CN102504430B - 用于诱导干细胞定向分化的纳米多孔生物材料薄膜及其制备方法 - Google Patents

用于诱导干细胞定向分化的纳米多孔生物材料薄膜及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于诱导干细胞定向分化的纳米多孔生物材料薄膜及其制备方法，纳米多孔生物材料薄膜由以下方法所得：在表面有二氧化硅胶体微球有序阵列的模板上涂覆生物材料溶液，固化成型后，分离模板和薄膜，对薄膜进行拉伸或不拉伸，得纳米多孔生物材料薄膜，其中，纳米多孔生物材料薄膜的材质为PS、PLGA、PLLA或PMMA。本发明的方法具有操作方便、简单易行、成本低廉以及可重复性好等优势，制备的纳米多孔生物材料薄膜可诱导干细胞定向分化，表现出其操纵细胞行为的潜力和在组织工程领域的应用潜力，非常适用于体外大规模细胞培养，具有很好的实用性，能够产生很好的经济效益和社会效应。

Description

用于诱导干细胞定向分化的纳米多孔生物材料薄膜及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物材料与组织工程技术领域，具体涉及一种适合于细胞生长并能诱导干细胞定向分化的纳米多孔生物材料薄膜及其制备方法。
背景技术
生物材料的拓扑形貌是影响细胞行为的重要因素之一，细胞在体内生存的微环境大多是由蛋白质和多糖类大分子构成的纳米网架结构，而这种纳米尺度的立体微观结构，能调节与其相接触的细胞的黏附、增殖、分化和迁移等行为和功能。
近年来，随着纳米技术的迅速发展，其应用领域也越来越广，包括在组织工程领域中用作支架材料。纳米拓扑结构的构建对于从分子和细胞水平上控制生物材料与细胞间的相互作用，从而引发特异性细胞反应，包括对细胞黏附、增殖、分化、凋亡以及细胞外基质的重建等一系列行为起到重要作用，以及对于组织再生与修复都具有潜在应用前景和意义。
发明内容
发明目的：针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种用于诱导干细胞定向分化的纳米多孔生物材料薄膜，使适合于细胞生长并能诱导干细胞定向分化。本发明的另一目的是提供一种制备上述用于诱导干细胞定向分化的纳米多孔生物材料薄膜的方法，以使其具有操作方便、简单易行、成本低廉和可重复性好等优点。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种用于诱导干细胞定向分化的纳米多孔生物材料薄膜，由以下方法所得：在表面有二氧化硅胶体微球有序阵列的模板上涂覆生物材料溶液，固化成型后，分离模板和薄膜，对薄膜进行拉伸或不拉伸，得纳米多孔生物材料薄膜，其中，纳米多孔生物材料薄膜的材质为聚苯乙烯（PS）、聚乳酸（PLLA）、聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）或聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）。
一种制备用于诱导干细胞定向分化的纳米多孔生物材料薄膜的方法，包括以下步骤：
（1）清洗模板载体，将载体放入盛有SiO2纳米粒子单分散乙醇溶液的容器中，室温下静置5~7d，取出，得表面形成二氧化硅胶体微球的有序阵列硬模板；
（2）在模板表面涂覆生物材料溶液，使其渗入SiO2微球孔隙中，溶剂挥发，薄膜成型，用2% v/v氢氟酸分离模板和薄膜，用1% v/v氢氟酸浸泡薄膜清除残余SiO2微球，用纯水冲洗薄膜，晾干，得纳米多孔生物材料薄膜；其中，生物材料溶液为PS的甲苯溶液、PLGA的氯仿溶液、PLLA的二氯甲烷溶液或PMMA的N,N-二甲基甲酰胺溶液；
（3）去除纳米多孔生物材料薄膜边缘不平整处，在80~85℃的水浴中进行匀速拉伸纳米多孔生物材料薄膜，得到不同拉伸度的纳米多孔生物材料薄膜。
步骤（1）中，载体为载玻片，采用体积比3：1的浓硫酸和过氧化氢混合液，在80℃下中放置，清洗至气泡消失。
步骤（1）中，SiO2纳米粒子的直径为200nm，SiO2纳米粒子单分散乙醇溶液的质量体积浓度为 5%。
步骤（1）中，SiO2微球的有序阵列的长度为2~3cm。
步骤（2）中，PS的甲苯溶液、PLGA的氯仿溶液、PLLA的二氯甲烷溶液以及PMMA的N,N-二甲基甲酰胺溶液的w/v浓度分别为20%、10%、2%以及25%。
步骤（2）中，室温下，待溶剂基本挥发，材料成固体状，在真空干燥箱中60℃保温12h以上，使溶剂完全挥发，再放入80℃烘箱中固化2h，使薄膜成型。
步骤（2）中，1% v/vHF浸泡薄膜48h以上，每12h换液一次，使薄膜上没有残余SiO2微球。
步骤（3）中，不同拉伸度的纳米多孔生物材料薄膜的拉伸倍数为2~6倍。
