KR101791347B1 - 편도유래 중간엽 줄기세포 스페로이드를 포함하는 알레르기 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
편도유래 중간엽 줄기세포 스페로이드를 포함하는 알레르기 질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은, 편도유래 중간엽 줄기세포 스페로이드의 파쇄물을 포함하는 알레르기 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 본 발명의 조성물은 호산구성 염증을 억제하고 알레르기 증상을 호전시키며, 항원 특이적인 T헬퍼 세포 유형 2의 면역반응을 감소시키므로, 알레르기 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
알레르기(allergy)란 어떤 외래성 물질과 접한 생체가 그 물질에 대하여 정상과는 다른 반응을 나타내는 현상을 말한다. 즉, 우리 몸속에서 일어나는 면역반응의 한 종류로서, 사람에게 문제가 되지 않는 외부 이물질(항원, antigen)에 대하여 체내의 항체 또는 림프구가 지나치게 반응하여 신체의 이상을 초래하는 이상 과민 면역 반응으로 생기는 질환이 알레르기 질환이다. 대표적인 알레르기 질환에는 발생 부위에 따라 기침, 천명, 호흡곤란을 주요 증상으로 하는 기관지 천식(기관지), 맑은 콧물, 재채기, 코막힘의 알레르기성 비염(코), 가려움증, 피부표면의 평평한 융기 등의 두드러기, 아토피성 피부염(피부), 알레르기성 결막염(눈) 등을 포함한다.
알레르기 질환은 문명이 발달함에 따라 증가되는 질환 중의 하나로, 현재 우리나라 성인의 약 10%, 어린이의 약 20% 이상에서 발생하는 것으로 추정되며, 이는 서구화된 생활환경, 공해, 화학 물질에 노출이 많아져서 점차 증가 추세에 있다. 이러한 환경 변화가 유전적 요인과 함께 우리 몸의 면역체계에 혼란을 가져오는 것이다. 특히, 환경위생의 발달로 병원체의 침입이 적어지고 우리의 면역 시스템이 병원체에 노출될 기회가 적어져서 병원체와 항원을 잘 구별하지 못하는 것이 알레르기 질환이 증가하는 한 원인이라는 가설이 있다. 이것을 뒷받침하는 한 가지 예로 기생충 감염이 많은 지역에서는 알레르기 질환이 적다는 것이다. 또한 젖먹이나 어린이의 감염질환의 감소도 주원인으로 주목받고 있다. 어릴 적 세균이나 바이러스에 감염되면 알레르기 질환의 발생을 억제하는 Th1 세포가 만들어지지만 그렇지 않으면 오히려 알레르기 질환을 유발하는 Th2 세포가 생성되기 때문이다.
Th 세포는 IL-2(interleukin-2)를 생산하고, 세포 주기의 G0 단계에서 G1단계로 들어가게 되어 세포 증식을 시작하게 되는데, 이 과정은 계속적인 항원자극의 도움없이 사이토카인(IL-2, IL-4, IL-7, IL-15 등)의 자극만을 통해서도 진행된다. 세포증식의 다음 단계는 분화(differentiation)인데, 분화란 세포의 기능이 결정 지워지는 단계이다. 즉, 활성화된 Th 세포는 그들이 분비하는 사이토카인의 종류와 분비한 사이토카인에 의한 면역 조절 기능에 따라 Th1과 Th2, 두 종류의 효력 T세포(effector CD4+ T cell)로 분화된다. 이러한 분화의 기전은 완전하게 밝혀지지는 않았지만, 일차 분화시기에 주위의 사이토카인 환경이 매우 중요하며, 항원의 종류와 용량, 항원제시세포의 종류, 항원제시세포와 T 세포 반응 할 때 보조자극 신호의 종류 등에 의해 Th1 또는 Th2로의 세포분화가 결정된다.
이때, Th1 세포가 생산하는 Th type 1 사이토카인은 Th1 세포의 분화를 유도하는 반면 Th2 세포의 증식과 분화를 억제한다. 이와는 반대로 Th2 세포가 생산하는 Th type 2 사이토카인은 Th2 세포의 증식과 분화를 유도하는 반면 Th1 세포의 분화를 억제하는 방식으로, Th1 과 Th2는 서로 상호견제를 통해 균형을 이루며 면역반응을 조절한다. 따라서, 이 균형이 깨어지게 되면 Th1/Th2 불균형으로 인한 여러 가지 면역질환을 겪게 된다. 알레르기 질환도 그 균형이 Th2 쪽으로 치우친 결과로 유발된 면역질환 중의 하나이다. 즉, Th2 세포와 알레르기 질환의 발생 관계는 Th2 세포 기능의 증가와 Th1 세포 기능의 감소(Th2/Th1 imbalance)라는 Th2 가설을 통해 이해할 수 있다. 알레르기 질환에서는 IL-4, IL-5, IL-13에 의한 비정상적인 Th2 면역반응이 호산구성 염증을 초래하므로, 선택적인 Th2 반응의 억제가 알레르기 염증을 억제하는데 중요하다고 할 수 있다(Wilson MS, et al., J Exp Med 202:1199-212, 2005; Park Y, et al. J Allergy Clin Immunol 108:570-6, 2001).
알레르기 질환 중에서 알레르기 비염은 가장 흔한 질환이며, 이는 천식 및 부비동염과 연관이 있다. 알레르기 비염은 점차 증가하고 있으며 생활의 질에 영향을 주고 생산능력의 감소와 치료비 부담의 증가로 인해 사회 경제적으로 문제가 되고 있으나 뚜렷한 치료법은 아직 없다. 약물요법은 알레르기 비염의 기본적인 치료지만 약제 중단 시 재발이 흔하고 심각한 부작용을 일으킬 수 있으며, 면역요법은 유일하게 변형된 면역체계를 원상회복시키는 근본치료가 될 수 있지만 수년간의 치료가 필요하고 과민반응과 비용이 문제가 될 수 있다.
