CN111206052A - 一种滋养细胞、其制备方法及其在大量快速扩增γδT细胞中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种滋养细胞、其制备方法及其在大量快速扩增γδT细胞中的应用，该制备方法包括：S1，pLenti‑okt3‑CD64‑CD86‑4.1BBL慢病毒质粒载体的构建；S2，用pLenti‑okt3‑CD64‑CD86‑4.1BBL质粒载体包装慢病毒颗粒；S3，K562‑okt3‑CD64‑CD86‑4.1BBL滋养细胞的制备；S4，获取脐血的白膜层细胞；S5，脐血γδT细胞的体外扩增。本发明的制备方法利用okt3单链抗体通过CD8A跨膜区表达在滋养细胞膜上，尤其是能从脐血中低成本、快速、大量扩增γδT细胞，经过一个24天的扩增周期，γδT细胞的扩增倍数能达到10000倍左右，制备的γδT细胞纯度能达到90％以上。相较于用可溶的okt3抗体刺激，膜结合的okt3对γδT细胞扩增倍数在其2倍以上，具有良好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程和细胞生物学领域，具体涉及到一种滋养细胞、其制备方法及其在大量快速扩增γδT细胞中的应用。
背景技术
根据T细胞受体，T细胞能分为两种，即αβT细胞和γδT细胞。在健康成人当中，γδT细胞在外周血中占T细胞的比例为3％到5％左右，而其中50％到75％是Vγ9Vδ2T细胞，而在脐血中，γδT细胞的含量更低，可能只有外周血的十分之一，因而在体外大量扩增脐血γδT细胞比较困难。γδT细胞介导的是一种先天性免疫，它不需要MHC分子的抗原提呈，在免疫监视和防范肿瘤发生起着重要的作用。它已经被发现浸润在肾癌、卵巢癌以及直肠癌等各种人类癌症组织中，它们能识别由转化细胞表达的压力相关抗原，发挥即刻的细胞毒作用以及分泌IFN和TNF等细胞因子。有文献都报道从肿瘤组织或外周血中分离的γδT细胞在体外对肿瘤细胞具有明显的杀伤作用。另外，γδT细胞还能提呈抗原给CD8和CD4 T细胞，从而引发过继性抗肿瘤反应。Vγ9Vδ2T细胞能被磷酸化抗原IPP或者它的类似物BrHPP激活并增殖。
K562细胞为一种人慢性骨髓性白血病细胞系，经常通过基因修饰来作为抗原提呈细胞来支持免疫细胞的扩增。还有文献报道了通过表达膜结合的IL15和CD86以及CD137L的K562细胞来扩增外周血中的γδT细胞。
近年来，越来越多体外扩增的Vγ9Vδ2T细胞被用于临床治疗，还有文献报道了对10名癌症患者进行了多轮Vγ9Vδ2T细胞回输治疗，结果6名患者获得了SD(疾病稳定)。还有文献报道了用体外扩增的Vγ9Vδ2T细胞对一个晚期肝胆管癌的患者做了8个疗程的治疗，结果发现经过治疗后，患者的淋巴结肿瘤转移灶明显缩小，肿瘤标志物表达水平明显降低，整个治疗过程中没有发现明显的毒负作用。因而Vγ9Vδ2T细胞有着良好的临床应用前景。由于Vγ9Vδ2T细胞在脐血中的含量非常低，再加上来源于脐血的γδT细胞免疫原性很低，目前还没有文献报道一种可行的大规模扩增脐血γδT细胞的方法。
因而，目前亟需一种能够低成本快速大规模的扩增方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种滋养细胞、其制备方法及其在大量快速扩增γδT细胞中的应用，可提高脐血或外周血中Vγ9Vδ2T细胞的扩增效率，从而达到大规模生产用于临床肿瘤免疫治疗的Vγ9Vδ2T细胞的目的。
本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
依据本发明提出的一种pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL慢病毒质粒载体，所述pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL慢病毒质粒载体包括如SEQ IDNO:5所示的整个编码区序列okt3-E2A-CD64-P2A-CD86-F2A-4.1BBL-T2A-Puro。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。
依据本发明提出的一种pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL慢病毒质粒载体的制备方法，包括以下步骤：
S11,利用基因合成的方法，获得okt3-E2A-CD64-P2A-CD86-F2A-4.1BBL-T2A-Puro基因的全长编码区序列；
S12,将okt3-E2A-CD64-P2A-CD86-F2A-4.1BBL-T2A-Puro基因构建到慢病毒载体pLenti-mbIL21-4.1BBL上，得到质粒载体pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL；
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。
依据本发明提出的一种K562-okt3-CD64-CD86-4.1BBL滋养细胞的制备方法，包括以下步骤：
S31，将1-2million的旺盛生长的K562细胞放入24孔板中的一个孔进行培养，培养基为1毫升含有10％FBS的1640；
S32，再将30-35毫升病毒上清液超速离心浓缩的300μL慢病毒颗粒加入孔中，培养5-6天后，再用2-4μg/ml的Puromycin进行选择性培养；
S33，用流式检测okt3、D64、D86和4.1BBL这4个基因在K562细胞的表达，使各个基因的表达在80％以上；
S34，再用100Gy的γ射线照射10分钟，-80℃冰箱进行冻存，用于以后的γδT细胞培养实验。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。
