로머레이스 결손 암화 모델(telomerase knock out cancer model; TKCM)을 구축하였다. 기존의 암화 유도 기작 연구에서 사용된 이차원 배양 암화 유도 세포주가 가지는 단점, 즉 유전체적 변이가 이미 축적되어 있고, 체내 환경적 특성을 모두 반영하지 못한다는 단점을 극복하기 위해, Brca2F11/F11;mTR-/-;Cre-ERTM 마우스의 3중 교배를 통한 TKCM 마우스 (G3)를 제작하였다. 또한, 해당 마우스에서 장기의 체내 환경을 모사하고 성장 저해 여부를 직접적으로 확인할 수 있는 췌장 유래 오거노이드를 구축하고, 실제 암화가 유도되는 것을 확인하였다.
보다 구체적으로, 상기 마우스 췌장 오거노이드 암화 모델 구축을 위하여, 실시예 2를 참조하여, 교배를 통해 3번의 세대를 거친 (G3) Brca2 F11/F11 ; mTR -/- ; Cre-ER TM 마우스로부터 췌장 오거노이드를 구축한 후, 타목시펜(4-OHT)을 미처리 혹은 처리하여 Brca2 결손을 유도하지 않거나 유도하였다. 4-OHT 처리량은 400nM로 하였으며, 췌장 오거노이드를 플레이트에 세포 파종하고 하루 뒤부터 약물 처리 전까지 2일에 한번씩 지속적으로 처리하였다. 그 후, 3일에 한번씩 오거노이드를 도립 현미경(inverted microscope; Zeiss)으로 관찰하여 도 8에 나타내었다. 도 8에 나타난 [I], [II], [III] 순서대로 10일째 되는 날 계대를 하여 성장 정도를 비교하였다.
[I] Brca2 와 TERC가 함께 결손된 오거노이드(+4-OHT)가 TERC만 결손된 오거노이드(-4-OHT)에 비해 다소 성장이 더딘 것을 확인하였다.
[II] (상기 [I]의 오거노이드로부터 기계적으로 분리하여 성장정도 비교) TERC 단독 결손 오거노이드(-4-OHT)는 이전 계대에 비해 성장이 저해되고 있음을 확인하였고, TERC 와 Brca2가 함께 결손된 오거노이드(+4-OHT)는 이전 계대에 비해 성장이 완화된 것을 확인하였다.
[III] (상기 [II]의 오거노이드로부터 기계적으로 분리하여 성장정도를 비교)TERC 단독 결손 오거노이드(-4-OHT)는 성장이 크게 저하되어 더 이상 지속 가능한 배양이 불가능한 것을 확인한 것에 비해, TERC와 Brca2가 함께 결손된 오거노이드(+4-OHT)는 지속적인 배양이 가능한 상태임을 확인하였다. 이러한 결과는 상기 암화 유도 기작이 활성화되어 암화가 진행되는 오거노이드가 배양되었음을 확인시켜주는 것이다.
실시예 6. BubR1 K243R/+ 쥐 췌장 오거노이드에 면역형광검사(Immunofluorescence assay ;IFA)를 통한 이미징
실시예 2 및 3을 참조하여, BubR1 K243R/+ 마우스 췌장 오거노이드를 배양한 후, DAPI (파란색), 튜블린 (초록색), 및 BubR1 (빨간색) 염색을 통해, 구축된 오거노이드가 유전체 불안정성을 연구하는 새로운 모델로서 활용 가능함을 확인하였다.
우선, 배양된 오거노이드를 15ml 코니컬 튜브로 옮긴 후, 저온의 PBS를 15ml까지 채우고, 1200 rpm으로 5분동안 원심분리 하고, PBS로 세척하는 과정을 3회 반복하여 매트리젤을 제거하였다. 4%(w/v) 파라포름알데하이드(paraformaldehyde; PFA)를 넣어 세포를 고정하고, 30분 동안 인큐베이션한 후, PBS로 3회 세척하였다. 트리톤 X-100(Triton X-100) 용액 (in PBS; 농도: 1%(v/v))을 세포 시료에 넣고 1시간동안 인큐베이션한 후, 트리톤 X-100용액 (in PBS; 농도: 2%(v/v))을 넣어주고 2회 세척하였다. 그 후, 차단버퍼 (BSA 0.279g, 염소 혈청 450ul, 트리톤 X-100 180ul, PBS 20X 450ul, DW 7920ul)를 넣고 30분 동안 인큐베이션하였다. BubR1 항체(BD bioscience)를 처리하고 16시간 동안 인큐베이션하였다. 0.2%(v/v) PBS-T (Triton X-100 solution in PBS)로 20분간 3회 세척하였다. HRP 태그가 달린 이차 항체(Thermo Fisher Scientific)를 넣고 16시간 동안 인큐베이션하였다. 0.2%(v/v) PBS-T로 20분간 3회 세척하고, FITC 컨쥬게이션된 튜블린 항체(Abcam)를 1:1000 비율로 처리하고 2일 동안 인큐베이션하였다. 0.2%(v/v) PBS-T로 20분간 3회 세척 후, DAPI를 넣고 하루동안 인큐베이션하였다. 상층액 제거 후, 8웰챔버(well chamber)로 옮겨 공초점 현미경을 사용해 형광 이미지를 관찰하였다.