上述的用于诱导干细胞定向分化的纳米多孔生物材料薄膜在培养细胞和诱导干细胞定向分化中的应用。
本发明将该方法应用到四种不同的生物材料上，包括PS、PLLA、PLGA和PMMA，这四种材料由于物理化学性质的不同，其溶解溶剂，溶解浓度，由同一模板得到的纳米多孔生物材料薄膜都不尽相同。
有益效果：本发明的优点在于：采用简单易行的胶体粒子模板法，以不同材料制备有规则的纳米多孔基底膜，该方法成本低廉，不需要超洁净实验环境，可重复性好，并可以大批量制备，具有操作方便、简单易行、成本低廉以及可重复性好等优势，这些优势可被广泛应用于生物材料的纳米结构制备。制备的纳米多孔生物材料薄膜可诱导干细胞定向分化，表现出其操纵细胞行为的潜力和在组织工程领域的应用潜力，非常适用于体外大规模细胞培养，具有很好的实用性，能够产生很好的经济效益和社会效应。
附图说明
图1是实施例1的四种不同生物材料以同一模板得到的纳米多孔生物材料薄膜扫描电镜图；
图2是拉伸纳米多孔生物材料薄膜扫描电镜图，左列为PMMA，由上至下分别拉伸2倍、3倍和4倍；右列为PS，由上至下分别拉伸2倍、3倍和6倍；
图3为大鼠骨髓间充质干细胞在PS薄膜上向成骨细胞分化实验的免疫荧光染色（14天，21天）和茜素红染色（28天）图片，其中红色为细胞骨架，蓝色为细胞核，绿色为骨钙蛋白，红色箭头所指为钙结节。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1
二氧化硅（SiO2）胶体微球有序阵列模板的制备：将浓硫酸（H2SO4）和过氧化氢（H2O2）按3：1的体积比例混合，倒入放有载玻片的玻璃培养皿中，在80℃下中放置30min，至气泡消失。取出载玻片，将其竖直插入盛有直径为200nm的SiO2纳米粒子单分散乙醇溶液的称量瓶中，室温下静置5~7d，载玻片上即形成约2-3cm长度的SiO2微球的有序阵列，得模板。
按一定的质量体积比（w/v）将生物材料（溶质）溶于相应溶剂中，磁力搅拌至完全溶解并混合均匀，得生物材料溶液；无气泡的情况下将生物材料溶液涂覆在模板表面，使其渗入SiO2微球孔隙中，平面膜则将生物材料溶液涂覆在洁净的载玻片表面，不同生物材料使用的质量浓度及对应溶剂如表1所示。
表1 不同生物材料使用的质量浓度及对应溶剂表。
溶质 PS PLGA PLLA PMMA
溶剂 甲苯 氯仿 二氯甲烷 N,N-二甲基甲酰胺
w/v 20% 10% 2% 25%
平面膜及反结构膜后续成膜步骤相同，如下：
室温下待溶剂基本挥发，材料成固体状，在真空干燥箱中60℃保温12h以上，使溶剂完全挥发，再放入80℃烘箱中固化2h；
冷却后用2%（v/v）氢氟酸（HF）将模板除去，再以1%（v/v）HF浸泡薄膜48h以上，每12h换液一次，使薄膜上没有残余SiO2微球，后取出薄膜用纯水冲洗，室温晾干即得纳米多孔生物材料薄膜，此膜为未拉伸，四种不同生物材料以同一模板得到的纳米多孔生物材料薄膜扫描电镜图，如图1所示，标尺为1μm。
对纳米多孔生物材料薄膜进行拉伸，将薄膜边缘不平整处剪去，用夹具固定在游标卡尺卡口两侧，在80~85℃的水浴中进行匀速拉伸，得到不同拉伸度的纳米结构薄膜，拉伸纳米多孔生物材料薄膜扫描电镜图如图2所示。图2中，左列为PMMA，由上至下分别拉伸2倍、3倍和4倍，右列为PS，由上至下分别拉伸2倍、3倍和6倍。
实施例2
该实施例任选实施例1制备的纳米多孔生物材料薄膜，材质为PS以验证纳米多孔生物材料薄膜对干细胞向成骨细胞定向分化的影响。
采用常规接种方法将大鼠骨髓间充质干细胞接种到平面膜、未拉伸及拉伸的纳米结构薄膜上。其中，平面膜和未拉伸及拉伸的纳米结构薄膜均为实施例1制备的，在接种前预先将薄膜在碘伏中灭菌，然后在0.5% 的明胶中浸泡12小时，经缓冲溶液冲洗后在空气中晾30min左右，随即接种细胞。分别在细胞培养14d、21d采用免疫荧光染色法观察骨钙素（OCN）产生情况，在第28d用40mM茜素红染色细胞观察钙结节生成情况，图3为观察结果。图中，a图~p图均为大鼠骨髓间充质干细胞在PS薄膜上向成骨细胞分化实验的免疫荧光染色图片（14d、21d），q图和r图为茜素红染色图片（28d），在a图~d图以及i图~l图中，可以明显看到细胞骨架和细胞核；在e图~h图以及m图~p图中，可以看到不同含量的骨钙蛋白；在r图中，箭头所指为钙结节。
免疫荧光染色法观察结果显示不管是14天还是21天，拉伸组的OCN表达量均高于平面膜和未拉伸组，同时，6倍拉伸膜的OCN表达量为拉伸组中最高（图4h, p）。相似的结论在28天的茜素红染色图片中也能看到（图4q, r），在6倍拉伸的样品上能明显看到染色的钙结节，但是平面膜上却未见钙结节出现，可见拉伸对诱导干细胞向成骨细胞分化有显著促进作用。

