CN103911341A - Th1细胞亚群的制备方法及其在制备抗肿瘤细胞制剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了以CD4+T细胞为主的细胞群和Th1细胞亚群的制备试剂盒和制备方法，以及利用上述方法制得的Th1细胞亚群在制备抗肿瘤细胞制剂中的应用，属于生物技术领域。本发明采用CD4单克隆抗体和由聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯材料制成的培养瓶皿制备以CD4+T细胞为主的细胞群，采用两种细胞因子组合制备Th1细胞亚群。利用本发明提供的试剂盒和方法，能在单个核细胞中获得更高比例的CD4+T细胞，获得的Th1细胞亚群具有很强的免疫活性，能大量分泌细胞颗粒酶B、穿孔素、IFN-γ和TNF-α，具有显著的抗肿瘤活性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种Th1细胞亚群的制备方法及其在制备抗肿瘤细胞制剂中的应用。
背景技术
2008年，全球因恶性肿瘤而死亡的人数达760万(约占所有死亡人数的13％)，预计2030年全球因恶性肿瘤而死亡的人数将超过1310万。数据显示，全世界20％的新发恶性肿瘤病人在中国，24％的恶性肿瘤死亡病人在中国。尽管近年来手术、放疗、化疗以及其他治疗技术来不断发展，但是恶性肿瘤的复发、转移或者耐药等问题一直没有得到根本解决。随着肿瘤学和免疫学的不断进步，对肿瘤的发生发展机理研究的不断加深，肿瘤的免疫治疗越来越受到各国医学界的重视。单克隆抗体药物、DC疫苗药物、细胞信号传导通路抑制药物等新型抗肿瘤药物不断涌现，自体免疫细胞治疗技术在肿瘤的综合治疗中也逐渐发挥着作用，并取得了瞩目的成绩。
自体免疫细胞治疗技术分为特异性免疫细胞治疗，如树突状细胞(DC)、肿瘤浸润性T淋巴细胞(TIL)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)等；和非特异性免疫细胞治疗，如细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)和自然杀伤细胞(NK细胞)等。研究表明，在国内进行的24项涉及肿瘤CIK治疗的临床研究中，总体有效率达到51.7％。美国国立卫生研究院(NIH)的Rosenberg应用TIL细胞治疗转移性黑色素瘤，获得了58％的客观有效率。2010年4月，美国食品与药品监督局(FDA)正式批准了首个用于治疗恶性肿瘤的DC疫苗-Provenge，该疫苗治疗去势抵抗性前列腺癌患者，延长中位生存期约4.1个月，提高3年生存率约8.7％。这些自体免疫细胞的临床应用，极大的改善了恶性肿瘤患者生存质量，延长了生存期。
Provenge是用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和前列腺酸性磷酸酶(PAP)组成的融合蛋白负载恶性肿瘤患者自体富集的血液DC细胞制备而成。该疫苗不仅可以通过MHCI限制性方式将肿瘤抗原信息传递给CTL，还可以通过MHC II限制性方式将肿瘤抗原信息传递给Th1细胞。Th1细胞可通过Fas／FasL机制直接杀伤肿瘤细胞，还可通过释放IFN-γ等细胞因子，改善肿瘤微环境，下调Treg细胞表达，进一步刺激CTL，促进其对肿瘤细胞的特异性杀伤反应。Th1细胞在肿瘤的免疫治疗，尤其是肿瘤DC疫苗治疗中的作用，越来越得到重视。
T辅助细胞(Th)以细胞表面标记CD3、CD4+和TCRαβ为特征，即CD4+T细胞。据其 分泌的细胞因子的不同可分为Th0、Th1、Th2和Th3四个亚型。Th1、Th2和Th3细胞均由前体细胞Th0分化而来。未接触抗原的T细胞被称为Th细胞前体(Th cell precursor)，他们通过接触天然免疫细胞摄取的抗原而分化成一种不确定的状态，称为Th0细胞。Th0细胞既分泌Th1型细胞因子IL-2和IFN-γ，又分泌Th2型细胞因子IL-4，可在不同信号的刺激下分化为Th1或Th2细胞。Th1和Th2细胞除分泌不同的细胞因子，发挥不同的免疫作用外，他们各自细胞的表面受体也有许多的不同。IL-12、IFN-γ、IL-2等I型细胞因子促使Th0向Th1分化，并抑制Th2细胞分化；而IL-4、IL-10、IL-5、IL-6等II型细胞因子则促使Th0向Th2分化，同时也抑制Th1细胞增殖。TGF-β亦能抑制Th1细胞的分化生长。
