CN108642003B - 干细胞生物活性蛋白及其制备、应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种干细胞生物活性蛋白的制备方法，该制备方法包括：获取间充质干细胞；用添加有诱导试剂的DMEM培养基对所述间充质干细胞进行诱导培养，得培养物；所述诱导试剂包括IL‑1β、EGF；去除所述培养物中的细胞体及细胞碎片得干细胞生物活性蛋白粗提液；对干细胞生物活性蛋白粗提液进行浓缩纯化。本发明通过细胞培养基中加入合适种类的诱导试剂，特别是配合加入适量的该诱导试剂，从而形成特定的诱导培养基，用该诱导培养基对间充质干细胞进行诱导，能够显著提高干细胞生物活性蛋白的表达。

Description

干细胞生物活性蛋白及其制备、应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种干细胞生物活性蛋白及其制备、应用。

背景技术

干细胞具有强大的旁分泌功能，分泌多达236种生物活性蛋白，包括多种生长因子、转录因子、受体、营养因子等；参与14种以上生物学功能，调节细胞分化增殖、促使细胞合成分泌、趋化诱导、抑制炎症等，启动细胞内的代谢过程和细胞间的物质、信息传递。特别是其中KGF、TGF-β能有效促进伤口愈合，HGF、FGF能修复疤痕，VEGF能促进血管生成，滋养神经细胞，修复神经系统。多种干细胞生物活性蛋白在体内外具有免疫调节活性，在改善修复靶器官组织功能、抗炎、抗凋亡、免疫调节等发面发挥重要作用，具有广阔的再生医学应用前景。

干细胞可以从骨髓、脂肪、脐带等多种组织中分离。其中人脐带、胎盘间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)来源于胎儿娩出后产生的医疗废弃物，其具有取材方便、来源广泛、对供者无创、易于分离培养、增殖能力强、病毒感染风险低、免疫原性低、伦理限制较少、细胞干性强等优点，是细胞治疗中理想种子细胞。研究表明MSCs的旁分泌作用对神经系统疾病、心血管系统疾病、内分泌系统疾病、生殖系统疾病、消化系统疾病及肿瘤疾病具有很好的疗效，现已经进入广泛医学美容临床研究和应用。

目前上市的细胞活性蛋白产品大多通过大肠杆菌系统原核发酵制备，该方法制备效率高，便于蛋白大规模生产。但与细胞等真核表达系统相比，原核发酵的蛋白质翻译后折叠修饰途径与真核系统不同，使得最终生物活性蛋白功能受损；另外表达形成大量包涵体，从而使得最终生物活性蛋白纯化困难；并且，很难表达大量的可溶性蛋白。而真核系统表达的这类细胞因子多通过直接收集细胞上清，经旋转蒸发浓缩后再用层析柱纯化的方法。该方法虽然可以制备天然构象和完全功能的干细胞因子，但真核细胞培养和层析柱及填料成本昂贵，效率不高，上清中的生物活性蛋白表达量较低，难以大规模制备。

现有技术还公开了如下利用脐带间充质干细胞获取生物活性蛋白的方法：采用新鲜脐带组织作为间充质干细胞的来源，胶原酶短时消化脐带组织块后会得到混合物，该混合物在生物反应器内扩大培养，生长速度增加。虽然该现有技术在一定程度上提高了细胞生长速度，但是仅仅提高细胞生长速度，最终获得的干细胞活性蛋白的分泌量非常有限，培养成本昂贵，生产效率低。

因此，亟待提供一种高效的干细胞生物活性蛋白的制备方法。

发明内容

基于此，本发明的主要目的是提供一种高效的干细胞生物活性蛋白的制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种干细胞生物活性蛋白的制备方法，该制备方法包括：

获取间充质干细胞；

用添加有诱导试剂的细胞培养基对所述间充质干细胞进行诱导培养，得培养物；所述诱导试剂包括IL-1β和EGF；

去除所述培养物中的细胞体及细胞碎片得干细胞生物活性蛋白粗提液；

对干细胞生物活性蛋白粗提液进行浓缩纯化，得干细胞生物活性蛋白。

在其中一些实施例中，所述IL-1β在所述细胞培养基的浓度为1～100ng/mL、所述EGF在所述细胞培养基的浓度为1～100ng/mL。

在其中一些实施例中，所述IL-1β在所述细胞培养基的浓度为5～30ng/mL、所述EGF在所述细胞培养基的浓度为1～20ng/mL。

在其中一些实施例中，所述IL-1β在所述细胞培养基的浓度为10ng/mL、所述EGF在所述细胞培养基的浓度为10ng/mL。

在其中一些实施例中，所述浓缩纯化采用超滤，超滤以质量浓度为3～8％的PBS溶液为纯化溶液，超滤时间为24～48h，超滤中更换纯化溶液的次数为2～3次。通过该操作，可以有效排除杂质。

