KR101154188B1 - 테나신-ｃ를 발현하는 제대혈 유래 간엽줄기세포 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

하나이상의 구체예는 테나신-C를 발현하는 제대혈 유래 간엽줄기세포 및 그 를 이용하는 방법을 제공한다.

Description

테나신-Ｃ를 발현하는 제대혈 유래 간엽줄기세포 및 그 용도{Mesenchymal stem cell derived from umbilical cord blood expressing tenascin-C and use thereof}
하나이상의 구체예는 T 세포의 항원에 대한 반응을 감소시키기 위한 조성물 및 그를 이용하는 방법에 관한 것이다.
중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell:MSC)는 조골세포, 근육세포, 연골세포 및 지방세포를 포함한 세포계통으로 분화할 수 있는 다분화능 줄기세포이다. 또한, MSC는 인 비트로에서, 근육, 뉴론-유사 전구체 (neuronal-like precursor), 및 심근세포 (cardiomyocytes)로 분화될 수 있는 것으로 알려져 있다. 또한, MSC는 조혈 줄기세포의 증식을 위한 효과적인 공여층 (effective feeder layer)이 될 수 있다. 또한, MSC는 손상된 골, 연골, 반월판 (meniscus) 또는 심근 조직의 복구 또는 재생에 유용하게 사용될 수 있다.
테나신-C는 발생하는 척추 동물의 배아의 세포외 마트릭스 물질 (extracellar matrix material)에 풍부한, 디술피드로 연결된 헥사머 당단백질 (서브유니트 당 190-240 kDa)이다.
관용(tolerance)은 면역반응이 정상적으로 일어나야 하는 항원에 대하여 후천적으로 특이적 반응이 결여된 것이다. 일반적으로, 관용을 유도하기 위하여, 관용화 항원 (tolerizing antigen)에 노출되어야만 하고, 그에 따라 특정한 림프구의 사멸 또는 기능적 불활성화가 초래된다. 완전한 관용은 제2 항원 챌린지에 대하여 검출가능한 면역반응이 결여된 것이다. 부분적 관용은 면역반응이 양적으로 감소된 것이다.
면역체계는 이로운 조직 예를 들면, 이식된 조직과 해로운 조직을 구분하지 못하며, 그에 따라 면역체계는 이식된 조직 또는 기관을 거부한다. 이식된 기관의 거부는 공여자 항원 (donor alloantigen 또는 xenoantigen)을 인식하는 숙주에 존재하는 동종 반응성 T 세포에 의하여 상당 부분 매개된다. T 세포는 세포 매개성 면역에서 중심 역할을 하는 백혈구의 일 타입니다. T 세포는 세포 표면에 T 세포 수용체 (TCR)을 가지고 있어 다른 백혈구와 구분된다.
현재 이식물에 대한 면역 반응을 예방 또는 감소시키기 위하여, 환자는 강력한 면역억제 약물로 치료되어야 한다. T 세포 면역 반응을 예방 또는 억제하는 약물을 개인에게 주입하는 것은 이식 거부를 억제하지만, 일반적 면역 억제, 독성을 초래하고 심지어는 기회 감염에 의한 죽음을 초래하기도 한다. 공여자 조직 거부에대한 종래 치료에 대한 독성 및 불완전한 반응율로 인하여, 현재 약물 치료에 반응하지 않는 환자를 치료할 수 있는 대체 요법이 요구되고 있다.
따라서, 상기 선행기술에 의하더라도, 공여자 조직에대한 면역 반응을 억제할 수 있는 새로운 방법이 요구되고 있다. 또한, T 세포 증식을 더 효과적으로 억제할 수 있는 개선된 조성물 및 그를 사용하는 방법에 대한 요구가 여전히 있다.
하나의 구체예는, T 세포의 항원에 대한 반응을 감소시키기 위한 조성물을 제공한다.
다른 구체예는, 이식 수용자에서 항원에 대한 T 세포의 반응을 감소시키는 방법을 제공한다.
하나의 구체예는, 제대혈 유래 간엽줄기세포 (umbilical cord blood derived mesenchymal stem cell: UCB-MSC)를 포함하는, T 세포의 항원에 대한 반응을 감소시키기 위한 조성물을 제공한다.
본 명세서에 사용된 "제대혈 유래 간엽줄기세포 (umbilical cord blood derived mesenchymal stem cell: UCB-MSC)"는 포유동물, 예를 들면 인간의 제대혈로부터 분리되거나 배양된 간엽줄기세포를 말한다. 간엽줄기세포는 다양한 세포로 분화될 수 있는 다분화능 줄기세포 (multipotent stem cell)이다. 간엽줄기세포는 예를 들면, 인 비트로 또는 인 비보에서, 조골세포 (osteoblast), 연골세포 (chondrocyte), 근육세포 (myocyte) 및 지방세포 (adipocyte)로 분화될 수 있는 세포를 말한다.
상기 UCB-MSC는 테나신-C (tenascin-C : TNC)+일 수 있다. 테나신-C는 발생하는 척추 동물의 배아의 세포외 마트릭스 물질 (extracellar matrix material)에 풍부한, 디술피드로 연결된 헥사머 당단백질 (서브유니트 당 190-240 kDa)이다. 상기 테나신-C 모노머는 RefSeq NP_002151 (서열번호 1) (인간) 및 NP_035737 (서열번호 3) (생쥐)의 아미노산 서열 및 그로부터 유래된 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 테나신-C 모노머를 코딩하는 유전자는 서열번호 2 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 UCB-MSC는 골수 유래 간엽줄기세포 (BM-MSC)에 비하여, 테나신-C를 높은 농도로 발현하는 것일 수 있다. 상기 UCB-MSC는 비혈연 PBMC와 공동배양된 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 UCB-MSC는 3.3x104/cm2로 10% FBS와 50㎍/ml 겐타마이신 항생제를 포함하는 RPMI 배지에서 6.6x105/cm2의 비혈연 PBMC 2종류를 100mm 지름의 배양접시 또는 6웰 플레이트를 이용하여 6일간 37℃도, 5%의 CO2, 습도를 유지하는 배양기에서 배양하는 것일 수 있다. 상기 UCB-MSC는 CD105+, CD106+, CD73+, CD29+ 및 CD44+인 것일 수 있다. 또한, 상기 마커를 발현하는 동시에, 조혈관련 항원, Class II MHC 항원, T-세포 계열, 공동 자극 항원 (co-stimulatory antigen)은 발현하지 않는 것일 수 있다.