依据本发明提出的一种K562-okt3-CD64-CD86-4.1BBL滋养细胞，所述滋养细胞是通过上述的方法制备得到的。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。
依据本发明提出的一种γδT细胞的制备方法，包括以下步骤：
将上述的质粒载体包装慢病毒颗粒后，再将所述慢病毒颗粒侵染滋养细胞系，获得能够表达目的基因的滋养细胞，再利用滋养细胞在体外大量扩增γδT细胞。
优选的，前述的γδT细胞的制备方法，所述目的基因包括okt3、CD64、CD86和4.1BBL中的至少一种；所述滋养细胞系包括肿瘤细胞；所述γδT细胞为脐血γδT细胞或外周血γδT细胞。
优选的，前述的γδT细胞的制备方法，包括以下步骤：
S1，pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL慢病毒质粒载体的构建：
S2，用pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL质粒载体包装慢病毒颗粒；
S3，K562-okt3-CD64-CD86-4.1BBL滋养细胞的制备；
S4，获取脐血的白膜层细胞；
S5，脐血γδT细胞的体外扩增。
优选的，前述的γδT细胞的制备方法，步骤S2具体包括：
S21，重组慢病毒的包装制备；
S22，重组慢病毒的超速离心浓缩。
优选的，前述的γδT细胞的制备方法，步骤S21中，所述重组慢病毒的包装制备方法为：
S21-1)每10cm细胞培养皿中加入4.0-4.5million的293FT细胞和8-9毫升DMEM完全培养基，混合混匀，在细胞培养箱中进行培养；
S21-2)培养第2天，每个培养皿中加入如下试剂：450-500μL jetPRIME buffer、5-6μg pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL慢病毒质粒载体或者pLenti-CD64-CD86-4.1BBL、3-4μg psPAX2和1.5-1.8μg pMD2.G，混合均匀，然后再向体系中加入jetPRIME，25μL/10cm培养皿，再次混合均匀，室温静置8-10min，得到混合液；
S21-3)将用于包装病毒的293FT细胞从培养箱中取出，将混合液平均加到每个培养皿中，混匀，放入培养箱中继续培养。培养4-5h后，弃去旧培养基，加入PBS清洗细胞，再加入含10wt％FBS的DMEM完全培养基，放入培养箱中进行培养。
优选的，前述的γδT细胞的制备方法，步骤S22中，所述重组慢病毒的超速离心浓缩方法为：
S22-1)培养48小时后收取培养上清作为病毒原液，并将收集到的病毒原液过滤到离心管中；
S22-2)4℃，100000-150000g超速离心2-3小时，弃上清液，向沉淀中加入DMEM完全培养基重选病毒颗粒，得到表达okt3、D64、D86和137L4个基因的慢病毒颗粒。
优选的，前述的γδT细胞的制备方法，步骤S4中，所述获取脐血的白膜层细胞的制备方法为：
S41，在50毫升的离心管中加入20-25毫升的淋巴细胞分离液；
S42，向离心管中加入30-32毫升的脐血；
S43，室温2000-2500转/分钟快升慢降离心20-25分钟；
S44，将白膜层细胞转移到一个新的离心管中，用生理盐水补充到50毫升，1800-2000转/分钟快升快降离心8-10分钟；
S45，弃去上清，用1毫升生理盐水将细胞悬起，再用生理盐水补充到50毫升，以1200-1500转/分钟快升快降离心8-10分钟，即获得脐血白膜层细胞。
优选的，前述的γδT细胞的制备方法，步骤S5中，所述脐血γδT细胞的体外扩增方法为：
S51，脐血γδT细胞的第一轮扩增：
给白膜层细胞计数，用含有200IU/ml浓度IL2的X-VIVO无血清培养基将细胞密度调整为2-2.5million/ml，然后加入选择性扩增γδT细胞的试剂放入T75的培养瓶中进行培养，第4天添加一半体积的含有IL2、Zolmeta和GGPP的X-VIVO培养基，一直培养到第7天；
S52，脐血γδT细胞的第二轮扩增：
培养到第7天，给细胞计数，用含有IL2、选择性扩增γδT细胞的试剂的X-VIVO培养基将细胞密度调整为1-1.5million/ml，放在相应的培养瓶中继续进行培养7天，期间添加1倍体积的培养基。
S53，脐血γδT细胞的滋养细胞共培养扩增：
将上述步骤培养14天后的γδT细胞计数，然后加入经过100Gy剂量γ射线照射的K562-okt3-CD64-CD86-4.1BBL滋养细胞细胞进行共培养，K562和T细胞数目的比例为2：1，用含有IL2和Zolmeta(Zoledronic acid)的X-VIVO培养基将细胞密度调整为2-2.5million/ml；以后继续培养10天，期间添加1倍体积的含有200IU/ml浓度的IL2和5μMZolmeta的X-VIVO培养基。
优选的，前述的γδT细胞的制备方法，步骤S51和S52中，所述脐血γδT细胞的第一轮扩增和所述脐血γδT细胞的第二轮扩增所用的选择性扩增γδT细胞的试剂选自Zometa和GGPP中的至少一种。
优选的，前述的γδT细胞的制备方法，步骤S51中的所述Zometa的终浓度为5-6μM，所述GGPP的终浓度为10-12μM，以更好地促进γδT细胞的体外扩增。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。
依据本发明提出的一种脐血γδT细胞，所述脐血γδT细胞中Vγ9Vδ2T细胞的阳性比例在90％以上。
优选的，前述的NK细胞，所述NK细胞是通过上述方法制得的。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点：
本发明所提供的滋养细胞，其可先利用Zolmeta选择性地扩增Vγ9Vδ2T细胞，然后再利用表达okt3、CD64、CD86和CD137L这4个基因的K562细胞作为滋养细胞大量非选择性地扩增Vγ9Vδ2T细胞，该滋养细胞能有效地激活T细胞信号通路1(okt3-CD3)以及共刺激信号通路(CD86-CD28)和(CD137L-CD137)，从而实现Vγ9Vδ2T细胞的大量增殖。
