CN101085983A - 自体干细胞、由其转化而成的目标细胞及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种自体干细胞，其由一种单核性细胞加入蛋白激酶C调节剂经培养形成。本发明还公开了一种由自体干细胞进一步转化而成的目标细胞，例如软骨细胞、神经细胞、骨母细胞等。本发明还公开了应用上述自体干细胞和目标细胞作为组织细胞修复剂的方法，将这种自体干细胞置入损伤组织处，自体干细胞会转化成组织细胞，达到修复作用；将目标细胞直接置入损伤组织细胞处，亦可达到修复作用。

Description

自体干细胞、由其转化而成的目标细胞及其用途

技术领域

本发明涉及一种自体干细胞(P干细胞)(Multipotent stem cells)；本发明还涉及由这种P干细胞转化而成的目标细胞；此外，本发明还涉及上述P干细胞和目标细胞的用途。

背景技术

最近几年，骨髓干细胞(marrow-derived stem cells)及脐带血干细胞(core blood-derived stem cells)，几乎是取得干细胞的两种主要来源。此种干细胞取得的数量极少，对异体具排斥性，目前常被用于临床上细胞治疗的素材。其中，以CD34⁺(CD34阳性)的造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSC)的应用为最多，就是利用抗人类CD34抗体，所分离出来的干细胞。然而，CD34⁺的造血干细胞在一般成人体内的总量很少，在骨髓中，大约100,000个血液细胞中，才能收集到1个CD34⁺造血干细胞，由于能取得的干细胞数量极少，对异体又具排斥性，在临床上的应用受到极大的限制，相对的成功率也不高。因此，目前从事于干细胞(stem cell)研究的研究者，都试图在体外的细胞培养中，探询能让CD34⁺干细胞大量增生的方法及途径，而此种干细胞终究对异体具排斥性。这些因素成为骨髓干细胞在临床应用上的限制及缺点。

再者，在1990年之后，脐带血也开始受到干细胞研究者的青睐。因为，脐带血中具有较骨髓丰富的CD34⁺于细胞，并且，相对于骨髓中的CD34⁺干细胞，脐带血中CD34⁺干细胞有着更佳的转化能力。因此最近几年在世界各国，陆陆续续的成立脐带血银行，保存妇女产后所获得的脐带血，作为日后提供医学研究及临床应用的来源。然而，脐带血中虽比骨髓拥有较多的干细胞，但是在血液细胞中所占的比率，仍旧很低，必须依赖体外培养的方式，才能获得足够的数量作为细胞医疗用途。而脐带血的特殊冷冻保存，所耗的金钱成本是极高的，不是一般人所能负担的；且在长期保存过程中，任何的温度变化都将令细胞死亡，更增加了不确定性。利用脐带血干细胞做治疗时，首要顾虑的是免疫学上组织兼容性(Histocompatibility)的问题，也就是排斥性的问题，否则将造成病人体内免疫系统产生对脐带血干细胞的排斥作用，将降低治疗的成功率，更甚者是治疗失败。光就组织兼容性配对实验所耗的成本，往往又高于脐带血干细胞保存的成本，而寻找一组织兼容性相同的干细胞更加不易。

目前骨髓及脐带血干细胞在医学及临床应用时，存在以下问题：(一)干细胞在骨髓及脐带血中的数量不多，必须依赖体外培养的方式，方能使数量增加，可是目前对于干细胞体外的再新生(self-renewal)尚未有很好的培养环境或被报导。(二)脐带血银行虽宣称可以将脐带血永久保存，但是解冻后干细胞的存活率，以及再冻细胞的存活率，以及上述所说明的因素，含有极大的不确定性，是目前无法评估的。(三)取得骨髓干细胞时，病人必须承受骨髓穿刺后的疼痛及过程中身体麻醉可能受到未知的风险。(四)利用脐带血干细胞做治疗时，首要顾虑的是免疫学上组织兼容性的问题，避免造成病人体内免疫系统产生排斥作用。(五)对每个人来说，脐带血干细胞的采集，一辈子只能有一次机会。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种自体干细胞。

