CN101389349B - 驯化的nkt细胞及其在治疗免疫相关病症中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗需要这种治疗的哺乳动物对象的免疫相关或免疫介导的疾病的方法。该方法包括用合适的方法操纵所述对象的NKT细胞群，对NKT细胞群的所述操纵可调节Th1/Th2细胞平衡转向抗炎细胞因子产生细胞。操纵NKT细胞群可通过以合适方式消除所述细胞或者通过离体驯化NKT细胞来进行，从而使得驯化的NKT细胞能调节Th1/Th2平衡转向抗炎细胞因子产生细胞。本发明还涉及用于治疗哺乳动物对象的免疫相关或免疫介导病症的药物组合物。这些组合物含有离体驯化的NKT细胞作为有效成分。本发明还提供离体驯化的NKT细胞及其在治疗免疫相关或免疫介导病症中的应用的方法。

Description

驯化的NKT细胞及其在治疗免疫相关病症中的应用
相关专利申请的交叉引用
本申请是Yaron llan等于2003年6月25日提交的名为“驯化的(educated)NKT细胞及其在治疗免疫相关病症中的应用”的美国专利申请(申请号还未给予)的后续部分，所述专利申请是2001年12月24日提交的国际申请号PCT/IL01/01197的371。上述专利申请的内容全文纳入本文作为参考。
发明领域
本发明涉及治疗哺乳动物对象的免疫相关或免疫介导病症的治疗方法、组合物及其用途的领域。更具体地说，本发明的方法和组合物涉及操纵对象的NKT细胞群从而调节Th1/Th2细胞平衡向产生抗炎或促炎细胞因子的细胞，以及它们在治疗免疫相关病症中的应用。
为更全面地描述本发明所属领域的情况，在本说明书中引用或鉴定的所有专利、专利申请、专利公开、科技文章等均全文引作参考。
背景技术
免疫系统是机体抵御可能有害物质的主要防御部分。然而，该系统可反过来对抗自身抗原而导致自身免疫病症，例如炎性肠病。这些病症可认为是促炎(Th1)和抗炎(Th2)细胞因子之间丧失平衡所致。
抑制免疫应答可能涉及会导致不良副作用的广泛免疫抑制作用。因此，需要诱导抗原特异性免疫抑制的替代策略。可通过两种机制诱导免疫耐受。第一种称为“隐性”机制涉及克隆无反应性或去除能对抗原应答的大多数免疫细胞(Matzinger，P.等，Ann.Rev.Immunol.12：991-1045(1994)；Qin，S.等，Science 259：974-977(1993))。或者，在“显性”型耐受中，免疫耐受过程可产生负免疫调节性淋巴细胞。与克隆去除或无反应性相反，存在的有限数量的这些淋巴细胞可下调数量更多的效应细胞。
免疫系统在炎性肠病发病机制中的作用
炎性肠病(IBD)是常见的胃肠病症，该病症可认为是免疫应答的Th1-促炎和Th2-抗炎亚型之间失去平衡所致[Strober，W.等，Immunol Today 18：61-64(1997)；Neurath，M.等，J.Exp.Med.183：2605-2616(1996)]。
IBD伴有几种肠道外表现。例如，自身免疫现象，形成了在靶器官损伤中具有作用的免疫复合物和可与用于缓解此疾病的免疫抑制药物，例如糖皮质激素、咪唑巯嘌呤、氨甲喋呤和环抱菌素[Podolsky，D.K.等，New Engl.J.Med.，325：928-935(1991)；Strobe，W.等，刊于《临床免疫学》(Clinical Immunology)，Mosby，St.Louis.R.R.Rich编，1401-14281-2(1995)]。IBD患者具有抗结肠细胞成分和几种不同的细菌抗原的抗体。由于上皮细胞损伤，这些抗原得以接触免疫系统[Hibi，S.等，Clin.Exp.Immunol.54：163-168(1983)；Das，K.M.等，Gastroenterology98：464-69(1990)]。在这些患者中也发现了T细胞介导的免疫力异常，包括同时对T细胞刺激无反应性和反应性降低[Chiba，M.等，Gut，22：177-182(1981)；Raedler，A.等，Clin.Exp.Immunol.60：518-526(1985)]。此外，鉴定到粘膜细胞介导免疫力的变化，包括粘膜IgG细胞浓度的增加和T细胞亚类的变化，提示有抗原刺激[Dasgupta，A.等，Gut 35：1712-17(1994)；Takahashi，F.等，J.Clin.Invest.76：311-318(1985)]。感染后接触靶抗原、免疫性或毒性破坏可激活粘膜免疫细胞产生细胞因子，再导致粘膜炎性应答[Neurath，M.等，J.Exp.Med.，183：2605-2616(1996)]。促炎细胞因子，例如IFNγ的分泌增加了粘膜通透性，这已在IBD动物模型中得到描述[Strober，W.等，Immunol.Today 18：61-64(1997)]。类似地，在这些动物中检测到IL1和IL6介导的胶原合成增加[Strober，W.等，同前]。通过将Balb/C小鼠的正常CD45RB T细胞过继转移入CB-17scid小鼠建立了Th1-介导的肉芽肿结肠炎模型。当CD45RB的CD4细胞与CD45RB群一起注射时，显示其可预防该疾病。这种预防作用可通过加入抗TGFβ1的抗体来逆转[Sadlack，B.等，Cell 75：253-261(1993)；Powrie，F.等，Immunity 1：553-562(1994)]。
炎性肠病中的Th1/Th2失衡
CD4和CD8淋巴细胞可分类为产生IL-2和IFNγ的Th1细胞和产生IL-4和IL-10的Th2细胞。免疫系统对外来和自身抗原应答的方式是两种亚类应答之间的平衡[Weiner，H.L.等，Immunol.Today 18：335-343(1997)；Adorini，L.等，Immunol.Today 18：209-211(1997)；Rabbani，E.等，欧洲专利公开号EP1149586A1(2001年4月27日提交)，这些文献纳入本文作为参考]。Th1型应答涉及几种自身免疫和慢性炎性病症，例如IBD的发病机制[Adorini，L.等，(1997)，同前；Mizoguchi，A.等，J.Exp.Med.183：847-856，(1996)]。因此，人的实验性结肠炎和IBD可认为是促炎Th1型和抗炎Th2型细胞因子失去平衡所致。近来在动物和人中均显示抗炎细胞因子，例如IL10可下调Th-1介导的细胞因子的促炎作用，从而缓解免疫介导的病症[Mizoguchi，A.等，(1996)，同前；Madsen，K.L.等，Gastroenterology 113：151-159(1997)；Van Deventer Sander，J.等，Gastroenterology113：383-389(1997)]。
用于缓解免疫介导病症的口服耐受诱导(口服免疫调节)
口服耐受(口服免疫调节)是诱导抗原特异性外周免疫低反应性的公认方法[Weiner，H.L.等，(1997)，同前；Weiner，H.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10762-10765(1994)；Roy-Chowdury等，国际公开号WO 98/37917(1998年2月26日提交)，这些文献纳入本文作为参考]。抗原的口服给药在动物和人中均显示可预防或缓解几种自身免疫病症，例如胶原诱导的关节炎、眼色素层、糖尿病和实验性过敏性脑脊髓炎[Esbjorn，T.等，Iht.Arch.Allergy Immunol.113：219-223(1997)；Von Herrath，M.G.等，J.Clin.Inves.98：1324-1331(1996)；Hancock，W.等，Am.J.Path.147：1193-1197(1993)；Weiner，H.L.等，Science 261：1321-1324(1993)]。
肠道接触高剂量的抗原可通过抗原特异性T细胞的克隆灭活而诱导耐受，而给予低剂量的抗原可诱导调节细胞分泌能抑制抗原特异性效应细胞产生的因子[Weiner，H.L.等，(1997)，同前]。耐受诱导在动物和人中均与Th2/Th3型免疫应答相关，该应答导致免疫抑制细胞因子，例如IL10、IL4和TGFβ1的分泌[Weiner，H.L.等，(1997)，同前]。涉及对多种紧密相关抗原反应性的旁观效应已证明在几种模型的口服耐受诱导中起了作用[Weiner，H.L.等，(1997)，同前；Carvalho，B.A.等，Scand J.Immunol.45：276-281，(1997)]。由于调节细胞经给予的抗原激发后分泌非抗原特异性细胞因子，它们可抑制给予抗原所在部位微环境中的炎症。虽然已熟知该方法可用于诱导免疫耐受的方法，其确切的机理仍未发现。关于耐受诱导时抗原是否要经过加工和/或吸收，蛋白质是否应变性公布的结果相互矛盾[Carvalho，B.A.等，(1997)，同前；Blanas，E.等，Science 274：1707-1709(1996)]。
抗原呈递可能需要将完整的蛋白质经肠道呈递。然而，蛋白质加工和吸收也可能涉及耐受的诱导或涉及通过肠后机理维持耐受[Carvalho，B.A.等，(1997)，同前]。肠壁上皮细胞、派尔斑、肠系膜淋巴结或肠外细胞表明可介导免疫耐受的诱导[Strober，W.等，(1997)，同前]。然而，抗原的口服给药也可引发表位特异性免疫力[Carvalho.，B.A.等，(1997)，同前；Blanas，E.等，(1996)，同前]。实际上，在肠壁中，主要在派尔斑中同时发现口服耐受后出现了免疫抑制性细胞因子-分泌细胞(例如，分泌TGFβ的Th3细胞)，和分泌促炎细胞因子(例如，IFNγ)的第二群细胞[Weiner，H.L.等，(1997)，同前]。口服给予的抗原在肠粘膜中引发了IFNγ介导的局部促炎应答与全身性TGFβ和IL4介导的抗炎应答。与口服耐受的动物脾细胞相反，从肠道提取的淋巴细胞不能将此耐受性转移给原初动物[Strober，W.等，(1997)，同前；Weiner，H.L等，(1997)，同前]。因此，诱导口服耐受需要免疫原性和耐受原性细胞群之间的平衡，以及从Th1(和促炎细胞因子分泌)转向Th2(和抗炎细胞因子分泌)免疫应答。
其他人和本发明人已证明口服耐受可用于预防或缓解用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)处理的小鼠模型系统的实验性结肠炎[Madsen，K.L.等，Gastroenterology113：151-159(1997)；Trop，S.等，Hepatology 27：746-755(1999)]。诱导对结肠炎提取蛋白质的口服耐受可下调抗结肠免疫应答，从而缓解了免疫介导的结肠炎。抑制性淋巴细胞可通过诱导从促炎转向抗炎免疫应答来介导耐受性[Madsen，K.L.等，(1997)，同前；Trop，S.等，同前]。
肝脏在免疫耐受诱导中的作用
长久以来，肝脏就被认为涉及免疫调节功能。它是体内最大的网状内皮组织器官，肝脏细胞的几种亚群涉及抗原呈递和/或加工[Callery，M.P.等，J.Surg.Res.46：391-394(1989)；Nakano，Y.等，Surgery 111：668-676(1992)；Yu，S.Y.等，Surgery116：229-234(1994)]。
门腔静脉分流或库普弗细胞功能的阻断在几种动物模型中阻止了口服耐受的诱导[Callery，M.P.等，(1989)，同前；Nakano，Y.等，(1992)，同前；Yu，S.Y.等，(1994)，同前]。在经历门腔静脉分流的慢性肝病患者中发现对肠道菌群的抗体滴度升高[Crispe，N.等，Immun.Today 11：236-245(1996)；Ilan，Y.等，Gastro 114：260(1998)]。门静脉给予供体细胞显示能促进同种特异性低反应性[Crispe，N.等，(1996)，同前]。因此，肝脏可能通过首先清除细胞或肽的特异性亚群诱导外周免疫耐受所必需。
本发明的实施例显示通过连续喂食小鼠肝脏提取物所致的口服免疫调节诱导缓解了ob/ob小鼠的葡萄糖耐受不良症，降低了它们的肝脏脂肪含量，同时使得它们易遭受伴刀豆球蛋白-A介导的肝脏损伤。该机理涉及Th1/Th2应答的这转变。
肝脏相关的淋巴细胞
成人肝脏含有涉及其免疫调节功能的几种细胞亚群。发现库普弗细胞在抵御抗原通过门循环进入肝脏的第一道防线中有重要作用。抗原激活的库普弗细胞具有抗原呈递，吞噬作用并通过分泌细胞因子显示有杀伤性能。这些细胞也诱导趋化性和淋巴细胞聚集[Crispe，N.等，(1996)，同前]。此外，成人肝脏含有能产生多种细胞谱系的多能干细胞，所述谱系包括胸腺和胸腺外(extrathymic)T细胞，粒细胞，红血球谱系细胞[Crispe N等，(1996)，同前]。实际上，在成人肝脏中T细胞可胸腺外分化[Collins C.等，Eur.J.Immunol.26：3114-3118(1996)]。
肝脏看来是由具有高(亲和力)TCR(TCRhigh)的胸腺T细胞和具有中(亲和力)TCR(TCRint)的胸腺外T细胞组成的两群T细胞交汇的场所。第一种T细胞也称为主流T细胞，它包括小群CD4+和CD8+细胞和大群CD4-CD8-双阴性(DN)细胞的混合群，这些细胞不表达NK细胞标记或IL2Rβ并且与循环T细胞库密切相关[Crispe，N.等，(1996)，同前]。许多DN细胞表达B细胞标记，B220，诱导该标记导致将凋亡中的T细胞运至肝脏[Crispe，N.等，(1996)，同前；Ilan，Y.等，(1998)，同前；Collins，C.等，(1996)，同前；Garcia-Barcina，M.等，Immunol 82：95-8(1994)；MacDonald，R.H.等，J.Exp.Med.182：633-638(1995)]。称为另一种T细胞的肝脏T细胞的第二亚群是表达αβTCRint和已知的NK受体，包括NKR-P1、Ly-49A和IL2受体β链的CD4+、或CD4-8-和CD16-细胞[Garcia-Barcina，M.等，(1994)，同前；MacDonald，R.H.等，(1995)，同前；Bendelac，A.等，Curr.Opin.in Immunol.7：367-374(1995)]。大多数肝脏IL2Rβ+TCRint细胞是NK1.1+。这些细胞在经外周淋巴器官循环的库中罕见。然而，这些细胞的一小群存在于胸腺髓质、脾脏和骨髓中。TCRintIL2Rβ+NK1.1+细胞可通过原始途径、胸腺和胸腺外交替途径，而非通过常规胸腺途径分化并且可在切除胸腺动物的肝脏中发育[MacDonald，R.H.等，(1995)，同前；Bendelac，A.等，(1995)，同前；Takahashi，M.等，J.Immunol.156：2436-2442(1996)；Doherty，D.G.等，Hepatology 26：445A(1997)]。它们的功能不是常规T细胞任何亚群的特征性功能，但包括细胞毒性和B细胞辅助功能。初次激活后，它们释放大量各种Th1和Th2来源的细胞因子[MacDonald，R.H.等，(1995)，同前；Bendelac，A.等，(1995)，同前；Takahashi，M.等，(1996)，同前；Doherty，D.G.等，(1997)，同前]。它们也对IL12起反应并产生IFNγ，这二者均是诱导抗肿瘤和抗微生物的效应细胞的Th1细胞因子[Takahashi，M.等，(1996)，同前；Doherty，D.G.等，(1997)，同前]。此外，这些细胞在肝脏中可对IL2和TNFα反应而增殖并在外周消除(peripheral deletion)期间活跃地参与了对主流T细胞的致命性攻击[Takahashi，M.等，(1996)，同前；Doherty，D.G.等，(1997)，同前]。
本发明的目的之一是检测NK1.1+淋巴细胞在外周免疫耐受诱导、通过脾细胞过继转移诱导耐受和/或炎症、特别是在维持淋巴细胞的免疫原性和耐受原性亚群之间平衡中的作用。本项研究的结果首次证明NK1.1+淋巴细胞在免疫介导的病症中可能具有双重作用。在“耐受环境”中，它们可通过改变抗炎性方向中的Th1/Th2模式来诱导和/或维持免疫低反应性。另一方面，在“不耐受环境”中，它们支持促炎性模式。本发明的该目的和其它目的会随以下描述而更明了。
用于治疗哺乳动物的免疫相关或免疫介导的病症或疾病、感染性疾病、代谢病症和不同类型癌症的各种方法已有描述。这些方法中的一种涉及调节对象的免疫应答。这包采用产生和应用新的和未预料的免疫调节的方法或组合方法来下调免疫应答系统，该方法称为选择性免疫下调(SIDR)。免疫调节是在对象的免疫系统对引入的试剂、方法和过程应答中人工诱导改变。这些方法详细描述见1997年2月28日提交的美国专利申请号08/808,629；2003年3月4日提交的美国专利申请号10/377,628；2003年3月4日提交的美国申请号10/377,603；1997年2月28日提交的美国专利申请号09/447,704；2001年5月9日提交的美国申请号10/385,440和1999年7月16日提交的美国申请号09/356,294。前述每篇专利均全文纳入本申请作为参考并结合本发明应用。
发明概述
第一方面，本发明涉及通过合适的方法操纵对象的NKT细胞群来治疗需要治疗的该哺乳动物对象的免疫相关或免疫介导病症的方法，所述操纵NKT细胞群可导致调节Th1/Th2细胞平衡转向产生抗炎或促炎细胞因子细胞。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及通过消除NKT细胞来操纵该细胞群的方法。作为特别优选的实施方案，消除NKT细胞群可通过给予对象治疗有效量的含有作为有效成分的抗体组合物来进行，所述抗体能特异性识别NKT细胞。或者，可通过采用包被了特异性识别NKT细胞的抗体的小珠的离体除去法来消除NKT细胞群。
在另一优选的实施方案中，本发明涉及治疗哺乳动物对象的免疫相关或免疫介导病症的方法，该方法包括通过离体驯化所述NKT细胞来操纵NKT细胞群从而使得该驯化的NKT细胞能调节Th1/Th2平衡转向产生抗炎或促炎细胞因子的细胞。
一个特别优选的实施方案涉及治疗哺乳动物对象的免疫相关或免疫介导病症的方法，该方法包括：
a.获得所述对象或另一对象的NKT细胞；
b.离体驯化步骤(a)获得的NKT细胞，使产生的驯化NKT细胞能调节Th1/Th2平衡转向产生抗炎或促炎细胞因子细胞；和
c.将得自步骤(b)的驯化的NKT细胞重新引入该对象。调节Th1/Th2细胞平衡转向产生抗炎细胞因子细胞，从而提高IL4和IL10之一与IFNγ的数量比。调节Th1/Th2细胞平衡转向产生促炎细胞因子的细胞可导致IL4和IL10之一与IFNγ的数量比降低。
更具体地说，可通过在存在以下任何一种物质时培养NKT细胞来离体驯化NKT细胞：
a.与待治疗的免疫相关或免疫介导病症相关的抗原或它们的任何组合；
b.患有相同免疫相关或免疫介导病症的耐受或不耐受患者的或所述对象的至少一种肝脏相关细胞；
c.至少一种细胞因子或粘附分子；和
d.以上(a)、(b)和(c)的组合。
根据本发明方法离体驯化的NKT细胞可通过过继性转移再引入受治疗的对象。
另一优选的实施方案涉及治疗免疫相关或免疫介导病症是炎性肠病(IBD)的本发明方法。更具体地说，所述疾病是克罗恩病。
在另一个特别优选的实施方案中，本发明的方法用于治疗选自黑色素瘤、癌症、淋巴瘤和肉瘤的恶性肿瘤。对于此目的，为了提高有利的抗肿瘤免疫力，可定向提高免疫应答的促炎性方向而调节NKT细胞。
一个优选的实施方案涉及治疗所述免疫相关或免疫介导病症是非酒精性脂肪性肝炎的本发明方法。
在另一个优选的实施方案中，本发明的方法可用于治疗肥胖。
本发明的另一个优选实施方案是治疗糖尿病或葡萄糖耐受不良症的方法。
在还有另一个优选的实施方案中，本发明的方法用于治疗移植物抗宿主疾病。
另一个优选的实施方案涉及用于治疗免疫相关或免疫介导病症或疾病的本发明方法，所述病症或疾病包括：骨质疏松症、多发性硬化症、SLE、类风湿性关节炎、JRA、眼病、皮肤病、肾病、血液病、ITP、PA、自身免疫肝病、其它风湿病、内分泌疾病(不包括糖尿病)、脉管炎、硬皮病、CREST、神经疾病、肺病、肌炎、耳病或重症肌无力。
一个优选的实施方案涉及通过口服耐受诱导或口服免疫调节来治疗免疫相关或免疫介导的病症或疾病的免疫调节方法。
