KR20220160479A - 신경내분비종양의 치료용 자연살해세포 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신경내분비종양을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 자연살해세포, 이를 유도하는 방법과, 상기 자연살해세포를 포함하는 신경내분비종양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 신경내분비종양을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 자연살해세포, 이를 유도하는 방법과, 상기 자연살해세포를 포함하는 신경내분비종양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
신경내분비종양(neuroendocrine tumor; NET)이란 위장관 신경내분비세포 기원의 종양을 통칭하는 것으로 발생 빈도는 낮으나 발생하는 기관에 따라 다양한 임상양상과 병의 진행속도를 가지므로 병리학적 진단기준에 따라 조기 발견하는 것이 필수적이다. NET의 50% 이상이 위장관과 췌장에서 발생하며, 전체 암의 약 2%를 차지하는 비교적 드문 종양이지만, NET의 발생률과 유병률은 지난 30년간 꾸준히 증가하였다. 신경내분비종양의 확진은 병리조직학적 검사가 필수적이며, 특히 종양의 유사분열 수(mitotic count, 10 high power field)와 Ki-67 인덱스(index) (%)에 의해 NET G1, NET G2, NET G3 (큰 세포 또는 작은 세포 형), 혼합 신경내분비선암(mixed adenoneuroendocrine carcinoma; MANEC), 과증식 및 적인전암 병변(hyperplastic and preneoplastic lesions) 등으로 분류된다(표 1). 다만, 2010년 WHO 분류에서는 저분화 신경내분비 암종(poorly differentiated neuroendocrin carcinoma)과 Ki-67 분열 지수가 높은 G3 신경내분비종양을 하나의 동일한 진단 체계로 분류하였지만, 2017년 개정된 WHO 분류에서는 췌장 신경내분비암종의 경우 이를 구분하여 명명하였다.
| WHO 분류 2010 |
| 신경내분비종양 Grade 1 Grade 2 |
| 신경내분비암 Grade 3 |
| 혼합 신경내분비선암(mixed adenoneuroendocrine carcinoma; MANEC) |
| 과증식 및 적인전암 병변(hyperplastic and preneoplastic lesions) |
신경내분비종양(NET)은 증상 여부에 따라 기능성(functional)과 비기능성(non-functional)으로 나뉘며, 기능성 여부가 예후에 영향을 미칠 수 있다. 증상은 매우 다양하여 수년간 다른 질환으로 오진 되어 치료를 받는 경우가 흔하였고, 이에 따라 신경내분비종양(NET)으로 진단받을 당시에는 이미 병이 상당히 진행된 경우가 흔하다. 국소적으로 진행하였거나 원격 전이가 있어 근치적 절제가 불가능한 경우 생존 기간은 대략 6개월로, 불량한 예후를 보인다.
최근 진단 기법의 발전으로 인하여 세계적으로 신경내분비종양(NET)의 발생 빈도가 증가하는 추세로 보고되고 있을 뿐 아니라, 우리나라에서는 상부위장관 내시경과 대장 내시경 검사의 보급으로 인하여 작은 크기의 병변이 우연히 진단되고 내시경적 치료를 하는 경우가 많아지면서 질환에 대한 관심이 증가하고 있다.
한편, 신경내분비종양 중 위장관-췌장의 신경내분비종양(gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors, GEP-NETs)은 그 발생이 비교적 드물어 미국의 경우 연간 발생률이 10만명 당 3.65명으로 추정되며, 일본의 경우 췌장 신경내분비종양(Pancreatic neuroendocrine tumors, PNET)은 10만명 당 2.23명, 위장관 신경내분비종양(Gastrointestinal neuroendocrine tumors, GINET) 은 10만명당 3.45명으로 보고되고 있다. 2000년에서 2009년까지 국내 29개 병원에서 조사한 GEP-NETs 환자 4,951명의 증례에서 발생빈도가 높은 순서대로 보면 직장(48%), 위(14.6%), 췌장(8.7%), 결장(7.9%), 소장(7.7%), 간(6.8%), 담도(1.8%), 식도(1.4%), 기타(0.6%) 순으로 조사되었다. 이 보고서에 따르면 위장관-췌장의 신경내분비종양(GEP-NET)의 발병률은 2000년도에 비해 2009년 9배 증가하였으며 특히 직장 신경내분비종양의 발병률이 크게 증가하고 있는 것으로 보고되었다. 발병 부위별 평균 생존 기간은 위신경내분비 종양이 가장 길었으며 (154.42±7.74 개월), 담관 위신경내분비 종양이 가장 짧은 것(44.32±6.02 개월)으로 보고되었다. 질병관련 사망(Disease Related Death)은 간담도계(hepatobiliary system)에서 가장 높았으며(62.2%), 직장의 경우는 5.1%로 가장 낮은 것으로 보고되었다.
절제가능한 신경내분비종양(NET)의 경우 수술과 내시경을 통한 절제가 최선이지만, 대다수의 환자가 절제술 후 재발을 보이며 20~28% 진단 당시 전이성 질환인 경우이다. 또한 절제 불가능하거나 전이성인 GEP-NET의 전신적 치료 옵션은 매우 제한적이다. 진행성 위장관-췌장의 신경내분비종양(GEP-NET)의 치료 방법으로 소마토스타틴 유사체 (SSA), 표적 요법, 펩티드 수용체 방사성 핵종 요법 (PRRT) 및 세포 독성 화학 요법을 포함한 다양한 유형의 전신 요법 등이 선택되지만, 다양한 환자 상태에 따른 개별적 치료 방법의 선택은 매우 어려운 것이 현실이다. 위장관-췌장의 신경내분비종양(GEP-NET)의 치료는 현재까지 경험적 개념의 종합을 기반으로 하기 때문에 위장관-췌장의 신경내분비종양(GEP-NET)의 치료법에는 여러 측면에서 불분명하고 논란의 여지가 있다. 특히 췌장 신경내분비종양(PNET)의 경우 최근 2017년 WHO 분류기준에서 새롭게 분리된 Grade 3 췌장 신경내분비종양(well differentiated, highgrade) 환자군에 대해서는 아직까지 표준 치료에 대한 가이드라인이 확립되어 있지 않으며, 기존의 전신 항암제에 치료 반응률이 상대적으로 저조한 것으로 보고되고 있어 G1/G2 종양에서 사용되는 소마토스타틴 유사체나 분자표적치료제등의 치료 반응률을 평가할 연구가 필요한 상황이다. 뿐만 아니라, 이러한 위장관-췌장의 신경내분비종양(GEP-NET) 환자의 면역 항암제 사용에 대한 데이터는 국내에는 전무하다.
본 발명의 일 목적은 신경내분비종양의 예방, 개선 또는 치료에 사용할 수 있는 자연살해세포를 유도하는 방법과, 상기 방법으로 유도된 자연살해세포를 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에서 유도된 자연살해세포를 포함하는 신경내분비종양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 그 제조 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명에서 달리 정의되지 않은 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 시험을 위해 실행 시 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본 명세서에 기재된다. 본 발명의 기재 및 청구 시, 하기 정의가 이용될 것이다. 본 명세서에서 사용된 전문용어는 제한인 것으로 의도되지 않고, 오히려 특정한 실시형태를 기술할 목적을 위해 본 명세서에서 사용되는 것으로 또한 이해될 것이다. 관사 "하나" 및 "일"은 관사의 문법상 목적어의 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나 또는 하나 이상)를 의미하도록 본 명세서에서 사용된다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 신경내분비종양의 예방, 개선 또는 치료용 자연살해세포(Natural Killer cells; NK 세포)의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 “자연살해세포(Natural Killer cells; NK 세포)”는 선천성 면역계의 주요 성분을 구성하는 세포독성 림프구로서, 대형과립림프구(large granular lymphocyte, LGL)로 정의되고 림프계 전구세포(common lymphoid progenitor, CLP) 생성 B 및 T 림프구로부터 분화된 제3의 세포를 구성한다.
본 발명에서 상기 신경내분비종양의 예방, 개선 또는 치료 효과가 있는 자연살해세포는 이하의 단계를 포함하는 방법으로 수득될 수 있다.