Th1细胞介导细胞免疫且对于免疫介导的肿瘤根除极为关键；而Th2细胞介导体液免疫。研究表明，细胞因子作用于细胞表面受体，可引起Th细胞内一系列信号转导因子(STF)活化，从而发挥其对基因转录的调控作用，这一过程主要与JAK／STAT家族有关。如JAK2／STAT4被IL-12选择性激活，从而启动Th1型细胞因子IFN-γ的表达；IL-4选择性激活JAK1／STAT6，使Th0向Th2方向极化。另一个调节Th1细胞分化的细胞因子是IFN-γ。IFN-γ除了作为Th1效应细胞的标志外，它本身在维持Th1表型稳定性方面也有重要作用。分化的Th1细胞正常情况下不能转型而产生Th2型细胞因子，而IFN-γ缺陷鼠的Th1细胞在Th2极化条件下仍保持产生IL-4的能力。最近的研究提供了IFN-γ的作用机制：IFN-γ诱导转录因子T-bet的表达，而后者反过来诱导IFN-γ位点DNase1表达，使IFN-γ等位基因染色体重组进而转录激活IFN-γ基因，形成一个正反馈环路。IL-18与IL-12有协同作用，部分是因为增加IL-12对Th1分化的效能，部分是通过增加已分化的Th1细胞中细胞因子的表达。IL-12和IL-18联合缺失鼠与缺失二者之一的鼠相比有着更为严重的IFN-γ缺乏。有资料表明，IL-12能通过STAT4信号传导通路，增强Th1细胞的增殖和活化。美国学者发现，IL-7和IL-15可通过介导TCR的敏感性，促进Th1细胞的增殖与活化。这些研究，为本发明提供了坚实的理论基础。
恶性肿瘤患者的肿瘤微环境错综复杂，比如肿瘤局部高表达IL-10、TGF-β、VEGF、IL-6等免疫负性调节因子，或者通过STAT3信号传导通路激活Treg细胞，或者通过MDSC的免疫抑制作用，严重干扰体内免疫细胞治疗的临床疗效，甚至导致治疗失效。体外培养的效应性淋巴细胞，如CIK、NK、CTL、TIL、DC等细胞，能克服体内种种不利因素，提高其增殖能力和杀伤能力、或提高其抗原递呈功能等。但是这些细胞亚群中的Th1细胞的含量均很低，Th1细胞并未发挥应有的临床效果。
尽管Th1细胞在肿瘤的免疫治疗中起着重要的作用，但是对于Th1的制备，国内外相关的研究并不多。国内有学者利用胸腺5肽等免疫调节剂输入人体，可增加外周血中Th1／Th2的比值。国外Th1样细胞的制备，主要是提取外周血单个核细胞，然后利用免疫磁珠细胞分 选技术对CD4+细胞进行阳性筛选后，利用CD3／CD28ClinEx Vivo Dynal Beads(一种CD3、CD28单克隆抗体结合的免疫磁珠)进行Th1细胞培养，所得的Th1细胞百分比高，并且能分泌颗粒酶B和穿孔素等对靶细胞进行直接杀伤。然而，这种培养方案所用来进行CD4+细胞筛选的免疫磁珠细胞分选操作步骤繁琐，增加了培养过程中污染的可能性；免疫磁珠虽然可以自动分解，却不可避免的会有部分免疫磁珠进入人体，有激发机体的免疫排斥反应的可能。另外，利用CD3／CD28ClinEx Vivo Dynal Beads进行细胞培养，Th1占细胞总数的百分比很高，CTL数目却非常少，Th1细胞的直接杀伤肿瘤细胞能力要低于CTL细胞，Th1的促CTL特异性杀伤肿瘤细胞的能力也得不到充分利用。而且免疫磁珠产品费用昂贵，会极大的阻碍Th1细胞临床应用。
发明内容
为解决上述问题，本发明提出了一种用于制备以CD4+T细胞为主的细胞群的试剂盒和以CD4+T细胞为主的细胞群的制备方法，用于将以CD4+T细胞为主的细胞群制备成Th1细胞亚群的试剂盒和用于将以CD4+T细胞为主的细胞群制备成Th1细胞亚群的方法，以及制备得到的Th1细胞亚群在制备抗肿瘤细胞制剂中的应用。
本发明涉及一种用于制备以CD4+T细胞为主的细胞群的试剂盒，所述的试剂盒含有如下成分：
CD4单克隆抗体和由聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯材料制成的培养瓶皿。
其中，
