CN117467707A - 靶向cd5和cd7的通用car-t及其应用 - Google Patents

靶向cd5和cd7的通用car-t及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117467707A
CN117467707A CN202210910113.XA CN202210910113A CN117467707A CN 117467707 A CN117467707 A CN 117467707A CN 202210910113 A CN202210910113 A CN 202210910113A CN 117467707 A CN117467707 A CN 117467707A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
gene
cells
sgrna
sgrnas
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210910113.XA
Other languages
English (en)
Inventor
胡广
谭涛超
张佳元
姚小敏
董文洁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Reindeer Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Shanghai Reindeer Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Reindeer Biotechnology Co ltd filed Critical Shanghai Reindeer Biotechnology Co ltd
Priority to CN202210910113.XA priority Critical patent/CN117467707A/zh
Priority to PCT/CN2023/109928 priority patent/WO2024022513A1/zh
Publication of CN117467707A publication Critical patent/CN117467707A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001111—Immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001129—Molecules with a "CD" designation not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/867—Retroviral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A61K2039/804—Blood cells [leukemia, lymphoma]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本文提供了制备通用嵌合抗原受体T细胞(UCAR‑T)的方法，包括将T细胞敲除TRAC、B2M、CD5、CD7等基因后，转染该T细胞使其表达靶向肿瘤细胞的嵌合抗原受体(CAR)。本文还提供了用于进行基因敲除的优选sgRNA。本文提供的UCAR‑T可用癌症治疗。

Description

靶向CD5和CD7的通用CAR-T及其应用
技术领域
本文涉及制备通用嵌合抗原受体T细胞(UCAR-T)的方法。本文还涉及UCAR-T在癌症治疗方面的应用。
背景技术
相比自体CAR-T，通用CAR-T(universal CAR-T,简称UCAR-T)具有诸多优势，但同时也面临着诸多的挑战，其中最主要的两大难题是其一：由于异体细胞输注而导致的移植物抗宿主病GvHD，其二：UCAR-T在宿主体内被宿主免疫系统快速清除，而无法有效扩增。所以目前的UCAR-T主要围绕着解决这两个难题而设计。
目前，第一个难题已基本得到解决。研究人员通过基因编辑技术，敲除αβ-T细胞上编码T细胞表面受体(TCR)的TRAC基因1-3，有效抑制CAR-T细胞通过激活TCR对宿主细胞进行无差别的攻击，从而避免GvHD的发生。
相比之下，第二个问题更难解决。近年来研究者一直在探究如何使UCAR-T细胞在宿主体内进行有效扩增。目前主流的解决方案有两种：
(1)通过CD52单抗药物和通用CAR-T联合使用。应用CD52蛋白的单克隆抗体药Alemtuzumab和化疗药物清淋后，给患者输注TRAC/CD52双敲除的CAR-T细胞进行治疗。该方案中敲除TRAC预防移植物抗宿主病，敲除CD52预防清淋药物对UCAR-T的清除2。
(2)另一种为了降低宿主排斥移植物反应的策略，是敲除UCAR-T上的编码β2-微球蛋白的B2M基因3,4。破坏β2-微球蛋白(B2M敲除)可阻止功能性HLA-I类分子在CAR-T细胞表面表达。该方案通过破坏HLA-I类分子，避免了UCAR-T激活宿主体内的细胞毒性T细胞，从而使其获得长期增殖。然而，由于HLA是NK细胞的抑制性配体，它的缺失会激活患者NK细胞对CAR-T细胞进行清除，使其在体内的扩增受限，影响其有效性。
CD5和CD7是靶向T细胞恶性肿瘤治疗的两个有潜力的靶点5。许多T细胞恶性肿瘤表达CD7，大多数T-NHL和T-ALL高表达CD7，且除了T细胞恶性肿瘤，CD7在约24％的AML中表达，被认为是白血病干细胞的标记物，并在绝大多数自然杀伤细胞(NK)和NKT NHLs和白血病中表达6，这为T细胞癌的免疫治疗提供了一个有吸引力的靶点。
CD5是一种泛T细胞标记物，在大多数T细胞恶性肿瘤中普遍过表达，正常细胞CD5的表达仅限于胸腺细胞、外周T细胞和少量的B淋巴细胞亚群，称为B-1细胞。此外，CD5是T细胞受体(TCR)信号的负调节因子，并在保护自身免疫中发挥作用7。
在国内，目前已知以CD5和CD7为靶点进行产品开发的公司较少，其中有的产品为自体CD7-CAR-T，目前处于IND申报阶段；有的为通用CD7-CAR-T，分别处于IIT和I期临床实验阶段。目前还没有公司以CD5和CD7为靶点的双靶CAR-T开发的相关报道。
发明内容
在一方面，本文提供了制备通用嵌合抗原受体T细胞(UCAR-T)的方法，包括：
1)利用CRISPR基因编辑系统制备如下基因被敲除的T细胞：
i)TRAC基因和/或TRBC基因；
ii)CD5基因；
iii)CD7基因；以及
2)以包括嵌合抗原受体(CAR)的编码序列的核酸分子转染所述T细胞，使其表达所述CAR。
在一些实施方案中，在步骤1)中还包括敲除所述T细胞的B2M基因。
在一些实施方案中，对所述TRAC基因的敲除所使用的sgRNA的靶序列选自SEQ IDNO：1-7所示序列及其任意组合。
在一些实施方案中，对所述B2M基因的敲除所使用的sgRNA的靶序列选自SEQ IDNO：8、9、11、12所示序列及其任意组合。
在一些实施方案中，对所述B2M基因的敲除使用两种sgRNA的组合，所述两种sgRNA的靶序列分别为SEQ ID NO：9和11所示序列。
在一些实施方案中，在步骤1)中将用于所述TRAC基因敲除和用于所述B2M基因敲除的sgRNA与Cas9蛋白混合后同时进行所述T细胞中所述TRAC基因和所述B2M基因的敲除，并且用于所述TRAC基因敲除的sgRNA的靶序列为SEQ ID NO：7所示序列。
在一些实施方案中，用于敲除所述CD5基因的sgRNA的靶序列选自SEQ ID NO：13、14、16、17、18、19所示序列及其任意组合。
在一些实施方案中，用于所述CD7基因敲除的sgRNA的靶序列为SEQ ID NO：20所示序列。
在一些实施方案中，对所述TRAC基因、所述CD5基因和所述CD7基因的敲除同时进行，用于敲除所述TRAC基因的sgRNA的靶序列为SEQ ID NO：7所示序列；用于敲除所述CD5基因的sgRNA的靶序列为SEQ ID NO：13所示序列；以及用于敲除所述CD7基因的sgRNA的靶序列为SEQ ID NO：20所示序列。
在一些实施方案中，对所述TRAC基因、所述B2M基因、所述CD5基因和所述CD7基因的敲除同时进行，用于敲除所述TRAC基因的sgRNA的靶序列为SEQ ID NO：7所示序列；用于敲除所述B2M基因的两种sgRNA的靶序列分别为SEQ ID NO：9和11所示系列；用于敲除所述CD5基因的sgRNA的靶序列为SEQ ID NO：13所示序列；以及用于敲除所述CD7基因的sgRNA的靶序列为SEQ ID NO：20所示序列。
在一些实施方案中，对所述TRAC基因、所述CD5基因和所述CD7基因的敲除同时进行，用于进行所述敲除的组分按比例在20μL体系中包括：
不少于30pmol的Cas9和不少于45pmol的靶向SEQ ID NO：7所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；
不少于40pmol的Cas9和不少于120pmol的靶向SEQ ID NO：13所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；以及
不少于40pmol的Cas9和不少于120pmol的靶向SEQ ID NO：20所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物。
在一些实施方案中，对所述TRAC基因、所述B2M基因、所述CD5基因和所述CD7基因的敲除同时进行，用于进行所述敲除的组分按比例在20μL体系中包括：
不少于30pmol的Cas9和不少于45pmol的靶向SEQ ID NO：7所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；
不少于20pmol的Cas9和不少于30pmol的靶向SEQ ID NO：9所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；
不少于20pmol的Cas9和不少于30pmol的靶向SEQ ID NO：11所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；
不少于40pmol的Cas9和不少于120pmol的靶向SEQ ID NO：13所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；以及
