CN108272643B - 一种用于多重干细胞复合冻干粉及溶媒的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明利用健康组织块法培养脐带和胎盘的间充质干细胞，再以消化法培养脂肪干细胞；并将其培养过程所分泌的细胞因子，进行调配，经成纤维细胞增殖曲线测试，找出最佳生长浓度，并将调配好的培养上清低温冷冻干燥，配制好适宜的溶媒，作为美容产品的原料，后期可添加至其他美容产品中制备干细胞美容产品。

Description

一种用于多重干细胞复合冻干粉及溶媒的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于多重干细胞复合冻干粉及溶媒的制备方法。

背景技术

随着人们物质生活水平的逐渐提高，吃饱穿暖对人们来说不再是难题，生活的富裕使得人们开始追求更高层面的生活。爱美之心人皆有之，所有人都希望自己能够永远年轻、漂亮，很多人都将目光转向了各种能提升自己的外表形象的方法。皮肤作为人体最大的组织器官，覆盖于人体的外表，是美学美容研究的主要组织器官。一时之间，各种化妆品、护肤品等如同雨后春笋一样的应运而生了。然而，市面上的这些化妆品只是通过遮掩缺陷或是在皮肤表层起作用来达到美丽的目的，只是治标，而不能治本。人们渐渐也不满足这样的效果，将目光聚集到了搜寻能从根本上美容的方法。

研究表明，皮肤表皮细胞的自我更新、再生修复以及衰老退变是由来自毛囊或表皮基底层的成体干细胞——表皮干细胞的增殖分化所决定的。研究表明，干细胞能激活机体整体上处于休眠状态下的各种干细胞群，以替代更新原有的因衰老或病理性等因素所造成组织细胞的衰退和老化，达到组织器官功能的恢复，增强组织器官的活性和原有的抗耐受力，改善因衰老等因素所造成的细胞与细胞间、细胞与细胞外基质间的信息传递，增强和加快各组织细胞的新老更替等作用。

传统的干细胞美容需要将干细胞注射进皮肤真皮层，对操作者的要求较高，且此项操作对爱美人士容易产生心理负担，有安全性的困扰。而现在研究发现，干细胞培养过程种所分泌的细胞因子，通过涂抹，此类细胞因子因为是小分子物质，极易被水通道运输渗透至皮肤真皮层，可以达到刺激“唤醒”或营养表皮或真皮干细胞。这些细胞因子所唤醒的作用是：

1、在表皮水平上：影响角化细胞的活性和生长因素，刺激角化细胞迁移和上皮化，刺激表皮细胞分化和矫正，强烈促进表皮修复和愈合。

2、在真皮水平上：刺激成纤维细胞活性，增强细胞外基质收缩和构造，提供皮肤养分促进皮肤伤口愈合和功能再生。

3、在皮肤整体水平上：增强对环境侵袭、紫外线、污染物、刺激物、敏化剂、炎性细胞的抵抗力，巩固、增强皮肤张肌，增强皮肤弹性，刺激疤痕组织褪色，减少瘢痕形成，延缓皮肤衰老。

其主要机制有：①促进表皮和真皮层细胞(特别是成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞)增殖、分裂、分化，新生细胞增多，使皮肤增厚，逐渐恢复皮肤正常结构和生理功能；②促进胶原纤维、网状纤维、弹性纤维的形成，调节胶原蛋白和粘多糖的分泌，维持皮肤组织中水分含量和电解质代谢，改善萎缩皮肤的缺水状态，滋润皮肤组织；③通过对血管内皮细胞的作用，促进皮肤组织不断形成新的毛细血管。

皮肤干细胞激活所需要的细胞因子较为多样，且浓度不一，不同干细胞培养过程中所分泌的细胞因子浓度也有所差异，利用干细胞分泌的细胞因子进行天然的调和配比，达到皮肤干细胞所需最佳浓度，将为美容产品原料的制备提供基础，是本发明着重要研究的内容。