1) 혈액 시료 수득 단계
본 발명의 제조 방법은, 우선 건강한 사람으로부터 혈액, 예를 들면, 전혈, 제대혈, 골수, 또는 말초혈액, 바람직하게는 말초혈액을 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
2-1-1) 말초혈액 단핵세포의 분리 수득 단계
본 발명의 제조 방법은, 상기와 같이 수득된 말초혈액으로부터 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 분리 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)는 포유동물, 바람직하게는 사람의 말초혈액으로부터 분리된 단핵의 세포로서, 주로 B 세포, T 세포, 자연살해세포와 같은 면역세포, 및 호염구(basophil), 호산구(eosinophil), 호중구(neutrophil)와 같은 과립구 등을 포함한다. 상기 PBMC는 생체에서 채취한 말초혈액으로부터 통상의 제조방법에 의해 준비될 수 있다. 바람직하게 상기 PBMC는 피콜(Ficoll)을 이용한 비중 원심분리법을 이용하여 말초혈액으로부터 분리할 수 있다.
본 발명에서 상기 말초혈액 단핵세포는 치료를 필요로 하는 개체로부터 얻어지는 것, 즉 자가(autologous) 말초혈액 단핵세포일 수 있으나, 혹은 다른 개체로부터 얻어지는 것, 즉 타가(allogenic) 말초혈액 단핵세포일 수도 있으며, 특별히 제한하지 않는다.
2-1-2) 말초혈액 단핵세포로부터 CD3+ T 세포의 제거 단계
본 발명의 제조 방법은, 필요에 따라서는 상기 분리된 말초혈액 단핵세포로부터 CD3+ T 세포를 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 다만, 상기 말초혈액 단핵세포가 자가 말초혈액 단핵세포일 경우, 증식된 자연살해세포 집단에서 일부 T 세포가 존재하더라도, 모든 세포가 주입될 개체로부터 유래된 것이기 때문에 상기의 단계는 생략할 수 있다. 본 발명에서 상기 CD3+ T 세포를 제거하는 방법은 특별히 제한하지 않으나, 상업적으로 시중에 판매되고 있는 면역자기 분리 제품으로, 예를 들면, MACSxpress (Milteyi Biotec, Germany) 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
2-2) 혈액으로부터 자연살해세포의 분리 단계
본 발명의 제조 방법은 상기한 방법 외에도 건강한 사람으로부터 수득된 혈액으로부터 자성 입자를 이용하여 자연살해세포를 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 자성 입자는 비드(beads) 또는 미세구(microspheres) 등의 고형 구체 입자로, 자기(magnetic) 또는 초자기(magnetic)의 성질을 가진 내부 코어(core)를 포함하는 것이다. 여기서, 상기 코어는 금속 성분을 포함하고 있거나 금속 성분으로 이루어진 것일 수 있고, 이때 상기 금속 성분은 철, 니켈, 구리, 코발트, 가돌리늄, 망간, 탄탈륨, 아연, 지르코늄 또는 이들의 조합을 포함하는 금속; 또는 산화 철 등의 금속 산화물; 또는 망간 페라이트, 코발트 페라이트, 니켈 페라이트 등의 페라이트(ferrites); 헤마타이트(hematite); 또는 CoTaZr 등의 금속 합금; 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 자성 입자의 내부 코어는 필요에 따라서는 중합체, 다당류, 실리카, 지방산, 단백질, 탄소, 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있다. 여기서, 상기 중합체는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 폴리락트산-글리콜산 공중합체(poly(lactic-co-glycolic acid)), 폴리글루타르알데하이드(polyglutaraldehyde), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리스티렌(polystyrene), 사이클로-올레핀 폴리머(cyclo-olefin polymer; COP) 또는 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 다당류는 키토산, 아가로스, 전분, 덱스트란 또는 덱스트란 유도체를 포함할 수 있고, 상기 단백질은 알부민일 수 있으며, 상기 탄소는 아크릴아마이드 또는 말레산 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 자성 입자는 상기 내부 코어 상에 형성되는 1층 이상의 코팅층과, 상기 목적하는 세포에 결합할 수 있는 결합 분자를 더 포함할 수 있다. 이때 상기 코팅층은 상기 결합 분자에 커플링, 결합 또는 컨쥬게이션할 수 있는 물질을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 자성 입자의 코팅층은 덱스트란 또는 이의 유도체, 중합체, 다당류, 실리카, 지방산, 단백질, 탄소, 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있다. 여기서, 상기 중합체는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 폴리락트산-글리콜산 공중합체(poly(lactic-co-glycolic acid)), 폴리글루타르알데하이드(polyglutaraldehyde), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리스티렌(polystyrene), 사이클로-올레핀 폴리머(cyclo-olefin polymer; COP) 또는 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 다당류는 키토산, 아가로스 또는 전분을 포함할 수 있고, 상기 단백질은 알부민일 수 있으며, 상기 탄소는 아크릴아마이드 또는 말레산 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 자성 입자에 포함되는 결합 분자는 목적하는 세포에 결합할 수 있는 분자로서, RNA, DNA, 단백질(예를 들어 효소), 항원, 다클론성 항체, 단클론성 항체, 항체 단편, 카보하이드레이트, 지질 렉틴, 또는 원하는 표적을 위한 친화성(예를 들어 친화성 시약)을 갖는 임의의 다른 친화성 시약(예를 들어 스트렙타비딘)을 포함할 수 있다. 상기 하나 이상의 결합 분자, 예를 들어 친화성 시약은, 공지 및 이용가능한 다양한 방법에 의해서 상기 입자(예를 들어 비드 입자)에 직접 또는 간접적으로 부착될 수 있다. 상기 부착은 공유, 비공유, 정전기 또는 소수성일 수 있으며, 예를 들어 화학적 수단, 기계적 수단, 또는 효소적 수단을 비롯한 다양한 부착 수단에 의해서 달성될 수 있다.
본 발명에서 상기 항체로는 다클론성 항체, 단클론성 항체(면역글로불린 Fc 영역을 갖는 전장 항체를 포함한다), 폴리에피토프 특이성을 갖는 항체 조성물, 다중 특이적 항체(예를 들어 이중특이 항체, 다이아바디 및 단쇄 분자, 및 항체 단편(예를 들어 Fab, F(ab')2, 및 Fv)을 들 수 있다. 일부 구현예에서, 친화성 시약은 항체 단편(항원-결합 단편을 포함), 예를 들어 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, 또는 (Fab')2 단편이다. IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 영역을 비롯한 본원에 상정된 항체용으로 임의의 이소타입의 불변 영역이 이용될 수 있고 이러한 불변 영역은 인간 또는 동물 종(예를 들어 쥐 종)으로부터 얻을 수 있는 것으로 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 예시에서, 상기 결합 분자는 생물학적 시료 내에 존재하는 목적하는 세포, 혹은 목적하지 않는 세포에 결합할 수 있는 분자 또는 그 단편으로, 상세하게는 세포 상에 존재하는 하나 이상의 거대 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 분자일 수 있고, 예를 들면, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD25, CD27, CD28, CD29, CD31, CD44, CD45RA, CD45RO, CD54(ICAM-1), CD127, MHCI, MHCII, CTLA-4, ICOS, PD -1, OX40, CD27L(CD70), 4-1BB(CD137), 4-1BBL, CD30L, LIGHT, IL-2R, IL-12R, IL-1R, IL-15R; IFN-감마R, TNF-알파R, IL-4R, IL-10R, CD18/CD1la(LFA-1), CD62L(L-셀렉틴), CD29/CD49d(VLA-4), 노치 리간드(예를 들어 델타-유사 1/4, 재기드 1/2 등), CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7 및 CXCR3 또는 이들 거대분자 또는 이의 단편에 상응하는 리간드를 포함하는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 분자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 자성 입자의 직경은 특별히 제한하지 않으나, 0.001 ㎛ 초과, 0.01 ㎛ 초과, 0.1 ㎛ 초과, 1.0 ㎛ 초과, 10 ㎛ 초과, 50 ㎛ 초과, 100 ㎛ 초과 또는 1000 ㎛ 초과의 직경을 가질 수 있고, 구체적으로는 1.0 ㎛ 내지 500 ㎛, 1.0 ㎛ 내지 150 ㎛, 1.0 ㎛ 내지 30 ㎛, 1.0 ㎛ 내지 10 ㎛ 또는 1.0 ㎛ 내지 5.0 ㎛의 직경을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시에서, 상기 자성 입자는 EasySepTM Direct RapidSpheresTM 50300(STEMCELL Technologies, Canada)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 자성 입자를 이용하여 혈액으로부터 자연살해세포를 분리하는 방법은, 상기 혈액에 자성 입자를 첨가한 뒤 자석의 존재 하에서 자연살해세포를 분리할 수 있다.