不少于40pmol的Cas9和不少于120pmol的靶向SEQ ID NO：20所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物。
在一些实施方案中，对所述TRAC基因、所述CD5基因和所述CD7基因的敲除同时进行，用于进行所述敲除的组分按比例在20μL体系中包括：
30pmol的Cas9和45pmol的靶向SEQ ID NO：7所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；
80pmol的Cas9和150pmol的靶向SEQ ID NO：13所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；以及
40pmol的Cas9和120pmol的靶向SEQ ID NO：20所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物。
在一些实施方案中，对所述TRAC基因、所述B2M基因、所述CD5基因和所述CD7基因的敲除同时进行，用于进行所述敲除的组分按比例在20μL体系中包括：
30pmol的Cas9和45pmol的靶向SEQ ID NO：7所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；
20pmol的Cas9和30pmol的靶向SEQ ID NO：9所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；
20pmol的Cas9和30pmol的靶向SEQ ID NO：11所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；
80pmol的Cas9和150pmol的靶向SEQ ID NO：13所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；以及
40pmol的Cas9和120pmol的靶向SEQ ID NO：20所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物。
在一些实施方案中，在步骤1)中还包括敲除所述T细胞的CIITA基因。
在一些实施方案中，用于所述CIITA基因敲除的sgRNA的靶序列为SEQ ID NO：25所示序列。
在一些实施方案中，对所述TRAC基因、所述B2M基因、所述CD5基因、所述CD7基因和所述CIITA基因的敲除同时进行，用于进行所述敲除的组分按比例在20μL体系中包括：
不少于30pmol的Cas9和不少于45pmol的靶向SEQ ID NO：7所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；
不少于20pmol的Cas9和不少于30pmol的靶向SEQ ID NO：9所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；
不少于20pmol的Cas9和不少于30pmol的靶向SEQ ID NO：11所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；
不少于80pmol的Cas9和不少于150pmol的靶向SEQ ID NO：13所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；
不少于40pmol的Cas9和不少于120pmol的靶向SEQ ID NO：20所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；以及
不少于40pmol的Cas9和不少于60pmol的靶向SEQ ID NO：25所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物。
在一些实施方案中，对所述TRAC基因、所述B2M基因、所述CD5基因、所述CD7基因和所述CIITA基因的敲除同时进行，用于进行所述敲除的组分按比例在20μL体系中包括：
30pmol的Cas9和45pmol的靶向SEQ ID NO：7所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；
25pmol的Cas9和40pmol的靶向SEQ ID NO：9所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；
25pmol的Cas9和40pmol的靶向SEQ ID NO：11所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；
80pmol的Cas9和150pmol的靶向SEQ ID NO：13所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；
40pmol的Cas9和120pmol的靶向SEQ ID NO：20所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；以及
50pmol的Cas9和80pmol的靶向SEQ ID NO：25所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物。
另一方面，本文提供了制备通用嵌合抗原受体T细胞(UCAR-T)的方法，包括：
1)利用使用胞嘧啶碱基编辑器制备如下基因被敲除的T细胞：
i)TRAC基因和/或TRBC基因；
ii)CD5基因；
iii)CD7基因；以及
2)以包括嵌合抗原受体(CAR)的编码序列的核酸分子转染所述T细胞，使其表达嵌合抗原受体(CAR)。
在一些实施方案中，在步骤1)中还包括敲除所述T细胞的B2M基因。
在一些实施方案中，在步骤1)中还包括敲除所述T细胞的CIITA基因。
在一些实施方案中，对所述TRAC基因的敲除所使用的sgRNA的靶序列为SEQ IDNO：26所示序列。
在一些实施方案中，对所述TRBC基因的敲除所使用的sgRNA的靶序列选自SEQ IDNO：27-31任一项所示序列及其任意组合。
在一些实施方案中，对所述B2M基因的敲除所使用的sgRNA的靶序列选自SEQ IDNO：33和34所示序列及其组合。
在一些实施方案中，对所述B2M基因的敲除使用两种sgRNA，其中所述两种sgRNA的靶序列分别为SEQ ID NO：8和9所示序列。
在一些实施方案中，用于敲除所述CD5基因的sgRNA的靶序列选自SEQ ID NO：37、39、41-46任一项所示序列及其任意组合。
在一些实施方案中，用于所述CD7基因敲除的sgRNA的靶序列为SEQ ID NO：47所示序列。
在一些实施方案中，用于所述CIITA基因敲除的sgRNA的靶序列选自SEQ ID NO：50、51、54、57任一项所示序列及其任意组合。
在一些实施方案中，所述胞嘧啶碱基编辑器为nCBE3或nCBE4蛋白。
在一些实施方案中，在以CD2/CD3/CD28抗原激活所述T细胞之前对所述TRAC基因、所述B2M基因、所述CD5基因、所述CD7基因和/或所述CIITA基因进行敲除。
在一些实施方案中，所述CAR的胞外抗原结合结构域包括第一抗原结合部分和第二抗原结合部分，所述第一抗原结合部分能够特异性结合CD7，所述第二抗原结合部分能够特异性结合CD5。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分包括来自抗CD7单域抗体的重链可变区，所述重链可变区的HCDR1包括SEQ ID NO：59所示氨基酸序列、HCDR2包括SEQ ID NO：60所示氨基酸序列以及HCDR3包括SEQ ID NO：61所示氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分包括来自抗CD5单域抗体的重链可变区，所述重链可变区的HCDR1包括SEQ ID NO：63所示氨基酸序列、HCDR2包括SEQ ID NO：64所示氨基酸序列以及HCDR3包括SEQ ID NO：65所示氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分包括SEQ ID NO：62所示氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分包括SEQ ID NO：66所示氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述CAR的胞外抗原结合结构域包括SEQ ID NO：74所示氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述CAR从氨基端到羧基端依次包括所述第一抗原结合部分、连接片段、所述第二抗原结合部分、铰链区、跨膜区、胞内共刺激结构域和胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，所述连接片段包括SEQ ID NO：67所示氨基酸序列；所述铰链区包括SEQ ID NO：68所示氨基酸序列；所述跨膜区包括SEQ ID NO：69所示氨基酸序列；所述胞内共刺激结构域包括SEQ ID NO：70所示氨基酸序列；所述胞内信号传导结构域包括SEQ ID NO：71所示氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述核酸分子中还包括tEGFR或单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)的编码序列。
在一些实施方案中，所述核酸分子中的所述tEGFR或HSV-TK的编码序列的通过自剪切肽的编码序列连接在所述CAR的编码序列的下游。
在一些实施方案中，所述自剪切肽为T2A，其氨基酸序列优选为SEQ ID NO：72所示。
在一些实施方案中，还包括在步骤2)后筛选出不表达TCR和MHC-I类分子的T细胞。
在一些实施方案中，所述T细胞含有NKT细胞，例如10-20％数量比例的NKT细胞。
另一方面，本文提供了通过上述方法制备的UCAR-T细胞。
另一方面，本文提供了药物组合物，其包括上述UCAR-T细胞和药学上可接受的载体。
另一方面，本文提供了上述UCAR-T细胞在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
在一些实施方案中，所述癌症在其细胞表面表达CD5和/或CD7。
在一些实施方案中，所述癌症为T细胞恶性肿瘤，如急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)和T细胞淋巴瘤。