发明内容

为解决现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于多重干细胞复合冻干粉及溶媒的制备方法。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种用于多重干细胞复合冻干粉及溶媒的制备方法，包括以下步骤：

⑴、脐带、胎盘间充质干细胞的分离培养

在无菌条件下，收取健康的脐带和胎盘；在GMP实验室生物安全柜将胎盘剪碎至1.5-2.5mm³大小的组织块，将所述组织块分别置于T175培养瓶所盛的DMEM-LG细胞培养液中，置37℃，5％CO₂培养箱中培养；

每隔2-3天换液，直至有大量干细胞爬出后，弃去组织块；细胞长满后，记为第一代，用0.28％胰酶进行消化传代；第二代后改用无抗生素DMEM-LG培养基进行培养；依次传代培养；

⑵、脂肪间充质干细胞的分离培养

在无菌条件下，获取健康人的脂肪组织100mg；将所述脂肪组织放入超净台中，用PBS反复冲洗，直至无明显血污；收集到离心管中，加入0.5％的胰酶和0.1％胶原酶各10ml，将离心管密封，放入37℃恒温摇床中，180r×min^-1，震荡消化30min；消化后从所述恒温摇床上取出，在1000rpm的条件下离心10min，去上清，以去除悬浮脂肪；再用0.16mol/L的NH4Cl溶解红细胞，PBS洗涤3次，200目过滤，分离单个核细胞；移入DMEM-LG培养基进行培养；同步骤⑴中进行消化传代；

⑶、脐带、胎盘和脂肪三种间充质干细胞培养上清中的细胞因子检测

将步骤⑴和步骤⑵中的干细胞培养至第五代时，收集培养上清，用Elisa法检测所述干细胞因子浓度，包括EGF、PDGF和VEGF；

⑷、脐带、胎盘和脂肪三种间充质干细胞培养上清调配及检测

将步骤⑴和步骤⑵中获取的脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞和脂肪间充质干细胞三种培养上清以1：1：1配比，检测混合液与单独上清对3T3细胞增殖的刺激作用；

将3T3细胞培养至最佳状态，胰酶消化，计数后，将细胞铺至八块六孔板上，每两块板为一组，每块板上设有四孔，每孔内铺1×103个细胞，分别添加步骤⑶及步骤⑷调配的上清；并培养24h、48h、72h、96h后，每板取1孔计数，绘制生长曲线；从曲线可以发现，三种干细胞培养上清分别刺激3T3的生长无明显差异，而复合上清刺激3T3的生长在72h刺激后开始有所差异；

⑸、种间充质干细胞培养上清的冻干粉制备

将步骤⑴和步骤⑵中获取的脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞和脂肪间充质干细胞三种培养上清加入10％BSA作为赋形剂，充分溶解后，0.45um过滤装入冻干瓶中；将冻干瓶置于-80℃进行预冻，预冻24h后取出置于冻干机冻干；

⑹、冻干粉溶媒的配制

将1％透明质酸、10％甘油、5％丁二醇，其余为双蒸水，配制成冻干粉溶媒，高温高压灭菌30min后，分装备用。

上述方案中，相关内容解释如下：

1、上述方案中，所述DMEM-LG细胞培养液中含10％FBS、bFGF 5ng/mL、L-谷氨酰胺2mM、青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL和两性霉素B 1μg/mL。

2、上述方案中，步骤⑴中所述无抗生素DMEM-LG培养基含10％FBS、bFGF 5ng/mL和L-谷氨酰胺2mM。

3、上述方案中，所述冻干机为真空冻干机。

4、上述方案中，采用的Elisa试剂盒为联科生物，严格按照试剂盒说明书操作。

与现有技术相比，本发明的优势在于：

本发明利用组织块法培养脐带、胎盘间充质干细胞、消化法培养脂肪干细胞；并将其培养过程所分泌的细胞因子，进行调配，经成纤维细胞增殖曲线测试，找出最佳生长浓度，并将调配好的培养上清低温冷冻干燥，配制好适宜的溶媒，作为美容产品的原料，后期可添加至其他美容产品中制备干细胞美容产品。