本发明提供的滋养细胞，其利用表达okt3、CD64、CD86和CD137L这4个基因的K562细胞作为滋养细胞大量非选择性地扩增Vγ9Vδ2T细胞，从而简化了培养、扩增Vγ9Vδ2T细胞的操作，大大降低了成本。
本发明提供的滋养细胞，其利用表达okt3、CD64、CD86和CD137L这4个基因的K562细胞作为滋养细胞大量非选择性地扩增Vγ9Vδ2T细胞，可以使Vγ9Vδ2T细胞在经过一个24天的扩增周期后，扩增倍数达到10000倍，制得的Vγ9Vδ2T细胞的纯度可达到90％以上。
本发明提供的滋养细胞，其利用Zolmeta能够提高细胞内的IPP(异戊基焦磷酸)水平，进而促进Vγ9Vδ2T细胞的增殖；而利用GGPP(geranylgeranyl Pyrophosphate)则能降低Zolmeta对T细胞的毒性，非常有利于γδT细胞的体外扩增。
本发明提供的滋养细胞，其为获得高纯度、高扩增倍数的Vγ9Vδ2T细胞奠定了良好的实践基础。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。
附图说明
图1为本发明的pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL的质粒载体图谱；
图2为本发明的经过一个24天扩增周期后的脐血Vγ9Vδ2T细胞流式检测图；
图3为本发明的K562-okt3-CD64-CD86-4.1BBL工程细胞对okt3、CD64、CD86、4.1BBL的流式表达检测图；
图4为本发明的滋养细胞K562-okt3-CD64-CD86-4.1BBL和现有技术的滋养细胞K562-CD64-CD86-4.1BBL分别加上可溶okt3抗体刺激脐血Vγ9Vδ2T细胞一个24天周期的对比增殖曲线图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合较佳实施例，对依据本发明提出的一种滋养细胞、其制备方法及其在大量快速扩增γδT细胞中的应用其具体实施方式、特征及其性能，详细说明如后。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，一或多个实施例中的特定特征、结构或特点可由任何合适形式组合。
下面以具体的实施例对本发明做进一步说明，但不作为本发明的限定。
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法；下述实施例中的材料或试剂，如无特别说明，均为市购。
实施例1
pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL慢病毒质粒载体的构建
在NCBI等网站查询得到okt3(如SEQ IDNO:1所示)、CD64(如SEQ IDNO:2所示)、CD86(如SEQ IDNO:3所示)、4.1BBL(如SEQ IDNO:4所示)的全基因编码序列；
通过基因合成的方法合成okt3-E2A-CD64-P2A-CD86-F2A-4.1BBL-T2A-Puro基因，并在其两侧合成上XbaI和SalI两个酶切位点，编码区避免出现这两个酶切位点；
将上述合成的基因用XbaI和SalI两个酶进行双酶切，再通过T4 DNA连接酶连接到慢病毒载体pLenti-mbIL21-4.1BBL(中科院遗传发育所赠送)上，得到pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL(如SEQ IDNO:5所示)，如图1所示。
将连接产物转化到E.coli(DH5α)细胞里，通过PCR鉴定出阳性的克隆，然后送到苏州泓迅生物技术公司进行测序验证；
将验证正确的阳性克隆用Qiagen的质粒大提试剂盒进行大提质粒。
实施例2
重组慢病毒的包装制备
1.每10cm细胞培养皿中加入4.5million的293FT细胞和9毫升DMEM完全培养基，混合混匀，在细胞培养箱中进行培养(37℃，5％(v/v)CO2)；
2.培养第2天，每个培养皿中加入如下试剂：500μL jetPRIME buffer、6μgpLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL或者pLenti-CD64-CD86-4.1BBL质粒载体、3μg psPAX2和1.5μg pMD2.G，混合均匀，然后再向体系中加入jetPRIME，25μL/10cm培养皿，再次混合均匀，室温静置10min，得到混合液；
3.将用于包装病毒的293FT细胞从培养箱中取出，将混合液平均加到每个培养皿中，混匀，放入培养箱中继续培养(37℃，5％(v/v)CO2)。培养4h后，弃去旧培养基，加入PBS清洗细胞，再加入含10wt％FBS的DMEM完全培养基，放入培养箱中进行培养(37℃，5％(v/v)CO2)；
4.培养48小时后收取培养上清作为病毒原液，并将收集到的病毒原液过滤到离心管中；
5.4℃，100000g超速离心2小时，弃上清液，向沉淀中加入300到500微升的DMEM完全培养基重选病毒颗粒，得到表达okt3、D64、D86和137L 4个基因的慢病毒颗粒。
实施例3
K562-okt3-CD64-CD86-4.1BBL滋养细胞的制备
将1million的旺盛生长的K562细胞放入24孔板中的一个孔进行培养，培养基为1毫升含有10％FBS的1640；
再将上述30毫升的病毒上清液超速离心浓缩的300μL慢病毒颗粒加入孔中，培养(37℃，5％(v/v)CO2)5天后，再用3μg/ml的Puromycin进行选择性培养；
用流式检测okt3、D64、D86和4.1BBL这4个基因在K562细胞的表达，使各个基因的表达在80％以上(见图3)；
再用100Gy的γ射线进行照射10分钟，照射后于-80℃冰箱中进行分支冻存，用于以后的γδT细胞培养实验。
实施例4
获取脐血的白膜层细胞
