CN110628864A - 一种水凝胶包被的微组织块培养药敏检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种水凝胶包被的微组织块培养药敏检测方法，还可以称为“果冻”药敏检测法，其主要包括以下步骤：肿瘤标本采集，肿瘤样本处理，组织块接种，药物处理，敏感性检测和和结果分析，分析时根据吸光度值换算公式进行换算得出，将孔板各孔的吸光度值进行换算，进而计算出每种药物对肿瘤组织块活性的影响。本发明保存了肿瘤的异质性和微环境，操作简单，实验条件要求低，可以快速、准确的筛选出最适合患者的肿瘤化疗方案，本发明的方法也可以也可以用于移植瘤小鼠（含PDX模型）肿瘤组织的微组织块培养和药敏检测，还可用于检测正常组织对各种干预措施的反应，如正常肝脏组织毒理学检测。

Description

一种水凝胶包被的微组织块培养药敏检测方法
技术领域
本发明涉及肿瘤药物敏感性检测技术领域，尤其涉及一种水凝胶包被的微组织块培养药敏检测方法。
背景技术
2018年2月，国家癌症中心发布了最新一期的全国癌症统计数据。2014年全国恶性肿瘤估计新发病例数380.4万例(男性211.4万例,女性169.0万万例)，平均每天超过1万人被确诊为癌症，每分钟有7个人被确诊为癌症[1, 2]。目前,大多数恶性肿瘤疗效欠佳，其中一个很重要的原因是肿瘤的异质性。所谓的肿瘤异质性就是，同一肿瘤类型的不同病人间或者同一病人肿瘤内部不同细胞之间存在着多种生物学差异。这种差异决定了同一种肿瘤不同患者之间对同一治疗方案存在着显著的疗效差异。目前大部分医生都是根据NCCN等行业指南的标准方案对患者进行治疗，对于个体而言这种标准化疗方案就缺乏相应针对性，具有一定的盲目性。研究表明目前平均化疗有效率仅有25-30%，因此利用药物敏感性实验指导个性化精准用药，来提高治疗的效果、减轻药品不良反应，已成为国内外研究的热点。
肿瘤微环境是指肿瘤细胞与肿瘤局部浸润的免疫细胞、基质细胞、内皮细胞及所分泌的活性介质等共同构成的局部内环境。大量的实验研究证明，复杂的肿瘤微环境调节着肿瘤的生长、浸润和转移，肿瘤的发展依赖于这个复杂的动态的微环境[3]。近年来的一些研究表面肿瘤微环境与细胞耐药存在密切关系。对癌症肿瘤用药往往达不到预期效果的一个重要原因很可能是存在于肿瘤微环境中的健康细胞给癌细胞提供了相应的条件，使它能抵抗药物并存活下来。改变癌细胞与周围细胞（肿瘤微环境）的相互作用，可以提高抗癌药物的功效[4]。
由于肿瘤的异质性和微环境与肿瘤的药物反应密切相关，所以一种理想的肿瘤药物敏感性检测的方法需要能重现患者肿瘤的异质性与微环境。人源肿瘤异种移植（Patient-derived tumor xenograft ，PDX）模型是将来源于肿瘤患者的组织块直接植入免疫缺陷鼠的体内形成的移植瘤模型。PDX模型由于保存了肿瘤组织的原始三维结构，使得肿瘤的异质性和微环境在小鼠体内得到了很好的重新，利用PDX模型进行的肿瘤药物敏感性检测和临床相符率达90%左右，是目前已知的最准确的药物筛选方法[5]。但是利用PDX模型进行肿瘤治疗方案的筛选需要的时间比较长（一般4-6月）、费用高（十万以上）、对实验条件要求高（需要SPF级的动物实验室），尚不能很好的满足临床的实际需求。
发明内容
本发明为了解决现有技术的上述不足，提出了一种水凝胶包被的微组织块培养药敏检测方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一种水凝胶包被的微组织块培养药敏检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
a）肿瘤标本采集：手术中切取肿瘤边缘生长比较旺盛、无溃疡坏死的肿瘤组织，迅速装入含有组织保存液的离心管中，离心管装入冰包低温运输；
