ITPI20100085A1 - Procedimento per l'ingegnerizzazione genetica di cellule staminali che attivano un tracciante fluorescente vitale in seguito al differenziamento in vitro delle cellule stesse verso il tipo cellulare specifico dei neuroni serotoninergici. - Google Patents
Procedimento per l'ingegnerizzazione genetica di cellule staminali che attivano un tracciante fluorescente vitale in seguito al differenziamento in vitro delle cellule stesse verso il tipo cellulare specifico dei neuroni serotoninergici. Download PDFInfo
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Description
2. DESCRIZIONE
Stato dell’arte
I brevetti, le domande di brevetto e gli articoli scientifici citati in questa parte, sono elencati per esteso come riferimenti bibliografici.
La serotonina (5-ΗΤ) è un importante neurotrasmettitore che svolge un ruolo fondamentale nella regolazione di molteplici funzioni fisiologiche e comportamentali come ad esempio l'umore, la memoria, i ritmi circadiani, il comportamento alimentare e sessuale. La serotonina è inoltre coinvolta in molteplici processi che regolano lo sviluppo embrionale.
La serotonina viene prodotta dai neuroni serotoninergici, che sono localizzati nei nuclei del raphe del rombencefalo. La serotonina è sintetizzata attraverso l'azione dell’enzima chiave e limitante Triptofano idrossilasi 2, Tph2, espresso in maniera selettiva nei neuroni serotoninergici. Dai nuclei del raphe i neuroni serotoninergici proiettano a tutto il sistema nervoso centrale attraverso una diffusa rete neuronaie. L’importanza del sistema serotoninergico è supportata dall'evidenza che alterazioni a carico della normale neurotrasmissione serotoninergica sono state correlate a diversi disturbi neuropsichiatrici come ad esempio depressione, ansia, disordini bipolari, schizofrenia, disordini dell'iperattività e del deficit dell’attenzione (ADHD) e autismo.
Le cellule staminali embrionali sono cellule derivate dalla massa cellulare interna dell'embrione dì mammifero ad uno stadio precoce di sviluppo e presentano due fondamentali caratteristiche: possono replicarsi in vitro in maniera indefinita (auto-rinnovamento) e hanno la potenzialità di originare tutti i tipi cellulari presenti in un individuo adulto (totipotenza). Per questi motivi le cellule staminali embrionali possono essere coltivate in vitro in maniera indefinita e nelle opportune condizioni di coltura possono essere indotte a generare tipi cellulari specifici (differenziamento cellulare). Le cellule staminali embrionali rappresentano quindi un eccellente modello per studiare i meccanismi molecolari che sottendono il differenziamento verso tipi cellulari specifici e sono alla base di nuovi campi della medicina come la terapia cellulare e la medicina rigenerativa.
Negli ultimi anni sono stati elaborati diversi metodi per ottenere il differenziamento in vitro di cellule staminali embrionali verso tipi cellulari specifici e, in particolare, per quanto riguarda il differenziamento in vitro in senso neurale, recentemente sono stati descritti diversi protocolli. In generale le strategie note possono essere raggruppate in due approcci di base: (i) il primo si basa sulla formazione di aggregati cellulari (corpi embrioidi) contenenti derivati dei tre foglietti embrionali che mimano la situazione che nell'embrione induce la formazione del neuroectoderma fornendo appropriati segnali e contatti cellula-cellula; (ii) il secondo approccio si basa sulla coltura delle cellule staminali embrionali a bassa densità in un mezzo di coltura definito (privo di siero) limitando cosi sia i segnali dati da eventuali fattori presenti nel siero, sia il contatto cellula-cellula ed evocando quindi la via differenziativa di default verso il fenotipo neurale.
In campo biologico l'utilizzo dei geni reporter vitali, come ad esempio la proteina verde fluorescente (eGFP), permette di visualizzare in vivo sia nel tempo che nello spazio la regolazione dell'espressione genica e di poter seguire cosi nel tempo processi dinamici dei sistemi viventi. Ad oggi i tipi cellulari differenziati a partire da cellule staminali embrionali sono stati principalmente caratterizzati mediante approcci molecolari e cellulari come RT PCR o immunocitochimica o ibridazione in situ. Per questi tipi di approccio è necessaria la fissazione del preparato, processo che impedisce di poter seguire le cellule nel tempo durante processi dinamici.
La possibilità di ingegnerizzare le cellule staminali embrionali e i vantaggi associati alla sostituzione mirata di geni ("gene targeting”) per introdurre, ad esempio, la sequenza di DNA codificante per un gene reporter fluorescente vitale come eGFP in uno specifico locus genico mediante un approccio di sostituzione "knock-in", forniscono la possibilità di generare nuovi strumenti genetici che facilitano notevolmente lo studio in vitro di molteplici aspetti dello sviluppo neurale come il differenziamento, l'emissione e la crescita del processo assonale, la funzionalità e le proprietà elettriche dei neuroni. Inoltre questi strumenti genetici risultano molto utili per mettere a punto e testare nuovi protocolli per il differenziamento in vitro di cellule staminali, o per testare l'effetto dell’esposizione a numerose molecole come fattori di crescita o specifici farmaci, facilitando l’analisi delle cellule in seguito al differenziamento verso un destino neurale.
