CN101625361A

CN101625361A - 一种慢性乙型肝炎患者免疫状态的诊断方法

Info

Publication number: CN101625361A
Application number: CN200910056906A
Authority: CN
Inventors: 梁雪松; 万谟彬
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2009-02-26
Filing date: 2009-02-26
Publication date: 2010-01-13

Abstract

本发明涉及一种医学诊断技术领域，具体涉及一种慢性乙型肝炎患者免疫状态的诊断方法。一种慢性乙型肝炎(CHB)患者免疫状态的诊断方法，包括下列步骤：收集慢性乙型肝炎患者的外周血样品、抗凝处理；检测外周血样品中外周血总CD8⁺T细胞的PD－1；分析外周血样品中外周血总CD8⁺T细胞PD－1单细胞表达强度。本发明所述的诊断方法具有很好的灵敏度和特异性，操作简单、耗时少，同时本发明能对临床了解患者免疫状态提供重要信息，进一步能为临床CHB抗病毒治疗时治疗方案的确定和调整提供有效的信息，对改善和预测CHB治疗疗效具有深远意义。

Description

一种慢性乙型肝炎患者免疫状态的诊断方法

技术领域

本发明涉及一种医学诊断技术领域，具体涉及一种慢性乙型肝炎患者免疫状态的诊断方法。

背景技术

HBV感染引起的乙型病毒性肝炎是一种常见和严重的肝脏疾病.有超过20亿人曾感染过HBV，至今为止有3.5亿人仍携带有HBV病毒，其中有1/3在中国。

目前乙型肝炎慢性化的免疫学机制主要包括：(1)母婴传播或幼儿期感染形成的免疫耐受；(2)病毒基因整合于宿主基因组中；(3)病毒发生变异，导致免疫逃避；(4)病毒感染宿主免疫细胞，导致免疫功能下降。乙型肝炎慢性化与免疫耐受形成有关，并以机体对HBV的免疫应答低下为特征。免疫清除期特点是：经过多年的免疫耐受期后，病人自身的免疫开始识别乙肝病毒并开始清除，在清除肝内的乙肝病毒时，免疫反应对肝细胞造成损伤，肝细胞内的转氨酶释放入血，表现为ALT升高，HBV DNA仍然复制。HBeAg阳性的病人HBV DNA复制水平仍然较高，而HBeAg阴性的病人HBV DNA水平较低。

乙型肝炎病毒感染自然病程中，根据宿主免疫和病毒相互作用可分为免疫耐受期、免疫清除期和病毒残留期或再复制期三个阶段。在免疫清除期宿主免疫介导细胞裂解反应被激活，伴随血清HBV DNA水平下降和ALT水平升高。

宿主免疫反应特别是细胞免疫反应在病毒清除中起重要作用。然而，慢性乙型肝炎患者(CHB)宿主免疫特点为严重的HBV特异性T细胞功能缺陷，伴随着抗病毒细胞因子分泌水平低下和细胞毒性T细胞活性下降。免疫清除期，靠慢性乙型肝炎患者(CHB)自身的免疫反应常常达不到将病毒完全抑制或清除，临床常用干扰素治疗，来加强自身的抗乙肝病毒免疫，起到帮助清除的作用。但是现有的技术缺乏有效的针对慢性乙型肝炎患者(CHB)的免疫状体有效提示，常产生不必要的免疫激活而造成组织损伤或用药过度。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为提供一种新的特异度好的慢性乙型肝炎患者免疫状态的诊断方法。

为此，本发明公开了一种慢性乙型肝炎(CHB)患者免疫状态的诊断方法，包括下列步骤：

a)收集慢性乙型肝炎患者的外周血样品、抗凝处理；

b)检测外周血样品中外周血总CD8⁺T细胞的PD-1；

c)分析外周血样品中外周血总CD8⁺T细胞PD-1单细胞表达强度(MFI)。

在一些实施方式里，所述慢性乙型肝炎患者为ALT≥2倍n.v的乙型肝炎患者。

在一些实施方式里，所述步骤b中检测采用流式细胞检测方法，其中抗体为荧光标记的抗-CD8抗体和荧光标记的抗-PD-1抗体，二者的荧光标记均不相同，其中优选抗体为抗-CD8-APC和抗-PD-1-PE抗体。