另一方面，本文提供了在受试者中治疗癌症的方法，包括以治疗有效量的上述UCAR-T细胞或药物组合物向所述受试者给药。
在一些实施方案中，所述癌症在其细胞表面表达CD5和/或CD7。
在一些实施方案中，所述癌症为T细胞恶性肿瘤，如急性T淋巴细胞白血病和T细胞淋巴瘤。
在一些实施方案中，所述方法还包括治疗后以更昔洛韦(GCV)向所述受试者给药。
另一方面，本文提供了药物试剂盒，包括：1)上述UCAR-T细胞或药物组合物；以及2)GCV。
附图说明
图1.CD5-CD7通用CAR-T的设计示意图。
图2.CD5-CD7双特异性CAR结构示意图。
图3.通过小分子药物控制的CAR-T安全开关分子种类(来自参考文献8)。
图4.TRAC基因候选sgRNA信息以及敲除效率、脱靶测试结果。(A)发明人通过CRISPick、CRISPOR和IDT网站对TRAC基因进行敲除sgRNA设计并经过筛选后得到的候选sgRNA信息。根据前期经验，网站预测的sgRNA编辑效率不是特别准，因此在筛选候选sgRNA时，发明人主要看网站预测的脱靶信息，而在CRISPick、CRISPOR和IDT三个网站中，CRISPick对sgRNA脱靶的计算是最精密的，因此发明人主要根据CRISPick的脱靶排名来选择sgRNA，排名越靠前，则脱靶概率越低。(B)TRAC候选sgRNA敲除效率测试的FACS结果图。横坐标代表细胞的TCR表达情况，纵坐标代表细胞的大小；每一列代表一种sgRNA，每一行代表一种RNP浓度。(C-E)候选sgRNA A-XL,A-02,A-06的脱靶测试结果。每一幅图的第一行是sgRNA的序列信息，第二行是在靶的reads数，第三行起是可能的脱靶位点的序列信息以及reads数。A-XL这条sgRNA测试了两次，分别标注为R1和R2，A-02和A-06各测试了一次。最高脱靶比例＝(出现次数最多的位点的reads数/在靶位点的reads数)*100％。
图5.B2M基因候选sgRNA信息以及敲除效率测试结果。(A)发明人通过CRISPick、CRISPOR、IDT、CHOPCHOP和GUIDES网站对B2M基因进行敲除sgRNA设计并经过筛选后得到的候选sgRNA信息。最终的sgRNA是综合几个网站的在靶和脱靶信息而选择得出，排名数字越小越好，得分越高越好。(B)B2M候选sgRNA敲除效率测试的FACS结果图。横坐标代表细胞的B2M表达情况，纵坐标代表细胞的大小，MOCK-T组代表细胞未使用sgRNA。
图6.B2M和TRAC基因双敲测试结果及B2M-sgRNA的脱靶检测结果。(A)B2M的5条候选sgRNA与TRAC sgRNA(A-XL)一起共敲除的FACS结果图。横坐标代表细胞的B2M表达情况，纵坐标代表细胞的TCR表达情况；双基因阳性的细胞位于四象限的右上象限，双基因阴性的细胞位于四象限的左下象限；因此，位于左下象限的细胞占比越高，代表双基因同时敲除的细胞越多。(B)测试不同的B2M sgRNA与TRAC sgRNA一起在不同RNP浓度下的共敲除效率的FACS结果图。横坐标代表细胞的B2M表达情况，纵坐标代表细胞的TCR表达情况，每一列代表一种B2M sgRNA，每一行代表一种RNP浓度。(C)B-13sgRNA的两次脱靶测试结果，分别为R1和R2。(D)B-03sgRNA的两次脱靶测试结果，分别为R1和R2。
图7.CD5基因候选sgRNA信息和基因敲除结果。(A)第一次测试的CD5 sgRNA的序列信息。(B)第一次测试中CD5 sgRNA的敲除效率测试的FACS结果图。横坐标代表细胞的CD5表达情况，纵坐标代表细胞的大小，其中sgRNA1和sgRNA3对应C图中的C-01和C-03。(C)发明人第二次通过CRISPick、CRISPOR、IDT、CHOPCHOP和GUIDES网站对CD5基因进行敲除sgRNA设计并经过筛选后得到的候选sgRNA信息。
图8.CD5基因候选sgRNA的敲除效率和脱靶检测结果。(A)CD5候选sgRNA敲除效率测试的FACS结果图。横坐标代表细胞CAR的表达情况，纵坐标代表细胞的CD5表达情况，坐下象限的细胞比例越高，代表CD5的敲除效率越高。(B)CD5候选sgRNA的敲除效率总结图，数据来源于5A的FACS结果。(C)CD5候选sgRNA在CRISPick网站中的脱靶和综合排名情况，排名数字越小，代表sgRNA越好。(D)C-06sgRNA的两次脱靶测试结果，分别为R1和R2。
图9.CD7基因sgRNA(E-01)的脱靶检测结果。左边为未使用sgRNA的对照细胞的测序结果，右边为使用了CD7 sgRNA的测序结果。
图10.CIITA基因候选sgRNA信息、敲除效率和脱靶检测结果。(A)CIITA候选sgRNA的序列信息以及敲除效率测试的FACS结果图。横坐标代表细胞HLA-II类分子的表达，纵坐标代表细胞的大小。(B)F-05sgRNA的两次脱靶测试结果，分别为R1和R2。
图11.TRAC、B2M、CD5、CD7共敲RNP条件摸索。(A)用Lonza电转仪进行20ul体系(2x106个细胞)电转时各基因的RNP用量。每一行为一组设置，共探索了6组RNP用量组合；每一列代表一种sgRNA的RNP用量，表中每格的数字分别Cas9蛋白和sgRNA的用量，单位为pmol。(B)不同RNP用量组合下TRAC、B2M、CD5、CD7共敲效率的FACS结果图，分别在两个donor(供着)来源的T细胞上进行了测试。每个图中，左下角象限中细胞的比例越高，代表双基因共同敲除的效率越高。
图12.两次制备(后续提到“两次制备”，均是指相同的两次制备)CD5-CD7UCAR-T的敲除设置和结果。(A)第一次制备的CD5-CD7 UCAR-T成品细胞的各基因敲除情况。上面一排是未敲除细胞的各基因表达情况，下面一排是CD5-CD7 UCAR-T细胞的各基因敲除情况，左下角象限的细胞即为敲除细胞的比例。(B)两次制备CD5-CD7UCAR-T时各基因的RNP用量，每格中的数字代表相应物料的用量，单位为pmol。(C)第二次制备CD5-CD7 UCAR-T细胞时KO-T细胞的各基因敲除情况，KO-T为只进行了基因敲除但未进行转毒的细胞，能反应各基因的真实敲除情况。ISO为阴性对照结果，MOCK-T为阳性对照结果。
图13.TRAC、B2M、CIITA、CD5、CD7基因的五敲实验结果。(A)TRAC、B2M、CIITA、CD5、CD7五基因共同敲除预实验的RNP用量，每格中的数字代表相应物料的用量，单位为pmol。(B)TRAC、B2M、CIITA、CD5、CD7五基因共同敲除预实验的FACS结果图。ISO为阴性对照，MOCK-T为阳性对照，其中HLA-DR-DP-DQ的表达情况反应CIITA基因的敲除情况。(C)制备五敲版本的CD5-CD7 UCAR-T细胞时的RNP用量，每格中的数字代表相应物料的用量，单位为pmol。(D)制备五敲版本的CD5-CD7UCAR-T细胞时KO-T组细胞的各基因敲除情况。ISO为阴性对照，MOCK-T为阳性对照，其中HLA-DR-DP-DQ的表达情况反应CIITA基因的敲除情况。
图14.针对TCR/B2M/CD5/CD7/CIITA基因的单碱基编辑候选sgRNA信息。
图15.针对TCR基因的碱基编辑sgRNA效率。图为针对TCR的碱基编辑sgRNA效率测试的FACS结果，横坐标代表TCR的表达情况，纵坐标代表细胞内容物的复杂程度。
图16.针对B2M基因的碱基编辑sgRNA效率。(A)图为针对B2M的碱基编辑sgRNA效率测试的结果，横坐标代表B2M的表达情况，纵坐标代表细胞内容物的复杂程度。(B)图为Cas9蛋白利用相邻两条反向的sgRNA，分别在基因组的两条链上进行切割的示意图，以及B2M的1号外显子上可利用的几条sgRNA的位置和序列信息。(C)B-10、B-13、NB-37、NB-38四条sgRNA不同组合下对B2M的敲除情况，横坐标代表B2M的表达情况，纵坐标代表细胞内容物的复杂程度。
图17.针对CD5基因和CD7基因的碱基编辑sgRNA效率。(A)图为针对CD5的碱基编辑sgRNA效率测试的FACS结果，横坐标代表CD5的表达情况，纵坐标代表细胞内容物的复杂程度，每一列为一种sgRNA，做了两个重复实验。(B)图为针对CD7的碱基编辑sgRNA效率测试的结果，横坐标代表CD7的表达情况，纵坐标代表细胞内容物的复杂程度，同样做了两个重复实验。
图18.针对CIITA基因的不同sgRNA的碱基编辑效率。图为针对CIITA的碱基编辑sgRNA效率测试的FACS结果，横坐标以HLA-II类分子的表达情况来反应CIITA的表达情况，纵坐标代表细胞内容物的复杂程度，ISO为阴性对照，MOCK-T为阳性对照。
图19.两次制备UCAR-T的CD5、CD7和CAR阳性细胞比例。(A)图为第一次制备的CD5-CD7 UCAR-T在转毒后3天CAR阳性细胞的比例，分别通过EGFR抗体和CD5/CD7抗原来检测EGFR和CD5、CD7 CAR的表达。(B)图为第一次制备的CD5-CD7 UCAR-T在转毒后8天CAR阳性细胞的比例，比转毒后3天高了接近一倍。(C和D)分别为第二次制备的CD5-CD7 UCAR-T在转毒后第3天和第8天时CAR阳性细胞的比例，结果与第一次的CD5-CD7 UCAR-T相似。
图20.两次制备UCAR-T期间的TRAC/B2M阴选结果。图为两次制备CD5-CD7 UCAR-T期间的TRAC/B2M阴选结果，横坐标代表B2M的表达，纵坐标代表TCR的表达，红色虚框为阴选后继续培养的细胞。
图21.两次制备的CD5-CD7 UCAR-T的CD107a释放情况检测结果。(A)第一次制备CD5-CD7 UCAR-T时KO-T和UCAR-T与不同的肿瘤细胞共孵育4h后，CD8和CAR双阳性T细胞中CD107a阳性细胞的比例。(B)根据18A中的数据做的直方图。(C)第二次制备的CD5-CD7UCAR-T与不同的肿瘤细胞共孵育4h后，CD8和CAR双阳性T细胞中CD107a阳性细胞的比例结果图。
图22.两次制备的CD5-CD7 UCAR-T的杀瘤情况检测。(A)第一次制备的CD5-CD7UCAR-T在第7天时的杀瘤功能检测结果。每个点的数据代表CD5-CD7 UCAR-T杀死相应肿瘤细胞的百分比，值越高，说明越多的肿瘤细胞被杀死，值为负数代表肿瘤细胞不但没被杀死反而有所增殖。(B)第一次制备的未转毒KO-T细胞在同样时间点相应的杀瘤能力。(C)第一次制备的CD5-CD7 UCAR-T细胞冻存复苏后的杀瘤功能检测结果。(D)第二次制备的CD5-CD7UCAR-T在第10天时的杀瘤功能检测结果。(E)第二次制备的未转毒KO-T细胞在同样时间点相应的杀瘤能力。(F)第二次制备的CD5-CD7 UCAR-T细胞冻存复苏后的杀瘤功能检测结果。
