JP7029617B2

JP7029617B2 - 末梢血から腫瘍反応性ｔ細胞の濃縮された集団を作製する方法

Info

Publication number: JP7029617B2
Application number: JP2019221431A
Authority: JP
Inventors: グロス、アレナ; エイ．ローゼンバーグ、スティーヴン
Original assignee: US Government
Current assignee: US Government
Priority date: 2013-03-01
Filing date: 2019-12-06
Publication date: 2022-03-04
Anticipated expiration: 2033-04-30
Also published as: EP3628322A1; AU2018204458B2; US10716809B2; US11679128B2; JP7252383B2; US20180133253A1; JP6903558B2; JP2018082702A; JP6257655B2; ES2771251T3; US9844569B2; AU2018204458A1; CA2902448C; AU2021202640B2; AU2019284080A1; CN111643524B; CN105163745B; CN105163745A; US20160008400A1; CN111643524A

Description

関連出願への相互参照
本特許出願は、２０１３年３月１日に出願された米国仮特許出願第６１／７７１，２５１号の利益を主張し、それは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本発明の背景
腫瘍反応性Ｔ細胞を用いる養子細胞療法（ACT）は、ある種の癌患者において明確な臨
床反応を引き起こし得る。それにもかかわらず、癌及び他の疾病の治療のためにＡＣＴを有効に活用するためには、いくつかの障壁が残っている。例えば、末梢血から単離されたＴ細胞は、十分な腫瘍特異的反応性を示さないことがある。従って、末梢血から腫瘍反応性Ｔ細胞の集団を得る方法を改善する必要がある。

本発明の簡単な概要
本発明の実施の態様は、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を得る方法を提供し、該方法は：（a）末梢血のサンプルから末梢血単核細胞（PBMCs）の混合集団（bulk
population）を得ること；（b）混合集団からＰＤ‐１及び／またはＴＩＭ‐３も発現するＣＤ８⁺Ｔ細胞を特異的に選択すること；及び（c）（b）において選択された細胞を、
選択されていない細胞から分離して、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を得ること、を含む。

本発明の別の実施態様は、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を、哺乳動物に投与する方法を提供し、該方法は：（a）末梢血のサンプルからPBMCsの混合集団を得ること；（b）混合集団からＰＤ‐１及び／またはＴＩＭ‐３も発現するＣＤ８⁺Ｔ細胞を特異的に選択すること；（c）（b）において選択された細胞を、選択されていない細胞から分離して、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を得ること；及び（d）腫瘍反
応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を哺乳動物に投与すること、を含む。

本発明の更に別の実施態様は、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を含む医薬組成物を得る方法を提供し、該方法は：（a）末梢血のサンプルからPBMCsの混合集団を得ること；（b）混合集団からＰＤ‐１及び／またはＴＩＭ‐３も発現するＣＤ８⁺Ｔ細胞を特異的に選択すること；（c）（b）において選択された細胞を選択されていない細胞から分離して、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を得ること；及び（d）腫瘍
反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を医薬上許容される担体と組み合わせて、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を含む医薬組成物を得ること、を含む。

本発明の追加的な実施態様は、関連する細胞集団、及び癌を治療または予防する方法を提供する。

図面のいくつかの図の簡単な説明
図１Ａ～１Ｂは、メラノーマ患者１９１３（A）またはメラノーマ患者３７１３（B）の末梢血から単離され、蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）により、ＣＤ８発現、ＰＤ‐１発現、またはＴＩＭ‐３発現、あるいはＰＤ‐１発現の欠損またはＴＩＭ‐３発現の欠損によってソートされ、インビトロで増加された細胞による、自己腫瘍細胞株に対する共培養時における、インターフェロン（IFN）-ガンマ分泌（pg／ml）（黒棒）、及び４‐１ＢＢを発現するＣＤ８⁺細胞の百分率（灰色棒）を示すグラフである。図１Ｃは、メラノーマ患者３２８９の末梢血から単離され、FACSによりＣＤ８発現、ＰＤ‐１発現、ＬＡＧ‐３発現またはＴＩＭ‐３発現、あるいはＰＤ‐１発現の欠損またはＴＩＭ‐３の発現の欠損によってソートされた細胞による、自己腫瘍に対する共培養時における、IFN-ガンマ分泌（pg／ml）（黒棒）、及び４‐１ＢＢを発現するＣＤ８⁺細胞の百分率（灰色棒）を示すグラフである。図２Ａ～２Ｃは、患者１９１３の末梢血から単離され、以下の発現によってソートされ、インビトロで増加させたエフェクター細胞による標的自己腫瘍細胞株ＴＣ１９１３（A）、同種異系（Allo.）腫瘍細胞株ＴＣ３２８９（B）、またはHLA-A０２０１-適合腫瘍細胞株ＴＣ２４４８（C）の特異的溶解の百分率を示すグラフである：ＣＤ８⁺（白丸）、ＰＤ‐１⁺（黒丸）、ＰＤ‐１^-（灰色丸）、ＴＩＭ‐３⁺（黒ひし形）、またはＴＩＭ‐３^-（灰色ひし形）。図２Ｄ～２Ｆは、患者３２８９（D-F）の末梢血から単離され、以下の発現によってソートされたエフェクター細胞による標的自己腫瘍細胞株ＴＣ３２８９（D）、同種異系腫瘍細胞株ＴＣ１９１３（E）、または同種異系腫瘍細胞株ＴＣ６２４（F）の特異的溶解の百分率を示すグラフである：ＣＤ８⁺（白丸）、ＰＤ‐１⁺（黒丸）、ＰＤ‐１^-（灰色丸）、ＴＩＭ‐３⁺（黒ひし形）、またはＴＩＭ‐３^-（灰色ひし形）。インビトロ増加後の標的細胞の溶解が示される。