상기 관찰된 형광 이미지를 도 9에 나타내었다. 도 9의 왼쪽은 야생형 마우스로부터 유래한 췌장 오거노이드의 결과이고, 오른쪽은 BubR1 K243R/+ 마우스로부터 유래한 췌장 오거노이드의 결과이다.
실시예 7. BubR1 K243R/+ 마우스 췌장 오거노이드의 약물 반응성 시험
실시예 2 및 3을 참조하여, BubR1 K243R/+ 마우스 췌장 오거노이드를 배양한 후, 하기의 단계를 수행하여 약물 반응성을 시험하였다:
BubR1 K243R/+ 마우스로부터 분리한 췌장 조직을 해리시키고, 해리된 췌장 조직으로부터 췌관 세포를 포함하는 세포 펠렛을 수집한 후, 수집된 세포 펠렛을 생체 기질 물질과 함께 37℃, 5% 탄산 가스 세포배양기에서 키웠다(실시예 2 및 3 참조). 얻어진 오거노이드를 파이펫 말단의 직경, 배양액의 용량, 및 압력을 가하는 횟수를 고려하여 기계적 응력으로 파쇄(mechanically dissociation)하였다. 상기의 기계적 응력은 3 내지 30000 파스칼(PA)인 것이 바람직하고, 3 내지 3000 파스칼인 것이 더욱 바람직하며, 50 내지 3000 파스칼인 것이 더욱 바람직하며, 50 내지 500 파스칼인 것이 더욱 바람직하다. 예를 들면, 말단의 직경이 9mm인 파이펫을 사용하는 경우, 1ml의 배양액으로 15회 파이펫팅 하는 것이 바람직하다. 이후, 매트리젤로 재부유(resuspension)하고, 세포 파종하여, 오거노이드가 100 내지200㎛ 사이즈로 자랄 때까지 오거노이드 배양 배지에서 키웠다. 그 후, 200㎛ 이상의 거대 오거노이드를 필터하여 제거하고, 약물을 오거노이드 배양 배지에 희석한 후 오거노이드에 처리하였다. 도립 현미경으로 오거노이드 형태 관찰 및 다양한 분석(assay)을 통해 생존 능력(viability)를 측정하였다.
상기 오거노이드 배양 배지 조건은 아래와 같다: DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12; Thermo Fisher Scientific)에 1%(vol/vol) 페니실린/스트렙토마이신, 10mM HEPES, 1% GlutaMAX, 1:50 B27 첨가물(Gibco), 1 mM N-아세틸시스테인, 5%(vol/vol) Rspo1이 포함된 배양액(Hans Clevers lab), 10 mM 니코틴아마이드, 10 nM 재조합형 인간[Leu15]-가스트린 I(Sigma Aldrich), 50 ng/ml 재조합형 마우스 EGF(Peptron), 100 ng/ml 재조합형 인간 FGF10(Peptron), 및 25 ng/ml 재조합형 인간 노긴(Peptron) 또는 5%(vol/vol) 노긴 포함된 배양액(Hans Clevers lab)을 혼합.
약물로서 panHDAC 억제제인 AR-42 (N-hydroxy-4-[[(2S)-3-methyl-2-phenylbutanoyl]amino]benzamide; CAS No. 935881-37-1)와 HDAC6 억제제인 ACY-241 (Citarinostat; CAS No. 1316215-12-9)을 각각 5uM 처리하고 3일째에 도립현미경(inverted microscope; Zeiss)으로 관찰한 사진을 도 10에 나타내었다.
