CN113293138A - 经修饰的自然杀伤细胞、医药组合物、其制备方法及其使用方法 - Google Patents

经修饰的自然杀伤细胞、医药组合物、其制备方法及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本公开内容提供具有自然杀伤(natural killer，NK)细胞功能与树突细胞功能的经修饰的自然杀伤细胞及其培养方法。通过施用该经修饰的自然杀伤细胞，可细胞调节的免疫作用有效地抑制受试者的癌细胞。

Description

经修饰的自然杀伤细胞、医药组合物、其制备方法及其使用 方法
技术领域
本公开内容涉及经修饰的自然杀伤(natural killer，NK)细胞及包含该经修饰的自然杀伤细胞的医药组合物。还提供了鉴定该经修饰的自然杀伤细胞以及培养该经修饰的自然杀伤细胞的方法。
背景技术
免疫监视对癌症具有相当重要的作用，且代表一种非常有吸引力的治疗方法，特别是鉴于传统手术、放射线以及化学疗法在癌症管理中的许多缺点。
人体抵抗癌症的第一道防线为自然杀伤(NK)细胞，其表型为CD3-CD14-CD19-CD56+CD16+NGK2D+CD11cdimHLA-DR-CD86-CD83-。自然杀伤细胞为细胞毒性淋巴细胞，可主动扫描人体中的异常细胞，并在其发展为真正的癌细胞之前将其破坏。自然杀伤细胞在人体中巡逻时，它们会利用其一系列活化及抑制表面受体与多种类型的细胞相互作用。大多数癌细胞与自然杀伤细胞的活化受体结合，进而触发其自然杀伤反应。
由于仍然没有满足有效治疗及/或预防癌症的需求，这些发现为开发针对癌细胞的基于自然杀伤细胞的疗法以及产生更多的用于临床应用的具有治疗能力的自然杀伤细胞的培养方法提供理论依据。本公开内容提供具有独特表型的经修饰的自然杀伤细胞，以满足这些及其他需求。该细胞可用于自体疗法或非自体疗法。
发明内容
鉴于本领域的迫切需要，本文提供在癌症治疗中安全有效的经修饰的自然杀伤(NK)细胞以及包含所述细胞的医药组合物。
在一个实施方式中，本公开内容提供了包含CD45+CD3-CD19-CD14-表型的经修饰的自然杀伤细胞。在优选的实施方式中，该经修饰的自然杀伤细胞可进一步包含CD56hiCD16dimNKG2D+CD11c+CD86+HLA-DR+CD83-HLA-ABC+的表型，亦即该经修饰的自然杀伤细胞可包含CD45+CD3-CD19-CD14-CD56hiCD16dimNKG2D+CD11c+CD86+HLA-DR+CD83-HLA-ABC+的表型。
某些实施方式提供医药组合物，包含本文所述的经修饰的自然杀伤细胞以及医药上可接受的载体或赋形剂。
某些实施方式提供一种治疗癌细胞的方法，包含对有此需要的受试者施用有效量的本文所述的经修饰的自然杀伤细胞或医药组合物。
某些实施方式提供经修饰的自然杀伤细胞或医药组合物在制备用于治疗癌细胞的药物中的用途，其中所述治疗包含对有此需要的受试者施用包含有效量的本文所述的经修饰的自然杀伤细胞或医药组合物的药物。
在优选的实施方式中，所述有效量可为每剂量约1×103至约1×109个细胞。
在优选的实施方式中，所述经修饰的自然杀伤细胞可为自体的或同种异体的。
在优选的实施方式中，所述经修饰的自然杀伤细胞可衍生自外周血、脐带血，或骨髓。
在优选的实施方式中，所述方法可进一步包含在体外扩增所述经修饰的自然杀伤细胞。
其他实施方式提供一种培养具有自然杀伤细胞功能以及树突细胞功能的经修饰的自然杀伤细胞的方法，包含
获得包含单核细胞的体液；
使所述单核细胞与包含IL-15、IL-12，以及IL-18的第一培养基接触以获得培养的细胞群；以及
从所述培养的细胞群中分离出具有CD3-CD19-CD14-CD56hiCD16dimNKG2D+CD11c+CD86+HLA-DR+CD83-表型的该经修饰的自然杀伤细胞。
在优选的实施方式中，所述单核细胞可衍生自外周血、脐带血或骨髓。
在优选的实施方式中，所述第一培养基可进一步包含：造血细胞培养基，优选地，AIM-V培养基。
在优选的实施方式中，所述第一培养基可进一步包含：血清蛋白，优选地，人类血小板裂解物。
在优选的实施方式中，所述单核细胞可与所述第一培养基接触约1至6天。
在优选的实施方式中，所述方法可进一步包含在与所述第一培养基接触后，将所述培养的细胞群与包含IL-15以及IL-12的第二培养基接触。
在优选的实施方式中，所述第二培养基可进一步包含：造血细胞培养基，优选地，AIM-V培养基。
在优选的实施方式中，所述第二培养基可进一步包含：血清蛋白，优选地，人类血小板裂解物。
在优选的实施方式中，所述培养的细胞群可与所述第二培养基接触约1至6天。
在优选的实施方式中，所述方法可进一步包含在与所述第一培养基接触之前，对具有CD3-CD14-CD19-表型的细胞，负选择所述单核细胞。
本文所述的培养方法允许从固定量的样品，例如10mL血液中分离更多数量的经修饰的自然杀伤细胞。
附图说明
以下为本公开内容各示例性实施方式的详细说明，并请参阅下列附图：
图1A说明以各种培养基培养的经修饰的自然杀伤细胞的细胞数。图1B及1C说明以各种培养基培养的用于表达NKG2D、CD45、CD16、CD56、CD3、CD14、CD19、CD86、CD83、CD11c，以及HLA-ABC的经修饰的自然杀伤细胞的流式细胞仪分析图像的集合。
图2A说明从各种初始细胞培养的用于表达CD45、CD3、CD14，以及CD19的经修饰的自然杀伤细胞的流式细胞仪分析图像的集合。图2B及2C分别说明从各种初始细胞培养的针对NK表型以及DC表型的经修饰的自然杀伤细胞的流式细胞仪分析图像的集合。
图3A说明在有或没有IFN-γ的情况下培养的用于表达CD45、CD3、CD14，以及CD19的经修饰的自然杀伤细胞的流式细胞仪分析图像的集合。图3B及3C分别说明在有或没有IFN-γ的情况下针对NK表型及DC表型培养的经修饰的自然杀伤细胞的流式细胞仪分析图像的集合。
图4A说明在各种IL-12暴露时间下培养的经修饰的自然杀伤细胞的细胞数。图4B及4C分别说明以各种IL-12暴露时间培养的自然杀伤细胞表型及树突细胞表型的经修饰的自然杀伤细胞的流式细胞仪分析图像的集合。图4D为流式细胞仪图像的集合，说明了该经修饰的自然杀伤细胞的细胞毒性。图4E为细胞分裂的流式细胞仪分析的集合，说明了经修饰的自然杀伤细胞对T淋巴细胞增殖的抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)活性。
图5A说明以各种IL-18暴露浓度培养的经修饰的自然杀伤细胞的细胞数。图5B说明在第3天上调经修饰的自然杀伤细胞的CD25、HLA-DR，以及CD86的表达的流式细胞仪分析图像的集合。图5C说明在第12天下调经修饰的自然杀伤细胞的HLA-DR及CD86的流式细胞仪分析图像的集合。图5D为流式细胞仪图像的集合，说明以IL-18培养的经修饰的自然杀伤细胞的细胞毒性。图5E为细胞分裂的流式细胞仪分析的集合，说明以IL-18培养的经修饰的自然杀伤细胞对T淋巴细胞增殖的APC活性。
图6A说明在各种IL-18暴露时间下培养的经修饰的自然杀伤细胞的细胞数。图6B为流式细胞仪图像的集合，说明在各种IL-18暴露时间下培养的经修饰的自然杀伤细胞的细胞毒性。图6C为细胞分裂的流式细胞仪分析的集合，说明在各种IL-18暴露时间下培养的经修饰的自然杀伤细胞对T淋巴细胞增殖的APC活性。
图7为培养经修饰的自然杀伤细胞的方法的实施方式的流程图。