在其中一些实施例中，所述超滤包括以质量浓度为15～25％的PEG6000溶液为纯化溶液超滤3～5h。通过该操作可以起到有效浓缩的作用。

在其中一些实施例中，所述诱导培养的时间为45～55h。时间过短会影响产量，时间过长已有的生物活性蛋白会降解或失活，同样降低产量。

在其中一些实施例中，所述间充质干细胞的组织来源包括动物的胎盘、脐带、脐带血、脂肪、骨髓、牙髓。

在其中一些实施例中，所述细胞培养基为DMEM培养基。

在其中一些实施例中，所述间充质干细胞的制备包括：

挑选新鲜健康的离体组织，充分清洗并切成小块，去除血管和粘膜组织，剪成组织碎片；

将组织碎片于DMF12培养液中进行传代培养、清洗，即得。

在其中一些实施例中，所述组织碎片的大小为3～8mm³；所述传代培养至细胞生长密度不低于60％；所述清洗采用PBS溶液。

在其中一些实施例中，所述离体组织来源包括动物的胎盘、脐带、脐带血、脂肪、骨髓、牙髓。

本发明的另一目的是提供上述制备方法制备得到的干细胞生物活性蛋白。

本发明的再一目的是提供上述的干细胞生物活性蛋白在作为美容产品有效成分的应用。

与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：

本发明通过细胞培养基中加入合适种类的诱导试剂，特别是配合加入适量的该诱导试剂，从而形成特定的诱导培养基，用该诱导培养基对间充质干细胞进行诱导，显著的提高干细胞生物活性蛋白的表达，特别是能够提高干细胞与抗炎、抗凋亡、免疫调节功能最为相关的几种生物活性蛋白的表达，并且本申请采用细胞诱导和细胞生长同步进行，还能更快的实现生物活性蛋白的表达，最终实现高效的生物活性蛋白制备。

本申请还采用合适的超滤工艺对干细胞生物活性蛋白粗提液进行浓缩纯化，该超滤工艺能够显著提升纯化浓缩效率。

附图说明

图1为实施例的干细胞生物活性蛋白的制备工艺图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/5或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明涉及一种高效的干细胞生物活性蛋白制备方法，制备流程(见图1)主要是：通过核心诱导试剂预处理间充质干细胞，诱导多种生物活性蛋白大量表达；然后通过一步超滤法对培养物上清完成活性蛋白的浓缩和纯化，有效提高生物活性蛋白的纯化回收效率。本技术涉及细胞等真核系统表达的生物活性蛋白，不存在翻译后折叠修饰差异及复杂的包涵体变性和复性的问题，可确保提取蛋白维持天然构象和功能。本发明通过诱导试剂和一步超滤法，诱导蛋白高效表达，简化纯化过程，操作简便，纯化效率高。诱导是和细胞生长后期同步进行，时间计入细胞培养中，整个工艺流程只算纯化制备为27～53h。细胞生长时间与接种细胞数、容器和培养液相关，快的话3天左右。

本发明实施例所采用的胎盘组织、脐带组织等均为动物的生产废弃的组织。

实施例1：

本实施例提供一种高效的干细胞生物活性蛋白的制备方法，该制备包括如下步骤：

(1)选用经过筛选的新鲜健康羊胎盘组织100mL；

(2)将胎盘组织充分清洗并切成小块，去除血管和粘膜组织，剪碎成5mm³；

(3)将组织碎片贴附于10cm无菌培养皿中，加入DMF12培养液，置于5％的二氧化碳培养箱中培养至细胞可传代，常规传至第3代，即为间充质干细胞；

(4)选取第3代有活性的间充质干细胞，常规培养至其生长密度为60％，然后用PBS溶液清洗后进行换液处理；其中，该步骤所述的常规培养是指使用DMF12培养基且于温度为37℃、培养体系含有5％的二氧化碳的条件下培养；该处所述的换液处理是指使用其他培养基进行培养前，需要对间充质干细胞进行清洗处理，避免原培养基混入新培养基中；常规处理使用的培养基为DMF12培养基，换液时采用的培养基为DMEM培养基；

