CN115418352A - 一种黑色素瘤类器官无血清专用培养基 - Google Patents

一种黑色素瘤类器官无血清专用培养基 Download PDF

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Abstract

本发明涉及肿瘤类器官培养领域。具体涉及一种黑色素瘤类器官无血清专用培养基和培养方法。所述培养基为一种无需添加Wnt重组蛋白的无血清专用培养基，由基础培养基和添加物组成，基础培养基为含1％青‑链霉素、1％HEPES缓冲液、1％GlutaMax溶液的Advanced DMEM/F12培养基。添加物包括生长因子EGF、Neuregulin1，N‑乙酰基‑L‑半胱氨酸、尼克酰胺，小分子抑制剂Y‑27632，B27supplement、N2supplement。将患者来源黑色素瘤样本用胶原酶消化，重悬于CultrexTM growth factor reduced BME type2中，直接加入培养板，37度半小时固化，加入培养基，放入培养箱，每2天更换培养基，一周即可获得所需黑色素瘤类器官。本发明所述培养基可支持黑色素瘤细胞体外生长，呈现典型球状或不规则团块肿瘤类器官形态，为后续进一步研究提供较好研究样本。

Description

一种黑色素瘤类器官无血清专用培养基
技术领域
本发明涉及一种肿瘤类器官培养技术领域，尤其涉及一种黑色素瘤类器官的无血清专用培养基和培养方法。
背景技术
黑色素瘤约占皮肤癌死亡的75％以上，特别是转移性(IV期)黑色素瘤患者5年生存率只有23％。根据基因突变类型，黑色素瘤可以分为四个不同的亚型，即BRAFV600突变、NRAS突变、NF-1失活突变和野生型突变患者。转移性黑色素瘤一直被认为是一种无法治疗的疾病，直到2011年和2014年靶向和免疫治疗药物问世。其中，对于BRAFV600E/K突变黑色素瘤患者，BRAF抑制剂和MEK抑制剂联合应用的有效率约为76％，但超过80％的患者在BRAF/MEK抑制剂治疗后复发。另一方面，60-70％的黑色素瘤患者由于药物毒性、耐药和其他不明原因而对免疫检查点抑制剂治疗无效。
这是大多数转移性黑色素瘤患者面临的临床困境：一旦发生转移，只有少数黑色素瘤患者从目前的靶向和免疫治疗中获得长期治疗。导致这种困境的主要原因在于恶性肿瘤的异质性特征，黑色素瘤细胞与肿瘤微环境(TME)的其他细胞和非细胞成分的动态相互作用提供了对治疗效果至关重要的稳态调节机制，每一种都影响对特定治疗策略的敏感性。因此导致了临床治疗反应的多样性。
黑色素瘤的是一种高度异质性的恶性肿瘤，这些亚型在遗传表型、病理特征和临床表现均不相同。因此，构建基于患者来源的肿瘤体外模型，能够准确模拟体内肿瘤的生物学特征和对药物治疗的反应，对于肿瘤研究、药物测试及筛选有着巨大的价值。传统的肿瘤细胞系模型(Cell line model)建立成功率低、肿瘤异质性缺失、缺少三维结构，异种移植动物模型(PDX model)需要较长时间和耗费大量实验资源、不适合进行大规模培养及动物特异性肿瘤的进化，因此建立基于肿瘤类器官技术(Tumor organoids)的三维肿瘤体外模型，才能满足临床个体化治疗和肿瘤研究的需求。
Neal et al.(Organoid Modeling of the Tumor ImmuneMicroenvironment.Cell(2018).175,1972-1988e1916.)提出了一种黑色素瘤类器官的培养方法，他采用气液培养法(ALI)并使用包括WNT3A、EGF、NOGGIN蛋白和Wnt激动剂R-Spondin1在内的重组蛋白作为肿瘤类器官生长培养基，并补充添加多种生长因子，成功建立了黑色素瘤类器官。专利CN114736869A亦公开了一种黑色素瘤类器官的培养方法，培养基包括HEPES缓冲液、GlutaMAX、Primocin、B27补充剂、N-Acetylcysteine、rhEGF、A83-01、Nicotinamide、Wnt3a、Noggin以及R-spondin-1，还包括胎牛血清、Y-27632、FGF-10、Dexamethasone、N2、FGF-2、Prostaglandin E2、CHIR 99021、Forskolin和Antibiotic-Antimycotic。然而，这些培养基的设计存在以下问题和缺点，第一种方法即文献报道的方法使用气液培养方法，增加了操作步骤，且在培养基种添加Wnt激动剂R-spondin 1、BMP抑制剂Noggin等调控因子，此类重组蛋白价格昂贵，且主要生产企业均位于国外，这导致黑色素瘤类器官专用培养基存在生产成本较高、主要添加成分需要进口、采购周期长且供应周期易受外部环境影响等问题。这些问题极大的阻碍了黑色素瘤类器官的大规模培养和更广范围的应用研究。第二种方法即专利CN114736869A公开的方法，虽然使用简便的基质胶包埋法进行培养，但培养基中同样需要添加Wnt激动剂R-spondin 1、WNT3A等调控因子，且需要添加胎牛血清以增加培养的成功率，同样会导致培养成本较高。因此，迫切希望开发更低成本、更易用的黑色素瘤类器官专用培养基的出现。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种全新的黑色素瘤类器官无血清专用培养基的组成和培养方法，其目的在于，提供一种无需添加Wnt激动剂及WNT3A等昂贵重组蛋白、无需添加胎牛血清的黑色素瘤类器官无血清专用培养基。