한편, 중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cells, MSCs)는 생체 내(in vivo) 및 생체 외(in vitro)에서 중간엽 계통의 여러 가지 세포, 즉 골, 연골, 지방조직 또는 근육으로 분화할 수 있다(Prockop DJ. Science 276:71-4, 1997; Pittenger MF, et al. Science 284:143-7, 1999). MSCs는 여러 문헌에서 골형성 부전증, 심근 경색, 폐 손상 및 뇌 경색 등 손상된 조직의 재생에 유용하다고 보고된 바 있으며, 현재 여러 연구들에서 MSCs의 분화능 및 재생능을 이용하여 치료제로 사용하려는 시도가 이루어지고 있다(Horwitz EM, et al. Blood 97:1227-31, 2001; Shake JG, et al . Ann Thorac Surg 73:1919-26, 2002; Rojas M, et al. Am J Respir Cell Mol Biol 33:145-52, 2005; Li Y, et al Neurology 59:514-23, 2002). MSCs는 분화능을 가질 뿐만 아니라 면역억제효과도 가지고 있는데, 동종간의 이식(allogeneic transplantation)에서 이식편대숙주병(graft-versus-host disease)의 발생과 중증도를 감소시킨다고 보고되었다(Le Blanc K, et al. Lancet 363:1439-41, 2004). 또한, MSCs는 T세포, B세포 및 NK세포(natural killer cell)의 기능을 억제하고 수상돌기세포(dendritic cells)의 기능에도 영향을 줄 수 있다(Di Nicola M, et al. Blood 99:3838-43, 2002; Jiang XX, et al. Blood 105:4120-6, 2005; Corcione A, et al. Blood 107:367-72, 2006).
줄기세포는 자가 재생과 여러 가지 세포로 분화가 가능한 능력을 가지고 있다. ADSCs도 자가 재생 능력을 보이며, 중간엽에서 발생하는 연골세포(chondrocytes), 지방세포(adipocytes), 조골세포(osteoblasts), 근세포 (myocytes) 또는 내피세포(endothelial cells) 등 여러 가지 세포로 분화가 가능하다. 이전의 연구는 ADSCs가 미토겐(mitogen)에 반응하여 혼합 림프구 반응(mixed lymphocyte reaction)과 림프구 증식 반응을 억제하여 면역억제효과를 보인다고 하였다(Puissant B, et al., Br J Haematol 129:118-29, 2005). 하지만, 아직까지 줄기세포를 이용하여 알레르기 질환에 임상시험이 진행된 경우는 없으며 현재 그 기전을 밝히는 단계이다. 대부분의 연구가 인간의 중간엽 줄기세포 자체를 마우스의 정맥주사하여 치료효과를 규명하고자 하는 것인데, 이는 아직 면역 거부 반응 등의 여러 이유로 실제로 임상에 적용하기에 부적절하다는 문제점이 있다.
본 발명의 목적은, 편도유래 중간엽 줄기세포 스페로이드를 포함하는 알레르기 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
일실시예에 따르면, 편도유래 중간엽 줄기세포 스페로이드의 파쇄물을 포함하는, 알레르기 질환의 예방 또는 치료를 위한 조성물을 제공한다.
일측에 따르면, 상기 편도유래 중간엽 줄기세포 스페로이드의 파쇄물은 0.1 mg/ml 내지 10 mg/ml 농도로 포함되는 것일 수 있다.
일측에 따르면, 상기 편도유래 중간엽 줄기세포 스페로이드는 혈청 함유 배양 배지에서 배양된 후, 무혈청 배양 배지에서 배양된 것일 수 있다.
일측에 따르면, 상기 알레르기 질환은, 알레르기성 피부염, 알레르기성 비염, 알레르기성 천식, 알레르기성 중이염, 아나필락틱 쇼크(anaphylatic shock), 소아 알레르기성 질환, 알레르기성 결막염, 자가면역성 간염, 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증(allergic bronchopulmonary aspergillosis), 또는 알레르기성 구내염(allergic stomatitis)일 수 있다.
일측에 따르면, 상기 편도유래 중간엽 줄기세포 스페로이드 파쇄물은 호산구성 염증을 억제하는 것일 수 있다.
일측에 따르면, 상기 편도유래 중간엽 줄기세포 스페로이드 파쇄물은 Th2 (T helper cell type 2)면역반응을 감소시키는 것일 수 있다.
일측에 따르면, 상기 Th2 면역반응의 감소는 혈청 내의 난알부민-특이 IgE 항체는 감소시키고 난알부민-특이 IgG2a 항체는 증가시키는 것일 수 있다.
일측에 따르면, 상기 Th2 면역반응의 감소는 비장 내의 IL-6, IL-17 또는 IFN-γ 를 감소시키는 것일 수 있다.
일측에 따르면, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다.
일측에 따르면, 상기 조성물의 제형은 정제, 환제, 산제, 갑셀제, 액제, 현탁제, 과립제, 시럽제, 주사제, 또는 외용제일 수 있다.
일실시예에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 개선을 위한 건강 보조 식품이 제공된다.
일실시예에 따르면, 키토산 용액으로 세포 배양 플레이트를 코팅하는 단계, 상기 세포 배양 플레이트에 편도유래 중간엽 줄기세포를 접종하는 단계, 상기 편도유래 중간엽 줄기세포를 혈청 함유 세포 배양배지에서 배양한 후 무혈청 세포 배양배지에서 배양하여, 3차원의 편도유래 중간엽 줄기세포 스페로이드를 형성시키는 단계 및 상기 스페로이드를 회수하여 파쇄하는 단계를 포함하는, 알레르기 질환의 예방 또는 치료를 위한 조성물 제조방법이 제공된다.
본 발명의 편도유래 중간엽 줄기세포 스페로이드를 포함하는 조성물은, 알레르기 질환 동물모델에서의 알레르기 비염 질환의 증상을 개선을 개선하는 효과가 있을 뿐만 아니라 부작용이 없으므로, 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물로 활용될 수 있다.