在50毫升的离心管中加入20毫升的淋巴细胞分离液；
向离心管中缓缓加入30毫升的外周血；
室温2000转/分钟快升慢降离心20分钟；
将白膜层细胞转移到一个新的离心管中，用生理盐水补充到50毫升，1800转/分钟快升快降离心8分钟；
弃去上清，用1ml生理盐水将细胞悬起，再用生理盐水补充到50毫升，1200转/分钟快升快降离心8分钟，即获得脐血白膜层细胞。
实施例5
脐血γδT细胞的体外扩增
给白膜层细胞计数，用含有200IU/ml IL2的X-VIVO无血清培养基将细胞密度调整为2million/ml，然后加入终浓度为5μM的Zolmeta和10μM的GGPP(geranylgeranylPyrophosphate)放入T75的培养瓶中进行培养(37℃，5％(v/v)CO2)，第4天添加一半体积的含有IL2、Zolmeta和GGPP的X-VIVO培养基，一直培养到第7天；
培养到第7天，给细胞计数，用含有IL2、Zolmeta和GGPP的X-VIVO培养基将细胞密度调整为1million/ml，放在相应的培养瓶中继续进行培养(37℃，5％(v/v)CO2)7天，期间添加原有培养基体积的一倍的培养基。
给上述步骤培养14天后的γδT细胞计数，然后加入实施例3经过100Gy剂量γ射线照射的K562-okt3-CD64-CD86-4.1BBL或K562-CD64-CD86-4.1BBL滋养细胞细胞进行共培养，K562和T细胞数目的比例为2：1，对于滋养细胞K562-okt3-CD64-CD86-4.1BBL用含有IL2和Zolmeta的X-VIVO培养基将细胞密度调整为2million/ml，而对于滋养细胞K562-CD64-CD86-4.1BBL，培养基用用含有IL2、Zolmeta和60ng/ml okt3的X-VIVO培养基将细胞密度调整为2million/mll。以后继续培养10天(37℃，5％(v/v)CO2)，期间添加原有培养基体积的一倍的相对应的培养基。
检测Vγ9Vδ2T细胞培养24天后的增殖数
取培养24天期间的脐血Vγ9Vδ2T细胞，计数制作Vγ9Vδ2T细胞增殖曲线图，见图4，从图4中可以看出，用K562-okt3-CD64-CD86-4.1BBL滋养细胞扩增的Vγ9Vδ2T细胞增殖了10000倍左右，而用K562-CD64-CD86-4.1BBL滋养细胞加可溶的okt3抗体的Vγ9Vδ2T细胞增殖了不到5000倍，这说明用细胞膜结合的okt3比可溶的okt3能更好地扩增Vγ9Vδ2T细胞，前者的扩增倍数是后者的两倍以上，这可能是由于固定化的抗体更有助于激活T细胞进行增殖。
检测Vγ9Vδ2T细胞增殖后的阳性率
取培养24天后的Vγ9Vδ2T细胞，稀释细胞密度为1million/ml，样本用CD3-APC，Vδ2-FITC双色共染，然后经过流式细胞仪检测，用K562-okt3-CD64-CD86-4.1BBL滋养细胞扩增的Vγ9Vδ2T细胞结果显示CD3+Vδ2+双阳性细胞比率达到90.2％(见图2)，而用K562-CD64-CD86-4.1BBL滋养细胞加可溶的okt3抗体的Vγ9Vδ2T细胞CD3+Vδ2+双阳性细胞比率也可达到90％左右。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 秦皇岛中邦干细胞医学科技有限公司
<120> 一种滋养细胞、其制备方法及其在大量快速扩增γδ T细胞中的应用
<130> P2010199
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1017
<212> DNA
<213> mice（小鼠）
<400> 1
atggcactgc ccgtgaccgc cctcctcctg cccctcgcgc tactcctgca cgccgccaga 60
ccccaggtgc agctgcagca gagtggcgct gagctggccc gccccggcgc ctccgtgaag 120
atgtcctgca aggctagtgg gtataccttc accaggtata ctatgcactg ggtgaagcag 180
cgtccggggc aggggctcga gtggatcggc tacatcaatc cctcccgcgg ctacaccaat 240
tacaaccaga agttcaagga taaggccacg ctgaccacag acaagagtag ctccacggcc 300
tacatgcagt tatcaagtct gacctctgag gactccgctg tgtactattg tgcgaggtac 360
tacgacgacc actactgtct ggactactgg ggccaaggca caaccctgac tgtaagttcc 420
tccggcggcg gggggtccgg cggcggcggc tccggcgggg ggggtagtat cgtgctgaca 480
cagagtcccg caatcatgtc cgcaagcccc ggagagaagg tgaccatgac gtgtagtgct 540
tccagctccg tgtcctatat gaactggtac cagcagaaat ccgggacttc ccccaagaga 600
tggatctacg acaccagtaa gctggccagt ggcgtgcctg cacacttccg cggcagtggc 660
tccggcacta gttacagtct caccatctcc gggatggaag ctgaggacgc cgctacctac 720
tactgccagc agtggagctc gaacccattc accttcggtt cggggaccaa gctcgagatc 780
aacagggcgg ccgccaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 840
gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 900
cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat atctacatct gggcgccctt ggccgggact 960
tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc accctttact gcaaacgggg cagaaag 1017
<210> 2
<211> 1125
<212> DNA
<213> Homo sapiens（人类）
<400> 2
atgtggttct tgacaactct gctcctttgg gttccagttg atgggcaagt ggtagacacc 60
acaaaggcag tgatcacttt gcagcctcca tgggtcagcg tgttccaaga ggaaaccgta 120
accttgcact gtgaggtgct ccatctgcct gggagcagct ctacacagtg gtttctcaat 180
ggcacagcca ctcagacctc gacccccagc tacagaatca cctctgccag tgtcaatgac 240
agtggtgaat acaggtgcca gagaggtctc tcagggcgaa gtgaccccat acagctggaa 300
atccacagag gctggctact actgcaggtc tccagcagag tcttcacgga aggagaacct 360
ctggccttga ggtgtcatgc gtggaaggat aagctggtgt acaatgtgct ttactatcga 420
aatggcaaag cctttaagtt tttccactgg aattctaacc tcaccattct gaaaaccaac 480
ataagtcaca atggcaccta ccattgctca ggcatgggaa agcatcgcta cacatcagca 540
ggaatatctg tcactgtgaa agagctattt ccagctccag tgctgaatgc atctgtgaca 600
tccccactcc tggaggggaa tctggtcacc ctgagctgtg aaacaaagtt gctcttgcag 660
aggcctggtt tgcagcttta cttctccttc tacatgggca gcaagaccct gcgaggcagg 720
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tgcgaggctg ccacagagga tggaaatgtc cttaagcgca gccctgagtt ggagcttcaa 840
gtgcttggcc tccagttacc aactcctgtc tggtttcatg tccttttcta tctggcagtg 900
ggaataatgt ttttagtgaa cactgttctc tgggtgacaa tacgtaaaga actgaaaaga 960
aagaaaaagt gggatttaga aatctctttg gattctggtc atgagaagaa ggtaatttcc 1020
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<211> 987
<212> DNA
<213> Homo sapiens（人类）
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atagtaccaa tttctaatat aacagaaaat gtgtacataa atttgacctg ctcatctata 480
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<210> 4
<211> 762
<212> DNA
<213> Homo sapiens（人类）
<400> 4
atggaatacg cctctgacgc ttcactggac cccgaagccc cgtggcctcc cgcgccccgc 60
gctcgcgcct gccgcgtact gccttgggcc ctggtcgcgg ggctgctgct gctgctgctg 120
ctcgctgccg cctgcgccgt cttcctcgcc tgcccctggg ccgtgtccgg ggctcgcgcc 180
tcgcccggct ccgcggccag cccgagactc cgcgagggtc ccgagctttc gcccgacgat 240
cccgccggcc tcttggacct gcggcagggc atgtttgcgc agctggtggc ccaaaatgtt 300
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ttgaccgtgg acctgccacc cgcctcctcc gaggctcgga actcggcctt cggtttccag 600
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acccccgaaa tcccagccgg actcccttca ccgaggtcgg aa 762
<210> 5
<211> 4725
<212> DNA
<213> Artificial sequence（人工序列）
<220>
<221> misc_feature
<223> 质粒载体
<400> 5
atggcactgc ccgtgaccgc cctcctcctg cccctcgcgc tactcctgca cgccgccaga 60