Claims (5)

1.一种制备用于诱导干细胞定向分化的纳米多孔生物材料薄膜的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将浓硫酸和过氧化氢按3：1的体积比例混合，倒入放有载玻片的玻璃培养皿中，在80℃下中放置30min，至气泡消失；取出载玻片，将其竖直插入盛有直径为200nm的质量体积浓度为5% SiO2纳米粒子单分散乙醇溶液的称量瓶中，室温下静置5~7d，载玻片上即形成2-3cm长度的SiO2微球的有序阵列，得模板；
（2）在模板表面涂覆生物材料溶液，使其渗入SiO2微球孔隙中，溶剂挥发，薄膜成型，用2% v/v氢氟酸分离模板和薄膜，用1% v/v氢氟酸浸泡薄膜清除残余SiO2微球，用纯水冲洗薄膜，晾干，得纳米多孔生物材料薄膜；其中，生物材料溶液为PS的甲苯溶液、PLGA的氯仿溶液、PLLA的二氯甲烷溶液或PMMA的N,N-二甲基甲酰胺溶液；
（3）去除纳米多孔生物材料薄膜边缘不平整处，在80~85℃的水浴中进行匀速拉伸纳米多孔生物材料薄膜，得到不同拉伸度的纳米多孔生物材料薄膜。
2.根据权利要求1所述的制备用于诱导干细胞定向分化的纳米多孔生物材料薄膜的方法，其特征在于：步骤（2）中，PS的甲苯溶液、PLGA的氯仿溶液、PLLA的二氯甲烷溶液以及PMMA的N,N-二甲基甲酰胺溶液的w/v浓度分别为20%、10%、2%以及25%。
3.根据权利要求1所述的制备用于诱导干细胞定向分化的纳米多孔生物材料薄膜的方法，其特征在于：步骤（2）中，室温下，待溶剂基本挥发，材料成固体状，在真空干燥箱中60℃保温12h以上，使溶剂完全挥发，再放入80℃烘箱中固化2h，使薄膜成型。
4.根据权利要求1所述的制备用于诱导干细胞定向分化的纳米多孔生物材料薄膜的方法，其特征在于：步骤（2）中，1% v/vHF浸泡薄膜48h以上，每12h换液一次，使薄膜上没有残余SiO2微球。
5.根据权利要求1所述的制备用于诱导干细胞定向分化的纳米多孔生物材料薄膜的方法，其特征在于：步骤（3）中，不同拉伸度的纳米多孔生物材料薄膜的拉伸倍数为2~6倍。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN102850567B (zh) * 2012-09-21 2013-12-25 中国科学院理化技术研究所 一种具有取向生长结构细胞的材料的制备方法
CN105879113A (zh) * 2016-06-17 2016-08-24 东南大学 一种基于丝素蛋白的三维细胞支架的制备方法
CN105906835A (zh) * 2016-07-06 2016-08-31 东南大学 一种孔洞梯度改变的生物材料的制备方法
CN106674585B (zh) * 2016-12-13 2019-11-22 北京大学 一种具有多孔结构的可拉伸弹性体的制备方法
CN110538349A (zh) * 2019-08-28 2019-12-06 温州医科大学 一种整合明胶-丝素复合微球的MSCs细胞薄膜及其制备方法
CN111424009B (zh) * 2020-03-19 2021-11-19 南开大学 多孔纳米材料在调控胚胎干细胞多能性中的应用
CN114645013B (zh) * 2020-12-17 2024-04-19 深圳先进技术研究院 一种通过物理途径促进干细胞分化的材料及方法
WO2022126610A1 (zh) * 2020-12-18 2022-06-23 深圳先进技术研究院 一种调控巨噬细胞极化和免疫功能的材料及其应用
CN113262322A (zh) * 2021-01-20 2021-08-17 温州医科大学附属第一医院 一种用于创面修复的可监控给药敷料及其制备方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100556944C (zh) * 2006-10-16 2009-11-04 中国科学院化学研究所 纳米二氧化硅微粒增强的超疏水聚苯乙烯薄膜及其制备方法

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