CN115094027A

CN115094027A - 一种胰腺癌类器官无血清专用培养基

Info

Publication number: CN115094027A
Application number: CN202210877474.9A
Authority: CN
Inventors: 郑维越; 扈晖; 扈晓玉
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2022-07-27
Filing date: 2022-07-27
Publication date: 2022-09-23

Abstract

本发明涉及肿瘤类器官培养领域。具体涉及一种胰腺癌类器官无血清专用培养基和培养方法。所述培养基为一种无需添加重组蛋白的无血清专用培养基，由基础培养基和添加物组成，基础培养基为含有1％青链霉素、1％HEPES缓冲液、1％GlutaMax溶液的DMEM/F12培养基。培养添加物包括生长因子EGF、FGF2、FGF7、FGF10、Neuregulin1，胰岛素，氢化可的松，小分子抑制剂A83‑01、Y‑27632、SB202190，B27supplement。将患者来源胰腺癌样本用胶原酶消化，重悬于Cultrex^TM growth factor reduced BME type2中，加入培养板，37度半小时固化，加入上述培养基，放入细胞培养箱，每4天更换培养基，一周即可获得所需胰腺癌类器官。本发明所述培养基可支持胰腺癌细胞体外生长，呈现典型球状或不规则团块肿瘤类器官形态，为后续进一步研究提供较好研究样本。

Description

一种胰腺癌类器官无血清专用培养基

技术领域

本发明涉及一种肿瘤类器官培养技术领域，尤其涉及一种胰腺癌类器官的无血清专用培养基和培养方法。

背景技术

胰腺癌的预后极差，五年总生存率仅为10％左右。目前的治疗措施如吉西他滨、紫杉醇或奥沙利铂应答率很低，复发极为常见。此外，胰腺癌的隐匿进展和转移也是预后不良的主要原因。因此，迫切需要工具和模型来为个别患者确定更有效的治疗方案。随着分子生物学技术的进展，已经知道胰腺癌是一种高度异质性疾病，包括不同的亚型，这些亚型在遗传表型、病理特征和临床表现均不相同，因此构建基于患者来源的肿瘤体外模型，能够准确模拟体内肿瘤的生物学特征和对药物治疗的反应，对于肿瘤研究、药物测试及筛选有着巨大的价值。

Watanabe et al.(BMC Cancer，2022，22:489)提出了一种胰腺癌类器官的培养方法，使用含有L-Wnt3A、R-spondin 3和Noggin 的50％L-WRN条件培养基(ATCC)，建立了多个原发性和转移性胰腺癌类器官。专利CN202210181982、专利CN201910659579亦公开了相似的胰腺癌类器官培养基的组成和相似的培养方法，即在培养基种添加Wnt激动剂R-spondin、BMP抑制剂Noggin等调控因子。然而，这些设计存在以下问题和缺点：此类重组蛋白价格昂贵，且主要生产企业均位于国外，这导致胰腺癌类器官专用培养基存在生产成本较高、主要添加成分需要进口、采购周期长且供应周期易受外部环境影响等问题。这些问题极大的阻碍了胰腺癌类器官的大规模培养和更广范围的应用研究，因此，迫切希望开发更低成本、更易用的胰腺癌类器官专用培养基的出现。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种全新的胰腺癌类器官无血清专用培养基的组成和培养方法，其目的在于，提供一种无需添加Wnt激动剂及BMP抑制剂等昂贵重组蛋白的胰腺癌类器官无血清专用培养基。

为实现上述目的，本发明提供的方案是这样实现的：一方面，本发明所述胰腺癌类器官无血清专用培养基由基础培养基和培养添加物两部分组成。基础培养基为含有1％青-链霉素、1％HEPES缓冲液、1％GlutaMax溶液的DMEM/F12培养基。

进一步地，所述培养添加物包括生长因子EGF、FGF2、 FGF7、FGF10、Neuregulin1，胰岛素，氢化可的松，小分子抑制剂 A83-01、Y-27632、SB202190，其他添加成分B27supplement。

进一步地，所述培养添加物的终浓度为：EGF：0.01- 0.1μg/mL、FGF2：0.005-0.05μg/mL、FGF7：0.005-0.05μg/mL、 FGF10：0.005-0.05μg/mL、Neuregulin1：5-50nM，胰岛素：10- 50μg/mL，氢化可的松：0.1-10μg/mL，小分子抑制剂A83-01：0.1- 1.0μM、Y-27632：0.1-1.0μM、SB202190：0.1-1.0μM，B27 supplement：1％。