附图说明

图1、本发明中3T3增殖曲线示意图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式进一步描述本发明，但本发明不仅仅限于以下实施例。

实施例：

一种用于多重干细胞复合冻干粉及溶媒的制备方法，包括以下步骤：

⑴、脐带、胎盘间充质干细胞的分离培养

在无菌条件下，收取健康的脐带和胎盘；在GMP实验室生物安全柜将胎盘剪碎至1.5-2.5mm³大小的组织块，将所述组织块分别置于T175培养瓶所盛的DMEM-LG细胞培养液中，置37℃，5％CO₂培养箱中培养；

每隔2-3天换液，直至有大量干细胞爬出后，弃去组织块；细胞长满后，记为第一代，用0.28％胰酶进行消化传代；第二代后改用无抗生素DMEM-LG培养基进行培养；依次传代培养；

⑵、脂肪间充质干细胞的分离培养

在无菌条件下，获取健康人的脂肪组织100mg；将所述脂肪组织放入超净台中，用PBS反复冲洗，直至无明显血污；收集到离心管中，加入0.5％的胰酶和0.1％胶原酶各10ml，将离心管密封，放入37℃恒温摇床中，180r×min^-1，震荡消化30min；消化后从所述恒温摇床上取出，在1000rpm的条件下离心10min，去上清，以去除悬浮脂肪；再用0.16mol/L的NH4Cl溶解红细胞，PBS洗涤3次，200目过滤，分离单个核细胞；移入DMEM-LG培养基进行培养；同步骤⑴中进行消化传代；

⑶、脐带、胎盘和脂肪三种间充质干细胞培养上清中的细胞因子检测

将步骤⑴和步骤⑵中的干细胞培养至第五代时，收集培养上清，用Elisa法检测所述干细胞因子浓度，包括EGF、PDGF和VEGF；采用的Elisa试剂盒为联科生物，严格按照试剂盒说明书操作。细胞因子检测浓度结果如下：

⑷、脐带、胎盘和脂肪三种间充质干细胞培养上清调配及检测

将步骤⑴和步骤⑵中获取的脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞和脂肪间充质干细胞三种培养上清以1：1：1配比，检测混合液与单独上清对3T3细胞增殖的刺激作用；

将3T3细胞培养至最佳状态，胰酶消化，计数后，将细胞铺至八块六孔板上，每两块板为一组，每块板上设有四孔，每孔内铺1×103个细胞，分别添加步骤⑶及步骤⑷调配的上清；并培养24h、48h、72h、96h后，每板取1孔计数，绘制生长曲线；从曲线可以发现，三种干细胞培养上清分别刺激3T3的生长无明显差异，而复合上清刺激3T3的生长在72h刺激后开始有所差异；3T3细胞增殖曲线如图1所示：

⑸、种间充质干细胞培养上清的冻干粉制备

将步骤⑴和步骤⑵中获取的脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞和脂肪间充质干细胞三种培养上清加入10％BSA作为赋形剂，充分溶解后，0.45um过滤装入冻干瓶中；将冻干瓶置于-80℃进行预冻，预冻24h后取出置于冻干机冻干；所述冻干机为真空冻干机。冻干机设置的冻干曲线如下表所示：

温度(℃)	时间(小时)
		-30	5
-20	5
		-5	10
10	20
		20	保存至取出

⑹、冻干粉溶媒的配制

将1％透明质酸、10％甘油、5％丁二醇，其余为双蒸水，配制成冻干粉溶媒，高温高压灭菌30min后，分装备用。

所述DMEM-LG细胞培养液中含10％FBS、bFGF 5ng/mL、L-谷氨酰胺2mM、青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL和两性霉素B 1μg/mL。

步骤⑴中所述无抗生素DMEM-LG培养基含10％FBS、bFGF 5ng/mL和L-谷氨酰胺2mM。

本发明利用组织块法培养脐带、胎盘间充质干细胞、消化法培养脂肪干细胞；并将其培养过程所分泌的细胞因子，进行调配，经成纤维细胞增殖曲线测试，找出最佳生长浓度，并将调配好的培养上清低温冷冻干燥，配制好适宜的溶媒，作为美容产品的原料，后期可添加至其他美容产品中制备干细胞美容产品。