图8为根据本发明的实施方式的经修饰的自然杀伤细胞的表型分析。
图9A说明根据本发明的实施方式的由经修饰的自然杀伤细胞调节的细胞毒性。图9B说明根据本发明的实施方式的由经修饰的自然杀伤细胞调节的APC活性。
发明详述
本公开内容的前述及其他方面现将更详细地描述关于本文所述的其他实施方式。应当理解的是，本发明可以不同的形式实施，且不应被解释为限于本文阐述的实施方式。而是提供这些实施方式使本发明的阐述彻底且完整，并将向本发明所属领域的一般技术人员充分传达本发明的范围。
在本公开内容的描述中使用的术语仅出于描述特定实施方式的目的，而无意限制本发明。如在本公开内容的说明书及权利要求书中所使用的，单数形式的“一”、“一个”以及“该/所述”也意图包含复数形式，除非上下文另有明确指出。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”、“特征在于”或其任何其他变型，目的在于非排他性的涵盖，除非受明确指出的任何限制。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、程序或方法不一定仅限于那些元素，而是可包含未明确列出的或这些组合物、混合物、程序或方法所固有的其他元素。
连接短语“由…组成”不包含任何未指定的元素、步骤或成分。若用于权利要求书中，则这将使权利要求范围限于所列举的材料，除了通常与之相关的杂质除外。当在权利要求的主体中出现短语“由…组成”时，而非紧接在序言之后时，这仅限制该子句中列出的元素；整体上，其他要素并不排除在该权利要求的范围内。
当申请人已经以例如“包含”之类的开放式术语定义发明或其部分，应该容易理解(除非另有说明)，该描述应解释为也还使用了术语“由…组成”来描述该发明。
本文中的所有数字可被理解为由“约”所修饰。如本文所用，术语“约”用于指示数值包含例如测量设备、用于确定该数值的方法的误差的固有变化，或研究对象之间存在的变化。通常，根据情况，该术语目的在于涵盖大约或少于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％，15％，16％，17％，18％，19％，或20％的变异度。
除非明确指出仅指替代方案或替代方案是互斥的，否则权利要求中的术语“或”的使用是指“及/或”，尽管本公开内容支持仅提及的替代方案以及“及/或”的定义。
如本文所用，“受试者”是指动物，包含例如被诊断患有或怀疑患有或正在发展癌症的哺乳动物受试者。在一个实施方式中，术语“受试者”可以指患有癌症的脊椎动物或被认为需要进行癌症治疗的脊椎动物。受试者包含温血动物，例如哺乳动物，例如灵长类动物，且优选地为人类。非人类的灵长类动物也是受试者。术语受试者包含家养动物，例如猫、狗、猿等，家畜(例如牛、马、猪、绵羊、山羊等)，以及实验动物(例如小鼠、兔、大鼠、沙鼠、天竺鼠等)。因此，本文涵盖了兽医用途及药物制剂。
本文中，“施用”是指对受试者提供本发明的自然杀伤细胞或医药组合物。举例而非限制，施用可通过肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹腔内、囊内、软骨内、体腔内、颅内、小脑内、脑室内、结肠内、子宫颈管内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊髓内、滑膜内、胸腔内、子宫内、膀胱内、推注、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内以及透皮进行。例如，可通过静脉内(intravenous，i.v.)注射、皮下(sub-cutaneous，s.c.)注射、皮内(intradermal，i.d.)注射、腹膜内(intraperitoneal，i.p.)注射，或肌内(intramuscular，i.m.)注射进行注射。可采用一种或多种这样的途径。肠胃外给药可以是例如通过推注或随时间逐渐灌注。替代地或同时地，可通过口服途径施用。
术语“治疗”的使用在本文中是指对受试者施用自然杀伤细胞或医药组合物，其目的为治愈、减轻、缓解、补救、预防或改善疾病、该疾病的症状、继发于该疾病的疾病状态或对该疾病的易感性。当在权利要求书及/或说明书中使用时，术语“抑制”、“减少”或“预防”或这些术语的任何变化包含任何可测量的降低或完全抑制以达到期望的结果。
可由本发明内容的自然杀伤细胞或医药组合物治疗的“癌症”包含按部位分类的那些，包含口腔及咽(嘴唇、舌头、唾液腺、口底、牙龈及其他口、鼻咽、扁桃体、口咽、下咽，其他口腔/咽)的癌症；消化系统(食道；胃；小肠；结肠及直肠；肛门、肛管，及直肠肛门；肝；肝内胆管；胆囊；其他胆道；胰腺；腹膜后；腹膜、网膜，以及肠系膜；其他消化器官)的癌症；呼吸系统(鼻腔、中耳，以及鼻窦；喉；肺及支气管；胸膜；气管、纵隔，以及其他呼吸道)的癌症；间皮瘤的癌症；骨头及关节；软组织，包含心脏；皮肤癌，包含黑色素瘤及其他非上皮性皮肤癌；卡波西氏肉瘤以及乳癌；女性生殖系统(子宫颈；子宫体；子宫、卵巢；阴道；外阴；以及其他女性生殖器)的癌症；男性生殖系统(前列腺、睾丸、阴茎，以及其他男性生殖器)的癌症；泌尿系统(膀胱；肾及肾盂；输尿管；以及其他尿道)的癌症；眼及眼框癌；脑及神经系统(大脑；以及其他神经系统)的癌症；内分泌系统(甲状腺以及其他内分泌，包含胸腺)的癌症；淋巴瘤(霍奇金氏病以及非霍奇金氏淋巴瘤)、多发性骨髓瘤，以及白血病(淋巴细胞性白血病；骨髓性白血病；单核细胞性白血病；以及其他白血病)。
可作为根据本发明的治疗组合物的合适目标的，按组织学类型分类的其他癌症包含，但不限于，恶性肿瘤；未明确分类(not otherwise specified，NOS)的癌；未分化的癌，未明确分类(NOS)；巨细胞及梭形细胞癌；小细胞癌，未明确分类(NOS)；乳头状癌，未明确分类(NOS)；鳞状细胞癌，未明确分类(NOS)；淋巴上皮癌；基底细胞癌，未明确分类(NOS)；阴唇癌；移行细胞癌，未明确分类(NOS)；乳头状移行细胞癌；腺癌，未明确分类(NOS)；胃泌素瘤，恶性；胆管癌；肝细胞癌，未明确分类(NOS)；合并肝细胞癌及胆管癌；小梁腺癌；腺样囊状癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉；实体癌，未明确分类(NOS)；类癌，恶性；细支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌，未明确分类(NOS)；色母癌；嗜酸癌；嗜氧腺癌；嗜碱性球癌；透明细胞腺癌，未明确分类(NOS)；颗粒细胞癌；滤泡性腺癌，未明确分类(NOS)；乳头状及滤泡性腺癌；非包膜硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜癌；皮肤附器癌；顶分泌腺癌；皮脂腺癌；耳垢腺癌；黏液性表皮性脑膜癌；囊腺癌，未明确分类(NOS)；乳头状囊腺癌，未明确分类(NOS)；乳头状浆液性囊腺癌；黏液性囊腺癌，未明确分类(NOS)；黏液腺癌；戒环细胞癌；浸润性导管癌；髓状癌，未明确分类(NOS)；小叶癌；炎性癌；佩吉特氏病，乳腺；腺泡细胞癌；腺鳞癌；具有鳞状转移瘤的腺癌；胸腺瘤，恶性；卵巢间质肿瘤，恶性；鞘细胞瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；雄胚瘤，恶性；睾丸支持细胞癌；睾丸间质细胞瘤，恶性；脂质细胞瘤，恶性；副神经节瘤，恶性；乳腺旁神经节瘤，恶