本发明要解决的技术问题之二是提供自体干细胞的形成方法。

本发明要解决的技术问题之三是提供一种由上述自体干细胞转化而成的目标细胞。

本发明要解决的技术问题之四是提供一种应用上述自体干细胞作为组织细胞修复剂的方法。

本发明要解决的技术问题之五是提供一种应用上述目标细胞作为组织细胞修复剂的方法。

本发明提供一种自体干细胞，其由一种单核性细胞加入蛋白激酶C调节剂经培养形成。所述的蛋白激酶C调节剂可以为Bryostatin-1、Go6976或其组合物，也可以为GM-CSF、SDF或其组合物，还可以为胶原蛋白、纤维粘连蛋白或其组合物。

本发明还提供自体干细胞的形成方法，其以活化单核性细胞的蛋白激酶CβII，来将单核性细胞转变成自体干细胞。所述的活化单核性细胞的蛋白激酶CβII，其使用的蛋白激酶C调节剂可以为Bryostatin-1、Go6976或其组合物，也可以为GM-CSF、SDF或其组合物，还可以为胶原蛋白、纤维粘连蛋白或其组合物。

本发明所述的单核性细胞(mononucleated)，是一种具单一球状性细胞核的细胞。例如将血液中之单核性细胞，完全地转变为多功能型P干细胞。单核性细胞数量至少占血液中白血球细胞之1/10例如单核球(Monocyte)，一般正常人之周边白血球细胞浓度约为每毫升中有5,000至10,000个，以此推算，单核性细胞浓度在周边血液中至少每毫升中有500至1,000个。若以100毫升周边血液计算，其中单核性细胞数量应在50,000至1,00,000个。利用本发明能将这50,000至1,00,000个单核性细胞完全地转变成为多功能型P干细胞。至于P干细胞取得的多寡，只要控制血液采集的数量即可。

本发明还提供一种目标细胞，其由所述的自体干细胞加入-转化素，并置于培养基内经培养而形成。所述的目标细胞可以为骨母细胞，其培养基为低葡萄糖DMEM，其转化素为dexamethasone、β-磷酸甘油、维生素C或其组合物。所述的目标细胞可以为软骨细胞，其培养基为低葡萄糖DMEM，其转化素为dexamethasone、转移生长因子-β1或其组合物。所述的目标细胞可以为神经细胞，其培养基为α-最低基础培养基，其转化素为乙基硫醇、A酸、L-麸酰氨酸、N2营养剂、B27营养剂或其组合物。所述的目标细胞可以为心肌细胞，其培养基为IMDM，其转化素为5-氮杂胞苷。所述的目标细胞可以为肾脏细胞，其培养基为Embryo Medium，其转化素为血癌抑制因子。所述的目标细胞可以为肺脏细胞，其培养基为DMEM，其转化素为胰岛素、纤维母细胞生长因子或其组合物。所述的目标细胞可以为肝脏细胞，其培养基为低葡萄糖DMEM，其转化素为肝细胞生长因子、纤维母细胞生长因子或其组合物。所述的目标细胞可以为骨骼肌细胞，其培养基为DMEM，其转化素为5-氮杂胞苷。所述的目标细胞可以为脂肪细胞，其培养基为DMEM，其转化素为dexamethasone、indomethacin、胰岛素、methyl-isobutylxantine或其组合物。

再者，本发明亦提供了一种应用自体干细胞作为组织细胞修复剂的方法，其包括：取一自体干细胞，并将自体干细胞直接置入损伤组织细胞处，以达到修复作用。例如将A病人的P干细胞接种于A病人的心肌受损的组织细胞处，P干细胞将直接转化成心肌细胞，达到直接修复及重建的目的，这在骨髓或脐带血干细胞的治疗史上，已经有成功的案例，例如：将干细胞置入骨髓中，用于治疗白血病，让病人造血功能恢复正常；又例如心肌梗塞的病人，将干细胞直接移置于心肌坏死处，可使心肌恢复或改善功能等，这在新闻、报章、网络皆有报导。对于肝机能不全及肾功能不全，也能达到同样的效果。P干细胞能修复及重建任何生物的受损组织细胞。例如肝组织细胞、脑组织细胞、眼球组织细胞、听觉组织细胞、胰脏组织细胞、心脏组织细胞、肌肉细胞、皮肤细胞、骨组织细胞、胆组织细胞、神经细胞、软骨组织细胞、血管组织细胞、脂肪细胞、肾脏组织细胞、骨髓组织细胞、肺脏组织细胞、毛囊组织细胞、肠胃组织细胞、消化系统组织细胞、生殖系统组织细胞等，本发明就如同是自体细胞的植入，没有排斥作用及副作用的产生。