In questo contesto, le proteine fluorescenti sono state utilizzate come reporter di specifici tipi cellulari (US patent 7,105,344 B2) attraverso approcci basati sulla generazione di linee stabili di cellule staminali embrionali mediante transfezione con costrutti contenenti sequenze di DNA codificanti per proteine fluorescenti associate a sequenze promotrici di geni correlati con lo sviluppo e il differenziamento di specifici tipi cellulari. Con questa strategia l'espressione del gene reporter viene guidata da promotori tessuto/cellula specifici con l'obiettivo di ottenere linee stabili in cui il gene reporter viene espresso in specifici cellule o tessuti. Un simile approccio è stato utilizzato per generare diverse linee di cellule staminali embrionali che sono state recentemente commercializzate da Millipore (http://www.laboratorytalk.com/news/mll/mll322.html). Inoltre, per quanto riguarda il fenotipo serotoninergico, la domanda di brevetto US 2008/0118913 A1 introduce un metodo per marcare i neuroni serotoninergici mediante transgenesi.
Tuttavia, tutti gli esempi sin qui riportati sono basati sull'integrazione casuale del gene esogeno (transgene) all’interno del genoma ospite. Anche se il gene reporter introdotto nel genoma è associato a sequenze promotrici tessuto/cellula- e tempo- specifici, con questo tipo di approccio l'espressione del gene reporter può risentire del sito di inserzione del transgene nel genoma ospite. Il transgene può infatti inserirsi sia in zone di eterocromatina in cui il DNA è fortemente compattato, sia in regioni di eucromatina, nelle vicinanze di sequenze regolative per il controllo trascrizionale. Nel primo caso, nonostante la presenza di una sequenza promotrice in grado di attivare la trascrizione del transgene, la struttura eterocromatica della regione genomica può essere tale da inibire la trascrizione e prevenire l'espressione del transgene stesso, provocandone persino il silenziamento. Nel secondo caso è possibile riscontrare situazioni variabili dovute a possibili eventi modulatori da parte di sequenze regolative (“enhancers") esterne al transgene, ma poste in prossimità del suo sito d'integrazione. Un ulteriore aspetto da considerare consiste nella possibilità che il transgene si inserisca nel DNA genomico sotto forma di concatenameri alterando, in funzione del numero di copie presenti nel concatenamero, il controllo trascrizionale del transgene e, in alcuni casi, provocandone il silenziamento (Dobie et a/,1997; Garrick et al, 1998). Infine un altro aspetto limitante può essere dato dalla difficoltà di individuare sequenze promotrici in grado di guidare l'espressione del gene reporter in modo da ricapitolare il profilo di espressione del gene di interesse.
La soluzione tecnica a questo tipo di problemi viene dall’utilizzo della sostituzione mirata di geni (knock-in) mediante ricombinazione omologa nelle cellule staminali embrionali proposto nella presente domanda di brevetto per indurre l'espressione del gene reporter eGFP in maniera specifica nei neuroni serotoninergici. Infatti, la sostituzione mirata di geni (knock-in) consente di ovviare ai potenziali problemi di interferenza trascrizionale sul gene reporter correlati al sito di inserzione del transgene e alla possibile presenza di concatenameli. Inoltre con questa strategia è lo stesso promotore endogeno del gene tessuto/cellula specifico scelto ad attivare e regolare l'espressione del gene reporter. In particolare la presente domanda di brevetto si riferisce alla sostituzione mirata di un gene codificante per una proteina fluorescente vitale (es. eGFP) nel locus genico del gene della Tph2, marcatore ideale dei neuroni serotoninergici in quanto espresso in maniera selettiva nei neuroni serotoninergici a partire dalla loro genesi durante lo sviluppo. Con questo tipo di approccio il cDNA del gene per la proteina fluorescente viene sostituito alla regione codificante del gene Tph2 e quindi posto sotto il controllo trascrizionale del promotore endogeno del gene Tph2. Questo assicura una accurata e precisa regolazione dell'espressione del gene reporter, il cui pattern di espressione sarà analogo a quello del gene endogeno. Numerosi articoli scientifici e brevetti (e.s. "Pasqualetti et al, 2002" e "provisionai US patent WO 2008/082125 ΑΓ, rispettivamente) hanno suggerito come l'unione dei vantaggi di geni reporter vitali come la eGFP a quelli della sostituzione mirata di geni possa risultare molto utile per lo studio della funzione genica. Con la sostituzione mirata di geni codificanti per la proteine fluorescenti nel focus di Tph2 il cDNA ad esempio di eGFP viene introdotto in singola copia a partire dal secondo codone con la stessa cornice di lettura di Tph2 a valle del primo codone metionina del gene della Tph2 in modo che l’espressione della eGFP rispecchi quella del gene endogeno Tph2, rendendo la linea di cellule così modificata un utile sensore per il differenziamento dei neuroni serotoninergici in vitro in quanto l'espressione della proteina fluorescente si attiva in maniera specifica e selettiva nei neuroni serotoninergici a partire dalla loro genesi. Questo tipo di approccio, grazie all'espressione di eGFP, permette inoltre di identificare direttamente i neuroni serotoninergici una volta differenziati in coltura, offrendo così la possibilità di caratterizzarli in modo semplice ed accessibile.