도 1은, 편도 조직으로부터 제조된 T-MSC 스페로이드가 알레르기 질환에 활용되는 것을 나타낸 모식도이다.
도 2는, T-MSC의 표면 표지(CD90, CD105, CD31, CD34, CD45)를 분석한 그래프이다.
도 3은, 3차원 세포 배양 스페로이드 및 파쇄 과정을 나타낸 모식도이다.
도 4는, Human protein XL 분석 결과 사진 및 유의미한 단백질 발현을 표시한 표이다.
도 5는, 면역조절 관련 단백질인 인간 FGF, HGF 및 TGF-β1의 ELISA 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은, 동물 모델 6개 군 각각의 투여 스케쥴을 나타낸 것이다.
도 7은, 각 군에서 측정된 IL-4, IL-5 IL-6, IL-17, 및 IFN-γ 농도를 나타낸 그래프이다.
도 8은, 동물 모델 5개 군 각각의 투여 스케쥴을 나타낸 것이다.
도 9는, 동물 모델 5개 군에서 15분 동안 측정된 알레르기 비염 증상을 나타낸 그래프이다.
도 10은, 동물 모델 5개 군에서 측정된 IgE, OVA 특이 IgE, OVA 특이 IgG1 및 OVA 특이 IgG2의 농도를 나타낸 그래프이다.
도 11은, 각 군에서 측정된 IL-6, IL-17 및 IFN-γ 농도를 나타낸 그래프이다.
도 12는, 각 군에서 측정된 호산구의 수 및 조직염색사진을 나타낸 것이다.
도 2는, T-MSC의 표면 표지(CD90, CD105, CD31, CD34, CD45)를 분석한 그래프이다.
도 3은, 3차원 세포 배양 스페로이드 및 파쇄 과정을 나타낸 모식도이다.
도 4는, Human protein XL 분석 결과 사진 및 유의미한 단백질 발현을 표시한 표이다.
도 5는, 면역조절 관련 단백질인 인간 FGF, HGF 및 TGF-β1의 ELISA 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은, 동물 모델 6개 군 각각의 투여 스케쥴을 나타낸 것이다.
도 7은, 각 군에서 측정된 IL-4, IL-5 IL-6, IL-17, 및 IFN-γ 농도를 나타낸 그래프이다.
도 8은, 동물 모델 5개 군 각각의 투여 스케쥴을 나타낸 것이다.
도 9는, 동물 모델 5개 군에서 15분 동안 측정된 알레르기 비염 증상을 나타낸 그래프이다.
도 10은, 동물 모델 5개 군에서 측정된 IgE, OVA 특이 IgE, OVA 특이 IgG1 및 OVA 특이 IgG2의 농도를 나타낸 그래프이다.
도 11은, 각 군에서 측정된 IL-6, IL-17 및 IFN-γ 농도를 나타낸 그래프이다.
도 12는, 각 군에서 측정된 호산구의 수 및 조직염색사진을 나타낸 것이다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 각 도면에 제시된 동일한 참조 부호는 동일한 부재를 나타낸다.
아래 설명하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 실시예를 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조 부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
일실시예에 따르면, 편도유래 중간엽 줄기세포 스페로이드의 파쇄물을 포함하는, 알레르기 질환의 예방 또는 치료를 위한 조성물을 제공한다.
도 1은, 편도 조직으로부터 제조된 T-MSC 스페로이드가 알레르기 질환에 활용되는 것을 나타낸 모식도이다.
본 명세서에서 상기 "스페로이드(spheroid)"는 3차원 세포집합체 (3D cell mass, 3DCM)인 세포괴를 지칭한다. 스페로이드는 배양시간의 경과에 따라 직경이 증가될 수 있으나, 일정 크기 이상이 되면 스페로이드 내부에서 세포괴사가 발생할 수 있다. 따라서, 적절한 스페로이드의 직경으로 배양하는 것이 바람직하며, 예를 들면, 0.5 내지 1 mm 직경일 수 있다.
상기 조성물의 알레르기 질환에 대한 영향을 확인하기 위하여, 편도 조직 (Tonsil biopsytis)을 채취한 후, 편도유래 중간엽 줄기세포 (Tonsil derived mesenchymal stem cell: T-MSC)을 분리하여 3차원 배양하였다. 3차원 배양된 편도유래 중간엽 줄기세포 스페로이드는, 알레르기 질환 동물 모델에서 평가되었으며, 상기 동물 모델은 난알부민 (ovalbumin, OVA)을 이용하여 감작시키는 방식으로 알레르기 질환을 유도하여 준비되었다. (실시예 4 및 6 참조)
일측에 따르면, 3차원 세포 배양 환경에서 배양하여 형성된 편도유래 줄기세포의 스페로이드는, 2차원 환경에서 배양된 편도유래 줄기세포에 비하여, 면역조절 관련 단백질인 FGF, HGF 및 TGFβ1 단백질을 더 많이 생산할 수 있다 (실시예 3 및 도 5 참조). 이러한 면역조절 관련 단백질은, 알레르기 질환 증상을 완화시키고, 항체 또는 사이토카인 농도에 영향을 줄 수 있다.
일측에 따르면, 상기 편도유래 중간엽 줄기세포 스페로이드의 파쇄물은 0.1 mg/ml 내지 10 mg/ml 농도로 포함되는 것일 수 있다. 상기 편도유래 중간엽 줄기세포 스페로이드의 파쇄물의 농도에 따른 효과를 확인하였으며, 0.1 mg/ml 내지 10 mg/ml 농도에서 알레르기 질환의 증상을 완화하고, 호산구 염증을 억제하며, 사이토카인의 농도를 감소시키는 것을 확인하였다. (실시예 6 내지 10 참조) 상기 스페로이드 파쇄물의 농도는 바람직하게는, 0.5 mg/ml 내지 5 mg/ml, 가장 바람직하게는, 약 1mg/ml 일 수 있다.