本发明还提供一种应用目标细胞作为组织细胞修复剂的方法，其包括：至少以一种目标细胞直接置入损伤组织细胞处，以达到修复作用。P干细胞有能力转化成目标细胞，例如软骨细胞、神经细胞、骨母细胞等。这证明P干细胞具有原始细胞最重要的转化功能，其与骨髓或脐带血干细胞相同的。这种目标细胞对损伤组织细胞是有修复功能的，例如将软骨细胞接种于关节受损的软骨处，有助于受损软骨的修复及重建。又例如将神经细胞接种于神经受损处，对神经的修复是有直接的帮忙的。本发明的P干细胞有能力转化成生物的任何目标细胞，并可应用于生物的任何受损组织细胞的修复，例如肝组织细胞、脑组织细胞、神经细胞、软骨组织细胞、脂肪细胞、眼球组织细胞、听觉组织细胞、胰脏组织细胞、心脏组织细胞、肌肉细胞、皮肤细胞、骨组织细胞、胆组织细胞、血管组织细胞、肾脏组织细胞、骨髓组织细胞、肺脏组织细胞、毛囊组织细胞、肠胃组织细胞、消化系统组织细胞生殖系统组织细胞等，而且本发明就如同是自体细胞的植入，没有排斥及其它副作用的产生。

和现有技术相比，本发明具有以下有益效果：将血液中的单核性细胞转变成多功能型自体干细胞，这样的数量是骨髓或脐带血干细胞的千倍或万倍或更高，是骨髓或脐带血干细胞望尘莫及、难以达到的；其次，本发明完全没有排斥作用的产生，由于是以自体的细胞植入自体，当然不需要考虑排斥作用，例如骨髓或脐带血干细胞首要的考虑就是免疫学上组织兼容性的排斥作用；再次，本发明随时可以重复实验，成功率几乎百分之百，由于血液取得简便，随采随用，例如：抽血，就没有冷冻保存的明显。不像脐带血干细胞的采集，一辈子只能有一次，或采取骨髓干细胞时，病人必须承受骨髓穿刺后的疼痛，且在该过程中身体麻醉可能受到未知的风险，还必须长时间的冷冻保存，相对提高应用上的成本，广泛推行的难度极高。此外，本发明自体干细胞对受损组织细胞有良好的修复作用。

附图说明

图1是以200倍显微镜放大的单核球照片；

图2是以200倍显微镜放大的自体干细胞照片；

图3为骨母细胞以Alizarin染色结果的200倍显微镜放大照片；

图4为骨母细胞内碱性磷酸酶的测定值示意图；

图5是以400倍显微镜放大的多角形态软骨细胞照片；

图6是以400倍显微镜放大的染色后软骨细胞照片，其中的粘性物质(Mucin)呈红色；

图7是以400倍显微镜放大的神经细胞照片，其中的CAD蛋白呈荧光阳性反应；

图8是以400倍显微镜放大的神经细胞照片，其中的Nestin蛋白呈荧光阳性反应；

图9是蛋白激酶C的电泳测定图；

图10是24小时蛋白激酶C的电泳测定图。

具体实施方式

以下结合附图及实施例对本发明作进一步的阐述：

实施例一  自体干细胞的配制

使用内含肝素(Heparin)抗凝剂的无菌真空采血管或无菌抽血针筒，采集20ml血液。使用抗人类CD14单株抗体结合荧光(anti-human CD14monoclonal antibody-FITC)，来分离所采集血液中的单核性细胞，例如单核球(monocyte)，再以流式细胞仪(Flow Cytometry)将单核性细胞单独分离收集于无菌试管，将分离的单核性细胞置入含有10％的RPMI-1640(Gibco，NY USA)的培养基中。