실시예 8. 표준화된 약물 처리 방법의 개발
상기 실시예 1 내지 7에 기재된 유전자 변이 마우스로부터 분리된 췌장 조직을 해리 시켰다. 해리된 췌장 조직으로부터 췌관 세포를 포함하는 세포 펠렛을 수집하였고, 수집된 세포 펠렛을 생체 기질 물질과 함께 37℃, 5% 탄산 가스 세포배양기에서 키웠다. 그 후 생성된 오가노이드의 75% 이상이 직경 200 내지 500 μm 사이즈로 자랄 때까지 오거노이드 배양 배지에 키웠다. 자란 오거노이드를 50 내지 500 파스칼의 강도로 물리적 해리(mechanically dissociation)시켜 칩 또는 플레이트에 직경 100 내지 200 μm 사이즈의 오거노이드가 90% 이상이 되도록 생체 기질 물질과 함께 37℃, 5% 탄산 가스 세포배양기에서 하루 동안 키웠다. 약물을 오거노이드 배양 배지에 희석한 후 해당 오거노이드에 처리하였다. 이와 같은 과정을 거친 후 도립 현미경으로 오거노이드 형태 관찰 및 MTT assay를 통하여 생존 능력(viability)을 측정하였다. 측정 결과, 상기 약물 처리 방법을 사용하였을 때, 기존 오거노이드에서의 약물 스크리닝 방법의 한계였던 각각의 오거노이드의 약물 처리 반응에 대한 추적이 가능하게 되었으며, 균등한 사이즈 상태에서의 약물 처리가 가능한 것을 확인할 수 있었다. 도 12는 세포펠렛을 수집하여 배양하는 단계에서 기계적 응력을 가하여 물리적 해리시키는 단계를 더 포함한 2스텝 과정을 거친 경우와 그렇지 않은 경우 오거노이드 크기의 균일성을 비교한 결과이다. 수집된 오거노이드의 평균 직경의 최대값이 커질수록, 포함된 오거노이드들의 크기(평균 직경) 간의 오차가 커져서, 동일한 약물에 대하여 각각의 오거노이드가 나타내는 반응성의 차이가 커지게 되므로, 균질한 약물 반응성 결과를 얻기 위하여, 오거노이드의 크기(평균 직경)의 상한값을 결정하는 것이 중요하다. 본 발명은 상기 오거노이드에 기계적 응력을 가하여 2스텝으로 후 처리하여, 수득된 오거노이드 크기를 균일화함으로써 약물반응성을 증대시키는 현저한 효과가 있음을 확인하였다. 이는 췌장뿐만 아니라 다른 조직의 오거노이드 배양시 균일한 수득률을 획득하는데 사용 가능할 것으로 기대된다.
실시예 9. 유전자 돌연변이 Kras G12D 쥐의 오거노이드에 약물 처리 후 반응 관찰
실시예 8을 참조하여 K-ras G12D 돌연변이 마우스와 야생형 (wild type) 마우스로부터 균등한 사이즈의 췌장 오가노이드를 제조하고, 오거노이드에 각각 레스베라트론(Resveratrone)약물을 100 μM, 200 μM, 500 μM를 처리한 후 5일째 되는 날 도립 현미경(inverted microscope; Zeiss)으로 관찰한 사진을 도 13에 나타내었다. 레스베라트론은 레스베라트롤에서 유래한 신규 물질이다. 실시예 5와 같이 일반적인 12 웰 플레이트에서 오거노이드를 기르고 약물 처리한 경우 오거노이드의 크기가 직경 20μm에서 1000μm까지 다양하기에 각각의 오거노이드 추적이 불가능한 반면, 실시예 8을 참조하여 실험한 경우에는 오거노이드의 크기가 균등하게 세포 파종된다는 점과 각각의 오거노이드 형태 및 양상 추적이 가능하다는 장점이 있음을 확인하였다.