本発明の詳細な説明
プログラム細胞死タンパク質１（programmed cell death protein 1，ＰＤ‐１；ＣＤ
２７９）及び／またはT-細胞イムノグロブリン及びムチンドメイン３（T-cell immunoglobulin and mucin domain 3，ＴＩＭ‐３）バイオマーカも発現するＣＤ８⁺細胞を選択す
ることにより、末梢血にある腫瘍反応性Ｔ細胞が濃縮されることが分かった。ＰＤ‐１及び／またはＴＩＭ‐３も発現するＣＤ８⁺細胞を選択することにより、これらのマーカを
発現しないＣＤ８⁺細胞に比べて、より多数の腫瘍反応性Ｔ細胞が有利に濃縮される。

この点において、本発明の実施態様は、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を得る方法を提供し、該方法は：（a）末梢血のサンプルから末梢血単核細胞（PBMCs）の混合集団を得ること；（b）混合集団からＰＤ‐１及び／またはＴＩＭ‐３も発現するＣ
Ｄ８⁺Ｔ細胞を特異的に選択すること；及び（c）（b）において選択された細胞を、選択
されていない細胞から分離して、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を得ること、を含む。本発明の方法は、インビトロでの培養の時間を短縮すること、及び自己腫瘍認識についてスクリーニングをする必要なく、腫瘍反応性Ｔ細胞のために選択することを好都合に可能にする。

本方法は、当分野において知られた任意の適切な方法によって末梢血のサンプルからPBMCsの混合集団を得ることを含み得る。PBMCsの混合集団を得る適切な方法としては、採血及び／または白血球アフェレーシス（leukapheresis）が挙げられ得るが、これらに限定
されない。腫瘍サンプルから得られるPBMCsの混合集団は、腫瘍反応性Ｔ細胞等のＴ細胞
を含み得る。

末梢血は、任意の哺乳動物から入手され得る。特に明記しない限り、本明細書で使用する場合、「哺乳動物」という用語は、限定されることなく、ウサギ等のウサギ目；ネコ科（猫）及びイヌ科（犬）等の食肉目；ウシ亜科（乳牛）及びイノシシ科（豚）等の偶蹄目；またはウマ科（ウマ）等の奇蹄目の哺乳動物を含む任意の哺乳動物に言及する。哺乳動物は、非ヒト霊長類、例えば、霊長目、セボイド（Ceboids）目、またはシモイド（Simoids）目（サル）またはアンスロポイド目（ヒト及び類人猿）が好ましい。いくつかの実施態様では、哺乳動物は、マウス及びハムスター等のネズミ目の哺乳動物であり得る。好ましくは、哺乳動物は非ヒト霊長類またはヒトである。特に好ましい哺乳動物はヒトである。

本方法は、ＰＤ‐１及び／またはＴＩＭ‐３も発現するＣＤ８⁺Ｔ細胞を混合集団から
特異的に選択することを含み得る。好ましい実施態様では、本方法は、ＣＤ３も発現する細胞を選択することを含む。本方法は、任意の適切な方法において細胞を特異的に選択することを含み得る。好ましくは、当該選択は、フローサイトメトリーを用いて実施される。フローサイトメトリーは、当分野において知られた任意の適切な方法を用いて実施され得る。フローサイトメトリーは、任意の適切な抗体及び染料を用い得る。例えば、ＣＤ３、ＣＤ８、ＴＩＭ‐３、またはＰＤ‐１の特異的な選択は、それぞれ抗ＣＤ３、抗ＣＤ８、抗ＴＩＭ‐３、または抗ＰＤ‐１抗体を用いて行われ得る。好ましくは、抗体は、選択された特定のバイオマーカを特異的に認識し、これに結合するように選択される。抗体または複数の抗体は、ビーズ（例えば、磁気ビーズ）または蛍光色素に結合され得る。好ましくは、フローサイトメトリーは、蛍光活性化セルソーティング（FACS）である。