ccccaggtgc agctgcagca gagtggcgct gagctggccc gccccggcgc ctccgtgaag 120
atgtcctgca aggctagtgg gtataccttc accaggtata ctatgcactg ggtgaagcag 180
cgtccggggc aggggctcga gtggatcggc tacatcaatc cctcccgcgg ctacaccaat 240
tacaaccaga agttcaagga taaggccacg ctgaccacag acaagagtag ctccacggcc 300
tacatgcagt tatcaagtct gacctctgag gactccgctg tgtactattg tgcgaggtac 360
tacgacgacc actactgtct ggactactgg ggccaaggca caaccctgac tgtaagttcc 420
tccggcggcg gggggtccgg cggcggcggc tccggcgggg ggggtagtat cgtgctgaca 480
cagagtcccg caatcatgtc cgcaagcccc ggagagaagg tgaccatgac gtgtagtgct 540
tccagctccg tgtcctatat gaactggtac cagcagaaat ccgggacttc ccccaagaga 600
tggatctacg acaccagtaa gctggccagt ggcgtgcctg cacacttccg cggcagtggc 660
tccggcacta gttacagtct caccatctcc gggatggaag ctgaggacgc cgctacctac 720
tactgccagc agtggagctc gaacccattc accttcggtt cggggaccaa gctcgagatc 780
aacagggcgg ccgccaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 840
gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 900
cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat atctacatct gggcgccctt ggccgggact 960
tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc accctttact gcaaacgggg cagaaagcaa 1020
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aaggcagtga tcactttgca gcctccatgg gtcagcgtgt tccaagagga aaccgtaacc 1200
ttgcactgtg aggtgctcca tctgcctggg agcagctcta cacagtggtt tctcaatggc 1260
acagccactc agacctcgac ccccagctac agaatcacct ctgccagtgt caatgacagt 1320
ggtgaataca ggtgccagag aggtctctca gggcgaagtg accccataca gctggaaatc 1380
cacagaggct ggctactact gcaggtctcc agcagagtct tcacggaagg agaacctctg 1440
gccttgaggt gtcatgcgtg gaaggataag ctggtgtaca atgtgcttta ctatcgaaat 1500
ggcaaagcct ttaagttttt ccactggaat tctaacctca ccattctgaa aaccaacata 1560
agtcacaatg gcacctacca ttgctcaggc atgggaaagc atcgctacac atcagcagga 1620
atatctgtca ctgtgaaaga gctatttcca gctccagtgc tgaatgcatc tgtgacatcc 1680
ccactcctgg aggggaatct ggtcaccctg agctgtgaaa caaagttgct cttgcagagg 1740
cctggtttgc agctttactt ctccttctac atgggcagca agaccctgcg aggcaggaac 1800
acatcctctg aataccaaat actaactgct agaagagaag actctgggtt atactggtgc 1860
gaggctgcca cagaggatgg aaatgtcctt aagcgcagcc ctgagttgga gcttcaagtg 1920
cttggcctcc agttaccaac tcctgtctgg tttcatgtcc ttttctatct ggcagtggga 1980
ataatgtttt tagtgaacac tgttctctgg gtgacaatac gtaaagaact gaaaagaaag 2040
aaaaagtggg atttagaaat ctctttggat tctggtcatg agaagaaggt aatttccagc 2100
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ggactgagta acattctctt tgtgatggcc ttcctgctct ctggtgctgc tcctctgaag 2340
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ttatcttcac ctttctctat agagcttgag gaccctcagc ctcccccaga ccacattcct 3000