실시예 10. 유전자 돌연변이 Kras G12D 쥐의 오거노이드에 약물 처리 후 생존 능력(viability) 측정 방법 최적화
TUNEL 방법의 경우 죽어가는 세포가 형광을 띄게 되는 방법이다. 실시예 9와 마찬가지로 실시예 8을 참조하여 KrasG12D 돌연변이 마우스의 췌장 오거노이드에 레스베라트론 약물을 처리하였다. 상기 약물은 세포가 죽어갈 때 초록색 형광을 띄는데, 이 약물을 각각 0 μM, 200 μM, 500 μM를 처리한 후 GFP를 확인하였다(도 14a 참조). 실험 결과, KrasG12D 돌연변이 마우스의 췌장 오거노이드에 레스베라트론 약물을 적정농도 200 μM로 처리한 경우 형광을 띄고, 고농도 500 μM로 처리한 경우 세포사멸을 일으켜 GFP가 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 이 때, 정상 췌장 오거노이드에서는 영향이 없는 것으로 나타났다. 상기 약물을 처리한 후 5일째 되는 날 생존 능력을 TUNEL방법으로 TdT 효소가 포함되어 있는 염색 시약(staining solution)과 DAPI 시약을 각각 처리하여 측정한 결과를 도 14b에 나타내었다. MTT 방법은 대사 활동을 측정하는 방법으로 살아있는 세포에서 색을 띄게 되는 방법이다. 실험 결과, 시약이 오거노이드 내로 제대로 침투되지 않아 염색이 되지 않으며, 따라서 상기 방법으로 세포의 생존 능력을 확인하는 것이 불가능한 것을 알 수 있었다. 실시예 9와 마찬가지로 실시예 8을 참조하여 KrasG12D 돌연변이 마우스의 췌장 오거노이드에 레스베라트론 약물을 처리하였다. 상기 약물을 각각 0 μM, 200 μM, 500 μM 를 처리한 후 5일째 되는 날 생존 능력을 MTT 방법으로 각각의 염색 시약(staining solution)을 넣어 측정한 결과를 도 14c 에 나타내었다.
상기 TUNEL 방법과 MTT 방법으로 오거노이드 생존 능력(viability)을 측정한 결과를 비교하여 보았다. TUNEL 방법을 오거노이드에 적용하여 생존 능력을 측정하였을 때는 약물 처리한 것과 그렇지 않은 것과의 차이가 없었다(도 14a 및 도 14b 참조). 해당 시약이 투과되지 않아 생존능력을 측정하기 어려운 것을 확인할 수 있다. 반면, MTT 방법을 오거노이드에 적용하여 약물 처리한 오거노이드의 생존 능력을 측정하였을 때는 살아있는 세포가 많을수록 색을 진하게 띄는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 정량화할 수 있음을 확인하였다(도 14d 참조).
실시예 11. 웨스턴 블롯(western blot)기법을 이용하여 특이 마커의 발현정도 확인을 통한 췌장 오거노이드 약물 반응성 검증
상기 실시예 1 내지 7에 기재된 마우스 유래 또는 환자 유래 오거노이드에 1차 약물 처리하고, 72시간 이후 2차 약물 처리를 하였다. 상기 약물은 실시예 9 및 10에서 이용한 레스베라트론을 사용하였다. 2차 약물 처리 후 2일차(1차 약물 처리 후 5일 차)에 세포 배양액을 제거한 후 PBS 1ml로 세척하였다. PBS 제거 후 리커버리 솔루션 500 μl를 넣어 물리적 해리(mechanical dissociation)시켰다. 4 ℃에서 1시간 동안 50 내지 70 rpm으로 교반하고, 마이크로튜브로 옮긴 후 1200 rpm으로 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. 남아있는 펠렛을 NETN 버퍼로 용해시킨 후, 초음파 세포파쇄기(Sonicator)를 이용해 2 내지 3 아웃풋으로 1분 동안 파쇄(sonication)하고, 12000rpm으로 20 내지 30 분간 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 해당 상층액(supernatant)은 Bradford 분석(assay)을 이용하여 100 내지 120 μg으로 정량한 후 10% 폴리 아크릴아마이드겔에 로딩하여 SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide gel electrophoresis) 겔 러닝하였다. 이후 겔을 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮겨 트렌스퍼된 멤브레인은 5% 스킴밀크로 RT에서 1시간 동안 50 rpm으로 교반하면서 블럭킹하였다. 웨스턴 블롯 기법을 이용하여 항-p53 항체를 4℃에서 18 시간 동안 처리하고, 2차 항체를 RT에서 3시간 동안 처리한 후 필름에 인화하였다.
