CN108102129A - 一种纤维素海绵的制备方法 - Google Patents

一种纤维素海绵的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明是关于一种制备一纤维素海绵的方法，包含：(A)提供具有一可自我交联的取代基的羟丙基纤维素溶液；及(B)加入引发剂与催化剂进入具有所述可自我交联的取代基的羟丙基纤维素溶液进行交联，其中具有所述可自我交联的取代基的羟丙基纤维素的制备方法包含：(a)将羟丙基纤维素溶于二甲基甲酰胺中，以形成一羟丙基纤维素溶液；(b)将具有所述可自我交联的取代基的化合物溶于二甲基甲酰胺后，缓慢滴入到所述羟丙基纤维素溶液中；(c)加入醇类进行反应；及(d)于室温下反应并干燥以形成具有所述可自我交联的取代基的羟丙基纤维素。

Description

一种纤维素海绵的制备方法
技术领域
本发明是关于一种纤维素海绵的制备方法。
背景技术
细胞培养及组织工程是再生医学中的关键技术，其是藉由人为方式大量增殖，以提供足够的细胞进行实验分析，再模拟并提供组织细胞生长发育所需的条件，使经由培养所得的细胞能生长分化成具有特定性质的细胞或组织。
虽然运用再生医学不仅可解决病患等待器官捐赠的不确定性，更可消除器官移植后免疫系统可能发生排斥的潜在疑虑。然而，其发展却受限于少数技术，例如细胞培养及立体支架。
在生物细胞的领域中，通常会认为三维培养比二维单层培养有更好的生物模拟性。大量的三维细胞培养方法因此应运而生，例如水凝胶(hydrogel)培养、悬浮(suspension)培养、悬滴(hanging drop)培养、微团(micromass)培养、以及无接触(non-adherent)基质。细胞培养技术中，为使经由培养所得的细胞最终能生长成为符合理想功能及型态的组织或器官，支架(scaffold)的运用扮演了极为重要的角色。支架的功能是提供一个适宜细胞生长的立体框架结构，也就是一般所称的三维支架，其具有大量的孔洞供应细胞附着或接种，再藉此导引细胞朝依规划的三维方向进行生长分化，产生拟似的再生组织或器官。
传统的平面细胞培养中，细胞与细胞间仅有极小部份的接触面积，细胞一半的面积接触于培养盘，而另一半接触培养基。而立体的培养环境能够提供其它利基，其能够：有更好的生物化学讯号引导细胞功能、提供细胞在支架内迁徙(migration)的功能、增加细胞的密度以及细胞彼此间的讯号传递、提供细胞贴附的分子、诱导细胞分化。而海绵(sponge)型态的立体支架，其孔径若大于50μm，即可促进细胞迁徙，此外彼此相通的孔状结构，也使得细胞播种以及养分的散布更加均匀。
因此，如何提供一种三维支架的制备方法及制备装置，能以简易的方式及设备，即可达到制备三维支架的目的，以稳定培养细胞并使得细胞最终能生长成为符合理想功能及型态的组织或器官是为当前重要的课题之一。
有鉴于上述课题，本发明的目的为提供一种纤维素海绵的制备方法，能以简易的方式及溶液，即可达到制备三维支架的目的，以简化制备支架的繁复操作与制备时间。
发明内容
本发明所称的“纤维素海绵”一词，是包含任何形状、大小或组成的三维结构，可用作为至少一种细胞附着、依附或植入的结构，且能达成使细胞正常生长、及/或增殖及/或分化的目的者。在本发明的一实施例中，由于利用本发明揭露的制备方法所制成的纤维素海绵是以医疗用途为导向，使用上仍以具有生物包容性者为佳。在本发明的另一实施例中，利用本发明揭露的制备方法所制成的纤维素海绵是用于细胞培养，并具有高度的透气性及养分可渗透性(即具有较佳的比表面积)。
本发明所称的“引发剂”一词，是指一类容易受热或光照条件下分解出自由基的化合物，能使单体进行聚合反应的物质，可用于引发单体的不饱和链产生自由基聚合和共聚合反应，也可用于不饱和高分子的交联固化反应。