图23.两次制备的CD5-CD7 UCAR-T的活化、分型结果。(A)第一次制备的CD5-CD7UCAR-T上各抗原表达情况(未进行TRAC/B2M阴选)；(B)第二次制备的制备的CD5-CD7 UCAR-T上各抗原表达情况(已进行TRAC/B2M阴选)；(C)第一次制备的CD5-CD7 UCAR-T中CCR7阳性比例(day10冻存)；(D)第二次制备的CD5-CD7 UCAR-T中CCR7阳性比例(day12冻存)。
图24.两次制备的CD5-CD7 UCAR-T的耗竭和早调情况。(A)第一次制备的CD5-CD7UCAR-T上耗竭marker表达情况；(B)第二次制备的CD5-CD7 UCAR-T上耗竭marker表达情况；(C)第一次制备的CD5-CD7 UCAR-T上早凋marker表达情况；(D)第二次制备的CD5-CD7UCAR-T上早凋marker表达情况。
图25.两次制备的CD5-CD7 UCAR-T的组分鉴定结果。(A)第一次制备的CD5-CD7UCAR-T细胞在冻存当天的组分鉴定结果；(B)第二次制备的CD5-CD7 UCAR-T细胞在制备期间不同时间点的组分鉴定结果。
图26.CD5-CD7 UCAR-T(EGFR开关)的一例临床实验结果。(A)整个临床测试周期的设计示意图。其中的Flu是氟达拉滨(Fludarabine)，CTX是环磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)。(B)CD5-CD7 UCAR-T回输后患者外周血中CAR阳性细胞的VCN随着时间的变化情况，VCN越高，代表患者外周血中UCAR-T细胞越多。(C-E)CD5-CD7 UCAR-T回输后患者外周血中各种细胞的比例变化情况，lym指淋巴细胞(lymphocyte)。
图27.CD5-CD7 UCAR-T(HSV-TK)细胞制备。(A)HSV-TK版本的CAR分子结构示意图，将原来的tEGFR改为了HSV-TK。(B)激活电转工艺和静息电转工艺制备CD5-CD7 UCAR-T的简要流程图。(C)激活电转和静息电转工艺下TRAC/B2M/CD5/CD7的敲除以及CAR的转效情况。(D)激活电转和静息电转工艺制备的CD5-CD7 UCAR-T的细胞分型。(E)激活电转和静息电转工艺制备的CD5-CD7 UCAR-T的细胞组分比较。
图28.HSV-TK版本与EGFR版本UCAR-T之间的杀瘤效果比较。(A)HSV-TK版本的CD5-CD7 UCAR-T细胞在冻存复苏后的24h杀瘤结果。(B)EGFR版本的CD5-CD7 UCAR-T细胞在冻存复苏后的24h杀瘤结果。
图29.GCV药物对HSV-TK阳性细胞的清除情况。(A)HSV-TK版本的CD5-CD7 UCAR-T细胞在不同浓度的GCV处理下，总细胞的增殖情况。(B)HSV-TK版本的CD5-CD7 UCAR-T细胞在不同浓度的GCV处理下，CAR阳性细胞比例的变化情况。(C)HSV-TK版本的CD5-CD7 UCAR-T细胞在不同浓度的GCV处理下，CAR阳性细胞数量的变化情况。(D)-(F)EGFR版本的CD5-CD7UCAR-T细胞在不同浓度的GCV处理下，总细胞的增殖、CAR阳性细胞比例、CAR阳性细胞数量的变化情况。
图30.UCAR-T和GCV的体内药效测试。(A)动物实验的整个流程设计示意图，D代表天数。(B)小鼠的荧光成像结果图，由于肿瘤细胞表达荧光素蛋白，因此给与小鼠注射荧光素蛋白的底物后，小鼠即可产生荧光，通过荧光成像仪检测产生的荧光强度可间接地反应肿瘤细胞的多少。(C)不同组别的小鼠体内的平均荧光值强度随着时间的变化情况。
具体实施方式
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。
术语“或”是指列举的可选择要素中的单个要素，除非上下文明确地另外指出。
术语“和/或”是指所列举的可选择要素中的任意一个、任意两个、任意三个、任意更多个或其全部。
“包含”或“包括”指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。当使用“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。
“B2M基因”在本文中指β2微球蛋白的编码基因。β2微球蛋白为MHC-I类分子(人MHC-I类分子也称HLA-I类分子)的组成部分，与MHC-I类分子中的重链结合，在细胞表面形成异二聚体。B2M基因被敲除将导致细胞表面MHC-I类分子的缺失。
“TRAC基因”和“TRBC基因”在本文中分别指T细胞受体α链恒定区的编码基因和T细胞受体β链恒定区的的编码基因。该α链和β链构成T细胞受体(TCR)，其识别抗原和介导免疫应答的作用。“TRAC基因”和/或“TRBC基因”的敲除导致细胞不能表达TCR分子。
“CIITA基因”的编码产物为II类反式激活因子，在HLA基因的表达中发挥主导开关的作用。II类反式激活因子本身为非DNA结合蛋白，但其可通过结合多种转录因子和协同激活因子参与对HLA基因的转录调控。CIITA基因的敲除可影响到HLA基因，尤其是HLA-II类基因的转录，使其不能表达相应产物。
“CD5”为I型跨膜糖基化蛋白，在T细胞受体信号传导的负调控中起着重要作用，并促进正常和恶性淋巴细胞的存活。CD5是恶性T细胞肿瘤的特征性表面标志物之一，80％的T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)和外周T细胞淋巴瘤都表达CD5。本文中，CD5可以为人CD5，其GenBank登录号为NM_014207.4。CD5蛋白也可包括CD5的片段，诸如胞外结构域及其片段。
“CD7”为细胞表面糖蛋白，分子量约40kD，属于免疫球蛋白超家族成员，在T细胞和NK细胞以及其他细胞如胸腺细胞、髓系细胞等细胞表面表达。其在T细胞相互作用以及早期淋巴发育期间的T细胞-B细胞相互作用方面起重要作用。
“抗体”指由浆细胞(效应B细胞)分泌、被机体免疫系统用来中和外来物质(多肽、病毒、细菌等)的免疫球蛋白。该外来物质相应地称作抗原。经典抗体分子的基本结构是由2个相同重链和2个相同轻链组成的4聚体。根据氨基酸序列的保守性差异，将重链和轻链分为位于氨基端的可变区(V)和位于羧基端的恒定区(C)。一条重链和一条轻链的可变区相互作用形成了抗原结合部位(Fv)。在可变区中，某些区域氨基酸残基的组成和排列次序比可变区内的其它区域(骨架区，FR)更易变化，称为高变区(HVR)，高变区实际上是抗体与抗原结合的关键部位。由于这些高变区序列与抗原决定簇互补，故又称为互补决定区(complementarity-determining region,CDR)。重链和轻链均具有三个互补决定区，分别称为HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2、LCDR3。CDR的氨基酸序列可以使用本领域公认的编号方案来确定，例如Kabat、Chothia、IMGT、AbM或Contact编号方案。根据抗体重链恒定区的氨基酸序列，可将抗体分为五种主要的不同类型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。这些抗体类型根据铰链区的大小，链间二硫键的位置和分子量的不同可进一步分为亚类，例如，IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3等。根据抗体轻链恒定区氨基酸组成和排列的不同，可将轻链分为κ和λ两种类型。不同类别的免疫球蛋白的亚单位结构和三维构象在本领域内是已知的。
抗体分子的“抗原结合片段”指抗体分子中参与抗原特异性结合的氨基酸片段，例如，Fab、Fab’、(Fab’)2、scFv和sdAb等。本领域技术人员已知如何获得这些抗原结合片段。例如，经典抗体分子可经木瓜蛋白酶消化而得到Fab片段，经胃蛋白酶消化得到F(ab’)2，通过以还原剂处理断开F(ab’)2铰链区之间的二硫键而形成Fab’片段。
“单链抗体(single chain fragment variable,scFv)”，是由抗体重链可变区和轻链可变区通过短肽连接成一条肽链而构成。通过正确折叠，来自重链和轻链的可变区通过非共价键相互作用形成Fv段，因而scFv能较好地保留其对抗原的亲和活性。
“单域抗体(single domain antibody，sdAb)”，或者也称为“VHH抗体”，指具有抗原结合能力，包括重链可变区而无轻链的抗体分子。从结构上看，单域抗体也可以认为是抗体分子的一种抗原结合片段。其首先在骆驼科动物中被发现，随后，研究人员通过抗体库(例如噬菌体展示文库)筛选发现了更多的具有抗原结合能力的单域抗体。单域抗体相对于普通抗体分子(例如，经典四聚体抗体分子)或其抗原结合片段具有一些优势，例如包括但不限于：分子量更小，使用于人体时易于到达普通抗体分子难以到达的组织或部位，或者，能够接触到蛋白或多肽中普通抗体分子难以接触到的抗原表位；更加稳定，能够耐受例如温度和pH的变化以及变性剂和蛋白酶的作用。
提及抗体或其抗原结合片段时，“靶向”或“特异性结合”指，相对于环境中同时存在的其他分子，一种分子(例如抗体或其抗原结合片段)对另一种分子(如肿瘤细胞表面抗原)具有更高的结合亲和力。“靶向”或“特异性结合”并不排除该分子可以对一种以上的分子具有结合亲和力，例如双特异性抗体可以对两种不同抗原具有高亲和力。
“嵌合抗体受体(chimeric antigen receptor，CAR)”，也称为嵌合T细胞受体、嵌合免疫受体，为一种工程化的膜蛋白受体分子，其可将期望的特异性赋予免疫效应细胞，例如与细胞表面蛋白(如肿瘤抗原)结合的能力。嵌合抗原受体通常由胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域构成。通常，抗原结合结构域为一段scFv或sdAb序列，负责识别和结合特定的抗原。该抗原结合结构域可以为单特异性的，即仅对一种抗原具有特异性结合能力；也可以为多特异性的(例如双特异性的)，即对多种抗原具有特异性结合能力。在本文提供的一些实例中，该双特异性胞外抗原结合结构域对CD5和CD7都有特异性结合能力，这可以通过在胞外抗原结合结构域中包括靶向或特异性结合CD5的抗体片段(例如scFv或sdAb)和靶向或特异性结合CD7的抗体片段(例如scFv或sdAb)来实现。胞内信号结构域通常包括免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)，例如来源于CD3ζ分子的信号传导结构域，负责激活免疫效应细胞，产生杀伤作用。另外，嵌合抗原受体还可在氨基端包括负责新生蛋白在细胞内定位的信号肽，以及在抗原结合结构域和跨膜结构域之间包括铰链区。胞内信号传导结构域还可包括来源于例如4-1BB或CD28分子的共刺激结构域。相应地，将表达CAR的T细胞简称为CAR-T。CAR-T利用其细胞表面表达的CAR识别靶细胞，被靶细胞激活后以非MHC限制性方式产生对靶细胞的杀伤作用。在一个实例中，利用CAR-T细胞对受试者(如癌症患者)进行治疗的大体过程为：从受试者采集外周血单个核细胞(PBMC)，分离并培养T细胞，通过慢病毒转导方式导入CAR编码核酸序列，继续培养并收集CAR+细胞，以及将CAR+细胞回输给该受试者。本领域技术人员已知，在一些情况下，可以利用NK细胞替代T细胞来进行该过程。因此，在提及CAR-T时，视情况也可涵盖表达CAR的NK细胞。另外，本文在提及CAR-T细胞时，除非另有说明，不仅指直接经CAR修饰的细胞，还指这些细胞在体外或体内增殖后产生的子细胞