性；嗜铬细胞瘤；血管肉瘤；恶性黑色素瘤，未明确分类(NOS)；非黑素瘤；浅表扩散黑色素瘤；巨大色素痣中的马里格黑色素瘤；上皮样细胞黑素瘤；蓝色母斑，恶性；肉瘤，未明确分类(NOS)；纤维肉瘤，未明确分类(NOS)；纤维组织细胞瘤，恶性；黏液肉瘤；脂肪肉瘤，未明确分类(NOS)；平滑肌肉瘤，未明确分类(NOS)；横纹肌肉瘤，未明确分类(NOS)；胚胎横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；基质肉瘤，未明确分类(NOS)；混合性肿瘤，恶性，未明确分类(NOS)；苗勒氏混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤：癌肉瘤，未明确分类(NOS)；间皮肉瘤，恶性；睪丸小管卵巢腺瘤，恶性；叶状瘤，恶性；滑膜肉瘤，未明确分类(NOS)；间皮瘤，恶性；精原细胞瘤；胚胎癌，未明确分类(NOS)；畸胎瘤，恶性，未明确分类(NOS)；甲状腺肿样卵巢瘤，恶性；绒毛膜癌；中肾上皮瘤，恶性；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性；卡波西氏肉瘤；血管外皮细胞瘤，恶性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤，未明确分类(NOS)；近皮质骨肉瘤；软骨肉瘤，未明确分类(NOS)；软骨母细胞瘤，恶性；间质软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因氏肉瘤；齿源性肿瘤，恶性；釉质母细胞骨肉瘤；成釉细胞瘤，恶性；釉质母细胞纤维肉瘤；松果体瘤，恶性；脊索瘤；胶质瘤，恶性；室管膜瘤，未明确分类(NOS)；星状细胞瘤，未明确分类(NOS)；原生质星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤，未明确分类(NOS)；寡树突神经胶细胞瘤，未明确分类(NOS)；寡树突神经胶质母细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤，未明确分类(NOS)；神经节神经母细胞瘤；神经母细胞瘤，未明确分类(NOS)；视网膜母细胞瘤，未明确分类(NOS)；嗅觉神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性；神经纤维肉瘤；神经性瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；恶性淋巴瘤，未明确分类(NOS)；霍奇金氏病，未明确分类(NOS)；霍奇金氏类肉芽肿，未明确分类(NOS)；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞；恶性淋巴瘤，大细胞，弥漫性；恶性淋巴瘤，滤泡性，未明确分类(NOS)；蕈状肉芽肿；其他指定的非霍奇金氏淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病，未明确分类(NOS)；淋巴白血病，未明确分类(NOS)；浆细胞白血病；红血球性白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；骨髓性白血病，未明确分类(NOS)；嗜碱性球白血病；嗜酸性球白血病；单核细胞白血病，未明确分类(NOS)；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；髓样肉瘤；以及毛细胞白血病。
如本文所用，“有效量”是指足以减少癌症的症状以及体征的该经修饰的自然杀伤细胞或医药组合物的剂量，症状以及体征包含但不限于，体重减轻，疼痛或肿瘤块，其为在临床上可触知的团块或通过各种影像方法在放射学上可检测到。
在某些实施方式中，期望限制、减小，或改善肿瘤或癌症病变的大小。施用途径自然会随要标靶的病变或部位的位置及性质而变化，且包含例如局部的、肠胃外、静脉内、肌肉内及/或全身性施用及制剂。针对目标区域，特别考虑直接注射到器官或组织中或从器官或组织或从中注射到脉管系统或血管中。局部、区域或系统性施用也可能是适当的。
在本公开中，使用FACS/流式细胞仪分析的细胞表面抗原的表达水平或表面密度定义于表1中。表1中对各种表达水平的解释为定义细胞表面抗原表达水平的一个实例。应当注意的是，流式细胞仪信号强度随以下因素而变化：流式细胞仪，软件，以及所使用的不同批次的抗体。
表1
符号 解释
- 流式细胞仪信号强度小于或等于10<sup>0</sup>(即1)
+(dim) 流式细胞仪信号强度介于10<sup>0</sup>至10<sup>1</sup>之间
+ 流式细胞仪信号强度介于10<sup>1</sup>至10<sup>2</sup>之间
+(hi) 流式细胞仪信号强度大于或等于10<sup>2</sup>
除非另有定义，否则本文所用的所有技术及科学术语具有与本发明所属技术领域的一般技术人员通常所理解的相同含义。本文引用的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献通过全文引入作为参考，以用于与其中存在该参考文献的句子及/或段落有关的教导。
经修饰的自然杀伤细胞
天然存在或常规自然杀伤细胞具有CD16+CD56+表型。在一个实施方式中，天然存在或常规的自然杀伤细胞具有CD3-CD14-CD19-CD56+CD16+NKG2D+CD11cdim表型，如表2所示。
在一个实施方式中，本发明内容提供了一种经修饰的自然杀伤细胞，包含CD3-CD19-CD14-CD56hiCD16dimNKG2D+CD11c+CD86+HLA-DR+CD83-细胞表型，如表2所示。本发明的经修饰的自然杀伤细胞为非天然存在的。经修饰的自然杀伤细胞包含一种或多种完全活化的树突(dendritic，DC)细胞表面抗原(例如，HLA-DR以及CD86)，并且具有自然杀伤细胞功能以及树突细胞功能以及增强的抗癌活性。
表2.常规自然杀伤细胞以及经修饰的自然杀伤细胞的表型比较
常规自然杀伤细胞 经修饰的自然杀伤细胞
CD3 - -
CD14 - -
CD19 - -
CD56 + hi
CD16 + dim
NKG2D + +
CD11c dim +
HLA-DR - +
CD86 - +
CD83 - -
具体而言，本发明内容提供一种包含CD16dimCD56hi表型的经修饰的自然杀伤细胞，其中该CD16dimCD56hi自然杀伤细胞不含CD83细胞表面抗原(具有CD16dimCD56hiCD83-的表型)。
WO2015/100495公开一种包含CD3-CD19-CD14-CD56+CD16+NKG2D+CD11c-CD86+HLA-DR+CD83+表型的经修饰的自然杀伤细胞。相较于WO2015/100495的经修饰的自然杀伤细胞，本发明内容的经修饰的自然杀伤细胞具有一般的树突细胞表面抗原CD11c，但缺乏完全活化的树突细胞表面抗原CD83。无论如何，本发明内容的经修饰的自然杀伤细胞具有更高且更强的树突细胞功能，例如，抗原呈递，较WO2015/100495的修饰自然杀伤细胞高出66％。
在一个实施方式中，通过将经修饰的自然杀伤细胞暴露于荧光染料标记的特异性抗人类单株抗体(例如，CD86-PE(Beckman Coulter公司；型号：IM2729U)或抗人类CD83-PE-Cy5(BioLegend公司；型号：305310)来定量细胞表面抗原的表达水平或表面密度，然后使用流式细胞仪(例如Navios，可购自Beckman Coulter公司，美国)对经修饰的自然杀伤细胞进行分选。