所述的CD4单克隆抗体为含CD4单克隆抗体1-10μg／mL的包被液；
所述的CD4单克隆抗体选自IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和IgA中的任意一种类型。
本发明还涉及一种以CD4+T细胞为主的细胞群的制备方法，所述的方法包括如下步骤：
(1)用CD4单克隆抗体包被培养瓶皿；所述的培养瓶皿由聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯材料制成；
(2)从外周血、脐带血或骨髓中获取单个核细胞；
(3)用培养基将步骤(2)获得的单个核细胞吹打混匀，按2～5×106／mL的浓度种植于步骤(1)用CD4单克隆抗体包被好的培养瓶皿中，5％CO2、37℃条件下孵育2～6个小时，即获得以CD4+T细胞为主的细胞群。
其中，
步骤(1)中，所述的用CD4单克隆抗体包被培养瓶皿的方法为：将含1-10μg／mL的CD4单克隆抗体的包被液，加入至聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯制成的培养瓶皿中，将培养瓶皿 用锡箔纸包住以避光，平放，4℃孵育过夜；
步骤(2)中，所述的外周血为采自正常人或肿瘤患者的外周血，或者脐带血，正常人或者肿瘤患者骨髓；
步骤(3)中，所述的培养基为GT-T551／AIM V／X-VIVO。
本发明还涉及一种用于将以CD4+T细胞为主的细胞群制备成Th1细胞亚群的试剂盒，所述的试剂盒含有如下成分：
1～10μg／mL CD3mAb和1～10μg／mL CD28mAb以及如下任意一种细胞因子组合：
第1种细胞因子组合：
10～100ng／mL IL-7、10～100ng／mL IL-15、10～100ng／mL IL-18、10～100ng／mL IL-12、500～1000U／mL IL-2；
第2种细胞因子组合：
10～100ng／mL IL-7、10～100ng／mL IL-15、10～100ng／mL IL-18、500～1000U／mL IL-2。
本发明还涉及一种用于将以CD4+T细胞为主的细胞群制备成Th1细胞亚群的方法，所述的方法包括如下步骤：
(1)用含有1～10μg／mL CD3mAb和1～10μg／mL CD28mAb的包被液包被培养瓶皿，4℃避光孵育过夜；
(2)将以CD4+T细胞为主的细胞群用含500～3000U／mL IFN-γ的培养基调节成1～5×106／mL的细胞悬液后转入步骤(1)中用CD3mAb和CD28mAb过夜包被的培养瓶皿中，5％CO2、37℃条件下孵育过夜，得到以激活的CD4+T细胞为主的细胞群；
(3)收集步骤(2)中获得的以激活的CD4+T细胞为主的细胞群，使用含有下述任一种细胞因子组合的培养基，调节成1～3×106／mL的细胞悬液，种植到培养瓶皿中：
第1种细胞因子组合如下：
10～100ng／mL IL-7、10～100ng／mL IL-15、10～100ng／mL IL-18、10～100ng／mL IL-12、500～1000U／mL IL-2；
第2种细胞因子组合如下：
10～100ng／mL IL-7、10～100ng／mL IL-15、10～100ng／mL IL-18、500～1000U／mL IL-2；
每2～3天，加入和之前使用的培养基相同的培养基，维持细胞密度在1～2×106／mL；第14天即得到所述的Th1细胞亚群。
其中，
步骤(2)中所述的以CD4+T细胞为主的细胞群优选采用上述的以CD4+T细胞为主的细胞群的制备方法获得；
步骤(2)和步骤(3)中所述的培养基为GT-T551／AIM V／X-VIVO培养基。
利用上述方法制备得到的Th1细胞亚群在制备抗肿瘤细胞制剂中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的有益效果为：
利用本发明提供的用于制备以CD4+T细胞为主的细胞群的试剂盒和以CD4+T细胞为主的细胞群的制备方法能在贴壁单个核细胞中获得更高比例的CD4+T细胞，从而有利于减少杂质细胞对其转化为Th1细胞亚群的影响；利用本发明提供的用于将以CD4+T细胞为主的细胞群制备成Th1细胞亚群的试剂盒和用于将以CD4+T细胞为主的细胞群制备成Th1细胞亚群的方法能获得的Th1细胞亚群具有很强的免疫活性，能大量分泌细胞颗粒酶B、穿孔素、IFN-γ和TNF-α，具有显著的抗肿瘤活性。