본 발명에서 상기 혈액에 자성 입자를 첨가하는 경우 자성 입자 내 결합 분자가 자연살해세포 또는 제거하고자 하는 비-자연살해세포의 표면에서 발현되거나 표면 상에 존재하는 하나 이상의 거대분자(예를 들어 세포 표면 수용체)에 특이적으로 결합될 수 있고, 자석을 이용하여 자성 입자가 결합된 자연살해세포를 회수하거나, 혹은 자성 입자가 결합된 비-자연살해세포를 제거함으로써 자연살해세포를 분리할 수 있다.
본 발명에서 상기 자석을 이용하여 자연살해세포를 분리하는 방법은 자성 입자가 첨가된 혈액을 자석의 존재 하에서 배양한 뒤 상층액을 회수, 분리 또는 제거할 수 있고, 혹은 자성 입자가 첨가된 혈액을 자석을 포함하는 컬럼을 통과시키며 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시에서, 상기 혈액에 자성 입자를 첨가하면 자성 입자 내 결합 분자가 적혈구 세포의 표면에서 발현되는 거대분자에 특이적으로 결합되고, 자석의 존재 하에서 자성 입자가 첨가된 혈액을 배양한 뒤 상층액만을 취하여 목적하지 않는 세포인 적혈구 세포를 제거할 수 있고, 혹은 자석이 포함된 컬럼에 상기 자성 입자가 첨가된 혈액을 통과시켜 컬럼을 통과한 자연살해세포를 회수할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
3) 말초혈액 단핵세포 또는 자연살해세포의 배양 단계
본 발명의 제조 방법은, 상기와 같이 CD3+ T 세포가 제거된 말초혈액 단핵세포 또는 분리된 자연살해세포를 사이토카인(cytokine)이 500 내지 1500 IU/ml의 양으로 포함된 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 사이토카인(cytokine)은 말초혈액 단핵구를 자연살해세포로 유도하거나, 자연살해세포를 활성화 또는 증폭하는데 사용 가능한 면역 활성화 사이토카인을 의미한다. 본 발명의 한 구체예에서, 이러한 사이토카인으로는 예를 들어 IL-2, IL-15, IL-21, Flt3-L, SCF, IL-7, IL-12 및 IL-18로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 특히 IL-2, IL-15 또는 IL-21이 자연살해세포로의 분화 및 증식에 탁월한 효과가 있는 사이토카인으로 알려져 있으므로, 이들 사이토카인을 이용하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 IL-2일 수 있다.
본 발명의 목적상 상기 사이토카인은 배양 배지 내에 500 내지 1500 IU/ml의 양으로 포함되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 800 내지 1200 IU/ml의 양으로 포함될 수 있다.
본 발명에서 상기 배양 배지는 염화나트륨(NaCl), D-글루코스(D-glucose), 아미노산(amino acid), 중탄산나트륨(NaHCO3) 및 HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있고, 그 외에 Na2HPO4; NaH2PO4 또는 그 수화물; KCl; CaCl2; MgCl2 또는 그 수화물; 비타민; 피루브산 또는 이의 염(예, 나트륨염); 옥살아세트산(oxalacetic acid); 및 인간 혈청 알부민(human serum albumin)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있으며, 잔부로 용매를 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 배양 배지는 염화나트륨(NaCl) 0.5 내지 0.6 w/v%, D-글루코스(D-glucose) 0.4 내지 0.5 w/v%, 아미노산 0.2 내지 0.3 w/v%, NaHCO3 0.15 내지 0.25 w/v% 및 HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 0.15 내지 0.25 w/v%를 포함할 수 있고, Na2HPO4 0.01 내지 0.05 w/v% NaH2PO4 또는 그 수화물 0.0005 내지 0.0015 w/v%; KCl 0.01 내지 0.05 w/v%; CaCl2 0.005 내지 0.05 w/v%; MgCl2 또는 그 수화물 0.005 내지 0.05 w/v%; 비타민 0.001 내지 0.005 w/v%; 피루브산 또는 이의 염(예, 나트륨염) 0.005 내지 0.05 w/v%; 옥살아세트산(oxalacetic acid) 0.005 내지 0.05 w/v%; 인간 혈청 알부민(human serum albumin) 0.01 내지 0.10 w/v%; 및 잔부 용매를 포함할 수 있다. 여기서 상기 용매는 물, 인산염 완충 용액(phosphate buffer solution; PBS), 생리 식염수(saline solution) 또는 알코올 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 배양 배지는 리포산(lipoic acid)을 더 포함할 수 있고, 바람직하게는 상기 리포산을 0 초과 0.001 w/v%의 양으로 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 배양 배지로는 바람직하게는 Cell Science & Technology Institute inc. (CSTI)의 AlyS505NK-AC(Cat.# 01600P02), AlyS505NK-AC1000(Cat.# 01610P02), AlyS505NK-EX(Cat.# 01400P10) 또는 AlyS505NK-EX1000(Cat.# 01410P10)를 사용할 수 있고, 바람직하게는 상기 배양 시 리포산(lipoic acid)을 포함하는 AlyS505NK-AC(Cat.# 01600P02) 또는 AlyS505NK-AC1000(Cat.# 01610P02)의 배양 배지에서 1차로 배양한 뒤 AlyS505NK-EX(Cat.# 01400P10) 또는 AlyS505NK-EX1000(Cat.# 01410P10)의 배양 배지에서 2차로 배양하며 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 배양 시 배양 배지는 10 내지 50 ml의 양으로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 배양 시 T75 플라스크 및 T175 플라스크를 이용하여 수행될 수 있고, 바람직하게는 상기한 세포를 T75 플라스크에서 배양한 뒤 T175 플라스크로 옮겨서 배양할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 T75 플라스크를 이용하여 배양하는 경우, T75 플라스크의 하면이 바닥과 평행하게 되도록 T75 플라스크를 세워서 1차로 배양한 뒤 T75 플라스크의 옆면 중 어느 하나의 면이 바닥과 평행하게 되도록 T75 플라스크를 눕혀서 2차로 배양하며 공간 제한적인 조절에 의해 수행될 수 있으며, 이때 세포 클러스터의 밀도에 따라 2차 배양 시기를 조절할 수 있다. 또한, 상기 1차 배양 및 2차 배양의 배양을 1회, 또는 2회 이상 반복하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 T175 플라스크를 이용하여 배양하는 경우, T175 플라스크의 하면이 바닥과 평행하게 되도록 T175 플라스크를 세워서 1차로 배양한 뒤 T175 플라스크의 옆면 중 어느 하나의 면이 바닥과 평행하게 되도록 T175 플라스크를 눕혀서 2차로 배양하며 공간 제한적인 조절에 의해 수행될 수 있다. 상기한 2차 배양 방법은 세포 클러스터의 양과 밀도에 따라 배양 배지를 첨가하여 조절할 수 있고, 세포 클러스터의 밀도를 조절하는 공간 제한적인 방법이다. 여기서 상기 1차 배양 및 2차 배양의 배양을 1회, 또는 2회 이상 반복하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 배양은 10 내지 36일 동안 수행될 수 있으며, 바람직하게는 CD3+ T 세포가 제거된 말초혈액 단핵세포 또는 분리된 자연살해세포를 T75 플라스크에서 5 내지 15일 동안 배양한 뒤 T175 플라스크로 이동시켜 5 내지 21일 동안 추가로 배양하며 수행할 수 있으나, 최대 배양 기간은 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시에서, 상기 배양은 CD3+ T 세포가 제거된 말초혈액 단핵세포를 T75 플라스크에서 5 내지 10일 동안 배양한 뒤 T175 플라스크로 이동시켜 14 내지 21일 동안 추가로 배양하며 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시에서, 상기 배양은 분리된 자연살해세포를 T75 플라스크에서 10 내지 15일 동안 배양한 뒤 T175 플라스크로 이동시켜 5 내지 15일 동안 추가로 배양하며 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 배양은 정치 배양(stationary culture) 또는 부유 배양(suspension culture) 방법을 사용할 수 있고, 정치 배양은 배양기에 교반(agitating) 또는 진탕(shaking) 없이 방치한 상태에서 배양하는 것을 의미하며, 부유 배양은 통기(aeration)나 교반 등을 통해 세포들이 반응기의 하부 또는 측면부에 부착되지 않고 현탁된 상태에서 배양하는 것을 의미한다. 또한, 정치 배양을 위한 반응기와 부유 배양을 위한 반응기는 동일한 것일 수도 있고, 상이한 것일 수도 있다. 예를 들어, 정치 배양을 위한 반응기와 부유 배양을 위한 반응기가 동일한 것인 경우에는 동일한 반응기에서 정치 배양이 완료된 후, 사이토카인 등의 필요한 영양성분을 포함하는 배지를 추가적으로 공급하여 부유 배양 방식으로 배양하는 것이 가능하며, 상이한 종류의 배양기를 사용하는 경우에는 정치 배양이 완료된 후에 배양물을 부유 배양을 위한 반응기로 옮겨 부유 배양할 수 있다.