상기 UCB-MSC는 단위 투여량 (unit dosage) 당 1x103 cells 내지 1x109 cells, 1x104 cells 내지 1x108 cells, 또는 1x105 cells 내지 1x107 cells로 포함되는 것일 수 있다.
상기 조성물은, 상기 UCB-MSC와 배양된 T 세포, 예를 들면, 상기 UCB-MSC와 미리 배양된 말초혈액 단핵세포 (PBMC)를 포함하는 것일 수 있다. 상기 UCB-MSC와 PBMC는 서로에 대하여 동종타가 (allogeneic) 유래의 것일 수 있다. 상기 배양은 상기 UCB-MSC를 배양하는데 사용되는 것으로 알려진 배지 및 조건에서 배양되는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 배지는 10% FBS가 보충된 MEM-α 배지일 수 있다. 상기 PBMC는 단위 투여량 당 1x103 cells 내지 1x1010 cells, 1x104 cells 내지 1x108 cells, 또는 1x105 cells 내지 1x107 cells로 포함되는 것일 수 있다. 상기 PBMC는 상기 T 세포에 대하여 자가 또는 동종타가 유래인 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된 "PBMC (peripheral blood mononuclear cell)"는 림프구 또는 모노사이트를 포함하는 혈액 세포이다. 이들 혈액 세포는 면역 체계에서 중요한 요소이다. 상기 림프구는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포를 포함한 T 세포, B 세포 및 NK 세포를 포함한다.
상기 UCB-MSC는 T 세포에 대하여 자가 또는 동종타가 유래인 것일 수 있다. 또한, 상기 항원은 T 세포에 대하여 자가 항원 또는 동종 항원 또는 이종 항원일 수 있다. 상기 항원이 T 세포에 대하여 자가 항원인 경우, 상기 항원은 비록 자가 유래이지만 T 세포에 의하여 비자기 항원으로 인식되는 것일 수 있다.
T 세포의 항원에 대한 반응을 감소시키는 활성은 인 비보 및 인 비트로 중 하나이상에서 이루어지는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 인 비보에서 항원 및 T 세포 중 하나이상과 접촉되는 것일 수 있다. 상기 접촉은 상기 T 세포 및 UCB-MSC에 대하여 알려진 배양 조건에서 이루어지는 것일 수 있다. 예를 들면, T 세포 및 UCB-MSC 중 하나이상의 세포를 유지 또는 분화시키기 위한 배지에서 이루어지는 것일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 인 비보에서 항원 및 T 세포 중 하나이상과 접촉되는 것일 수 있다. 인 비보에서의 접촉은 개체에 상기 조성물 및 항원, 또는 상기 조성물과 T 세포를 포함하는 이식물 (transplant)을 동시에 또는 별개로 투여함으로써 이루어질 수 있다. 상기 투여는, 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 전신적으로, 예를 들면, 정맥 내, 근육 내, 또는 국소적으로 투여되는 것일 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 상기 T 세포는 CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, 및 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나이상일 수 있다.
상기 조성물은, 상기 UCB-MSC를 위한 담체를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 담체는 배지, 또는 버퍼인 것일 수 있다.
다른 구체예는, 이식 수용자 (transplant recipient)에게 항원에 대한 T 세포의 반응을 감소시키기에 효과적인 양의 상기한 바와 같은 UCB-MSC를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 이식 수용자에서 항원에 대한 T 세포의 반응을 감소시키는 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 상기 이식 수용자는 조직 또는 기관을 이식받는 개체를 의미한다. 상기 이식 수용자는 인간일 수 있다. 상기 조직 또는 기관은 상기 이식 수용자에 대하여 동종타가 또는 이종 유래의 것일 수 있다.
"T 세포의 반응을 감소시키기에 효과적인 양"이란 T 세포가 항원에 반응하여항원을 제거하거나 항원을 포함하는 세포를 제거하는 것을 감소시키는 활성을 의미한다. 이러한 양은 당업자가 선택되는 개체의 성별, 상태, 이식되는 이식물, 투여량 및 투여 경로 등을 고려하여 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들면, 상기 양은 단위 투여량의 상기 조성물 중에 UCB-MSC가 1x103 cells 내지 1x109 cells, 1x104 cells 내지 1x108 cells, 또는 1x105 cells 내지 1x107 cells로 포함되는 것일 수 있다.
상기 T 세포는 수용자로부터 유래하고, 상기 항원은 공여자로부터 유래하는 것일 수 있다. 또한, 상기 T 세포는 공여자로부터 유래하고, 상기 항원은 수용자로부터 유래하는 것일 수 있다. 상기 T 세포는 상기 UCB-MSC에 대하여 자가 또는 동종타가 유래의 것일 수 있다. 상기 T 세포는 CD3+ T 세포, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나이상인 것일 수 있다.
상기 "UCB-MSC를 포함하는 조성물"에 대하여는, 상기한 바와 같다.
상기 UCB-MSC 조성물은 전신적으로 투여되는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 정맥 내로 투여되는 것일 수 있다. 상기 이식되는 이식물은 고체 기관일 수 있다. 상기 고체 기관은 피부, 심장, 췌장, 신장, 폐 및 간으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나이상인 것일 수 있다.
다른 구체예는, 자가 면역 질환을 앓고 있는 개체에게 항원에 대한 T 세포의 반응을 감소시키기에 효과적인 양의 상기한 바와 같은, UCB-MSC를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 자가면역 질환을 앓고 있는 개체에서 자기항원에 대한 T 세포의 반응을 감소시키는 방법을 제공한다.