本发明提供一种制备一纤维素海绵的方法，包含：(A)提供具有一可自我交联的取代基的羟丙基纤维素溶液；及(B)加入引发剂与催化剂进入具有所述可自我交联的取代基的羟丙基纤维素溶液进行交联，其中具有所述可自我交联的取代基的羟丙基纤维素的制备方法包含：(a)将羟丙基纤维素溶于二甲基甲酰胺中，以形成一羟丙基纤维素溶液；(b)将具有所述可自我交联的取代基的化合物溶于二甲基甲酰胺后，缓慢滴入到所述羟丙基纤维素溶液中；(c)加入醇类进行反应；及(d)于室温下反应并干燥以形成具有所述可自我交联的取代基的羟丙基纤维素。
依据本发明的方法，在一较佳实施例中，具有所述可自我交联的取代基的化合物包含但不限于烯丙基异氰酸酯、甲基丙烯酸、丙烯酸或甲基丙烯酸环氧丙酯。
依据本发明的方法，在一较佳实施例中，所述醇类的体积为所述二甲基甲酰胺的总体积的1.5-50%；在另一较佳实施例中，所述醇类的体积为所述二甲基甲酰胺的总体积的7.5-40%；在又一较佳实施例中，所述醇类的体积为所述二甲基甲酰胺的总体积的10-35%。
依据本发明的方法，在一较佳实施例中，所述醇类包含但不限于甲醇、乙醇、丙醇或丁醇。
依据本发明的方法，在一较佳实施例中，所述引发剂为过硫酸盐类引发剂，而所述催化剂为有机胺类催化剂。在另一较佳实施例中，所述过硫酸盐类引发剂包含但不限于过硫酸钠、过硫酸铵或过硫酸钾，而所述有机胺类催化剂包含但不限于四甲基乙二胺(N,N,N',N'- tetramethylethylenediamine，TEMED)、N,N,N',N'-四-(2-羟丙基)乙二胺(N,N,N',N'-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine，TKHED)、N,N,N',N'-四甲基-3-(10H-吩噻嗪-10-基)-1,2-丙二胺(N,N,N',N'-tetramethyl-3-(10H-phenothiazin-10-yl)-1,2-propanediamine)、N，N，N'，N'-四甲基孕-5-烯-3β，20α-二胺(N,N,N',N'-tetramethylpregn- 5-ene-3β,20α-diamine)、N,N,N',N-四甲基-1,4-丁二胺(N,N,N',N'-tetramethyl-1,4-butanediamine)、4,4'-(对二甲氨基)二苯基甲烷(4,4'-tetramethyldiaminodiphenylmethane)、N,N,N',N'-四甲基-1,4-苯二胺(N,N,N',N'-tetramethyl-1,4- benzenediamine)或N,N,N',N'-四甲基-1,4-萘二胺(N,N,N',N'-tetramethyl-1,4- naphthalenediamine)。
附图说明
图1为本发明的有额外添加醇类的纤维素海绵的孔径分布图。
图2为本发明的有额外添加醇类的纤维素海绵，以光学显微镜观察纤维素海绵干燥状态的放大图。
图3为本发明的有额外添加醇类的纤维素海绵，以光学显微镜观察纤维素海绵湿润状态的放大图。
图4为依循本发明，但无额外添加醇类的纤维素海绵，以光学显微镜观察纤维素海绵干燥状态的放大图。
图5为依循本发明，但无额外添加醇类的纤维素海绵，以光学显微镜观察纤维素海绵湿润状态的放大图。
图6为本发明的有额外添加醇类的纤维素海绵，在种植细胞后，以光学显微镜观察的放大图。
图7为依循本发明，但无额外添加醇类的纤维素海绵，在种植细胞后，以光学显微镜观察的放大图。
图8为本发明的有额外添加醇类的纤维素海绵，以扫描式电子显微镜观察的剖面图。
图9为本发明的有额外添加醇类的纤维素海绵，并有细胞培养在内，以共轭焦微镜观察的剖面图。