本発明の実施態様では、特異的に選択することは、ＴＩＭ‐３、ＰＤ‐１のいずれか１つの発現、またはＴＩＭ‐３及びＰＤ‐１の両方の発現に対し陽性であるＣＤ８⁺Ｔ細胞
を特異的に選択することを含み得る。この点に関し、特異的に選択することは、ＴＩＭ‐３もしくはＰＤ‐１発現に対し単独陽性であるＴ細胞を特異的に選択すること、またはＴＩＭ‐３及びＰＤ‐１の同時共発現に対し二重陽性であるＴ細胞を特異的に選択することを含み得る。本発明の実施態様では、本方法は、ＴＩＭ‐３を発現するＣＤ８⁺Ｔ細胞を
混合集団から特異的に選択することを含む。本発明の更に別の実施態様では、本方法は、混合集団からＰＤ‐１を発現するＣＤ８⁺Ｔ細胞を特異的に選択することを含む。本発明
の更に別の実施態様は、（i）ＴＩＭ‐３⁺／ＰＤ‐１⁺、（ii）ＴＩＭ‐３^-／ＰＤ‐１⁺
、または（iii）ＴＩＭ‐３⁺／ＰＤ‐１^-であるＣＤ８⁺Ｔ細胞を混合集団から特異的に選択することを含む。本発明の別の実施態様では、本明細書中に記述された方法のいずれかが、ＣＤ３⁺も発現する細胞を選択することを更に含み得る。

本発明の実施の態様では、特異的に選択することは、本明細書中に記述されたマーカのいずれかを発現するＣＤ８⁺細胞の組み合わせを特異的に選択することを含み得る。この
点に関し、本方法は、腫瘍反応性細胞について濃縮された細胞集団であって、本明細書中に記述されたバイオマーカのいずれか２つを発現する細胞の混合物を含むものを作製し得る。本発明の実施態様では、特異的に選択することは、ＰＤ‐１⁺細胞及びＴＩＭ‐３⁺細胞の組み合わせを特異的に選択することを含む。本発明の別の実施態様では、本明細書中に記述された方法のいずれかは、ＣＤ８⁺及び／またはＣＤ３⁺も発現する細胞を選択することを更に含み得る。

本方法は、選択された細胞を、選択されていない細胞から分離して、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を得ることを含み得る。この点において、選択された細胞は、選択されていない細胞から物理的に分離され得る。選択された細胞は、例えば、ソーティング等の任意の適切な方法によって、選択されていない細胞から分離され得る。選択されていない細胞から選択された細胞を分離することにより、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団が好ましくは作製される。

本発明の方法によって得られた細胞集団は、有利に腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮される。この点において、本発明の方法によって得られた細胞集団は、ＴＩＭ‐３及び／またはＰＤ‐１発現によるソーティングによって得られたものではない細胞集団と比べて、より高い割合の腫瘍反応性Ｔ細胞を含み得る。

本発明の実施態様では、本方法は、自己腫瘍認識についてスクリーニングすることなく、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を得ることを含む。この点において、本発明の方法は、自己腫瘍認識について細胞をスクリーニングする必要なく、腫瘍反応性を
有する細胞について濃縮された細胞集団を有利に提供する。

本発明の実施の態様では、本方法は、細胞を特異的に選択する前にＴ細胞の混合集団を非特異的に刺激することを含まない。この点において、本発明の方法は、Ｔ細胞の混合集団を非特異的に刺激（例えば、抗４‐１ＢＢ抗体、抗ＣＤ３抗体、及び／または抗ＣＤ２８抗体を用いて）することなく、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を有利に提供する。

本発明の実施態様では、本方法は、本発明の方法によって得られた濃縮された細胞集団においてインビトロでＴ細胞数を増大させることを更に含む。Ｔ細胞の数は、少なくとも約３倍（または４、５、６、７、８、もしくは９倍）、より好ましくは少なくとも約１０倍（または２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、もしくは９０倍）、より好ましくは少なくとも約１００倍、より好ましくは少なくとも約１,０００倍、または最も好ま
しくは少なくとも約１００，０００倍に増加され得る。Ｔ細胞の数は、その分野において知られた任意の適切な方法を用いて増加され得る。細胞数を増大させる典型的な方法は、米国特許第８,０３４,３３４号及び米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３号において記述され、そのそれぞれは、参照することによって本明細書中に組み込まれる。

本発明の実施態様では、本方法は、ＴＷＳ１１９、インターロイキン（ＩＬ‐２１）、ＩＬ‐１２、ＩＬ‐１５、ＩＬ‐７、形質転換成長因子（TGF）ベータ、及びＡＫＴイン
ヒビター（AKTi）のいずれか１以上の存在下、本発明の方法によって得られた濃縮された細胞集団を培養することを更に含む。特定の理論に拘束されることなく、ＴＷＳ１１９、ＩＬ‐２１、及び／またはＩＬ‐１２の存在下において、濃縮された細胞集団を培養することは、濃縮された細胞集団の分化を抑制または遅延させることにより、濃縮された細胞集団の抗腫瘍反応性を有利に強化し得ると考えられる。