다른 구체예는, 면역자극물질의 존재하에서 제대혈 유래 간엽줄기세포를 배양하는 단계; 및 상기 배양물로부터 배양 상층액를 분리하는 단계;를 포함하는, T 세포의 항원에 대한 반응을 감소시키기 위한 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 면역자극물질의 존재하에서 제대혈 유래 간엽줄기세포를 배양하는 단계를 포함한다. 상기 면역자극물질은 UCB-MSC에 대하여 동일 개체로부터 유래하지 않은 항원 또는 동일 개체로부터 유래하더라도 비자기로 인식되는 항원일 수 있다. 상기 면역자극물질은 비혈연 PBMC, PHA 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 UCB-MSC의 배양은 당업계에 알려진 배양 방법에 의하여 배양되는 것일 수 있다. 예를 들면, MEM-α 또는 RPMI 배지에서 배양되는 것일 수 있다. 상기 배지에는 혈청 및/또는 겐타마이신 항생체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 배양은 10% FBS와 50㎍/ml 겐타마이신 항생제를 포함하는 RPMI 배지에서 100mm 지름의 배양접시 또는 6웰 플레이트를 이용하여 37℃도, 5%의 CO2, 습도를 유지하는 배양기에서 배양하는 것일 수 있다.
상기 방법은 상기 배양물로부터 배양 상층액를 분리하는 단계를 포함한다. 배양 상층액을 분리하는 것은 당업게에 알려져 있다. 예를 들면, 원심분리 또는 여과를 사용할 수 있다.
상기 방법은 또한, 상기 배양 상층액으로부터 테나신-C를 분리하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 테나신-C의 분리는 당업계에 알려진 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 염석, 이온교환크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 여과 및 투석으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상이 사용될 수 있다.
다른 구체예는, 상기 방법에 의하여 제조된 T 세포의 항원에 대한 반응을 감소시키기 위한 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 T 세포의 항원에 대한 반응을 감소시키는 효과가 현저하다. 따라서, 상기 조성물은 면역억제용 조성물로서 사용될 수 있다.
다른 구체예는, 테나신-C를 포함하는, T 세포의 항원에 대한 반응을 감소시키기 위한 조성물을 제공한다.
테나신-C는 발생하는 척추 동물의 배아의 세포외 마트릭스 물질 (extracellar matrix material)에 풍부한, 디술피드로 연결된 헥사머 당단백질 (서브유니트 당 190-240 kDa)이다. 상기 테나신-C 모노머는 RefSeq NP_002151 (서열번호 1) (인간) 및 NP_035737 (서열번호 3) (생쥐)의 아미노산 서열 및 그로부터 유래된 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 테나신-C 모노머를 코딩하는 유전자는 서열번호 2 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 당업자에게 알려진 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 담체는 배지, 또는 버퍼인 것일 수 있다.
T 세포의 항원에 대한 반응을 감소시키기 위한 조성물은 면역 반응, 예를 들면, T 세포에 의한 면역 반응을 억제하는 현저한 효과가 있다. 상기 T 세포는 인 비트로 또는 인 비보에 존재하는 것일 수 있다. 인 비보의 경우, 포유동물, 예를 들면, 인간 체내에 존재하는 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 T 세포의 항원에 대한 반응을 감소시키기 위한 조성물에 의하면, T 세포의 항원에 대한 반응을 효과적으로 감소시킬 수 있다.
일 구체예에 따른 이식 수용자에서 항원에 대한 T 세포의 반응을 감소시키는 방법에 의하면, 이식 수용자에서 T 세포의 항원에 대한 반응을 효과적으로 감소시킬 수 있다.
도 1은 자극세포와 반응 세포를 공동한 배양한 후, 현미경으로 반응세포의 증식 및 군집형성을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 자극세포와 반응 세포를 공동한 배양한 후, 최종 24시간 동안 새로 합성된 반응세포의 DNA를 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 자극세포로서 UCB-MSC 및 BM-MSC를 사용하고, 이를 반응 세포와 공동배양한 후, 최종 24시간 동안 새로 합성된 반응세포의 DNA를 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 배양 상층액을 이용하여 면역자극 이후 UCB-MSC 및 BM-MSC에서 분비된 PGE2의 양을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 DNA 어레이 및 실시간-PCR법에 의하여 확인된 자극세포로서 PBMC, 반응세포로서 PBMC 및 UCB-MSC를 공동배양한 경우, UCB-MSC에서 발현된 테나신-C의 양을 나타내는 도면이다.
도 6 및 7은 각각 트란스웰 또는 트란스웰 없이, 동종 면역자극 조건에서 배양된 배양상층액에서의 테나신-C의 농도를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 자극원으로서 PBMC 대신에 피토헤마글루티닌(5㎍/ml)을 사용한 것을 제외하고는 도 6과 동일하게 실험한 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는 siRNA가 도입된 UCB-MSC 또는 대조군으로서 리포좀으로 트란스펙션된 UCB-MSC을 사용한 것을 제외하고는 도 8에 나타낸 바와 동일하게 실험한 결과를 나타내는 도면이다.
도 10은 동종 면역자극 조건에서 PBMC를 UCB-MSC 또는 BM-MSC와 공동배양된 경우, 테나신-C의 단백질 농도를 나타내는 도면이다.
도 11은 동종 면역자극 조건에서 PBMC를 UCB-MSC 또는 테나신-C에 대한 siRNA로 트란스펙션된 UCB-MSC와 공동배양된 경우, 반응세포인 PBMC를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 12는 TNC-C의 존재하에서 반응세포와 자극세포를 공동배양한 결과를 나타내는 도면이다.
도 13은 면역자극물질의 존재하에서 배양된 UCB-MSC의 배양 상층액의 면역억제 효과를 나타내는 도면이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
이하 실시예에서 사용된 재료 및 방법은 아래와 같다.
(1) 사용 기기 및 기구
ECLIPSE TE2000-U inverted Microscope (Nikon Co., Kanagawa, Japan), VERSAmaxTM absorbance microplate reader (Molecular Devices Co., Sunnyvale, CA, USA), FACSCaliburTM Flow Cytometer (BD Bioscience, San Jose, CA, USA).