Il principale vantaggio dell'invenzione proposta nella presente domanda di brevetto risiede nella generazione e nell'utilizzo di un modello sperimentale che funzioni come sensore specifico per il differenziamento in vitro dei neuroni serotoninergici. La presente domanda di brevetto propone una linea di cellule staminali embrionali (cellule ES) o di cellule pluripotenti indotte (cellule iPS) geneticamente modificata mediante sostituzione mirata di un gene reporter vitale come ad esempio la proteina verde fluorescente intensificata (eGFP), la proteina rossa fluorescente (RFP), la proteina fluorescente azzurra (CFP) o la proteina fluorescente gialla (YFP), nel locus genico di Tph2 in modo che l'espressione del gene reporter fluorescente esogeno sia specifica perché regolata dal promotore endogeno di Tph2, contenente tutte le sue regioni regolatorie (enhancers). La presente domanda di brevetto propone inoltre il procedimento per la generazione di queste linee cellulari e il suo utilizzo come utile strumento genetico che può trovare applicazione nello studio di molteplici aspetti dello sviluppo neurale come ad esempio il differenziamento, la crescita assonale, la funzionalità e le proprietà elettriche dei neuroni. La stessa invenzione può inoltre risultare utile per mettere a punto nuovi protocolli di differenziamento in vitro con l'obiettivo di migliorare l'efficienza del differenziamento serotoninergico o per testare l’azione di molecole specifiche come ad esempio fattori di crescita o farmaci specifici sul differenziamento e sulla funzione dei neuroni serotoninergici, anche in screening industriali su larga scala.
Descrizione dettagliata dell'invenzione
La presente invenzione si riferisce ad una linea di cellule staminali che può essere utilizzata come sensore per il differenziamento dei neuroni serotoninergici in vitro. In particolare l'invenzione si riferisce ad una linea di cellule staminali in cui l’espressione di un gene reporter vitale come eGFP è attivata in seguito al differenziamento verso il tipo neuronaie serotoninergico.
in una realizzazione, il marcatore ideale per un tipo cellulare specifico è quello che definisce quel particolare tipo cellulare: il gene in questione viene espresso in quel tipo cellulare e non in altri. Nel sistema nervoso centrale la Triptofano idrossilasi 2, Tph2, è l’enzima chiave e limitante per la sintesi di serotonina e durante lo sviluppo l'inizio dell’espressione di Tph2 correla con l’inizio della sintesi di serotonina nei neuroni serotoninergici al termine del processo differenziativo. L’espressione di Tph2 non è rilevabile in altri tipi cellulari del sistema nervoso centrale. Per i motivi sopraelencati Tph2 è idealmente il miglior marcatore specifico per i neuroni serotoninergici.
In un’altra realizzazione le peculiari caratteristiche dei neuroni serotoninergici, ne fanno un buon modello sperimentale per studiare lo sviluppo neurale:
1. i neuroni serotoninergici presentano un’estesa innervazione proiettando i loro assoni a tutto il sistema nervoso centrale, contattando quasi tutte le strutture nervose ed utilizzando sia sistemi di segnalazione sinaptica che paracrina.
2. i neuroni serotoninergici forniscono un'azione neuromodulatoria ricevendo informazioni da altri sistemi di neurotrasmissione come il sistema glutamatergìco e GABAergico.
3. il sistema serotoninergico è coinvolto in molteplici comportamenti e funzioni fisiologiche come la regolazione dell'appetito, della memoria, deH'umore, dello stress e del comportamento sessuale e in alcuni processi dello sviluppo.
4. alterazioni della normale neurotrasmissione serotoninergica sono state associate a patologie neuropsichiatriche come depressione, disordini bipolari, ansia, schizofrenia, disordini ossessivocompulsivi, aggressività, disordini dell’iperattività e del deficit dell'attenzione (ADHD) e autismo.
5. molti farmaci utilizzati per il trattamento di patologie neuropsichiatriche agiscono sulla funzionalità del sistema serotoninergico.
In una realizzazione, il locus del gene Tph2 può essere ingegnerizzato in modo tale da usare la regione regolatoria dello stesso gene per controllare l'espressione del gene reporter vitale (es. eGFP) con un pattern di espressione analogo a quello di Tph2. La possibilità di ingegnerizzare le cellule staminali e i vantaggi della sostituzione mirata della eGFP in uno specifico locus genico attraverso una strategia di knock-in permettono una regolazione genica rigorosa e accurata del gene reporter che viene espresso nelle stesse cellule in cui è espresso il gene endogeno Tph2. Il principale vantaggio di questo approccio è che l’espressione del gene reporter esogeno ( eGFP) è regolata dal promotore endogeno di Tph2 completo di tutte le sue regioni "enhancers". Alcune pubblicazioni hanno mostrato che le proteine fluorescenti possono essere utilizzate come reporter per tipi cellulari specifici utilizzando approcci basati sulla generazione di linee stabili di cellule staminali mediante l'integrazione casuale nel genoma di costrutti contenenti geni reporter guidati da promotori specifici (transgenesi) (US patent 7,105,344 B2). Tuttavia questo tipo di approccio può comportare un certo grado di interferenza trascrizionale in relazione alla regione del genoma in cui il transgene si è casualmente integrato e alla possibilità di integrazione in concatenameri. La strategia della sostituzione mirata di un gene utilizzata nella presente invenzione previene la possibilità che l'espressione del transgene possa essere influenzata dalla regione regolatoria dei geni localizzati nelle vicinanze del sito di integrazione. Il cDNA del gene reporter è stato infatti clonato in singola copia a partire dal secondo codone con la stessa cornice di lettura di Tph2 a valle del primo codone codificante per la metionina del gene della Tph2 in modo che l’espressione della proteina fluorescente sia guidata dal promotore endogeno di Tph2 (linea “knock-in" di cellule staminali).