本発明の実施態様では、本方法は、ＩＬ‐１２、ＩＬ‐７、ＩＬ‐１５、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ｍｉｒ１５５、及び抗ＰＤ‐１ｓｉＲＮＡのいずれか１以上をコードするヌ
クレオチド配列を用いて、本明細書中に記述された本発明の方法のいずれかによって得られた濃縮された集団の細胞を形質導入すること、またはトランスフェクトすることを更に含む。

本発明の実施態様では、本方法は、本発明の方法によって得られた濃縮された細胞集団を、癌抗原及び／または自己腫瘍細胞で刺激することを更に含む。癌抗原及び／または自己腫瘍細胞で濃縮された細胞集団を刺激することは、任意の適切な方法によってなされ得る。例えば、濃縮された細胞集団を刺激することは、癌抗原及び／または自己腫瘍細胞を濃縮された細胞集団に物理的に接触させることによってなされ得る。特定の理論に拘束されることなく、癌抗原及び／または自己腫瘍細胞で濃縮された細胞集団を刺激することにより、濃縮された細胞集団の抗腫瘍反応性が有利に促進され得ると考えられる。

本明細書中において使用される「癌抗原」という用語は、抗原が腫瘍または癌に関連付けられるように、腫瘍細胞または癌細胞によってもっぱらまたは大部分が発現され、または過剰発現される任意の分子（例えば、タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物等）のことをいう。癌抗原は、正常、非腫瘍、または非癌性細胞によって追加的に発現され得る。しかしながら、このような場合には、正常、非腫瘍、または非癌性細胞による癌抗原の発現は、腫瘍または癌細胞による発現程に強く（robust）ない。この点において、腫瘍または癌細胞は、抗原を過剰発現し得、または正常、非腫瘍、もしくは非癌性細胞による抗原の発現に比べて、より有意に高いレベルにおいて抗原を発現し得る。また、癌抗原は、発生または成熟（maturation）の異なる状態の細胞によって追加的に発現され得る。例えば、癌抗原は、胚形成期または胎児期の細胞によって追加的に発現され得、該細胞は、成体
宿主（adult host）において通常みられない。あるいは、癌抗原は、幹細胞または前駆細胞によって追加的に発現され得、該細胞は、成体宿主には通常みられない。

癌抗原は、本明細書中に記述された癌及び腫瘍を含む、任意の癌または腫瘍のいずれかの細胞によって発現される抗原であり得る。癌抗原は、１種類のみの癌または腫瘍に関連づけられ、またはこれらに特徴的であるように、１種類のみの癌または腫瘍の癌抗原であり得る。代わりに、癌抗原は、２種類以上の癌または腫瘍の癌抗原（例えば、特徴的であり得る）であり得る。例えば、癌抗原は、乳癌及び前立腺癌細胞の両方によって発現され、正常、非腫瘍、または非癌性細胞によって全く発現されなくてもよい。典型的な癌抗原としては、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ－１、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ５、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ７、ＭＡＧＥ－Ａ８、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１１、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、血管内皮増殖因子受容体２（VEGFR－２）、ＨＥＲ－２、メソテリン（mesothelin）、及び上皮細胞増殖因子受容体変異III（epidermal growth factor receptor variant III, EGFR III）のいずれか１以上が挙げられ得る。

本発明の方法は、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を有利に作製する。Ｔ細胞は、腫瘍細胞を特異的に認識し、溶解し、及び／または死滅させるように、腫瘍反応性であり得る。この点において、本発明の実施態様は、明細書中に記述された本発明の方法のいずれかによって得られ、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団であって、単離され、または精製された細胞集団を提供する。実施の態様では、単離され、または精製された細胞集団は、（a）ＣＤ８⁺／ＴＩＭ‐３⁺／ＰＤ‐１⁺Ｔ細胞、（b）ＣＤ８⁺／ＴＩＭ‐３^-／ＰＤ‐１⁺Ｔ細胞、及び（c）ＣＤ８⁺／ＴＩＭ‐３⁺／ＰＤ‐１^-Ｔ細胞、を含み、細胞集団は、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮される。本発明の別の実施態様では、単離され、または精製された細胞集団は、（a）ＣＤ８⁺／ＴＩＭ‐３⁺／ＰＤ‐１⁺Ｔ細胞、（b）ＣＤ８⁺／ＴＩＭ‐３^-／ＰＤ‐１⁺Ｔ細胞、または（c）ＣＤ８⁺／ＴＩＭ‐３⁺／Ｐ
Ｄ‐１^-Ｔ細胞、を含む。本発明の別の実施態様では、本明細書中に記述された細胞集団
のいずれかは、ＣＤ３⁺でもあり得る。

本発明の実施態様では、単離され、または精製された細胞集団は、本明細書中に記述されたバイオマーカのいずれかを発現する細胞の混合物を含む。例えば、単離され、または精製された細胞集団は、ＰＤ‐１⁺細胞及びＴＩＭ‐３⁺細胞の組み合わせを含み得る。本発明の別の実施態様では、本明細書中に記述された細胞集団のいずれかはまた、ＣＤ８⁺
及び／またはＣＤ３⁺であり得る。