经修饰的自然杀伤细胞可由单一个体产生，例如，自体的或同种的。
医药组合物
在一个实施方式中，本发明内容提供一种医药组合物，包含本文所述的经修饰的自然杀伤细胞以及医药上可接受的载体或赋形剂。
本发明内容还提供一种抑制癌细胞的方法，通过对有此需要的受试者施用有效抑制癌细胞的量的本发明的经修饰的自然杀伤细胞或本发明的医药组合物。不受任何特定理论的束缚，据信经修饰的自然杀伤细胞通过一种或多种自然杀伤细胞/树突细胞功能抑制癌细胞：增强细胞毒性、刺激癌症特异性T淋巴细胞增殖，或IFN-γ分泌。
所述医药组合物或经修饰的自然杀伤细胞的施用途径包含但不限于静脉内、肌内、皮下、口服、局部、皮内、透皮、表皮下、肠胃外、直肠、脊柱或表皮施用。在一个实施方式中，该经修饰的自然杀伤细胞通过静脉内注射或输注施用。
本发明的医药组合物可制备为注射剂，可为液体溶液或悬浮液，也可为适合于在注射前在液体载体中溶解或悬浮的固体形式。
将本发明的经修饰的自然杀伤细胞配制为医药组合物，以递送至哺乳动物受试者。该医药组合物可以单独给药及/或与医药上可接受的载剂、赋形剂或载体混合。合适的载剂为，例如，盐水(例如，生理盐水)、右旋糖、甘油、血小板富集的血浆(platelet-richplasma，PRP)等，以及它们的组合。此外，该载剂可包含少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂或佐剂。医药上可接受的载体可包含生理上可接受的化合物，其具有例如稳定或增加或降低本发明的医药组合物的吸收或清除速率的作用。生理上可接受的化合物可包含例如碳水化合物(如葡萄糖、蔗糖或葡聚醣)、抗氧化剂(如抗坏血酸或麸胱甘肽)、螯合剂、低分子量蛋白质、清洁剂、脂质体载体，或赋形剂或其他稳定剂及/或缓冲剂。其他生理上可接受的化合物包含湿润剂、乳化剂、分散剂或防腐剂。参见，例如，雷明顿氏医药科学(Remington's Pharmaceutical Science)，第21版，Mack出版公司，伊斯顿，宾州(“雷明顿氏”)。本发明的医药组合物还可包含辅助物质，例如药理剂、细胞激素，或其他生物反应调节剂。
制备此类剂型的实际方法对于本发明所属领域中的一般技术人员而言为已知的或显而易见的。参见，例如，Remington's Pharmaceutical Science，第21版，Mack出版公司，伊斯顿，宾州。
本发明的经修饰的自然杀伤细胞或医药组合物可按照适合受试者的年龄、体重以及状况、所使用的特定组合物以及施用的途径，以时间表和一段时间以单剂量治疗或多剂量治疗进行施用，无论本发明的经修饰的自然杀伤细胞还是医药组合物是用于预防或治疗目的等。例如，在一个实施方式中，根据本发明的经修饰的自然杀伤细胞或医药组合物每月一次、每月两次、每月三次、隔周一次(every other week，qow)、每周一次(once per week，qw)、每周二次(twice per week，biw)、每周三次(three times per week，tiw)、每周四次(four times per week，qiw)、每周五次、每周六次、隔日一次(every other day，qod)、每日一次(daily，qd)，一天二次(twice a day，bid)、一天三次(three times a day，tid)，或一天四次(four times a day，qid)。
根据本发明的经修饰的自然杀伤细胞或医药组合物的治疗持续时间，例如施用该经修饰的自然杀伤细胞或医药组合物的时间段，可根据多种因素中的任何因素而变化，例如，受试者的反应等。例如，该经修饰的自然杀伤细胞或医药组合物可在约一或数秒至一或数分钟、一或数小时至一天至约一周、自大约两周至大约四周、自大约一个月至大约两个月、自大约两个月至大约四个月、自大约四个月至大约六个月、自大约六个月至大约八个月、自大约八个月至大约一年、自大约1年至大约2年、或自大约2年至大约4年，或更长的一段时间内施用。
以剂量单位形式配制肠胃外医药组合物或经修饰的自然杀伤细胞是有利的，以易于给药及剂量均匀。如本文所用，剂量单位形式是指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单元包含预定量的经修饰的自然杀伤细胞，经计算可与所需的医药载体结合产生所需的治疗效果。
自细胞培养测定法以及动物研究中获得的数据可用于配制用于人类的剂量范围。在一个实施方式中，这种自然杀伤细胞的剂量在包含很少或没有毒性的ED50在内的循环浓度范围内。剂量可在该范围内变化，这取决于所采用的剂型及所采用的给药途径。在另一实施方式中，治疗有效剂量可以最初从细胞培养测定中估计。可在动物模型中制定剂量，以达到包含细胞培养中确定的IC50(亦即，达到症状最大抑制一半的经修饰自然杀伤细胞浓度)在内的循环血浆浓度范围。Sonderstrup,Springer,Sem.Immunopathol 25：35-45，2003年。Nikula等人，Inhal.Toxicol.4(12):123-53，2000年。
将医药组合物配制成含有有效量的经修饰的自然杀伤细胞，其中该量取决于待治疗的动物及待治疗的状况。任何特定受试者的特定剂量取决于多种因素，包含特定经修饰的自然杀伤细胞的活性、年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径，以及排泄率、药物组合以及接受治疗的特定疾病的严重程度。治疗或预防有效量的经修饰的自然杀伤细胞的示例性的非限制性范围为每剂至少约1×103个细胞至每剂约1×109个细胞。其他剂量也是可能的，包含，但不限于每剂量1×104、1×105、1×106、1×107、1×108，或1×109个细胞。
经修饰的自然杀伤细胞或医药组合物可单独施用或与另一种治疗剂联合施用，例如化学疗法、放射疗法，或标靶治疗，或癌症疫苗。
鉴定及培养经修饰的自然杀伤细胞的方法
在一个实施方式中，鉴定初始自然杀伤细胞及培养经修饰的自然杀伤细胞的方法如图7所示。简言之，该方法至少包含以下步骤：获得含有单核细胞的体液；使该单核细胞与包含IL-15、IL-12，以及IL-18的第一培养基接触以获得培养的细胞群；以及以细胞标记CD3-CD19-CD14-CD56hiCD16dimNKG2D+CD11c+CD86+HLA-DR+CD83-从该培养的细胞群中分离出同时具有自然杀伤细胞功能以及树突细胞功能的自然杀伤细胞。
优选地，本文用于筛选或产生经修饰的自然杀伤细胞的单核细胞为纯化的CD3-CD14-CD19-单核细胞，作为扩增培养的初始细胞群。
在一个实施方式中，获得高度纯化的CD3-CD14-CD19-单核细胞部分的鉴定/去除步骤如下：
(a)从受试者收集取得样品。该样品包含，但不限于，含有一种或多种单核细胞的任何体液，例如外周血、脐带血，或骨髓样品。
(b)通过离心(Ficoll-PaqueTM PREMIUM，GE Healthcare公司，美国)，将步骤(a)中样品中的单核细胞与其他类型的血细胞分离。分离单核细胞的其他方法对于本发明所属领域中的一般技术人员而言为已知的或显而易见的。
(c)在步骤(b)中，从其他单核细胞中耗竭一个或多个包含CD3细胞表面抗原(例如，单核细胞表型CD3+CD56-以及CD3+CD56+)、CD14细胞表面抗原或CD19细胞表面抗原的单核细胞，例如，通过MACS分选(Mitenyi Biotec公司，德国)。