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gagagggaag agagtgaaca gaccaagaaa agagaaaaaa tccatatacc tgaaagatct 3180
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tgttttgtga aacagacttt gaattttgac cttctcaagt tggcgggaga cgtggagtcc 3300
aacccagggc ccatggaata cgcctctgac gcttcactgg accccgaagc cccgtggcct 3360
cccgcgcccc gcgctcgcgc ctgccgcgta ctgccttggg ccctggtcgc ggggctgctg 3420
ctgctgctgc tgctcgctgc cgcctgcgcc gtcttcctcg cctgcccctg ggccgtgtcc 3480
ggggctcgcg cctcgcccgg ctccgcggcc agcccgagac tccgcgaggg tcccgagctt 3540
tcgcccgacg atcccgccgg cctcttggac ctgcggcagg gcatgtttgc gcagctggtg 3600
gcccaaaatg ttctgctgat cgatgggccc ctgagctggt acagtgaccc aggcctggca 3660
ggcgtgtccc tgacgggggg cctgagctac aaagaggaca cgaaggagct ggtggtggcc 3720
aaggctggag tctactatgt cttctttcaa ctagagctgc ggcgcgtggt ggccggcgag 3780
ggctcaggct ccgtttcact tgcgctgcac ctgcagccac tgcgctctgc tgctggggcc 3840
gccgccctgg ctttgaccgt ggacctgcca cccgcctcct ccgaggctcg gaactcggcc 3900
ttcggtttcc agggccgctt gctgcacctg agtgccggcc agcgcctggg cgtccatctt 3960
cacactgagg ccagggcacg ccatgcctgg cagcttaccc agggcgccac agtcttggga 4020
ctcttccggg tgacccccga aatcccagcc ggactccctt caccgaggtc ggaagagggc 4080
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aaaccaactg ttcgcctggc aactcgtgat gatgttccac gtgcagttcg cactctggct 4200
gctgcatttg ctgactaccc tgcaacccgt cacactgtgg acccagaccg ccacattgaa 4260
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tgggtggcag atgatggtgc tgctgtggca gtgtggacca cccctgaatc tgttgaagct 4380
ggtgcagtgt ttgctgagat tggcccacgc atggcagaac tgtctggcag ccgcctggca 4440
gcacaacagc agatggaagg tctgctggca ccacaccgcc caaaagaacc tgcttggttc 4500
ctggcaactg tgggtgtgag ccctgaccac cagggtaagg gcctgggctc tgcagtggtg 4560
ctgcctggtg tggaagcagc tgaacgtgca ggtgtgcctg ctttcctgga gacctcagct 4620
ccacgcaacc tgcctttcta tgaacgcctg ggcttcactg tgactgctga tgtggaagtg 4680
ccagaaggcc cacgcacttg gtgcatgact cgcaaaccag gtgct 4725
Claims (12)
1.一种pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL慢病毒质粒载体，其特征在于，所述pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL慢病毒质粒载体包括如SEQ ID NO:5所示的整个编码区序列okt3-E2A-CD64-P2A-CD86-F2A-4.1BBL-T2A-Puro。
2.一种权利要求1所述的pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL慢病毒质粒载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S11,利用基因合成的方法，获得okt3-E2A-CD64-P2A-CD86-F2A-4.1BBL-T2A-Puro基因的全长编码区序列；
S12,将okt3-E2A-CD64-P2A-CD86-F2A-4.1BBL-T2A-Puro基因构建到慢病毒载体pLenti-mbIL21-4.1BBL上，得到质粒载体pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL。
3.一种K562-okt3-CD64-CD86-4.1BBL滋养细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S31，将1-2million的旺盛生长的K562细胞放入24孔板中的一个孔进行培养，培养基为1毫升含有10wt％FBS的1640；