一个优选的实施方案涉及通过口服耐受诱导或口服免疫调节来治疗非酒精性脂肪性肝炎的免疫调节方法。
另一个优选的实施方案涉及通过口服耐受诱导或口服免疫调节来治疗糖尿病或葡萄糖耐受不良症的免疫调节方法。
在还有另一个优选的实施方案中，本发明涉及通过口服耐受诱导或口服免疫调节来治疗肥胖的免疫调节方法。
本发明的方法还可任选包括优选通过口服耐受上调或下调对象的免疫相关或免疫介导病症的免疫应答的步骤。
还有另一个优选的实施方案涉及通过口服耐受诱导或口服免疫调节来治疗免疫相关或免疫介导的病症或疾病的免疫调节方法，所述病症或疾病包括：骨质疏松症、GVHD、多发性硬化症、SLE、类风湿性关节炎、JRA、眼病、皮肤病、肾病、血液病、ITP、PA、自身免疫肝病、其它风湿病、内分泌疾病(不包括糖尿病)、脉管炎、硬皮病、CREST、神经疾病、肺病、肌炎、耳病或重症肌无力。
在还有另一个特定的实施方案中，本发明的方法用于治疗人患者。
本发明的第二方面涉及治疗哺乳动物对象的免疫相关或免疫介导病症的治疗性组合物。本发明的组合物含有离体驯化的自体或非自体NKT细胞作为有效成分，驯化的细胞能调节Th1/Th2细胞平衡转向产生抗炎或促炎细胞因子细胞。这些驯化的NKT细胞可介导IL4和IL10之一与IFNγ的数量比增加或降低。本发明的组合物还任选含有药学上可接受的运载体、稀释剂、赋形剂和/或添加剂。
在一个优选的实施方案中，在用于本发明组合物中之前，本发明的治疗性组合物中所含的驯化NKT细胞在存在以下任何一种物质时离体培养：
a.与所述免疫相关或免疫介导病症相关的抗原，或它们的任何组合；
b.患有所述免疫相关或免疫介导病症的耐受或不耐受患者的或待治疗对象的至少一种肝脏相关细胞；
c.至少一种细胞因子或粘附分子；和
d.以上(a)、(b)和(c)的组合。
在一优选的实施方案中，本发明的治疗性组合物用于治疗哺乳动物对象的炎性肠病，更具体地说，用于治疗克罗恩病。
在另一个优选的实施方案中，本发明的治疗性组合物用于治疗选自黑色素瘤、癌症、淋巴瘤和肉瘤的恶性肿瘤。
在一优选的实施方案中，本发明的治疗性组合物用于治疗非酒精性脂肪性肝炎。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及用于治疗肥胖的治疗性组合物。
本发明的另一个优选实施方案是用于治疗糖尿病或葡萄糖耐受不良症的治疗性组合物。
在还有另一个优选的实施方案中，本发明的治疗性组合物用于治疗移植物抗宿主疾病。
在还有另一个优选的本发明实施方案中，本发明涉及用于治疗免疫相关或免疫介导病症的治疗性组合物。该组合物含有能特异性识别NKT细胞的抗体作为有效成分。
在一个实施方案中，本发明的治疗性组合物用于治疗肠道炎性疾病，例如克罗恩病。
在另一个实施方案中，本发明的治疗性组合物可用于治疗选自黑色素瘤、癌症、淋巴瘤和肉瘤的恶性肿瘤。对于此目的，为了提高有利的抗肿瘤免疫力，可定向提高免疫应答的促炎性方向而调节NKT细胞。
另一个优选的实施方案涉及用于治疗免疫相关或免疫介导的病症或疾病的本发明方法，所述病症或疾病包括：骨质疏松症、多发性硬化症、SLE、类风湿性关节炎、JRA、眼病、皮肤病、肾病、血液病、ITP、PA、自身免疫肝病、其它风湿病、内分泌疾病(不包括糖尿病)、脉管炎、硬皮病、CREST、神经疾病、肺病、肌炎、耳病或重症肌无力。
一优选的实施方案涉及口服抗原在制备用于治疗免疫相关或免疫介导的病症或疾病的治疗性组合物中的应用。
一优选的实施方案涉及口服抗原在制备用于治疗非酒精性脂肪性肝炎的治疗性组合物中的应用。
另一个优选的实施方案涉及口服抗原在制备用于治疗糖尿病或葡萄糖耐受不良症的治疗性组合物中的应用。
其它优选的实施方案涉及口服抗原在制备用于治疗肥胖的治疗性组合物中的应用。
在另一个优选的实施方案中，口服抗原用于制备用于治疗免疫相关或免疫介导病症或疾病的治疗性组合物，所述病症或疾病包括：骨质疏松症、多发性硬化症、SLE、类风湿性关节炎、JRA、眼病、皮肤病、肾病、血液病、ITP、PA、自身免疫肝病、其它风湿病、内分泌疾病(不包括糖尿病)、脉管炎、硬皮病、CREST、神经疾病、肺病、肌炎、耳病或重症肌无力。
本发明的第三方面涉及驯化的自体或非自体NKT细胞在制备用于调节患免疫相关或免疫介导病症的哺乳动物对象的Th1/Th2平衡转向产生抗炎细胞因子的细胞的治疗性组合物中的应用。
在特别优选的实施方案中，本发明涉及离体驯化的自体或非自体NKT细胞在制备用于治疗哺乳动物对象的免疫相关或免疫介导病症的治疗性组合物中的应用。所述驯化的NKT细胞能调节Th1/Th2细胞平衡转向产生抗炎细胞因子的细胞从而介导IL4和IL10之一与IFNγ之间数量比的提高。
在一特别优选的实施方案中，本发明涉及离体驯化的自体或非自体NKT细胞在制备用于治疗哺乳动物对象，特别是人类患者的肠道炎性疾病，特别是治疗克罗恩病的治疗性组合物中的应用。
在另一个特别优选的实施方案中，本发明涉及驯化的自体或非自体NKT细胞在制备用于治疗恶性肿瘤，更具体地说治疗黑色素瘤、癌症、淋巴瘤和肉瘤的治疗性组合物中的应用。
在一优选的实施方案中，本发明涉及驯化的自体或非自体NKT细胞在制备用于治疗非酒精性脂肪性肝炎的治疗性组合物中的应用。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及驯化的自体或非自体NKT细胞在制备用于治疗肥胖的治疗性组合物中的应用。
本发明的另一个优选的实施方案涉及驯化的自体或非自体NKT细胞在制备用于治疗糖尿病或葡萄糖耐受不良症的治疗性组合物中的应用。
在还有另一个优选的实施方案中，本发明涉及驯化的自体或非自体NKT细胞在制备用于治疗移植物抗宿主疾病的治疗性组合物中的应用。
另一个优选的实施方案涉及用于治疗免疫相关或免疫介导的病症或疾病的本发明方法，所述病症或疾病包括：骨质疏松症、多发性硬化症、SLE、类风湿性关节炎、JRA、眼病、皮肤病、肾病、血液病、ITP、PA、自身免疫肝病、其它风湿病、内分泌疾病(不包括糖尿病)、脉管炎、硬皮病、CREST、神经疾病、肺病、肌炎、耳病或重症肌无力。
本发明还提供用于治疗需要这种治疗的哺乳动物对象的免疫相关或免疫介导病症的离体驯化NKT细胞。将驯化的NKT细胞在存在以下任何一种物质时离体培养：
a.与所述免疫相关或免疫介导病症相关的抗原，或它们的任何组合；
b.患所述免疫相关或免疫介导病症的耐受或不耐受患者的或所述对象的至少一种肝脏相关细胞；
c.至少一种细胞因子或粘附分子；和
d.以上(a)、(b)和(c)的组合。
在该方面的另一个实施方案中，本发明涉及离体驯化的自体或非自体NKT细胞在治疗需要这种治疗的哺乳动物对象的免疫相关或免疫介导病症中的应用。
在还有另一个优选的实施方案中，本发明涉及能特异性识别NKT细胞的抗体在制备用于调节患有免疫相关或免疫介导病症的哺乳动物对象NKT细胞群的治疗性组合物中的应用。具体地说是消除所述NKT细胞群。
NKT细胞群的消除将导致Th1/Th2细胞平衡转向产生抗炎细胞因子的细胞。
在一特别优选的实施方案中，本发明涉及能特异性识别NKT细胞的抗体在制备用于治疗哺乳动物对象的免疫相关或免疫介导病症的治疗性组合物中的应用。
在一特定的实施方案中，免疫相关病症可以是炎性肠道疾病，例如克罗恩病。在另一个特定的实施方案中，免疫相关或免疫介导的病症可是恶性肿瘤，例如黑色素瘤、癌症、淋巴瘤和肉瘤。
附图简述
图1A-1B：耐受对实验性结肠炎中肠粘膜的组织学评价的作用。
图1A：显示不耐受小鼠远端结肠组织(最后10cm)的石蜡切片。
图1B：显示耐受小鼠远端结肠组织(最后10cm)的石蜡切片。
用苏木精-曙红对切片染色。炎性应答和粘膜破坏显著降低(B组，图1B)证明喂食来源于小鼠的CEP极大缓解了实验性结肠炎。相反，在喂食BSA的不耐受小鼠中观察到严重的结肠炎(A组，图1A)。
图2：NK1.1+淋巴细胞提高了耐受小鼠的CD4+IL4+/CD4+IFNγ+之比。
收集所有组中小鼠的脾细胞和肝脏相关淋巴细胞(LAL)(2.5×106个脾细胞和0.5×106LAL)并在存在CEP和APC时培养72小时。以下直方图总结了流式细胞术分析，显示与没有消除NK1.1-的耐受小鼠(E组，白色柱)相比，口服耐受诱导后NK1.1-LAL的消除降低了CD4+IL4+/CD4+IFNγ+之比(B组，黑色柱)。与没有消除NK1.1-组(C组，白色柱)相比，NK1.1-消除对照组(F组，黑色柱)的CD4+IL4+/CD4+IFNγ+之比降低。缩写：EXP.GR.＝实验组，rat.＝比率，CEP＝结肠炎提取蛋白质，n-dep.＝没有消除的，NK 1.1-dep.(NK1.1-消除的)，cont.＝对照。
图3：NK 1.1+淋巴细胞降低了患实验性结肠炎的不耐受小鼠中CD4+IL4+/CD4+IFNγ+之比。
与耐受组相反，NK 1.1-消除对患实验性结肠炎(N-CEP)不耐受小鼠具有相反作用。与没有NK 1.1-消除的不耐受组(A组，白色柱)相比，NK 1.1-消除的不耐受组(D组，黑色柱)的CD4+IL4+/CD4+IFNγ+之比增加。缩写：EXP.GR.＝实验组，rat.＝比率，CEP＝结肠炎提取蛋白质，n-dep.＝没有消除的，NK 1.1-dep.(NK1.1-消除的)，cont.＝对照。
图4：不同实验组的分离的淋巴细胞上的IL4和IFNγ表达。
该图显示检测IL4和IFNγ表达的流式细胞术分析的代表性结果。分别分析了IL4和IFNγ在以下小鼠的分离淋巴细胞中的表达：B和E组耐受的NK 1.1没有消除和消除的小鼠；A和D组不耐受的NK 1.1没有消除和消除的小鼠。门控选出(gating)5×104小淋巴细胞，数据以点图显示。点图下的数值表示染色细胞的百分比。
不同的实验组以B、E、A和D表示。缩写：EXP.GR.＝实验组。
图5：体外抗原接触对患实验性结肠炎的耐受和不耐受小鼠的CD4+IL4+/CD4+IFNγ+之比的作用。
为评价疾病靶抗原对CD4+IL4+/CD4+IFNY+之比的作用，收集所有组(B、E、A、D、C、F)小鼠的脾细胞和肝脏相关淋巴细胞(2.5×106个脾细胞和0.5×106LAL)在存在ConA(伴刀豆球蛋白-A)和无CEP与APC时(白色柱)培养12小时。流式细胞术显示B和E组与对照C和F组耐受小鼠的CD4+IL4+/CD4+IFNY+之比显著降低，而在A和D组不耐受(n-CEP)小鼠中显著增加。
对NK 1.1消除在无抗原存在时的作用进行评价显示与在抗原存在时相类似的作用(黑色柱)。与耐受的E组NK 1.1-消除小鼠相比，收集自B组的耐受小鼠的淋巴细胞显示明显较高的CD4+IL4+/CD4+IFNy+比例。相反，NK 1.1消除在无疾病靶抗原存在时的A和D组不耐受小鼠中诱导了CD4+IL4+/CD4+IFNγ+之比增加。缩写：EXP.GR.＝实验组，rat.＝比率，CEP＝结肠炎提取蛋白质，n-dep.＝没有消除的。
图6：不同实验组中的IL4和IFNγ水平。
收集一式三份的两组上清液体，检测所有耐受和不耐受组(以A、B、C、D、E、F表示不同的组)所有小鼠的细胞因子水平。通过“夹心”ELISA检测IL4和IFNγ水平。耐受小鼠显示免疫应答细胞因子分泌从Th1型转向Th2型。这些小鼠(B组)显示IL4水平升高和IFNγ水平降低。相反，不耐受组(A、E和F组)显示IFNγ水平高和IL4水平低。缩写：EXP.GR.＝实验组。
图7：NK 1.1-消除对IL12水平的作用。
收集一式三份的两组上清液体，检测所有耐受和不耐受组(以A、B、C、D、E、F表示不同的组)的所有小鼠的细胞因子水平。NK 1.1消除导致喂食CEP组(分别是E和B组)的IL12水平升高但在未喂食CEP组(A和D组)中具有相反作用。缩写：EXP.GR.＝实验组。
图8A-8B：耐受对实验性结肠炎肠粘膜组织学评价的作用。
图8A：显示不耐受小鼠远端结肠组织(最后10cm)的石蜡切片。
图8B：显示耐受小鼠远端结肠组织(最后10cm)的石蜡切片。
用苏木精-曙红对切片染色。炎性应答和粘膜破坏显著降低(H组，图8B)证明喂食来源于小鼠的CEP极大缓解了实验性结肠炎。相反，在喂食BSA的不耐受小鼠中观察到严重的结肠炎(G组，图8A)。
图9：NK1.1+淋巴细胞提高了耐受小鼠的CD4+IL4+/CD4+IFNγ+之比。
收集所有组中小鼠的脾细胞和肝脏相关淋巴细胞(2.5×106个脾细胞和0.5×106LAL)，在存在CEP和APC时培养72小时。不同的实验组以G’、H’、I’、J’、K’和L’表示。流式细胞术分析显示与没有NK1.1-消除的耐受小鼠(K’组)相比，口服耐受诱导后NK 1.1-LAL消除降低了CD4+IL4+/CD4+IFNγ+之比(H’组)。与没有消除NK1.1-组(I’组)相比，NK1.1-消除对照组(L’组)的CD4+IL4+/CD4+IFNγ+之比降低。NK 1.1+淋巴细胞降低了患实验性结肠炎的不耐受小鼠的CD4+IL4+/CD4+IFNγ+之比。与没有NK1.1-消除的非耐受组(G’组)相比，NK 1.1-消除不耐受组(J’组)的CD4+IL4+/CD4+IFNγ+之比增加。缩写：EXP.GR.＝实验组，rat.＝比率。
图10：不同实验组的分离淋巴细胞上的IL4和IFNγ表达。
该附图显示检测IL4和IFNγ表达的流式细胞术分析的代表性结果。分别分析了IL4和IFNγ在耐受的NK 1.1没有消除和消除的小鼠与不耐受的NK 1.1没有消除和消除的小鼠的分离淋巴细胞中的表达。门控选出5×104小淋巴细胞后，数据以点图显示。点图下的数值表示染色细胞的百分比。显示了代表性的结果。实验组(EXP GR)。不同的实验组以G、H、I和J表示。缩写：EXP.GR.＝实验组，rat.＝比例。
图11：NK 1.1的肝脏淋巴细胞细胞毒性
在这些研究中使用E∶T之比为100∶1-10∶1的YAC-1细胞作为靶细胞。与其它组相比，不耐受没有-NK 1.1消除小鼠(H’组)的受试细胞显示几乎无裂解。G’组中不耐受的NK 1.1消除小鼠的受试细胞的裂解程度分别高于H’组。喂食CEP的NK1.1消除小鼠(I’组)的受试细胞的裂解程度低于J’组的没有NK 1.1消除的小鼠。分别与L’组相比，K’组小鼠和对照组小鼠的受试细胞具有23％与22.47％的细胞毒性。不同的实验组以G’、H’、I’、J’、K’和L’表示。缩写：EXP.GR.＝实验组。
图12：不同实验组中的细胞因子水平。
收集一式三份的两组上清液，检测所有耐受和不耐受组的所有小鼠的细胞因子水平。通过“夹心”ELISA检测IL4、IL10和IFNγ水平。耐受小鼠显示免疫应答细胞因子分泌从Th型1转向Th2型。这些小鼠(H组)显示IL4、IL10水平升高和IFNγ水平降低。相反，不耐受组(G、J、K组)和对照组I显示IFNγ水平高和IL10水平低。与耐受K组中的NK 1.1消除的小鼠相比，收集自H组的耐受小鼠的淋巴细胞显示较高的IL4、IL10水平和较低的IFNγ水平。相反，NK 1.1消除在无抗原存在时的G和J组不耐受小鼠中诱导IFNγ水平升高和IL4、IL10水平降低。不同的实验组以G、H、J和K表示。缩写：EXP.GR.＝实验组。IL4和IL10以黑色柱表示，IFNγ以白色柱表示。
图13：葡萄糖耐受时间曲线。
图14a：MRI脂肪含量(IP-OP)。
图14b：MRI SI指数(IP-OP/IP)。
图15a：过继转移组对伴刀豆球蛋白-A应答的AST水平。
图15b：过继转移组对伴刀豆球蛋白-A水平应答中的ALT。
图16：6组小鼠的平均葡萄糖耐受曲线。
图17a：平均MRI肝脏脂肪含量(SI指数)-野生型小鼠。
图17b：平均MRI肝脏脂肪含量(SI指数)-ob/ob小鼠。
图18a：野生型小鼠中的AST水平。
图18b：ob/ob小鼠中的AST水平。
图19：接种(Miu/ml)HBV疫苗(Miu/ml)后的平均抗-HBS滴度。
图20：NKT细胞移植对存活的作用。
图21：NKT细胞移植对外周CD4+/CD8+比例的作用。
图22：NKT细胞移植对肝脏CD4+/CD8+比例的作用。
图23：NKT细胞移植对血清IL12(pg/ml)的作用。
图24：NKT细胞移植对血清IL10(pg/ml)的作用。
发明详述
NK1.1T细胞涉及通过细胞因子分泌和/或杀伤而维持抗炎和促炎淋巴细胞之间的平衡，并且可能参与确定T辅助细胞的分化[Arase，H.等，Eur.J.Immunol.23：307-310(1993)；Yoshimoto，T.等，J.Exp.Med.179：1285-1295(1994)；MacDonald，H.R.等，J.Exp.Med.182：633-638(1995)；Seder，R.A.等，Annu.Rev.Immun.12：635-673(1994)；Yoshimoto，T.等，Science 270：1845-1847(1995)]。经鉴定，NK1.1T细胞的激活有多种信号传递途径。假定NK1.1+T细胞是不稳定极化的，经不同激发剂作用后，TCR整合(engagement)激发这些细胞分泌两种Th1和Th2细胞因子[Bendelac，A.等，Annu.Rev.Immunol.15：535-562(1997)；Arase，H.等，J.Immunol.151：546(1993)；Kawamura，T.等，J.Immunol.160：16-19(1998)；Chen，H.等，J.Immonol.，159：2240-2249(1997)；Arase，H.等，Eur.J.Immunol.23：307-310(1998)；Yoshimoto，T.，J.Exp.Med.179：1285-1295(1994)；MacDonald，H.R.，J.同前，(1995)]。NK1.1R或IL12R整合可选择性促进Th1分泌模式[Bendelac等，(1997)，同前；Arase，H.等，J.Exp.Med.183：2391-2396(1996)；Hayakawa，T.等，J.Exp.Med.176：269-274(1992)]。
如上所述，NK1.1+T细胞在免疫调节中具有复杂的作用。本发明所述的结果显示NK1.1T淋巴细胞在调节免疫介导的实验性结肠炎中具有双重作用。口服耐受诱导后NK1.1T细胞的消除阻止了耐受性的过继性转移，同时显著降低了CD4+细胞分泌的IL4和IFNγ之间的数量比。相反，消除不耐受小鼠的NK1.1T细胞缓解了结肠炎并显著提高了CD4+细胞分泌IL4和CD4-细胞分泌的IFNγ之间的数量比。
因此，在第一方面，本发明涉及治疗需要这种治疗的哺乳动物对象的免疫相关或免疫介导病症的方法。本发明的方法包括以合适的方式操纵对象NKT细胞群的步骤。对NKT细胞群的操纵可调节Th1/Th2细胞平衡使其转向产生抗炎或促炎细胞因子的细胞。应该强调免疫调节可下调或上调免疫应答。该调节作用可由该对象和其它对象的免疫系统的不同组分介导。这种组分是，例如细胞免疫反应元件、体液免疫反应元件和细胞因子。
在一优选的实施方案中，通过消除NKT细胞群来操纵该细胞群。消除NKT细胞群可通过例如给予对象以治疗有效量的组合物来进行，所述组合物含有能特异性识别NKT细胞的抗体作为有效成分。该特异性方法包括采用多克隆，以及优选单克隆抗体。
产生抗蛋白质的多克隆抗体描述于《当前免疫学方法》(Current Protocols inImmunology)，第二章，Wiley and Sons Inc。可将取自免疫动物，特别是大鼠或小鼠的脾脏或淋巴结B细胞在有利于杂交细胞生长的条件下与无限增殖的B细胞融合来制备单克隆抗体。就鼠B细胞的融合而言，优选Ag-8细胞系。产生单克隆抗体的技术描述于许多文章和教科书中，例如上述《当前免疫学方法》第二章。为产生如该书第二章所述的单克隆抗体，这些动物的脾脏或淋巴结细胞可以与蛋白质免疫动物的脾脏或淋巴结细胞相同的方式使用。用于产生单克隆抗体的技术还描述于Kohler和Milstein，Nature 256：495-497，(1975)和美国专利号4,376,110。
术语“抗体”包括完整的抗体分子及其片段，例如能结合抗原的Fab和F(ab’)2片段。Fab和F(ab’)2片段缺乏完整抗体的Fc片段，可更快从循环中清除并比完整的抗体具有更低的非特异性组织结合[Wahl等，J.Nucal.Med.24：316-325，(1983)]。应该理解的是，根据本发明公开的(制备)完整抗体分子的方法，本发明所用抗体的Fab和F(ab’)2以及其它片段可用于选择性消除NKT细胞。这种片段通常用酶，例如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab’)2片段)通过蛋白切割而产生。