进一步地，所述胰腺癌类器官无血清专用培养基在使用时配制，在已配制好的基础培养基中，按照终浓度加入所有培养添加物，混合均匀后即可获得。

在本发明的另一个方面中，提供一种胰腺癌类器官体外培养的方法，包括以下步骤：

(1)将胰腺癌组织样本切成3mm³左右大小，清洗后加入浓度为1mg/mL的胶原酶中，37度消化30分钟左右；

(2)将消化后的细胞按照2×10⁶个细胞/mL的浓度重悬于冷的 Cultrex^TM growthfactor reduced BME type2中，加入24孔细胞培养板，每孔加40微升，放入37度细胞培养箱20分钟，使含有细胞的 BME固化；

(3)每孔加入上述胰腺癌类器官无血清专用培养基400微升，放入5％CO₂浓度、37℃细胞培养箱培养，每4～6天更换一次上述胰腺癌类器官无血清专用培养基，7天左右即可获得所需胰腺癌类器官。

由于本发明采用的培养添加物中去除了价格昂贵的重组蛋白成分，从而可以得到以下有益效果：

(1)本发明所述培养基对于胰腺癌类器官的生长有较好的支持和促进作用，7天左右即可获得典型的胰腺癌类器官，在体外较好的保留了患者来源肿瘤一致性和保留异质性，为进一步进行研究应用奠定了基础；

(2)本发明所述培养基的成本较其他方法有明显下降，主要原因在于去除了价格较为昂贵的Wnt信号调节重组蛋白R-Spondin或者发育调控蛋白Noggin等重组蛋白，使用其他成分替代，从而为以后进行大规模胰腺癌类器官培养用于药物筛选等研究应用提供了可能。

(3)本发明所述培养方法步骤清晰简便，操作人员对培养结果影响较小，提高了培养结果的一致性，为后续大规模培养提供了便利条件。

附图说明

以下结合附图对本发明做进一步详细描述。

附图1是本发明实施例中培养第2天至第10天的胰腺癌类器官光学显微镜下形态图；

附图2是本发明对比例中培养第13天至第18天的胰腺癌类器官光学显微镜下形态图。

具体实施方式

实施例：

如图1所示，本发明的优选实施方式是，提供一种无需添加 Wnt通路调控重组蛋白及BMP抑制剂头蛋白Noggin的胰腺癌类器官无血清专用培养基及培养方法，所述培养基包括无血清基础培养基和培养添加物。所述基础培养基为含有1％青-链霉素、1％HEPES 缓冲液、1％GlutaMax溶液的DMEM/F12培养基，所述培养添加物由以下终浓度的成分组成：EGF：0.1μg/mL、FGF2：0.05μg/mL、FGF7：0.05μg/mL、FGF10：0.005μg/mL、Neuregulin1：5nM，胰岛素：50μg/mL，氢化可的松：10μg/mL，小分子抑制剂A83-01： 0.1μM、Y-27632：0.1μM、SB202190：1.0μM，B27 supplement： 1％。在使用时将所有培养添加物按照终浓度加入所述基础培养基，即可获得所述胰腺癌类器官无血清专用培养基。所述胰腺癌类器官培养方法为，将患者来源胰腺癌组织样本切成3mm³左右大小，清洗后加入1％胶原酶消化30分钟左右，将消化后的细胞按照2×10⁶个细胞/mL的浓度重悬于冷的Cultrex^TM growth factorreduced BME type2中，加入24孔细胞培养板，每孔加40微升，放入37度细胞培养箱20分钟，待含有细胞的BME固化后，每孔加入上述胰腺癌类器官无血清专用培养基400微升，放入5％CO2浓度、37℃细胞培养箱培养，每4天更换一次上述胰腺癌类器官无血清专用培养基，7 天左右即可获得所需胰腺癌类器官，图1为实施例培养第2天至第 10天胰腺癌类器官光学显微镜下形态图。可见所述胰腺癌类器官无血清专用培养基可以有效支持胰腺癌类器官的体外生长，且生长迅速，所形成的胰腺癌类器官呈现典型的三维球状或三维不规则细胞团块，经测量胰腺癌类器官在第10天时直接可达100微米左右，为后续进一步研究提供了较好的研究样本。