(d)在步骤(c)中收集CD3-CD14-CD19-单核细胞进行培养。
本发明的一个实施方式提供用于从样品中鉴定初始细胞的方法，包含从该样品中除去含以下一种或多种细胞表面抗原的单核细胞：CD3、CD14或CD19，其中该初始细胞基本上不含一种或多种选自CD3、CD14以及CD19的细胞表面抗原。
在一个实施方式中，在样品中将步骤(b)中包含CD3的单核细胞除去。在另一实施方式中，在样品中将步骤(b)中包含CD14的单核细胞除去。在又一实施方式中，在样品中将步骤(b)中包含CD19的单核细胞除去。在又一实施方式中，在样品中将步骤(b)中一或多个包含CD14的单核细胞以及一或多个包含CD3的单核细胞除去。在又一实施方式中，在样品中将步骤(b)中一或多个包含CD14的单核细胞以及一或多个包含CD19的单核细胞除去。在又一实施方式中，在样品中将步骤(b)中一或多个包含CD19的单核细胞以及一或多个包含CD3的单核细胞除去。在又一实施方式中，在样品中将步骤(b)中一或多个包含CD19的单核细胞、一或多个包含CD3的单核细胞，以及一或多个包含CD14的单核细胞除去。
在一个实施方式中，该样品中基本上除去了所有包含CD3的单核细胞。在另一实施方式中，该样品中基本上除去了所有包含CD14的单核细胞。在又一实施方式中，该样品中基本上除去了所有包含CD19的单核细胞。
在一个实施方式中，用于培养细胞的组合物还包含IFN-γ。在一个替代实施方式中，用于培养细胞的组合物不包含IFN-γ。在该实施方式中，IFN-γ对本文所公开的经修饰的自然杀伤细胞的产生几乎没有影响。
包含IL-12的组合物的培养时间对于经修饰的自然杀伤细胞的功能可能是关键的。在一个实施方式中，单核细胞可与IL-12，例如，人类IL-12，一起培养1至12天，优选地1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12天，以产生经修饰的自然杀伤细胞。在一个实施方式中，以IL-12培养3、6、9或12天的单核细胞产生具有相似的细胞产量及表型模式的经修饰的自然杀伤细胞。在另一实施方式中，延长IL-12的暴露时间，例如12天，相较于暴露在IL-12的时间较短的细胞，例如9天，培养细胞的细胞毒性及抗原呈递细胞活性增加。
在一个实施方式中，用于培养细胞的组合物还包含IL-18。在一个实施方式中，IL-18的有效浓度为约1至300ng/mL，例如50、100、150、200、250、300ng/mL。在另一实施方式中，IL-18的有效浓度为约10至约250ng/mL，或两者之间的任何数值或以10ng/mL增量的数值范围(例如，约30ng/mL，约220ng/mL等)。
在另一实施方式中，IL-18对经修饰的自然杀伤细胞的表型及功能活性产生影响。长期暴露IL-18可能对细胞大小、表型以及功能活性有相反的影响。在一个实施方式中，单核细胞可与IL-18，例如人类IL-18，一起培养1至12天，优选地1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11，或12天，以产生经修饰的自然杀伤细胞。在一个实施方式中，与IL-18一起培养3、6、9或12天的单核细胞产生具有各种表型的经修饰的自然杀伤细胞。在另一实施方式中，充分暴露在IL-18，例如6天，相较于暴露在IL-18的时间较短的细胞，例如6天，对该经修饰的自然杀伤细胞的细胞大小、表型以及功能可能具有相反的影响。
在一个实施方式中，高度纯化的CD3-CD14-CD19-单核细胞的部分与包含IL-18、IL-15及/或IL-12的培养组合物接触。在另一实施方式中，将步骤(c)中的CD3-CD14-CD19-单核细胞与基本上由造血细胞培养基(例如，X-vivo 20)、IL-18、IL-15、IL-12，以及血清蛋白(例如，人类血小板裂解物)所组成的组合物混合。在另一实施方式中，将步骤(c)中的CD3-CD14-CD19-单核细胞与基本上由X-vivo 20、IL-18、IL-15、IL-12以及人类血小板裂解物所组成的组合物混合。
在另一实施方式中，该组合物还包含造血细胞培养基。该造血细胞培养基的非限制性实例包含X-vivo 10、X-vivo 15、X-vivo 20(可购自Lonza公司，瑞士)以及AIM-V(可购自ThermoFisher Scientific公司，美国)。
在另一实施方式中，该组合物还包含血清蛋白，例如人类血小板裂解物。在本发明中，“血清蛋白”为存在于血液或血浆中的蛋白，其具有许多不同的功能，包含运输及调节细胞活性。血清蛋白的非限制性实例包含酵素、补体成分、蛋白酶抑制剂、激肽前驱物、血清白蛋白、球蛋白，以及纤维蛋白原等。
用于培养细胞的组合物的非限制性实例包含(a)造血细胞培养基+IL-15+IL-18；(b)造血细胞培养基+IL-12+IL-18；(c)造血细胞培养基+IL-15+IL-12+IL-18；(d)X-vivo20+IL-15+IL-18；(e)X-vivo 20+IL-12+IL-18；(f)X-vivo 20+IL-15+IL-12+IL-18；(g)AIM-V+IL-15+IL-18；(h)AIM-V+IL-12+IL-18；(i)AIM-V+IL-15+IL-12+IL-18；(j)造血细胞培养基+IL-15+IL-18+血清蛋白；(k)造血细胞培养基+IL-12+IL-18+血清蛋白；(l)造血细胞培养基+IL-15+IL-12+IL-18+血清蛋白；(m)X-vivo 20+IL-15+IL-18+血清蛋白；(n)X-vivo 20+IL-12+IL-18+血清蛋白；(o)X-vivo 20+IL-15+IL-12+IL-18+血清蛋白；(p)AIM-V+IL-15+IL-18+血清蛋白；(q)AIM-V+IL-12+IL-18+血清蛋白；以及(r)AIM-V+IL-15+IL-12+IL-18+血清蛋白。
在一个实施方式中，该组合物用于在37℃、5％CO2存在下培养该经修饰的自然杀伤细胞。
根据本发明内容的某些实施方式的组合物增强了该经修饰的自然杀伤细胞的增殖。在一个实施方式中，该组合物基本上增强了该经修饰的自然杀伤细胞上CD11c细胞表面抗原的表达。在另一实施方式中，该组合物在该经修饰的自然杀伤细胞上增强了完全活化的树突细胞标记物例如HLA-DR以及CD86细胞表面抗原的表达，但不增强CD83细胞表面抗原的表达。经由FACS通过CD3-CD14-CD19-细胞的纯度及活菌数确定经修饰的自然杀伤细胞的增殖速率。细胞增殖的其他测定法为本领域公知的，例如选殖株形成测定法(clonogenicassay)、代谢测定法以及直接增殖测定法。
CD3-CD14-CD19-单核细胞与组合物的接触时间的示例性非限制性范围为自约1分钟至约1小时，自大约1小时至约24小时，自约1天至约3天，自约1天至约6天，自约1天至约9天，自约1天至约12天，自约3天至约6天，自约3天至约9天，自约3天至约12天，自约6天至约9天，自约6天至约12天，或至少1天。在一个实施方式中，接触时间为约3天。在另一实施方式中，接触时间为约6天。
在一个实施方式中，该CD3-CD14-CD19-单核细胞与包含IL-15、IL-12，以及IL-18的第一组合物接触；然后与包含IL-15以及IL-12的第二组合物接触。在另一实施方式中，该第一及第二组合物还包含造血细胞培养基(如AIM-V或X-vivo)及/或血清蛋白(例如人类血小板裂解物)。