S32，再将30-35毫升病毒上清液超速离心浓缩的300μL慢病毒颗粒加入孔中，培养5-6天后，再用2-4μg/ml的Puromycin进行选择性培养；
S33，用流式检测okt3、D64、D86和4.1BBL这4个基因在K562细胞的表达，使各个基因的表达在80％以上；
S34，再用100Gy的γ射线照射10分钟，-80℃冰箱进行冻存。
4.一种K562-okt3-CD64-CD86-4.1BBL滋养细胞，其特征在于，所述滋养细胞是通过权利要求3所述的方法制备得到的。
5.一种γδT细胞的制备方法，特征在于，包括以下步骤：将权利要求1所述的质粒载体包装慢病毒颗粒后，再将所述慢病毒颗粒侵染滋养细胞系，获得能够表达目的基因的滋养细胞，再利用滋养细胞在体外大量扩增γδT细胞。
6.如权利要求5所述的γδT细胞的制备方法，其特征在于，所述目的基因包括okt3、CD64、CD86和4.1BBL中的至少一种；所述滋养细胞系包括肿瘤细胞；所述γδT细胞为脐血γδT细胞或外周血γδT细胞。
7.如权利要求5或6所述的γδT细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL慢病毒质粒载体的构建：
S2，用pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL质粒载体包装慢病毒颗粒；
S3，K562-okt3-CD64-CD86-4.1BBL滋养细胞的制备；
S4，获取脐血的白膜层细胞；
S5，脐血γδT细胞的体外扩增。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤S2具体包括：
S21，重组慢病毒的包装制备；
S22，重组慢病毒的超速离心浓缩。
9.如权利要求8所述的γδT细胞的制备方法，其特征在于，
步骤S21中，所述重组慢病毒的包装制备方法为：
S21-1)每10cm细胞培养皿中加入4.0-4.5million的293FT细胞和8-9毫升DMEM完全培养基，混合混匀，在细胞培养箱中进行培养；
S21-2)培养第2天，每个培养皿中加入如下试剂：450-500μL jetPRIME buffer、5-6μgpLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL慢病毒质粒载体或者pLenti-CD64-CD86-4.1BBL、3-4μgpsPAX2和1.5-1.8μg pMD2.G，混合均匀，然后再向体系中加入jetPRIME，25μL/10cm培养皿，再次混合均匀，室温静置8-10min，得到混合液；
S21-3)将用于包装病毒的293FT细胞从培养箱中取出，将混合液平均加到每个培养皿中，混匀，放入培养箱中继续培养；培养4-5h后，弃去旧培养基，加入PBS清洗细胞，再加入含10wt％FBS的DMEM完全培养基，放入培养箱中进行培养。
步骤S22中，所述重组慢病毒的超速离心浓缩方法为：
S22-1)培养48小时后收取培养上清作为病毒原液，并将收集到的病毒原液过滤到离心管中；
S22-2)4℃，100000-150000g超速离心2-3小时，弃上清液，向沉淀中加入DMEM完全培养基重选病毒颗粒，得到表达okt3、D64、D86和137L4个基因的慢病毒颗粒。
10.如权利要求7所述的γδT细胞的制备方法，其特征在于，
步骤S4中，所述获取脐血的白膜层细胞的制备方法为：
S41，在50毫升的离心管中加入20-25毫升的淋巴细胞分离液；
S42，向离心管中加入30-32毫升的脐血；
S43，室温2000-2500转/分钟快升慢降离心20-25分钟；
S44，将白膜层细胞转移到一个新的离心管中，用生理盐水补充到50毫升，1800-2000转/分钟快升快降离心8-10分钟；
S45，弃去上清，用1毫升生理盐水将细胞悬起，再用生理盐水补充到50毫升，以1200-1500转/分钟快升快降离心8-10分钟，即获得脐血白膜层细胞；
步骤S5中，所述脐血γδT细胞的体外扩增方法为：
S51，脐血γδT细胞的第一轮扩增：
给白膜层细胞计数，用含有200IU/ml浓度IL2的X-VIVO无血清培养基将细胞密度调整为2-2.5million/ml，然后加入选择性扩增γδT细胞的试剂放入T75的培养瓶中进行培养，第4天添加一半体积的含有IL2、Zolmeta和GGPP的X-VIVO培养基，一直培养到第7天；
S52，脐血γδT细胞的第二轮扩增：
培养到第7天，给细胞计数，用含有IL2、选择性扩增γδT细胞的试剂的X-VIVO培养基将细胞密度调整为1-1.5million/ml，放在相应的培养瓶中继续进行培养7天，期间添加1倍体积的培养基；
S53，脐血γδT细胞的滋养细胞共培养扩增：
将上述步骤培养14天后的γδT细胞计数，然后加入经过100Gy剂量γ射线照射的K562-okt3-CD64-CD86-4.1BBL滋养细胞细胞进行共培养，K562和T细胞数目的比例为2：1，用含有IL2和Zolmeta的X-VIVO培养基将细胞密度调整为2-2.5million/ml；以后继续培养10天，期间添加1倍体积的含有200IU/ml浓度的IL2和5μM Zolmeta的X-VIVO培养基。
11.如权利要求10所述的γδT细胞的制备方法，步骤S51和S52中，所述脐血γδT细胞的第一轮扩增和所述脐血γδT细胞的第二轮扩增所用的选择性扩增γδT细胞的试剂选自Zometa和GGPP中的至少一种；步骤S51中的所述Zometa的终浓度为5-6μM，所述GGPP的终浓度为10-12μM。
12.一种权利要求5-11任一项所述的方法制备的脐血γδT细胞，所述脐血γδT细胞中Vγ9Vδ2T细胞的阳性比例在90％以上。
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