在此描述并且要求保护的本发明不限于在此披露的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员而言从前述描述将变得清楚。此类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。

Claims (4)

1.一种用于多重干细胞复合冻干粉及溶媒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

⑴、脐带、胎盘间充质干细胞的分离培养

在无菌条件下，收取健康的脐带和胎盘；在GMP实验室生物安全柜将胎盘剪碎至1.5-2.5mm³大小的组织块，将所述组织块分别置于T175培养瓶所盛的DMEM-LG细胞培养液中，置37℃，5％CO₂培养箱中培养；

每隔2-3天换液，直至有大量干细胞爬出后，弃去组织块；细胞长满后，记为第一代，用0.28％胰酶进行消化传代；第二代后改用无抗生素DMEM-LG培养基进行培养；依次传代培养；

⑵、脂肪间充质干细胞的分离培养

在无菌条件下，获取健康人的脂肪组织100mg；将所述脂肪组织放入超净台中，用PBS反复冲洗，直至无明显血污；收集到离心管中，加入0.5％的胰酶和0.1％胶原酶各10ml，将离心管密封，放入37℃恒温摇床中，180r×min^-1，震荡消化30min；消化后从所述恒温摇床上取出，在1000rpm的条件下离心10min，去上清，以去除悬浮脂肪；再用0.16mol/L的NH4Cl溶解红细胞，PBS洗涤3次，200目过滤，分离单个核细胞；移入DMEM-LG培养基进行培养；同步骤⑴中进行消化传代；

⑶、脐带、胎盘和脂肪三种间充质干细胞培养上清中的细胞因子检测

将步骤⑴和步骤⑵中的干细胞培养至第五代时，收集培养上清，用Elisa法检测所述干细胞因子浓度，包括EGF、PDGF和VEGF；

⑷、脐带、胎盘和脂肪三种间充质干细胞培养上清调配及检测

将步骤⑴和步骤⑵中获取的脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞和脂肪间充质干细胞三种培养上清以1：1：1配比，检测混合液与单独上清对3T3细胞增殖的刺激作用；

将3T3细胞培养至最佳状态，胰酶消化，计数后，将细胞铺至八块六孔板上，每两块板为一组，每块板上设有四孔，每孔内铺1×103个细胞，分别添加步骤⑶及步骤⑷调配的上清；并培养24h、48h、72h、96h后，每板取1孔计数，绘制生长曲线；从曲线可以发现，三种干细胞培养上清分别刺激3T3的生长无明显差异，而复合上清刺激3T3的生长在72h刺激后开始有所差异；

⑸、种间充质干细胞培养上清的冻干粉制备

将步骤⑴和步骤⑵中获取的脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞和脂肪间充质干细胞三种培养上清加入10％BSA作为赋形剂，充分溶解后，0.45um过滤装入冻干瓶中；将冻干瓶置于-80℃进行预冻，预冻24h后取出置于冻干机冻干；

⑹、冻干粉溶媒的配制

将1％透明质酸、10％甘油、5％丁二醇，其余为双蒸水，配制成冻干粉溶媒，高温高压灭菌30min后，分装备用。

2.根据权利要求1所述的用于多重干细胞复合冻干粉及溶媒的制备方法，其特征在于：所述DMEM-LG细胞培养液中含10％FBS、bFGF 5ng/mL、L-谷氨酰胺2mM、青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL和两性霉素B 1μg/mL。

3.根据权利要求1所述的用于多重干细胞复合冻干粉及溶媒的制备方法，其特征在于：步骤⑴中所述无抗生素DMEM-LG培养基含10％FBS、bFGF 5ng/mL和L-谷氨酰胺2mM。

4.根据权利要求1所述的用于多重干细胞复合冻干粉及溶媒的制备方法，其特征在于：所述冻干机为真空冻干机。

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