提供以下用于实施本发明的方面的实施方式，仅用于说明目的，而无意以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1：培养基的选择
将CD3-CD14-CD19-单核细胞在含有30ng/mL人类重组IL-15(hIL-15)、3ng/mL人类重组IL-12(hIL-12)、60ng/mL人类重组IL-2(hIL-2)、37.5ng/mL人类重组IL-18(hIL-18)，以及可选的4％(w/w)人类血小板裂解液(human platelet lysate，HPL)的AIM-V培养基或X-vivo 20培养基中培养15天。通过使用锥虫蓝(trypan blue)染料排除计数每组的细胞数。此外，细胞随后以单株抗体(monoclonal antibodies，mAbs)NKG2D-PE、CD45-ECD、CD16-PE-Cy7、CD56-APC-Alexa Flour 700、CD3-APC-Alexa Flour 750、CD14-APC-Alexa Flour750、CD19-APC-Alexa Flour 750(Beckman Coulter公司)、CD86-Alexa488、CD83-PE-Cy5、CD11c-APC，以及HLA-ABC-Pacific Blue(Biolegend公司)染色。通过Navios流式细胞仪采集并分析样品，同时通过Kaluza软件(Beckman Coulter公司)进行数据分析。
如图1A所示，在补充有人类血小板裂解液(HPL)的AIM-V培养基中培养的细胞数量比在X-vivo 20中培养获得的细胞培养物的产量更高，表明具有人类血小板裂解液(HPL)的AIM-V培养基具有增加细胞产量的潜力。此外，以补充有人类血小板裂解液(HPL)的AIM-V培养基培养的细胞产生与以X-vivo 20培养的细胞相似的表型(图1B-1C)。
实施例2：初始单核细胞的选择
将CD3-CD14-CD19-(TN1)或CD25-CD14-CD19-(TN2)单核细胞在含有30ng/mL hIL-15、3ng/mL hIL-12、45ng/mL人类重组IFN-γ(hIFN-γ)，以及4％(w/w)人类血小板裂解液(HPL)的AIM-V培养基中培养9天。通过使用锥虫蓝染料排除法(trypan blue)对培养的细胞计数，并以单株抗体(mAb)CD45-ECD、CD3-APC-Alexa Flour 750、CD14-APC-Alexa Flour750以及CD19-APC-Alexa Flour 750(Beckman Coulter公司)染色。通过Navios流式细胞仪采集并分析样品，同时通过Kaluza软件(Beckman Coulter公司)进行数据分析。
如图2A及表3所示，相较于使用TN2初始细胞的那些，TN1初始细胞以更高的产率提供具有高纯度的目标细胞。
表3
细胞种类 纯度 产量(个细胞)
TN1 91.62％ 1.22×10<sup>7</sup>
TN2 22.88％ 6.2×10<sup>6</sup>
另一方面，将培养的细胞以单株抗体NKG2D-PE、CD45-ECD、CD16-PE-Cy7、CD56-APC-Alexa Flour 700、CD3-APC-Alexa Flour 750、CD14-APC-Alexa Flour 750、CD19-APC-Alexa Flour 750(Beckman Coulter公司)、CD86-Alexa488、CD83-PE-Cy5、CD11c-APC，以及HLA-ABC-Pacific Blue(Biolegend)染色，以分析其表型。通过Navios流式细胞仪采集并分析样品，同时通过Kaluza软件(Beckman Coulter公司)进行数据分析。
如图2B及2C所示，表型分析显示了TN1及TN2初始细胞生成的培养细胞的相似表型。
因此，尽管从TN1初始细胞生成的培养细胞表达的自然杀伤细胞及树突细胞表型与从TN2初始细胞生成的CD3-CD14-CD19-CD56hiCD16dimNKG2D+CD11c+HLA-DR+CD86+CD83-类似，但TN1初始细胞(CD3-CD14-CD19-)产生的高纯度培养细胞比使用TN2初始细胞(CD25-CD14-CD19-)产生的产率更高。
实施例3：IFN-γ的重要作用
WO2015/100495公开了IFN-γ对具有自然杀伤细胞及树突细胞功能的经修饰的自然杀伤细胞的产生相当重要。然而，我们意外地发现IFN-γ在本文所公开的经修饰的自然杀伤细胞的产生中几乎没有作用。
在存在30ng/mL hIL-15、3ng/mL hIL-12以及有或没有45ng/mL hIFN-γ的情况下培养1×106个/mL的CD3-CD14-CD19-单核细胞9天。以单株抗体CD45-ECD、CD3-APC-AlexaFlour750、CD14-APC-Alexa Flour 750以及CD19-APC-Alexa Flour 750(Beckman Coulter公司)对培养的细胞进行染色。通过Navios流式细胞仪采集并分析样品，同时通过Kaluza软件(Beckman Coulter公司)进行数据分析。
如图3A及表4所示，在有或没有IFN-γ的情况下培养的细胞产生基本相同的纯度及产率，显示从TN1初始细胞出现的培养细胞是以IFN-γ非依赖性的方式出现的。此外，表型分析显示具有或不具有IFN-γ的培养细胞的相似模式(图3B及3C)。
表4
细胞种类 纯度 产量(个细胞)
不含IFN-γ 91.82％ 1.22×10<sup>7</sup>
含IFN-γ 91.61％ 1.22×10<sup>7</sup>
因此，就细胞纯度、自然杀伤细胞及树突细胞表型的产率及获得而言，IFN-γ对本文公开的培养细胞的出现影响较小。
实施例4：IL-12的处理时期
将CD3-CD14-CD19-单核细胞以30ng/mL hIL-15培养12天，并以3ng/mL hIL-12培养9或12天。在第6天细胞进行继代培养，且每三天更换一次培养基。通过使用锥虫蓝染料排除法对培养的细胞进行计数。此外，将培养的细胞以单株抗体NKG2D-PE、CD45-ECD、CD16-PE-Cy7、CD56-APC-Alexa Flour 700、CD3-APC-Alexa Flour 750、CD14-APC-AlexaFlour 750、CD19-APC-Alexa Flour 750(Beckman Coulter公司)、CD86-Alexa488、CD83-PE-Cy5、CD11c-APC以及HLA-ABC-Pacific Blue(Biolegend公司)染色。通过Navios流式细胞仪采集并分析样品，同时通过Kaluza软件(Beckman Coulter公司)进行数据分析。
如图4A所示，相较于暴露于IL-12 9天的细胞，延长暴露于IL-12(12天)对培养的细胞在细胞产量方面的影响较小。类似地，表型分析显示暴露于IL-12 9天或12天的培养的细胞具有相似的表型(图4B及4C)。