(一)将蛋白激酶C(Protein Kinase C)抑制调节剂，例如Go6976加入细胞培养液中，使其在培养液中的浓度为0.1-10μM，作用30分钟之后，再加入蛋白激酶C活化调节剂，例如bryostatin-1，使其在培养液中的浓度为5-15μM。接着将细胞培养在37℃含有5％的CO₂培养箱(incubator)中15-21天。培养基中单核性细胞将直接转化成P干细胞，其转化率将近百分之百。

(二)将颗粒球巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)与基质细胞因子(SDF，Stromal Cell Derived Factor)加入细胞培养液中，浓度维持在100-1,000U/ml及10-100nM，接着将细胞培养在37℃含有5％的CO₂培养箱(incubator)中3-7天。培养基中CD14⁺单核性细胞将直接转化成P干细胞，其转化率将近百分之百。

(三)将培养皿固定一层胶原蛋白(Collagen)或纤维粘连蛋白(Fibronectin)，加入含有10％的RPMI-1640(Gibco，NY USA)的培养基进入培养皿中。再将分离的单核性细胞置入培养皿中。接着将细胞培养在37℃含有5％的CO₂培养箱(incubator)中7-14天。培养基中CD14⁺单核性细胞将直接转化成P干细胞。

本实施例中分离单核性细胞的方式，亦可使用连结抗人类CD14抗体的磁珠做分离动作，再以磁铁型细胞收集器(Magnetic cell sortor)收集单核性细胞，是众所皆知的一种方式。本实施例中所指单核性细胞的来源，并不限于血液检体。结果如图1和图2所示。将P干细胞至少用无菌生理食盐水清洗3次，最后1000转离心速度10分钟后，去除上清液，将此浓缩的P干细胞收集于无菌注射针筒内，即可直接注射于受损组织细胞处，可作为修复之用。本实施例中所指蛋白激酶C调节剂，并不仅仅限用Go6976或bryostatin-1或GM-CSF或SDF或胶原蛋白或纤维粘连蛋白或其组合物，只要能抑制蛋白激酶C活性的物质或活化蛋白激酶C的物质或具有相同功效或其组合物都可以。

实施例二

使用抗人类CD14单株抗体结合荧光检测P干细胞，经流式细胞仪(Flow Cytometry)测定结果，P干细胞呈现CD14阳性反应(CD14⁺)。取0.5ml的P干细胞悬浮液放入一试管，接着加入10μl抗人类CD14单株抗体结合荧光(anti-human CD14 monoclonal antibody FITC)，接着于4℃静置30分钟后，使用离心机离心10分钟(1000转)，接着倒掉上清液；接着再以生理食盐水清洗3次，加入5ml生理食盐水并与P干细胞混合均匀，再次离心机离心10分钟(1000转)，接着倒掉上清液，重复3次清洗步骤；最后将清洗后的P干细胞直接用流式细胞仪(FACScan，BECTON DICKINSON)做荧光测定，若anti-human CD14 monoclonal antibody FITC与P干细胞结合，则将出现荧光阳性反应，反之则为阴性反应，本实施例二测定结果为阳性反应。流式细胞仪测定的测定方法，是众所皆知的。

实施例三

将P干细胞置于一骨母细胞培养基(Osteogenic medium)，此骨母细胞培养基为低葡萄糖DMEM培养基(low-glucose DMEM(Dulbecco’sModified Eagle Media)，Gibco)内含骨母细胞转化素，例如将100nMdexamethasone，10mM β-磷酸甘油(β-glycerophosphate)及100μg/ml维生素C(ascorbic acid)等，同时置于CO₂培养箱培养14天后，P干细胞将直接转化成骨母细胞(Osteoblast，OB)。

实施例四  鉴定骨母细胞(Osteoblast，OB)

以Alizarin化学染色法及细胞内碱性磷酸酶(alkaline phophatase)分别为一般鉴定骨母细胞的方法，是众所皆知的。图3是以Alizarin化学染色法测定细胞间钙离子的堆积情形(红色区域，200倍放大)。图4为测定细胞内碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)的结果。将P干细胞(当作标准对比细胞)及骨母细胞各配成等量细胞悬浮液，并将细胞打碎后，各取1ml的细胞悬浮液进入个别的比色管，接着在个别的比色管中再加入0.3ml碱性磷酸酶的呈色剂pNPP(p-nitrophenyl phosphate)，接着静置15分钟后，立即以405nm(波长)比色测定个别比色管的吸光度，呈色剂pNPP与碱性磷酸酶作用后会产生黄色变化，碱性磷酸酶含量越多，相对的黄色就越深。测定结果如图4，骨母细胞内碱性磷酸酶的活性/浓度是P干细胞的近六倍高。