일측에 따르면, 상기 편도유래 중간엽 줄기세포 스페로이드는 혈청 함유 배양 배지에서 배양된 후, 무혈청 배양 배지에서 배양된 것일 수 있다. 세포 배양액에 첨가되는 동물 혈청이 면역거부 반응을 유발할 수 있으므로, 혈청 함유 배양 배지에서 배양된 이후에, 무혈청 배양 배지에서 추가적인 배양이 이뤄지는 것이 바람직하다.
일측에 따르면, 상기 알레르기 질환은, 알레르기성 피부염, 알레르기성 비염, 알레르기성 천식, 알레르기성 중이염, 아나필락틱 쇼크(anaphylatic shock), 소아 알레르기성 질환, 알레르기성 결막염, 자가면역성 간염, 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증(allergic bronchopulmonary aspergillosis), 또는 알레르기성 구내염(allergic stomatitis)일 수 있다.
본 명세서에서 상기 "알레르기 질환"은 생체가 어떤 외래성 물질에 대해서 정상과는 다른 반응을 나타내는 질환을 모두 지칭한다. 또한, 본 발명에서 상기 알레르기 질환은 Th1 및 Th2 면역반응으로 인해 일어나는 질환은 모두 포함할 수 있다. 특히, "알레르기 비염(Allergic rhinitis)"은 코 점막이 특정 물질에 대하여 과민반응을 나타내는 비강 점막의 일반적인 염증 질환으로, 알레르기를 일으키는 원인 물질(항원)이 코 점막에 노출된 후 자극 부위로 비만세포(mast cell), 호산구를 비롯한 여러 종류의 IgE 항체를 매개로 하는 염증세포가 몰려들어 이들이 분비하는 다양한 매개물질에 의하여 염증반응이 발생하는 질환이며, 중이염, 부비동염, 인후두염 등이 동반될 수 있다. 이러한 알레르기 비염은 Th2 세포에 의해 주로 매개되며, Th2 세포 기능의 증가로 인해 알레르기 반응이 발생한다.
본 발명의 조성물이 알레르기 질환의 증상에 대하여 미치는 영향을 알아보기 위하여, 알레르기 질환 동물 모델에서 OVA로 분무하는 중 재채기와 코를 비비는 동작의 숫자를 기록하여 비교하였다. (실시예 7 참조) 그 결과, 재채기와 코를 비비는 동작을 합한 증상 점수의 평균은, 항원을 투여하지 않은 대조군에 비하여 알레르기 질환 유발군에서 의미 있게 증가하였고, 상기 알레르기 질환 유발군에 비하여 편도유래 중간엽줄기세포가 투여된 군에서는 유의하게 감소하였다. 따라서 본 발명의 조성물은 알레르기 질환의 증상을 감소시킬 수 있음을 확인할 수 있다.
일측에 따르면, 상기 편도유래 중간엽 줄기세포 스페로이드 파쇄물은 호산구성 염증을 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 조성물이 비강 점막의 호산구성 염증에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 알레르기 질환 동물 모델에서 채취한 비강 점막 조직 절편을 고정 및 염색 후 광학현미경하에서 관찰하였다. (실시예 10 참조) 상기 결과, 항원을 투여하지 않은 대조군에서는 비강점막에 염증세포의 침윤이 전혀 관찰되지 않았으나, 알레르기 질환 유발군의 점막에서는 염증세포, 특히 호산구의 침윤이 증가하였고, 상기 호산구의 침윤은 편도유래 중간엽 줄기세포의 파쇄액 투여에 의해 감소되었다. 따라서 본 발명의 조성물이 알레르기 질환에서 비강점막의 호산구 염증을 억제할 수 있음을 확인할 수 있다.
일측에 따르면, 상기 편도유래 중간엽 줄기세포 스페로이드 파쇄물은 Th2 (T helper cell type 2)면역반응을 감소시키는 것일 수 있다.
일측에 따르면, 상기 Th2 면역반응의 감소는 혈청 내의 난알부민-특이 IgE 항체는 감소시키고 난알부민-특이 IgG2a 항체는 증가시키는 것일 수 있다.
일측에 따르면, 상기 Th2 면역반응의 감소는 비장 내의 IL-6, IL-17 또는 IFN-γ 를 감소시키는 것일 수 있다.
본 발명의 조성물이 면역 반응에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 알레르기 질환 동물 모델에 OVA를 분무한 후 비장 세포의 부유물을 배양하여 비장 상층액 내 IL-4, IL-10, IL-17, IFN-γ 농도를 ELISA 방법으로 측정하였다. (실시예 5 및 9 참조) 상기 결과, 비장 상층액 내 IL-4, IL-10, IL-17, IFN-γ의 농도는 알레르기 질환 유발군에 비하여, 편도유래 중간엽 줄기세포의 파쇄액이 투여된 군에서 유의하게 감소하였다.
또한, 알레르기 질환 동물 모델로부터 수득된 혈청 내 Th2 면역반응과 관계된 OVA 특이 IgE, IgG1 항체와 Th1 면역반응과 관계된 OVA 특이 IgG2 항체를 ELISA 방법을 사용하여 측정하였다.(실시예 8 참조) 상기 결과, 항원을 투여하지 않은 대조군에 비해 OVA 항원을 투여한 알레르기 질환 유발군의 OVA 특이 IgE, IgG1 및 IgG2a 항체농도는 유의하게 증가한 반면, 편도유래 중간엽 줄기세포의 파쇄액이 투여된 군에서는 OVA 특이 IgE 농도는 유의하게 감소하고, IgG2a 농도는 유의하게 증가하였으나 IgG1 농도는 의미있는 차이를 보이지 않았다. 따라서 비강 점막에 의해 정착된 편도유래 중간엽 줄기세포의 파쇄액이 Th2 면역반응을 억제한다는 것을 알 수 있다.