본 발명에서 상기와 같은 방법으로 유도된 자연살해세포는 CD3- 표현형을 가지며, CD56bright 또는 CD56dim의 표현형을 가지는 자연살해세포를 포함할 수 있고, 바람직하게는 CD56dim의 표현형을 가진 자연살해세포가 CD56bright의 표현형을 가진 자연살해세포보다 우세하게(즉, 많은 비율로) 포함될 수 있고, 일 예시로 상기 CD56dim의 표현형을 가진 자연살해세포, 특히는 CD3-CD56dimCD16+ 표현형을 가진 자연살해세포가 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상의 세포 수로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 방법으로 유도된 자연살해세포는 신경내분비종양 세포에 대한 선택적 세포 독성이 매우 뛰어나, 신경내분비종양을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
본 발명에서 상기 "신경내분비종양(Neuroendocrine Tumor; NET)"은 호르몬을 생성하는 신경내분비세포에서 생긴 종양으로, 위, 소장, 대장과 같은 소화기관, 폐, 흉선, 췌장 등 다양한 장기에서 발생한다. 이러한 신경내분비종양 세포에서는 S100, NES, 크로모그라닌 A(chromogranin A) 등의 마커가 발현되지만, 상피세포 기원의 CEA나 CA19-9의 마커는 발현되지 않는다. 상기한 신경내분비종양 세포의 분화도에 따라 Grade 1,2,3로 구분되며 분화도가 불량한 Grade 3는 악성 종양에 해당하며 세포독성 항암제를 사용해야 함에도 예후는 불량하다. 특히 췌장에 발생한 신경내분비종양은 예후가 매우 불량하다.
본 발명에서 상기 신경내분비종양은 위장관-췌장 신경내분비종양(gastroenteropancreatic neuroendocrine tumor), 유암종(carcinoid tumor), 갈색세포종(pheochromocytoma), 부신경절종(paraganglioma), 갑상선수질암(medullary thyroid cancer), 폐 신경내분비종양(pulmonary neuroendocrine tumor), 흉선 신경내분비종양(thymic neuroendocrine tumor), 췌장 신경내분비종양(pancreatic neuroendocrine tumor), 뇌하수체 선종(pituitary adenoma), 부신 종양(adrenal gland tumors), 메켈세포암종(Merkel cell carcinoma), 유방암(breast cancer), 비-호치킨 림프종(Non-Hodgkin lymphoma), 호치킨 림프종(Hodgkin lymphoma), 두경부 종양(Head & Neck tumor), 요로상피세포암종(urothelial carcinoma), 신장세포암종(renal cell carcinoma), 간세포암종(hepatocellular carcinoma), GIST, 신경모세포종(neuroblastoma), 자궁경부 종양(cervix tumor), 유잉육종(Ewing sarcoma), 골육종(osteosarcoma), 소세포폐암(small cell lung cancer; SCLC), 전립선암(prostate cancer), 흑색종(melanoma), 뇌수막종(meningioma), 신경교종(glioma), 수모세포종(medulloblastoma), 혈관아종(hemangioblastoma), 원시신경외배엽 종양(supratentorial primitive neuroectodermal tumor) 및 감각신경모세포종(esthesioneuroblastoma)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 바람직하게는 위장관-췌장 신경내분비종양(gastroenteropancreatic neuroendocrine tumor) 또는 췌장 신경내분비종양(pancreatic neuroendocrine tumor)일 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 자연살해세포(Natural Killer cells; NK 세포)를 유효 성분으로 포함하는 신경내분비종양의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물 또는 그 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 "세포치료제(cellular therapeutic agent)"를 의미한다. 본 발명에서 상기 "세포치료제(cellular therapeutic agent)"란, 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.
본 발명에서 상기 약학적 조성물에 포함되는 자연살해세포를 얻는 방법은 상기 자연살해세포의 제조 방법에서 기재된 바와 중복되어, 명세서의 과도한 복잡을 피하고자 이하 그 기재를 생략한다.
또한, 본 발명에서 상기 자연살해세포는 본 발명의 상기 방법으로 유도된 자연살해세포 외에 NK-92 세포일 수 있다.
본 발명에서 상기 "NK-92 세포"는 본래 비-호지킨 림프종을 갖는 환자로부터 수득되는 불멸 NK 세포주, NK-92을 지칭한다. 본 개시내용의 목적을 위해서, 달리 나타내지 않는 한, 용어 "NK-92"은 최초의 NK-92 세포주 뿐만 아니라 (예를 들어, 외인성 유전자의 도입에 의해) 변형된 NK-92 세포주를 지칭하는 것으로 의도된다.
본 개시내용의 목적을 위해서, 달리 나타내지 않는 한, 용어 "NK-92"은 최초의 NK-92 세포주 뿐만 아니라 (예를 들어, 외인성 유전자의 도입에 의해) 변형된 NK-92 세포주를 지칭하는 것으로 의도된다. NK-92 세포 및 그의 예시적이고 비-제한적인 변형은 미국 특허 번호 7,618,817; 8,034,332; 및 8,313,943에 기재되고, 그들의 모두는 그의 전문이 참고로 본원에 도입된다.
본 발명에서 상기 NK-92 세포주는 CD56bright, CD2, CD7, CD11a, CD28, CD45, 및 CD54 표면 마커를 발현하는 것으로 확인된다. 게다가 CD1, CD3, CD4, CD5, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20, CD23, 및 CD34 마커를 나타내지 않는다. 본 발명에서 상기 NK-92 세포의 성장은 사이토카인, 바람직하게는 IL-2에 의존성이며, 1 IU/mL만큼의 낮은 용량으로도 NK-92 세포의 증식을 유지할 수 있다. 이러한 NK-92 세포는 아메리칸 타입 컬처 컬렉션 (ATCC), 기탁번호 CRL-2407로 기탁되어 있는 것으로, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 이러한 세포는 난트케이웨스트, 인크.(NantKwest, Inc.)로부터 쉽게 입수 가능하다.
본 발명에서 상기 NK-92 세포는 활성화된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 NK-92 세포의 활성화 시 사이토카인으로, 예를 들어 IL-2, IL-15, IL-21, Flt3-L, SCF, IL-7, IL-12 및 IL-18로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 포함된 배양 배지에서 NK-92 세포를 배양하며 수행될 수 있다.
본 발명의 목적상 상기 사이토카인은 배양 배지 내에 500 내지 1500 IU/ml의 양으로 포함되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 800 내지 1200 IU/ml의 양으로 포함될 수 있다.