종양 억제(Tumor suppressor) 유전자인 p53은 세포 주기를 조절함으로써 세포의 이상 증식을 억제하고 암세포 등의 세포 자멸을 유도하는 것으로 알려져 있다. 보통 p53은 암세포에서 비활성화되어 있으며, 도 15를 참조하면 레스베라트론을 추가로 처리하였을 때, 해당 약물에 대한 반응이 마우스 유래 정상 오거노이드와 돌연변이 오거노이드 (암 유사)에서 특이적으로 다르게 발현이 되는 것을 확인할 수 있었다. 정상 오거노이드에서는 약물을 처리함에 따라 p53 발현 정도가 높아지는 반면, 돌연변이 오거노이드에서는 그렇지 않음을 확인하였으며, 환자 유래 오거노이드에서도 이와 같은 경향성을 띄는 것을 확인하였다(도 15 참조). 이를 통해 해당 기법을 사용하여 정상세포와 암세포에 따른 해당 약물에 대한 반응성을 보기 위한 마커로서 p53를 사용할 수 있을 것으로 기대된다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Pancreatic Organoid Derived from Mutant Mouse and Use thereof and Standardized Method for Identifying Drug Efficacy <130> PDPB192037k01 <150> KR 10-2018-0075560 <151> 2018-06-29 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse Brca2-11F primer <400> 1 ctcatcattt gttgcctcac ttc 23 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Brca2-11R primer <400> 2 tgttggatac aaggcatgta c 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mTR-WT primer <400> 3 gcactcctta caagggacga 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mTR-common primer <400> 4 cttcaatttc cttggcttcg 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mTR-mutant primer <400> 5 atttgtcacg tcctgcacga cg 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRE-3F primer <400> 6 cggcatggtg caagttgaat 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRE-3R primer <400> 7 cggtgctaac cagcgttttc 20 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRE-internal-F primer <400> 8 ctaggccaca gaattgaaag atct 24 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRE-internal-R primer <400> 9 gtaggtggaa attctagcat catcc 25 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BubR1K243R/+ F primer <400> 10 gaggtaaagg caggggaatc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BubR1K243R/+ R primer <400> 11 gagaaagcgg gggtcattat 20

Claims (16)

  1. 텔로머레이스(telomerase)가 결실되고, BRCA2 엑손 11 결실이 유도된 암 동물 모델.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 텔로머레이스 결실은 텔로머레이스 RNA 성분(Telomerase RNA component)의 넉아웃으로 유도되는 것을 특징으로 하는, 암 동물 모델.
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 암은 췌장암인 것을 특징으로 하는, 암 동물 모델.
  5. 제 1항의 동물 모델로부터 제조된 암 오거노이드.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 암 오거노이드는 췌장암 오거노이드인 것을 특징으로 하는, 암 오거노이드.
  7. (a) 제 1항의 동물 모델로부터 조직을 수득하는 단계; 및,
    (b) 상기 조직으로부터 분리된 세포를 매트리젤과 혼합하여 프리-오거노이드(pre-organoid)로 배양하는 단계;를 포함하는, 암 오거노이드의 제조방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 조직은 췌장 조직인 것을 특징으로 하는, 암 오거노이드의 제조방법.
  9. 제 7항에 있어서,
    상기 (b)단계 이후에,
    (c) 프리-오거노이드를 50 내지 500 파스칼의 기계적 응력으로 파쇄하는 단계; 및,
    (d) 파쇄된 오거노이드를 재배양하는 단계;를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 암 오거노이드의 제조방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 암 오거노이드는 직경 100 내지 200um인 것을 특징으로 하는, 암 오거노이드의 제조방법.
  11. (a) 제 7항 내지 제 10항 중 어느 하나의 방법으로 암 오거노이드를 제조하는 단계;
    (b) 상기 오거노이드에 암 치료용 후보 약물을 처리하는 단계; 및,
    (c) 상기 오거노이드의 세포생존율(viability)을 측정하는 단계;를 포함하는 암 치료용 후보 약물의 효과를 검증하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 암은 췌장암인 것을 특징으로 하는, 암 치료용 후보 약물의 효과를 검증하는 방법.
  13. 제 11항에 있어서,
    상기 약물은 히스톤 디아세틸라아제 억제제(HDACi), PARP-1(Poly [ADP-ribose] polymerase 1) 억제제, 및 plk1 (polo-like kinase 1) 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 암 치료용 후보 약물의 효과를 검증하는 방법.
  14. (a) 제 7항 내지 제 10항 중 어느 하나의 방법으로 암 오거노이드를 제조하는 단계;
    (b) 상기 오거노이드에 암 치료용 후보 약물을 처리하는 단계; 및,
    (c) 종양 억제 유전자 p53을 코딩하는 핵산, 또는 이로부터 합성된 단백질에 특이적으로 결합하는 바이오 마커의 발현을 확인하는 단계;를 포함하는 암 치료용 후보 약물의 반응성을 검증하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 암은 췌장암인 것을 특징으로 하는, 암 치료용 후보 약물의 반응성을 검증하는 방법.
  16. 제 14항에 있어서,
    상기 약물은 히스톤 디아세틸라아제 억제제(HDACi), PARP-1(Poly [ADP-ribose] polymerase 1) 억제제, 및 plk1 (polo-like kinase 1) 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 암 치료용 후보 약물의 반응성을 검증하는 방법.

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