附图说明
图1是本发明实施例2中，流式细胞仪检测的贴壁单个核细胞中CD4+T淋巴细胞所占百分比；其中，图1A表示用CD4单克隆抗体包被培养瓶皿法获得的贴壁的单个核细胞中CD4+T细胞占比；图1B为用普通的单个核细胞提取法获得的单个核细胞中CD4+T淋巴细胞占比；
图2是本发明实施例3中，流式细胞仪检测的CD4单克隆抗体包被培养瓶皿法结合CD3mAb和CD28mAb包被培养瓶皿法以及两种细胞因子组合获得的Th1细胞亚群的情况；图2A表示用第1种细胞因子组合的结果；图2B为用第2种细胞因子组合的结果；
图3是本发明实施例4中，免疫印迹法检测得到的Th1细胞亚群中Th1细胞颗粒酶B和穿孔素表达情况。
具体实施方式
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步的说明：
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：CD4单克隆抗体包被培养瓶皿法制备以CD4+T细胞为主的细胞群
(1)将含1-10μg／mL的CD4单克隆抗体的包被液，加入至聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯材料制成的培养瓶皿中，将培养瓶皿用锡箔纸包住以避光，平放，4℃孵育过夜；其中，使用的CD4单克隆抗体类型可为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和IgA中的任意一种；
(2)第1天，无菌条件下抽取健康人或肿瘤患者外周血，或取采血初步分离(即单采)得到的正常人或肿瘤患者的外周血单个核细胞，或采集脐带血，或采集骨髓，转入50mL离心管中，加入等体积生理盐水稀释，获得经稀释的样品；再按经稀释的样品与淋巴细胞分离液的体积比2∶1或1∶1的比例，将经稀释的样品转至淋巴细胞分离液上方，慢升慢降(升1 降0)，2000转／分离心20-30分钟；然后小心吸取白膜层，用生理盐水、D-Hanks液或PBS洗涤两次，即得到单个核细胞；
(3)用培养基GT-T551／AIMV／X-VIVO将步骤(2)获得的单个核细胞吹打混匀，按2～5×106／mL的密度种植于步骤(1)用CD4单克隆抗体包被好的培养瓶皿中，5％CO2、37℃条件下孵育2～6个小时；然后吸弃上清，用生理盐水、D-Hanks液或PBS轻柔冲洗培养瓶皿壁3次，吸弃上清；
(4)使用0.25％胰酶消化细胞，然后收集细胞，用生理盐水、D-Hanks液或PBS洗涤细胞3次，收集沉淀细胞，即为以CD4+T细胞为主的细胞群；或者采用细胞刮等进行细胞收集也可。
其中，本实施例采用的培养基GT-T551购自TAKARA，AIM V购自LIFE，X-VIVO购自LONZA。
上述利用CD4单克隆抗体包被聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯等材料制成的培养瓶皿所获得的CD4+T细胞的纯度与普通单个核细胞提取法获得的CD4+T细胞相比的优点将通过实施例2来进一步详细说明。
实施例2：利用实施例1所述的CD4单克隆抗体包被培养瓶皿法能在单个核细胞中获得更高比例的CD4+T细胞
(1)将按照实施例1步骤(2)所述的方法制备得到的单个核细胞分成如下两组：
第1组：CD4单克隆抗体包被培养瓶皿法：
将单个核细胞按2～5×106／mL的密度种植于按照实施例1步骤(1)所述的方法制备的用CD4单克隆抗体包被的聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯材料制成的培养瓶皿中；5％CO2、37℃条件下孵育2～6小时后，吸弃上清，用生理盐水、D-Hanks液或PBS冲洗瓶皿壁，获得以CD4+T细胞为主的细胞群；
第2组：普通的单个核细胞提取法：
直接收集按照实施例1步骤(2)所述的方法制备得到的单个核细胞；