具体实施方式
纤维素海绵的制备
本发明的有额外添加醇类的纤维素海绵的制备分成两步骤：
1. 合成具有取代基的羟丙基纤维素：
(1) 将羟丙基纤维素(hydroxypropyl cellulose，HPC)(Mn≈10,000)以甲苯(toluene)共沸蒸馏进行脱水；
(2) 将3.6 g脱水处理后的羟丙基纤维素(HPC)溶解于200 ml二甲基甲酰胺(Dimethylformamide，DMF)中；
(3) 将4.18 ml烯丙基异氰酸酯(allyl isocyanate)溶于5 ml二甲基甲酰胺后，缓慢滴入到上述羟丙基纤维素溶液中；
(4) 加入24.6 ml醇类(如丙醇)进行反应，醇类含量为二甲基甲酰胺总体积的12 %(二甲基甲酰胺205 ml×12%= 24.6 ml，体积比二甲基甲酰胺：醇类=8.3:1)；
(5) 加入一滴催化剂月桂酸二丁基锡(dibutyltin dilaurate)；
(6) 于室温下搅拌48小时；
(7) 利用旋转真空减压浓缩机(rotatory evaporator)缩减体积，再以乙醚(ether)分离出高分子；及
(8) 利用真空过滤(vacuum filtration)收集产物并析出于乙醚中，残存的杂质利用索氏萃取法(Soxhlet extraction)从乙醚中移除以形成具有取代基的羟丙基纤维素。
2. 固化过程
(1) 将干燥状态的具有取代基的羟丙基纤维素配制成10 wt%水溶液，放置于玻璃管(直径10 mm×高50 mm)中；
(2) 于2-8 ℃环境下，加入1.2 g 过硫酸铵(ammonium persulfate, APS)与 35μL四甲基乙二胺 (tetramethylethylenediamine, TEMED)；
(3) 将玻璃管放置于低温 (-20 ℃) 中反应24 小时；及
(4) 将玻璃管移出于室温下反应 48 小时，再经过清洗、冷冻干燥，便完成成品。
本发明的无额外添加醇类的纤维素海绵的制备方法如上，但于第1步骤中不额外添加醇类，即删除第1的(4)步骤。
纤维素海绵的外观与孔径测量
测量有额外添加醇类的纤维素海绵的干燥状态与湿润状态时的直径与厚度，其结果如表1。
表1：有额外添加醇类的纤维素海绵的外观尺寸
如表1所示，有额外添加醇类的纤维素海绵的直径为9 mm，适合放入48孔培养盘中，易于与一般细胞培养载具搭配使用。而有额外添加醇类的纤维素海绵的厚度为1 mm，可避免厚度过厚时，会无法使用光学显微镜做初阶的观察。因此有额外添加醇类的纤维素海绵的外观易于与常见细胞培养设备搭配使用。
接着使用软件image J对有额外添加醇类的纤维素海绵孔径做分析统计，其结果如图1与表2。
表2：本发明的有额外添加醇类的纤维素海绵的孔径分布
经由分析孔径大小，可知有额外添加醇类的纤维素海绵的孔径大多落在50~250 μm，此尺寸大小的孔洞可提供细胞适当的生长环境，以一定大小的孔洞限制细胞团大小，不会因过大的孔洞造成细胞三维结构失真，或是此细胞团块过大导致中心细胞死亡的现象发生。
纤维素海绵的结构
将干燥状态的纤维素海绵放置于载具(dish)上，以光学显微镜观察其内部孔洞型态。湿润状态则是将其以去离子水浸润纤维素海绵，以光学显微镜观察其一天后内部孔洞型态。
图2、图3为本发明的有额外添加醇类的纤维素海绵，以光学显微镜观察纤维素海绵干燥状态与湿润状态，可知在湿润状态与干燥状态下，两者孔洞型态接近，不会因为加入水后使孔壁结构受影响，因此可知本发明的有额外添加醇类的纤维素海绵孔形稳定性高。
图4、图5为依循本发明，但无额外添加醇类的纤维素海绵，以光学显微镜观察纤维素海绵干燥状态与湿润状态，可知无额外添加醇类的纤维素海绵在湿润状态下，会因水份吸入后，使孔壁结构受影响，此时孔壁宽度变宽，进而导致孔洞体积缩小。此外，由图可知内部气泡不易排出，此缺点会使无额外添加醇类的纤维素海绵悬浮于培养液中，影响后续细胞生长。因此，可知依循本发明，但无额外添加醇类的纤维素海绵，结构稳定性差。