In una realizzazione le cellule staminali embrionali sono cellule totipotenti derivate dalla massa cellulare interna dell'embrione precoce di mammifero che possono essere coltivate indefinitamente in vitro e hanno la capacità di originare tutti i tipi cellulari. Le cellule staminali embrionali rappresentano un eccellente modello per studiare i meccanismi molecolari che sottendono il differenziamento verso tipi cellulari specifici e sono alla base della terapia cellulare e della medicina rigenerativa.
In un'ulteriore realizzazione la presente invenzione rappresenta un metodo semplice ed accessibile per seguire lo sviluppo e la funzione dei neuroni serotoninergici mediante differenziamento in vitro sia di cellule staminali embrionali murine o umane, sia di cellule pluripotenti indotte (cellule iPS). Ad oggi i diversi tipi cellulari ottenuti mediante differenziamento in vitro sono stati caratterizzati principalmente mediante approcci di immucitochimica, di ibridazione in situ o di RT PCR. Questi approcci sperimentali richiedono la fissazione del campione prima della visualizzazione dei tipi cellulari specifici e non possono quindi essere utilizzati per seguire processi cellulari dinamici. L’impiego del gene reporter vitale, come ad esempio eGFP, permette di monitorare in vivo la regolazione dell'espressione genica sia nel tempo che nello spazio e di seguire il comportamento dinamico dei sistemi viventi nel tempo. La presente invenzione fornisce un metodo che permette la generazione di neuroni serotoninergici in vitro e un semplice metodo per identificarli e caratterizzarli, rendendo il modello sperimentale accessibile ad analisi funzionali, molecolari e morfologiche durante lo sviluppo o durante processi cellulari dinamici.
In una realizzazione la suddetta linea cellulare utilizza i vantaggi di una proteina fluorescente vitale come la eGFP per marcare i neuroni che esprimono il gene Tph2 come conseguenza del differenziamento verso neuroni serotoninergici e permette quindi di visualizzare direttamente il differenziamento di questi neuroni. Questa caratteristica offre l’opportunità di poter studiare lo sviluppo e la funzionalità dei neuroni serotoninergici in vitro sia in condizioni di coltura standard sia in seguito all’esposizione ad un ampio spettro di molecole specifiche o a nuovi farmaci. Le peculiari proprietà di una siffatta linea di cellule staminali permettono di seguire direttamente la progressione e il differenziamento serotoninergico in vitro rendendo questo strumento ottimale per testare diversi parametri e per mettere a punto protocolli di differenziamento nuovi e più efficienti.
In una realizzazione la presente invenzione permette di generare neuroni serotoninergici in vitro facilitando per esempio le analisi elettrofisiologiche in quanto, essendo fluorescenti, le cellule possono essere facilmente identificate. Questa caratteristica si traduce in una reale semplificazione per gli studi funzionali su queste cellule. In questo contesto, in un’altra realizzazione, la risposta dei neuroni serotoninergici a molecole specifiche o a farmaci può essere analizzata sulle suddette cellule anche a livello elettrofisiologico.
In una realizzazione con la presente invenzione può essere isolata una popolazione pura di neuroni serotoninergici. Poiché i neuroni serotoninergici differenziati in vitro esprimono la proteina fluorescente, possono essere separati dalle altre cellule presenti in coltura mediante esperimenti di citofluorimetria a flusso mediante un "fluorescence activated celi sorter” (FACS). Le cellule così isolate possono essere utilizzate per sintetizzare cDNA o librerie di espressione che rappresentano l’intero ''trascrittoma" caratteristico dei neuroni serotoninergici. In questo contesto, in un’altra realizzazione, la risposta dei neuroni serotoninergici a molecole specìfiche o a farmaci può essere testata in una singola cellula o in una popolazione pura di neuroni serotoninergici per valutare eventuali cambiamenti nel profilo di espressione di geni specifici.
In un'ulteriore realizzazione, grazie all'espressione del tracciante fluorescente nei neuroni serotoninergici a partire dal loro differenziamento terminale, la presente invenzione permette di seguire la progressione durante lo sviluppo dei neuroni serotoninergici in vitro, permettendo di visualizzare in tempo reale diversi aspetti dello sviluppo neurale e di seguire cambiamenti morfologici durante il tempo come l'emissione di processi cellulari, la crescita assonale e la migrazione neuronaie.