(2) 시약 및 재료
말초혈액 단핵세포 (ALLCELLS, Emeryville, CA), 제대혈유래 간엽줄기세포, 골수유래 간엽줄기세포 (Cambrex Bio Science Walkersville,Inc., Walkersville, MD, USA), PHA-L (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany), RPMI 배지 및 FBS (Invitrogen, Calsbad, CA, USA), 마이토마이신 C (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), BrdU assay kit (BD Bioscience, San Jose, CA, USA), PGE2 assay kit (R&D systems, Minneapolis, MN, USA),
상기 UCB-MSC는 다음과 같이 얻었다. 먼저, 초저온을 유지하는 액체질소탱크에 보관 중인 UCB-MSC를 37℃를 유지하는 수조에서 2-3분 내에 녹인 후 10%의 FBS, 50㎍/ml 겐타마이신 항생제를 포함하는 MEM-α 배지에서 배양접시 cm2 당 5000-7000개의 세포로 배양을 하였다. 다음으로, 3-4일에 한 번씩 배지를 교환해주며 세포가 자라는 면적이 배양접시 총면적의 80%에 도달하면서 계대배양을 하였다.
(3) 항체 (BD Bioscience, San Jose, CA, USA)
항-인간 (anti-human) CD14, CD29, CD31, CD34, CD44, CD45, CD51-61, CD73, CD90, CD105, CD106, CD166, HLA-DR, HLA-A,B,C, B7-1, B7-2, CD3, CD7, CD40 및CD40L을 사용하였다.
실시예 1: UCB-MSC의 면역학적 특성 및 인 비트로에서 BM-MSC와 면역억제 능력의 비교
(1) UCB-MSC의 세포표면 항원 분석
10% FBS가 포함된 MEM-α 배지에서 80~90% 자란 UCB-MSC를 트립신 처리하여 떼어내었다. 떼어낸 세포를 2 x 105씩 FACS 튜브에 분주한 후, 각각의 이소타입 (isotype) 항체와 확인하고자 하는 항체를 첨가하여 실온 암소에서 15분간 반응한 후, PBS로 세척하였다.
세포를 1% 파라포름알데히드로 고정한 뒤, FACSCaliburTM Flow Cytometer로 분석하였다. UCB-MSC의 세포 표면 항원에 대한 FACS 분석 결과는 다음과 같다:
MSC 마커; CD105+, CD73+, 조혈 세포 마커 (hematopoietic cell marker); CD45-, CD34-, CD14-, 인테그린 수용체; CD29+, 내피 세포 마커; CD31-, 마트릭스 수용체 마커; CD44+, 파골세포 마커; CD51/61-, 기타 마커; CD13+, CD90+, CD106-, CD166+, 조직적합성 마커; HLA-DR-, HLA-ABC+, T 세포 마커; CD3-, CD7-, T 세포 공동자극 분자 마커; B7-1-, B7-2-, CD40-, CD40L-.
상기 결과로부터 상기 배양된 UCB-MSC에서 간엽줄기/전구세포 관련 항원인 CD105, CD106, CD73, 인테그린 수용체 관련 항원인 CD29, 기질 수용체 관련 항원인 CD44 등의 항원이 발현되었으며, 조혈관련 항원, Class II 조직적합성항원, T-세포계열, 공동자극 (co-stimulatory) 항원등의 발현은 음성이었다. 이는 상기 배양된 UCB-MSC가 세포표면에 면역원성을 나타내는 항원을 발현하지 않는다는 것을 나타낸다.
(2) UCB-MSC의 인 비트로 면역학적 특성평가
96-웰 플레이트의 웰에 반응세포 (responder cells)가 되는 말초혈액 단핵세포 (PBMC)를 1 x 105씩 준비하였다. 음성대조군으로 사용할 웰에는 RPMI 1640배지를 첨가하였다. 양성대조군으로 사용할 웰에는 5㎍/ml의 PHA (phytohemaglutinin)-L 또는 자극세포 (stimulator cells)로서 50㎍/ml의 마이토마이신 C가 처리된 비혈연 PBMC 1 x 105을 반응세포가 되는 말초혈액단핵세포에 첨가하였다.
시험군 웰에는 자극세포로서 10㎍/ml의 마이토마이신 C가 처리된 UCB-MSC를 각각 1 x 104, 1 x 103, 및 1 x 102씩 10% FBS가 포함된 MEM-α 배지에서 80~90% 자란 UCB-MSC를 트립신 처리하여 떼어낸 반응세포에 첨가하였다. 각 시험군 웰을 5일간 배양한 후, 현미경으로 반응세포의 증식 및 군집형성을 확인하였다.
다음으로, 배양 5일에 BrdU를 처리하여 최종 24시간 동안 새로 합성된 반응세포의 DNA를 측정하였다.
도 1은 자극세포와 반응 세포를 공동한 배양한 후, 현미경으로 반응세포의 증식 및 군집형성을 확인한 결과를 나타내는 도면이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, PHA가 처리된 군 (B)과 비혈연 PBMC로 자극된 군 (C)에서 반응세포인 PBMC가 증식하여 다세포성 군집을 형성하였으나, UCB-MSC는 반응세포를 자극하지 않아 다세포성 군집 형성이 관찰되지 않았다 (D, E, F). 도 1에서, D,E 및 F는 UCB-MSC의 농도가 각각 1 x 104, 1 x 103, 및 1 x 102인 경우를 나타낸다.
도 2는 자극세포와 반응 세포를 공동한 배양한 후, 최종 24시간 동안 새로 합성된 반응세포의 DNA를 확인한 결과를 나타내는 도면이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, PHA와 자극세포인 비혈연 PBMC는 반응세포를 자극하여 증식을 유도한 반면, UCB-MSC는 반응세포를 자극하지 않아 세포 증식을 유도하지 않았다.
(3) UCB-MSC와 BM-MSC의 인 비트로 면역억제 능력비교
96-웰 플레이트의 웰에 음성대조군으로서 1 x 104의 UCB-MSC, 1 x 104의 BM-MSC, 1 x 105의 반응 세포 (비혈연 PBMC), 1 x 105의 자극세포 (비혈연 PBMC)를 각각 단독 배양하였다.
양성대조군의 웰에는 반응세포인 비혈연 PBMC 1 x 105와 자극세포로서 50㎍/ml의 마이토마이신 C가 처리된 비혈연 PBMC 1 x 105을 배양하였다.