纤维素海绵的应用
细胞培养条件：HepG2(人类肝癌细胞)，培养液为高葡萄糖的Dulbecco’s modifiedEagle’s medium(DMEM)，内含10 %胎牛血清，培养条件为37℃与 5% CO2。
细胞种植步骤：将纤维素海绵放入48孔盘中，将HepG2的细胞浓度调整至5 ×106细胞/ml，取60 μL种入纤维素海绵内，放入培养箱中4小时后，取出并加入500 μL培养液。后续培养方法为每隔三日，以磷酸盐缓冲溶液清洗后，加入新的培养液。
图6、图7为种植HepG2后24小时观察，图6为有额外添加醇类的纤维素海绵；图7为无额外添加醇类的纤维素海绵。在种植HepG2后的隔日，以光学显微镜观察的两种纤维素海绵的放大图。可发现本发明的有额外添加醇类的纤维素海绵(图6)，在细胞种入后，孔形结构依然维持住，且细胞型态呈现团状(spheroid)，较趋向肝细胞在体内真实的型态。而依循本发明但无额外添加醇类的纤维素海绵(图7)，在细胞种入后，不仅孔形结构无法维持，形成纺锤状的孔洞，孔洞尺寸明显缩小，且细胞型态趋于凋亡。因此可知孔形影响细胞型态甚大。
纤维素海绵的电子显微剖面结构
扫描式电子显微样品制备方法：将有额外添加醇类的纤维素海绵以去离子水润湿后，以酒精梯度脱水(50%、70%、90%、100%)，最后利用六甲基二硅氮烷 (hexamethyldisilazane，HMDS)处理，于化学排气柜中风干。
扫描式电子显微步骤：将制备好的纤维素海绵固定于贴有导电碳胶的载台，于表面镀金，之后将载体放入腔体中并抽真空，即可利用计算机撷取扫描式电子显微镜高倍率的图像。
图8为以扫描式电子显微镜观察有额外添加醇类的纤维素海绵剖面图，可知内部结构是多孔结构，有利于细胞生长于其中。多孔结构不仅可提供细胞生长及迁移的途径，让营养物质或讯号因子可通过孔洞传送至纤维素海绵内部的细胞，也能使细胞代谢后的物质有通道能排出纤维素海绵。因此，此多孔特点能提供一个适合细胞生长的环境。
纤维素海绵的共轭焦显微剖面结构
细胞种植步骤：将有额外添加醇类的纤维素海绵放入48孔盘中，将HepG2的细胞浓度调整至5×106 细胞/ml，取60 μL种入纤维素海绵内，放入培养箱中4小时后，取出并加入500μL培养液。于二日后以磷酸盐缓冲溶液清洗，加入新的培养液。
配制荧光染剂：使用The LIVE/DEAD® Viability/Cytotoxicity Assay Kit(Molecular Probes)，依循染剂的标准步骤配制，取20 μL的2 mM EthD-1原液与5 μL的4mM calcein AM原液加入10 ml磷酸盐缓冲溶液中，混合均匀后，荧光染剂即配制完成。
共轭焦显微样品制备方法：将有额外添加醇类的纤维素海绵放入多孔盘中，每片纤维素海绵加入200 μL荧光染剂，在室温反应30分钟。再以磷酸盐缓冲溶液清洗多次，移除染剂。
共轭焦显微上机步骤：将制备好有额外添加醇类的纤维素海绵放在载玻片上，在共轭焦显微镜上，观察红色荧光与绿色荧光，即可知细胞存活情况。
图9为共轭焦微镜观察有额外添加醇类的纤维素海绵的剖面图，此图为培养三日的情况。可藉由荧光颜色知道细胞存活状况。绿色代表活细胞，红色代表死细胞。由图上可知细胞于有额外添加醇类的纤维素海绵内培养三日后，多为绿色(无箭头处)，红色为极少数(箭头处)。因此可知经过三天的培养后，其存活比例高。
细胞培养于纤维素海绵的存活情况