本明細書中において使用される「単離され（isolated）」という用語は、その天然の環境から取り出されていることを意味する。本明細書中において使用される「精製され（purified）」という用語は、純度を増加させたことを意味し、「純度」は、相対的な用語であり、必ずしも絶対純度と解釈されない。例えば、純度は、少なくとも約５０%であり得
、６０%、７０%もしくは８０%より大きく、９０%より大きく、あるいは１００%であり得
る。

本発明の別の実施態様は、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を哺乳動物に投与する方法を提供し、該方法は：（a）末梢血のサンプルからPBMCsの混合集団を得ること；（b）混合集団からＰＤ‐１及び／またはＴＩＭ‐３も発現するＣＤ８⁺Ｔ細胞を特異的に選択すること；（c）（b）において選択された細胞を、選択されていない細胞から分離して、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を得ること；及び（d）腫瘍反応
性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を哺乳動物に投与すること、を含む。末梢血のサンプルからPBMCsの混合集団を得ること、混合集団からＰＤ‐１及び／またはＴＩＭ‐３も
発現するＣＤ８⁺Ｔ細胞を特異的に選択すること、並びに選択された細胞を、選択されて
いない細胞から分離して、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を得ることは、本発明の他の態様に関して本明細書中に記述されたようになされ得る。

本方法は、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を哺乳動物へ投与することを更に含み得る。腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団は、任意の適切な方法において投与され得る。好ましくは、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団は、例えば、静脈に注射することによって投与される。

腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された本発明の細胞集団は、医薬組成物等の組成物中に含まれ得る。この点において、本発明は、本明細書中に記述された細胞集団のいずれか及び医薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。

本発明の別の実施態様は、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を含む医薬組成物を得る方法を提供し、該方法は：（a）末梢血のサンプルからPBMCsの混合集団を得ること；（b）混合集団からＰＤ‐１及び／またはＴＩＭ‐３も発現するＣＤ８⁺Ｔ細胞を特異的に選択すること；（c）（b）において選択された細胞を、選択されていない細胞から分離して、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を得ること；及び（d）腫瘍反
応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を医薬上許容される担体と組み合わせて、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を含む医薬組成物を得ること、を含む。末梢血のサンプルからPBMCsの混合集団を得ること、混合集団からＰＤ‐１及び／またはＴＩＭ‐
３も発現するＣＤ８⁺Ｔ細胞を特異的に選択すること、並びに選択された細胞を、選択さ
れていない細胞から分離して、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を得ることは、本発明の他の態様に関して本明細書中に記述されたようになされ得る。

本方法は、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を医薬上許容される担体と組み合わせて、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を含む医薬組成物を得ることを含み得る。好ましくは、担体は、医薬上許容される担体である。医薬組成物に関し、担体は、細胞の投与のために従来使用されるもののいずれかであり得る。かかる医薬上許容される担体は、当業者に周知であり、公に容易に利用可能である。医薬上許容される担体は、使用条件下で有害な副作用または毒性を全く有さないものであることが好ましい。注射用の細胞のための適切な医薬上許容される担体としては、例えば、生理食塩水（水中における約０.９０％ｗ／ｖのＮａＣｌ、水中における約３００ｍＯｓｍ／ＬのＮａＣｌ、
または水１リットル当たり約９.０ｇＮａＣｌ）、NORMOSOL R電解質溶液（Abbott、シカ
ゴ，IL）、ＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥＡ（バクスター、ディアフィールド、IL）、水中における約５％ブドウ糖、または乳酸リンゲル液等の任意の等張性担体が挙げられ得る。実施態様において、医薬上許容される担体には、ヒト血清アルブメン（albumen）が追加さ
れる。

本発明の目的のため、投与される用量（dose）、例えば、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された本発明の細胞集団における細胞の数は、合理的な時間枠にわたって哺乳動物において、例えば治療応答または予防応答などをもたらすのに十分でなければならない。例えば、細胞の数は、投与時点から約２時間またはそれ以上、例えば、１２～２４時間またはそれ以上の期間において、癌抗原と結合するため、または癌を検出、治療若しくは予防するために、十分でなければならない。ある実施態様では、時間は、更に長くなり得る。細胞の数は、例えば、特定の細胞の有効性及び哺乳動物（例えば、ヒト）の状態、並びに治療対象の哺乳動物（例えば、ヒト）の体重によって決定されるだろう。

腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された本発明の細胞集団から、投与される細胞の数を決定するための多くの分析が、その分野において知られている。本発明の目的のため、分析は、それぞれ異なる数の細胞が与えられる１セットの哺乳動物間で、ある哺乳動物へ所与
の数のかかる細胞が投与された時に、標的細胞が溶解される程度、またはＩＦＮ－g 及びＩＬ－２等の１以上のサイトカインが分泌される程度を比較することを含み、該分析が、哺乳動物に投与される開始数を決定するために使用され得る。ある数の細胞の投与時に、標的細胞が溶解される程度、または例えば、ＩＦＮ－g 及びＩＬ－２等のサイトカインが分泌される程度は、その分野において知られた方法によって分析され得る。例えば、ＩＬ－２等のサイトカインの分泌は、細胞調製物（cell preparation）の品質（例えば、表現型及び／または有効性）の指標も提供し得る。

腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された本発明の細胞集団からの細胞の数は、特定の細胞集団の投与に伴い得る有害な副作用の存在、類型及び程度によっても決定されるだろう。通常、主治医が、年齢、体重、全体的な健康、食生活、性別、投与ルート、及び治療されている疾患の重症度等の多様な要因を考慮して、それぞれ個々の患者を治療するための細胞の数を決定するだろう。例として、本発明を制限する意図なく、細胞の数は、注入１回当たり（per infusion）約１０ｘ１０^６から約１０ x １０^１１細胞、注入１回当たり
約１０ｘ１０^９細胞から約１０ｘ１０^１１細胞、または注入１回当たり１０ｘ１０^７から約１０ｘ１０^９細胞であり得る。本発明の方法によって得られた細胞集団は、有利には、効果的に癌を治療または予防することを可能にし得る。

本発明の方法によって得られた細胞集団は、癌を治療または予防する方法において使用され得ると考えられる。この点において、本発明は、哺乳動物において癌を治療または予防する方法であって、哺乳動物において癌を治療または予防するのに有効な量で、本明細書中に記述された本発明の方法のいずれかによって得られた医薬組成物または細胞集団を哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。本発明の別の実施態様は、哺乳動物において癌を治療または予防する方法であって、哺乳動物において癌を治療または予防するのに有効な量で、本明細書中に記述された本発明の方法のいずれかにより、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。

「治療する，」及び「予防する」という用語、並びにその派生語は、本明細書中で使用される場合、１００%または完全な治療または予防を必ずしも意味しない。むしろ、当業
者が、潜在的な利益または治療的効果を有すると認識する治療または予防の様々な度合いがある。この点では、本発明の方法は、哺乳動物において任意の量または任意のレベルの癌の治療または予防をもたらし得る。更に、本発明の方法によってもたらされる治療または予防としては、治療または予防される疾患、例えば、癌の１以上の状態または症状の治療または予防が挙げられる。また、本明細書中の目的のために、「予防」は、疾患、またはその症状若しくは状態の発症を遅延させることを包含し得る。

本発明の方法の目的のために、細胞集団が投与される場合において、細胞は、哺乳動物に対して同種または自己の細胞であり得る。好ましくは、細胞は、哺乳動物に対して自家性である。

本発明の実施態様には、本明細書中に記述された本発明の方法のいずれかによって得られる濃縮された細胞集団のいずれかを投与する前に、哺乳動物のリンパ球を枯渇させること（lymphodepleting）が更に含まれる。リンパ球枯渇の例としては、骨髄非破壊的リン
パ球枯渇化学療法（nonmyeloablative lymphodepliting chemotherapy）、骨髄破壊的リ
ンパ球枯渇化学療法（myeloablative lymphodepleting chemotherapy）、全身照射（total body irradiation）等が挙げられるが、これらに限定され得ない。

本発明の方法に関し、癌は、肉腫（例えば、滑膜肉腫、骨肉種、子宮平滑筋肉腫（leiomyosarcoma uteri）、及び胞巣状横紋筋肉腫）、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫）、肝細胞癌、神経膠腫、頭頸部癌、急性リンパ腫（acute lympho
cytic cancer）、急性骨髄性白血病、骨肉種、脳腫瘍、乳癌、肛門癌、肛門管癌、または肛門直腸癌、眼癌、肝内胆管癌、関節癌（cancer of the joints）、頸部癌、胆嚢癌、または胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌、または中耳癌（middle ear）、口腔癌、外陰癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄癌（chronic myeloid cancer）、結腸癌（colon cancer）（例えば、結腸上皮性悪性腫瘍（colon carcinoma））、食道癌、子宮頚癌、消化管癌（例えば、
消化管カルチノイド腫瘍）、下咽頭癌、咽頭癌、肝癌、肺癌、悪性中皮腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭癌、卵巣癌、膵癌、腹膜癌（peritoneum cancer）、網癌（omentum cancer）、及び腸間膜癌（mesentery cancer）、咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、腎癌、小腸癌
、軟部組織癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、尿管癌、及び膀胱癌のいずれかを含む任意の癌であり得る。

以下の実施例は、本発明を更に説明するが、言うまでもなく、その範囲を多少なりとも限定すると解釈すべきではない。

実施例１
本実施例は、ＰＤ‐１、ＴＩＭ‐３、またはＬＡＧ‐３発現に従う、メラノーマ患者の末梢血から単離したＴ細胞の細胞数をインビトロで増加させた後のインビトロでの自己腫瘍認識を示す。