“通用CAR-T细胞(UCAR-T)”在本文指这种细胞不限于输入特定患者体内的CAR-T细胞。在现有技术中，为了防止GvHD以及宿主对移植物的排斥反应，通常是从患者体内收集细胞(如T细胞)并进行CAR修饰后输回到患者体内。这种方法不仅耗时昂贵，而且在有些情况下无法获得足够数量的患者T细胞来进行CAR修饰。与此相反，这里的通用CAR-T细胞指其适合于异体移植，同一批CAR-T细胞可用于不同的患者，并且这些通用CAR-T细胞通常并非源自于这些患者。
“CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)基因编辑技术”是新出现的一种由RNA指导的通过Cas核酸酶对靶基因进行DNA编辑的技术。该技术所使用的CRISPR基因编辑系统包括Cas核酸酶和引导RNA(single-guide RNA,sgRNA)，视情况可还包括作为修复模板的ssDNA。sgRNA的一部分序列可以与Cas核酸酶结合，另外部分序列(crRNA)可以与靶基因的部分序列互补，借助sgRNA的识别作用使得Cas核酸酶可以在靶基因特定位点形成单链或双链切口。细胞通常会通过两种方式对断裂链进行DNA修复，这两种方式分别是同源重组修复机制(homology-directed repair,HDR)和非同源末端连接修复机制(non-homologous end joining,NHEJ)。在将CRISPR技术例如用来对细胞的基因进行基因敲除操作时，通常只需要考虑破坏该基因的正常编码功能，例如引起移码突变或基因片段缺失，从而不能产生有正常功能的产物(如蛋白)。通常，可以在向细胞中引入Cas核酸酶(例如Cas9)和sgRNA后，再筛选出不表达待敲除基因的产物的细胞。“CRISPR基因编辑系统”在本文中指Cas核酸酶和sgRNA的组合，用于在引入细胞后对sgRNA靶向基因进行编辑。
除了CRISPR技术外，也可以采用其他技术来实现基因敲除，例如同源重组、TALEN技术等。
“胞嘧啶碱基编辑技术”是在CRISPR技术基础上引入了单碱基编辑功能的基因编辑技术。其采用了具有多个功能部分的称为“胞嘧啶碱基编辑器”的融合蛋白。一个功能部分为Cas9n(Cas9-nickase)蛋白，其源自对Cas9蛋白的RuvC1结构域进行D10A突变，从而只保留了HNH结构域的酶活性。Cas9n不会造成DNA双链断裂，只能够切割基因组上与sgRNA互补结合的DNA单链，从而诱导碱基错配修复(BER)。另两个功能部分分别为胞嘧啶脱氨酶APOBEC和尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)。APOBEC能够诱导另一条DNA单链(非sgRNA靶向链)上的胞嘧啶发生脱氨，形成尿嘧啶，在UGI蛋白存在下，最终促使胞嘧啶向胸腺嘧啶的突变(C->T突变)。在本文中，通过胞嘧啶碱基编辑技术向细胞的待敲除基因中引入终止密码子，从而使得细胞不能产生有功能的基因产物。胞嘧啶碱基编辑技术可以视为CRISPR技术的一部分，但出于方便描述的目的，在本文中，提及CRISPR技术，尤其是采用Cas9蛋白的CRISPR技术时，不涉及上述单碱基编辑功能，从而与胞嘧啶碱基编辑技术区分开。
“敲除”或“基因敲除”在本文中指改变细胞中某基因的核苷酸序列，无论该改变是核苷酸插入、缺失还是替换，只要被敲除的该基因在细胞中不能产生有功能的基因产物(如RNA或蛋白)即可。理想地，基因敲除使得细胞或细胞群完全不形成该基因的基因产物或者有功能的基因产物。可理解地，导致基因产物的量明显减少，或者基因产物的活性明显减低，也可认为是实现了“基因敲除”。在一些情况下，可能需要对细胞中的两个或更多个基因进行基因敲除。在一些实施方案中，可以按次序进行基因敲除，即在敲除一个基因后，接着进行下一个基因的敲除。在另一些实施方案中，可以同时对两个或更多个基因进行敲除。例如，在采用CRISPR技术敲除细胞中的多个基因时，可以同时向该细胞引入Cas9和分别靶向各个基因的多种sgRNA。
提及sgRNA时，术语“靶序列”指目标基因或待敲除基因中与sgRNA的部分序列(crRNA，约20个碱基)互补的核苷酸片段。借助于sgRNA中与靶序列互补的这部分序列，让Cas9等蛋白可以在相对确定的位置在目标基因中引入核苷酸序列改变，达到基因敲除的效果。相应地，在本文中，“靶向某指定序列的sgRNA”指该sgRNA的靶序列为该指定序列。
“RNP复合物”在本文中指sgRNA与相应Cas酶(如Cas9)结合的产物。在通过CRISPR技术或胞嘧啶碱基编辑技术进行基因敲除时，可以先将sgRNA与Cas酶混合，随后通过电转引入细胞(如T细胞)中。
“EGFRt”或“tEGFR”在本文中可以互换使用，指编码截短的人表皮生长因子受体多肽的基因或其编码产物，其缺乏远端膜EGF结合域和细胞质信号传导尾，但保留了由抗EGFR抗体识别的细胞外表位。EGFRt可用作具有遗传修饰细胞功能的非免疫原性选择工具以及追踪标记。在本文中，其一方面可作为CAR-T细胞的标记分子，另一方面还可以在需要时用于清除体内的CAR-T细胞，例如通过EGFR抗体(例如，西妥昔单抗)介导的ADCC途径(参见US8802374B2)，即在临床转化时作为安全开关使用。
“HSV-TK”为Herpes Simplex Virus Thymidine Kinase(人类单纯疱疹病毒胸苷激酶)的缩写，其底物是小分子药物GCV。关于HSV-TK和GCV作为分子开关的作用，在下文有更详细描述。
“自剪切肽”指可经核糖体跳跃而非蛋白酶水解来实现剪切蛋白的功能的短肽，可包括T2A、F2A和P2A等。
“治疗”指对受试者进行处理以获得有益的或所期望的临床结果。本文所用的“治疗”涵盖各种处理手段，包括以任何可能的药物向受试者给药、手术、辐射等。出于本发明的目的，有益或所期望的临床结果包括但不限于以下的任一种或多种：减轻一种或更多种症状、减弱疾病程度、预防或延迟疾病扩散(例如转移，例如转移至肺或淋巴结)、预防或延迟疾病复发、延迟或减缓疾病进展、改善疾病病况、抑制疾病或疾病进展、阻滞其发展和缓解(无论部分抑或完全缓解)。本文所提供的方法涵盖这些治疗方面中的任一种或多种。按照以上内容，“治疗”不需要完全去除病症或疾病的所有症状或完全缓解。
术语“治疗有效量”指足以在受试者体内引起临床医师所期望的生物学或医学反应的活性化合物的量。本发明融合蛋白的“治疗有效量”可由本领域技术人员根据给药途径、受试者的体重、年龄、病情等因素而确定。例如，典型的日剂量范围可以为每kg体重0.01mg至100mg或更多活性成分。
提及药物组合物，所使用的术语“药学上可接受的载体”指可以安全地进行施用的固体或液体稀释剂、填充剂、抗氧化剂、稳定剂等物质，这些物质适合于人和/或动物给药而无过度的不良副反应，同时适合于维持位于其中的药物或活性剂的活力。依照给药途径，可以施用本领域众所周知的各种不同的载体，包括，但不限于糖类、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽糖、明胶、滑石、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、藻酸、磷酸缓冲液、乳化剂、等渗盐水、和/或无热原水等。本文所提供的药物组合物可以制成粉末、注射剂等临床可接受的剂型。可以使用任何适当的途径向受试者施用本发明的药物组合物，例如可通过口服、静脉内输注、肌肉内注射、皮下注射、腹膜下、直肠、舌下，或经吸入、透皮等途径给药。
“药物试剂盒”指包括至少两种活性成分的药物组合。不同于药物组合物，药物试剂盒中至少一种活性成分与其他活性成分分开保存。
“受试者”指动物，例如哺乳动物，包括(但不限于)人类、啮齿动物、猿猴、猫科动物、犬科动物、马科动物、牛科动物、猪科动物、绵羊、山羊、哺乳类实验动物、哺乳类农畜、哺乳类运动动物和哺乳类宠物。受试者可为雄性或雌性且可为任何适龄受试者，包括婴儿、幼年、青年、成年和老年受试者。在一些实例中，受试者指需要治疗疾病或病症的个体。在一些实例中，接受治疗的受试者可为患者，其患有与该治疗有关联的病症，或有风险患上该病症。在另一些实例中，受试者为健康个体或者为患有非所关注疾病的个体。在特定实例中，受试者为人类，诸如人类患者。该术语通常可与“患者”、“检测对象”、“治疗对象”等互换使用。
CD5-CD7通用CAR-T策略设计
为了解决GvHD问题，本发明人通过敲除TRAC和/或TRBC基因来让CAR-T的T细胞表面受体TCR不表达，进而不能识别宿主的细胞，如图1所示。
为了解决宿主免疫系统清除输入的CAR-T细胞，本发明人通过敲除CAR-T细胞的HLA分子来避免宿主的T细胞清除CAR-T细胞。HLA分子分为HLA-I和HLA-II两种类型，HLA-I分子被CD8阳性的毒性T细胞识别，是宿主T细胞清除CAR-T细胞的主要途径，而HLA-II分子被CD4阳性的T细胞识别，是宿主T细胞清除CAR-T细胞的辅助途径。因此发明人的HLA分子敲除有两个版本，一种是敲除HLA-I分子的B2M基因，第二种是同时敲除HLA-I分子的B2M基因和与HLA-II分子表达相关的CIITA基因，第二种版本的UCAR-T理论上会更好地避免宿主T细胞的清除，但HLA的敲除会激活宿主的NK，激活的NK也会清除UCAR-T。
巧妙的是，本发明人制备的CAR是针对CD5和CD7，CD7在NK细胞上也会表达，所以CAR在攻击肿瘤细胞的同时也能攻击宿主的NK细胞，这就解决了由于HLA敲除导致的NK激活问题。由于CAR-T本身也会表达CD5和CD7，因此为了避免CAR-T自杀，发明人将CAR-T细胞的CD5和CD7也同时敲除。HLA的敲除联合CAR作为攻击分子来减弱宿主的T和NK细胞对UCAR-T细胞的清除作用，从而使UCAR-T在体内能得到很好的扩增。