일측에 따르면, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 염을 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는, 완충액, 주사용 멸균수, 일반 식염수 또는 인산염 완충 식염수, 슈크로스, 히스티딘, 염 및 폴리솔베이트 등과 같은 여러 성분을 함유할 수 있다. 또한, 상기 약학적으로 허용 가능한 염은, 유리 산(free acid)에 의해 형성된 부가염일 수 있다. 적합한 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산 및 인산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 구연산(citric acid), 초산, 젖산, 주석산(tartariac acid), 말레인산, 푸마르산(fumaric acid), 포름산, 프로피온산(propionic acid), 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산 또는 아스파르트산 등을 사용할 수 있다. 나아가, 약학적으로 허용 가능한 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 조제될 수 있는 모든 염, 수화물 및 용매화물을 모두 포함할 수 있다.
일측에 따르면, 상기 조성물의 제형은 정제, 환제, 산제, 갑셀제, 액제, 현탁제, 과립제, 시럽제, 주사제, 또는 외용제일 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 에리오딕티올을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에이스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 웨텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 또한, 비경구적으로 국소 적용할 수 있는 연고제, 액제, 패취제, 드레싱제, 스프레이제 등과 같은 피부외용제 형태로 투여될 수 있다.
일실시예에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 개선을 위한 건강 보조 식품이 제공된다. 본 명세서에서 "건강 보조 식품"이란, 상기 조성물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 건강 보조 식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 알레르기성 질환을 예방 또는 개선하는 효과를 기대할 수 있어 매우 유용하다.
본 발명의 조성물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 식품 또는 식품첨가물의 유효성분으로 사용할 수 있다. 상기 유효성분 이외에도 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 첨가량은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 예를 들면, 전체 식품 중량의 0.01 내지 5 중량%로 첨가되거나, 또는, 100 mL를 기준으로 0.02 내지 2 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 첨가될 수 있다. 하지만, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다. 상기 건강 보조 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.
일실시예에 따르면, 키토산 용액으로 세포 배양 플레이트를 코팅하는 단계, 상기 세포 배양 플레이트에 편도유래 중간엽 줄기세포를 접종하는 단계, 상기 편도유래 중간엽 줄기세포를 혈청 함유 세포 배양배지에서 배양한 후 무혈청 세포 배양배지에서 배양하여, 3차원의 편도유래 중간엽 줄기세포 스페로이드를 형성시키는 단계 및 상기 스페로이드를 회수하여 파쇄하는 단계를 포함하는, 알레르기 질환의 예방 또는 치료를 위한 조성물 제조방법이 제공된다.
일측에 따르면, 상기 편도유래 중간엽 줄기세포 스페로이드의 파쇄물은 0.1 mg/ml 내지 10 mg/ml 농도로 포함되는 것일 수 있다. 상기 편도유래 중간엽 줄기세포 스페로이드의 파쇄물의 농도에 따른 효과를 확인하였으며, 0.1 mg/ml 내지 10 mg/ml 농도에서 알레르기 질환의 증상을 완화하고, 호산구 염증을 억제하며, 사이토카인의 농도를 감소시키는 것을 확인하였다. 상기 스페로이드 파쇄물의 농도는 바람직하게는, 0.5 mg/ml 내지 5 mg/ml, 가장 바람직하게는, 약 1mg/ml 일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 편도유래 중간엽 줄기세포(MSC)확보 및 특성 분석
편도선 절제술을 통하여 수득되는 인체 구개 편도 조직에 콜라제나이즈 I (collagenase I)을 처리하여, 편도유래 중간엽 줄기세포 (Tonsil derived mesenchymal stem cell: T-MSC)을 분리한 후에 배양하였다. 분리된 Human adipose-derived mesenchymal stem cells (ASC)와 T-MSC는 유동세포계수법 (flow cytometry)으로 표면 표지 (surface marker)들을 분석하여 그 특성을 확인하였다.
도 2는, T-MSC의 표면 표지(CD90, CD105, CD31, CD34, CD45)를 분석한 그래프이다. 도 2를 참고하면, 간엽 줄기세포 표지 (Mesenchymal marker: CD90, CD105)는 발현을 보였고, 조혈 표지 (hematopoietic marker: CD34, CD45)와 내피 세포 표지 (endothelial cell marker: CD31)는 발현되지 않았다.
실시예 2: 편도유래 중간엽 줄기세포(MSC) 스페로이드 형성 및 파쇄
배양 플레이트를 키토산으로 코팅하였다. 상세하게는, 0.67% (w/v) 아세트산에 0.5 mL 1% (w/w) 키토산 용액 (C-3646, Sigma, St. Louis, MO)을 용해하여, 24-웰 조직 배양 플레이트(TCPS; Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany) 각각에 넣고, 60 ℃ 오븐에서 24 시간 건조시켰다. 이후에, 0.5 N NaOH 수용액(Sigma)으로 2시간 동안 중화시켰다. 이어서, 자외선으로 오버나이트 노출되기 전에, 플레이트를 증류수로 완전히 세척하였다.
상기 1% (w/w) 키토산 용액으로 코팅된 24-웰 조직 배양 플레이트에 편도유래 중간엽 줄기세포를 배양하였다. 세포 배양의 농도는 15 × 104/cm2 이며, 세포 배양배지는 RPMI-1640 (또는 DMEM, DMEM F12 사용) 배양배지를 사용하였다. 세포배양액에 첨가되는 동물혈청이 면역거부반응을 유발할 수 있으므로, 혈청 함유 세포배양액에서 1일간 배양 후, 무혈청 세포 배양 환경으로 옮겨 다시 2일 간 배양하였다. 상기 배양 과정을 통하여, 고밀도의 3차원 세포 배양 스페로이드 (spheroid)가 형성되었다. 도 3은, 3차원 세포 배양 스페로이드 및 파쇄 과정을 나타낸 모식도이다.