如果某抗体能特异性与抗原(在该特定例子中是某特定细胞表达的胞外标记分子)反应，从而使该分子与抗体结合，则该抗体称为“能特异性识别”所述细胞。
“抗原”是能被抗体结合的分子或分子的一部分，抗原还能诱导动物产生能结合该抗原表位的抗体。抗原可具有一种或多种表位。术语“表位”指能被抗体结合也可被抗体所识别的任何分子的一部分。表位或“抗原决定簇”通常由分子的化学活性表面基团(例如氨基酸或糖侧链)组成，具有特定的三维结构特征以及特定的荷电特征。
或者，可通过离体除去法来消除NKT细胞群，该除去法采用包被能特异性识别NKT细胞的抗体的小珠。在除去过程中，抽取治疗对象的全血并立即分离为血浆、红细胞和白细胞。使用针对NKT细胞标记的特异性抗体消除白细胞群中的NKT细胞同时将其它血液成分输回治疗的对象。
NK1.1+细胞上的NK1.1分子作为受体可导致IFNγ产生而不产生IL4。[Arase，H.等，J.Exp.Med.183：2391-2396(1996)；Seder，R.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：10188-92(1993)]。用糖基磷脂酰肌醇锚定的蛋白或LPS配体刺激后，NK1.1T细胞变成IFNγ产生细胞，抑制Th2细胞的分化并抑制IgE应答[Cui，J.等，J.Exp.Med.190(N-6)：783-792(1999)]。NK1.1R-P1交联后，外源性IL2可增加IFNγ产生[Arase，H.等，(1996)，同前]。NK1.1+T细胞在经抗CD3体内刺激后立即通过大量分泌IL4来参与CD4+T细胞分化[γoshimoto，T.等，Science 270：1845-7(1995)]。CD1-限制的NK1.1T细胞群是抗-CD3-诱导的早期IL4暴发性释放所必需[Seder，R.A.，Ann.Rev.Imm.12：635-673(1994)]。细菌LPS显示可通过使库普弗细胞产生IL-12来激活NK1.1+细胞，进而诱导IFNγ产生[Ma，X.等，J.Exp.Med.183：147-157(1996)]。树突状细胞和NK和/或T淋巴细胞之间的细胞与细胞接触可导致细胞溶解活性和IFNγ产生的实质性增加[De-Moraes，L.等，Eur.J.Immunol.28：1507-1515(1998)]。IL18和白血球功能相关的抗原-1可能在NK1.1+T细胞的肝脏积累和它们的细胞毒性活性中有作用[Sakamoto，Y.等，J.Immunol.，103(5pt2)：445-51(1999)]。有人提出NK1.1+T细胞在抗原呈递中有作用，这可能是它们影响T细胞应答的另一途径[Seki.S.等，J.Immunol.V 147：1214-1221(1991)]。曾证明该亚型细胞具有高水平的自身杀伤作用[Crispe，N.等，Immun.Today 11：236-245(1996)；Kawamura，T.等，J.Immunol.160：16-19(1998)；Dohert，D.G.等，J.Hepatology 28：59A.(1998)]。LAL的Fas表达可导致激活的表达Fas的T细胞死亡[Dohert，D.G.等，(1998)，同前；Jonsson，J.R.等，Hepatology 26：269A(1997)；Doherty，D.G.等，Hepatology 26：445A(1997)]。因此，NK1.1T细胞在耐受的环境中除了分泌IL-4介导的抗炎细胞因子外，可能参与杀伤致敏的促炎细胞，而在非耐受环境中除了分泌IFNγ外，可能参与杀伤抗炎细胞。IL4和IL12均能提高NK1.1T细胞的细胞毒效力[Hashimoto，W.等，J.Immonol.154：4333-4340(1995)；Ballas，Z.K.等，J.Immonol.150：17-30(1993)]。发炎期间IL12/IFNγ环起到平衡免疫应答的作用[Ma等，(1996)，同前]。IL12能增加NK1.1+T细胞的IFNγ分泌以及细胞毒性活性和增殖[Cui等，(1999)，同前；Bendelac等，(1997)，同前；Arase等，(1996)，同前；De-Moraes等，(1998)，同前；Neurath，M.F.等，J.Exp.Med.，182：1281-1290(1995)]。
因此，作为其它优选的实施方案，本发明涉及治疗哺乳动物对象免疫相关或免疫介导病症的方法。该方法包括通过离体驯化的NKT细胞来操纵NKT细胞群，从而使得该驯化的NKT细胞能调节Th1/Th2平衡使之转向产生抗炎细胞因子的细胞，并将驯化细胞给予所述对象。这种调节可导致IL4和IL10之一与IFNγ的数量比(在整个说明书中也可称为CD4+IL4、IL10/CD4+IFNγ比例)增加。在免疫介导病症中，该比例根据疾病的严重性而降低，在恢复期可能升高。因此，应该理解的是IL4和IL10之一与IFNγ的数量比例的变化应该与治疗前的水平相关。
在还有另一个优选的实施方案中，本发明涉及治疗哺乳动物对象免疫相关或免疫介导病症的方法。该方法包括通过离体驯化NKT细胞来操纵该NKT细胞群，从而使驯化的NKT细胞能调节Th1/Th2平衡、使其转向产生促炎细胞因子的细胞并将所述驯化的细胞给予所述对象。这种调节可导致IL4和IL10之一与IFNγ的数量比(在整个说明书中也可称为CD4+IL4、IL10/CD4+IFNγ比例)降低。
术语“CD4+IL4”表示CD4+细胞产生的IL4，“CD4+IL10”表示CD4+细胞产生的IL10，“CD4+IFNγ”表示CD4+细胞产生的IFNγ。本发明使用的术语“CD4+IL4IL10/CD4+IFNγ比例”表示IL4和IL10之一(优选CD4+细胞产生的)和IFNγ(优选CD4+细胞产生的)之间的数量比。确定这些细胞因子每种的数量的定量检测如本文实施例(实验性方法)所述方法进行。
一个特别优选的实施方案涉及治疗哺乳动物对象免疫相关或免疫介导病症的方法。该治疗方法包括以下步骤：
a.获得所述对象或另一对象的NKT细胞；
b.离体驯化获得自步骤(a)的NKT细胞，从而使该驯化的NKT细胞能调节Th1/Th2细胞平衡转向抗炎或促炎细胞因子的细胞；和
c.将步骤(b)获得的驯化的NKT细胞重新引入所述对象。调节Th1/Th2平衡转向抗炎细胞因子产生细胞，导致IL4和IL10之一与IFNγ之间的数量比增加。调节Th1/Th2平衡转向促炎细胞因子产生细胞，导致IL4和IL10之一与IFNγ之间的数量比降低。
NKT细胞可通过上述细胞除去法得自骨髓、肝脏、脾脏或子宫，但也可得自外周血。
更具体地说，可通过在存在以下任何一种物质时培养NKT细胞来离体驯化这些细胞：
a.至少一种与待治疗的免疫相关或免疫介导病症相关的具有旁观表位的抗原，或它们的任何组合；
b.患有相同免疫病症的耐受或不耐受患者的或待治疗对象的至少一种肝脏相关细胞，或它们的任何组合；
c.至少一种细胞因子或粘附分子或它们的任何组合；和
d.以上(a)、(b)和(c)的任何组合。
应该理解的是NKT细胞也可通过任何上述方法进行体内驯化。可在接触同种异体表位或抗原之前或之后的任何时间点对它们进行调节。
在一个特定的实施方案中，通过在存在与待治疗的免疫相关或免疫介导病症相关的抗原时培养NKT细胞来离体驯化这些细胞。这些抗原可是取自患所述免疫相关或免疫介导病症的供体患者的同种异体抗原、异种抗原、自体抗原、重组方法制备的抗原或它们的任何组合。
相对于所述对象，这些抗原可是天然或非天然的。它们可以是天然或合成的、修饰的或未修饰的、完整的或其片段。片段可得自合成或通过消化或其它修饰方法从大抗原产生片段。这种抗原包括，但不限于：蛋白质、糖蛋白、酶、抗体、组织相容性决定簇、配体、受体、激素、细胞因子、细胞膜、细胞成分、病毒、病毒成分、病毒载体、非病毒载体、完整的细胞、组织或器官。抗原可由单个分子组成或是不同单个分子的混合物。抗原可存在于病毒表面、细胞表面、膜、基质、或与受体、配体、抗体或任何其它结合伙伴(partner)形成复合物或偶联。这种抗原可单独或与能促进摄取、稳定性、反应性或靶向的试剂一起引入该对象。
聚合与降解、分级与化学修饰均能改变特定抗原在潜在的免疫应答方面的性能。可分离或合成这些小区段、片段或表位。这种抗原的非限制性例子是机体提取物(例如在实施例7中用于离体驯化的CEP)产生的不同抗原的组合。
本发明的方法还包括重组制备的抗原。重组抗原的制备涉及使用本领域熟知的通用分子生物学技术。这种技术包括，例如将所需抗原克隆至合适的表达载体。
本文使用的“载体”包括能将DNA片段整合入宿主基因组的质粒、病毒、细菌噬菌体、可整合性DNA片段和其它载体。表达载体通常是含有所需基因或其片段的自我复制性DNA或RNA构建物，其末端操作性连接有能被合适的宿主细胞识别并引起所需基因表达的遗传调控元件。这些调控元件能在合适的宿主中引起表达。遗传调控元件通常含有原核启动子系统或真核启动子表达控制系统。所述系统一般包含转录启动子，能控制转录起始的任选的操纵子；能提高RNA表达水平的转录增强子；编码合适的核糖体结合位点的序列；RNA剪接接头；终止转录和翻译的序列等。表达载体通常含有能使该载体在宿主细胞中独立复制的复制起点。
载体还可含有合适的限制性位点、用于选择含有载体的细胞的抗生素抗性或其它标记。质粒是最常用的载体形式，但可提供相同功能和本领域已知的其它形式的载体也适用于本发明。参见，例如引作参考的，Pouwels等，《克隆载体：实验室手册》(Cloning Vectors：a Laboratory Manual)(1985和增刊)，Elsevier，N.Y.；Rodriquez等编，《载体：分子克隆载体的展望及其用途》(Vectors：a Survey ofMolecular Cloning Vectors and their Uses)，Buttersworth，Boston，Mass，(1988)。
近来有人提出肝脏是T细胞破坏的主要部位并且在自身免疫小鼠Ipr/Ipr的肝脏中，该过程失效而导致T细胞从肝脏向外周淋巴组织渗出[Crispe，N.等，Immunol.Review，174：47-62(2000)]。证明肝脏在T细胞分化中起作用。可通过将CD-4-8TCRβ无胸腺裸鼠骨髓细胞与肝脏实质细胞一起培养从产生CD3-CD4+/CD8+TCRβ细胞和CD3-4-TCRβ+细胞[Mabuchi，A.等，J.LeukocyteBiology，63：575-583(1998)]。因此，在另一特定的实施方案中，离体驯化NKT细胞可通过在存在肝脏相关细胞时培养这些细胞来进行。这些细胞可以是，例如库普弗细胞、星形细胞、肝脏内皮细胞、肝脏相关干细胞或任何其它肝脏相关淋巴细胞。
本发明也考虑了在存在外周淋巴细胞时共同培养NKT细胞，所述淋巴细胞是患相同免疫相关或免疫介导病症的耐受或不耐受患者的或受治疗对象的。为从对象，特别是人患者获得淋巴细胞，抽取患者的血通过细胞除去法得到大量白细胞同时将其它血液成分输回该对象。
如实施例7所述，可将NKT细胞与CD4或CD8细胞共同培养来离体驯化NKT细胞。这些细胞优选得自耐受对象(接受CEP作为口服耐受小鼠)。
在另一个特定的实施方案中，在存在细胞因子，例如IL4、IL10、TGF、IFNγ、IL12和IL15时，或在存在粘附分子，例如整联蛋白、选凝素和ICAM时培养细胞来离体驯化NKT细胞。
虽然IL12诱导NK1.1T细胞产生IFNγ，IFNγ可反过来对其调节[Ma等，(1996)，同前]。NK1.1+细胞消除后，患急性GVHD小鼠的胸腺细胞的溶解细胞活性显著降低[Neurath等，(1995)，同前]。患急性GVHD的小鼠胸腺中的NK1.1+T细胞增加前，胸腺中IL12产生短暂上升[Neurath等，(1995)，同前]。据报道，IL12在患急性GVHD小鼠的胸腺中诱导NK1.1T细胞增加[Onoe，Y.等，Immunology 95：248-256(1998)]。近来，抗IL12抗体显示可提高转基因动物的口服耐受性，这与TGFβ分泌增加相关[Marth，T.等，J.Immunol.157：2348-2357(1996)]。IL12和TNFα均显示在实验性结肠炎的免疫发病机理中起重要作用[Bragger，M.S.H.等，Gut 34：1705(1998)；Parronchi，P.等，Am.J.Pathol.150：823(1997)]。单核细胞/巨噬细胞产生的IL2是维持TNBS诱导的结肠炎所必需并且是Th1介导的炎性应答所需[Kuhn，R.等，Cell 75：263-274，(1993)；Sellon，R.K.等，Immun.66：5224-5231(1998)；Neurath等，(1995)，同前；Marth，T.等，J.Immunol.157：2348-2357(1996)]。
IL12的抗体可消除慢性TNBS诱导的结肠炎[Neurath等，(1995)，同前]。因此，IL12可能在NK1.1+T细胞激活所致的疾病发病机理中起主要作用。在不耐受小鼠中，该亚组淋巴细胞的激活可能诱导IFNγ分泌，然后发生Th1免疫转变[Arase等，(1996)，同前；Bleicher，P.A.等，Science 250：679-682(1990)；Kitamura，H.等，J.Exp.Med.189：1121-1127(1999)]。
在实验性结肠炎中，NK1.1T细胞在存在IL12时是有效的IFNγ产生细胞[Cui等，(1999)，同前；Bendelac等，(1997)，同前；Arase等，(1996)，同前；De-Moraes等，(1998)，同前]。本发明的结果表明IFNγ在NK1.1R所致的炎性状态时由NK1.1T细胞分泌，其分泌独立于IL12途径。然后IFNγ可刺激IL12产生，IL12通过IL12R诱导IFNγ分泌。相反，在抗炎耐受状态时，NK1.1T细胞由于IL4分泌增加而激活。实际上，淋巴细胞从不耐受的NK1.1-消除小鼠的过继转移上调了抗炎Th2细胞因子。不同的刺激可能决定细胞因子应答的类型。
因此，趋化因子或其它介质可能决定了NK1.1+T细胞的功能以及它们影响不同免疫性环境中Th1/Th2模式的方式。
在一个特别优选的实施方案中，可将上述离体驯化的NKT细胞可重新输入受治疗的对象。这可通过称为过继转移的方法进行。用于转移的特定驯化NKT细胞优选来源于对象(自体转移)。也不排除同系或非同系供体(非自体转移)。转移细胞的保存、生长或扩增可在体内、离体或体外进行。
转移前细胞的体外保存、生长或扩增方法是本领域从业人员所熟知的。当用于转移的驯化NKT细胞来源于供体，这些细胞也可如上所述在体内或体外进行保存、生长或扩增。
细胞治疗可通过注射，例如静脉内或通过任何上文所述的方法进行。给予时间或方式不限制本发明。考虑到以下因素，例如驯化细胞可能的细胞毒性、疾病的阶段和患者的状况等本领域技术人员已知的其它考虑事项，不难调整细胞治疗方案。
本发明的方法还可任选包括在受治疗对象中诱发上调或下调对免疫相关或免疫介导病症的免疫应答的步骤。下调应答可通过给予所述对象患有所述免疫相关或免疫介导病症的同种异体供体、异种来源、自体来源的组分、细胞、组织或器官、或免疫性等价物或它们的任何组合来实现。
本发明提供给予非天然活性化合物而不会引起可能减少这种治疗有效性的免疫应答风险的方法，无论这种治疗是暂时的还是可长期反复进行。因此，本发明提供这些非天然活性化合物的有效的生物学功能而不会干扰机体的免疫应答。这可通过使用本发明提供的用作暂时或短期治疗的通用免疫抑制的免疫调节和/或通过调节长期治疗的免疫应答而调节提供的耐受来实现。在一些情况中，联用两种或多种免疫调节方案可是有利的。这种治疗可在非天然活性化合物给药之前和/或给药期间应用。
在一个特别优选的实施方案中，所述组分、细胞、组织或器官可以单一剂量或多剂量给予。这些组分、细胞、组织或器官可以一种给药途径或至少两种不同的给药途径给予。
这些组分可直接给予待治疗对象，或者取决于化合物的大小，可能需要在将它们与运载体相偶联后给予。治疗性制剂可以常规的剂量制剂给药。制剂通常含有上述至少一种活性成分与其一种或多种可接受的运载体。
在与其它成分相容并且不伤害患者的意义上，每种运载体应该同时是药学上和生理上可接受的。制剂包括适合于口服、直肠、鼻或胃肠外(包括皮下、肌肉内、静脉内和真皮内)给药的制剂。制剂可以单位剂量形式方便地提供并且可用药学领域熟知的任何方法制备。所有这种化合物的性质、可利用性和来源，包括在对象中产生所需作用的有效量是本领域熟知的，本文无需进一步描述。
特别是，所述组分、细胞、组织或器官可通过以下途径给药：口服、静脉内、胃肠外、经皮、皮下、阴道内、鼻内、粘膜、舌下、局部和直肠给药以及它们的任何组合。这些组分、细胞、组织或器官优选作为口服耐受经口服给予。
本发明方法的另一个优选的实施方案涉及治疗炎性肠病(IBD)，特别是克罗恩病。对哺乳动物，特别是人患者的克罗恩病的治疗包括：
a.获得所述对象的NKT细胞；
b.离体驯化获得自步骤(a)的NKT细胞，从而使驯化的NKT细胞能调节Th1/Th2细胞平衡转向抗炎或促炎细胞因子的细胞；和
c.将步骤(b)获得的驯化的NKT细胞重新输入所述对象。调节Th1/Th2平衡转向产生抗炎细胞因子的细胞可导致IL4和IL10之一与IFNγ之间的数量比增加。
虽然本发明的方法特别设计用于治疗人的免疫相关或免疫介导病症，但也包括治疗其它哺乳动物。哺乳动物对象的非限制性例子包括猴子、马、牛、犬、猫、小鼠、大鼠和猪。
为治疗人患者，本发明的离体驯化方法可利用表达CD56标记的特定亚型的NKT细胞。就小鼠而言，本发明的离体驯化方法可利用NK1.1+T细胞的特定亚型。本发明的实施例公开了使用小鼠模型的NK1.1+T细胞实验。应该理解的是这些结果也适用于人体中表达CD56标记的NKT细胞。可通过在存在以下任何一种物质时培养本发明表达CD56标记的NKT细胞来离体驯化这些细胞：
a.至少一种与克罗恩病相关的抗原；这些抗原包括，但不限于来自患克罗恩病的供体的同种异体抗原、异种抗原、患者本身的自体抗原和重组方法制备的抗原，或它们的任何组合；
b.患有克罗恩病的耐受或不耐受患者的或受治疗患者的至少一种肝脏相关细胞，这些细胞包括，但不限于库普弗细胞、星形细胞、肝脏内皮细胞、肝脏相关干细胞或任何其它肝脏相关淋巴细胞，或它们的任何组合；
c.至少一种细胞因子，例如IL4、IL10、TGF、IFNγ、IL12和IL15或粘附分子，例如整联蛋白、选凝素和SCAM，或它们的任何组合；和
d.以上(a)、(b)和(c)的任何组合。
本发明方法的驯化NKT细胞可经过继转移重新输入受治疗对象。
本发明的方法还可任选包括在受治疗对象中诱发上调或下调对免疫相关或免疫介导病症的免疫应答步骤。可通过给予对象以提取自患克罗恩病的对象的发炎的肠或受治疗对象的发炎的肠的蛋白质成分来诱导下调应答。
所述组分可以是细胞、组织、器官或它们的一部分，这些组分可以单剂量或多剂量给予。这些组分可经一种给药途径或至少两种不同的给药途径给药。具体说，所述组分可通过以下途径给药：口服、静脉内、胃肠外、经皮、皮下、阴道内、鼻内、粘膜、舌下、局部和直肠给药以及它们的任何组合。这些组分优选如实施例中所述作为口服耐受(CEP的口服诱导)经口服给药。
在另一个特别优选的实施方案中，本发明的方法可用于治疗恶性肿瘤。在癌症情况中，可按照诱导促炎应答或提高抗肿瘤相关抗原免疫力的方向调节NKT细胞。如本文所述，本发明的“癌症”、“肿瘤”和“恶性肿瘤”均同等地涉及组织或器官的过度增殖，如果所述组织是淋巴或免疫系统的一部分，恶性肿瘤细胞可包括循环细胞的非实体肿瘤。其它组织或器官的恶性肿瘤可产生实体肿瘤。总体上，本发明的方法和组合物可用于治疗非实体和实体肿瘤。
本发明考虑的恶性肿瘤可选自黑色素瘤、癌症、淋巴瘤和肉瘤。可用本发明治疗的恶性肿瘤包括，但不限于：血液恶性肿瘤(包括白血病、淋巴瘤和骨髓增殖性疾病)、再生不良性和再生障碍性贫血(病毒诱导的和自发的)、骨髓发育异常综合征、所有类型的肿瘤相关综合症(免疫介导的和自发的)和实体肿瘤，(包括肺、肝、乳腺、结肠、前列腺G1道、胰腺和卡波西肉瘤)。
为治疗患癌症的哺乳动物对象，本发明的方法使用驯化的NKT细胞可以各种方式给予。试举一非限制性例子，驯化的细胞可经静脉内递送，或递送入接近实体肿瘤位置的体腔，例如腹膜内腔，或直接注射入实体肿瘤或至其相邻区域。