b）肿瘤样本处理：在实验室生物安全柜内用0.4%的台盼蓝染液检测肿瘤组织活性，剔除没有活性的组织。然后将组织放入0.2%的碘伏溶液中浸泡30秒钟消毒，再用含有3%双抗的PBS冲洗组织。将肿瘤组织分割成2×2×2mm3的组织块，96孔细胞培养板每一个孔内放一块切割后组织块（其他规格的细胞培养板或者培养皿可以根据容积大小放入适当数量的组织块）细胞培养板放在冰上或者蓝冰冰砖上预冷；
c）组织块接种：将一定量4℃预冷的I型胶原蛋白/组织培养基混合液溶液（80ul，96孔细胞培养板）加入到在含有组织块的细胞培养孔中，，将全部组织块淹没，然后盖上盖子，放入37℃，5% 二氧化碳含量的细胞培养箱中孵育2-3 小时，待胶原蛋白凝固后，将培养板取出在生物安全柜里加入适量的组织培养基（100ul，96细胞培养板），再放入细胞培养箱中培养。
d）药物处理：组织块在细胞培养箱内培养24小时候后吸弃原来的培养基，加入含有测试药物的完全培养基，每24小时更换一次含有测试药物的完全培养基；
e）敏感性检测：组织块在使用含有测试药物的完全培养基药培养了3至7天后，吸弃含药培养基，用PBS缓冲液洗涤3次，然后加入MTT溶液，6小时后将MTT溶液吸去，用眼科镊将组织块从水凝胶中取出，放入新的细胞培养孔中再加入200ul DMSO（96孔细胞培养板）试剂并震荡10min，从装有组织块的细胞培养板中的每个板孔中吸取100ul溶液，把吸取的溶液加入新的细胞培养板的孔板中，使用酶标仪检测每孔的吸光度值；
f）结果分析：根据吸光度值换算公式，将孔板各孔的吸光度值进行换算，进而计算出每种药物对肿瘤组织块活性的影响。
进一步地，在步骤a）中，所采集的肿瘤组织是医生在做肿瘤切除手术时从肿瘤生长比较旺盛的部位上切取的，切除的肿瘤组织装入含有组织保存液的50ml离心管中，冰包低温运输至实验室，标本离体至低温运输到实验室的时间最长不超过48小时，最好在2个小时内。
进一步地，在步骤c）中，采用的细胞培养板采用96孔、48孔或24孔的孔板，加入的I型胶原蛋白溶液还可以替换成Matrigel胶或其他温敏水凝胶；在孵育时孔板放入细胞培养箱中，温度控制在37℃并孵育2-3小时，水凝胶凝固后每孔加入加入适量的组织培养基，然后将培养板继续放入细胞培养箱中培养。
进一步的，在步骤e）中，采用的MTT溶液可换成CCK试剂，MTS试剂等检测试剂。
与现有技术相比，本发明可称为“果冻”药敏检测法，该方法保存了肿瘤的异质性和微环境，操作简单，实验条件要求低，可以快速、准确的筛选出最适合患者的肿瘤化疗方案，本发明的方法也可以用于检测正常组织对各种干预措施的反应，比如用与正常肝脏组织毒理学检测。
具体实施方式
下面结合实施例对发明进行详细的说明。
本发明提出的水凝胶包被的微组织块培养药敏检测方法，主要包括以下步骤：
a.肿瘤标本采集：由医生在手术台上采集生长比较旺盛、无溃疡坏死的肿瘤组织，迅速装入含有组织保存液的50ml离心管中，用冰包2小时内带回实验室。
b.肿瘤样本处理：在细胞实验室生物安全柜内将肿瘤组织进行活性鉴定、修整、消毒和清洗后分割成2×2×2mm3的组织块，96孔细胞培养板每一个孔内放一块切割后组织块细胞培养板放在冰上或者蓝冰冰砖上预冷。
c. 组织块接种：将一定量4℃预冷的I型胶原蛋白/组织培养基混合液溶液（80ul，96孔细胞培养板）加入到在含有组织块的细胞培养孔中，将全部组织块淹没，然后盖上盖子，放入37℃，5% 二氧化碳含量的细胞培养箱中孵育2-3 小时，待胶原蛋白凝固后，将培养板取出在生物安全柜里加入适量的组织培养基（100ul，96细胞培养板），再放入细胞培养箱中培养。
d.药物处理：组织块培养24小时候后吸弃原来的培养基，加入含有测试药物的完全培养基，每24小时更换一次含有测试药物的完全培养基。