본 발명에서 상기 배양 배지는 염화나트륨(NaCl), D-글루코스(D-glucose), 아미노산(amino acid), 중탄산나트륨(NaHCO3) 및 HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있고, 그 외에 Na2HPO4; NaH2PO4 또는 그 수화물; KCl; CaCl2; MgCl2 또는 그 수화물; 비타민; 피루브산 또는 이의 염(예, 나트륨염); 옥살아세트산(oxalacetic acid); 및 인간 혈청 알부민(human serum albumin)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있으며, 잔부로 용매를 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 배양 배지는 염화나트륨(NaCl) 0.5 내지 0.6 w/v%, D-글루코스(D-glucose) 0.4 내지 0.5 w/v%, 아미노산 0.2 내지 0.3 w/v%, NaHCO3 0.15 내지 0.25 w/v% 및 HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 0.15 내지 0.25 w/v%를 포함할 수 있고, Na2HPO4 0.01 내지 0.05 w/v% NaH2PO4 또는 그 수화물 0.0005 내지 0.0015 w/v%; KCl 0.01 내지 0.05 w/v%; CaCl2 0.005 내지 0.05 w/v%; MgCl2 또는 그 수화물 0.005 내지 0.05 w/v%; 비타민 0.001 내지 0.005 w/v%; 피루브산 또는 이의 염(예, 나트륨염) 0.005 내지 0.05 w/v%; 옥살아세트산(oxalacetic acid) 0.005 내지 0.05 w/v%; 인간 혈청 알부민(human serum albumin) 0.01 내지 0.10 w/v%; 및 잔부 용매를 포함할 수 있다. 여기서 상기 용매는 물, 인산염 완충 용액(phosphate buffer solution; PBS), 생리 식염수(saline solution) 또는 알코올 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 활성화 시 사용되는 배양 배지로는 바람직하게는 Cell Science & Technology Institute inc. (CSTI)의 AlyS505NK-AC(Cat.# 01600P02), AlyS505NK-AC1000(Cat.# 01610P02), AlyS505NK-EX(Cat.# 01400P10) 또는 AlyS505NK-EX1000(Cat.# 01410P10)를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 활성화 시 배양 배지는 5 내지 30 ml의 양으로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 활성화 시 T25 플라스크 및 T75 플라스크를 이용하여 수행될 수 있고, 바람직하게는 상기한 NK-92 세포를 T25 플라스크에서 배양한 뒤 T75 플라스크로 옮겨서 배양할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 활성화 시 배양은 10 내지 30일 동안 수행될 수 있으며, 바람직하게는 NK-92 세포를 T25 플라스크에서 5 내지 15일 동안 배양한 뒤 T75 플라스크로 이동시켜 5 내지 15일 동안 추가로 배양하며 수행할 수 있으나, 최대 배양 기간은 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 신경내분비종양은 위장관-췌장 신경내분비종양(gastroenteropancreatic neuroendocrine tumor), 유암종(carcinoid tumor), 갈색세포종(pheochromocytoma), 부신경절종(paraganglioma), 갑상선수질암(medullary thyroid cancer), 폐 신경내분비종양(pulmonary neuroendocrine tumor), 흉선 신경내분비종양(thymic neuroendocrine tumor), 췌장 신경내분비종양(pancreatic neuroendocrine tumor), 뇌하수체 선종(pituitary adenoma), 부신 종양(adrenal gland tumors), 메켈세포암종(Merkel cell carcinoma), 유방암(breast cancer), 비-호치킨 림프종(Non-Hodgkin lymphoma), 호치킨 림프종(Hodgkin lymphoma), 두경부 종양(Head & Neck tumor), 요로상피세포암종(urothelial carcinoma), 신장세포암종(renal cell carcinoma), 간세포암종(hepatocellular carcinoma), GIST, 신경모세포종(neuroblastoma), 자궁경부 종양(cervix tumor), 유잉육종(Ewing sarcoma), 골육종(osteosarcoma), 소세포폐암(small cell lung cancer; SCLC), 전립선암(prostate cancer), 흑색종(melanoma), 뇌수막종(meningioma), 신경교종(glioma), 수모세포종(medulloblastoma), 혈관아종(hemangioblastoma), 원시신경외배엽 종양(supratentorial primitive neuroectodermal tumor) 및 감각신경모세포종(esthesioneuroblastoma)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 바람직하게는 위장관-췌장 신경내분비종양(gastroenteropancreatic neuroendocrine tumor) 또는 췌장 신경내분비종양(pancreatic neuroendocrine tumor)일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 자연살해세포를 1X103 개 이상, 1X104 개 이상, 1X105 개 이상, 3X105 개 이상, 1X106 개 이상, 3X106 개 이상, 6X106 개 이상, 또는 1X107 개 이상, 그리고 1X1010 개 이하로 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은, 상기 약학적 조성물의 투여로 신경내분비종양 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는, 상기 약학적 조성물의 투여로 신경내분비종양 질환의 증세가 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 약제적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.
본 발명에서, "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 개체에게 자연살해세포(NK cells)를 유효 용량으로 투여하는 단계를 포함하는, 신경내분비종양의 예방, 개선 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 "개체"는 신경내분비종양이 발병되거나 발병할 위험이 있는 포유동물 또는 비-포유동물일 수 있다. 여기서, 상기 포유동물의 예로는 인간, 비-인간 영장류, 예컨대 침팬지, 다른 유인원 또는 원숭이 종; 축산 동물, 예컨대 소, 말, 양, 염소, 돼지; 사육 동물, 예컨대 토끼, 개 또는 고양이; 실험 동물, 예를 들어 설치류, 예컨대 래트, 마우스 또는 기니아 피그 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에서 상기 비-포유동물의 예로는 조류 또는 어류 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에서 상기 개체에 투여되는 자연살해세포를 얻는 방법은 상기 자연살해세포의 제조 방법에서 기재된 바와 중복되어, 명세서의 과도한 복잡을 피하고자 이하 그 기재를 생략한다.
또한, 본 발명에서 상기 자연살해세포는 본 발명의 상기 방법으로 유도된 자연살해세 외에 NK-92 세포일 수 있다. 이때 상기 NK-92 세포의 활성화 방법 또한 상기 약학적 조성물에서 기재된 바와 중복되어, 명세서의 과도한 복잡을 피하고자 이하 그 기재를 생략한다.
본 발명의 방법에서 상기 자연살해세포는 상기 개체에게 각 투여 시 1X103 세포/kg 이상, 1X104 세포/kg 이상, 1X105 세포/kg 이상, 3X105 세포/kg 이상, 1X106 세포/kg 이상, 3X106 세포/kg 이상, 6X106 세포/kg 이상, 또는 1X107 세포/kg 이상, 그리고 1X1010 세포/kg 이하의 양으로 투여될 수 있고, 바람직하게는 1X106 ~ 1X107 세포/kg, 보다 바람직하게는 1X106 ~ 5X106 세포/kg, 가장 바람직하게는 3X106 세포/kg의 양으로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 신경내분비종양은 위장관-췌장 신경내분비종양(gastroenteropancreatic neuroendocrine tumor), 유암종(carcinoid tumor), 갈색세포종(pheochromocytoma), 부신경절종(paraganglioma), 갑상선수질암(medullary thyroid cancer), 폐 신경내분비종양(pulmonary neuroendocrine tumor), 흉선 신경내분비종양(thymic neuroendocrine tumor), 췌장 신경내분비종양(pancreatic neuroendocrine tumor), 뇌하수체 선종(pituitary adenoma), 부신 종양(adrenal gland tumors), 메켈세포암종(Merkel cell carcinoma), 유방암(breast cancer), 비-호치킨 림프종(Non-Hodgkin lymphoma), 호치킨 림프종(Hodgkin lymphoma), 두경부 종양(Head & Neck tumor), 요로상피세포암종(urothelial carcinoma), 신장세포암종(renal cell carcinoma), 간세포암종(hepatocellular carcinoma), GIST, 신경모세포종(neuroblastoma), 자궁경부 종양(cervix tumor), 유잉육종(Ewing sarcoma), 골육종(osteosarcoma), 소세포폐암(small cell lung cancer; SCLC), 전립선암(prostate cancer), 흑색종(melanoma), 뇌수막종(meningioma), 신경교종(glioma), 수모세포종(medulloblastoma), 혈관아종(hemangioblastoma), 원시신경외배엽 종양(supratentorial primitive neuroectodermal tumor) 및 감각신경모세포종(esthesioneuroblastoma)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 바람직하게는 위장관-췌장 신경내분비종양(gastroenteropancreatic neuroendocrine tumor) 또는 췌장 신경내분비종양(pancreatic neuroendocrine tumor)일 수 있다.
본 발명에서 상기 자연살해세포는 상기 개체에게 1회 투여될 수 있거나, 또는 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23시간마다 1회씩, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일마다 1회씩, 또는 요법 동안 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10주 또는 그 이상의 주마다 1회씩, 또는 종점을 포함하는 임의의 2개의 수 사이의 임의의 범위로 다수회 투여될 수 있다.