本发明还提供驯化NKT细胞的方法。该驯化方法可通过在存在以下任何一种物质时培养这些细胞来进行：
a.至少一种与待治疗的免疫相关或免疫介导病症相关的具有旁观表位的抗原，或它们的任何组合；
b.患有相同免疫病症的耐受或不耐受患者的或待治疗对象的至少一种肝脏相关细胞，或它们的任何组合；
c.至少一种细胞因子或粘附分子或它们的任何组合；和
d.以上(a)、(b)和(c)的任何组合。
本发明的方法可与其它用于治疗癌症的疗法联用。也期望该治疗方法可给予因疾病已处于免疫抑制状态的哺乳动物对象。本领域的技术人员易于确定对人或患病动物免疫状态的评价。
本发明的第二方面涉及用于治疗哺乳动物对象免疫相关或免疫介导病症的治疗性组合物。本发明的组合物含有能调节Th1/Th2平衡转向产生抗炎细胞因子的细胞的离体驯化的自体NKT细胞作为活性成分。这些驯化的自体NKT细胞介导IL4和IL10之一与IFNγ之间数量比的增加。
本发明的组合物还可含有药学上可接受的运载体、添加剂、稀释剂或赋形剂。合适的运载体包括，例如盐水、磷酸缓冲盐水和含有5％HAS或PPF的盐水。其它合适的运载体是本领域普通技术人员熟知的并且不限制本发明。类似地，本领域的技术人员易于选择可加入本发明药物组合物的其它所需组分，这种组分不限制本发明。
在一个优选的实施方案中，本发明治疗性组合物中驯化的自体NKT细胞在存在以下任何一种物质时离体培养：
a.至少一种与待治疗的免疫相关或免疫介导病症相关的抗原；这些抗原可以是患相同免疫相关或免疫介导病症供体的同种异体抗原、异种抗原、来自受治疗患者的自体抗原和重组方法制备的抗原中的任何一种，或它们的任何组合；
b.患所述免疫相关或免疫介导病症的耐受或不耐受患者的或受治疗患者的至少一种肝脏相关细胞；这些细胞包括，但不限于库普弗细胞、星形细胞、肝脏内皮细胞和任何其它肝脏相关淋巴细胞，或它们的任何组合；
c.至少一种细胞因子，例如IL4、IL10、TGF、IFNγ、IL12和IL15或粘附分子，例如整联蛋白、选凝素和SCAM，或它们的任何组合；和
d.以上(a)、(b)和(c)的任何组合。
在一个优选的实施方案中，本发明的治疗性组合物可用于治疗哺乳动物对象的肠道炎性疾病，更具体地说用于治疗克罗恩病。该组合物含有驯化的自体NKT细胞作为有效成分，该NKT细胞能调节Th1/Th2平衡转向产生抗炎细胞因子的细胞。
本发明治疗性组合物中所含的驯化自体NKT细胞能调节Th1/Th2平衡并使之转向产生抗炎细胞因子的细胞。该平衡的改变导致CD4+IL4+/CD4+IFNγ比例(IL4和IL10之一与IFNγ之间的数量比)增加。这些调节过程还受到该对象免疫系统的不同组分，例如细胞免疫反应元件、体液免疫反应元件和细胞因子的介导。
优选按照上述方法驯化该组合物中含有的自体NKT细胞。
在另一个优选的实施方案中，本发明的治疗性组合物可用于治疗恶性肿瘤，例如黑色素瘤、癌症、淋巴瘤和/或肉瘤。在癌症情况中，可以向诱导促炎应答或提高抗肿瘤相关抗原免疫力的方向调节该组合物中所含的NKT细胞。
在还有另一个优选的实施方案中，本发明涉及用于治疗免疫相关或免疫介导病症的治疗性组合物。该组合物含有能特异性识别NKT细胞的抗体作为有效成分。本发明的组合物还可含有药学上可接受的运载体。合适的运载体包括，例如盐水、磷酸缓冲盐水和含有5％HAS或PPF的盐水。其它合适的运载体是本领域普通技术人员熟知的并且不限制本发明。类似地，本领域的技术人员易于选择可加入本发明药物组合物的其它所需组分，这种组分不限制本发明。
在一个实施方案中，本发明的治疗性组合物可用于治疗肠道炎性疾病，例如克罗恩病。就治疗肠道炎性疾病，特别是克罗恩病而言，口服药物组合物可能是有利的。口服给药可缓解患者的症状，而无需全身性免疫抑制或侵入性方法。
在另一个实施方案中，本发明的治疗性组合物可用于治疗选自黑色素瘤、癌症、淋巴瘤和/或肉瘤的恶性肿瘤。
组合物的剂量可是足够调节Th1/Th1平衡的任何量。本领域的技术人员应该理解的是优选的剂量可按照良好实验室规程和标准医学实践为每位患者个别确定。
本文使用的“足够调节Th1/Th1平衡的量”表示实现所选择结果的所需量。例如，本发明组合物的有效量可调节Th1/Th2平衡转向产生抗炎细胞因子的细胞。
本发明的组合物和方法还可治疗自身免疫疾病，例如胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)。
本发明的组合物可以各种方式给予。试举一非限制性例子，该组合物可静脉内递送。
适合注射使用的药学剂型包括无菌水溶液或分散液和可用于临时配制无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况中，此剂型必须无菌并且必须可配制成易于注射的流体。在制备和保存条件下必须稳定并且能预防微生物，例如细菌和真菌的污染。
防止微生物的作用可采用各种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、柳汞等实现。在许多情况中，优选含有等渗剂，例如糖或氯化钠。延长可注射组合物的吸收可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如一硬脂酸铝和明胶来实现。
无菌可注射溶液可通过将所需量的活性化合物与以上列举的各种其它成分加入合适的溶剂中来制备，如果需要，然后可过滤除菌。分散液一般通过将各种灭菌的活性成分加入含有基础分散液介质和上述的其它所需成分的无菌运载体来制备。
就用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，优选的制备方法是真空和冷冻干燥技术，该技术产生活性成分的粉末和其过滤除菌溶液的其它所需成分。
本发明的药物组合物一般含有调节其等渗性的缓冲剂，和任选含有本领域已知的一种或多种药学上可接受的运载体、赋形剂和/或添加剂。添加的活性成分也可加入组合物。运载体可是溶剂或含有水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)的分散介质、它们合适的混合物和植物油。例如可通过使用包衣(如卵磷脂)维持分散液中所需颗粒的大小和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。
本文使用的“药学上可接受的运载体”包括任何与所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂等。对于药学活性物质采用这些介质和试剂本领域熟知的。除非有的常规介质或试剂与活性成分不相容，其在治疗性组合物中的使用可以考虑。
本发明的第三方面涉及驯化的自体NKT细胞在制备治疗性药物组合物中的用途，所述组合物用于在患免疫相关或免疫介导病症哺乳动物对象中调节Th1/Th2细胞平衡转向产生抗炎细胞因子的细胞。优选的用途是制备治疗哺乳动物对象肠道炎性疾病，特别是人患者的克罗恩病的组合物。或者，驯化的自体NKT细胞可用于制备治疗恶性肿瘤，例如黑色素瘤、癌症、淋巴瘤和肉瘤的治疗性药物组合物。在癌症情况中，可以向诱导促炎应答或提高抗肿瘤相关抗原免疫力的有利方向调节本发明的NKT细胞。
本发明还提供离体驯化的自体NKT细胞。驯化的NKT细胞在存在以下任何一种物质时离体培养：
a.至少一种与所述免疫相关或免疫介导病症相关的抗原，或它们的任何组合；
b.患所述免疫相关或免疫介导病症的耐受或不耐受患者的或来自所述对象的至少一种肝脏相关细胞，或它们的任何组合；
c.至少一种细胞因子或粘附分子；和
d.以上(a)、(b)和(c)的任何组合。
本发明还提供用于治疗需要这种治疗的哺乳动物对象的免疫相关或免疫介导病症的本发明离体驯化自体NKT细胞。
在该方面的另一个实施方案中，本发明涉及采用离体驯化的自体NKT细胞来治疗需要这种治疗的哺乳动物对象免疫相关或免疫介导病症。
在还有的另一个优选实施方案中，本发明涉及能特异性识别NKT细胞的抗体在制备治疗性药物组合物中的用途，所述组合物可用于调节患免疫相关或免疫介导病症哺乳动物对象中的NKT细胞群。特别是，消除所述对象中的所述NKT细胞群。应该理解的是NKT细胞群的消除可导致调节Th1/Th2平衡转向可取的产生抗炎细胞因子的细胞。抗体特别可用于制备治疗性药物组合物，所述组合物可用于治疗哺乳动物对象免疫相关或免疫介导病症，特别是肠道炎性疾病，例如人患者的克罗恩病。
在另一个特定的实施方案中，免疫相关或免疫介导病症可以是恶性肿瘤，例如黑色素瘤、癌症、淋巴瘤和肉瘤。
免疫系统在非酒精性脂肪性肝炎发病机理中的作用
非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是没有饮酒史患者因肝脏脂肪积累、发炎和纤维化而形成的临床病理学疾病。20％的病例可发展为肝硬化并且认为它是西方世界隐发性肝硬化的最常见病因(Caldwell SH等，Hepatology 29：664(1999)；Matteoni CA等，Gastroenterology 116：1413(1999))。NASH在患有其它代谢紊乱的患者中常见，已提出这些紊乱对该疾病的发病具有作用。这些紊乱包括胰岛素抗性(Sanyal AJ等，Gastroenterology 120：1183(2001))、肥胖相关的ATP消除(Cortez-Pinto H等，Jama282：1659(1999))、游离脂肪酸β过氧化增加(Hruszkewycz AM，Biochem Biophys ResCommun 153：191(1988))、铁积累(George DK等，gastroenterology 114：311(1998))、抗氧化物耗尽(Harrison SA等，gastroenterology 123：M1332(2002))和瘦蛋白缺乏(Cohen B等，Science 274：1185(1996))。如果不作治疗干预，采用包括降低体重、严格的糖尿病控制、脂质水平正常化和抗氧化剂治疗，这些措施常能使该疾病的自然进程发生改变(Angulo P，New England Journal ofMedicine 346：1221-1231(2002))。
有关NASH的大多数信息得自两种哺乳动物模型：瘦蛋白缺乏的ob/ob小鼠和瘦蛋白受体缺乏fa/fa Zucker大鼠。瘦蛋白是参与体重调节的一种蛋白质(Zhang Y等，Nature 372：425-432(1994))。其在啮齿类动物和人中的缺乏将导致病态肥胖、葡萄糖耐受不良症、高脂血症和严重的肝脂肪变性(Pelleymounter MA等，Science269：540-543(1995)构成严重的代谢综合征(以前称为综合征X)。然而，如上所述，还没有能纠正这种代谢紊乱的干预(治疗)方法可缓解脂肪肝、纤维化和炎症。
近来的证据表明免疫系统在瘦蛋白缺乏模型的NASH发病机理中可能具有关键性作用。在瘦蛋白缺乏小鼠中，脂多糖诱导肝脏损伤后观察到肝脏缺少巨噬细胞(库普弗细胞)应答(Diehl AM，J Physiol Gastrointest liver Physiol 282：G1-G5(2002))。在相似的模型中，LPS诱生的IL6大大提高，而IL10受到抑制(Loffreda S等，FASEBJ12：57-65(1998))。观察到ob/ob小鼠的肝脏巨噬细胞在对LPS攻击的应答中比对照小鼠产生更多IL12和较少的IL15，这可解释这些小鼠中观察到的NKT淋巴细胞的数量和功能的显著降低(Yang等，Proc Natl Acad Sci USA 94：2557-2562(1997))。其它观察结果显示瘦蛋白缺乏ob/ob小鼠的血液和肝脏中CD4T淋巴细胞数量减少(Howard JK等，J Clin Invest 104：1051-1059(1999)和Lord等，Nature394：897-901(1998))。这可解释瘦蛋白缺乏小鼠对由CD4T淋巴细胞介导的伴刀豆球蛋白A肝炎的相对抗性(Faggioni R等，Proc Natl Acad Sci USA 97：2367-2372(2000))。
非酒精性脂肪性肝炎中的Th1/Th2失衡
CD4和CD6淋巴细胞可分类为产生IL-2和IFNγ的Th1细胞或产生IL-4和IL-10的Th2细胞。免疫系统通过改变这两类亚型应答之间的平衡对外来和自身抗原产生应答[Weiner，H.L.等，Immunol.Today 18：335-343(1997)；Adorini，L.等，Immunol.Today 18：209-211(1997)]。Th1型应答通常导致促炎反应[Adorini，L.等，(1997)，同前；Mizoguchi，A.等，J.Exp.Med.183：847-856(1996)]，而抗炎细胞因子，例如IL10将平衡转向抗炎Th2反应，从而缓解免疫介导病症[Mizoguchi，A.等，(1996)，同前；Madsen，K.L.等，Gastroenterology 113：151-159(1997)；Van DeventerSander，J.等，Gastroenterology 113：383-389(1997)]。据信，在对不同的内源性和外源性刺激的应答中，NKT细胞在将免疫系统引向Th1或Th2型途径中起主要作用。
已证明瘦蛋白在Th1和Th2应答之间平衡的免疫调节中起主要作用(Lord GM等，Nature 394：897-901(1998))。在瘦蛋白缺乏的ob/ob小鼠NASH模型中，NKT细胞的数量和功能的改变表明免疫系统向Th1应答倾斜。提出这种倾斜导致了对LPS诱导肝毒性的敏感性增加和对伴刀豆球蛋白A的肝毒性作用的独特抗性。区别可能在于它们的发病机理不同。前者取决于先天肝脏免疫系统的作用，该系统在瘦蛋白缺乏小鼠中过度活跃，而后者取决于NKT-淋巴细胞的激活，这些淋巴细胞在瘦蛋白缺乏小鼠中受抑制和缺乏(Faggioni R等，PNAS 97：2367-2372(2000)；Zhiping LI等，Gastroenterology 123：1304-1310(2002))。
免疫系统和肥胖症
免疫系统和脂肪组织代谢的调节看来是紧密相互联系的。脂肪组织中高达50％的细胞由非脂肪细胞组成，包括许多免疫细胞(Montague CT等，Diabetes47：1384-91(1998))。大多数研究致力于病态肥胖症的免疫性后果。已知在肥胖动物和人中存在有免疫性改变，包括DTH和有丝分裂原刺激的淋巴细胞增殖应答降低(Chandra RK等，Acta paediatr Scand 69：25-30(1980))、巨噬细胞数量和功能受损(Krishnan EC等，J Surg Res 33：89-97(1982))、胰岛素诱导的淋巴细胞细胞毒性减弱(Koffler M等，Diabetes 40：364-360(1991))和CD4/CD8比例改变，特别是在试图减轻体重期间(Field CJ等，Am J Clin Nutr 54：123-129(1991))。
脂肪细胞已知能分泌促炎细胞因子，包括TNF-α(Hotamisligil GS等，Science259：87-91(1993))和IL6(Purohit A等，Journal of Clinical Endocrinology andMetabolism 80：3052-58(1995))，二者与肥胖程度相关(Hotamisligil GS等，Journal ofInternal Medicine 245：621-625(1999))。认为这种细胞因子中的一些具有代谢作用，例如TNF-α可介导胰岛素抗性(Ogawa H等，Biochimica et biophysica acta1003：131-135(1989))和IL6可介导脂蛋白酯酶抑制(Feingold等，Diabetes41：97s-101s(1992))。TNF-α敲除小鼠比其正常的同窝幼鼠具有较高的胰岛素敏感性和改善的脂质分布(Uysal等，Nature 389：610-614(1997))。脂肪细胞产生的免疫系统的其它组分包括蛋白质脂肪细胞蛋白酶，该物质是整个补体旁路系统(alternativecomplement system)的一部分，其功能与人补体因子D相同(Rosen BS等，Science244：1483-7(1989))。
关于免疫系统作为肥胖症中介体的作用的信息知之甚少，但几项近来的研究表明免疫系统在肥胖症发展中可能具有重要促进作用。已知几种细胞因子具有脂肪组织调节剂的作用。TNF-α能抑制脂肪细胞上参与交感神经介导的脂类分解的β3腺苷受体的表达，而IL1能刺激脂肪瘦蛋白分泌(Sarraf等，Journal ofexperimentalmedicine 185：171-175(1997))。观察到脂肪细胞的代谢活性速率通过部分由IL4、IL6和TNF-α介导的机制(Mattacks CA等，Cytokine 11：334-346(1999))与其最近的淋巴结的距离密切相关(Pond CM等，Proceedings of the nutrition society 60：365-374(2001))。
这些观察结果指出肥胖动物和人也可能受到免疫系统不同分支各种改变的影响，这表明调节免疫系统可能改变一些造成病态肥胖症发展的发病机理。
免疫系统在移植物抗宿主疾病发病机理中的作用
移植物抗宿主疾病(GVHD)是获得成功的骨髓移植的主要障碍。GVHD是在干细胞移植(SCT)后发生的多器官疾病[Ferrara JLM，Deeg HJ，“移植物抗宿主疾病”(Graft versus host disease)，New Eng J of Med 1991；324：667-72]。其发病机理涉及对导致组织破坏的同种异体反应性抗原的识别和T细胞与其它免疫活性效应细胞的激活[Vogelsang GB，“移植物抗宿主疾病：用于预防和治疗的基础免疫学的含义”(Graft versust host disease：Implications from basic immunology for prophylaxisandtreatment)，Cancer Treat and Res 1997；77：87-97]。GVHD中涉及肝脏是由于移植的供体淋巴细胞对受者胆管免疫攻击所致。
几项研究显示调节性T细胞亚组在GVHD中的重要性。例如，近来输注CD4+CD25+调节T细胞显示降低GVHD致死率[Taylor PA，Lees CJ，Blazar B，“输注离体激活和扩增的CD4+CD25+免疫调节细胞降低移植物抗宿主病的致死率”(The infusion of ex-vivo activated and expanded CD4+CD25+immune regulatorcells inhibits graft-versus-host-disease lethality)，Blood 2002；99：3493-99]。NKT细胞是具有重要免疫调节作用的调节性T淋巴细胞的独特亚组。这些细胞已显示在各种免疫介导病症，包括各种感染、炎症和肿瘤过程中有至关重要的作用。NKT细胞通过分泌不同的细胞因子(即，IFNγ或IL-4)或通过激活不同的免疫细胞亚组[Godfrey DJ，Hammond KJ，Poulon LD，Smyth MJ，Baxter AG，“NKT细胞：事实、功能和谬误”(NKT cells：facts，functions and fallacies)，Imunol Today 200，21：573-83]参与Th1和Th2型免疫力。近来，我们发现NKT细胞分别在结肠炎[TropS.Ilan Y.“NK1.1+T细胞：一种在IL4/IFN模式的免疫调节中的双面淋巴细胞？”(NK1.1+Tcell：A two-faced lymphocyte in immune modulation of the IL4/IFNparadigm？)，J ofClinical Immunology，22：270-80，2002]和肝癌[Shibolet O，Alper R，Zlotogarov L，Thalenfeld B，Engelhardt D，Rabanni E，llan Y.“NKT和CD8淋巴细胞通过肿瘤抗原脉冲的树突状细胞介导了对肝细胞瘤生长的抑制”(NKT andCD8 lymphocytes mediate suppression of hepatocellular carcinoma growth via tumorantigen-pulsed dendritic cells)，Int J Cancer.20；106：236-43，2003]小鼠模型的口服免疫调节诱导的抗炎和抗肿瘤作用中具有关键作用。先前研究表明NKT细胞在急性和慢性GVHD中具有作用。例如，证明NK1.1阳性T细胞亚组能抑制GVHD，而NK1.1阴性T细胞可加重GVHD，该作用与细胞因子差别产生相关[Zeng D，Lewis D，Dejbakhsh-Jones S，Lan F，Garcia-Ojeda M，Sibley R，Strober S，“骨髓NK1.1-和NK1.1+T细胞交互调节急性移植物抗宿主疾病”(Bone marrowNK1.1-and NK 1.1+Tcells reciprocally regulate acute graft versus host disease)，J Exp Mes1999；189：1073-81]。