In un'altra realizzazione le cellule staminali descritte nella presente domanda costituiscono un utile strumento genetico per esaminare l’effetto di specifiche molecole o di farmaci sullo sviluppo dei neuroni serotoninergici e sul loro funzionamento. La presente invenzione facilita gli studi in vitro sullo sviluppo e sulla funzione dei neuroni serotoninergici sia in condizioni standard di coltura sia in seguito all’esposizione a un ampio spettro di molecole specifiche (ad esempio in screening industriali di specifiche molecole segnale o nuovi farmaci) fornendo un metodo semplice ed accessibile per visualizzare gli effetti su specifici processi come la migrazione o la proiezione dei neuriti o sul funzionamento dei neuroni serotoninergici.
Esempi
Generazione del vetore per la sostituzione mirata di Toh2
Clonaggio del locus di Tph2 murino
L'ingegnerizzazione di cellule staminali embrionali inizia con la progettazione di un vettore per la sostituzione mirata per introdurre II DNA esogeno in una specifica regione del genoma attraverso un evento di ricombinazione omologa. Per generare il vettore per la sostituzione mirata di Tph2 è stato isolato un frammento di DNA genomico corrispondente alla regione genomica adiacente al primo esone di Tph2. Il frammento di restrizione BamHI - Clal di questo clone genomico comprendente il primo esone di Tph2 e una regione genomica fiancheggiante più ristretta corrispondente a circa 3.3 kb a monte e circa 3.7 kb a valle del primo codone ATG, è stata sub-clonata in un vettore plasmidico (Tpfi2 BC) per rendere più agevole la successiva manipolazione in vitro del frammento genomico.
Generazione del vettore per la sostituzione mirata di Tph2, Tph2<eGFP(neo)>
Il vettore per la sostituzione mirata di Tph2 è stato preparato sostituendo 105 nucleotidi dell'esone I a valle del primo codone di metionina (ATG), codificanti per 35 amminoacidi dell'enzima Triptofano Idrossilasi 2, con il cDNA codificante per il gene reporter vitale eGFP. Per permettere un accurato controllo dell'espressione del gene reporter, il più possibile analogo a quello di Tph2, il secondo codone del cDNA della eGFP è stato clonato nella stessa cornice di lettura del primo codone metionina di inizio della traduzione di Tph2, utilizzando una strategia basata sulla ricombinazione in batteri E. Coli (Yu et al, 2000).
Il vettore per la sostituzione mirata di Tph2, chiamato Tph2<eGFP(nB0>>e mostrato in figura 1, è costruito come segue:
i) il cDNA di eGFP è inserito a partire dal secondo codone nella stessa cornice di lettura del primo codone metionina di inizio della traduzione di Tph2\
ii) una cassetta di selezione codificante per il gene neo, sotto il controllo del promotore del gene per la fosfoglicerochinasi (PGK) è presente a valle del gene reporter. Per evitare possibili interferenze da parte del promotore PGK sulla regolazione trascrizionale di eGFP è stato utilizzato un approccio basato sulla ricombinazione mediata da ricombinasi Flp per generare un allele con la cassetta di selezione removibile. La cassetta PGK-neo è infatti fiancheggiata da due siti frt che permettono la successiva excisione mediata dalla ricombinasi Flp.
iii) due braccia di omologia, rispettivamente di 3.3 e 3.7 kb corrispondenti a sequenze omologhe alle regioni del locus genico del gene Tph2 stesso, fiancheggiano le suddette per guidare l’evento di ricombinazione omologa nel genoma delle cellule staminali.
La sequenza nucleotidica delle porzioni di DNA genomico adiacenti al primo esone del gene Tph2, che costituiscono le braccia di omologìa del vettore per la sostituzione mirata di Tph2 stesso sono necessarie per promuovere l'evento di ricombinazione omologa per inserire il secondo codone del cDNA della proteina fluorescente (es. eGFP) nella stessa cornice di lettura del primo codone metionina di inizio della traduzione di Tph2 e sono schematizzate nella figura 1. In particolare la sequenza nucleotidica delle braccia di omologia specifiche per il vettore per la sostituzione mirata del gene Tph2 è cosi composta: dal nucleotide 114621947 al nucleotide 114625298 e dal nucleotide 114618071 al nucleotide 114621839 della sequenza di riferimento NCBI NC_000076, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC 000076 ( Mus musculus Tph2)
Ricombinazione omologa nelle cellule staminali embrionali
Elettroporazione del vettore per la sostituzione mirata di Tph2, Tph2<eGFP<neo>>nelle cellule staminali embrionali e identificazione dei cloni ricombinanti
L'elettroporazione è il metodo maggiormente utilizzato per introdurre vettori a DNA per la sostituzione mirata di geni all'interno delle cellule staminali embrionali in quanto la concentrazione del DNA e la densità cellulare possono essere ottimizzate per favorire l’integrazione di una singola copia del vettore. E' stata utilizzata una linea di cellule staminali embrionali mantenuta in vitro su piastre per coltura cellulare gelatinate ed in un mezzo contenente "leukemia inhibitory factor” (LIF) seguendo protocolli di coltura per la sostituzione mirata del gene Tph2 Tph2e<GFP(neoJ>è stato purificato e 30 pg del DNA linearizzato è stato aggiuntò a 2 x 10<7>cellulle staminali embrionali / 0.7 mi di PBS ottenute da piastre all’ 80% di confluenza ed elettroporato mediante un’unità Bio-Rad Gene Pulser. Le cellule elettroporate sono state poi diluite in 40 mi di mezzo