通用CAR-T的制备流程与普通CAR-T的制备流程基本一致，只是另外包括了基因敲除步骤。其大体流程为：T细胞分选、激活→电转敲除基因→慢病毒转导→敲除效率和CAR结构的整合效率检测→体外功能验证→细胞制剂冻存。
CD5-CD7 CAR结构
本文采用的CAR的结构如图2所示。CD7和CD5的单VH结构域(单域抗体)通过一个linker串联，然后紧接CD8α铰链区、TM转膜区、4-1BB和CD3ζ共刺激分子。
可在其后通过T2A连接EGFRt开关分子，T2A蛋白会将EGFRt开关分子与CAR结构分割开。如下文描述的，在一些情况下，更有利地是采用自杀基因作为分子开关，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因。采用HSV-TK分子开关的CAR结构设计如图27A所示。
不依赖于免疫细胞的CAR-T开关分子
由于CD5-CD7通用CAR-T在清除肿瘤的同时也清除了患者体内的正常T/NK细胞，导致在治疗期间患者处于免疫缺陷状态，无法在正常环境下生存；另外CD5敲除的T细胞若在患者体内长期存在，则很容易导致自身免疫疾病。因此，需要对CD5-CD7通用CAR-T在受试者体内的存在或增殖情况进行控制，这可通过使用分子开关来实现。
目前常用的CAR-T开关分子是EGFR，可通过抗EGFR的抗体西妥昔单抗来清除CAR-T细胞，但此方法需要NK等免疫细胞的参与才能实现。发明人的CD5-CD7 UCAR-T由于会将患者体内的NK细胞也杀死，因此EGFR开关不再适用于CD5-CD7 UCAR-T。
不依赖于免疫细胞的CAR-T开关分子通常是通过小分子药物去控制CAR-T中的某个元件来实现启动或关闭(杀死)CAR-T细胞，Ali Can Sahillioglu Ton和N Schumacher于2022在Current Opinion in Immunology上发表的文章8总结了目前研究发现的CAR-T小分子药物开关，根据作用机理大致可分为7类，如图3所示，包括自杀基因、转录调控、稳定性控制等。
本发明人的CD5-CD7 UCAR-T的其中一个版本即采用了自杀基因开关中的HSV-TK。HSV-TK是Herpes Simplex Virus Thymidine Kinase(人类单纯疱疹病毒胸苷激酶)的简称，其底物是小分子药物GCV(Ganciclovir，更昔洛韦)，GCV由美国Syntex公司推出，于1988年批准上市，为治疗巨细胞病毒感染的首选药物。HSV-TK联合GCV治疗巨细胞病毒感染的原理是：HSV-TK能高效地和GCV结合并对其进行一磷酸化，随后细胞内的激酶对其进行二磷酸化和三磷酸化，三磷酸化的GCV结构与细胞内的核苷极其类似，因此会竞争性地与DNA聚合酶结合或打破细胞内四种核苷的比例而抑制DNA的合成，DNA合成受阻后细胞会渐渐地凋亡。
因此，在一方面，本发明人针对TRAC/B2M/CD5/CD7/CIITA基因，利用CRISPR/Cas9系统的敲除功能，成功筛选出敲除效率高、脱靶概率低的sgRNA。
另一方面，本发明人针对TRBC/B2M/CD5/CD7/CIITA基因，利用CRISPR/Cas9系统的碱基编辑功能，成功筛选出可通过在基因的重要区域引入终止密码子来实现基因沉默的sgRNA。
另一方面，本发明人通过sgRNA的筛选以及电转工艺的优化，成功实现多个基因同时高效率的敲除(每个基因的敲除效率在90％左右)。
另一方面，本发明人成功制备出在体外/体内的杀瘤功能强、扩增能力强的CD5-CD7 UCAR-T。
另一方面，本发明人利用HSV-TK、联合GCV小分子药物，成功实现在体内高效清除UCAR-T细胞。
通用CD5-CD7 CAR-T与自体CD5-CD7 CAR-T相比可以存在如下区别：1)敲除的基因不一样：自体CD5-CD7 CAR-T只需敲除CD5和CD7基因，而通用的CD5-CD7 CAR-T除了敲除CD5和CD7基因外，还需敲除TCR和HLA的相关基因；2)通用CAR-T的制备过程中，可能需要对UCAR-T进行纯化，将表达TCR和HLA复合物的CAR-T细胞筛选掉，保证进入患者体内的UCAR-T细胞完全不表达TCR和HLA复合物，避免引起HvGD或者GvHD毒副作用；3)适应症不完全一样：自体的CD5-CD7 CAR-T只适用于肿瘤细胞未侵犯到外周血的T细胞淋巴瘤，而通用的CD5-CD7 CAR-T则适用于所有类型的T细胞恶性肿瘤。
以下通过具体实施例来进一步说明本发明。
实施例中涉及的通用方法如下：
1.CD3+ T细胞的分选和激活
复苏冻存的健康供体(具体信息保密)PBMC共1.0×108个细胞每管，快速融化后重悬于8ml预热的Rinsing buffer中，取少量细胞悬液进行细胞计数。将PBMC悬液以400g离心(↑8↓8)10分钟。离心结束后，弃上清，加入20ul/107的CD3微珠，混匀后放入4℃冰箱孵育20分钟，期间每10分钟轻弹管壁数次避免细胞沉淀。孵育结束后，加入Rinsing buffer润洗1遍后离心(400g 10min↑8↓8)，再用500μl Rinsing buffer重悬细胞。同时将LS分选柱放置在美天旎磁力分选架上，用2ml Rinsing buffer润洗润洗1遍后，加入500μl的细胞悬液，待细胞悬液滴尽后反复2次加入2ml Rinsing buffer于LS柱上。用5mL Rinsing buffer将目的细胞从LS柱上冲出并收集，做适当稀释后对目的细胞进行计数，取约1×105个细胞以流式细胞术确定分选的T细胞的纯度。随后将细胞悬液300g离心10分钟，用新鲜T细胞培养基将细胞密度调整至1×106,以10ul/106个细胞的浓度加入抗-CD3/-CD28抗体磁珠激活，按每孔4mL，种入到12孔板中，放入37℃，CO2培养箱中进行培养。
2.激活电转
对于CD3/CD28 Dynabeads激活的细胞，激活24h后即可进行电转。细胞收集于离心管中，置于磁力架上去除Dynabeads，反复过3遍，然后将细胞离心(300g 15min升8降8)；结束后，弃上清，用适量的复方电解质将细胞重悬到一起，取细胞计数；根据细胞计数结果配制相应量的RNP(Cas9蛋白和sgRNA的复合物)，37℃孵育10分钟以上；同时将细胞再次离心，结束后用相应量的电转buffer重悬细胞，加入孵育好的RNP，轻轻混匀后加入Lonza电转仪配套的电转杯中，选择电转激活T细胞的程序EH-115，电转，然后立即加入少量的经温热后的T细胞培养基，放入培养箱中恢复15分钟以上，再将细胞悬液从电转杯中转出至合适的培养瓶中，加入T细胞培养基使培养密度为2M/ml。
3.Pan-T细胞阴选
复苏冻存的健康供体PBMC共1.0×108个细胞每管，快速融化后重悬于8ml预热的Rinsing buffer中，取少量细胞悬液进行细胞计数。将PBMC悬液以400g离心(↑8↓8)10分钟；离心结束后，弃上清，加入Rinsing buffer(按40ul/10^7cells)和Pan T Cell Biotin-Antibody Cocktail(10ul/10^7cells)，用枪头轻轻吹打混匀后，放入4℃冰箱孵育10min，期间轻弹管壁一次避免细胞沉淀；然后加入Rinsing buffer(按30ul/10^7cells)和Pan TCell MicroBead Cocktail(20ul/10^7cells)，用枪头轻轻吹打混匀后，放入4℃冰箱孵育15min，期间每隔5min轻弹管壁数次避免细胞沉淀；磁珠孵育的同时取出LS分选柱(阳性载量100M/柱)装置在美天旎磁力分选架上，用3ml的Rinse buffer润洗分选柱一次；磁珠孵育结束后，补加适量的Rinse buffer，细胞混匀后均分至每个LS中，每个柱子2ml；待细胞悬液滴尽后用2ml Rinsing buffer洗柱子2次，流下的阴性细胞为T细胞，从细胞中取出100ul，以900ul buffer稀释10倍后，取20ul进行计数；根据计数结果，用不含细胞因子的T细胞培养基静息培养T细胞4h后进行电转，培养密度为5M/ml。
4.静息电转
阴选出的T细胞静息培养4h后，收集细胞于离心管中，取细胞计数，根据细胞计数结果，配制相应量的RNP(Cas9蛋白和sgRNA的复合物)，37℃孵育10分钟以上；同时将细胞离心，结束后用相应量的电转buffer重悬细胞，加入孵育好的RNP，轻轻混匀后加入Celletrix电转仪配套的电转杯中，设置电转静息T细胞的相应参数(100ul体系，1380V,3ms)，电转，然后立即将细胞吸出至培养瓶中(培养瓶中的培养基提前加好CD2/CD3/CD28激活剂并温热)，此时勿吹打细胞，然后将细胞放入培养箱中培养，培养密度为2M/ml。
5.CAR的慢病毒转导
细胞激活48小时后，进行CAR的慢病毒转导。对细胞悬液进行活率检测和细胞计数，根据细胞计数结果加入相应量的慢病毒，MOI为3，再加入100x的lentiboost助，轻轻混匀后，37℃培养箱中继续培养。24小时后换液去除病毒，换新鲜的培养基继续培养T培养细胞，密度为1M/ml。
6.FACS(流式细胞术)检测
取约2×10^5个细胞悬液于1.5ml离心管中，300g离心5分钟，用PBS+2％胎牛血清缓冲液洗1遍，完全弃去上清，用100μl缓冲液重悬细胞后加入相应抗体1μl，混匀后4℃避光孵育30分钟，加入100ul缓冲液洗一遍后，用100ul含DAPI或者7AAD的缓冲液重悬后上机检测。
7.TRAC/B2M阴选
在细胞制备的第六天左右，TRAC和B2M成功敲除的细胞已不表达相应的蛋白，因此可对细胞进行阴选，将TRAC和B2M成功敲除的细胞给分离出来继续培养。具体步骤如下：收集细胞室温离心(400g 15min，升8降8)，结束后弃上清，用Rinsing Buffer重悬细胞(80ul/10^7cells)，加入FITC-B2M抗体(1ul/10^6cells),四度避光孵育20min；孵育完毕后，加40ml的Rinsing Buffer重悬细胞，室温离心，结束后弃上清，用Rinsing Buffer重悬细胞(80ul/10^7cells)，加FITC-beads(1ul/10^6cells)，加CD3-beads(按1ul/10^6cells),四度避光孵育20min；孵育完毕后，加40ml的Rinsing Buffer重悬细胞，室温离心，同时用3ml的buffer润洗LD柱子；离心结束后弃上清，用Rinsing Buffer(1*10^8/ml)重悬细胞，过柱子2遍(2ml/柱子)，然后用3ml的buffer洗柱子2遍，收集流下的阴性细胞，计数，取少量细胞用于FACS检测敲除效率、CAR阳性率和分选的纯度等，将阴性细胞离心后用500ml-1000ml的T细胞完全培养基培养于G-rex培养瓶中。
8.CD107a释放检测