另一方面，还进行功能测定以评估细胞毒性及抗原呈递活性。通过PanToxilux套件(OncoImmunin公司)评估经修饰的自然杀伤细胞的细胞毒性。以人类慢性骨髓性白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)细胞株K562作为目标细胞，并在最佳浓度下以TFL4染色50分钟。将TFL4标记的目标细胞及该培养的细胞与凋亡蛋白酶基质在37℃下共培养20分钟。收获细胞并通过流式细胞仪分析TFL-4+基质+的信号。通过混合淋巴细胞反应(mixedlymphocyte reaction，MLR)评估该培养的细胞的抗原呈递活性。富集反应细胞(CD25-PBMC)，并以CellTraceTM CFSE细胞增殖套件(Invitrogen公司)染色。CSFE标记的CD25-PBMC与经修饰的自然杀伤细胞在37℃下共培养5天。在第1天及第3天添加hIL-2与hIL-15，以降低TCR参与的阈值。收获细胞并通过流式细胞仪分析CFSE稀释的模式。
如图4D及4E所示，相较于暴露于IL-12 9天的细胞，延长暴露于IL-12(共12天)增强了该培养细胞的细胞毒性及抗原呈递细胞活性。
因此，尽管就细胞纯度、自然杀伤细胞以及树突细胞表型的获得及产量而言，延长暴露于IL-12对本文所公开的培养细胞的出现影响较小，但将暴露于IL-12的时间延长至12天确实增强了经修饰的自然杀伤细胞的细胞毒性及抗原呈递细胞活性。
实施例5：IL-18对经修饰的自然杀伤细胞的出现的影响
在存在30ng/mL hIL-15、3ng/mL hIL-12以及0、50、100或200ng/mL hIL-18的情况下，将CD3-CD14-CD19-单核细胞培养12天。于第6天对细胞继代培养，且每三天更换一次培养基。于第3、6、9和12天收获培养的细胞，并通过锥虫蓝染料排除法计数。此外，于第3天及第12天收获培养的细胞，并以单株抗体NKG2D-PE、CD45-ECD、CD16-PE-Cy7、CD56-APC-AlexaFlour 700、CD3-APC-Alexa Flour 750、CD14-APC-Alexa Flour 750、CD19-APC-AlexaFlour 750(Beckman Coulter公司)、CD86-Alexa488、CD83-PE-Cy5、CD25-PerCP/Cyanine5.5 CD11c-APC以及HLA-ABC-Pacific Blue(Biolegend公司)染色。通过Navios流式细胞仪采集并分析样品，同时通过Kaluza软件(Beckman Coulter公司)进行数据分析。
如在图5A所示，添加IL-18增加了第6天至第12天培养的细胞的扩增。令人意外的是，表型分析显示加入IL-18上调了第3天的CD25、HLA-DR以及CD86的表达(图5B)。但是，HLA-DR与CD86的表达在第12天被下调(图5C)。
类似地，还进行功能测定以评估以不同剂量的IL-18处理的培养细胞的细胞毒性及抗原呈递活性。根据图5D及5E，于第12天加入IL-18对培养细胞的细胞毒性及抗原呈递细胞活性产生负调节。
因此，于第3天添加50ng/mL IL-18可增强修饰自然杀伤细胞的CD25、HLA-DR以及CD86的表达，并使经修饰的自然杀伤细胞的细胞数量一直扩展至第12天。但是，长期暴露于IL-18可能对经修饰的自然杀伤细胞的细胞大小、表型以及功能产生相反的影响。因此，暴露于IL-18足够的时间对于经修饰的自然杀伤细胞的产生可能相当重要。
实施例6：IL-18的处理时期
在30ng/mL hIL-15、3ng/mL hIL-12存在的情况下，将CD3-CD14-CD19-单核细胞培养12天。于第0、3及6天动态暴露于50ng/mL hIL-18。于第6天将细胞继代培养，且每三天更换一次培养基。于第3、6、9、12和15天收获培养的细胞，并通过锥虫蓝染料排除法计数。
类似地，还进行功能测定以评估以不同时期的IL-18处理的培养细胞的细胞毒性及抗原呈递活性。
如图6A所示，相较于在第0天(亦即，暴露3天)或第0、3及6天(亦即，暴露9天)添加IL-18的细胞，于第0天及第3天(亦即，暴露6天)添加IL-18促进培养的细胞在第15天的最佳扩增。针对细胞毒性，相较于暴露于IL-18 3天或9天，暴露于IL-18 6天促进培养的细胞在培养第9天的最佳细胞毒性(图6B)。针对抗原呈递活性，相较于暴露于IL-18 3天或9天，暴露于IL-18 6天可提高培养细胞的最佳抗原呈递细胞活性(图6C)。
最重要的是，暴露于IL-18 6天的培养细胞的抗原呈递活性在第12天达到最高程度，然后在第15天显著下降。因此，在目前的细胞激素环境下，培养细胞的最佳培养时间小于15天。
实施例7：初始细胞的制备
从健康志愿者收集40mL外周血，放入装有K2EDTA的真空管中。将血液样品与等体积的预热磷酸盐缓冲盐水(phosphate-buffered saline，PBS)(Biological Industries公司，以色列)混合。将40mL稀释的外周血等分试样放入50mL离心管中，并装入10mL预热的Ficoll-PaqueTM PREMIUM。离心管在室温下以2000rpm离心30分钟。收集界面层中的单核细胞，并在PBS中洗涤一次。将细胞沉淀重新悬浮于密度为106个细胞/100mL的MACS缓冲液中。
为了除去CD14+细胞、CD19+细胞，以及CD3+细胞，根据制造商的说明书，使用“QuadroMACS Separator”(Miltenyi Biotec Bergisch公司，格拉德巴赫，德国)对单核细胞进行免疫磁珠分离。简言之，将单核细胞与生物素-抗CD14抗体、生物素抗CD19抗体以及生物素-抗CD3抗体反应，并以磁力分离器分离，然后通过洗涤从未结合的细胞中纯化出CD14-、CD19-以及CD3-细胞部分。富集的单核细胞部分基本上不含CD14+细胞、CD19+细胞以及CD3+细胞。
实施例8：经修饰的自然杀伤细胞培养
负耗竭后，来自实施例7的纯化的CD14-、CD19-以及CD3-自然杀伤细胞部分如下培养：
(a)于第0天使1×106个/mL CD14-CD19-CD3-初始细胞与包含AIM-V培养基、HPL(浓度：4％w/w)、IL-15(浓度：30ng/mL)、IL-12(浓度：3ng/mL)以及IL-18(浓度：50ng/mL)的组合物接触。
(b)在步骤(a)中收获并离心一半的初始细胞，然后于第6天以包含AIM-V培养基、HPL、IL-15以及IL-12的组合物重新悬浮细胞沉淀物。
(c)于第12天收集步骤(b)中所有培养的细胞。
可选地，用于培养细胞的组合物可以用新鲜的培养基替换，分别在第3天及第9天分别换上与第0天及第6天相同成分的培养基。例如，可以如下培养初始细胞：
(a)于第0天使1×106个/mL CD14-CD19-CD3-自然杀伤细胞与包含AIM-V培养基、HPL(浓度：4％w/w)、IL-15(浓度：30ng/mL)、IL-12(浓度：3ng/mL)以及IL-18(浓度：50ng/mL)的组合物接触。
(b)于第3天以包含AIM-V培养基、HPL、IL-15、IL-12以及IL-18的组合物替换培养基。
(c)于第6天收获并离心一半步骤(b)中的培养细胞，然后以包含AIM-V培养基、4％w/wHPL、30ng/mL IL-15以及3ng/mL IL-12的组合物重新悬浮细胞沉淀物。
(d)于第9天以包含AIM-V培养基、HPL、IL-15以及IL-12的组合物替换培养基。
(e)于第12天收集步骤(d)中所有培养的细胞。
或者，可以新鲜的培养基代替用于培养细胞的组合物，第3天及第9天分别换上与第0天及第6天相同成分的培养基。例如，初始细胞可以如下培养：