(2)分别将步骤(1)获得的两组细胞用CD4-FITC标记，用流式细胞仪检测(结果见图1)。
从图1可知，第1组CD4单克隆抗体包被培养瓶皿法获得的贴壁细胞中CD4+T细胞百分比约为57.6％±7.3％(如图1A所示)，而第2组的该比例为32.4％±8.4％(如图1B所示)；
因此，利用实施例1所述的CD4单克隆抗体包被培养瓶皿法，与普通的单个核细胞提取法相比获得的单个核细胞中CD4+T淋巴细胞百分比更高。
本实施例中CD4-FITC抗体购自BD Bioscience。
实施例3：
(1)用含有1～10μg／mL CD3mAb和1～10μg／mL CD28mAb的包被液包被培养瓶皿，4℃避光孵育过夜；
(2)将按照实施例1中的方法制备得到的以CD4+T细胞为主的细胞群用含500～3000U／mL IFN-γ的GT-T551／AIM V／X-VIVO培养基调节成1～5×106／mL的细胞悬液后转入步骤(1)中用CD3mAb和CD28mAb过夜包被的培养瓶皿中，5％CO2、37℃条件下孵育过夜，得到以激活的CD4+T细胞为主的细胞群；
(3)收集步骤(2)中获得的以激活的CD4+T细胞为主的细胞群，使用含有下述任一种细胞因子组合的、含1％～5％自体血浆或AB血浆的GT-T551／AIM V／X-VIVO培养基，调节成1～3×106／mL的细胞悬液，种植到培养瓶皿中：
第1种细胞因子组合如下：
10～100ng／mL IL-7、10～100ng／mL IL-15、10～100ng／mL IL-18、10～100ng／mL IL-12、500～1000U／mL IL-2；
第2种细胞因子组合如下：
10～100ng／mL IL-7、10～100ng／mL IL-15、10～100ng／mL IL-18、500～1000U／mL IL-2；
每2～3天，加入和之前使用的培养基相同的培养基，维持细胞密度在1～2×106／mL；第14天，即获得Th1细胞亚群；分别收集用上述两种不同的细胞因子组合刺激培养后获得的Th1细胞亚群，用流式细胞仪进行如下检测：
分别使用CD3-FITC、CD8-PE、γ-IFN-CYS、IL-4-CYS或CD25-PE和CD127-FITC对上述两组细胞进行染色，然后分别用流式细胞仪检测。检测结果见图2。
由图2A1、2A2和图2B1、2B2可知：采用第1种细胞因子组合(10～100ng／mL IL-7、10～100ng／mL IL-15、10～100ng／mL IL-18、10～100ng／mL IL-12、500～1000U／mL IL-2)能获得Th1细胞百分比85％以上的Th1细胞亚群；采用第2种细胞因子组合(10～100ng／mL IL-7、10～100ng／mL IL-15、10～100ng／mL IL-18、500～1000U／mL IL-2)能获得Th1细胞百分比60％以上的Th1细胞亚群；
由图2A3和图2B3可知：采用第1种细胞因子组合获得的Th1细胞亚群中，Th2细胞所占百分比在1％以下；采用第2种细胞因子组合获得的Th1细胞亚群中，Th2细胞所占百分比在3％以下；
由图2A4和图2B4可知：采用第1种细胞因子组合获得的Th1细胞亚群中，Treg细胞所占百分比为0；采用第2种细胞因子组合获得的Th1细胞亚群中，Treg细胞所占百分比在1％以下；
综上，图2说明了：利用实施例1所述的CD4单克隆抗体包被培养瓶皿法结合本实施例的CD3mAb和CD28mAb包被培养瓶皿法以及第1种细胞因子组合(10～100ng／mL IL-7、 10～100ng／mL IL-15、10～100ng／mL IL-18、10～100ng/mL IL-12、500～1000U／mL IL-2)或第2种细胞因子组合(10～100ng／mL IL-7、10～100ng／mL IL-15、10～100ng／mL IL-18、500～1000U／mL IL-2)刺激法，能获得Th1细胞占比很高、Th2和Treg杂质细胞占比极低的Th1细胞亚群，且使用第1种细胞因子组合时，Th1细胞占比更高。
其中，IL-7、IL-15、IL-18、IL-12和IFN-γ购自PEPROTECH；IL-2购自济南泉港；CD3单克隆抗体和CD28单克隆抗体购自Ebioscience。