시험군 웰에는 양성대조군의 웰의 조건에 더하여, 10㎍/ml의 마이토마이신이 처리된 UCB-MSC와 BM-MSC를 각각 1 x 104씩 첨가하였다. 각 시험군 웰을 5일간 배양한 후, BrdU를 처리하고 24시간 동안 새로 합성된 반응세포의 DNA를 측정하였다.
총 6일간 배양된 각 시험군의 배양 상층액을 이용하여 면역자극 이후 제대혈 및 BM-MSC에서 분비된 PGE2 (prostaglandin E2)의 양을 측정하였다.
도 3은 자극세포로서 UCB-MSC 및 BM-MSC를 사용하고, 이를 반응 세포와 공동한 배양한 후, 최종 24시간 동안 새로 합성된 반응세포의 DNA를 확인한 결과를 나타내는 도면이다. 도 3에서, A와 B는 각각 비혈연 관계의 PBMC를 나타내며 H는 PHA 자극인자, UCB-MSC는 제대혈 유래 간엽줄기세포, BM-MSC는 골수 유래 간엽줄기세포이며 A+B는 비혈연관계의 PBMC인 A와 B를 공동 배양하여 동종면역반응을 유발한 것이다. 도 3은, PHA 자극을 준 A 혹은 B의 PBMC 또는 A와 B의 공동 배양으로 (A+B) 동종면역반응을 유발한 조건에 UCB-MSC 또는 BM-MSC를 공동배양하여 면역 억제능력을 측정한 것이다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 자극세포인 비혈연 PBMC에 의해 면역반응이 유도된 조건이나 PHA 자극에 UCB-MSC 또는 BM-MSC가 존재하면, 반응세포인 PBMC의 증식이 억제됨을 관찰할 수 있다. 비혈연 PBMC에 의한 자극의 경우, BM-MSC는 양성 대조군 대비 반응세포의 세포증식을 평균 22.2% 억제하였으나, UCB-MSC는 평균 80.6% 억제하였다. 즉, UCB-MSC가 BM-MSC에 비해 3.6배 PBMC의 증식을 억제하는 놀라운 효과를 확인하였다.
또한, PHA에 의한 증식자극의 경우에도 BM-MSC는 PBMC의 공여자에 따라 양성대조군 대비 평균 3.8%에서 24.9% 억제하지만 UCB-MSC는 평균 56%에서 62.6% PBMC의 증식을 억제한다는 것을 확인하였다.
도 4는 배양 상층액을 이용하여 면역자극 이후 UCB-MSC 및 BM-MSC에서 분비된 PGE2의 양을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 반응세포인 PBMC를 PHA 또는 자극세포인 비혈연 PBMC로 자극한 환경에서, UCB-MSC 또는 BM-MSC는 반응세포의 세포증식을 억제하였다. 이 과정에서 면역반응 억제물질인 PGE2를 분비하는데, UCB-MSC가 BM-MSC에 비해 1.2~2배의 PGE2를 더 분비하였다.
실시예 2 : 면역억제 활성 물질의 확인
실시예1에 확인된 바와 같이, 자극세포인 비혈연 PBMC에 의해 동종 (allogeneic) 면역반응이 유도된 조건에서 UCB-MSC가 존재하면, 반응세포인 PBMC의 증식이 억제되며 면역 억제 물질인 프로스타글란딘 E2가 발현 유도된다.
이 조건에서 면역억제반응과 관련해서 UCB-MSC에서 발현이 유도되는 새로운 분비 단백질을 DNA 어레이 분석법으로 동정하고, 실시간-PCR로 확인하였다.
도 5는 DNA 어레이 및 실시간-PCR법에 의하여 확인된 자극세포로서 PBMC, 반응세포로서 PBMC 및 UCB-MSC를 공동배양한 경우, UCB-MSC에서 발현된 테나신-C의 양을 나타내는 도면이다.
도 5에서, PBMC와 UCB-MSC가 직접 접촉할 수 있는 직접 자극조건 (direct)에서는 PBMC의 경우 로트 (lot) 번호가 다른 PBMC 각각 3.3x105/cm2, UCB-MSC의 경우 3.3x104/cm2로 10% FBS (Gibco)와 50㎍/ml 겐타마이신 (Gibco) 항생제를 포함하는 RPMI 배지에서 지름이 100mm인 배양접시를 이용하여 6일간 37℃, 5%의 CO2, 습기를 유지하는 배양기에서 배양하였다. 공동배양의 경우 cm2 당 위에 기술한 PBMC와 UCB-MSC의 세포수를 모두 포함하는 조건으로 배양하였다. PBMC와 UCB-MSC의 접촉이 제한되는 간접 자극조건 (indirect)에서의 배양조건은 위에 기술한 내용과 동일하고 배양접시는 자극조건의 제한으로 6웰 플레이트를 사용하였다. 공동 배양 환경에서 세포간 접촉이 제한되는 간접 자극조건을 확립하기 위해 6웰 플레이트용 트란스-웰 (trans-well)를 이용하였다. 세포간 접촉을 제한하고 수용성 인자들만 통과 가능한 트란스-웰 위쪽에 PBMC, 아래쪽에 UCB-MSC를 배양하였다. 6일간 배양 후 TriZol 시약으로 총 (total) RNA를 준비하였고 1㎍의 총 RNA로 cDNA를 합성 후 실시간-PCR을 수행하였다. 상대적인 발현량을 비교하기 위해 PBMC, UCB-MSC 각각 단독배양에서의 발현량을 1로 정하고 공동배양에서의 발현량을 계산하였다. 도 5의 A는 PBMC에서의 테나신 C의 발현량을 나타내고, B는 UCB-MSC에서의 테나신 C의 발현량을 나타낸다. Y 축은 실시간-PCR 측정법으로 얻어진 테나신C의 mRNA 카피수를 상대적으로 나타낸 값이며 X축은 직접 혹은 트란스-웰을 사용한 간접접촉을 하도록 하여 각각 PBMC 단독, UCB-MSC 단독 또는 이들을 직접 혹은 간접접촉이 되도록 공동배양한 경우를 나타내며, 도 5의 A에서 PBMC는 PBMC에 대해 PBMC 단독 혹은 UCB-MSC와의 공동배양에서 얻은 PBMC에서 유래된 테나신C의 mRNA의 상대적인 양이며, B에서 UCB-MSC는 UCB-MSC에 대해 각각 단독 혹은 공동배양으로 UCB-MSC에서 유래된 테나신C의 mRNA의 상대적 양을 나타낸다. 또한, ELISA를 이용하여 배양물 중의 테나신 C의 농도를 측정한 결과, 직접 접촉의 경우 6118pg/ml/7day/1.5x104cells이었으나, 간접 접촉의 경우 1545pg/ml/7day/1.5x104cells이었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 테나신-C가 면역억제 조건에서 UCB-MSC에서 발현이 증가됨을 DNA 어레이 및 실시간-PCR법으로 확인하였다. naive한 UCB-MSC에 비해 면역억제 조건에서 배양한 경우, UCB-MSC 유래의 테나신-C 발현량이 5.43배에서 24.69배 증가하였다.