(a)于第0天使1×106个/mL CD14-CD19-CD3-自然杀伤细胞与包含AIM-V培养基、HPL(浓度：4％w/w)、IL-15(浓度：30ng/mL)、IL-12(浓度：3ng/mL)以及IL-18(浓度：50ng/mL)的组合物接触。
(b)于第3天以包含AIM-V培养基、HPL、IL-15、IL-12以及IL-18的组合物替换培养基。
(c)于第6天收获并离心一半步骤(b)中的培养细胞，然后以包含AIM-V培养基、4％w/wHPL、30ng/mL IL-15、3ng/mL IL-12以及50ng/mL IL-18的组合物重新悬浮细胞沉淀物。
(d)于第9天以包含AIM-V培养基、HPL、IL-15、IL-12，以及IL-18的组合物代替培养基。
(e)于第12天收集步骤(d)中所有培养的细胞。
使用Navios流式细胞仪(10 COLORS/3 LASERS，序号：AW40325，Beckman Coulter公司，美国)、Kazula软件版本2.1(Beckman Coulter公司，美国)以及表5中列出的抗体分析步骤(e)中的培养细胞的表型。
表5.用于培养功能测定及经修饰的自然杀伤细胞的表型分析试剂
Figure BDA0002945812090000211
Figure BDA0002945812090000221
结果：如图8所示，获得的经修饰的自然杀伤细胞具有CD3-CD19-CD14-CD56hiCD16dimNKG2D+CD11c+CD86+HLA-DR+CD83-的自然杀伤细胞以及树突细胞相关表型。
实施例9：自然杀伤细胞功能的确定
“杀伤”分析
通过PanToxilux套件(OncoImmunin公司)评估实施例8的经修饰的自然杀伤细胞的细胞毒性。以人类慢性骨髓性白血病(CML)细胞株K562作为目标细胞，并在最佳浓度下以TFL4染色50分钟。将TFL-4标记的目标细胞以及经修饰的自然杀伤细胞与凋亡蛋白酶基质于37℃下共培养20分钟。收获细胞并通过流式细胞仪分析TFL-4+基质+的信号。凋亡蛋白酶阳性的细胞代表毒杀。
结果：如图9A所示，凋亡蛋白酶阳性目标细胞(未经修饰的自然杀伤细胞)的百分比为0.77％，而凋亡蛋白酶阳性目标细胞(经修饰的自然杀伤细胞)的百分比为40.2％。该结果显示经修饰的自然杀伤细胞对白血病目标细胞K562具有细胞毒性作用。
抗原呈递活性的测定
通过混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction，MLR)评估实施例8的经修饰的自然杀伤细胞的抗原呈递活性。富集反应细胞(CD25-PBMC)，并以CellTraceTM CFSE细胞增殖套件(Invitrogen公司)染色。CSFE标记的CD25-PBMC以及经修饰的自然杀伤细胞于37℃下共培养5天。于第1天及第3天添加hIL-2及hIL-15，以降低TCR参与的阈值。随后收集细胞，并通过流式细胞仪分析CFSE稀释的模式。
结果：如图9B所示，如通过流式细胞仪分析所鉴定的，4.32％的反应细胞正在分裂。然而，在实施例8的经修饰的自然杀伤细胞存在下，有24.71％的细胞分裂。该结果显示经修饰的自然杀伤细胞对CD25-PBMCs反应细胞具有抗原呈递活性。
尽管已经描述并说明本发明的特定方面，但这些方面应被认为仅为对本发明的说明，而非限制根据权利要求书所解释的本发明。出于所有目的，在本说明书中引用的所有出版物及专利申请通过引用整体并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请均被明确且单独地指出出于所有目的通过引用并入。尽管出于清楚理解的目的已经通过附图及实施例的呈现对上述发明进行了详细描述，但根据本发明的教导，对于本领域的普通技术人员而言显而易见的是，某些改变及修改可在不背离权利要求书的精神或范围的前提下，可对其进行修改。
无需进一步阐述，相信本发明所属技术领域中的一般技术人员可以基于以上描述，最大程度地利用本发明。因此，以上实施方式应被解释为仅为说明性的，而不以任何方式限制本发明的其余部分。本文引用的所有出版物均通过引用方式并入。

Claims (21)

1.一种经修饰的自然杀伤细胞，包含
CD3-CD19-CD14-CD56hiCD16dimNKG2D+CD11c+CD86+HLA-DR+CD83-的表型。
2.一种医药组合物，包含
(a)如权利要求1所述的经修饰的自然杀伤细胞；以及
(b)医药上可接受的载体或赋形剂。
3.如权利要求1所述的经修饰的自然杀伤细胞在制备用于治疗癌细胞的药物中的用途，所述治疗包含
将有效量的包含所述经修饰的自然杀伤细胞的药物施用于有此需要的受试者。
4.如权利要求3所述的用途，其中所述有效量为每剂约1×103至约1×109个细胞。
5.如权利要求3所述的用途，其中所述经修饰的自然杀伤细胞为自体的或同种异体的。
6.如权利要求3所述的用途，其中所述经修饰的自然杀伤细胞衍生自外周血、脐带血或骨髓。
7.如权利要求3所述的用途，进一步包含体外扩增所述经修饰的自然杀伤细胞。
8.一种培养经修饰的自然杀伤细胞的方法，包含
获得包含单核细胞的体液；
使所述单核细胞与包含IL-15、IL-12，以及IL-18的第一培养基接触以获得培养的细胞群；以及
从所述培养的细胞群中分离出具有CD3-CD19-CD14-CD56hiCD16dimNKG2D+CD11c+CD86+HLA-DR+CD83-表型的经修饰的自然杀伤细胞。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述单核细胞衍生自外周血、脐带血，或骨髓。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述第一培养基进一步包含造血细胞培养基。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述造血细胞培养基包含AIM-V培养基。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述第一培养基进一步包含血清蛋白。
13.如权利要求13所述的方法，其中所述血清蛋白包含人类血小板裂解物。
14.如权利要求8所述的方法，其中所述单核细胞与所述第一培养基接触约1至6天。
15.如权利要求8所述的方法，进一步包含在与所述第一培养基接触后，使所述培养的细胞群与包含IL-15及IL-12的第二培养基接触。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述第二培养基进一步包含造血细胞培养基。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述造血细胞培养基包含AIM-V培养基。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述第二培养基进一步包含血清蛋白。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述血清蛋白包含人类血小板裂解物。
20.如权利要求15所述的方法，其中所述培养的细胞群与所述第二培养基接触约1至6天。
21.如权利要求8所述的方法，进一步包含在与所述第一培养基接触之前，对具有CD3-CD14-CD19-表型的细胞，负选择所述单核细胞。
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