急性GVHD是同种异体SCT后的主要并发症，即使采用先进的移植方法，包括移植、低强度条件化后(psot low intensity conditioning)或非骨髓消融(myeloablative)方案时也一直是SCT获得成功的主要障碍。用于研究急性GVHD的一种实验模型是半同种异体C57BL/6到(C57BL/6×Balb/c)F1小鼠模型，其中将C57BL/6供体小鼠的2×107个脾细胞输注入(C57BL/6×Balb/c)F1受者小鼠可产生GVHD，该受者小鼠在移植前接受7Gy60Co全体辐射(TBI)[Nagler A，Ohana M，Alper R，Doviner V，Sherman Y，Rabbani E，Englhardt D和Ilan Y，“骨髓移植受者口服耐受的诱导可抑制半同种异体小鼠模型中的移植物抗宿主疾病”(Induction of oral tolerance in bone marrow transplantation recipients suppresses graftversus host disease in a semiallogeneic mouse model)，Bone Marrow Transplantation，2003，(出版中)]。近来，我们发现该模型中通过在移植前用受者脾细胞喂食供体进行的口服免疫调节缓解了急性GVHD，其表现为体外同种异体反应受抑制、存活改善、靶器官中淋巴细胞渗出和其它典型的组织病理学GVHD表现减少。
应该理解的是本发明不受限于本文所公开和描述的具体实施例、方法步骤和组合物，因为这些方法、步骤和组合物有时可不同。由于本发明的范围仅受附加的权利要求及其等价要求的限制，本文所用术语目的也应该理解为仅是描述具体实施方案而非限制。
必须注意的是，除非另有明确指出，本说明书和附加的权利要求中所用的单数形式“一个”和“该”包括复数形式。
除非文中另有要求，本说明书与以下的实施例和权利要求中的用词“含有”及其变体“包含”和“包括”应理解为包括所述的整数或步骤，或一组整数或步骤，但不排除任何其它整数或步骤或一组整数或步骤。
以下实施例是本发明人实施本发明各方面内容所采用的代表性技术。应该理解的是尽管这些技术是实施本发明的示范性优选实施方案，但本领域技术人员应了解根据本发明内容可做出许多改进，但这不脱离本发明的构思和所规定的范围。
实施例
I.
材料与方法
动物
正常生育的2-4月龄C57BL雄性小鼠得自Harlan并供养在Hadassah-Hebrew大学医学院的动物中心。小鼠以标准实验室食物供养并保持在白天/夜晚各12小时周期。
诱导结肠炎
通过直肠滴注(1mg/小鼠)上述溶解于100ml50％乙醇中的TNBS来诱导TNBS-结肠炎。[Collins，C.等，Eur.J.Immunol.26：3114-3118(1996)]。
口服抗原的制备和给药
切取TNBS-诱导结肠炎小鼠的结肠，切成小条带并机械匀浆。经40毫米尼龙细胞粗滤器过滤后，离心沉降得到完整的细胞。采用蛋白质测定试剂盒(Biorad，慕尼黑，德国)定量测定蛋白质。用补料无创伤针头每隔一天将结肠炎提取的蛋白(CEP)喂给下述实验组的动物，共11天(总共5次剂量)。
NK1.1细胞消除
用前述的小鼠抗小鼠NK1.1单克隆抗体(Serotec，Oxford，UK)来消除NK1.1+细胞[Kawamura，T.等，J.Immunol.160：16-19(1998)]。给小鼠IP注射50μg/天后36小时收集供体小鼠脾细胞。
淋巴细胞的过继转移
在诱导结肠炎后第14天处死所有组的供体小鼠并如上所述制备脾脏淋巴细胞悬浮液[Weiner，H.等，Annu.Rev.Immunol.12：809-837(1994)]。移植前细胞重悬于PBS。用TNBS进行直肠攻击24小时后，所有组小鼠的脾淋巴细胞移植入原初受者小鼠。
耐受诱导对实验性结肠炎作用的评价
通过监测以下结肠炎的参数评价耐受诱导的作用：
结肠炎的临床评价：
在整个研究期间每天的腹泻。
宏观的结肠炎评分
采用标准参数在结肠炎诱导14天后进行结肠炎评价[Madsen，K.L等，Gastroenterology 113：151-159(1997)；Trop，S.等，Hepatology 27：746-755(1999)]。
确定了4个宏观参数，即：结肠溃疡的程度；肠和腹膜粘连程度；肠壁厚度；粘膜水肿程度。由两位有经验的不知情检查员给每个参数按0(完全正常)-4(最严重)级评分。
组织学病损的分级
为进行炎症的组织学评价，切取远端结肠组织(最后10cm)并用10％甲醛固定。用标准技术以苏木精-曙红对每只小鼠的5份石蜡切片染色。结肠的显微横截面切片上炎症的程度按0-4进行半定量分级[Madsen等，(1997)，同前；Trop等，Hepatology 27：746-755(1999)]。0级：正常，无炎症迹象；1级：极低水平的白血球渗出；2级：低水平的白血球渗出；3级：高水平渗出和血管密度高且肠壁增厚；4级：穿透粘膜的渗出、杯状细胞丧失、血管密度高、肠壁增厚和正常肠结构破坏。由两位有经验的不知情检查员进行分级。
实验性结肠炎模型中NK1.1淋巴细胞对耐受诱导作用的评价
分离肝脏和脾脏淋巴细胞
如前所述分离脾细胞并除去红血球[Vicari，A.P.等，Immunology Today 17(2)：71(1996)]。在该项研究结束时，按照前述稍有改进的方法分离获得所有组小鼠的肝内淋巴细胞[Vicari等，(1996)，同前；Bleicher，P.A.等，Science 250：679-682(1990)]。切取隔膜上的下腔静脉和肝脏并用5ml冷的PBS冲洗直至其变为苍白色。除去结缔组织和胆囊，将肝脏置于10ml装有冷无菌PBS的平皿中。肝脏和脾脏经不锈钢筛网(孔径60，Sigma Chemical Co.，St.Louis MO)碾碎。将细胞悬液置于50ml试管中3分钟并用冷的PBS(1,250×rpm，10分钟)洗涤两次，弃去碎片。细胞重悬于PBS中，细胞悬液通过预先浸渍在PBS中的尼龙筛网，收集不结合的细胞。细胞用45ml PBS(1,250×rpm，室温)洗涤两次。为分离肝脏和脾脏淋巴细胞，在50ml试管中将20ml的histopague1077(Sigma Diagnostics，St.Louis，MO)缓慢地置于悬浮在7ml PBS中的细胞下面。试管于室温以1,640rpm离心15分钟。收集位于界面处的细胞，稀释入50ml试管并用冰冷却的PBS洗涤两次(1,250rpm，10分钟)。每个小鼠肝脏约回收到1×106个细胞。台盼蓝染色的存活率大于95％。分离得到所有实验组的所有动物的脾细胞和肝脏相关淋巴细胞。
用于测定NK1.1 + 淋巴细胞消除的流式细胞术分析
淋巴细胞分离后立即取一式三份2-5×104个细胞/500μl PBS，放入Falcon2052试管中与4ml1％PBS孵育10分钟，1400rpm离心5分钟。细胞重悬于10μl含有1∶20FITC-抗小鼠NK1.1抗体(NKR-P1C，Pharmingen，USA)的FCS中，每隔10分钟搅拌一次共30分钟。细胞用1％BSA洗涤两次，维持于4℃直至读数。对照组仅加入5μl 1％BSA。用荧光激活细胞分选仪(FACSTAR plus，Beton Dickinson)对各组的1×104个细胞进行分析性细胞分选。仅计数活细胞，不用抗体处理的淋巴细胞的背景荧光从获得的水平中扣除。闸门设置为正向-和侧面散射以排除死细胞和红血球。用Consort 30双色轮廓图程序(Becton Dickinson，Oxnard，CA)或CELLQuest程序分析数据。
脾细胞和肝脏相关淋巴细胞的培养
收集所有组(A’-F’)小鼠的脾细胞和肝脏相关淋巴细胞并培养在24孔组织培养板上。所有研究组中每只动物制备一式三份细胞试样并培养12小时。淋巴细胞在细胞皿(1×106个脾细胞/ml RPMI 1640)中于37℃、5％(C02)，用2μg/ml Con A和防止细胞因子从细胞释放所需的2μM莫能星(Biosource，CA)激活12小时。RPMI培养基含有：10％FCS、200mM Hepes、100U的青霉素和100μg的链霉素/ml、10mM Hepes IL2-10U/ml、CEP-50μg/ml。细胞包括2.5×105个脾细胞和0.5×106LAL，2μM莫能星(Biosource，CA)。收集两组上清液流体用于ELISA检测细胞因子，并用上述流式细胞术分析淋巴细胞[Collins，C.等，Eur.J.Immunol.26：3114-3118(1996)]。
胞内染色和流式细胞术
收集所有孔的细胞进行双重染色。如前所述检测CD4+T细胞群(Th1和Th2细胞)的胞外和胞内染色，采用以下抗体：用于检测CD4+IL4+细胞(PharMingen，SanDiego，CA)的FITC偶联的抗CD4，和PE偶联的抗IL4mAb。FITC偶联的抗CD4和PE偶联的抗IFNγmAb用于检测CD4+IFNγ细胞(PharMingen，San Diego，CA)。所有操作均按照生产商的使用说明书(IC screen，Biosource胞内染色试剂盒，CA)进行。通过流式细胞术分析淋巴细胞。
肝脏淋巴细胞的细胞毒性测定
用于这些研究的靶细胞是YAC-1细胞，一种适应于在使用添加10％FCS的RPMI的组织培养中连续生长的淋巴瘤细胞系。用于NK测定的YAC-1细胞的制备是通过将其以2×105个细胞/ml的密度接种于装有RPMI 10％FCS的25ml烧瓶，24小时后收集。重悬细胞并收集入50ml试管中，离心(1250rpm)10分钟用培养基洗涤。该方法保证用51Cr有效标记和NK细胞对裂解的高敏感性。靶细胞用51Cr标记(New Life Science，BostonMA，Gamidor，Israel)并于37℃孵育90分钟(300μl培养基中含有200mCi/2×106个细胞)。每隔10分钟手动混合细胞一次。孵育后，加入3ml 20％的FCS RPMI并于37℃再孵育30分钟。细胞用RPMI 10％FCS洗涤三次并计数。为测定标记效率的程度，计数100μl细胞并检测0.6cpm/细胞的最小值。效应细胞是从上述A-H组的肝脏中分离的肝淋巴细胞。在Costar 96-板上进行51Cr释放测定。100μl不同级数量的效应细胞与100μl 5000标记的靶细胞混合，使效靶细胞比(E∶T之比)为100∶1、50∶1和10∶1。每孔含有总体积为200μl的靶细胞和效应细胞。每个样品的每种比例测试5个孔。为测定自发释放，用100μlRPMI 10％FCS接种相似数目靶细胞的6个孔。为测定最大释放，100μl培养基6个孔的靶细胞与100μl TritonX混合。培养板离心2分钟(500rpm)，然后于37℃在5％CO2中孵育4小时。然后再离心培养板2分钟(500rpm)，收集上清液并用γ计数仪计数。结果用以下方程式计算表示为靶细胞特异性裂解的百分比：细胞毒性％＝(测定的平均cpm-自发释放的cpm)/(TritonX-cpm裂解靶细胞的cpm-自发释放的cpm)×100。
细胞因子分泌
收集两组一式三份的上清液并检测所有耐受和不耐受组小鼠，NK1.1消除和没有消除小鼠的细胞因子水平。根据生产商的使用说明，使用Genzyme诊断试剂盒(Genzyme Diagnostics，MA，USA)通过“夹心”ELISA来检测IL4、IL10、IL12和IFNγ水平。诱导结肠炎10天后，检测耐受和不耐受NK1.1消除和没有消除小鼠组5只小鼠的(细胞因子)血清水平。
体外驯化实验
分离淋巴细胞
制备脾细胞并分成淋巴细胞的4种亚组：CD4+、CD8+、NK和树突状细胞。使用磁力细胞分选(Magnetic Cell Sorting)(MACS)法分离细胞。采用特定的微珠分离淋巴细胞的每种亚组：CD4和CD8微珠与抗-NK珠(Mitenyl Biotec，德国)。淋巴细胞分离后立即将一式三份2-5×104个细胞/500μl PBS放入Falcon 2052试管与4ml 1％PBS孵育10分钟，1400rpm离心5分钟。细胞重悬于10μl含有1∶20FITC-抗小鼠NK1.1抗体(NKR-P1C，Pharmingen，USA)的FCS中，每隔10分钟搅拌一次共30分钟。细胞用1％BSA洗涤两次并维持于4℃直至读数。对照组仅加入5μl1％BSA。用荧光激活细胞分选仪(FACSTAR plus，Becton Dickinson)对各组的1×104个细胞进行分析性细胞分选。仅计数活细胞，不用抗体处理的淋巴细胞的背景荧光从获得的水平中扣除。闸门设置为正向-和侧面散射以排除死细胞和红血球。用Consort 30双色轮廓图程序(Becton Dickinson，Oxnard，CA)或CELLQuest程序分析数据。
脾细胞和肝脏相关淋巴细胞的培养
收集所有组(A’-F’)小鼠的脾细胞并培养在24孔组织培养板上。所有研究组中每只动物制备一式三份细胞试样并培养12小时。收集两组上清液用于ELISA检测细胞因子。
实施例1
耐受诱导在实验性结肠炎中的作用
为评价耐受诱导在实验性结肠炎模型中的作用，研究了6组小鼠(每组20只动物)(表1)。在研究的第一天，所有小鼠经直肠用TNBS(A、B、D和E组)，或用普通盐水(对照组C和F)攻击。所有组小鼠从诱导结肠炎之日起每隔一天喂食TNBS(50μg/小鼠)共11天。B和E组包括的小鼠喂食结肠炎提取蛋白(CEP)。A、C、D和F组的小鼠喂食牛血清白蛋白(BSA，50μg/小鼠)。在诱导结肠炎后第14天处死所有组的小鼠。如上所述，D-F组小鼠在研究结束前36小时用抗NK1.1-小鼠单克隆抗体治疗。A-C组小鼠不是NK1.1消除的。
表1
实验组和对照组
  组别   NK1.1消除   喂食的抗原   直肠攻击
  A   -   BSA   TNBS
  B   -   CEP   TNBS
  C   -   BSA   NS
  D   +   BSA   TNBS
  E   +   CEP   TNBS
  F   +   BSA   NS
BSA：牛血清白蛋白
CEP：结肠炎提取蛋白
TNBS：2，4，6-三硝基苯磺酸
结肠炎的临床评价
在喂食小鼠-CEP或NK1.1-消除的B和D组耐受小鼠中分别观察到腹泻显著减轻。相反，喂食BSA或小鼠-CEP和NK1.1-消除的A和E组小鼠腹泻严重。与A和E组小鼠相比，对小鼠体重的追踪表明B和D组耐受小鼠的体重具有统计学显著的增加(分别是，13.5％和11.65％对3.2％和4.8％，p＜0.005)。
结肠炎的宏观分级
通过喂食小鼠提取的结肠炎蛋白质或NK1.1-消除(B和D组)诱导的口服耐受显著减轻了结肠炎的宏观级别。所测试的结肠炎宏观参数评分是：结肠溃疡的程度；肠和腹膜的粘连程度；肠壁厚度；粘膜水肿程度。B和D组小鼠总的宏观评分分别是0.35±0.01、0.63±0.03，而未治疗的对照和CEP-喂食-NK1.1消除的A和E组分别是3.1±0.54、3.05±0.67(p＜0.005)。
组织学损伤的分级
与A和E组不耐受小鼠相比，组织学评价显示B和D组耐受或NK1.1消除小鼠的炎性应答和粘膜溃疡明显减轻。在B和D组小鼠中，几乎所有切片均正常，或者仅检测到很少的淋巴细胞渗出。相反，在取自不耐受小鼠的肠样品(图1)中观察到严重(3-4级)的炎性反应。
实施例2
NK1.1+淋巴细胞提高了患实验性结肠炎耐受小鼠的CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比 例而降低了不耐受小鼠的CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例
耐受小鼠
为研究NK1.1+淋巴细胞在耐受小鼠中的作用，收集所有组小鼠的脾细胞和肝脏相关淋巴细胞(2.5×106个脾细胞和0.5×106LAL)并在存在CEP和APC时培养72小时。流式细胞术分析显示与非NK1.1LAL消除小鼠相比，口服耐受诱导后的NK1.1消除降低了CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例(在E和B组中分别是0.99±0.03和1.8±0.35CD4+IL4+/CD4+IFNγ+，p＜0.005，图2)。与非NK1.1消除组C相比，对照NK1.1消除组(F组)显示CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例降低(在C和F组中分别是2.13±0.36和1.6±0.29)。
不耐受小鼠
与耐受组相反，NK1.1消除对患实验性结肠炎的不耐受小鼠具有相反作用。与没有NK1.1消除的不耐受组相比，NK1.1消除的不耐受组的CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例增加(在A和D组中分别是0.74±0.06对0.56±0.05，p＜0.005，图3)。
对耐受和不耐受小鼠之间CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例的比较表明所有耐受组具有较高的比例。
与喂食BSA(组A)的不耐受小鼠相比，用TNBS处理和口服CEP(A组)的小鼠显示明显较高的比例。A、B和C组的CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例分别是：0.56±0.05、1.8±0.35和2.13±0.36(p＜0.005)。图4分别显示了IL4和IFNγ在以下各组小鼠分离的淋巴细胞表达的代表性结果：B和E组耐受的NK1.1没有消除和消除小鼠，与A和D组不耐受的NK1.1没有消除和消除小鼠。
实施例3
体外致敏和疾病靶抗原对患实验性结肠炎的耐受和不耐受小鼠 CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例的作用
为评价体外接触疾病靶抗原对CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例的作用，收集所有组小鼠的脾细胞和肝脏相关淋巴细胞，(2.5×106)脾细胞和(0.5×106)LAL(列于表1)，在存在Con A和无CEP和APC时培养12小时。评价无抗原时NK1.1消除的作用发现类似于存在抗原时。与耐受组E的NK1.1消除小鼠相比，从B组耐受小鼠收集淋巴细胞显示出明显较高的CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例(分别是0.7±0.02对1.1±0.02，p＜0.005)。相反，在无抗原时，NK1.1消除在A和D组不耐受小鼠中诱导了CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例增加(分别是1.21±0.03对0.96±0.01，p＜0.005，表2，图5)。这些结果显示免疫驯化可在体内实现并且不受体外细胞抗原孵育的影响。
类似地，流式细胞术显示B和E组与对照组耐受小鼠中CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例显著降低，而A和D组不耐受小鼠中该比例显著增加(p＜0.005，图5)。
表2
NK1.1消除和疾病靶抗原对CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例的作用