또한, 비혈연 관계에 있는 두 사람으로부터 각각 유래된 비혈연 PBMC를 공동배양하여 동종 면역자극 (allogeneic stimulation)이 일어나도록 하였다. 배양은 각 PBMC 3.3x105/cm2를 10% FBS 및 50㎍/ml 겐타마이신 함유 RPMI 배지에서 지름이 100mm인 배양접시를 이용하여 7일간 37℃, 5%의 CO2, 습기를 유지하는 트란스웰 배양기 또는 트란스웰 없는 단순 배양기에서 배양하였다. 또한, 상기 동종 면역자극 조건에서 상기 PBMC와 비혈연관계에 있는 UCB-MSC를 공동배양하였다. 이때 UCB-MSC는 3.3x104/cm2의 세포 농도로 플레이트의 웰에 부착하여 있고, 비혈연 관계의 두 PBMC는 부유된 상태로 트란스웰의 상부에 배양하였다. 상기 UCB-MSC는 10㎍/ml의 마이토마이신 C가 처리된 것을 사용하였다. 각 배양 시간에 따른 배양 상층액에서의 테나신-C의 농도를 ELISA를 이용하여 측정하였다.
도 6 및 7은 각각 트란스웰 또는 트란스웰 없이, 동종 면역자극 조건에서 배양된 배양상층액에서의 테나신-C의 농도를 측정한 결과를 나타내는 도면이다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 비혈연 관계에 있는 두 사람으로부터 각각 유래된 비혈연 PBMC를 트란스웰을 사용하여 공동배양한 경우, 테나신-C의 농도는 시간에 따라 증가하지 않았다. 반면, UCB-MSC를 트란스웰을 사용하여 공동배양한 경우, 테나신-C의 농도는 시간에 따라 변하였다. 0일에서 5일까지는 증가하여, 5일에서 피크를 이루었으며 5일에서 7일에서는 감소하였다. 7일째에 측정된 테나신-C의 누적 농도는 1545 pg/ml/7일/1.5x104/cm2이었고, 104UCB-MSC/cm2 당 147 pg/ml/일의 테나신-C 생산성을 보였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 트란스웰을 사용하지 않은 경우, 테나신-C의 농도는 7일까지 계속 증가하는 양상을 보이며 7일째 측정된 테나신-C의 누적 농도는 6118pg/ml/7일/1.5x104/cm2이었고, 104UCB-MSC/cm2 당 582 pg/ml/일의 테나신-C 생산성을 보였다. 도 6 및 7에서 A는 PBMC1, B는 PBMC1와 다른 사람 유래의 PBMC이며, UCB-MSC는 A 및 B와는 다른 사람 유래의 UCB-MSC이다.
도 8은 자극원으로서 PBMC 대신에 피토헤마글루티닌(phytohemagglutinin: PHA) (5㎍/ml)을 사용한 것을 제외하고는 도 6과 동일하게 실험한 결과를 나타내는 도면이다. 도 8에서 H는 피토헤마글루티닌이다. 도 8에 나타낸 바와 같이, PHA와 PBMC를 공동배양한 경우, 테나신-C의 농도는 시간에 따라 증가하지 않았다. 반면, UCB-MSC를 공동배양한 경우, 테나신-C의 농도는 시간에 따라 변하였다. 0일에서 7일까지는 증가하였다. 7일째에 측정된 테나신-C의 누적 농도는 5950 pg/ml/7일/1.5x104/cm2이었고, 104 UCB-MSC/cm2 당 566 pg/ml/일의 테나신-C 생산성을 보였다.
UCB-MSC에서 발현되는 테나신-C가 PBMC의 증식을 억제하는지를 검증하기 위하여, 테나신-C의 발현을 억제하는 siRNA (서열번호 5 및 6)를 UCB-MSC에 리포좀을 이용하여 트란스펙션하고, 얻어진 siRNA가 도입된 UCB-MSC를 면역자극 조건에서 배양하여 PBMC의 증식에 미치는 영향을 확인하였다. 트란스펙션은 UCB-MSC가 50% 컨플루언시 미만인 조건에서 lipofectamineTM 2000 (Invitrogen 사)과 33nM siRNA의 혼합물을 UCB-MSC에 첨가하고 6시간 동안 인큐베이션한 후 배지를 10%FBS 및 50㎍/ml 겐타마이신 함유 RPMI로 교환하였다.
도 9는 siRNA가 도입된 UCB-MSC 또는 대조군으로서 리포좀으로 트란스펙션된 UCB-MSC을 사용한 것을 제외하고는 도 8에 나타낸 바와 동일하게 실험한 결과를 나타내는 도면이다. 도 9에 나타낸 바와 같이, PHA와 PBMC를 공동배양한 경우, 테나신-C의 농도는 시간에 따라 증가하지 않았다. 반면, PHA 및 PBMC 및 UCB-MSC를 공동배양한 경우, 테나신-C의 농도는 시간에 따라 증가하였다(UCB-MSC+A+H; 및 UCB-MCC(lipo)+A+H). 그러나, 이러한 효과는 siRNA가 도입된 UCB-MSC를 공동배양한 경우에는 나타나지 않았다 (UCB-MSC(si)+A+H). 도 9에서, A는 PBMC이며, H는 자극원인 피토헤마글루티닌이고 UCB-MSC(si)는 siRNA로 트란스펙션된 UCB-MSC이고, UCB-MSC(lipo)는 siRNA가 없는 조건에서 동일한 과정에 따라 트란스펙션된 UCB-MSC (대조군)이다.