상기 편도유래 줄기세포의 스페로이드를 회수한 후, PBS로 2 내지 3회 세척하였다. 그 다음에, 위하여 냉동-해동 (freeze-thawing; 얼음 결정으로 세포 파괴)방법으로 세포를 파쇄하기 위하여 2분간 냉동된 막자 사발에서 세포를 골고루 갈았다. 분쇄물은 원심분리한 후, 상층액을 분리하고 동결건조기에 넣어 수일 간 건조시켜 파우더 형태의 세포 파쇄 단백질을 수득 하였다. 수득된 파우더 형태의 파쇄물을 생리식염수에 적당 농도로 희석하여 실험에 사용하였다.
실시예 3: T-MSC의 2차원 배양물과 3차원 배양물의 단백질 평가
3차원 세포 배양 (spheroid) 환경에서 배양한 T-MSC의 스페로이드 파쇄물과 2차원 환경에서 배양한 줄기세포 파쇄물에 함유된 단백질을 측정하기 위하여, 인간 단백질의 XL array(정성 평가) 및 면역조절 관련 단백질의 ELISA 분석 (정량 평가)를 수행하였다.
도 4는, Human protein XL 분석 결과 사진 및 유의미한 단백질 발현을 표시한 표이다. 도 4를 참고하면, 3차원 세포 배양 환경에서 배양한 줄기세포 스페로이드와 2차원 환경에서 배양한 줄기세포를 비교하였을 때, 스페로이드에서 면역 조절 단백질의 분비가 더 촉진되었음을 확인할 수 있었다.
또한, 도 5는, 면역조절 관련 단백질인 인간 FGF, HGF 및 TGF-β1의 ELISA 분석 결과를 나타낸 그래프이다. 도 5를 참고하면, 3차원 세포 배양 환경에서 배양한 줄기세포 스페로이드와 2차원 환경에서 배양한 줄기세포를 비교하였을 때, 스페로이드에서 FGF, HGF 및 TGFβ1 단백질이 더 많이 생산되었음을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 알레르기 질환 동물모델에 2차원 배양 T-MSC 또는 3차원 배양 스페로이드 투여
알레르기 질환에 대한 T-MSC 스페로이드의 효과를 측정하기 위하여, 2차원으로 배양된 편도유래 중간엽 줄기세포 파쇄액과 3차원으로 배양된 편도유래 중간엽 줄기세포 스페로이드 파쇄액을 준비하였다. 또한, 혈청을 함유한 배지에서 배양된 세포와 무혈청 배지에서 배양된 세포 간의 차이점을 확인하기 위하여, 각각의 2차원 및 3차원 배양 세포는, 혈청 함유 배양 배지에서 배양된 후 무혈청 배양 배지에서 배양된 세포 군과, 혈청 함유 배양 배지에서만 배양된 세포 군으로 나누어 준비되었다. 알레르기 질환에 대한 T-MSC 스페로이드의 효과를 측정하기 위하여, 알레르기 질환을 동물(쥐)에 유발시킨 후 각각의 줄기세포 파쇄물을 투여하였으며, 동물은 5 마리씩 구성된 6개의 군으로 나눈 후 실험하였다.
도 6은, 동물 모델 6개 군 각각의 투여 스케쥴을 나타낸 것이고, 표 1은 투여 스케쥴 및 투여량을 나타낸 것이다.
도 6을 참고하면, 음성 대조군((-)control)은 PBS로 감작하고 코에 분무한 투여한 후, 다시 PBS를 투여한 군이고, 양성 대조군((+)control) 또는 OVA 군은 OVA로 감작하고 코에 분무하여 알레르기 비염을 발생시킨 후, OVA를 투여한 군이다. T-MSC 군은, OVA로 감작하고 코에 분무하여 알레르기 비염을 발생시킨 후, 2차원으로 배양된 중간엽 줄기세포의 파쇄액을 투여한 군이다. T-MSC 중에서도, "T-MSC (with FBS)" 군은 혈청(FBS)를 함유한 배양 배지에서만 2차원 배양된 T-MSC의 파쇄액이 투여된 군이고, "T-MSC (FBS free)"군은 혈청 함유 배지에서 하루 배양된 후 무혈청 배양 배지에서 2차원 배양된 T-MSC의 파쇄액이 투여된 군이다. 스페로이드 (Spheorid)군은, OVA로 감작하고 코에 분무하여 알레르기 비염을 발생시킨 후, 3차원으로 배양된 중간엽 줄기세포의 스페로이드 파쇄액을 투여한 군이다. 스페로이드 (Spheorid)군 중에서도, "Spheorid (with FBS)" 군은 혈청(FBS)를 함유한 배양 배지에서만 3차원 배양된 T-MSC의 파쇄액이 투여된 군이고, "Spheorid (FBS free)"군은 혈청 함유 배지에서 하루 배양된 후 무혈청 배양 배지에서 3차원 배양된 T-MSC의 파쇄액이 투여된 군이다. 각각의 투여 스케쥴은 도 6에 나타낸 바와 같다. 특히, T-MSC 군과 스페로이드 (Spheorid)군은 편도유래 중간엽 줄기세포 파쇄액의 효과를 측정하기 위하여, OVA를 분무하기 3일 전부터 매일 20㎕의 중간엽 줄기세포 파쇄액를 비강에 흘려 주었다.
실시예 5: 알레르기 질환 동물모델에서의 사이토카인 농도 측정
실시예 4의 모든 군에서, 각각 비장 세포를 체취하여 부유물을 배양한 후 비장 상층액 내 IL-4, IL-5 IL-6, IL-17, 및 IFN-γ 농도를 ELISA 방법으로 측정하였다.