본 발명에서 유도되는 자연살해세포는 신경내분비종양 세포에 대한 살상능이 매우 뛰어나 신경내분비종양을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
도 1은 참고 실험예 1에서, 실시예 1에서 얻어진 자연살해세포에 대하여 panT 세포 마커인 CD3와, 자연살해세포 마커인 CD56의 발현 수준을 유세포 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 참고 실험예 1에서, 실시예 1에서 얻어진 자연살해세포에 대하여 CD56의 발현 정도를 유세포 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 참고 실험예 1에서, 실시예 1에서 얻어진 자연살해세포에 대하여 CD56 및 CD16의 발현 정도를 유세포 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 참고 실험예 1에서, 실시예 1에서 얻어진 자연살해세포에 대하여 CD56 및 CD16의 발현 정도를 유세포 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 참고 실험예 1에서, 실시예 1에서 얻어진 자연살해세포에 대하여 항원제시세포 마커인 CD40과, panT 세포 마커인 CD3의 발현 수준을 유세포 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 참고 실험예 2에서, 실시예 3에서 활성화된 NK-92 세포주에 대하여 panT 세포 마커인 CD3와, 자연살해세포 마커인 CD56의 발현 수준을 유세포 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 참고 실험예 2에서, 실시예 3에서 활성화된 NK-92 세포주에 대하여 CD56 및 CD16의 발현 정도를 유세포 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 참고 실험예 2에서, 실시예 3에서 활성화된 NK-92 세포주에 대하여 CD56 및 CD16의 발현 정도를 유세포 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 참고 실험예 2에서, 실시예 3에서 활성화된 NK-92 세포주에 대하여 항원제시세포 마커인 CD40과, panT 세포 마커인 CD3의 발현 수준을 유세포 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 실험예 1에서 이펙터 세포(Effector cells)로 실시예 1에서 얻어진 자연살해세포와 타겟 세포(Target cells)로 신경내분비종양 세포의 공배양 비율에 따른 타겟 세포의 사멸율의 변화를 확인하여 그 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 11은 실험예 2에서 이펙터 세포(Effector cells)로 실시예 3에서 활성화된 NK-92 세포와 타겟 세포(Target cells)로 신경내분비종양 세포의 공배양 비율에 따른 타겟 세포의 사멸율의 변화를 확인하여 그 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 12는 실험예 3에서 RFP 유전자가 발현되도록 형질 전환된 Bon1 세포주에 실시예 1에서 얻어진 자연살해세포를 혼합 배양한 뒤 5일 경과 후 형광 현미경으로 RFP의 발현 여부를 관찰한 사진이다.
도 13은 실험예 3에서 RFP 유전자가 발현되도록 형질 전환된 Qgp1 세포주에 실시예 1에서 얻어진 자연살해세포를 혼합 배양한 뒤 5일 경과 후 형광 현미경으로 RFP의 발현 여부를 관찰한 사진이다.
도 14는 실험예 3에서 RFP 유전자가 발현되도록 형질 전환된 K562 세포주에 실시예 1에서 얻어진 자연살해세포를 혼합 배양한 뒤 5일 경과 후 형광 현미경으로 RFP의 발현 여부를 관찰한 사진이다.
도 15는 실험예 4에서 RFP 유전자가 발현되도록 형질 전환된 Bon1 세포주에 실시예 3에서 활성화된 NK-92 세포를 혼합 배양한 뒤 5일 경과 후 형광 현미경으로 RFP의 발현 여부를 관찰한 사진이다.
도 16은 실험예 4에서 RFP 유전자가 발현되도록 형질 전환된 Qgp1 세포주에 실시예 3에서 활성화된 NK-92 세포를 혼합 배양한 뒤 5일 경과 후 형광 현미경으로 RFP의 발현 여부를 관찰한 사진이다.
도 17은 실험예 4에서 RFP 유전자가 발현되도록 형질 전환된 K562 세포주에 실시예 3에서 활성화된 NK-92 세포를 혼합 배양한 뒤 5일 경과 후 형광 현미경으로 RFP의 발현 여부를 관찰한 사진이다.
도 2는 참고 실험예 1에서, 실시예 1에서 얻어진 자연살해세포에 대하여 CD56의 발현 정도를 유세포 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 참고 실험예 1에서, 실시예 1에서 얻어진 자연살해세포에 대하여 CD56 및 CD16의 발현 정도를 유세포 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 참고 실험예 1에서, 실시예 1에서 얻어진 자연살해세포에 대하여 CD56 및 CD16의 발현 정도를 유세포 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 참고 실험예 1에서, 실시예 1에서 얻어진 자연살해세포에 대하여 항원제시세포 마커인 CD40과, panT 세포 마커인 CD3의 발현 수준을 유세포 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 참고 실험예 2에서, 실시예 3에서 활성화된 NK-92 세포주에 대하여 panT 세포 마커인 CD3와, 자연살해세포 마커인 CD56의 발현 수준을 유세포 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 참고 실험예 2에서, 실시예 3에서 활성화된 NK-92 세포주에 대하여 CD56 및 CD16의 발현 정도를 유세포 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 참고 실험예 2에서, 실시예 3에서 활성화된 NK-92 세포주에 대하여 CD56 및 CD16의 발현 정도를 유세포 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 참고 실험예 2에서, 실시예 3에서 활성화된 NK-92 세포주에 대하여 항원제시세포 마커인 CD40과, panT 세포 마커인 CD3의 발현 수준을 유세포 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 실험예 1에서 이펙터 세포(Effector cells)로 실시예 1에서 얻어진 자연살해세포와 타겟 세포(Target cells)로 신경내분비종양 세포의 공배양 비율에 따른 타겟 세포의 사멸율의 변화를 확인하여 그 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 11은 실험예 2에서 이펙터 세포(Effector cells)로 실시예 3에서 활성화된 NK-92 세포와 타겟 세포(Target cells)로 신경내분비종양 세포의 공배양 비율에 따른 타겟 세포의 사멸율의 변화를 확인하여 그 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 12는 실험예 3에서 RFP 유전자가 발현되도록 형질 전환된 Bon1 세포주에 실시예 1에서 얻어진 자연살해세포를 혼합 배양한 뒤 5일 경과 후 형광 현미경으로 RFP의 발현 여부를 관찰한 사진이다.
도 13은 실험예 3에서 RFP 유전자가 발현되도록 형질 전환된 Qgp1 세포주에 실시예 1에서 얻어진 자연살해세포를 혼합 배양한 뒤 5일 경과 후 형광 현미경으로 RFP의 발현 여부를 관찰한 사진이다.
도 14는 실험예 3에서 RFP 유전자가 발현되도록 형질 전환된 K562 세포주에 실시예 1에서 얻어진 자연살해세포를 혼합 배양한 뒤 5일 경과 후 형광 현미경으로 RFP의 발현 여부를 관찰한 사진이다.
도 15는 실험예 4에서 RFP 유전자가 발현되도록 형질 전환된 Bon1 세포주에 실시예 3에서 활성화된 NK-92 세포를 혼합 배양한 뒤 5일 경과 후 형광 현미경으로 RFP의 발현 여부를 관찰한 사진이다.
도 16은 실험예 4에서 RFP 유전자가 발현되도록 형질 전환된 Qgp1 세포주에 실시예 3에서 활성화된 NK-92 세포를 혼합 배양한 뒤 5일 경과 후 형광 현미경으로 RFP의 발현 여부를 관찰한 사진이다.
도 17은 실험예 4에서 RFP 유전자가 발현되도록 형질 전환된 K562 세포주에 실시예 3에서 활성화된 NK-92 세포를 혼합 배양한 뒤 5일 경과 후 형광 현미경으로 RFP의 발현 여부를 관찰한 사진이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
[실시예 1] 자연살해세포의 준비
덱스트란으로 코팅된 자성 미세구(microsphere)를 포함하고 있는 EasySepTM Direct RapidSpheresTM 50300 (STEMCELL Technologies, Canada)를 이용하여 건강한 혈액공여자의 전혈로부터 비-자연살해세포, 즉 적혈구 세포(RBC) 등을 제거하여 자연살해세포를 농축 및 선별하였다. 구체적으로 건강한 기증자로부터 얻은 전혈 시료 60ml을 2개의 50ml 튜브에 30ml씩 옮기고, 분리 칵테일 50 μl/ml를 첨가한 뒤 상온에서 5 분간 인큐베이션 하였다. RapidSpheresTM를 30초간 볼텍싱한 뒤 시료에 50 μl/ml의 양을 첨가 후 상온에서 5 분간 인큐베이션 하였다. 이후, 둘베코 인산염 완충 식염수(Dulbecco's phosphate-buffered saline; DPBS)를 총 용량이 45ml이 되도록 첨가한 후 자석(EasySepTM magnet) 상에 튜브를 놓고 상온에서 10분간 인큐베이션 하였다. 이후 자석과 튜브의 위치를 바꾼 뒤, 농축 세포 현탁액을 새로운 튜브에 부었다. RapidSpheresTM를 초기 전혈 시료 양 (ml)에 대한 50 μl/ml의 양으로 첨가하여, 따라서 전단계에서 넣었던 RapidSpheresTM와 동일한 양을 첨가하고 상온에서 5분간 인큐베이션한 뒤 둘베코 인산염 완충 식염수(Dulbecco's phosphate-buffered saline; DPBS)를 총 용량이 40 ml이 되도록 첨가한 후 자석 상에 튜브를 놓고 상온에서 5분간 인큐베이션 하였다. 이후 자석과 튜브의 위치를 바꾼 뒤, 농축 세포 현탁액을 새로운 튜브에 부었다. 2차 농축된 세포 현탁액을 자석의 존재 하에서 5분간 인큐베이션한 뒤 자석과 튜브의 위치를 바꾼 후 3차 농축 세포 현탁액을 회수하였다. 3차 농축 세포 현탁액에서는 대부분의 적혈구 세포가 제거되고 목적하는 자연살해세포(CD3-CD56+ 세포)가 농축 및 선별되어 포함되어 있었다. 이후 3차 농축 세포 현탁액에, 동량의 DPBS를 첨가하여 1500 rpm으로 5분간의 세척 공정을 3회 수행하였다. 농축된 자연살해세포를 NK 증폭 배지(ALyS505NK-IL2 1000 IU/ml, Cell Science & Technology Inst) 20ml를 포함하는 T75 플라스크에서 배양하였다. 초기에는 T75 플라스크를 세워서 배양하다가 세포의 밀도가 높아지면 T75 플라스크를 눕혀서 배양을 지속하였다. 3일마다 IL-2 활성화된 자연살해세포에 신선한 배지를 추가하였고, 배양 12~14일 후에 T175 플라스크로 이동시켜 7~10일 동안 추가로 배양하였다. 단, T175 플라스크에서 배양 시에도 초기에는 T175 플라스크를 세워서 배양하다가 세포의 밀도가 높아지면 T175 플라스크를 눕혀서 배양하였다.