实施例4：Th1细胞亚群中Th1细胞颗粒酶B和穿孔素免疫印迹检测
(1)收集实施例3步骤(3)中第14天收集的经两种不同的细胞因子组合刺激培养后获得的Th1细胞亚群，用带有CD4标签的免疫磁珠分选得到Th1细胞；
同时，用带有CD4标签的免疫磁珠分选使用实施例2步骤(1)第2组实验所述的普通的单个核细胞提取法获得的细胞中的Th1细胞；
免疫印迹法检测上述两组Th1细胞的颗粒酶B和穿孔素表达情况。检测结果见图3。
图3中，第11组为采用实施例3步骤(3)中的第1种细胞因子组合后获得的Th1细胞的颗粒酶B和穿孔素表达情况结果图；第12组为采用实施例3步骤(3)中的第2种细胞因子组合后获得的Th1细胞的颗粒酶B和穿孔素表达情况的结果图；第21组为采用实施例2步骤(1)第2组实验所述的普通的单个核细胞提取法获得的细胞中的Th1细胞的颗粒酶B和穿孔素表达情况的结果图。
结果显示，第11组和第12组的Th1细胞，可以表达颗粒酶B和穿孔素，且第11组比第12组的颗粒酶B和穿孔素的表达量均更高；而第21组基本不表达颗粒酶B和穿孔素。
因此，使用本发明提供的CD4单克隆抗体包被培养瓶皿法结合CD3mAb和CD28mAb包被培养瓶皿法以及第1种细胞因子组合(10～100ng／mL IL-7、10～100ng／mL IL-15、10～100ng／mL IL-18、10～100ng／mL IL-12、500～1000U／mL IL-2)或第2种细胞因子组合(10～100ng／mL IL-7、10～100ng／mL IL-15、10～100ng／mL IL-18、500～1000U／mL IL-2)获得的Th1细胞亚群中的Th1细胞具有更高的活性，同时，使用第1种细胞因子组合获得的Th1细胞亚群中的Th1细胞活性更高。
实施例5：Th1细胞亚群中Th1细胞的IFN-γ和TNF-α表达检测
(1)收集实施例3步骤(3)中第14天收集的经两种不同的细胞因子组合刺激培养后获得的Th1细胞亚群，用带有CD4标签的免疫磁珠分选得到Th1细胞；
同时，用带有CD4标签的免疫磁珠分选使用实施例2步骤(1)第2组实验所述的普通的单个核细胞提取法获得的细胞中的Th1细胞；
Elisa法检测上述两组Th1细胞的IFN-γ和TNF-α表达情况。检测结果见表1。
表1中，第11组为采用实施例3步骤(3)中的第1种细胞因子组合后获得的Th1细胞 的IFN-γ和TNF-α表达情况；第12组为采用实施例3步骤(3)中的第2种细胞因子组合后获得的Th1细胞的IFN-γ和TNF-α表达情况；第21组为采用实施例2步骤(1)第2组实验所述的普通的单个核细胞提取法获得的细胞中的Th1细胞的IFN-γ和TNF-α表达情况。
结果显示，第11组和第12组的Th1细胞，表达的IFN-γ和TNF-α显著高于第21组的Th1细胞，且第11组比第12组的IFN-γ和TNF-α的表达量均更高。
因此，使用本发明提供的CD4单克隆抗体包被培养瓶皿法结合CD3mAb和CD28mAb包被培养瓶皿法以及第1种细胞因子组合(10～100ng／mL IL-7、10～100ng／mL IL-15、10～100ng／mL IL-18、10～100ng／mL IL-12、500～1000U／mL IL-2)或第2种细胞因子组合(10～100ng／mL IL-7、10～100ng/mL IL-15、10～100ng／mL IL-18、500～1000U／mL IL-2)获得的Th1细胞亚群中的Th1细胞具有更高的活性，同时，使用第1种细胞因子组合获得的Th1细胞亚群中的Th1细胞活性更高。
表1
| 分组 | IFN-γ分泌量 | TNF-α分泌量 |
| 第21组 | 10ng以下 | 100pg以下 |
| 第11组 | 20.1+8.7ng／ml | 305±65pg／ml |
| 第12组 | 14.6±5.2ng／ml | 216+43ng／ml |
实施例6：Th1细胞亚群对肿瘤细胞系的杀伤试验
(1)收集实施例3步骤(3)中第14天收集的经两种不同的细胞因子组合刺激培养后获得的Th1细胞亚群；