도 7은, 각 군에서 측정된 IL-4, IL-5 IL-6, IL-17, 및 IFN-γ 농도를 나타낸 그래프 이다. 도 7을 참고하면, 무혈청 배양 배지에서 3차원 배양된 T-MSC의 파쇄액 군에서 측정된 IL-4, IL-5, IL-6, IL-17 및 IFN-γ 의 농도는, OVA 군이나 다른 군들에서 보다 전체적으로 낮은 것으로 측정되었다.
실시예 6: 알레르기 질환 동물모델에서의 3차원 배양 스페로이드의 농도에 따른 평가
알레르기 질환에 대한 3차원 배양된 T-MSC 스페로이드의 농도에 따른 효과를 측정하기 위하여, 혈청 함유 배지에서 하루 배양된 후 무혈청 배양 배지에서 3차원으로 배양된 편도유래 중간엽 줄기세포 스페로이드 파쇄액을 준비하였다. 상기 스페로이드 파쇄액은 각각 0.1 mg/ml, 1 mg/ml, 및 10 mg/ml 농도로 준비되었다. 알레르기 질환을 동물(쥐)에 유발시킨 후 각각의 스페로이드 파쇄물을 투여하였으며, 동물은 5 마리씩 구성된 5개의 군으로 나눈 후 실험하였다.
도 8은, 동물 모델 5개 군 각각의 투여 스케쥴을 나타낸 것이고, 표 2는 투여 스케쥴 및 투여량을 나타낸 것이다.
도 8을 참고하면, 음성 대조군((-)control)은 PBS로 감작하고 코에 분무한 투여한 후, 다시 PBS를 투여한 군이고, 양성 대조군((+)control) 또는 OVA 군은 OVA로 감작하고 코에 분무하여 알레르기 비염을 발생시킨 후, OVA를 투여한 군이다. T-MSC 군은, OVA로 감작하고 코에 분무하여 알레르기 비염을 발생시킨 후, 2차원으로 배양된 중간엽 줄기세포의 파쇄액을 투여한 군이다. 스페로이드 (Spheorid)군은, OVA로 감작하고 코에 분무하여 알레르기 비염을 발생시킨 후, 3차원으로 배양된 중간엽 줄기세포의 스페로이드 파쇄액을 투여한 군이다. 스페로이드 (Spheorid)군은, 스페로이드 파쇄액의 농도에 따라 3 군 (각각의 농도 0.1 mg/ml, 1 mg/ml, 및 10 mg/ml)으로 나뉘었다. 각각의 투여 스케쥴은 도 8에 나타낸 바와 같다. 대조군과 달리, 스페로이드 (Spheorid)군은 편도유래 중간엽 줄기세포 파쇄액의 효과를 측정하기 위하여, OVA를 분무하기 3일 전부터 매일 20㎕의 중간엽 줄기세포 파쇄액를 비강에 흘려 주었다.
실시예 7: 알레르기 질환 동물모델에서의 알레르기 비염 증상 측정
실시예 6 및 상기 도 8의 투여 스케쥴에 따라, OVA를 분무하는 중 마지막 15분간 쥐의 재채기와 코를 비비는 동작의 숫자를 실험 과정을 모르는 4명의 관찰자에 의해 기록하도록 하였다. 측정치는 unpaired t test를 이용하여 통계분석을 실시하였으며, p<0.05를 통계학적으로 의미있는 것으로 본다. 통계학적 분석은 통상적인 방법으로 수행되었다.
도 9는, 동물 모델 5개 군에서 15분 동안 측정된 알레르기 비염 증상을 나타낸 그래프이다.
도 9를 참고하면, 재채기와 코를 비비는 동작을 합한 증상 점수의 평균은, 음성대조군에 비하여 OVA군에서 매우 크게 증가되었고, OVA군에 비하여 편도유래 중간엽줄기세포의 스페로이드 파쇄액이 투여된 군에서는 유의하게 감소되었다.
실시예 8: 알레르기 질환 동물모델에서의 혈청 내 OVA 특이 IgE 및 IgG 측정
실시예 6의 모든 군에서, 혈액 2 내지 3 ml를 채취하고 원심분리를 통해 혈청을 얻었다. 각각의 혈청에 함유된, T 헬퍼 세포 유형 2(T helper cell type 2, Th2) 면역반응과 관계된 OVA 특이 IgE, IgG1 항체와 Th1면역반응과 관계된 OVA 특이 IgG2 항체를 ELISA 방법을 사용하여 측정하였다. 보다 상세하게는, 96 웰 마이크로타이터 플레이트 (well microtiter plate)(Nunc Maxisorb, Roskilde, Denmark)를 PBS(pH 9.8)로 녹인 100 ㎕/well OVA로 코팅(coating) 후 4℃ 에서 하룻밤 동안 인큐베이션시키고 실온에서 1시간 동안 웰을 블로킹 완충용액(blocking buffer) (4% BSA in PBS)으로 블로킹(blocking)시켰다. 단계적으로 희석된 각각의 혈청 100 ㎕/well을 각 웰에 넣은 다음 실온에서 2시간 동안 반응시키고 0.1% PBS-Tween 20 버퍼 용액으로 씻은 후 HRP-결합된 항 마우스 IgE(horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse IgE) (Pharmingen, Hamburg, Germany)(1:4000), IgG1(1:5000) 또는 IgG2a(1:5000)를 각 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. PBS-T로 씻고 모든 웰을 100 ㎕ 테트라메틸 벤지딘(tetramethyl benzidine)(Sigma, St. Louis, MO)으로 추가 반응시킨 후 흡광도 (absorbance) 450nm에서 ELISA 플레이트 리더기(plate reader)(Molecular Devices, Sunnyvale, California)로 측정하였다.