在一些实施方式里，所述分析外周血总CD8⁺T细胞PD-1单细胞表达强度(MFI)时，CHB患者的PD-1 MFI与健康人的PD-1 MFI差值愈大，则表明该CHB患者的免疫状态低下，反之则表明其免疫状态正常。健康人的PD-1 MFI为3.64±0.76。

需要指出的，健康人的PD-1 MFI可因人种的不同存在差异，本领域的技术人员完全可以通过公知常识，来定义各人种的健康人的PD-1 MFI数值范围。

本发明所述的诊断方法具有很好的灵敏度和特异性，操作简单、耗时少，同时本发明能对临床了解患者免疫状态提供重要信息，进一步能为临床CHB抗病毒治疗时治疗方案的确定和调整提供有效的信息，对改善和预测CHB治疗疗效具有深远意义。

附图说明

图1.免疫清除期CHB和健康对照外周血总T细胞PD-1表达百分比比较。

图2.免疫清除期CHB和健康对照组外周血总T细胞PD-1单细胞表达强度比较。

图3.不同炎症活动CHB外周血总T细胞PD-1 MFI比较。

图4.免疫清除期CHB外周血总T细胞PD-1表达同ALT相关关系分析。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

1.材料和方法

1.1病例2007年9月-2008年2月长海医院感染科收治的45例临床诊断慢性乙型肝炎患者(CHB)，均处于免疫清除期(ALT≥2倍n.v)。诊断符合2000年修订《病毒性肝炎防治方案》标准。所有病例排除其它肝炎病毒感染及合并自身免疫性肝炎、酒精性肝病等，同时在入组前6个月内未经任何抗病毒及免疫抑制治疗。另选年龄和性别与病人相匹配的健康献血员(Health)10例为正常对照组。

1.2主要试剂和仪器FITC-CD4流式抗体和APC-CD8流式抗体购自美国eBiosciences公司，PD-1-PE流式抗体购自美国BD公司。HBV DNA荧光定量PCR法试剂盒购于深圳匹基生物工程公司；FACSCcalibur流式细胞仪为美国BD公司。

1.3实验方法外周血总T细胞PD-1表达水平的流式检测：取50μL抗凝血，加抗-CD4-FITC、抗-CD8-APC和抗-PD-1-PE流式抗体各5μL常温避光孵育20min标记，用流式细胞裂解液1mL常温避光裂解10min，1500r常温离心5min，弃去上清并用PBS 1mL冲悬沉淀，1500r常温离心5min洗沉淀1次，标记处理好后，将细胞收集冲悬在400μLPBS中，避光放置待上机，上机浓度为106/mL。激光器波长为488nm和635nm，用Cellquest(Becton DickinsonRutherford，NJ)软件获取和分析数据。

抗HAV、抗HCV、抗HDV、抗HEV、抗EB、抗CMVIgM和HBV病毒学指标用第三代ELISA法进行检测(SABC公司)。血清HBV DNA水平应用荧光-定量PCR法检测，操作按深圳匹基生物工程公司生产的HBV DNA荧光定量检测试剂盒说明书进行。肝功指标在住院期间每周和随访期每月进行检测。

2、统计学处理统计学处理采用SPSS12.0软件，数据进行样本均数t检验和两变量相关性分析。

3.结果

3.1病例资料45例慢性乙型肝炎患者，其中男38例，女7例；年龄波动在16-53(平均33.13±8.8)岁，所有病例肝功能指标ALT波动在76-1233(平均309.81±290.75)IU/L，TBIL波动在5.30-220.00(平均30.71±48.95)μmol/L；血清HBV DNA载量水平波动在103-108copies/mL(Log 6.32±1.57)；健康献血员10例。

3.2免疫清除期CHB外周血总T细胞PD-1表达升高应用流式细胞术对免疫清除期CHB和健康献血员(Health)外周血总T细胞PD-1表达状态进行了检测。免疫清除期CHB外周血总CD8⁺T细胞PD-1表达阳性率波动在3.01％到47.97％之间，平均为14.23％±10.27％；外周血总CD4⁺T细胞PD-1表达阳性率波动在4.69％到33.32％之间，平均为10.26％±4.77％，明显高于健康对照组(如图1)。免疫清除期CHB外周血总CD8⁺T细胞和CD4+T细胞PD-1单细胞表达强度(MFI)分别为5.79±2.69与4.53±1.19，健康对照为3.64±0.76与3.46±0.38，CHB组明显高于对照组(如图2)。