e. 敏感性检测：给药3-7天后吸弃含药培养基，用PBS洗涤3次，然后加入MTT溶液（或者CCK，MTS等检测试剂），6小时候后吸去MTT溶液，用眼科镊将组织块从水凝胶中取出，放入新的细胞培养孔中再加入200ul DMSO（96孔细胞培养板）试剂并震荡10min，从每孔吸取100ul溶液，加入新的96孔板，酶标仪上检测每孔的吸光度值。
f.结果分析：根据公式，将各孔吸光度值进行换算，计算每种药物对肿瘤组织块活性的影响。公式为A=abc，其中a吸光系数，单位L/(g·cm)，b为光在样本中经过的距离(通常为比色皿的厚度)，单位cm，c为溶液浓度，单位g/L。
在检测时，参照下表（表1）进行判断每种药物对肿瘤组织块活性的影响。
表1
其中，表1中的药物为本发明做检测时检测结果，其中抑制率的临界值为30%，抑制率低于30%的药物可视为无效药物。
上述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利和保护范围应以所附权利要求书为准。

Claims (4)

1.一种水凝胶包被的微组织块培养药敏检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
a）肿瘤标本采集：手术中切取肿瘤边缘生长比较旺盛、无溃疡坏死的肿瘤组织，迅速装入含有组织保存液的离心管中，离心管装入冰包低温运输；
b）肿瘤样本处理：在实验室生物安全柜内用0.4%的台盼蓝染液检测肿瘤组织活性，剔除没有活性的组织，然后将组织放入0.2%的碘伏溶液中浸泡30秒钟消毒，再用含有3%双抗的PBS冲洗组织，将肿瘤组织分割成2×2×2mm3的组织块，96孔细胞培养板每一个孔内放一块切割后组织块，细胞培养板放在冰上或者蓝冰冰砖上预冷；
c）组织块接种：将一定量4℃预冷的I型胶原蛋白溶液加入到在含有组织块的细胞培养孔中，将全部组织块淹没，然后盖上盖子，放入37℃二氧化碳含量为5%的细胞培养箱中孵育2-3 小时，待胶原蛋白凝固后，将培养板取出在生物安全柜里加入适量的组织培养基，再放入细胞培养箱中培养；
d）药物处理：组织块在细胞培养箱内培养24小时候后吸弃原来的培养基，加入含有测试药物的完全培养基，每24小时更换一次含有测试药物的完全培养基；
e）敏感性检测：组织块在使用含有测试药物的完全培养基药培养了3至7天后，吸弃含药培养基，用PBS缓冲液洗涤3次，然后加入MTT溶液，6小时后将MTT溶液吸去，用眼科镊将组织块从水凝胶中取出，放入新的细胞培养孔中再加入200ul DMSO试剂并震荡10min，从装有组织块的细胞培养板中的每个板孔中吸取100ul溶液，把吸取的溶液加入新的细胞培养板的孔板中，使用酶标仪检测每孔的吸光度值；
f）结果分析：根据吸光度值换算公式，将孔板各孔的吸光度值进行换算，进而计算出每种药物对肿瘤组织块活性的影响。
2.如权利要求1所述的水凝胶包被的微组织块培养药敏检测方法，其特征在于：在步骤a）中，所采集的肿瘤组织是医生在做肿瘤切除手术时从肿瘤生长比较旺盛的部位上切取的，切除的肿瘤组织装入含有组织保存液的50ml离心管中，冰包低温运输至实验室，标本离体至低温运输到实验室的时间最长不超过48小时，最好在2个小时内。
3.如权利要求1所述的水凝胶包被的微组织块培养药敏检测方法，其特征在于：在步骤c）中，采用的细胞培养板采用96孔、48孔或24孔的孔板，加入的I型胶原蛋白溶液还可以替换成Matrigel胶或其他温敏水凝胶；在孵育时孔板放入细胞培养箱中，温度控制在37℃并孵育2-3小时，水凝胶凝固后每孔加入加入适量的组织培养基，然后将培养板继续放入细胞培养箱中培养。
4.如权利要求1所述的水凝胶包被的微组织块培养药敏检测方法，其特征在于：在步骤e）中，采用的MTT溶液可换成CCK试剂，MTS试剂等检测试剂。
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