４‐１ＢＢ上方制御は、ＴＣＲ刺激の指標である。細胞数を増加させた後、ＴＣＲ刺激の非存在下において４‐１ＢＢ発現が失われるということがみられた。細胞数を増加させ、かつ細胞を自己腫瘍細胞株とともに共培養させた後、４‐１ＢＢ発現を先に失い、かつ細胞株によって刺激されたＴ細胞が、４‐１ＢＢを再度発現するということもみられた。従って、自己腫瘍との共培養の２４時間後、自己腫瘍細胞株に対するＴＣＲ刺激のマーカとして、４‐１ＢＢ発現を測定する。

３人のメラノーマ患者（１９１３、３７１３、及び３２８９）のそれぞれの末梢血からアフェレーシス（apheresis）によって得られた細胞を、サイトカインなしで一晩静置し
、着色した。患者１９１３及び３７１３からの細胞を、蛍光活性化セルソーティング（FACS）により、抗ＣＤ３、抗ＣＤ８、抗ＰＤ‐１、及びＴＩＭ‐３抗体を用いて以下のＣＤ３⁺集団にソートした：ＣＤ８⁺、ＣＤ８⁺／ＰＤ‐１⁺、ＣＤ８⁺／ＴＩＭ‐３⁺、ＣＤ８⁺
／ＰＤ‐１^-、またはＣＤ８⁺／ＴＩＭ‐３^-。患者３２８９からの細胞を、ＦＡＣＳによ
り、抗ＣＤ３、抗ＣＤ８、抗ＰＤ‐１、ＴＩＭ‐３、及びＬＡＧ‐３抗体を用いて、以下のＣＤ３⁺集団にソートした：ＣＤ８⁺、ＣＤ８⁺／ＰＤ‐１⁺、ＣＤ８⁺／ＬＡＧ３⁺、ＣＤ８⁺／ＴＩＭ‐３⁺、ＣＤ８⁺／ＰＤ‐１^-、ＣＤ８⁺／ＬＡＧ３^-、またはＣＤ８⁺／ＴＩＭ
‐３^-。細胞数をインビトロで１４日間、増加させた。１４日目に、細胞を洗浄し、対応
する自己腫瘍細胞株（１ x １０^５エフェクター：１ x １０^５標的細胞）とともに共培養し、共培養の２４時間後にＩＦＮ‐ガンマ放出、及び４１ＢＢを発現するＣＤ８⁺細胞の
百分率を定量することによって反応性を評価した。結果を図１Ａ～１Ｃ及び表１～３に示す。図１Ａ～１Ｃ及び表１～３に示すように、ＰＤ‐１またはＴＩＭ‐３発現に従ってソートされた細胞は、それぞれＰＤ‐１またはＴＩＭ‐３発現に対して陰性の細胞と比べて、腫瘍反応性細胞が濃縮された。

実施例２
本実施例は、メラノーマ患者の末梢血から単離し、ＰＤ‐１またはＴＩＭ‐３発現に従ってソートしたＴ細胞のインビトロで細胞数を増加させた後のインビトロでの自己腫瘍認識を示す。

実施例１に記述された通り、細胞を、患者１９１３または患者３２８９の末梢血から得て、ＦＡＣＳによりＰＤ‐１またはＴＩＭ‐３発現に従ってソートした。ソートされた細胞数を、インビトロで１４日間増加させた。１５日目に、標的腫瘍細胞株（自己及び同種異系）を^５１Crで標識し、ソートされた細胞集団（エフェクター細胞）と図２Ａ～２Ｆに示す割合で４時間、共培養した。^５１Cr放出をγ-カウントによって３重に決定し、特異
的な溶解の百分率を以下の式を用いて計算した：[（１分当たりの実験的カウント（cpm）
- 自発的cpm）／（最大cpm - 自発的cpm）] × １００。結果を図２Ａ～２Ｆに示す。図２Ａ～２Ｆに示すように、末梢血から得られ、かつＰＤ‐１⁺またはＴＩＭ‐３⁺発現によってソートされた細胞は、自己腫瘍細胞株を溶解することを可能にする。

刊行物、特許出願及び特許を含む、本明細書に引用した全ての参考文献は、それぞれの参考文献が参照によって組み込まれることが個々に且つ具体的に示され、その全体が本明細書に記載されているのと同程度まで、参照によって本明細書に組み込まれる。