[실시예 2] 자연살해세포의 준비
건강한 기증자로부터 혈액을 얻은 뒤 PBMC를 분리하였다. MACSxpress (Milteyi Biotec, Germany)를 이용하여 CD3+ T 세포를 제거하였다. DPBS 버퍼를 이용하여 T 세포가 제거된 PBMC를 2차례 세척한 뒤 NK 활성화 배지(ALyS505NK-AC1000(IL-2 1000 IU/ml), Cat.# 01610P02, Cell Science & Technology Inst) 10ml를 포함하는 T75 플라스크에서 배양하였다. 3~5일 후 IL-2 활성화된 자연살해세포의 세포 클러스터를 확인하여 신선한 배지를 추가하였고, 초기에는 T75 플라스크를 세워서 배양하다가 세포의 밀도가 높아지면 T75 플라스크를 눕혀서 배양을 지속하였다. 배양 7~10일 후에 T175 플라스크로 이동시켰다. 자연살해세포 증폭은 목표로 하는 세포 수에 도달할 때까지 배지(ALyS505NK-EX1000(IL-2 1000 IU/ml), Cat.# 01410P10, Cell Science & Technology Inst) 10ml를 계속하여 추가해 주면서 14~21일 동안 추가로 수행하였다. 단, T175 플라스크에서 배양 시에도 초기에는 T175 플라스크를 세워서 배양하다가 세포의 밀도가 높아지면 T175 플라스크를 눕혀서 배양하였다.
[실시예 3] NK-92 자연살해세포의 준비
동결보관된 NK-92 세포주를 해동하여 DPBS 버퍼를 이용하여 세척한 뒤 NK 활성화 배지(ALyS505NK-AC1000(IL-2 1000 IU/ml), Cat.# 01610P02, Cell Science & Technology Inst) 10mL을 포함하는 T25 플라스크에서 세워서 배양하였다. 배양 7~10일 후 세포의 클럼프(clump)를 확인하여 신선한 배지를 추가하고, 세포의 밀도가 높아지면 T75 플라스크로 이동시켜 눕혀서 배양을 지속하였다.
[참고 실험예 1] 분화 유도된 자연살해세포의 발현 마커 확인
상기 실시예 1에서 분화 유도된 자연살해세포에서 발현되는 마커를 확인하기 위하여, PerCP-Cy™5.5 Mouse Anti-Human CD56, FITC Mouse Anti-Human CD3, PE Mouse Anti-Human CD40 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 세포 표면 항원에 대한 단클론항체 (monoclonal antibody)를 이용하여 간접 형광 염색을 통해 유세포 분석을 수행하였고, 그 결과는 도 1 내지 5에 나타내었다.
도 1에서 보는 바와 같이, 자연살해세포 마커인 CD56이 발현되는 세포 분획은 90% 이상이었고, panT 세포 마커인 CD3가 발현되는 세포 분획은 3.92%에 불과하였는 바, 상기 실시예 1을 통해 순수하게 자연살해세포가 정제되었음을 알 수 있었다.
또한, 도 2에서 보는 바와 같이, CD56 양성 NK 세포는 발현의 정도에 따라 bright와 dim으로 구분되는데, 그 중 dim 분획이 활성도가 더욱 강한 것으로 알려져 있다. 유세포 분석상 CD56 양성 NK 세포 중 dim 분획이 73.8%를 차지하였고, bight 분획은 16.1%로 상대적으로 적은 비율로 포함되어 있었다. 그 외의 극소량의 세포는 T 세포 마커와 자연살해세포 마커 모두에 양성을 보여 NKT 세포(3.54%)일 가능성을 보였다.
한편, NK 세포는 세 아형으로 나눌 수 있고, 상세하게는 세포 융해 기능을 갖고 있는 CD56dimCD16+ NK 세포, 사이토카인을 생산하는 CD56+CD16+/- NK 세포와, 아직까지 정확한 기능이 밝혀지지 않은 CD56-CD16+ NK 세포가 있다. 동종혈액유래 자연살해세포(NK세포)는 CD56 및 CD16 세포 표면 항원을 발현하고 강한 세포독성(cytotoxicity)을 갖는다. 도 3 및 4에서 보는 바와 같이, 녹색 계통(FITC)으로 자연살해세포의 활성화 수용체 CD16(67.91%)가 발현되고, 적색 계통(PC5.5, percp5.5)으로 CD56(96.76%)가 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
도 5에서 보는 바와 같이, 항원 제시 세포(APC) 마커인 CD40과 T 세포 마커인 CD3에 대한 이중 유세포 분석을 수행한 결과, 실시예 1로부터는 순수하게 자연살해세포가 분리되었는 바, APC 세포와 T 세포 분획이 매우 낮게 관찰되었다.
[참고 실험예 2] NK-92 세포의 발현 마커 확인
실시예 3에서 활성화된 NK-92 세포주에 대하여도 상기 참고 실험예 1과 동일한 방법으로 유세포 분석을 수행하였고, 그 결과는 도 6 내지 9에 나타내었다.
도 6에서 보는 바와 같이, NK-92 세포주에서도 전체적인 양상은 상기 실시예 1에서 분화 유도된 세포와 유사한 양상을 보였으나, CD56의 발현이 더욱 두드러지고, T 세포 마커의 발현은 전무한 소견을 보였다. 즉, NK-92 세포주는 순수한 CD56+ 자연살해세포인 것을 알 수 있었다.
도 7 및 8에서 보는 바와 같이, NK-92 세포주의 경우 상기 실시예 1에서 분화 유도된 세포와는 다르게 CD16 세포 표면 항원이 발현되지 않는 것을 볼 수 있다. 이를 통해 세포 독성은 약하고 다양한 종류의 사이토카인을 분비하는 특징을 가짐을 알 수 있었다.
또한, 도 9에서 보는 바와 같이, APC 마커인 CD40과 T 세포 마커인 CD3에 대하여도 실시예 1의 세포와 유사한 양상을 보였고, 즉 APC 세포와 T 세포 분획이 거의 포함되어 있지 않은 순수한 자연살해세포임을 알 수 있었다.
[실험예 1] 신경내분비종양 세포주에 대한 자연살해세포의 살상력 평가(1)
96-웰 플레이트에 이펙터 세포주(Effector cells)로 상기 실시예 1의 자연살해세포와 타겟 세포주(Target cells)로 Bon1 세포, Qgp1 세포 또는 K562 세포를 다양한 비율(1:10, 1:5, 1:1, 5:1 및 10:1)로 접종 및 배양하였다. 시료의 세포 독성 효과는 WST-8 (Water Soluble Tetrazolium salt)을 이용하는 Cell Counting Kit (Cell Counting Kit-8, Dojindo Laboratories)와 암 세포가 유리한 LDH(lactate dehydrogenase)의 양을 이용하는 Cytotoxicity Assay Kit (CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay kit, Promega )를 이용하여 제조사의 지침에 따라 450 nm, 490 nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과는 도 10에 나타내었다.
도 10에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따르는 자연살해세포의 비율 의존적으로 Bon1 세포 및 Qgp1 세포의 사멸율이 증가하였으며, Bon1 세포 및 Qgp1 세포의 사멸율이 대략 90% 이상으로 매우 높은 반면, K562 세포의 사멸율은 27%에 불과하였다.