  组别   耐受的   NK1.1消除   CD4+IL4+/CD4+IFNγ+(耐受抗原)   CD4+IL4+/CD4+IFNγ+(无耐受抗原)
  A   -   -   0.56±0.05   0.96±0.01
  B   +   -   1.8±0.35   1.1±0.02
  C   原初的   -   2.13±0.36   1.3±0.21
  D   -   +   0.74±0.06   1.21±0.03
  E   +   +   0.99±0.03   0.7±0.02
  F   原初的   +   1.6±0.29   1.33±0.27
耐受和不耐受小鼠中细胞因子水平的改变
收集两组一式三份的上清液并检测所有耐受和不耐受组所有小鼠的细胞因子水平。通过“夹心”ELISA检测IL4和IFNγ水平。耐受小鼠显示了免疫应答细胞因子分泌从Th1转向Th2。这些小鼠(B组)显示IL4水平上升和IFNγ水平降低。相反，不耐受组小鼠(A、E组)显示IFNγ水平高和IL4水平低。与耐受E组的NK1.1消除小鼠相比，收集自B组耐受小鼠的淋巴细胞表现出显著较高的IL4和较低的IFNγ水平(分别是24.4±1.4和14.1±0.4对22.6±0.7和189.8±8.4，图6)。相反，在无抗原时，NK1.1消除在A和D组的不耐受小鼠中诱导了IFNγ增加和IL4水平降低(分别是128.3±3.7和0.6±0.01对48.3±4.1和19.1±0.4，图6)。NK1.1消除导致喂食CEP组小鼠的IL12水平上升(分别是475±23.3与145±5.7，E组图7)但在未喂食CEP组中具有相反作用(165±7.4和74±3.3，分别是A和D组)。
实施例4
耐受诱导在实验性结肠炎中对脾细胞过继转移的作用
为评价耐受诱导在实验性结肠炎模型中的作用，研究了6组(每组10只动物)供体小鼠(不同的组列于表3)。通过用TNBS经直肠攻击在G-J组小鼠中诱导了结肠炎。K-L组的对照小鼠用普通盐水攻击。所有组小鼠从诱导结肠炎之日起每隔一天喂食TNBS(50μg/小鼠)，共11天。I和J组包括喂食结肠炎提取蛋白(CEP)的小鼠。G、H、K和L组小鼠以牛血清白蛋白喂食(BSA，50μg/小鼠)。G、I和K组小鼠在收集脾细胞之前36小时按照上述进行NK1.1消除。在诱导结肠炎后第14天处死所有组小鼠。
也研究了受者小鼠G’-L’组，每组10只动物。受者小鼠在静脉内注射0.5ml PBS配制的1×106供体细胞前24小时用300rad全身辐射进行亚致死照射。细胞移植后24小时所有小鼠用TNBS灌肠剂处理。结肠炎诱导14天后测定如下结肠炎的临床、宏观和组织学参数。
表3
实验组和对照组
  组别   NK1.1消除   喂食抗原   直肠攻击   脾细胞供体
  供体：
  G   +   BSA   TNBS   -
  H   -   BSA   TNBS   -
  I   +   CEP   TNBS   -
  J   -   CEP   TNBS   -
  K   +   BSA   NS   -
  L   -   BSA   NS   -
  G’   -   -   TNBS   G
  H’   -   -   TNBS   H
  I’   -   -   TNBS   I
  J’   -   -   TNBS   J
  K’   -   -   TNBS   K
  L’   -   -   TNBS   L
BSA：牛血清白蛋白
CEP：结肠炎提取蛋白
TNBS：2，4，6-三硝基苯磺酸
结肠炎的临床评价
在喂食小鼠-CEP的J’组耐受小鼠以及J组耐受小鼠的耐受细胞的受者小鼠中观察到腹泻显著减轻。相反，H’组和喂食BSA的H组的不耐受脾细胞的受者小鼠腹泻严重。与H和H’组的不耐受小鼠相比，对小鼠体重的追踪表明J和J’组耐受小鼠的体重增加具有统计学显著性(分别是，10.8％和11.2％对5.7％和5.5％，p＜0.005)。
与H和H’组的不耐受小鼠相比，接受G’组和G组其供体的NK1.1消除小鼠的脾细胞的受者小鼠腹泻较轻。两组小鼠均显示体重增加(分别是9.9％和10.2％对5.7％和5.5％，p＜0.005)。相反，接受I’组的NK1.1消除小鼠的脾细胞的小鼠导致耐受作用丧失。在其供体(I组)小鼠中观察到类似的作用。当与H和H’组相比时，这些小鼠显示较轻的腹泻，但比非NK1.1消除对照组严重。类似地，在两组小鼠中未观察到体重明显增加(与J和J’组耐受小鼠相比，I和I’组小鼠分别是6.0％和5.1％，p＜0.005)。
未用TNBS攻击的K和L组小鼠无患病的临床证据。其体重分别增加11.4％和12.3％。相反，K’和L’组小鼠发生严重的腹泻并且它们的体重分别仅增加4.5％和5.2％。
结肠炎的宏观分级
通过喂食小鼠提取的结肠炎蛋白质(J组)诱导口服耐受和将耐受的淋巴细胞过继转移(J’组)显著减轻了结肠炎的宏观级别。所测试的结肠炎宏观参数评分是：结肠溃疡程度；肠和腹膜的粘连程度；肠壁厚度；粘膜水肿的程度。与H和H’组不耐受小鼠分别是3.22±0.15和3.32±0.26相比，J和J’组总的宏观评分分别是0.31±0.24和0.3±0.25。G组NK1.1消除小鼠和它们的淋巴细胞的G’组受者小鼠显示疾病缓解(分别是0.8±0.4和0.85±0.5)。相反，I组的NK1.1消除小鼠和它们的淋巴细胞受者小鼠(I’组)显示严重的结肠炎(分别是3.72±0.22和3.77±0.6，p＜0.005)。K’和L’组小鼠显示有严重的结肠炎(分别是3.4±0.29和3.27±0.22)。
组织学损伤的分级
肠组织的组织学评价显示J和J’组耐受小鼠的炎性应答和粘膜溃疡明显减轻，组织学评分分别是1.8和1.7。在这些小鼠中，几乎所有切片均正常，或者仅检测到很少的淋巴细胞渗出。相反，在取自H和H’组不耐受小鼠的肠样品中观察到严重的炎性反应，组织学评分是3.3和3.08(分别为H和H′组，p＜0.005，图8)。在G组不耐受NK1.1消除小鼠和它们淋巴细胞的受者小鼠(G’组)检测到炎性应答和粘膜溃疡明显减轻。G和G’组的组织学评分分别是2.08和2。I组NK1.1消除小鼠和它们淋巴细胞的受者小鼠(I’组)显示有严重的结肠炎。I和I’组小鼠的评分分别是2.9和2.5。K和L组未用TNBS攻击。K’和L’组小鼠显示有严重的结肠炎证据，其评分分别是3.1和3。
实施例5
NK1.1+淋巴细胞提高了患实验性结肠炎耐受小鼠的CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比 例和降低了不耐受小鼠的CD4+IL4+/CD4±IFNγ+比例
耐受小鼠
比较了耐受和非耐受受者小鼠之间的CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比例，显示所有耐受组具有较高的比例。与H’组不耐受小鼠相比，J’组耐受受者小鼠显示较高的比例，二者的CD4+IL4+/CD4+IFNy+比例分别是：2.16和0.55(p＜0.005)。
耐受小鼠淋巴细胞的过继转移提高了受者小鼠的CD4+IL4/CD4+IFNγ+比例。流式细胞术分析显示与收集自耐受的没有消除小鼠的脾细胞相比，喂食CEP的NK1.1消除供体小鼠的脾细胞过继转移降低了CD4+IL4/CD4+IFNγ+比例(I’和J’组分别是0.58对2.16，p＜0.005，图9)。
不耐受小鼠
不耐受淋巴细胞的过继转移降低受者小鼠的CD4+IL4/CD4+IFNγ+比例。与耐受组相比，NK1.1消除对患实验性结肠炎的不耐受小鼠具有相反的作用。流式细胞术分析显示与不耐受的没有NK1.1消除小鼠脾细胞相比，NK1.1消除的不耐受供体小鼠脾细胞过继转移提高了CD4+IL4/CD4+IFNγ+比例(G’和H’组分别是1.7对0.55，p＜0.005，图9和表4)。图10显示了IL4和IFNγ在耐受的NK1.1没有消除和消除供体的受者小鼠与不耐受的NK1.1没有消除和消除供体的受者小鼠(G′-J′组)分离的淋巴细胞上表达的代表性结果。
表4
耐受和不耐受的，NK1.1消除和没有消除小鼠脾细胞的过继转移对 CD4+IL4/CD4+IFNγ+比例的作用
  受者：   供体：   CD4+IL4/CD4+IFNγ+比例
  G’   G   1.7
  H’   H   0.55
  I’   I   0.58
  J’   J   2.16
  K’   K   1.13
  L’   L   0.69
对照淋巴细胞的过继转移
流式细胞术分析显示与非NK1.1消除供体小鼠相比，对照NK1.1消除小鼠的脾细胞过继转移提高了CD4+IL4/CD4+IFNγ+比例(K’和L’组分别是1.13对0.69，p＜0.005)。
实施例6
NK1.1细胞转移肝脏淋巴细胞的细胞毒性
γAC-1细胞以E∶T比例为100∶1、50∶1裂解和10∶1在这些研究(细胞溶解试验)中用作靶细胞。使用分离自NK1.1消除和非消除的耐受和不耐受小鼠的受者小鼠的肝脏淋巴细胞进行研究。与其它组12.37％细胞毒性相比，非耐受非NK1.1消除小鼠的受者小鼠(H’组)(的细胞)显示几乎无溶解(100∶1 E∶T，图11)。G’组不耐受小鼠的受者(小鼠细胞)显示溶解高于H’组，细胞毒性分别是20.4％对12.37％。I’组喂食CEP的NK1.1消除小鼠的受者(小鼠细胞)显示溶解低于J’组没有NK1.1消除小鼠(细胞毒性分别是42.58％对46.98％)。K’和L’组小鼠相比，对照组的受者(小鼠细胞)的细胞毒性分别为23.1％对22.47％(p＜0.005，图11)。
细胞因子测定
收集两组一式三份的上清液并检测所有耐受和不耐受组所有小鼠的细胞因子水平。通过“夹心”ELISA检测IL4、IL10和IFNγ水平。耐受小鼠显示免疫应答细胞因子分泌从Th1转向Th2。这些小鼠(H组)显示IL4、IL10水平上升和IFNγ水平降低。相反，不耐受组小鼠(G、J和K组)显示IFNγ水平高和IL10水平低。与耐受K组NK1.1消除小鼠相比，收集自H组耐受小鼠的淋巴细胞表现出显著较高的IL4、IKL10和较低的IFNγ水平(分别是18.4±3.7、23.1±2.9和5.1±0.4对2.9±0.6、0.8±0.1和19.8±3.8，图12)。相反，在无抗原时，NK1.1消除在G和J组不耐受小鼠中诱导了IFNγ增加和IL4、IL10水平降低(分别是24.3±3.7、3.1±0.9和4.6±0.4对18.3±1.1、3.2±0.1和2.1±0.4，图12)。
实施例7
NKT淋巴细胞的离体免疫程序
如以上实施例所示，与不耐受小鼠相比，小鼠喂食提取的结肠炎蛋白质诱导的口服耐受明显缓解了各种结肠炎症状(结肠炎的宏观级别、严重的腹泻、炎性应答和粘膜溃疡)。
因此，本发明进行了以下实验，检查细胞，特别是NKT细胞的离体驯化是否缓解了患所诱导结肠炎的动物的各种结肠炎症状来检测NKT细胞的体外/离体免疫程序的这种可能性，所述动物未经任何口服耐受处理。
制备以下6个实验组的每组的8种不同组合(如表5所示，CD4、CD8、脾细胞和树突状细胞)的各种细胞亚组：
1.收集无结肠炎且未经治疗(口服耐受)的对照动物的细胞。将这些细胞与BSA离体孵育。
2.收集患结肠炎但未经治疗(口服耐受)的对照动物的细胞。将这些细胞与BSA离体孵育。
3.收集患结肠炎并经口服耐受治疗的动物的细胞。将这些细胞与BSA体外孵育。
4.收集自无结肠炎且未经治疗(口服耐受)的对照动物的细胞。将这些细胞与CEP离体孵育。
5.收集自患结肠炎但未经治疗(口服耐受)的对照动物的细胞。将这些细胞与CEP离体孵育。
6.收集自患结肠炎并经口服耐受治疗(口服耐受)的动物的细胞。将这些细胞与CEP离体孵育。
表5
细胞类型或组合不同的实验亚组
  不同亚组   细胞类型或细胞组合
  A”组   CD4细胞
  B”组   CD8细胞
  C”组   脾细胞
  D”组   树突状细胞(DC)
  E”组   NKT细胞
  F”组   NKT+CD4
  G”组   NKT+CD8
  H”组   NKT+DC
应该注意的是实验组1、2和3在存在BSA时体外孵育，因此作为对照，而实验组4、5和6的细胞在存在抗原(CEP)时体外孵育，因此作为测试组。通过检测经不同治疗小鼠细胞的IL10分泌(与IFNγ分泌相比较)来检查离体驯化的效果。
应该理解的是不同的细胞类型或细胞组合(亚组A”-H”)是主要测试组，表明与抗原一起孵育进行离体驯化具有可行性，所述细胞或细胞组合从患有结肠炎、未经治疗(口服耐受)的动物制备的但在存在CEP时体外孵育(亚组5A”-5H”)。如表6所示，IL10分泌增加表明在存在疾病相关抗原时(亚组E”5)培养NK1.1+T细胞可导致类似于耐受细胞的细胞因子分泌模式。
培养CD4和抗原时(亚组A”5)观察到了类似的分泌模式。这些结果表明通过使细胞与疾病相关抗原接触可成功地离体驯化。然而，在存在抗原时组合多种细胞类型降低该所需作用，因为加入的CD4、CD8或DC(分别是亚组F”5、G5”和H”5)阻止了抗原对NKT的驯化。
除了可与疾病相关抗原一起孵育来离体驯化NKT细胞外，本发明人检查了NKT细胞与其它类型细胞共同培养是否可导致IL10分泌升高所反映的所需离体驯化。如表6所示，仅当NKT细胞与得自耐受小鼠的CD4或CD8细胞混合(培养)才导致IL10分泌升高(分别是亚组F3和G3)。NKT和得自耐受小鼠的CD4细胞混合离体接触抗原具有类似的作用(亚组F6)，而当检查NKT与得自耐受小鼠的CD8细胞混合(培养)时，抗原的存在显著降低了IL10分泌(亚组G6)。
然而，所检查的NKT细胞与树突状细胞混合共同培养未能诱导IL10分泌(亚组H3-H6)。
表6
实验和对照组
  组别   TNBS结肠炎   分离的淋巴细胞   喂食的抗原   培养板中加入的抗原   IFNγ   IL10
  A”1   -   CD4   BSA   BSA   4000   1450
  A”2   +   CD4   BSA   BSA   36   200
  A”3   +   CD4   CEP   BSA   0   53
  A”4   -   CD4   BSA   CEP   0   0
  A”5   +   CD4   BSA   CEP   0   270
  A”6   +   CD4   CEP   CEP   0   66
  B”1   -   CD8   BSA   BSA   4000   1500
  B”2   +   CD8   BSA   BSA   0   305
  B”3   +   CD8   CEP   BSA   50   165
  B”4   -   CD8   BSA   CEP   0   0
  B”5   +   CD8   BSA   CEP   0   54
  B”6   +   CD8   CEP   CEP   0   98
  C”1   -   脾细胞   BSA   BSA   0   0
  C”2   +   脾细胞   BSA   BSA   230   160
  C”3   +   脾细胞   CEP   BSA   0   306
  C”4   -   脾细胞   BSA   CEP   0   0
  C”5   +   脾细胞   BSA   CEP   0   34
  C”6   +   脾细胞   CEP   CEP   0   420
  D”1   -   DC   BSA   BSA   240   120
  D”2   +   DC   BSA   BSA   4000   720
  D”3   +   DC   CEP   BSA   4000   920
  D”4   -   DC   BSA   CEP   0   0
  D”5   +   DC   BSA   CEP   140   170
  D”6   +   DC   CEP   CEP   30   280
  E”1   -   NKT   BSA   BSA   0   0
  E”2   +   NKT   BSA   BSA   0   52
  E”3   +   NKT   CEP   BSA   0   230
  E”4   -   NKT   BSA   CEP   0   14
  E”5   +   NKT   BSA   CEP   38   340
  E”6   +   NKT   CEP   CEP   0   60
  F”1   -   NKT+CD4   BSA   BSA   0   15
  F”2   +   NKT+CD4   BSA   BSA   150   0
  F”3   +   NKT+CD4   CEP   BSA   0   360
  F”4   -   NKT+CD4   BSA   CEP   29   28
  F”5   +   NKT+CD4   BSA   CEP   0   0
  F”6   +   NKT+CD4   CEP   CEP   0   300
  G”1   -   NKT+CD8   BSA   BSA   18   98
  G”2   +   NKT+CD8   BSA   BSA   0   12
  G”3   +   NKT+CD8   CEP   BSA   0   350
  G”4   -   NKT+CD8   BSA   CEP   0   0
  G”5   +   NKT+CD8   BSA   CEP   0   0
  G”6   +   NKT+CD8   CEP   CEP   0   19
  H”1   -   NKT+DC   BSA   BSA   0   100
  H”2   +   NKT+DC   BSA   BSA   4000   270
  H”3   +   NKT+DC   CEP   BSA   0   98
  H”4   -   NKT+DC   BSA   CEP   0   0
  H”5   +   NKT+DC   BSA   CEP   0   0
  H”6   +   NKT+DC   CEP   CEP   44   80
BSA：牛血清白蛋白
CEP：结肠炎提取蛋白
TNBS：2，4，6-三硝基苯磺酸
DC：树突状细胞
因为假定Th2特异性记忆细胞被转移，本发明的实施例显示耐受脾细胞过继转移给原初小鼠诱导了耐受。相反，喂食CEP的NK1.1消除小鼠的淋巴细胞过继转移未能转移耐受性而上调了炎性Th1介导的应答。发现NK1.1+T细胞能快速产生IL4并且在实验性过敏脑脊髓炎和糖尿病NOD小鼠模型的自身免疫应答中起调节作用[Bendelac，A.等，Annu Rev Immunol 15：535-562(1997)；Sakamoto，A.等，J Allergy Clin Immunol 103(第5部分第2章)：s445-51(1999)；Seki，S.等，J Immunol147：1214-1221(1991)]。然而，与耐受没有消除NK1.1T细胞的小鼠相比，口服耐受诱导最终的NK1.1T细胞消除影响了细胞因子分泌的类型，降低CD4+IL4+/CD4+IFNγ比例。本发明的结果表明NK1.1T细胞可能经IFNγ的促炎或经IL4抗炎细胞因子分泌来影响免疫应答的Th1/Th2模式。在两种情况中，它们的影响远大于常规的CD4+T细胞[Chen，H.等，JImmunol 159：2240-2249(1997)]。
此外，本发明人还证明离体驯化NKT细胞的可行性。因为NKT细胞体外接触疾病靶抗原可能驯化这些细胞转向抗炎IL10分泌模式。
总之，NK1.1+淋巴细胞在免疫调节和免疫应答的免疫原性和耐受原性之间转化中起双重作用。它们被激活的环境、不同的刺激类型或信号传递受体可能决定了它们的功能。值得注意的是NK1.1+T细胞可参与不同的免疫调节机理并且调节免疫介导病症中的效应细胞和Th1/Th2模式。
总之，NK1.1+淋巴细胞在免疫调节和免疫应答的免疫原性和耐受原性之间转化中起双重作用。它们被激活的环境、不同的刺激类型或信号传递受体可能决定了它们的功能。值得注意的是NK1.1+T细胞可参与不同的免疫调节机理并且调节免疫介导病症中的效应细胞和Th1/Th2模式。
II.