提前配制需要量的T细胞完全培养基，往培养基中加入100x的PE/Cy7 mouseanti-human CD107a抗体和1000x的monensin；对UCART细胞和多种肿瘤细胞计数，按1:1的比例(UCAR-T细胞按CAR阳性的细胞算)分别取细胞离心(一般CAR阳性细胞在0.1M以上)，然后用含有CD107a抗体和monensin的培养基重悬，接种于96孔板中，放入细胞培养箱中(37℃5％CO2)孵育4h；然后对细胞进行FACS染色，一般还需染CD8和EGFR抗体，通过FACS检测计算CD8阳性和CAR阳性的T细胞下的CD107a阳性细胞比例。
9.肿瘤杀伤检测
一般地，将UCAR-T细胞和多种表达luciferase(萤火虫荧光素)的靶向和非靶向肿瘤细胞以不同的效靶比(UCART细胞按CAR阳性的细胞算，固定肿瘤细胞的量)接种于96孔板中，在细胞培养箱中共培养24h后取出一半的细胞悬液于不透光的白底96孔板中，加入10x的luciferase底物混匀，室温反应10分钟后上机检测luciferase荧光值，通过荧光值间接地反应肿瘤细胞的存活数量，进而反应出UCAR-T细胞的杀瘤功能。
10.体外检测GCV的药效
UCAR-T细胞计数，取8M的细胞离心，结束后弃上清，用8ml新鲜的T细胞培养基重悬，均分至12孔板的8个孔中，每孔1ml，然后两个孔为一组，分别加入DMSO、0.3ug/ml、1ug/ml、3ug/ml的GCV，细胞于培养箱中培养，之后每3天通过计数和FACS检测来监测CAR阳性细胞的变化。同时，每3天收集细胞沉淀提基因组，通过荧光探针qPCR法检测DNA水平的CAR分子变化情况。
11.Guide-seq脱靶检测
通过电转将待检测sgRNA的RNP和dsODN导入进激活的T细胞中，电转后5-7天，提取带有dsODN整合的基因组；通过Covaris S220仪器将基因组打断成平均500bp的片段，用0.8x Ampure XP beads对基因片段纯化回收，再用UltraTM II DNA LibraryPrep Kit for/>试剂盒对纯化后的基因组片段进行末端修复并加A，使用UltraTM II DNA Library Prep Kit for/>试剂盒对已加A的DNA片段连接linker序列，每个样品连接不同的linker，再使用0.8 x Ampure XP beads纯化；接下来进行PCR，引物分别位于linker序列和dsODN上，对PCR产物进行回收，然后使用ABclonalRapid DNA Lib Prep Kit连接通用的P5和P7 Y型adaptor，产物纯化回收后即可用于二代测序。通过分析测序结果，将linker序列和dsODN序列之间的基因组序列与sgRNA序列比对，即可得到脱靶的位点信息以及脱靶概率。
12.SgRNA设计和编辑效率验证
sgRNA可通过许多网站进行设计，如CHOPCHOP(https://chopchop.cbu.uib.no/),CRIS Pick(https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public),GUIDES(http://guides.sanjanalab.org/#/),CRISPOR(http://crispor.tefor.net/)，IDT(https://sg.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_SEQUENCE)等，这些网站均可预测On-target和Off-target的效率。
一般步骤如下：
1)查找目的基因的基因组序列：可在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和UCSC(https://genome.ucsc.edu/)网站上查看和下载目的基因的基因组序列；
2)sgRNA预测以及合成：将目的基因的目标序列输入上述sgRNA预测网站，生成诸多候选的sgRNA，根据On-target和Off-target的排名选择和适量量的sgRNA序列，将sgRNA的靶向序列(20nt左右)告诉第三方公司让其合成全长的sgRNA。
候选sgRNA编辑效率验证：候选sgRNA合成好后，可直接通过电转将Cas9蛋白和sgRNA的复合物RNP(ribonucleoprotein)导入目的细胞，电转后24h-48h即可通过PCR和测序检测基因水平上的编辑效率，72h后可通过FACS检测蛋白水平的变化情况。
实施例中涉及的主要试剂如下：
/>
/>
实施例中涉及的主要耗材如下：
名称 厂商 货号
LS Columns Miltenyi 130-042-401
LD Columns Miltenyi 130-042-901
T25培养瓶 Corning 430639
T75培养瓶 Coming 430641
15ml离心管 Corning 430791
50ml离心管 Corning 430829
50ml注射器 康德莱 /
10ml移液管 Corning 4488
25ml移液管 Corning 4489
电转杯 lonza V4XP-3024
EP管 eppendorf 30108051
250ml离心瓶 Corning 430776
储液瓶-500ml Corning 430282
50ml血细胞冻存袋 Miltenyi 200-074-400
1.8ml冻存管 Thermo 375418
G-Rex 100M透气性培养瓶 Wilsonwolf 81100
实施例1利用CRISPR/Cas9技术敲除T细胞表面的TRAC/TRBC、B2M、CIITA、CD5、CD7抗原
1.1 TRAC、B2M、CIITA、CD5、CD7 sgRNA筛选
1.1.1 TRAC sgRNA筛选结果
发明人通过CRISPick、CRISPOR和IDT等常用的sgRNA设计网站得到诸多可能的sgRNA信息，然后综合考虑在靶和脱靶等信息后选出7条候选sgRNA(图4A)。将7条候选sgRNA的靶向序列告知技术服务公司(南京金斯瑞生物科技有限公司)让其合成全长的sgRNA(靶向序列+骨架序列)。
SgRNA合成好后，用nuclease-free的水将其溶解为100-500pmol/μl，然后与Cas9蛋白以不同的用量混合后37℃孵育10分钟以上，再通过lonza电转仪电转，将Cas9与sgRNA的复合物导入T细胞中，细胞培养6天后，用FACS检测TCR复合物的表达情况，从而反应出不同sgRNA对TRAC的敲除效率。从图4B可以看出，在较高RNP用量(Cas9 60pmol，sgRNA150pmol)下，所有7条sgRNA的敲除效率均可达到90％以上，但在较低RNP用量(Cas930pmol，sgRNA 30pmol)下，只有部分sgRNA的敲除效率可达到90％以上，其中A-XL这条sgRNA的敲除效率最高(99.5％)，因此发明人选择此条sgRNA作为后续制备UCAR-T使用。A-XL这条sgRNA也曾被多个研究者使用4,9。
发明人用Guide-seq方法对A-02、A-06和A-XL这三条sgRNA进行了脱靶检测，结果如图4C-E所示，A-XL的两次检测结果中均出现了有一个概率较高的脱靶位点，A-02的一次检测结果显示也有概率较高的脱靶位点，A-06的脱靶概率稍低，因此该版本的UCAR-T后续可能会倾向于使用A-06这条sgRNA。
1.1.2 B2M sgRNA筛选结果
如图5A是发明人通过CRISPick、CRISPOR、IDT、CHOPCHPOP和GUIDES几个网站预测后，综合考虑选出的候选sgRNA信息。同样用电转的方法将Cas9蛋白和sgRNA复合物导入T细胞中，电转后8天取出适量细胞，用流式细胞仪检测B2M的表达情况，从而反应出不同候选sgRNA对B2M的敲除效率。从图5B可以看出，B-03的敲除效率最高(90％以上)，B-10、B-13和B-XL的敲除效率相当(80％以上)，而B-01的敲除效率太低(50％左右)。
同时，发明人将单条B2M-sgRNA与已测试好的TRAC-sgRNA(A-XL)一起做双敲，以期筛选出TRAC-B2M双敲效率比较好的B2M-sgRNA。同样地，发明人将Cas9蛋白和TRAC-sgRNA、B2M-sgRNA混合孵育10分钟后通过电转导入T细胞中，电转后8天取出适量细胞，用FACS检测B2M和TCR复合物的表达情况。从图6A可以看出，在TRAC和B2M双敲情况下，还是B-03表现最优(双敲效率93％)，其次是B-13和B-XL(双敲效率91％)，B-10稍差(双敲效率88％)，而B-01还是最差(双敲效率50％)，因此B-01这条sgRNA在后续的测试中排除掉。
接下来，发明人对在双敲测试中表现比较好的TRAC/B2M(B-03、B-10、B-13、B-XL)sgRNA组合进行不同RNP浓度下的敲除效率测试，以期筛选出在较低RNP浓度下实现TRAC-B2M双敲效率在90％以上的sgRNA组合。具体地，发明人分别用30pmol+30pmol，60pmol+60pmol，60pmol+150pmol的Cas9蛋白和sgRNA(每组中TRAC和B2M的RNP用量相同)进行测试，结果如图6B所示，在较高浓度的RNP(60pmol+150pmol)下，所有4组sgRNA组合均能实现90％以上的双敲效率，但在较低浓度的RNP(60pmol+60pmol，30pmol+30pmol)下，只有B-03和B-13才能实现可以接受的双敲效率(80％以上)；在30pmol+30pmol的RNP浓度下，B-13的表型优于B-03，而在60pmol+60pmol的RNP浓度下，B-03和B-13的效率相当，但双敲效率均没有达到90％以上，考虑到B-03和B-13在B2M的不同外显子上，发明人决定同时使用B-03和B-13来实现B2M的敲除。
发明人对B-03和B-13这两条sgRNA进行了脱靶检测，结果如图6C-D所示，B-13的两次检测结果中最高脱靶概率的序列相同，说明此位点极有可能出现脱靶；而B-03的两次检测结果测到的最高脱靶概率的序列不一样，其中一次的最高脱靶概率为3％，而另一次则只有0.01％，表明B-03这条sgRNA的脱靶概率较低。
1.2.3 CD5 sgRNA筛选结果
针对CD5的敲除sgRNA，发明人总共进行了两次sgRNA的筛选。图7A和7B是第一次筛选时测试的sgRNA序列信息以及相应的敲除效率结果，其中sgRNA1和sgRNA3的敲除效率不错，但此前未对所选择的sgRNA进行脱靶分析，为了找出敲除效率高且脱靶低的sgRNA，本发明人再次设计了5条sgRNA与sgRNA1和sgRNA3一起进行敲除效率和脱靶率测试。图7C是发明人第二次筛选时通过CRISPick、CRISPOR、IDT、CHOPCHPOP和GUIDES几个网站预测后，综合考虑选出的候选sgRNA信息，其中C-01和C-03为图7A中的sgRNA1和sgRNA3。