细胞种植步骤：将有额外添加醇类的纤维素海绵放入48孔盘中，将HepG2的细胞浓度调整至5×106 细胞/ml，取60 μL种入纤维素海绵内，放入培养箱中4小时后，取出并加入500μL培养液。每隔三日，以磷酸盐缓冲溶液清洗，加入新的培养液。
使用试剂种类：以CellTiter-Glo® 3D Cell Viability Assay (Promega)量化细胞存活情况。将CellTiter-Glo® 3D试剂与培养液以体积比 1:1混和，即完成混和试剂配制。
将200 μL混和试剂加入每片纤维素海绵中，反应30分钟后，读取冷光数据，单位为相对冷光值(relative luminescence unit，RLU) 。数值越高，表示细胞存活越好，其结果如表3。
表3：细胞存活情况
如表3所示，以冷光试剂侦测细胞存活情况，可知有额外添加醇类的纤维素海绵其细胞生长情况良好，且逐日数值增加，代表持续生长。而依循本发明，但无额外添加醇类的纤维素海绵于第一天生长情况就明显不佳，在后续培养情况也是如此，因此可知本发明的有额外添加醇类的纤维素海绵能提供细胞良好生长环境。

Claims (10)

1.一种制备一纤维素海绵的方法，包含：
(A) 提供具有一可自我交联的取代基的羟丙基纤维素溶液；及
(B) 加入引发剂与催化剂进入具有所述可自我交联的取代基的羟丙基纤维素溶液进行交联，
其中具有所述可自我交联的取代基的羟丙基纤维素的制备方法包含：
(a) 将羟丙基纤维素溶于二甲基甲酰胺中，以形成一羟丙基纤维素溶液；
(b) 将具有所述可自我交联的取代基的化合物溶于二甲基甲酰胺后，缓慢滴入到所述羟丙基纤维素溶液中；
(c) 加入醇类进行反应；及
(d) 于室温下反应并干燥以形成具有所述可自我交联的取代基的羟丙基纤维素。
2.如权利要求1所述的方法，其中具有所述可自我交联的取代基的化合物包含烯丙基异氰酸酯、甲基丙烯酸、丙烯酸或甲基丙烯酸环氧丙酯。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述醇类的体积为所述二甲基甲酰胺的总体积的1.5-50%。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述醇类的体积为所述二甲基甲酰胺的总体积的7.5-40%。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述醇类的体积为所述二甲基甲酰胺的总体积的10-35%。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述醇类为甲醇、乙醇、丙醇或丁醇。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述引发剂为过硫酸盐类引发剂。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述过硫酸盐类引发剂包含过硫酸钠、过硫酸铵或过硫酸钾。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述催化剂为有机胺类催化剂。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述有机胺类催化剂包含四甲基乙二胺、N,N,N',N'-四-(2-羟丙基)乙二胺、N,N,N',N'-四甲基-3-(10H-吩噻嗪-10-基)-1,2-丙二胺、N，N，N'，N'-四甲基孕-5-烯-3β，20α-二胺、N,N,N',N-四甲基-1,4-丁二胺、4,4'-(对二甲氨基)二苯基甲烷、N,N,N',N'-四甲基-1,4-苯二胺或N,N,N',N'-四甲基-1,4-萘二胺。
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