材料与方法
动物
雌性免疫活性(杂合)和无胸腺Balb/C小鼠购自Jackson Laboratories，BarHarbor，Maine。所有的动物养在无菌箱的层流净化罩内并喂食经辐射的食物和无菌的酸化水。动物实验根据Hebrew大学-Hadassah学术委员会的实验室动物照料和使用指南进行，并得到该委员会的批准。
细胞培养
分泌HbsAg的人肝癌细胞系Hep-3B作为单细胞层进行培养，其中培养基补加了非必需氨基酸和10％热灭活的胎牛血清。
无胸腺小鼠的肿瘤和脾细胞移植
对无胸腺小鼠以亚致死剂量照射(600cGy)。照射24小时后，在小鼠右肩部皮下注射107个人肝癌Hep3B细胞。照射后的第三天，收集供体免疫活性小鼠的脾细胞。给受者无胸腺小鼠以1×107个细胞/小鼠经静脉内注射供体脾细胞，在受者小鼠中建立了有活性的免疫系统。然后给小鼠注射经抗原脉冲的NKT细胞。
分离淋巴细胞和NKT细胞
收集供体免疫活性Balb/C小鼠的脾脏制备脾细胞。除去脾脏的结缔组织后，将其置于10ml装有冷无菌PBS的平皿中并用不锈钢筛网(孔径60，Sigma ChemicalCo.，St.Louis MO)碾碎。为分离淋巴细胞，在50ml试管中将20ml的histopague1077(Sigma Diagnostics，St.Louis，MO)缓慢地置于悬浮在7ml PBS中的细胞下面。收集位于界面处的细胞，稀释入50ml试管并用冰冷却的PBS洗涤两次(1,250rpm，10分钟)。约回收到1×108个细胞。采用包有特异性抗-NK抗体的微珠(Mitenyl Biotec，德国)进行磁性细胞分选(MACS)分离得到NKT细胞。
通过脉冲驯化NKT细胞
用肿瘤或病毒相关抗原离体脉冲驯化NKT细胞。将0.5ml PBS中的1×106个NKT细胞置于培养瓶中并与HCC裂解物(3μ/ml)、Hep3B或牛血清白蛋白(BSA)(1μg/ml)一起孵育72小时。
NKT细胞的过继转移
免疫活性恢复后第7天进行过继转移。这通过静脉内注射与HCC裂解物、Hep3B细胞或BSA体外接触过的NKT细胞来进行。
对经离体免疫调节的调节性NKT淋巴细胞的过继转移作用的评价
通过监测以下参数评价离体驯化的NKT淋巴细胞的过继转移作用：
追踪肿瘤生长
受者小鼠以两周间隔追踪，共6周。评价了存活率、体重和肿瘤体积(使用卡尺)。处死表现出痛苦症状和体重过度降低(每次检测之间体重应增加10％以上或初始体重的25％以上)的小鼠。
细胞因子分泌
在第四周期间，所有组小鼠采血并以14,000rpm离心。使用Genzyme诊断试剂盒(Genzyme Diagnostics，MA，USA)通过“夹心”ELISA检测血清细胞因子水平。
肝脏和脾脏淋巴细胞的分离和流式细胞术测定CD4+、CD8+和NKT细胞
如上所述分离肝脏和脾脏淋巴细胞并将一式三份2×104个细胞/500μl PBS立即放入Falcon 2052试管。细胞重悬于10μl含有1∶20 FITC抗小鼠NK1.1抗体(NKR-P1C，Pharmingen，USA)的胎牛血清(FCS)中，每隔10分钟搅拌一次共30分钟。细胞用1％BSA洗涤两次并维持于4℃直至读数。使用荧光激活细胞分选仪(FACSTAR plus，Becton Dickinson)对各组的1×104个细胞进行分析性细胞分选。仅计数活细胞，没有抗体处理的淋巴细胞的背景荧光从获得的水平中扣除。用Consort 30双色轮廓图程序(Becton Dickinson，Oxnard，CA)或CELLQuest程序分析所得数据。
STAT 1-6的Western印迹分析
为测定STAT蛋白表达，从所有组小鼠中获得脾细胞。用配有马达驱动的特氟隆研棒的玻璃匀浆器在0.25M蔗糖/10mM Tris-HCl，pH7.4中制备组织匀浆(200mg/ml)。在SDS-聚丙烯酰胺(7.5％)凝胶上进行电泳分辨蛋白质(100μg/泳道)并将其电印迹到硝酸纤维素膜上。为检测STAT蛋白质，该膜用针对不同STAT蛋白质的多克隆家兔抗小鼠抗体，再用碱性磷酸酶偶联的山羊抗家兔IgG(Bethyl Lab.，Montgomery，TX)探查。
实施例1
经离体免疫调节的调节性NKT淋巴细胞的过继转移作用
为评价驯化的NKT细胞的体内抗肿瘤作用，研究了4组(A-D组)无胸腺Balb/C小鼠，每组10只动物(表1)。所有动物经亚致死照射并移植了人Hep3B HCC。制备免疫活性Balb/C小鼠的NKT细胞用HCC-衍生的抗原(HCC裂解物)、Hep3B细胞和BSA离体脉冲。随后将1×106个驯化的NKT细胞作过继转移注射入每只含有HCC的小鼠。A组接受以HCC裂解物脉冲的NKT细胞；B组接受以Hep3B细胞脉冲的NKT细胞；C组接受以BSA脉冲的NKT细胞；D组小鼠未经NKT移植。
表1：
实验和对照组
  组别   移植的细胞   脉冲用抗原
  A   NKT   HCC裂解物
  B   NKT   Hep3B细胞
  C   NKT   BSA
  D   无   HCC裂解物
为测定抗肿瘤作用的机理，进行FASC，分析脾内淋巴细胞群的NKT、CD4和CD8标记。也评价了肿瘤大小和重量、血清细胞因子水平和脾细胞的STAT 1-6蛋白质表达。
结果
用HCC-衍生抗原脉冲的NKT细胞过继转移(A组)导致4周内肿瘤完全消失并且缓解了体重丧失(6.5％)。相反，B、C和D组小鼠生出了大的、坏死肿瘤和严重的体重丧失(B、C和D组的体重丧失分别是21％、17％和23％，p＜0.05)；因此未能评价存活率。
A组的NKT/CD4和CD8/CD4比例显著增加(NKT/CD4比例A组是12.3B、C和D组分别是6.4、4.8和5.6，p＜0.05)。转录因子STAT4的表达在A组中显著增加，而在B-D组中未增加。与B、C和D组相比，A组的IFNγ的血清水平增加(分别是3.24、1.77和1.38倍，p＜0.05)。
用HCC-衍生抗原离体脉冲的NKT淋巴细胞过继转移导致小鼠中HCC抑制。抗肿瘤NKT和CD8淋巴细胞数量增加、作为IL-2活性标记的STAT4表达增加和血清促炎细胞因子水平升高，表明NKT介导的抗肿瘤活性与Th1免疫力增强相关。NKT淋巴细胞的离体调节是HCC免疫治疗的一种新方法，很有希望。
III.
材料和方法
试剂
伴刀豆球蛋白A购自Worthington Biochemical Corporation，USA。
抗-HBV疫苗(Bio Hep B)购自Bio Technological General Corporation，USA。
动物
实验方案经Jerusalem Hebrew大学医学院的动物研究委员会批准。10周龄的雄性瘦蛋白缺乏的C57BL/6J小鼠及其消瘦的(learn)同窝出生幼鼠(+/？)购自Hadrian实验室。动物饲养在温度控制的Hadassah-Hebrew大学医学院的动物中心。小鼠保持白天-夜晚各12小时周期，以标准小鼠食物喂养并可从瓶中喝自来水。每两天称重小鼠并记录食物摄入。实验结束时小鼠在异氟烷麻醉下脱颈处死。
口服抗原的制备和给药
取出相关小鼠的结肠，切成小条带并机械匀浆。经40mm尼龙细胞粗滤器过滤后，离心沉降取出完整的细胞。用蛋白质测定试剂盒(Biorad，慕尼黑，德国)定量沉淀蛋白质并用补料无创伤针头每隔一天喂食下述实验组小鼠，共30天(总共15次剂量)。
转氨酶和甘油三酯检测
采用自动化方法检测血清ALT和血浆AST活性。用Roche甘油三酯GPO-PAP酶测定试剂盒处理220cc血液样品的血清。使用Cobas DP-25分光光度计以550nm波长检测样品的甘油三酯水平。
葡萄糖耐受检测
为检测葡萄糖耐受，以每公斤体重1克量的葡萄糖喂食小鼠。口服喂食后，在0时以异氟烷麻醉从尾部采血，然后每15分钟进行一次，共3小时。用Elite葡萄糖测试条和葡萄糖计检测葡萄糖水平。
分离脾脏和肝脏淋巴细胞
如上述分离脾细胞并除去红血球[Vicari，A.P.等，Immunology Today 17(2)：71(1996)]。在该项研究结束时，按照前述稍有改进的方法从所有组小鼠中分离肝内淋巴细胞[Vicari等，(1996)，同前；Bleicher，P.A.等，Science 250：679-682(1990)]。切取隔膜上方的下腔静脉和肝脏并用5ml冷的PBS冲洗直至其变为苍白色。除去结缔组织和胆囊，将肝脏置于10ml装有冷无菌PBS的平皿中。肝脏和脾脏用不锈钢筛网(孔径60，Sigma Chemical Co.，St.Louis MO)碾碎。将细胞悬液置于50ml试管3分钟并用冷的PBS(1,250×rpm，10分钟)洗涤两次，弃去碎片。细胞重悬于PBS中，使细胞悬液通过预先浸渍在PBS中的尼龙筛网并收集不结合的细胞。细胞用45ml PBS(1,250×rpm，室温)洗涤两次。为分离肝脏和脾脏淋巴细胞，在50ml试管中将20ml的histopague1077(Sigma Diagnostics，St.Louis，MO)缓慢地置于悬浮于7ml PBS中的细胞下面。试管于室温以1,640rpm离心15分钟。收集位于界面处的细胞，稀释入50ml试管并用冰冷却的PBS洗涤两次(1,250rpm，10分钟)。每个小鼠肝脏约回收到1×106个细胞。台盼蓝染色的存活率大于95％。分离得到所有实验组所有动物的脾细胞和肝脏相关淋巴细胞。
淋巴细胞的过继转移
在过继转移实验的第1天处死所有相关组供体小鼠并如上所述制备获得脾脏的淋巴细胞悬浮液[Weiner，H.等，Annu.Rev.Immunol.12：809-837(1994)]。移植前细胞重悬于PBS。不经照射，将所有组的脾淋巴细胞移植入原初受者小鼠。
细胞因子检测
1.血清细胞因子：检测所有耐受和非耐受组所有小鼠的细胞因子水平。根据生产商的使用说明书，用Genzyme诊断试剂盒(Genzyme Diagnostics，MA，USA)通过“夹心”ELISA检测IFNγ、TGF-β、TNF、IL4、IL6和IL10水平。
2.脾脏细胞因子：如上所述收集1百万/ml脾细胞。然后使用Elispot方法(Diaclone Research，USA)计算IFNγ和IL10水平。
流式细胞术分析测定NK1.1淋巴细胞群
淋巴细胞分离后立即将一式三份2-5×104个细胞/500μl PBS放入Falcon 2052试管与4ml 1％PBS孵育10分钟并以1400rpm离心5分钟。细胞重悬于10μl含有1∶20FITC-抗小鼠NK1.1抗体(NKR-P1C，Pharmingen，USA)的FCS中并每隔10分钟搅拌一次，共30分钟。细胞用1％BSA洗涤两次并维持于4℃直至读数。对照组仅加入5μl 1％BSA。用荧光激活细胞分选仪(FACSTAR plus，Becton Dickinson)对各组的1×104个细胞进行分析性细胞分选。仅计数活细胞，没有抗体处理的淋巴细胞的背景荧光从获得的水平中扣除。闸门设置为正向-散射和侧面-散射以排除死细胞和红血球。用Consort 30双色轮廓图程序(Becton Dickinson，Oxnard，CA)或CELLQuest程序分析数据。
Stat Western印迹分析
使用Western印迹分析试剂盒评估stat 1、3、4、6水平。
肝脂肪含量的MRI检测
肝脂肪含量用双重-回声化学位移梯度-回声磁共振成像(MRI)测序技术检测，该技术对小鼠肝脏脂肪的评价/定量单次探测中可提供同相和反相图像。T1-加权反相MRI技术(T1-weighted opposed-phase MRI technique)对检测组织中较小比例的脂肪敏感。所有MRI用1.5-T系统(Signa LX；GE，Milwaukee，USA)进行。双重回声MR成像以125毫秒的重复时间(TR)、4和6.5毫秒的双重回声时间(TE)、80°的翻转角(flip angle)进行。成像参数包括3mm的截面厚度、13-cm的视野、256*160的矩阵并且获得了一种信号；采用拐点线圈(knee coil)。在肝脏水平上用3mm的截面厚度和无交叉缺口获得横向(轴向)和冠状图像。同相和反相图像之间信号强度变化的SI检测的定量评价按照以前报道所述的方法计算(Mitchell DG等，Invest.Radiol 26：1041-1052(1991)；Tomohiro N等，Radiology 218：642-646(2001))。SI指数按照下式计算：SI指数＝(SIip-SIop)/SIip，其中SIip是同相图像上的SI，SIop是反相图像上的SI。SI指数反映与同相图像上的SI相比，反性图像上SI损失的部分。
肝脏组织学检查
将每只小鼠的一段肝脏固定于10％甲醛缓冲液中，石蜡包埋作组织学分析。切片(μm)用苏木精/曙红染色并进行组织学评分。
统计学分析
数据表示为平均值+/-SEM。用非配对student t检验计算出不同组之间上述参数的统计学意义。p值小于0.05表明具有统计学显著差别。
实施例1
NKT1.1淋巴细胞过继转移对葡萄糖耐受的作用
为评价在ob/ob NASH模型中观察到的NKT1.1淋巴细胞在代谢和肝紊乱中的作用，将小鼠如表1所示分为5组。在实验的第12天，对所有小鼠组如上所述进行葡萄糖耐受测定。
表1
过继转移组
  A组   野生型NKT1.1淋巴细胞过继转移至ob/ob小鼠
  B组   ob/ob NKT1.1淋巴细胞过继转移至ob/ob小鼠
  C组   野生型脾细胞过继转移至ob/ob小鼠
  D组   对ob/ob小鼠无过继转移
  E组   ob/ob脾细胞过继转移至ob/ob小鼠
如我们以前的实验所示，未经免疫操作的ob/ob小鼠(C组)具有严重紊乱的葡萄糖耐受测试(见表2和图1)。类似地，经调节性ob/ob脾细胞过继转移的ob/ob小鼠在整个葡萄糖耐受测试期间葡萄糖水平显著上升。
表2
葡萄糖耐受测试结果
  A   B   C   D   E
 葡萄糖0分钟   146.7+\-28.59   125.8+\-19.98   151.7+\-104.86   211.7+\-37.49   91.3+\-38.30
 葡萄糖15分钟   188.9+\-46.79   205.1+\-37.60   232.6+\-99.15   288.2+\-61.25   274+\-50.24
 葡萄糖30分钟   175.4+\-37.13   216+\-46.44   237.3+\-125.49   289.2+\-79.12   289.1+\-43.64
 葡萄糖60分钟   161.1+\-26.66   159.3+\-36.07   201.8+\-141.82   281.6+\-74.82   285.8+\-85.06
 葡萄糖90分钟   165.7+\-28.48   165.9+\-20.73   212.1+\-130.68   288+\-57.83   224.3+\-62.33
 葡萄糖120分钟   156.1+\-29.68   151.5+\-21.23   186.9+\-119.99   247.3+\-69.06   199.6+\-28.17
 葡萄糖180分钟   165.2+\-49.98   130.6+\-30.11   169+\-105.82   190.7+\-70.04   176.9+\-65.87
相反，与D组相比，注射野生型(A组)或ob/ob(B组)NKT1.1淋巴细胞的小鼠表现出葡萄糖耐受测试显著提高(在120分钟内所有时间期间P＜0.001)。事实上，在葡萄糖耐受测试期间ob/ob各组和它们的消瘦的同窝出生幼鼠之间的葡萄糖水平差异没有统计学区别(在整个葡萄糖耐受测试期间P值范围是0.20-0.63)。植入野生型脾细胞的C组小鼠葡萄糖水平处于水平显著升高的D组和E组小鼠与实际上正常水平的A组和B组小鼠之间。
这些结果表明ob/ob NKT1.1淋巴细胞的数量降低和/或功能紊乱在ob/ob小鼠的葡萄糖不耐受发生中起主要作用。通过补充野生型或ob/ob NKT淋巴细胞，可纠正这些小鼠的葡萄糖不耐受。
实施例2
NKT1.1淋巴细胞过继转移对肝脂肪含量的作用
为评价NKT1.1淋巴细胞过继转移对脂肪变性水平的作用，所有组(见表3)的小鼠在该实验结束时进行腹部MRI，按照上述方法估计肝脂肪含量并以SI指数表示。
表3
肝脂肪含量-过继转移实验
  同相图像   IPSD   反相图像   OPSD   脂肪含量(IP-OP)   SI指数(IP-OP/IP)
  A   1066.87   91.29   426.92   196.62   639   0.59
  B   1060.57   83.07   512.99   75.53   647   0.55
  C   1147.36   86.17   449.28   87.95   698   0.61
  D   1088.1   85.92   365.93   85.72   722   0.66
  E   1119.45   90.68   401.04   83.99   718   0.64