为实现上述目的，本发明提供的方案是这样实现的：一方面，本发明所述黑色素瘤类器官无血清专用培养基由基础培养基和培养添加物两部分组成。基础培养基为含有1％青-链霉素、1％HEPES缓冲液、1％GlutaMax溶液的Advanced DMEM/F12培养基。
进一步地，所述培养添加物包括生长因子EGF、Neuregulin1，N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-Acetylcysteine)、尼克酰胺，小分子抑制剂Y-27632，B27 supplement、N2supplement。
进一步地，所述培养添加物的终浓度为：EGF：0.05-0.5μg/mL，Neuregulin1：0.5-50nM，N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-Acetylcysteine)：0.1-10mM，尼克酰胺：0.5-50mM，小分子抑制剂Y-27632：0.5-50μM，B27 supplement：2％，N2 supplement：2％。
进一步地，所述黑色素瘤类器官无血清专用培养基在使用时配制，在已配制好的基础培养基中，按终浓度加入所有培养添加物，混合均匀后即可获得。
在本发明的另一个方面中，提供一种黑色素瘤类器官体外培养的方法，包括以下步骤：
(1)将黑色素瘤组织样本放入10cm细胞培养皿，用5mL无菌PBS清洗后，切成3mm3左右大小，加入10mL无菌PBS离心清洗后，加入用5mL前述基础培养基配制的浓度为0.5mg/mL的胶原酶中，放置37度消化60分钟左右；
(2)将上述含细胞的培养基通过100μm孔径的细胞滤网，加入10mL基础培养基上下吹打5次；细胞计数后按照2×106个细胞/mL的浓度重悬于冷的CultrexTM growth factorreduced BME type2中，加入24孔细胞培养板，每孔加40微升，放入37度细胞培养箱20分钟，使含有细胞的BME固化；
(3)每孔加入上述黑色素瘤类器官无血清专用培养基400微升，放入5％CO2浓度、37℃细胞培养箱培养，每2～3天更换一次上述黑色素瘤类器官无血清专用培养基，7天左右即可获得所需黑色素瘤类器官。
由于本发明所采用培养方法不需要气液培养方法，不需要制备WENR条件培养基或添加价格昂贵的重组蛋白成分，也不需要添加胎牛血清作为生长支持物，从而可以得到以下有益效果：
(1)本发明所述培养基对于黑色素瘤类器官的生长有较好的支持和促进作用，而无需添加价格昂贵的WNT3A、EGF、NOGGIN和Wnt激动剂R-Spondin1在内的重组蛋白，也不需要添加胎牛血清作为生长支持物。7天左右即可获得典型的黑色素瘤类器官，在体外较好的保留了患者来源肿瘤一致性和保留异质性，为进一步进行研究应用奠定了基础；
(2)本发明所述培养基的成本较其他方法有明显下降，主要原因在于去除了价格较为昂贵的Wnt信号调节重组蛋白R-Spondin和发育调控蛋白Noggin等重组蛋白，也无需添加胎牛血清作为生长支持物，而使用其他成分替代，从而为以后进行大规模黑色素瘤类器官培养用于药物筛选等研究应用提供了可能。
(3)本发明所述培养方法步骤清晰简便，不需要准备气液培养条件，不需要单独制备和生产WNT条件培养基及其他条件培养基。操作人员对培养结果影响较小，提高了培养结果的一致性，为后续大规模培养提供了便利条件。
附图说明
无。
具体实施方式
实施例：
本发明的优选实施方式是，提供一种无需添加Wnt通路调控重组蛋白及BMP抑制剂头蛋白Noggin的黑色素瘤类器官无血清专用培养基及培养方法，所述培养基包括无血清基础培养基和培养添加物。所述基础培养基为含有1％青-链霉素、1％HEPES缓冲液、1％GlutaMax溶液的Advanced DMEM/F12培养基，所述培养添加物由以下终浓度的成分组成：EGF：5μg/mL、Neuregulin1：50nM，N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-Acetylcysteine)：10mM、尼克酰胺：5mM，小分子抑制剂Y-27632：10μM，B27 supplement：2％、N2supplement：2％。在使用时将所有培养添加物按照终浓度加入所述基础培养基，即可获得所述黑色素瘤类器官无血清专用培养基。所述黑色素瘤类器官培养方法为，将黑色素瘤组织样本放入10cm细胞培养皿，用5mL无菌PBS清洗后，切成3mm3左右大小，加入10mL无菌PBS离心清洗后，加入用5mL前述基础培养基配制的浓度为0.5mg/mL的胶原酶中，放置37度消化60分钟左右，将上述含细胞的培养基通过100μm孔径的细胞滤网，加入10mL基础培养基上下吹打5次，细胞计数后按照2×106个细胞/mL的浓度重悬于冷的CultrexTM growth factor reduced BME type2中，加入24孔细胞培养板，每孔加40微升，放入37度细胞培养箱20分钟，使含有细胞的BME固化；每孔加入上述黑色素瘤类器官无血清专用培养基400微升，放入5％CO2浓度、37℃细胞培养箱培养，每2～3天更换一次上述黑色素瘤类器官无血清专用培养基，7天左右即可获得所需黑色素瘤类器官。为后续进一步研究提供了较好的研究样本。