(5)向换液后的细胞培养液中添加组合诱导试剂，预处理48h。本发明所述的组合诱导试剂为IL-1β、EGF，并且二者在细胞培养液中终浓度分别为1ng/mL、100ng/mL；

(6)培养完毕后收集间充质干细胞的培养基，将培养基上清用高效滤网过滤，去除细胞碎片，即可得到干细胞生物活性蛋白粗提液；

(7)将干细胞生物活性蛋白粗提液置于高效超滤袋中，纯化溶液选用5％PBS，低温处理24h，期间更换纯化溶液2次。本步骤可以有效去除粗提液中酚红指示剂、各类小分子盐、抗生素以及其它杂质；

(8)将高效超滤袋置于20％PEG6000中继续处理3h，即为纯化后的干细胞生物活性蛋白浓缩液；

(9)纯化后的干细胞生物活性蛋白浓缩液可根据不同应用进一步分装、冻干或长期储存。

实施例2：

本实施例提供一种高效的干细胞生物活性蛋白的制备方法，该制备包括如下步骤：

(1)选用经过筛选的新鲜健康羊脐带组织10cm长；

(2)将脐带组织充分清洗并切成小块，去除血管和粘膜组织，剪碎成5mm³；

(3)将组织碎片贴附于10cm无菌培养皿中，加入DMF12培养液，置于5％的二氧化碳培养箱中培养至细胞可传代，常规传至第3代，即为间充质干细胞；

(4)选取第3代有活性的间充质干细胞，常规培养至其生长密度为60％，然后用PBS溶液清洗后进行换液处理；其中，该步骤所述的常规培养是指使用DMF12培养基且于温度为37℃、培养体系含有5％的二氧化碳的条件下培养；该处所述的换液处理是指使用其他培养基进行培养前，需要对间充质干细胞进行清洗处理，避免原培养基混入新培养基中；常规处理使用的培养基为DMF12培养基，换液时采用的培养基为DMEM培养基；

(5)向换液后的细胞中添加组合诱导试剂，预处理48h；本发明所述的组合诱导试剂为IL-1β、EGF，并且二者在细胞培养液中终浓度分别为30ng/mL、20ng/mL；

(6)培养完毕后收集间充质干细胞的培养基，将培养基上清用高效滤网过滤，去除细胞碎片，即可得到干细胞生物活性蛋白粗提液；

(7)将干细胞生物活性蛋白粗提液置于高效超滤袋中，纯化溶液选用5％PBS，低温处理48h，期间更换纯化溶液3次。本步骤可以有效去除粗提液中酚红指示剂、各类小分子盐、抗生素以及其它杂质。

(8)将高效超滤袋置于20％PEG6000中继续处理5h，即为纯化后的干细胞生物活性蛋白浓缩液。

(9)纯化后的干细胞生物活性蛋白浓缩液可根据不同应用进一步分装、冻干或长期储存。

实施例3：

本实施例提供一种高效的干细胞生物活性蛋白的制备方法，该制备包括如下步骤：

(1)选用经过筛选的新鲜健康羊胎盘组织100mL；

(2)将胎盘组织充分清洗并切成小块，去除血管和粘膜组织，剪碎成5mm³；

(3)将组织碎片贴附于10cm无菌培养皿中，加入DMF12培养液，置于5％的二氧化碳培养箱中培养至细胞可传代，常规传至第3代，即为间充质干细胞；

(4)选取第3代有活性的间充质干细胞，常规培养至其生长密度为60％，然后用PBS溶液清洗后进行换液处理；其中，该步骤所述的常规培养是指使用DMF12培养基且于温度为37℃、培养体系含有5％的二氧化碳的条件下培养；该处所述的换液处理是指使用其他培养基进行培养前，需要对间充质干细胞进行清洗处理，避免原培养基混入新培养基中；常规处理使用的培养基为DMF12培养基，换液时采用的培养基为DMEM培养基。

(5)向换液后的细胞中添加组合诱导试剂，预处理48h；本发明所述的组合诱导试剂为IL-1β、EGF，并且二者在细胞培养液中终浓度分别为10ng/mL、10ng/mL；

(6)培养完毕后收集间充质干细胞的培养基，将培养基上清用高效滤网过滤，去除细胞碎片，即可得到干细胞生物活性蛋白粗提液。

(7)将干细胞生物活性蛋白粗提液置于高效超滤袋中，纯化溶液选用5％PBS，低温处理36h，期间更换纯化溶液2次。本步骤可以有效去除粗提液中酚红指示剂、各类小分子盐、抗生素以及其它杂质。