또한, 비혈연 관계에 있는 두 사람으로부터 각각 유래된 비혈연 PBMC를 공동배양하여 동종 면역자극이 일어나도록 하였다. 배양은 각 PBMC 3.3x105/cm2를 10% FBS와 50㎍/ml 겐타마이신 함유 RPMI 배지에서 6-웰 배양접시를 이용하여 6일간 37℃, 5%의 CO2, 습기를 유지하는 배양기에서 배양하였다. 여기에, 상기 동종 면역자극 조건에서, 상기 PBMC와 비혈연관계인 UCB-MSC 및 BM-MSC를 공동배양하였다. 이때 UCB-MSC 또는 BM-MSC는 3.3x104/cm2의 세포 농도로 플레이트의 웰에 부착하여 있고, 비혈연 관계의 두 PBMC는 부유된 상태로 트란스웰의 상부에 배양하였다. 상기 UCB-MSC 또는 BM-MSC는 10㎍/ml의 마이토마이신 C가 처리된 것을 사용하였다. 배양 6 일에 배양상층액에서의 테나신-C의 농도를 ELISA를 이용하여 측정하였다. 도 10은 동종 면역자극 조건에서 PBMC를 UCB-MSC 또는 BM-MSC와 공동배양된 경우, 테나신-C의 단백질 농도를 나타내는 도면이다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 동종 면역자극 조건에서 PBMC를 UCB-MSC와 공동배양된 경우, 테나신-C의 농도가 현저하게 증가하는 것을 알 수 있었다.
또한, 비혈연 PBMC를 공동배양하여 동종 면역자극이 일어나도록 하였다. 배양은 각 PBMC 6x105/cm2를 10% FBS 및 50㎍/ml 겐타마이신 함유 RPMI 배지에서 96웰 배양접시를 이용하여 7일간 37℃, 5%의 CO2, 습기를 유지하는 배양기에서 배양하였다. 여기에, 상기 동종 면역자극 조건에서 UCB-MSC 및 테나신-C에 대한 siRNA로 트란스펙션된 UCB-MSC를 공동배양하였다. 이때 UCB-MSC 또는 테나신-C에 대한 siRNA로 트란스펙션된 UCB-MSC는 6x104/cm2의 세포 농도로 플레이트의 웰에 부착하여 있고, 비혈연 관계의 두 PBMC는 부유된 상태로 트란스웰의 상부에 배양하였다. 상기 UCB-MSC는 10㎍/ml의 마이토마이신 C가 처리된 것을 사용하였다. 배양 6일에 배양상층액에서의 반응세포인 PBMC의 증식 정도를 BrdU의 세포 내 삽입정도를 BrdU에 대한 항체와 항체에 대한 이차항체에 붙은 효소반응으로 나타나는 광밀도 (optical density)를 이용하여 측정하였다. 도 11은 동종 면역자극 조건에서 PBMC를 UCB-MSC 또는 테나신-C에 대한 siRNA로 트란스펙션된 UCB-MSC와 공동배양된 경우, 반응세포인 PBMC를 측정한 결과를 나타내는 도면이다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 동종 면역자극 조건에서 PBMC를 테나신-C에 대한 siRNA로 트란스펙션된 UCB-MSC와 공동배양된 경우, 반응세포인 PBMC가, 테나신-C에 대한 siRNA로 트란스펙션된 UCB-MSC를 사용한 경우에 비하여, 증식이 증가하는 것을 알 수 있었다. 이는 테나신-C가 동종면역자극 조건에서 PBMC의 증식을 억제한다는 것을 입증하는 것이다. 도 11에서, MSC는 UCB-MSC만을 배양한 것이고, MSC(si)는 테나신-C에 대한 siRNA로 트란스펙션된 UCB-MSC만을 배양한 것이고, A+B+MSC는 비혈연 관계에 있는 두 사람으로부터 각각 유래된 비혈연 PBMC와 UCB-MSC을 공동배양한 것이고, A+B+MSC(si)는 비혈연 관계에 있는 두 사람으로부터 각각 유래된 비혈연 PBMC와 테나신-C에 대한 siRNA로 트란스펙션된 UCB-MSC을 공동배양한 것이고, A+B는 비혈연 관계에 있는 두 사람으로부터 각각 유래된 비혈연 PBMC만을 공동배양한 것이다. 도 11에서, x 축은 OD 값으로, 이 값이 높을 수록 T 세포의 면역 활성에 의한 증식이 높아짐을 나타낸다.
또한, 96-웰 플레이트의 웰에 음성대조군으로서 1 x 105의 반응 세포 (비혈연 PBMC)(A), 1 x 105의 자극세포 (비혈연 PBMC)(B)를 각각 단독 배양하였다. 양성대조군의 웰에는 반응세포인 비혈연 PBMC 1 x 105(A)와 자극세포로서 50㎍/ml의 마이토마이신 C가 처리된 비혈연 PBMC 1 x 105(B)을 배양하였다. 시험군 웰에는 양성대조군의 웰의 조건에 더하여, 10㎍/ml의 TNC-C 첨가하였다. 각 시험군 웰을 5일간 배양한 후, BrdU를 처리하고 24시간 동안 새로 합성된 반응세포의 DNA를 측정하였다.
도 12는 TNC-C의 존재하에서 반응세포와 자극세포를 공동배양한 결과를 나타내는 도면이다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 재조합단백질을 TNC-C 단독으로 첨가 했을때 동종 면역반응으로 나타나는 T 세포의 증식을 억제함을 확인하였다.
실시예 3: UCB-MSC에 의한 면역억제 조성물의 생산
본 실시예에서는 면역자극물질의 존재하에서 UCB-MSC를 배양하고 그 배양 상층액을 분리하고, 배양 상층액에 면역억제 활성이 있는지를 확인하였다.