di coltura e seminate ad una confluenza di circa 5<χ>10<B>cellule per piastra petri di 10 cm di diametro. Dopo la selezione con l’antibiotico G418, le cellule che hanno integrato il vettore per la sostituzione mirata del gene Tph2 formano colonie ricombinanti resistenti all'antibiotico. Sono state scelte 576 colonie che sono state successivamente isolate e il cui DNA genomico è stato estratto e utilizzato per effettuare un’analisi per Southern Blot. In particolare il DNA genomico digerito con l’enzima Bglll è stato utilizzato in combinazione ad una sonda specifica per una regione a monte del braccio sinistro di omologia per verificare la corretta ricombinazione omologa all'estremità 5’. Nella figura 1a è riportato un diagramma che mostra il locus genico selvatico di Tph2, il vettore per la sostituzione mirata del gene Tph2 (figura 1 b), e l’allele dopo la sostituzione ( Tph2?<GFP(nB0)>, figura 1c),. Sono stati ottenuti 4 cloni dì cellule staminali embrionali in cui l'evento di ricombinazione omologa si è verificato correttamente: l'analisi mediante Southern blot, come mostra l'autoradiografia nella figura 1e le dimensioni attese di 12.5 kb per l'allele selvatico e 7.3 kb per l'allele ricombinante. La digestione con l'enzima Stul è stata utilizzata per determinare la corretta ricombinazione all'estremità 3' (8 kb e 5.6 kb rispettivamente per allele selvatico e ricombinante). In questi cloni il cDNA per il gene reporter vitale eGFP e la cassetta PGK-neo fiancheggiata dai siti frt sostituiscono 105 nucleotidi a valle del codone ATG di inizio della traduzione nel primo esone, corrispondenti a 35 aminoacidi dell’enzima Triptofano Idrossilasi 2 (cloni di cellule staminali embrionali knock-in Tph2<eGFP(neo>>).
Generazione della linea di cellule staminali embrionali Toh^<GFP>
Ricombinazione mediata dalla ricombinasi Flp nella linea di cellule staminali embrionali Tph2?<GFP(neo>>
La presenza della cassetta PGK-neo, come precedentemente osservato (Pasqualetti et al., 2002), verosimilmente interferisce con la normale regolazione trascrizionale del gene Tph2 sul gene reporter eGFP nelle cellule staminali embrionali knock-in Tph2?<GFP(neo)>in seguito al differenziamento. Per eludere questa possibilità e per assicurare che la linea di cellulare generata possa effettivamente fungere da sensore in vitro del differenziamento seroroninergico, la cassetta PGK-neo è stata rimossa dal genoma mediante espressione transiente della ricombinasi Flp nelle cellule Tph2<aGFP<ne>°<>>.
In breve, il procedimento è stato il seguente: le cellule Tph2<pGFP(neo>>sono state transfettate con il vettore pCAGGS-Flp, che induce l'espressione costitutiva della ricombinasi sito specifica Flp e conferisce resistenza all’antibiotico puromicina. Il giorno dell'elettroporazione 12x10<6>cellule Tph2<eGFP(neo)>, ottenute da piastre ad una confluenza circa dell'80%, sono state transfettate mediante elettroporazione in presenza di 15 pg del vettore pCAGGS-Flp. Il giorno seguente e per le successive 48 ore, il mezzo di coltura è stato addizionato di 1,5 pg/ml di puromicina per selezionare le cellule transfettate (si veda anche Schaft et al., 2001). Successivamente è stato possibile isolare 200 colonie ricombinanti di cellule staminali formatesi in seguito alla selezione in puromicina ed analizzarne il DNA genomico mediante PCR. Sono stati identificati 3 cloni in cui la cassetta PGK-neo è stata excisa per dare origine al nuovo allele Tph2<eGFP>. In figura 1d è schematizzato l’allele Tph2<eGFP>generatosi dopo la ricombinazione mediata dalla ricombinasi sito specifica Flp. Infine, la regione genomica dell’allele ricombinante è stata sequenziata per confermare che l’evento di ricombinazione somatica mediato dalla ricombinasi sito specifica Flp fosse awenutò in maniera corretta e non avesse alterato l’integrità dell'ailele.
Le cellule staminali embrionali Tph2?<GFP>sono totipotenti
E’ noto che il mantenimento in coltura per un elevato numero di passaggi e la prolungata manipolazione in vitro possono alterare il cariotipo e limitare la capacità di differenziamento delle cellule staminali embrionali. Pertanto, in un primo momento, è stato verificato il mantenimento di un corretto cariotipo delle cellule Tph2?<GFP>mediante conta cromosomica di cellule bloccate in metafase. Successivamente, per verificare che le cellule Tph?<GFP>avessero mantenuto lo stato di totipotenza, è stata valutata l’espressione di alcuni marcatori molecolari di cellule staminali quale Oct4, ed è stato effettuato il saggio per l’attività della fosfatasi alcalina ( AP ), comunemente utilizzato come indicatore del mantenimento dello stato di totipotenza delle cellule staminali embrionali. Le cellule staminali embrionali Tph^<GFP>mostrano alti livelli di espressione di Oct4 e di attività fosfatasica, indicando che in queste cellule la totipotenza risulta inalterata. In figura 2a è mostrata l’espressione di Oct4 mediante analisi di RT PCR su cellule ES indifferenziate Tph2<eGFP>e il saggio per l’attività della fosfatasi alcalina su cellule indifferenziate Tph2?<GFP>. (Figura 2b, 2c, LEGENDA: ESc WT: cDNA di cellule staminali embrionali indifferenziate di tipo selvatico, ESc Tph2<eGFP>: cDNA di cellule staminali embrionali indifferenziate Tph2?<GFP>, Diff 7pri2<eGFP>: cDNA di cellule Tph^<GFP>differenziate in vitro, Brain: cDNA da cervello murino adulto).