实施例五

将P干细胞置于一软骨细胞培养基(Chondrogenic medium)，软骨细胞培养基为low-glucose DMEM，内含软骨细胞转化素，例如将100nMdexamethasone，及10ng/ml转移生长因子-β1(Transforming growthfactor-betal，TGF-β1)，同时置于CO₂培养箱培养21天后，P干细胞将直接转化成软骨细胞(Chondrocyte)。

实施例六  鉴定软骨细胞(Chondrocyte)

图5为显微镜下观察的结果，可以看到细胞大多具有多角形型态(Polygonal)，此为典型的软骨细胞的型态。图6为进一步以Safranin O之组织染色法鉴定软骨细胞中黏性物质(Mucin)(红色部分)的生成，是众所皆知的基本鉴定方法。

实施例七

将P干细胞置于一神经细胞培养基(Neurogenic medium)，神经细胞培养基为α-最低基础培养基(α-MEM(minimum essential medium))，内含神经细胞转化素，例如将50μM乙基硫醇(mercaptoethanol)，1μM A酸(retinoic acid)，0.5mM L-麸酰氨酸(L-glutamine)，1％N2营养剂(1％N2supplement)及2％B27营养剂(2％B27 supplement)，同时置于CO₂培养箱培养14天后，P干细胞将直接转化成神经细胞(Neuron cell)。

实施例八  鉴定神经细胞(Neuron cell)

测定GAD(glutaminic acid decarboxylase)及Nestin，此为神经细胞专有的两种蛋白，是众所皆知的基本鉴定方法。使用结合荧光的抗GAD抗体及结合荧光的抗Nestin抗体进一步做免疫荧光细胞染色，发现GAD及Nestin都呈阳性荧光反应。如图7及图8所示。

再者，P干细胞也可以转化成其它的目标细胞，例如：骨骼肌细胞、心肌细胞、肾脏细胞、肺脏细胞、肝脏细胞、肝脏细胞等。

例如：将P干细胞置于一骨骼肌细胞培养基(skeletal myogenicmedium)，骨骼肌细胞培养基为DMEM，内包含骨骼肌细胞转化素，例如：10μM 5-氮杂胞苷(5-azacytidine)，置于CO₂培养箱培养24小时后，将细胞培养基置换为新鲜的DMEM，之后，将细胞继续培养7至11天，P干细胞将直接转化成骨骼肌细胞(skeletal muscle cell)。

例如：将P干细胞置于一心肌细胞培养基(cardiomyogenic medium)，心肌细胞培养基为Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium(IMDM)，包含心肌细胞转化素，例如：3μM 5-氮杂胞苷(5-azacytidine)，置于CO₂培养箱培养24小时后，将细胞培养基置换为新鲜的IMDM，之后，将细胞继续培养5至7天。此时，再以IMDM内包含3μM 5-氮杂胞苷(5-azacytidine)的心肌细胞培养基处理细胞24小时，将细胞继续培养在新鲜的IMDM中7至14天，P干细胞将直接转化成心肌细胞(cardiomyocytic cell)。

例如：将P干细胞置于第一型胶原蛋白涂抹(coating)的培养皿中，且培养皿中事先加入肾脏细胞培养基，肾脏细胞转化培养基为EmbryoMedium(Dainippon Pharmaceutical)培养基，包含肾脏细胞转化素，例如：10ng/ml血癌抑制因子(leukemia inhibitory factor(LIF))，同时置于CO₂培养箱培养3至4周，且每3至5天必须更换新鲜的包含10ng/mlLIF的Embryo Medium培养基，之后，P干细胞将直接转化成肾脏细胞(renal cell)。