사용된 실험재로는 PBMC (AllCells, LLC. (Emeryville, CA)), PHA (Roche Diagnotics GmbH, Mannheim, Germany), UCB-MSC, ELISPOT assay kit (BD Biosciences, San Diego, CA, USA),및 ELISPOT reader를 사용하였다.
96 well plate (0.33cm2)에서 RPMI, UCB-MSC를 포함하는 RPMI, UCB-MSC 및 PBMC를 포함하는 RPMI, UCB-MSC, PBMC 및 PHA를 포함하는 RPMI 배지에서 4일간 37℃에서 배양하였다. 이때 UCB MSC 및 PBMC는 각각 1x105 cell를 사용하였으며, PHA는 10㎍/ml, 총 배양액 부피는 250㎕로 하였다.
배양 후, 배양 상층액에 대한 면역조절반응은 BD Biosciences (San Diego, CA, USA)의 Enzyme-linked immunosorbent spot (ELISPOT) assay를 사용해 측정하엿다. ELISPOT 원리는 면역반응을 모니터링하는 분석으로써 마이크로플레이트의 PVDF (polyvilidene fluoride) 막에 특정 항-사이토카인 항체를 코팅하여 활성화된 세포에 의해 분비되는 사이토카인을 검출하는 방법이다. 분비된 사이토카인은 해당 항-사이토카인 항체와 스트렙타비딘-HRP 및 기질을 이용하여 시각화 하고, 반응정도를 스팟(spot)수로 비교할 수 있다. 4일 후, 플레이트를 1500 rpm, 5분간 원심분리 후, 세포를 제외한 배양상층액 150㎕를 회수하였다. ELISPOT 각 웰에 PBMC 1x105+ PHA (10㎍/ml) 100㎕와 각 조건에 얻어진 배양 상층액 100㎕를 첨가하여 37℃에서 3일간 배양하였다. 3일 후, 배양배지를 모두 제거하고, 탈이온수로 막을 2회 세척하였다. ELISPOT 세척 버퍼 200㎕를 첨가하여 막을 3회 세척하였다. 항-인간 인터페론-γ 항체 (1:250, 2㎍/ml)를 각 웰에 100㎕씩 첨가하여 실온에서 2시간 반응시켰다. ELISPOT 세척 버퍼 200㎕를 첨가하여 막을 3회 세척하였다. 스트렙타비딘-HRP 용액 (1:100) 100㎕를 첨가하여 실온에서 1시간 반응시켰다. ELISPOT 세척 버퍼 200㎕를 첨가하여 막을 4회 세척하였다. PBS 200㎕로 2회 세척하였다. AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) 발색 용액 100㎕를 첨가하여, 5분 후 막에 스팟 (spot)이 나타나면, 탈이온수로 반응을 중지시킨 후, 막을 완전히 건조시켰다. 플레이트를ELISPOT reader기로 웰 당 스팟 수를 계수하였다. 반응이 나타난 스팟 수는 배양 배지내에 분비된 인터페론-γ 양과 비례한다.
도 13은 면역자극물질의 존재하에서 배양된 UCB-MSC의 배양 상층액의 면역억제 효과를 나타내는 도면이다. 도 13에 나타낸 바와 같이, RPMI, UCB-MSC 배양상층액, UCB-MSC+PBMC 배양 상층액은 PHA에 의해 활성화된 PBMC로부터 인터페론-γ 분비를 억제하지 못하였였으나 PBMC+PHA에 의해 활성화된 UCB-MSC의 배양 상층액에는 면역조절물질이 분비되어 PHA에 의해 활성화된 PBMC로부터 인터페론-γ 분비를 억제할수 있었다. 도 13에서, 1: RPMI, 2: UCB-MSC 배양 상층액, 3: UCB-MSC+PBMC 배양 상층액, 4: PBMC+PHA에 의하여 활성화된 USC-MSC의 배양상층액을 나타낸다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (19)

  1. 제대혈 유래 간엽줄기세포 (umbilical cord blood derived mesenchyml stem cell: UCB-MSC)를 포함하는, T 세포의 항원에 대한 반응을 감소시키기 위한 조성물로서, 상기 UCB-MSC는 피토헤마글루티닌 (phytohemagglutinin: PHA)으로 자극된 말초혈액단핵세포 (peripheral blood mononuclear cell: PBMC)와 공동배양된 104 UCB-MSC/cm2 당 566 pg/ml/일 이상의 테나신-C를 생산하는 것 또는 동종타가의 PBMC로 자극된 PBMC와 공동배양된 104 UCB-MSC/cm2 당 147 pg/ml/일 이상의 테나신-C를 생산하는 것인 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 UCB-MSC는 프로스타글란딘 E2 (prostaglandin E2: PGE2)를 발현하는 것인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 UCB-MSC는 단위 투여량 내에 1x103 cells 내지 1x109 cells로 포함되는 것인 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 UCB-MSC와 배양된 T 세포를 포함하는 것인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 UCB-MSC와 배양된 말초혈액단핵세포 (PBMC)를 포함하는 것인 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 PBMC는 단위 투여량에 1x103 cells 내지 1x1010 cells로 포함되는 것인 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 UCB-MSC는 T 세포에 대하여 자가 또는 동종타가 유래인 것인 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 항원은 T 세포에 대하여, 자가, 동종타가, 또는 이종 유래인 것인 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 항원이 T 세포에 대하여 자가 항원인 경우, 비자기 항원으로 인식되는 것인 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 UCB-MSC를 위한 담체를 더 포함하는 것인 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 담체는 배지, 또는 버퍼인 것인 조성물.
  14. 삭제
  15. 비혈연 PBMC, PHA 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 면역자극물질의 존재하에서 제대혈 유래 간엽줄기세포를 배양하는 단계; 및
    상기 배양물로부터 배양 상층액을 분리하는 단계;를 포함하는, T 세포의 항원에 대한 반응을 감소시키기 위한 조성물을 생산하는 방법으로서,
    상기 배양 상층액으로부터 테나신-C를 분리하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
KR1020100045129A 2009-05-13 2010-05-13 테나신-ｃ를 발현하는 제대혈 유래 간엽줄기세포 및 그 용도 KR101154188B1 (ko)

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