Differenziamento delle cellule staminali embrionali TohT^^ verso neuroni serotoneroici Negli ultimi anni sono stati messi a punto diversi protocolli per ottenere il differenziamento neurale in vitro a partire da cellule staminali embrionali. Le strategie sperimentali che vengono comunemente adottate possono essere divise in due tipi di approcci: il primo prevede la formazione di aggregati cellulari (corpi embrioidi, EBs) contenenti cellule che derivano da tutti e tre i foglietti germinativi e che, mimando l’ambiente che nell’embrione produce il neuroectoderma, forniscono molecole segnale ed appropriati contatti cellula-cellula (Lee et al., 2000); il secondo approccio prevede l’impiego di un mezzo privo di siero ed una coltura a bassa confluenza per limitare i contatti cellula-cellula e l’azione delle molecole segnale con lo scopo di evocare il meccanismo di default per il differenziamento neurale (Fico et al., 2008). Sono stati saggiati i due protocolli sopra menzionati per differenziare le cellule staminali embrionali 7ph2<eGFP>verso neuroni serotoninergici in vitro e, in entrambi i casi, è stato possibile ottenere neuroni eGFP-positivi differenziati in vitro a partire da cellule staminlai 7pri2<eGFP>.
Per far luce sulla natura dei neuroni che esprimono eGFP sono stati effettuati esperimenti di doppia immunocitochimica utilizzando anticorpi specifici per serotonina e per eGFP. Esperimenti di immunocitochimica sono stati eseguiti seguendo protocolli convenzionali e gli anticorpi sono stati utilizzati come segue: rabbit anti-5-ΗΤ, chicken anti-eGFP; Rhodamine Red-X goat anti-rabbit IgG, Fluorescein (FITC) anti-chicken IgY. I risultati mostrano la co-localizzazione dei segnali di serotonina e eGFP dimostrando che le cellule che esprimono eGFP sono neuroni serotoninergici differenziati in vitro (Figura 3a e 3b). Inoltre, mediante l'analisi delle cellule differenziate per RT PCR è stato possibile mettere in evidenza, oltre all'espressione di specifici marcatori serotoninergici come Tph2, anche il trasportatore della serotonina ( SERT) e il recettore 1A per la serotonina (Figura 3c, LEGENDA: ESc: cDNA di cellule staminali indifferenziate Tph2?<GFP>\ Diff: cDNA di cellule 7pft2<®GFP>differenziate in vitro\ ctr: controlli positivi per l’espressione dei geni indicati in figura). Questi dati permettono di concludere che la comparsa di eGFP correla con l'attivazione dello specifico programma differenzìativo dei neuroni serotoninergici. Nell'insieme, la sintesi di serotonina e l'attivazione di specifici marcatori molecolari suggeriscono che i neuroni serotoninergici differenziati in vitro da cellule ES Tph?<GFP>costituiscono un modello sperimentale in vitro adatto allo studio di molteplici aspetti correlati allo sviluppo, alla biologia e al funzionamento dei neuroni serotoninergici. I neuroni serotoninergici differenziati in vitro hanno una morfologia multipolare da cui si originano numerosi neuriti organizzati in fasci che, nel complesso, ricordano ì neuroni presenti in vivo nei nuclei del raphe supportando ulteriormente la possibilità di utilizzare questo strumento come modello in vitro per lo sviluppo dei neuroni serotoninergici.
Questo modello sperimentale offre infatti la possibilità dì osservare in tempo reale il differenziamento serotoninergico grazie all'attivazione dell’espressione del gene reporter eGFP in seguito all'attivazione del promotore del gene Tph2. Questa caratteristica permette di introdurne la dimensione temporale nell'analisi delle cellule che differenziano in vitro in quanto i neuroni serotoninergici eGFP-positivi ottenuti a partire da cellule ES Tph2?<GFP>possono essere analizzati, mediante registrazioni in “timelapse", durante processi dinamici dello sviluppo neuronaie come ad esempio la migrazione e l’accrescimento neuritico.
In un'ulteriore realizzazione, queste caratteristiche permettono di saggiare facilmente diverse condizioni di coltura e valutare la differente efficienza di differenziamento di nuovi protocolli rispetto ai protocolli standard a cui si è fatto riferimento sopra. Nell'insieme la sintesi di serotonina e l'attivazione di specifici marcatori molecolari suggeriscono che neuroni serotoninergici differenziano in vitro da cellule staminali embrionali 7pft2<eGFP>con un'alta efficienza. Le cellule staminali embrionali Tph2?<GFP>forniscono un adeguato modello sperimentale per seguire la progressione del differenziamento dei neuroni serotoninergici e per studiare la biologia di questa importante classe di neuroni.