其中，使用第1种细胞因子组合(10～100ng／mL IL-7、10～100ng／mL IL-15、10～100ng／mLIL-18、10～100ng／mL IL-12、500～1000U／mL IL-2)的命名为第1组，使用第2种细胞因子组合(10～100ng／mL IL-7、10～100ng／mL IL-15、10～100ng／mL IL-18、500～1000U／mL IL-2)的命名为第2组；
同时收集实施例2步骤(1)第2组实验所述的普通的单个核细胞提取法获得的单个核细胞，流式分选单个核细胞中的Th1细胞亚群，命名为第3组；
(2)收集实施例2步骤(1)第2组实验所述的普通的单个核细胞提取法获得的单个核细胞，用GM-CSF和IL-4刺激其分化为未成熟DC细胞；然后使用小鼠移植瘤裂解液作为抗原对获得的未成熟DC细胞进行抗原负载，并用TNF-α刺激未成熟DC细胞成熟；
(3)将步骤(2)中获得的成熟DC细胞分别与步骤(1)中的3组Th1细胞亚群于5％CO2、37℃条件下混合孵育培养48小时，其中Th1细胞亚群中的细胞和成熟DC细胞的数量比例为10∶1；
(4)小鼠移植瘤体内实验：
将移植瘤小鼠分为6组，每组8只，每只均注射1×106个Th1细胞亚群细胞和1×105个成熟DC细胞；其中，
A组和D组注射第1组实验获得的Th1细胞和成熟DC细胞；
B组和E组注射第2组实验获得的Th1细胞和成熟DC细胞；
C组和F组注射第3组实验获得的Th1细胞和成熟DC细胞；
A组、B组、C组小鼠于第30天处死，记录移植瘤直径；
D组、E组、F组小鼠用于观察小鼠生存期。
检测结果见表2。
结果显示，A组和B组小鼠的移植瘤体积显著小于C组，且A组小鼠的移植瘤体积也小于B组小鼠；A组和B组小鼠的生存期显著长于C组，且A组小鼠的生存期也长于B组小鼠。
因此，使用本发明提供的CD4单克隆抗体包被培养瓶皿法结合CD3mAb和CD28mAb包被培养瓶皿法以及第1种细胞因子组合(10～100ng／mL IL-7、10～100ng／mL IL-15、10～100ng／mL IL-18、10～100ng／mL IL-12、500～1000U／mL IL-2)或第2种细胞因子组合(10～100ng／mL IL-7、10～100ng／mL IL-15、10～100ng／mL IL-18、500～1000U／mL IL-2)获得的Th1细胞亚群具有更高的抗肿瘤活性，同时，使用第1种细胞因子组合获得的Th1细胞亚群的抗肿瘤活性更高。
表2
| 组别 | 检测方法 | 移植瘤体积(mm3) | 小鼠生存期(天) |
| A组 | 第30天处死，检测移植瘤体积 | 38+17 | |
| B组 | 第30天处死，检测移植瘤体积 | 46±15 | |
| C组 | 第30天处死，检测移植瘤体积 | 73±19 | |
| D组 | 观察小鼠生存期 | 76.3+21.5 | |
| E组 | 观察小鼠生存期 | 54.4±20.6 | |
| F组 | 观察小鼠生存期 | 39.5±18.3 |
Claims (10)
1.一种用于制备以CD4+T细胞为主的细胞群的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有如下成分：
CD4单克隆抗体和由聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯材料制成的培养瓶皿。
2.根据权利要求1所述的用于制备以CD4+T细胞为主的细胞群的试剂盒，其特征在于，所述的CD4单克隆抗体为含CD4单克隆抗体1-10μg／mL的包被液；所述的CD4单克隆抗体选自IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和IgA中的任意一种类型。
3.一种以CD4+T细胞为主的细胞群的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)用CD4单克隆抗体包被培养瓶皿；所述的培养瓶皿由聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯材料制成；
(2)从外周血、脐带血或骨髓中获取单个核细胞；