[실험예 2] 신경내분비종양 세포주에 대한 자연살해세포의 살상력 평가(2)
상기 실험예 1과 동일한 방법으로 실험을 수행하되, 이때 자연살해세포로는 실시예 3에서 활성화된 NK-92 세포주를 사용하였다, NK-92 세포주와 타겟 세포주(Target cells)를 다양한 비율(1:10, 1:5, 1:1, 5:1 및 10:1)로 접종한 뒤 세포 독성을 평가하여 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에서 보는 바와 같이, NK-92 세포의 비율 의존적으로 Bon1 세포 및 Qgp1 세포의 사멸율이 증가하였으며, Bon1 세포 및 Qgp1 세포의 경우 NK-92 세포와 혼합 접종하자 사멸율이 대략 90% 이상으로 매우 높은 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 3] 신경내분비종양 세포주에 대한 자연살해세포의 살상력 평가(3)
형광 유전자인 RFP 유전자를 포함하고 있는 플라스미드 벡터(pLemiR, addgene, Open Biosystems)를 Bon1 세포주, Qgp1 세포주 또는 K562 세포주에 형질 감염 시킨 뒤 상기 실시예 1에서 얻어진 자연살해세포와 10:1의 비율(암세포주 5X103, 자연살해세포 5X104 세포 수)로 혼합 접종한 후 5일이 경과하였을 때 RFP의 발현을 형광 현미경으로 관찰하였다. 그 결과는 도 12 내지 14에 나타내었다.
도 12 내지 14에서 보는 바와 같이, Bon1 세포 또는 Qgp1 세포에 본 발명에 따르는 자연살해세포를 처리하자 대부분의 세포가 사멸된 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 4] 신경내분비종양 세포주에 대한 자연살해세포의 살상력 평가(4)
상기 실험예 3과 동일한 방법으로 실험을 수행하되, 자연살해세포로 실시예 3에서 활성화된 NK-92 세포주를 사용하였다. RFP 유전자가 발현되도록 형질 전환된 Bon1 세포주, Qgp1 세포주 또는 K562 세포주에 NK-92 세포주를 처리한 후 5일이 경과하였을 때 형광 현미경으로 RFP의 발현을 관찰하였고, 그 결과는 도 15 내지 17에 나타내었다.
도 15 내지 17에서 보는 바와 같이, Bon1 세포 또는 Qgp1 세포에 NK-92 세포를 처리하자 대부분의 세포가 사멸된 것을 확인할 수 있었다.
이를 통하여 본 발명에 따른 자연살해세포를 이용하는 경우 신경내분비종양을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있음을 알 수 있었다.
이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.
Claims (16)
- 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는 신경내분비종양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 자연살해세포는 말초혈액 단핵세포(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 또는 혈액으로부터 분리된 자연살해세포를 사이토카인(cytokine)이 포함된 배양 배지가 포함된 T75 플라스크에서 배양한 뒤 T175 플라스크로 이동시켜 추가로 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 유도된 것인, 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 자연살해세포는 NK-92 세포인, 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 신경내분비종양은 위장관-췌장 신경내분비종양(gastroenteropancreatic neuroendocrine tumor), 유암종(carcinoid tumor), 갈색세포종(pheochromocytoma), 부신경절종(paraganglioma), 갑상선수질암(medullary thyroid cancer), 폐 신경내분비종양(pulmonary neuroendocrine tumor), 흉선 신경내분비종양(thymic neuroendocrine tumor), 췌장 신경내분비종양(pancreatic neuroendocrine tumor), 뇌하수체 선종(pituitary adenoma), 부신 종양(adrenal gland tumors), 메켈세포암종(Merkel cell carcinoma), 유방암(breast cancer), 비-호치킨 림프종(Non-Hodgkin lymphoma), 호치킨 림프종(Hodgkin lymphoma), 두경부 종양(Head & Neck tumor), 요로상피세포암종(urothelial carcinoma), 신장세포암종(renal cell carcinoma), 간세포암종(hepatocellular carcinoma), GIST, 신경모세포종(neuroblastoma), 자궁경부 종양(cervix tumor), 유잉육종(Ewing sarcoma), 골육종(osteosarcoma), 소세포폐암(small cell lung cancer; SCLC), 전립선암(prostate cancer), 흑색종(melanoma), 뇌수막종(meningioma), 신경교종(glioma), 수모세포종(medulloblastoma), 혈관아종(hemangioblastoma), 원시신경외배엽 종양(supratentorial primitive neuroectodermal tumor) 및 감각신경모세포종(esthesioneuroblastoma)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 약학적 조성물. - 말초혈액 단핵세포(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 또는 혈액으로부터 분리된 자연살해세포를 사이토카인(cytokine)이 포함된 배양 배지가 포함된 T75 플라스크에서 배양한 뒤 T175 플라스크로 이동시켜 추가로 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 분화 유도된 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는 신경내분비종양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조 방법.
- 제5항에 있어서,
상기 제조 방법은 상기 말초혈액 단핵세포로부터 CD3+ T 세포를 제거하는 단계를 더 포함하는, 제조 방법. - 제5항에 있어서,
상기 사이토카인은 IL-2, IL-15, IL-21, Flt3-L, SCF, IL-7, IL-12 및 IL18로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 제조 방법. - 제5항에 있어서,
상기 혈액으로부터 분리된 자연살해세포는 자성 입자에 의해 혈액으로부터 분리된 것인, 제조 방법. - 제5항에 있어서,
상기 T75 플라스크를 이용한 배양 시 T75 플라스크를 세워서 1차 배양한 뒤 T75 플라스크를 눕혀서 2차 배양하는 단계를 포함하는, 제조 방법. - 제9항에 있어서,
상기 1차 배양 및 2차 배양은 1회 이상 수행되는, 제조 방법. - 제5항에 있어서,
상기 T175 플라스크를 이용한 배양 시 T175 플라스크를 세워서 1차 배양한 뒤 T175 플라스크를 눕혀서 2차 배양하는 단계를 포함하는 공간 제한적 조절에 의하는, 제조 방법. - 제11항에 있어서,
상기 1차 배양 및 2차 배양은 1회 이상 수행되는, 제조 방법. - 제5항에 있어서,
상기 배양 배지는 10 내지 50 ml의 양으로 사용되는, 제조 방법. - 제5항에 있어서,
상기 배양하는 단계는 상기 T75 플라스크에서 5 내지 15일 동안 배양한 뒤 T175 플라스크로 이동시켜 5 내지 21일 동안 배양하며 수행되는, 제조 방법. - 제5항에 있어서,
상기 신경내분비종양은 위장관-췌장 신경내분비종양(gastroenteropancreatic neuroendocrine tumor), 유암종(carcinoid tumor), 갈색세포종(pheochromocytoma), 부신경절종(paraganglioma), 갑상선수질암(medullary thyroid cancer), 폐 신경내분비종양(pulmonary neuroendocrine tumor), 흉선 신경내분비종양(thymic neuroendocrine tumor), 췌장 신경내분비종양(pancreatic neuroendocrine tumor), 뇌하수체 선종(pituitary adenoma), 부신 종양(adrenal gland tumors), 메켈세포암종(Merkel cell carcinoma), 유방암(breast cancer), 비-호치킨 림프종(Non-Hodgkin lymphoma), 호치킨 림프종(Hodgkin lymphoma), 두경부 종양(Head & Neck tumor), 요로상피세포암종(urothelial carcinoma), 신장세포암종(renal cell carcinoma), 간세포암종(hepatocellular carcinoma), GIST, 신경모세포종(neuroblastoma), 자궁경부 종양(cervix tumor), 유잉육종(Ewing sarcoma), 골육종(osteosarcoma), 소세포폐암(small cell lung cancer; SCLC), 전립선암(prostate cancer), 흑색종(melanoma), 뇌수막종(meningioma), 신경교종(glioma), 수모세포종(medulloblastoma), 혈관아종(hemangioblastoma), 원시신경외배엽 종양(supratentorial primitive neuroectodermal tumor) 및 감각신경모세포종(esthesioneuroblastoma)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 제조 방법. - NK-92 세포를 사이토카인(cytokine)이 포함된 배양 배지가 포함된 T25 플라스크에서 배양한 뒤 T75 플라스크로 이동시켜 추가로 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 활성화된 NK-92 세포를 유효성분으로 포함하는 신경내분비종양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조 방법.
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