(8)将高效超滤袋置于20％PEG6000中继续处理4h，即为纯化后的干细胞生物活性蛋白浓缩液。

(9)纯化后的干细胞生物活性蛋白浓缩液可根据不同应用进一步分装、冻干或长期储存。

对比例1：

本对比例是实施例1的对比例，与实施例相比，主要区别在于步骤(5)采用的诱导试剂的种类并非是IL-1β、EGF的组合，而是IL-6和EGF的组合。

对比例2：

本对比例是实施例1的对比例，与实施例相比，主要区别在于步骤(5)采用的诱导试剂的含量超出了本申请的限定，具体为：IL-1β的添加终浓度为0.5ng/mL、EGF的添加终浓度为105ng/mL。

结果测试：

对以上各例所得产物中干细胞生物活性蛋白的含量进行测试。对每例进行分阶段分组进行测试，包括：

按照各例的步骤(1)-(4)制备第三代间充质干细胞，并进行换液处理。然后将细胞培养物分成两组，组A不加组合诱导试剂，组B加入组合诱导试剂，预处理48h后继续按照步骤(5)-(6)提取干细胞生物活性蛋白粗提液，收集部分培养基样本分别标记为样本A和样本B。随后B组样本纯化后得到的干细胞生物活性蛋白浓缩液，标记为样本C。

分别对样本A、B、C中的细胞因子进行检测，检测细胞因子FGF、KGF、HGF、VEGF和TGF-β的含量。结果见下表：

可以看出：诱导后，各生物活性蛋白表达水平均有提高；进一步浓缩纯化后，生物活性蛋白的浓度显著增加。

本发明以上实施例采用诱导法结合一步超滤法制备干细胞生物活性蛋白，操作方法简单可控；表达水平高，纯化浓缩效率高。

本发明实施例的制备方法，其浓缩纯化方法采用一步超滤法，操作方便，成本低廉，无需昂贵的层析柱、填料和复杂的仪器操作。能够有效地去除小分子盐、抗生素以及其它杂质。浓缩纯化后，干细胞生物活性蛋白的浓度大幅提高。

本发明实施例所得干细胞生物活性蛋白来源于多种真核细胞和组织，保持了生物活性蛋白的天然结构和功能，适用范围广，不形成包涵体，无细菌蛋白污染。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.一种干细胞生物活性蛋白的制备方法，其特征在于，该制备方法包括：

获取间充质干细胞；

用添加有诱导试剂的细胞培养基对所述间充质干细胞进行诱导培养，得培养物；所述诱导试剂由IL-1β和EGF组成；

去除所述培养物中的细胞体及细胞碎片得干细胞生物活性蛋白粗提液；

对干细胞生物活性蛋白粗提液进行浓缩纯化，得干细胞生物活性蛋白；

所述间充质干细胞的组织来源为羊胎盘组织或者羊脐带组织；

所述IL-1β在所述细胞培养基的浓度为1～30ng/mL、所述EGF在所述细胞培养基的浓度为10～100ng/mL。

2.根据权利要求1所述的干细胞生物活性蛋白的制备方法，其特征在于，所述IL-1β在所述细胞培养基的浓度为10ng/mL、所述EGF在所述细胞培养基的浓度为10ng/mL。

3.根据权利要求1或者2所述的干细胞生物活性蛋白的制备方法，其特征在于，所述浓缩纯化采用超滤，超滤包括以质量浓度为3～8%的PBS溶液为纯化溶液，超滤时间为24～48h，超滤中更换纯化溶液的次数为2～3次。

4.根据权利要求3所述的干细胞生物活性蛋白的制备方法，其特征在于，所述超滤包括以质量浓度为15～25%的PEG6000溶液为纯化溶液超滤3～5h。

5.根据权利要求1或者2所述的干细胞生物活性蛋白的制备方法，其特征在于，所述诱导培养的时间为45～55h。

6.根据权利要求1或者2所述的干细胞生物活性蛋白的制备方法，其特征在于，所述细胞培养基为DMEM培养基。

7.根据权利要求1或者2所述的干细胞生物活性蛋白的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞的获取步骤包括：

挑选新鲜健康的离体组织，充分清洗并切成小块，去除血管和粘膜组织，剪成组织碎片；

将组织碎片于DMF12培养液中进行传代培养、清洗，即得。

Images