例如：将P干细胞置于肺脏细胞培养基，肺脏细胞培养基为DMEM，包含肺脏细胞转化素，例如：10μg/ml胰岛素(insulin)、100ng/ml纤维母细胞生长因子-1(Fibroblast Growth Factor-1，FGF-1)、200ng/ml纤维母细胞生长因子-2(FGF-2)、50ng/ml纤维母细胞生长因子-7(FGF-7)、800ng/ml纤维母细胞生长因子-9(FGF-9)、1,000ng/ml纤维母细胞生长因子-10(FGF-10)、1,000ng/ml纤维母细胞生长因子-18(FGF-18)，置于CO₂培养箱培养2至3周，且每3至5天必须更换新鲜的包含肺脏细胞转化素的DMEM，之后，P干细胞将直接转化成肺脏细胞(lung cell)。

例如：将P干细胞置于肝脏细胞培养基(Hepatogenic medium)，肝脏细胞培养基为low glucose-DMEM，内包含肝脏细胞转化素，例如：50ng/ml肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)、100ng/ml纤维母细胞生长因子-4(FGF-4)，置于CO₂培养箱培养2至3周，且每3至5天必须更换新鲜的包含相同的肺脏细胞转化素的low glucose-DMEM，之后，P干细胞将直接转化成肝脏细胞(Hepatocyte)。

例如：将P干细胞置于脂肪细胞分化培养基，脂肪细胞分化培养基为含10％牛血清的DMEM，包含脂肪细胞转化素，例如：1μM dexamethasone，0.5mM methyl-isobutylxantine，10μg/ml insulin，100mM indomethacin(Sigma)，置于CO2培养箱培养72小时，接着将培养基更换成含10％牛血清的DMEM，其包含脂肪细胞转化素，例如10μg/ml insulin，如此再置于CO2培养箱培养6-10天，之后，P干细胞将直接转化成脂肪细胞。

由于P干细胞具有多功能性的转化能力，能转化成各种不同的目标细胞，在P干细胞的存在下，只要使用不同的培养基及转化素，P干细胞即可转化成不同的目标细胞，例如肾细胞培养基、心肌细胞培养基等。将目标细胞例如实施例三、五、七所转化成的细胞，至少用无菌生理食盐水清洗3次，最后1000转离心速度离心10分钟后，去除上清液，将此浓缩的目标细胞收集于无菌注射针筒内，即可直接注射于自体受损组织细胞处，可作为修复之用。

实施例九    鉴定单核性细胞的蛋白激酶C

依照实施例一，当单核性细胞加入Go6976及Bryostatin-1后算起，在0小时、0.25小时、0.5小时、1小时、2小时、6小时、12小时及24小时的时间取样测定培养基中单核性细胞蛋白激酶C(Protein Kinase C)的变化。图1和图2为在0小时，单核性细胞中蛋白激酶C电泳图的变化，结果显示单核性细胞的细胞质中含有六种亚型的蛋白激酶C包括α、βI、βII、γ、ι/λ及ζ，Mo代表单核性细胞的蛋白质，pc代表蛋白激酶C的阳性对照组。将单核性细胞打碎后，直接取打碎后的溶液1μl进行蛋白质电泳分析30分钟，再将之转印到NC paper上后，再利用牛血清做NC paper的固定(blocking)，接着再用抗蛋白激酶C各亚型的抗体(已结合冷光)，来测定NC paper上是否含有蛋白激酶C，例如抗蛋白激酶Cα抗体结合冷光，将与转印到NC paper上的蛋白激酶Cα结合，最后利用清水清洗NC paper 3次，再利用底片曝光取得结果。结果如图9所示。

图10为在0小时、0.25小时、0.5小时、1小时、2小时、6小时、12小时及24小时的时间，单核性细胞的细胞质(cytosolic)中及细胞膜(membrane)中蛋白激酶C电泳图的变化，当任何亚型的蛋白激酶C被活化后，将由细胞质的部位转位(translocation)至细胞膜上，同时有浓度上的变化。mPKC是细胞膜蛋白激酶C亚型电泳测定，cPKC是细胞质蛋白激酶C亚型电泳测定。图10结果显示，只有蛋白激酶CβII被活化。只要活化单核性细胞的蛋白激酶CβII，即可将单核性细胞转变成P干细胞。只要能活化单核性细胞蛋白激酶CβII的任何物皆是蛋白激酶CβII活化调节剂，此蛋白激酶CβII活化调节剂可以是单一物质或复合物质。依照图9的实验方法，将打碎的单核性细胞高速离心，上清液做细胞质蛋白激酶C亚型电泳测定，沉淀的细胞碎片做细胞膜蛋白激酶C亚型电泳测定。