(3)用培养基将步骤(2)获得的单个核细胞吹打混匀，按2～5×106／mL的浓度种植于步骤(1)用CD4单克隆抗体包被好的培养瓶皿中，5％CO2、37℃条件下孵育2-6个小时，即获得以CD4+T细胞为主的细胞群。
4.根据权利要求3所述的以CD4+T细胞为主的细胞群的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的用CD4单克隆抗体包被培养瓶皿的方法为：将含1-10μg/mL的CD4单克隆抗体的包被液，加入至聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯制成的培养瓶皿中，将培养瓶皿用锡箔纸包住以避光，平放，4℃孵育过夜。
5.根据权利要求3或4所述的以CD4+T细胞为主的细胞群的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的外周血为采自正常人或肿瘤患者的外周血，或者脐带血，正常人或者肿瘤患者骨髓；步骤(3)中，所述的培养基为GT-T551／AIM V／X-VIVO。
6.一种用于将以CD4+T细胞为主的细胞群制备成Th1细胞亚群的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有如下成分：
1～10μg／mL CD3mAb和1～10μg／mL CD28mAb以及如下任意一种细胞因子组合：
第1种细胞因子组合：
10～100ng／mL IL-7、10～100ng／mL IL-15、10～100ng／mL IL-18、10～100ng／mL IL-12、500～1000U／mL IL-2；
第2种细胞因子组合：
10～100ng／mL IL-7、10～100ng／mL IL-15、10～100ng／mL IL-18、500～1000U／mL IL-2。
7.一种用于将以CD4+T细胞为主的细胞群制备成Th1细胞亚群的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)用含有1～10μg／mL CD3mAb和1～10μg／mL CD28mAb的包被液包被培养瓶皿，4℃避光孵育过夜；
(2)将以CD4+T细胞为主的细胞群用含500～3000U／mL IFN-γ的培养基调节成1～5×106／mL的细胞悬液后转入步骤(1)中用CD3mAb和CD28mAb过夜包被的培养瓶皿中，5％CO2、37℃条件下孵育过夜，得到以激活的CD4+T细胞为主的细胞群；
(3)收集步骤(2)中获得的以激活的CD4+T细胞为主的细胞群，使用含有下述任一种细胞因子组合的培养基，调节成1～3×106／mL的细胞悬液，种植到培养瓶皿中：
第1种细胞因子组合如下：
10～100ng／mL IL-7、10～100ng／mL IL-15、10～100ng／mL IL-18、10～100ng／mL IL-12、500～1000U／mL IL-2；
第2种细胞因子组合如下：
10～100ng／mL IL-7、10～100ng／mL IL-15、10～100ng／mL IL-18、500～1000U／mL IL-2；
每2～3天，加入和之前使用的培养基相同的培养基，维持细胞密度在1～2×106／mL；第14天即得到所述的Th1细胞亚群。
8.根据权利要求7所述的用于将以CD4+T细胞为主的细胞群制备成Th1细胞亚群的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的以CD4+T细胞为主的细胞群采用权利要求3至5中任一项所述的以CD4+T细胞为主的细胞群的制备方法制备得到。
9.根据权利要求7所述的用于将以CD4+T细胞为主的细胞群制备成Th1细胞亚群的方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)中所述的培养基为GT-T551／AIM V／X-VIVO培养基。
10.利用权利要求7至9中任一项所述的方法制备得到的Th1细胞亚群在制备抗肿瘤细胞制剂中的应用。
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