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Pasqualetti, M., Ren, S. Y, Poulet, M., LeMeur, M., Dierich, A. and Rijli F. M. (2002). A Hoxa2 knock-in allple that expresses EGFP upon conditional Cre-mediated recombination. Genesis 32, 109Schaft, J., Ashery-Padan, R., van der Hoeven, F., Gruss, R, Stewart, A.F. (2001). Efficient Flp recombination in mouse ES cells and oocytes. Genesis 31, 6-10.
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Claims (1)
- 3. RIVENDICAZIONI L'invenzione rivendicata è: 1) Una linea cellulare che esprime un gene reporter vitale in seguito al differenziamento verso lo specifico tipo cellulare dei neuroni serotoninergici. 2) La linea del punto 1, dove la linea cellulare è una linea di cellule staminali embrionali murine. 3) La linea del punto 1 , dove la linea cellulare è una linea di cellule staminali embrionali umane. 4) La linea del punto 1, dove la linea cellulare è una linea di cellule staminali pluripotenti indotte (cellule iPS). 5) La linea del punto 1, dove il gene reporter vitale è una proteina fluorescente tra la proteina verde fluorescente intensificata (eGFP), la proteina rossa fluorescente (RFP), la proteina fluorescente azzurra (CFP) o la proteina fluorescente gialla (YFP). 6) La linea del punto 1 dove il cDNA del gene reporter risulta inserito nel locus genico del gene della Tph2 in modo che il cDNA del gene reporter a partire dal secondo codone sia nella stessa cornice di lettura del primo codone metionina di inizio della traduzione del gene Tph2. 7) Un metodo per generare la linea di cellule del punto 1. 8) Il metodo del punto 7, dove è utilizzata una strategia di sostituzione mirata (knock-in) del gene Tph2 per introdurre mediante ricombinazione omologa il cDNA del gene reporter tra quelli descritti nel punto 5 nel focus genico del gene Tph2 in modo che il cDNA del gene reporter, a partire dal secondo codone, sia nella stessa cornice di lettura del primo codone metionina di inizio della traduzione del gene Tph2. 9) Il metodo del punto 8, in cui, in riferimento al punto 9, la strategia della sostituzione mirata del gene Tph2 prevede l'utilizzo di un vettore per la sostituzione mirata del gene Tph2 contenente il cDNA del gene reporter a partire dal secondo codone nella stessa cornice di lettura del primo codone metionina di inizio della traduzione del gene Tph2, una cassetta di selezione rimovibile mediante l’azione di ricombinasi sito specifiche e braccia di omologia cosi composte: dal nucleotide 114621947 al nucleotide 114625298 e dal nucleotide 114618071 al nucleotide 114621839 della sequenza di riferimento NCBI NC_000076, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC 000076 ( Mus musculus Tph2) oppure dal nucleotide 72329161 al nucleotide 72332768 e dal nucleotide 72332872 al nucleotide 72336508 della sequenza di riferimento NCBI NC_000012, http://www.ncbi.nlm.nih.qov/nuccore/NC 000012 ( Homo sapiens TPH2). 10) Utilizzo della linea del punto 1 per studiare lo sviluppo, la farmacologia e la biologia dei neuroni serotoninergici in riferimento ad una o più caratteristiche dei neuroni serotoninergici differenziati in vitro. 11) Un metodo sperimentale in accordo con il punto 10, in cui i neuroni serotoninergici sono generati in vitro con uno tra i metodi che permettono il differenziamento neuronaie in vitro. 12) Un metodo sperimentale in accordo con il punto 10, in cui la caratteristica o le caratteristiche sono una o diverse tra: efficienza del differenziamento verso un tipo neurale specifico, morfologia cellulare, comparsa o accrescimento/degenerazione del neurite, migrazione cellulare, neurogenesi, morte cellulare, proprietà elettriche, sinaptogenesi e/o espressione di marcatori molecolari per tipi neuronali specifici 13) Un metodo sperimentale in accordo con il punto 10, che comprende l'induzione del differenziamento delle cellule staminali in neuroni serotoninergici e l'analisi di una o più caratteristiche delle cellule neuronali in accordo con il punto 12 in condizione di test che comprende: il differenziamento dei neuroni serotoninegici in una prima condizione; il differenziamento di neuroni serotoninergici in una seconda condizione; l'analisi o quantificazione dì una o più caratteristiche neuronali delle cellule; la comparazione di una o più caratteristiche delle cellule coltivate nella prima condizione con la stessa caratteristica o caratteristiche delle cellule coltivate nella seconda condizione. 14) Un metodo sperimentale in accordo con il punto 13, in cui le condizioni di test si riferiscono alla coltura in presenza di molecole con azione psicotropa o altri tipi di molecole e/o alla coltura su supporti biocompatibili e sono utilizzate in screening industriali su larga scala (high-troughput) con particolare riferimento ad industrie del settore biomedico. 15) Un metodo in cui le cellule dell’invenzione sono utilizzate in tecniche di trapianto per mettere a punto il trattamento di patologie causate da danno o perdita cellulare
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