Claims (20)

1、一种自体干细胞，其特征在于，由一种单核性细胞加入蛋白激酶C调节剂经培养形成。

2、如权利要求1所述的自体干细胞，其特征在于，所述的蛋白激酶C调节剂为Bryostatin-1、Go6976或其组合物。

3、如权利要求1所述的自体干细胞，其特征在于，所述的蛋白激酶C调节剂为GM-CSF、SDF或其组合物。

4、如权利要求1所述的自体干细胞，其特征在于，所述的蛋白激酶C调节剂为胶原蛋白、纤维粘连蛋白或其组合物。

5、一种自体干细胞的形成方法，其特征在于，以活化单核性细胞的蛋白激酶CβII，来将单核性细胞转变成自体干细胞。

6、如权利要求5所述的自体干细胞的形成方法，其特征在于，所述的活化单核性细胞的蛋白激酶CβII，其使用的蛋白激酶C调节剂为Bryostatin-1、Go6976或其组合物。

7、如权利要求5所述的自体干细胞的形成方法，其特征在于，所述的活化单核性细胞的蛋白激酶CβII，其使用的蛋白激酶C调节剂为GM-CSF、SDF或其组合物。

8、如权利要求5所述的自体干细胞的形成方法，其特征在于，所述的活化单核性细胞的蛋白激酶CβII，其使用的蛋白激酶C调节剂为胶原蛋白、纤维粘连蛋白或其组合物。

9、一种目标细胞，其特征在于，权利要求1-8任一项所述的自体干细胞加入一转化素，并置于培养基内经培养而形成。

10、如权利要求9所述的目标细胞，其特征在于，所述的目标细胞为骨母细胞，其培养基为低葡萄糖DMEM，其转化素为dexamethasone、β-磷酸甘油、维生素C或其组合物。

11、如权利要求9所述的目标细胞，其特征在于，所述的目标细胞为软骨细胞，其培养基为低葡萄糖DMEM，其转化素为dexamethasone、转移生长因子-β1或其组合物。

12、如权利要求9所述的目标细胞，其特征在于，所述的目标细胞为神经细胞，其培养基为α-最低基础培养基，其转化素为乙基硫醇、A酸、L-麸酰氨酸、N2营养剂、B27营养剂或其组合物。

13、如权利要求9所述的目标细胞，其特征在于，所述的目标细胞为心肌细胞，其培养基为IMDM，其转化素为5-氮杂胞苷。

14、如权利要求9所述的目标细胞，其特征在于，所述的目标细胞为肾脏细胞，其培养基为Embryo Medium，其转化素为血癌抑制因子。

15、如权利要求9所述的目标细胞，其特征在于，所述的目标细胞为肺脏细胞，其培养基为DMEM，其转化素为胰岛素、纤维母细胞生长因子或其组合物。

16、如权利要求9所述的目标细胞，其特征在于，所述的目标细胞为肝脏细胞，其培养基为低葡萄糖DMEM，其转化素为肝细胞生长因子、纤维母细胞生长因子或其组合物。

17、如权利要求9所述的目标细胞，其特征在于，所述的目标细胞为骨骼肌细胞，其培养基为DMEM，其转化素为5-氮杂胞苷。

18、如权利要求9所述的目标细胞，其特征在于，所述的目标细胞为脂肪细胞，其培养基为DMEM，其转化素为dexamethasone、indomethacin、胰岛素、methyl-isobutylxantine或其组合物。

19、一种应用自体干细胞作为组织细胞修复剂的方法，其包括：取一自体干细胞，并将自体干细胞直接置入损伤组织细胞处，以达到修复作用。

20、一种应用目标细胞作为组织细胞修复剂的方法，其包括：至少以一种目标细胞直接置入损伤组织细胞处，以达到修复作用。

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