도 10은, 동물 모델 5개 군에서 측정된 IgE, OVA 특이 IgE, OVA 특이 IgG1 및 OVA 특이 IgG2의 농도를 나타낸 그래프이다. 도 10을 참고하면, OVA가 투여된 양성 대조군((+)control)의 OVA 특이 IgE, IgG1 및 IgG2a 농도는, OVA가 투여되지 않은 음성 대조군((-)control)에 비해 유의하게 증가하였다. 한편, 음성 대조군과 양성 대조군에 비하여, 스페로이드 파쇄액이 투여된 군에서의 OVA 특이 IgE 농도는 유의하게 감소하고, IgG2a 농도는 유의하게 증가하였으나 IgG1 농도는 의미 있는 차이를 보이지 않았다. 따라서 편도유래 중간엽 줄기세포의 파쇄액이 Th2 면역반응을 억제한다는 것을 알 수 있다. 특히, 스페로이드 파쇄액의 농도가 1 mg/ml 인 경우에 그 효과가 가장 좋음을 확인할 수 있었다.
실시예 9: 알레르기 질환 동물모델에서의 혈청 내 사이토카인 농도 측정
실시예 6의 모든 군에서, 각각 비장 세포를 체취하여 부유물을 배양한 후 비장 상층액 내 IL-6, IL-17 및 IFN-γ 농도를 ELISA 방법으로 측정하였다.
도 11은, 각 군에서 측정된 IL-6, IL-17 및 IFN-γ 농도를 나타낸 그래프이다. 도 11을 참고하면, OVA가 투여된 양성 대조군((+)control)의 사이토카인 농도는, OVA가 투여되지 않은 음성 대조군((-)control)에 비해 유의하게 증가하였는바 알레르기 질환이 잘 유도된 것을 확인할 수 있었다. 한편, 양성 대조군에 비하여, 스페로이드 파쇄액이 투여된 군에서의 사이토카인 농도는 감소하였으며, 특히, 스페로이드 파쇄액의 농도가 1 mg/ml 인 경우에 가장 유의하게 감소하였다.
실시예 10: 조직학적 검사 및 비강 점막에서의 호산구 측정
실시예 6의 모든 군에서의, 동물을 희생하여 채취한 비강 점막을 10% 중화된 포르말린에 담근 후 실온에서 24시간 동안 조직고정을 하고 파라핀 블록을 제작하였다. 4 μm로 조직 절편을 제조한 후, 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin)으로 조직 염색을 수행하고 400배 광학현미경하에서 관찰하였다. 호산구의 측정은 실험 과정을 모르는 두 명의 관찰자가 임의로 선정한 5군데 시야에서, 한 시야 전체에 침윤된 모든 호산구 (eosinophil; 호산성 물질; 에오신 기호성 백혈구)의 수를 측정하는 방법으로 수행되었다.
도 12는, 각 군에서 측정된 호산구의 수 및 조직염색사진을 나타낸 것이다.
도 12를 참고하면, OVA가 투여되지 않은 음성 대조군((-)control)에서는 비강점막에 염증세포의 침윤이 전혀 관찰되지 않은 반면, OVA가 투여된 양성 대조군((+)control)의 비강 점막에서는 염증세포, 특히 호산구의 침윤이 크게 증가하였다. 한편, 양성 대조군에 비하여, 스페로이드 파쇄액이 투여된 군에서의 호산구의 침윤은 유의하게 감소되었으며(p=0.01), 특히, 스페로이드 파쇄액의 농도가 1 mg/ml 인 경우에 가장 유의하게 감소하였다. 따라서, 스페로이드 파쇄액 투여는 비강 점막의 알레르기 염증의 발생을 억제한다는 것을 다시 한번 확인하였다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 특허청구범위의 범위에 속한다.
Claims (12)
- 편도유래 중간엽 줄기세포 스페로이드의 파쇄물을 포함하는, 알레르기성 비염의 예방 또는 치료를 위한 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 편도유래 중간엽 줄기세포 스페로이드의 파쇄물은, 0.1 mg/ml 내지 10 mg/ml 농도로 포함되는 것인, 알레르기성 비염의 예방 또는 치료를 위한 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 편도유래 중간엽 줄기세포 스페로이드는, 혈청 함유 배양 배지에서 배양된 후, 무혈청 배양 배지에서 배양된 것인, 알레르기성 비염의 예방 또는 치료를 위한 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 편도유래 중간엽 줄기세포 스페로이드 파쇄물은, 호산구성 염증을 억제하는 것인, 알레르기성 비염의 예방 또는 치료를 위한 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 편도유래 중간엽 줄기세포 스페로이드 파쇄물은, Th2 (T helper cell type 2)면역반응을 감소시키는 것인, 알레르기성 비염의 예방 또는 치료를 위한 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 Th2 면역반응의 감소는, 혈청 내의 난알부민-특이 IgE 항체는 감소시키고 난알부민-특이 IgG2a 항체는 증가시키는 것인, 알레르기성 비염의 예방 또는 치료를 위한 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 Th2 면역반응의 감소는, 비장 내의 IL-6, IL-17 또는 IFN-γ 를 감소시키는 것인, 알레르기성 비염의 예방 또는 치료를 위한 조성물.
- 제1항에 있어서,
약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함하는, 알레르기성 비염의 예방 또는 치료를 위한 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물의 제형은, 정제, 환제, 산제, 갑셀제, 액제, 현탁제, 과립제, 시럽제, 주사제, 또는 외용제인, 알레르기성 비염의 예방 또는 치료를 위한 조성물.
- 키토산 용액으로 세포 배양 플레이트를 코팅하는 단계;
상기 세포 배양 플레이트에 편도유래 중간엽 줄기세포를 접종하는 단계;
상기 편도유래 중간엽 줄기세포를, 혈청 함유 세포 배양배지에서 배양한 후 무혈청 세포 배양배지에서 배양하여, 3차원의 편도유래 중간엽 줄기세포 스페로이드를 형성시키는 단계; 및
상기 스페로이드를 회수하여 파쇄하는 단계를 포함하는, 알레르기성 비염의 예방 또는 치료를 위한 조성물 제조방법. - 삭제
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| Biomaterials. 2009;30(14),2705-2715* |
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