对比例：

如图2所示，本发明的对比例采用已公开专利 CN202210181982.3中所述的优选实施方法，即添加了Wnt信号调节重组蛋白R-Spondin和发育调控蛋白Noggin等重组蛋白和胎牛血清的培养添加成分。对比例胰腺癌类器官培养液为含有雌二醇 (100nM)，氢化可的松(50μg/ml)、R-Spondin 3(250ng/ml)、 Neuregulin1(5nM)、FGF10(50ng/ml)、EGF(5ng/ml)、PGE2(5ng/ml)、 Noggin(100ng/ml)、A83-01(500nM)、Wnt3a(5nM)、Y-27632(5μM)、SB202190(500ng)、B27(10ng/ml)、N-乙酰半胱氨酸(5nM)、烟酰胺 (10nM)、GlutaMAX添加剂(5nM)、胎牛血清(FBS，10％)、青链霉素(1％)的DMEM/F12培养基。具体培养方法为，将得到的胰腺癌样本浸泡于1％的青链霉素中1小时，将浸泡的胰腺癌样本取出，用一次性手术刀将细胞剪碎，剪碎的组织大约为1cm³；用碾磨棒将腺癌手术样本碾碎，制备成为单细胞悬液。将单细胞悬液吸出，用 200目的细胞滤网过滤2-3次，将多余的残留组织去除，加入PBS清洗3次，再加入Matrigel重悬细胞，接种于6孔板中；在6孔板中加入培养基培养细胞，放置于37℃的培养箱中，每三天更换一次培养基，培养至第2天可形成类器官，培养至第4天类器官细胞数量快速增加，至6天呈对数增长；同时培养过程中类器官逐渐变大，培养至18天最大直径超过100μm。保留了患者肿瘤组织特有的形态学特征。本发明采用对比例的方法也能够获得所需胰腺癌类器官，所获得的胰腺癌类器官呈现典型的肿瘤类器官三维结构，生长良好。

综上，本发明所述胰腺癌类器官无血清专用培养基及培养方法能够有效支持胰腺癌类器官的体外生长，且生长迅速，所形成的胰腺癌类器官呈现典型的三维球状或三维不规则细胞团块，可以生长至直径较大水平依然保持肿瘤类器官形态。与已公开文献与专利所述方法比较，本专利所述培养基去除了价格昂贵的重组蛋白类添加成分，改用其他生长因子替代，从而极大地降低了专用培养基的成本，且培养效果与已公开的方法相比较为一致。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本领域的技术人员应该了解本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都属于本发明保护的范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种胰腺癌类器官无血清专用培养基，其特征在于：包括基础培养基和培养添加物，基础培养基为含有1％青-链霉素、1％HEPES缓冲液、1％GlutaMax溶液的DMEM/F12培养基，培养添加物包括生长因子EGF、FGF2、FGF7、FGF10、Neuregulin1，胰岛素，氢化可的松，小分子抑制剂A83-01、Y-27632、SB202190，B27supplement。

2.根据权利要求1所述的一种胰腺癌类器官无血清专用培养基，其特征在于，所述培养添加物的终浓度为：EGF：0.01-0.1μg/mL、FGF2：0.005-0.05μg/mL、FGF7：0.005-0.05μg/mL、FGF10：0.005-0.05μg/mL、Neuregulin1：5-50nM，胰岛素：10-50μg/mL，氢化可的松：0.1-10μg/mL，小分子抑制剂A83-01：0.1-1.0μM、Y-27632：0.1-1.0μM、SB202190：0.1-1.0μM，B27supplement：1％。

3.根据权利要求1所述的一种胰腺癌类器官无血清专用培养基，其特征在于，所述基础培养基为无血清培养基。

4.根据权利要求1或2所述的一种胰腺癌类器官无血清专用培养基，其特征在于，所述培养基不需要添加Wnt信号调节重组蛋白R-Spondin或者发育调控蛋白Noggin等重组蛋白。

5.根据权利要求1所述的一种胰腺癌类器官无血清专用培养基，其特征在于，在已配制好的基础培养基中，按照终浓度加入所有培养添加物，混合均匀后即可获得。

6.一种胰腺癌类器官培养方法，其特征在于，将胰腺癌组织样本处理清洗后加入胶原酶消化，将消化后的细胞重悬于冷的Cultrex^TMgrowth factor reduced BME type2中，接种于细胞培养板，待含有细胞的BME固化后，加入权利要求1～5任意一项所述的培养基，放入5％CO2浓度、37℃细胞培养箱培养，每4～6天更换一次上述培养基，7天左右即可获得所需胰腺癌类器官。