如图2a和2b所示，接受野生型(A组)和ob/ob(B组)NKT1.1淋巴细胞过继转移的小鼠经MRI均显示肝脂肪水平降低。虽然在过继转移和MRI记录之间仅经过一段短时间(12天)，这些差别接近统计学显著性(分别是P＝0.063，P＝0.008)。这表明NKT1.1淋巴细胞消除或功能失常参与了ob/ob模型的非酒精性脂肪性肝炎的发病机理，补充它们可纠正脂肪变性。
实施例3
NKT1.1淋巴细胞过继转移对患伴刀豆球蛋白-A肝炎易感性的作用
为评价NKT1.1淋巴细胞对ob/ob小鼠以前已知的对Con-A诱导肝炎的抗性的作用，所有组的小鼠(表4)在该项实验的第12天经尾静脉静脉内注射溶解于无热源盐水、总体积0.1cc的200μg Con-A。24小时后，处死所有小鼠并检测血清转氨酶水平和肝脏炎症的组织学变化程度。如表4和图3a和3a所示，在对Con-A攻击的应答中，D和E组小鼠的肝脏转氨酶仅轻微高于其基线水平(AST分别是其基线水平的1.48和1.40倍；ALT分别是其基线水平的1.52和1.79倍)。相反，在对Con-A攻击的应答中，A和B组小鼠的AST(其基线水平的3.6和2.44倍)和ALT(是其基线水平的5.2和3.46倍)均明显升高。植入野生型脾细胞的C组小鼠肝脏转氨酶中度升高，处于A和B组与D和E组之间。该实验的结果表明NKT淋巴细胞的过继转移使得ob/ob小鼠更易患Con-A肝炎，这可能是由于激活了参与Con-A肝炎的CD4淋巴细胞。
表4
过继转移组的平均转氨酶水平
  AST   ALT
  A   819+/-269   1077+/-468
  B   556+/-143   626+/-123
  C   524+/-221   530+/-166
  D   338+/-90   315+/-66
  E   320+/-89   371+/-135
实施例4
口服免疫调节(通过喂食肝脏提取物)对葡萄糖耐受的作用
为评价口服免疫调节对NASH模型各种代谢组分和免疫组分的作用，小鼠如表5所示分成6组，每组14只动物。每隔一天，每组每只小鼠给予50μg的ob/op肝脏提取物、50μg正常同窝出生幼鼠的肝脏提取物或50μg牛血清白蛋白。
表5
各组小鼠的口服免疫调节
  A组   喂食c57bl/6小鼠肝脏提取物的ob/ob小鼠
 5B组   喂食ob/ob小鼠肝脏提取物的ob/ob小鼠
  C组   喂食牛血清白蛋白的ob/ob小鼠
  D组   喂食c57bl/6小鼠肝脏提取物的c57bl/6小鼠
  E组   喂食ob/ob小鼠肝脏提取物的c57bl/6小鼠
  F组   喂食牛血清白蛋白的c57bl/6小鼠
在第30天，停止所有肝脏提取物喂食(总共喂食15次)。在第59天，对所有小鼠进行上述葡萄糖耐受测试。如同预期一样，与它们的消瘦的同窝出生幼鼠相比，所有组的ob/ob小鼠在喂食葡萄糖后血糖水平显著上升(P＜0.001，表6)。然而，如图4所示，与喂食BSA的C组ob/ob小鼠相比，分别喂食野生型和ob/ob肝脏提取物的B和C组ob/ob小鼠对口服葡萄糖负荷的应答中产生明显较低的葡萄糖水平(P＜0.001)。
这表明经口服免疫调节诱导的免疫调节改变了ob/ob小鼠的代谢模式，提高了它们的葡萄糖耐受结果并使得它们更少患糖尿病。
表6
口服葡萄糖耐受测试后的平均葡萄糖水平
  A   B   C   D   E   F
  葡萄糖0分钟   87.4+\-10.3   103.8+\-19.37   81+\-29.74   85.6+\-7.75   131.2+\-9.00   78.3+\-12.74
  葡萄糖15分钟   145+\-22.05   150.2+\-27.13   202.7+\-68.36   95.5+\-7.67   101.7+\-16.87   105.9+\-19.34
  葡萄糖30分钟   144.1+\-23.88   144.5+\-26.18   226.9+\-91.34   88.8+\-11.70   86.5+\-9.44   91.7+\-12.96
  葡萄糖60分钟   118.6-+\-28.99   120.7+\-30.82   170.2+\-86.72   81.7+\-10.73   81.0+\-12.44   83.1+\-10.91
  葡萄糖90分钟   103.9+\-20.53   98+\-20.41   174.8+\-66.86   83.8+\-6.73   80.7+\-18.81   82.4+\-16.49
  葡萄糖120分钟   96.4+\-11.49   99.6+\-15.01   178.7+\-74.15   80.5+\-5.58   77.5+\-10.31   80.4+\-10.44
  葡萄糖180分钟   89.5+\-15.64   94.5+\-19.14   193.7+\-89.38   89.5+\-9.07   84.7+\-11.94   87.5+\-8.39
实施例5
喂食肝脏提取物的口服免疫调节诱导对肝脂肪含量的作用
为检测口服免疫调节对肝脂肪含量的作用，对6组小鼠在该项实验的第59天进行腹部MRI(见表7)。使用上述方法测定肝脂肪含量并以SI指数描述。所有3组野生型小鼠比ob/ob小鼠组显示肝脂肪含量明显较低(所有组P＜0.001)，喂食肝脏提取物未见有作用(图2a)。与C组小鼠相比，喂食野生型和ob/ob肝脏提取物的A和B组小鼠的肝脂肪含量明显降低(分别是P＝0.03和P＝0.019)。这些结果示于图5a和5b。
这表明经喂食肝脏提取物的口服免疫调节诱导改变了代谢模式，导致易感哺乳动物肝脏中的脂肪积累速率和NASH的降低。
表7
6组小鼠肝脂肪含量的MRI计算值
  同相图像   SDIP   反相图像   SDOP   脂肪含量(IP-OP)   SI指数(IP-OP/IP)
  A   1292.89   94.47   625.28   88.53   653   0.50
  B   1154.05   80.02   604.88   100.87   549   0.48
  C   1131.43   89.81   422.91   96.58   708   0.62
  D   996.1   69.96   900.93   69.11   95   0.09
  E   1105.29   72.12   982.05   85.25   123   0.11
  F   1071.65   76.88   955.26   77.68   116   0.10
实施例6
喂食肝脏提取物的口服免疫调节诱导对患伴刀豆球蛋白-A肝炎易感性的作用
相比于野生型小鼠，曾证明ob/ob(瘦蛋白缺乏的肥胖小鼠)小鼠对伴刀豆球蛋白-A诱导的肝炎具有独特的抗性。这是由这些小鼠中NKT1.1淋巴细胞群的数量和质量改变而确定的。为确定喂食肝脏提取物的口服免疫调节诱导对患伴刀豆球蛋白-A肝炎易感性的作用，在该项实验的第60天，所有小鼠以异氟烷麻醉从眼眶后区采血并检测血清转氨酶水平。在同一天，所有小鼠经尾静脉静脉内注射溶解于无热源盐水、总体积0.1cc的200μg Con-A。24小时后，处死所有小鼠并检测血清转氨酶水平和肝脏炎症的组织学变化程度。
如前所述，ob/ob小鼠患有自发性肝炎(平均AST＝227、平均ALT＝204)，而其消瘦的同窝出生幼鼠不患(平均AST＝37、平均ALT＝102)。当C和F组小鼠(ob/ob小鼠及它们消瘦的同窝出生幼鼠)注射200μg的Con-A后，与它们的消瘦的同窝出生幼鼠相比(平均AST增加至其基线值的5.94倍)，ob/ob小鼠的AST增加明显平缓(平均AST增加至其基线值的1.83倍)，这与ob/ob小鼠对Con-A肝炎相对具有抗性的以前观察相一致。由于未知的原因，ob/ob和消瘦的同窝出生幼鼠组的ALT水平有相当增加(分别比其基线值高2.75和2.098倍)。喂食肝脏提取物对野生型小鼠对给予Con-A的应答的转氨酶升高程度(在E和F组中AST分别增加至其基线值的5.56和6.67倍)无作用。这示于图6a和图6b。
相反，喂食野生型和ob/ob肝脏提取物的的A和B组小鼠的AST(AST分别升至其基线值的2.71和2.89倍)比喂食BSA的ob/ob小鼠明显升高。对ALT显示更加适中的作用(相比于C组增加至其正常值的2.75倍，A和B组的ALT分别增加至其基线值的3.1和3.72倍)。A和B组喂食肝脏提取物诱导的免疫调节导致对Con-A肝炎易感性程度有所差异，该免疫调节在这些小鼠中导致向更明显的CD4淋巴细胞介导的肝脏破坏转变。
实施例7
对乙型肝炎疫苗接种的应答
为证实ob/ob小鼠和它们的同窝出生幼鼠之间对外来刺激的免疫T细胞介导的应答存在深刻差异，对10只ob/ob小鼠和10只消瘦同窝出生幼鼠进行乙型肝炎疫苗免疫接种。在该项实验的第1、14、21、25和30天给所有小鼠腹膜内注射0.4克bio Hep B疫苗。在第30天，处死所有小鼠并用标准装置测定抗-HBS抗体滴度。与它们的消瘦的同窝出生幼鼠相比，ob/ob小鼠显示抗-HBS抗体滴度明显降低的减弱的免疫应答(P＝0.027)。该结果示于表8和图7。这证实了以前实验的印象，即ob/ob小鼠具有T细胞免疫应答的深度损伤，这在ob/ob小鼠发生上述代谢和免疫变化中起主要作用。喂食肝脏提取物口服耐受和NKT细胞的过继性转移可纠正此应答。
表8
HBV疫苗接种后的平均抗-HBS滴度(Miu/ml)
  OB/OB   105+/-115
  野生型   303+/-364
IV.
材料与方法
为评价NKT细胞在GVHD中假定的保护作用，将数量增加的NKT淋巴细胞(0-4.5×106个细胞)过继转移给移植了NKT消除的脾细胞的小鼠。追踪受者小鼠的GVHD相关的肝脏、肠和皮肤损伤的组织学参数。为测定NKT细胞介导的免疫调节的机理和肝脏在耐受诱导中的作用，分离肝内和脾内淋巴细胞，通过FACS分析CD4+和CD8+亚群并检测血清细胞因子水平。
动物
供体小鼠是12周龄的C57BL/6雄性小鼠，购自Jackson Laboratories(AnneHarbor，ME)。受者小鼠是(C57BL/6×Balb/c)F1雌性小鼠。小鼠在Hadassah-Hebrew大学医学院的动物中心保持白天-夜晚各12小时周期。所有的动物喂食常规实验室食物并随意饮水。所有动物实验得到照料和使用实验室动物Hebrew大学-Hadassah学术委员会的批准。照射和脾细胞移植后小鼠养在层流隔离间里。
分离淋巴细胞和NKT细胞
收集供体C57BL小鼠脾脏，制备脾细胞。除去结缔组织后，将脾脏置于10ml装有冷无菌PBS的平皿中并用不锈钢筛网(孔径60，Sigma Chemical Co.，St.LouisMO)碾碎。为分离淋巴细胞，在50ml试管中将20ml的histopague1077(SigmaDiagnostics，St.Louis，MO)置于悬浮于7ml PBS中的细胞下面。收集位于界面处的细胞，稀释入50ml试管并用冰冷却的PBS洗涤两次(1,250rpm，10分钟)。每个小鼠约回收到1×108个细胞。用包有特异性抗-DX5的微珠(Miltenyl Biotec，德国)进行磁性细胞分选(MACS)分离得到NKT细胞。
脾细胞移植
为诱导GVHD，C57BL/6供体小鼠的2×107个脾细胞经静脉内注射入(C57BL/6×Balb/c)F1受者小鼠。移植前，给予小鼠60Co全身照射(7Gy)。
实验组(n＝8只小鼠/细)
为评价NKT细胞在GVHD中假定的保护作用，进行数量增加的NKT淋巴细胞的过继转移。A组小鼠移植全脾细胞，B组小鼠移植NKT消除的脾细胞；C、D和E组小鼠移植NKT消除的脾细胞，其中分别加入了0.5、2.5和4.5×106个NKT细胞。F组未经脾细胞移植。
GVHD组织学变化的分级
为评价表皮、肝脏和肠道炎症的程度，切取所有组小鼠的组织并保存于10％甲醛中。每只小鼠的5份组织切片用石蜡包埋，切片，通过标准方法用苏木精-曙红染色并由不了解实验状况的有经验病理学家检查。
流式细胞术分析测定CD4+、CD8+T淋巴细胞
淋巴细胞分离后取一式三份2-5×106个细胞/500μλPBS立即放入Falcon 2052试管与4ml 1％PBS孵育10分钟并以1400rpm离心5分钟。细胞重悬于10μλ含有1∶20 FITC-抗小鼠CD4和CD8抗体(Pharmingen，USA)的FCS中并每隔10分钟搅拌一次，共30分钟。细胞用I％BSA洗涤两次并维持于4℃直至读数。使用荧光激活细胞分选仪(FACSTAR plus，Becton Dickinson)对各组的1×104个细胞进行分析性细胞分选。仅计数活细胞，没有抗体处理的淋巴细胞的背景荧光从获得的水平中扣除。闸门设置为正向-散射和侧面-散射以排除死细胞和红血球。用Consort 30双色轮廓图程序(Becton Dickinson，Oxnard，CA)或CELLQuest程序分析所得数据。
检测细胞因子水平
对所有组小鼠采血并以14,000rpm离心。使用Genzyme诊断试剂盒(GenzymeDiagnostics，MA，USA)通过“夹心”ELISA检测血清IFNγ、TNFα、IL-10和IL-12水平。
统计学分析
结果经Student t检验(双尾(two-tailed))分析。
NKT细胞的过继转移对GVHD相关组织损伤的作用：
实施例1
皮肤GVHD的缓解
对所有组小鼠进行皮肤活体检查。GVHD患者的表皮显示基底细胞层呈弥散的空泡状，海绵状和角化不良的角化细胞与表皮下裂隙形成；形态学变化的特征为II级急性GVHD。有时，观察到与III-IV级急性GVHD相对应的表皮下裂隙形成和表皮病灶性完全丧失。NKT细胞的过继转移减轻了这些改变。
实施例2
缓解小肠GVHD
对所有组小鼠进行小肠活体检查。在移植NKT细胞的小鼠中观察到所有GVHD相关组织学参数有显著减轻。在对照组中，许多腺管中观察到特征为I级急性GVHD的凋亡小体(单个细胞坏死)。在一些样品中，肠腺管中存在相应于II级急性GVHD坏死的碎片。
实施例3
缓解GVHD相关肝病
在移植了NKT细胞的小鼠中观察到轻度门静脉炎症、淋巴细胞渗出和肝内胆管破坏。相反，NKT消除的小鼠发生了伴有内皮炎症的严重非化脓胆管炎；内皮炎是静脉内皮破坏、淋巴细胞渗出和剥落损伤的证据。
实施例4
NKT细胞过继转移对GVHD相关死亡率的作用
4.5×106个NKT细胞的过继转移显著提高了存活率(第28天的存活率为85％)。相反，NKT细胞消除导致较高的死亡率(第14天死亡率是100％)。注意到(存活率)与移植的NKT细胞数量直接相关(移植4.5×106个NKT细胞作用最大)。这些结果示于图8。
实施例5
NKT细胞过继转移对作为外周耐受诱导衡量度的肝内CD8淋巴细胞捕获的作 用
与NKT细胞消除的小鼠相比，移植1.5×106个NKT细胞的小鼠外周CD4/CD8比例增加2.26倍同时肝内CD4/CD8比例减少16倍证实耐受诱导与CD8淋巴细胞的肝内捕获相关(p＜0.05)。这些结果示于图9和图10。
实施例6
NKT细胞的过继转移对血清细胞因子的作用
与NKT细胞消除动物相比，移植1.5×106个NKT细胞的耐受小鼠血清IL-12水平显著较低(52pg/ml对735pg/ml)，血清IL-10水平显著较高(112pg/ml对50pg/ml)。血清IFNγ和TNFα水平在各组之间无明显区别。这些结果示于图11和图12。
结论
过继转移4.5×106个NKT细胞显著缓解GVHD相关的肝脏、肠和皮肤损伤。相反，NKT细胞消除导致严重的GVHD相关的多器官损伤。
移植少量调节性NKT细胞通过帮助产生移植物-宿主耐受导致缓解GVHD相关的肝脏、肠和皮肤损伤。该作用与其调节效应细胞亚组和血清细胞因子转向Th2型免疫应答相关。肝脏经淋巴细胞捕获在耐受诱导中起重要作用。NKT细胞移植是GVHD的一种新颖治疗方法，很有希望。

Claims (6)

1.经肝细胞癌裂解物体外驯化的自体、异种、同源或非自体NKT细胞在制备治疗肝细胞癌用的药物中的用途。
2.经肝细胞癌裂解物体外驯化的NKT细胞在制备患肝细胞癌的哺乳动物用的治疗性组合物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述细胞对于所述哺乳动物而言是自体的。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述细胞对于所述哺乳动物而言是同源的。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述细胞对于所述哺乳动物而言是异种的。
6.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述细胞对于所述哺乳动物而言是非自体的。
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