3.3免疫清除期CHB PD-1表达和肝脏炎症活动关系ALT水平以400IU/L为界将CHB病例分为两组，比较两组外周血总T细胞PD-1表达水平发现，CD4⁺T细胞PD-1表达百分比≥400IU/L组同＜400IU/L组之间未见明显差异(9.38％±2.55％与10.83％±5.44％，P＝0.24)，CD8⁺T细胞PD-1表达百分比≥400IU/L组略高于＜400IU/L组，但没有明显统计学差异(20.82％±13.88％与12.21％±7.62％，P＝0.06)。比较两组CD8+T细胞PD-1 MFI发现，≥400IU/L组明显高于＜400IU/L组(7.83±3.34与5.15±2.01，P＝0.02)，但CD4⁺T细胞PD-1MFI两组之间未见明显差异(P＝0.87)(如图3).

对免疫清除期CHB外周血总T细胞PD-1表达状态和炎症活动相关性分析也显示，患者ALT水平和外周血总CD8⁺T细胞PD-1 MFI具有明显正相关性(P＝0.02)，但同CD8+T细胞PD-1阳性率之间均未见明显相关性.ALT水平同外周血CD4⁺T细胞PD-1 MFI和PD-1阳性率之间均未见明显相关性(图4，A：CD4⁺T细胞PD-1 MFI同ALT相关关系、B：CD4⁺T细胞PD-1百分比同ALT相关关系、C：CD8⁺T细胞PD-1 MFI同ALT相关关系、D：CD8⁺T细胞PD-1百分比同ALT相关关系)。

4、讨论

PD-1/PD-Ls共抑制途径是一种反向调节T细胞免疫的重要信号途径，对T细胞活化和免疫耐受调节具有重要意义。PD-1最早从胸腺T细胞系分离到，在启动凋亡后表达.PD-1属于免疫受体CD28家族，包括PD-1和PD-L1、PD-L2两个配体，在活化T、B和髓系细胞高表达。PD-1/PD-Ls结合可抑制T细胞增殖和细胞因子分泌。此外，有研究发现PD-1缺陷小鼠会发生自身免疫性疾病，这进一步提示PD-1/PD-Ls共抑制通路具有抑制和调节T细胞反应和免疫耐受的作用。

为了明确CHB患者PD-1表达水平，尤其是免疫清除期CHB患者PD-1表达状态，及其同疾病进展和病毒载量水平相关关系，发明人对免疫清除期CHB患者外周血T淋巴细胞上PD-1表达状态进行了检测，发现外周血总CD8+T细胞和CD4⁺T细胞上PD-1表达阳性率和单细胞表达水平同健康对照组相比均明显升高，也明显高于免疫耐受期HBV慢性感染组(CD8⁺T PD-1％∶6.23％±3.27％vsCD4⁺T PD-1％∶4.26％±2.77％)，提示外周血T细胞PD-1表达状态同炎症反应有关。对PD-1表达同ALT水平相关性分析发现，外周血总CD8⁺T细胞和CD4⁺T细胞PD-1表达百分比及PD-1外周血CD4⁺T细胞MFI同ALT水平之间未见明显相关性，但PD-1外周血CD8⁺T细胞MFI同ALT之间呈明显正相关。

本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只欲作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。

Claims

1.一种慢性乙型肝炎患者免疫状态的诊断方法，包括下列步骤：

a)收集慢性乙型肝炎患者的外周血样品、抗凝处理；

b)检测外周血样品中外周血总CD8⁺T细胞的PD-1；

c)分析外周血样品中外周血总CD8⁺T细胞PD-1单细胞表达强度。

2.如权利要求1所述的诊断方法，其特征在于所述慢性乙型肝炎患者为ALT≥2倍n.v的乙型肝炎患者。

3.如权利要求1所述的诊断方法，其特征在于所述步骤b中检测采用流式细胞检测方法，其中抗体为荧光标记的抗-CD8抗体和荧光标记的抗-PD-1抗体，二者的荧光标记均不相同。

4.如权利要求3所述的诊断方法，其特征在于所述抗体为抗-CD8-APC和抗-PD-1-PE抗体。

5.如权利要求1所述的诊断方法，其特征在于所述分析外周血总CD8⁺T细胞PD-1单细胞表达强度时，CHB患者的PD-1MFI与健康人的PD-1MFI差值愈大，则表明该CHB患者的免疫状态低下，反之则表明其免疫状态正常。

6.如权利要求5所述的诊断方法，其特征在于所述健康人的PD-1MFI为3.64±0.76。