对比例：
本发明的对比例采用Neal et al.已发表的文献中所描述的方法(OrganoidModeling of the Tumor Immune Microenvironment.Cell(2018).175,1972-1988e1916.)，首先将含有通透膜底部的小室插入组织培养皿中，加入制备好的混合胶原基质和10倍浓缩无菌培养基，避免出现气泡，从而形成气液培养板。患者来源的黑色素瘤组织在冰上切碎后，用培养基洗涤两次，用1毫升I型胶原凝胶重悬，在预先固化的1毫升胶原凝胶上分层，在一个30毫米×0.4毫米内小室内形成如上所述的气液培养系统，将此系统置于含有60mL Advanced DMEM/F12培养基中，加入Wnt3a，RSPO1，noggin条件培养基，1mM的HEPES溶液，1％谷氨酰胺，10mM烟酰胺，N-乙酰半胱氨酸，，1％不含维生素A的B-27supplement，0.5mM的A83-01，1％青霉素-链霉素，1％谷氨酰胺，10nM胃泌素，10mM的SB-202190和50ng/mL的EGF。然后更换外盘盖。用200单位/ml胶原酶IV在37℃下分离30分钟，每14-30天传代器官。本发明采用对比例的方法也能够获得所需黑色素瘤类器官，所获得的黑色素瘤类器官呈现典型的肿瘤类器官三维结构，生长良好。
综上，本发明所述黑色素瘤类器官无血清专用培养基及培养方法能够有效支持黑色素瘤类器官的体外生长，且生长迅速，所形成的黑色素瘤类器官呈现典型的三维球状或三维不规则细胞团块，可以生长至直径较大水平依然保持肿瘤类器官形态。与已公开文献与专利所述方法比较，本专利所述培养基去除了价格昂贵的重组蛋白类添加成分，不需要添加胎牛血清作为生长支持物，而是改用其他生长因子替代，从而极大地降低了专用培养基的成本，不需要制备气液培养装置作为肿瘤类器官生长的支持，且培养效果与已公开的方法比较相一致。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本领域的技术人员应该了解本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都属于本发明保护的范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.一种黑色素瘤类器官无血清专用培养基，其特征在于：包括基础培养基和培养添加物，基础培养基为含有1％青-链霉素、1％HEPES缓冲液、1％GlutaMax溶液的AdvancedDMEM/F12培养基，培养添加物包括生长因子EGF、Neuregulin1，N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-Acetylcysteine)、尼克酰胺，小分子抑制剂Y-27632，B27 supplement、N2 supplement。
2.根据权利要求1所述的一种黑色素瘤类器官无血清专用培养基，其特征在于，所述培养添加物的终浓度为：EGF：0.05-0.5μg/mL、Neuregulin1：0.5-50nM，N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-Acetylcysteine)：0.1-10mM、尼克酰胺：0.5-50mM，小分子抑制剂Y-27632：0.5-50μM，B27 supplement：2％、N2 supplement：2％。
3.根据权利要求1所述的一种黑色素瘤类器官无血清专用培养基，其特征在于，所述基础培养基为无血清培养基。
4.根据权利要求1或2所述的一种黑色素瘤类器官无血清专用培养基，其特征在于，所述培养基不需要添加Wnt信号调节蛋白R-Spondin或者发育调控蛋白Noggin等重组蛋白，不需要单独制备WNT条件培养基。
5.根据权利要求1所述的一种黑色素瘤类器官无血清专用培养基，其特征在于，在已配制好的基础培养基中，按终浓度加入所有培养添加物，混合均匀后即可获得。
6.一种黑色素瘤类器官培养方法，其特征在于，将患者来源的黑色素瘤组织样本处理清洗后加入胶原酶消化，将消化后的细胞溶液通过100μm的细胞滤网，离心后将细胞重悬于冷的CultrexTMgrowth factor reduced BME type2中，接种于细胞培养板，待含有细胞的BME固化后，加入权利要求1～5任意一项所述的培养基，放入5％CO2浓度、37℃细胞培养箱培养，每2～3天更换一次上述培养基，7天左右即可获得所需黑色素瘤类器官。
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