本発明を説明する文脈における“a”及び“an”及び「前記（the）」及び「少なくとも１つ（at least one）」という用語及び同様の指示対象の使用（特に、以下のクレームの文脈において）は、異なるように明細書中に示され、または文脈によって明確に否定されなければ、単数形及び複数形の両方をカバーするように解釈されるべきである。異なるように明細書中に示され、または文脈によって明確に否定されなければ、１以上の項目のリストが次に来る「少なくとも１つ（at least one）」という用語の使用（例えば、「Ａ及びＢの少なくとも１つ」）は、リストされた項目（ＡまたはＢ）から選択された１の項目、または２以上のリストされた項目の任意の組み合わせ（Ａ及びＢ）を意味するべく解釈される。「含む（comprising）」「有する（having）」「含む（including）」及び「含
有する（containing）」という用語は、異なるように言及されなければ、オープンエンド用語（すなわち、「を含むが、これに限定されない」ということを意味する）として解釈されるべきである。明細書中の数値範囲の記述は、本明細書中に異なるように示されなければ、範囲に入るそれぞれ別々の値に個別に言及する略記方法として役立つことを意図したに過ぎず、それぞれ別々の値が、本明細書中に個別に挙げられたように、本明細書中に組み込まれる。本明細書中において異なるように指摘されなければ、あるいは文脈によって異なるように明確に否定されなければ、明細書中に記述された全ての方法が、任意の適切な順序で行うことができる。異なるようにクレームされていなければ、本明細書中で提供された任意の及び全ての実施例または例示的な言葉（例えば、「等（such as）」）の
使用は、単に本発明の理解をより容易にすることが意図されており、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中におけるいかなる言葉も、特許請求されていない任意の要素を本発明の実施に必須のものとして示していると解釈すべきではない。

本発明の好ましい実施の態様は、本明細書中に記述されており、本発明を実施するために本発明者らが知っている最良の形態を含んでいる。これらの好ましい実施の態様の変形例は、先の記述を読んだ当業者にとって明らかになり得る。本発明者らは、当業者が、必要に応じてかかる変形例を採用するものと思っており、本発明者らは、本明細書中に具体的に記述されたものとは異なるように本発明が実施されることを意図している。従って、本発明は、本明細書に添付された特許請求の範囲に記載された要旨の、適用され得る法律によって許容されるすべての修正形態及び均等物を含む。さらに、本明細書中に異なるように示され、あるいは文脈によって異なるように明確に否定されなければ、これらの全ての可能な変形例において上述された要素の任意の組み合わせは、本発明に包含される。

Claims

腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を哺乳動物へ投与するための組成物であって、
（a）前記哺乳動物に対して自家性である末梢血のサンプルから末梢血単核細胞（PBMCs）の混合集団を得ること；
（b）前記混合集団からＰＤ‐１および／またはＴＩＭ‐３も発現するＣＤ８⁺Ｔ細胞を特異的に選択すること；および
（c）（b）において選択された前記細胞を、選択されていない細胞から分離して、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を得ること、
を含む方法によって腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を含み、
前記腫瘍反応性Ｔ細胞が、子宮頚癌、結腸癌、肺癌、卵巣癌、黒色腫、乳癌、食道癌、肝細胞癌、肝癌、甲状腺癌または肉腫である腫瘍に反応性である、組成物。
（b）が、前記混合集団からＴＩＭ‐３を発現するＣＤ８⁺Ｔ細胞を特異的に選択することを含む、請求項１に記載の組成物。
（b）が、前記混合集団からＰＤ‐１を発現するＣＤ８⁺Ｔ細胞を特異的に選択することを含む、請求項１に記載の組成物。
（b）が、前記混合集団から（i）ＴＩＭ‐３⁺／ＰＤ‐１⁺、（ii）ＴＩＭ‐３^-／ＰＤ‐１⁺、または（iii）ＴＩＭ‐３⁺／ＰＤ‐１^-であるＣＤ８⁺Ｔ細胞を特異的に選択することを含む、請求項１に記載の組成物。
腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された前記細胞集団が、自己腫瘍認識についてスクリーニングをすることなく得られる、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。
Ｔ細胞の混合集団が、（b）より前に非特異的に刺激されない、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
前記方法が、（c）において得られた前記濃縮された細胞集団においてＴ細胞の数を増加させることを更に含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物。
前記方法が、ＴＷＳ１１９、インターロイキン（ＩＬ‐２１）、ＩＬ‐１２、ＩＬ‐１５、ＩＬ‐７、形質転換成長因子（TGF）ベータ、およびＡＫＴインヒビター（AKTi）のいずれか１以上の存在下で、（c）において得られた前記濃縮された細胞集団を培養することを更に含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物。
前記方法が、腫瘍抗原および／または自己腫瘍Ｔ細胞を用いて、（c）において得られた前記濃縮された細胞集団を刺激することを更に含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の組成物。
前記方法が、ＩＬ‐１２、ＩＬ‐７、ＩＬ‐１５、ＩＬ‐２、ＩＬ‐２１、ｍｉｒ１５５、および抗ＰＤ‐１ｓｉＲＮＡのいずれか１以上をコードするヌクレオチド配列を、（c）において得られた前記濃縮された集団の細胞に形質導入またはトランスフェクトすることを更に含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の組成物。
癌の治療または予防のための組成物であって、請求項１～１０のいずれか１項に記載の組成物を含み、
前記癌が、子宮頚癌、結腸癌、肺癌、卵巣癌、黒色腫、乳癌、食道癌、肝細胞癌、肝癌、甲状腺癌または肉腫である、組成物。