SgRNA合成好后，发明人首先进行敲除效率的测试，方法与上述其它sgRNA的筛选相同，结果如图8A-B所示，除C-05外，其它sgRNA的敲除效率均在80％以上。根据网站CRISPick预测的脱靶结果显示，C-06的脱靶概率最低(图8C)，因此发明人用Guide-Seq方法对C-06的实际脱靶概率进行了评估，结果如图8D所示，两次的检测结果显示最高脱靶概率的序列相同，但脱靶的概率只有千分之四以下，且脱靶位点基本位于基因内含子区域，极低概率影响蛋白编码，综上所述，发明人选择C-06在后续实验中使用。
1.2.4 CD7 sgRNA
本发明中使用的CD7 sgRNA来自已报道的文献10，本发明人对其进行了脱靶检测。如图9所示，一次实验的脱靶检测中发现有3个序列出现的频次较高，但其中的两个位点也出现在了未使用sgRNA的对照组中，且在两者中出现的频次基本一致，所以可以判定为假阳性；而出现频次第二高的序列与sgRNA序列比起来，突变碱基的数量较多且位置离NGG比较近，所以也不太可能出现脱靶，综上所述，CD7 sgRNA出现脱靶的概率极低。
1.2.5 CIITA sgRNA筛选结果
针对CIITA基因，发明人选择了5条sgRNA进行敲除效率测试，结果如图10A所示，F-05的敲除效率最好。
发明人对F-05这条sgRNA进行了脱靶检测，结果如图10B所示，两次实验中检测到的最高脱靶概率的序列不一致且出现的概率均为0.1％左右，因此F-05的脱靶概率极低。
1.2基于Cas9蛋白敲除T细胞表面的TRAC、B2M、CD5、CD7抗原
在制备CD5-CD7 UCAR-T之前，发明人首先进行了TRAC、B2M、CD5、CD7共敲的RNP条件摸索。如图11所示，共设置了6组RNP用量以及在2个Donor的T上进行了测试，结果，在所有6个条件下，TRAC、B2M、CD5、CD7的敲除效率均在90％及以上，且在2个donor之间无明显差异，因此发明人选择用量最小的RNP组合6作为后续制备CD5-CD7 UCAR-T的条件基础。
第一次制备CD5-CD7 UCAR-T时，发明人为了保证CD5的敲除效率，在RNP组合6的基础上，将CD5的RNP用量从40/120pmol/20ul体系调高至80/150pmol/20ul体系，结果如图12A-B所示，敲除后9天用FACS检测各基因的敲除情况，结果TRAC/B2M双敲效率为97.8％，CD5/CD7双敲效率为95.8％。TRAC、B2M、CD5、CD7的敲除效率均非常高，因此发明人在后续制备CD5-CD7 UCAR-T时均采用此电转条件。
图12C为发明人第二次制备CD5-CD7 UCAR-T时KO未转毒组在敲除后4天检测的敲除结果，在未转毒的情况下，TRAC/B2M双敲效率为86.7％，CD5/CD7双敲效率为90.6％，敲除效率已经非常高，而转毒后UCAR-T还会杀死一部分CD5或CD7阳性的细胞，所以TRAC/B2M和CD5/CD7的双敲效率在UCAR-T组中还会更高。
1.3基于Cas9蛋白敲除T细胞表面的TRAC、B2M、CIITA、CD5、CD7抗原
为了让UCAR-T在体内更有生存优势，发明人还制备了另外一个版本的CD5-CD7UCAR-T,即在敲除TRAC、B2M、CD5、CD7的基础上还敲除了CIITA基因，敲除CIITA基因后UCAR-T不表达HLA-II类分子，可避免宿主体内的CD4+T细胞清除UCAR-T。
发明人在制备第二版本的CD5-CD7 UCAR-T之前，首先在Celletrix电转仪上进行了TRAC、B2M、CIITA、CD5、CD7五个基因同时敲除的预实验，RNP用量和敲除结果如图13A-B所示，在敲除后5天FACS检测各蛋白的表达情况，结果TRAC/B2M双敲效率为69.9％，TRAC/CIITA双敲效率为62.8％，CD5/CD7双敲效率为85.3％。根据分群来看，TRAC/B2M和CD5/CD7双敲效率均可以接受，但TRAC/CIITA的双敲效率稍低。
根据预实验结果，发明人在制备第二版本的CD5-CD7 UCAR-T时，加大了B2M和CIITA基因的RNP用量，如图13C-D所示，在敲除后4天FACS检测各蛋白的表达情况，结果TRAC/B2M双敲效率为87.1％，TRAC/CIITA双敲效率为85.2％，CD5/CD7双敲效率为90.3％，每个基因的敲除效率与预实验比起来均有所提升。
实施例2基于nCBE3/nCBE4蛋白敲除T细胞表面的TRBC、B2M、CIITA、CD5、CD7抗原
除了利用Cas9蛋白敲除基因，发明人还尝试了利用碱基编辑蛋白nCBE3或nCBE4在基因的外显子区域引入终止密码子来破环基因的表达。nCBE3或nCBE4蛋白是在Nikase-Cas9蛋白(只切割target链)的N端融合表达了一个胞嘧啶脱氨酶(ABOBEC)和在C端融合表达了一个或者两个尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)，Nikase-Cas9在切割target链的同时，ABOBEC可对靶向区域中non-target链的胞嘧啶(C)脱氨进而转变为尿嘧啶(U)，而UGI可以维持尿嘧啶(U)的稳定，target链被切割后发生修复，这条链所对应的G会以U为模板修复成A，DNA在之后的复制或修复中会将non-target链上的U替换为T,最终实现C到T的转变。因此，利用nCBE3或nCBE4可将外显子区域正义链上的CAA、CAG、CGA突变为TAA、TAG、TGA，或将反义链上的CCA突变为TTA(对应正义链为TAA)，提前引入终止密码子而破环蛋白的表达。
sgRNA筛选
根据以上原则，发明人针对TRBC、B2M、CD5、CD7、CIITA基因设计了多条候选sgRNA，序列信息如图14所示，其中CD7的sgRNA已有文献报道且效率很高11，因此未对CD7进行更多的sgRNA筛选。
碱基编辑的sgRNA效率测试方法同敲除的sgRNA，电转后5天通过流式染色看蛋白的表达情况。如图15所示，针对TCR的敲除，BE-A02、BE-A03的效率最高且两者相当，考虑到BE-A02已有文献报道11，发明人选择了BE-A03作为后续使用的sgRNA。
如图16A所示，针对B2M的敲除，3条sgRNA的效率都不是很理想，但也没有了更多符合要求的sgRNA选择。考虑到nCBE3或nCBE4可以切割DNA一条链的特性，发明人还尝试了利用2条相近且分别位于正义链和反义链上的sgRNA来实现基因的敲除，方案设计和结果如图16B-C所示，B-10和B-13的组合效率最高，因此发明人选择结合BE-B02和B-10、B-13来实现B2M的敲除。
针对CD5的敲除，结果如图17A所示，BE-C07的效率最高，达到了90％以上，因此发明人选择了BE-C07。发明人同时也验证了文献中使用的CD7-sgRNA，敲除效率为87％左右(图17B)。
针对CIITA的敲除，发明人测试了11条sgRNA，结果如图18所示，在敲除后第7天，BE-F04和BE-F10的效率较好，其中BE-F10的效率最好，敲除效率在80％以上，因此发明人最终选择BE-F10。
实施例3慢病毒转导及CAR阳性细胞比例检测
一般地，在T细胞激活48h后进行CAR的慢病毒转导，病毒一般按MOI＝3的用量使用，同时加入慢病毒转导增强剂Lenti-boost(100倍稀释使用)，病毒转导后24h换液，3天后即可检测CAR阳性细胞比例，CAR阳性细胞比例可以通过FACS检测细胞的EGFR或者CAR的表达情况来反应。
如图19是两次制备的CD5-CD7 UCAR-T的CAR阳细胞比例检测结果，分别通过Anti-EGFR-PE、FITC偶联的CD5和CD7抗原检测细胞的EGFR和CAR的表达情况。转毒后3天检测，一般EGFR的阳性率会高于CD5和CD7 CAR阳性率，这可能是由于前期UCAR-T杀伤CD5和CD7未敲除的细胞后CAR内吞导致，后期如day8检测时三者代表的CAR阳细胞比例就会比较一致。CD5-CD7 UCAR-T中的CAR阳性细胞由于存在自激活(杀伤CD5或CD7未被敲除的T)，因此CAR阳细胞比例会随着培养天数的增加而增加，从day3到day8 CAR阳细胞比例会增加一倍左右。
实施例4 TRAC/B2M阴选
UCAR-T细胞最重要的是避免发生免疫排斥反应，所以回输给患者的UCAR-T成品细胞通常情况下必须保证不表达TCR和HLA-I复合物，否则会发生严重的GvHD或HvGD，因此，发明人在制备CD5-CD7 UCAR-T时，一般会在第六天左右对UCAR-T细胞进行TRAC和B2M的阴选，具体步骤见上文通用方法里的“TRAC/B2M阴选”。
图20为两次制备CD5-CD7 UCAR-T期间的TRAC/B2M阴选结果，从图中可以看出，没进行阴选前的input细胞均会有TCR和B2M的少量表达，而阴选后的阴性细胞(negative)几乎不会有TCR和B2M的阳性，一般要保证TRAC/B2M双阴性细胞比例在99％以上才算合格。
实施例5通用CAR-T细胞的体外功能验证
一般地，CAR-T细胞的功能可通过体外将CAR-T细胞和肿瘤靶细胞一起共孵育，4-6小时后通过FACS检测CAR-T细胞的CD107a释放情况或者24h-48h检测肿瘤细胞的多少来反应CAR-T细胞的杀伤功能是否好。
5.1 CD107a释放检测
CD107a又称LAMP-1，是CD8+毒性T细胞和NK细胞在杀伤靶标细胞过程中释放的一种蛋白，因此可通过检测CAR-T细胞的CD107a释放情况来反应CAR-T细胞是否具有杀伤功能。
一般地，发明人会将CD5-CD7 UCAR-T与多种CD5和CD7阳性的肿瘤细胞在无细胞因子的T细胞培养基中共孵育，效靶比按CAR阳性的细胞算为1:1，共孵育4-6小时后，收集细胞进行FACS染色，用流式细胞仪分析CD8和CAR双阳性细胞中CD107a阳性的细胞比例，比例越高，说明UCAR-T被靶细胞激活的越强，分泌的肿瘤杀伤因子越多，但CD107a阳性细胞比例越高并不代表其杀伤肿瘤的能力越强，只能初步认为UCAR-T具有杀伤肿瘤细胞的能力。
如图21A-B所示，CD5-CD7 UCAR-T能被不同的肿瘤靶细胞激活而释放CD107a，而KO-T因没有CAR则不会被激活。图21B和21C是两次制备的CD5-CD7 UCAR-T与不同的肿瘤细胞共孵育4小时后，CD8和CAR双阳性细胞中CD107a阳性细胞的占比情况，不同的肿瘤细胞刺激后CD107a阳性细胞的占比不同。CD5或CD7阳性的肿瘤细胞刺激后CD107a阳性细胞的比例在50％左右，但阴性靶细胞组(Raji)和no tumor组也有20％左右的CD107a阳性细胞，这可能是由于CD5-CD7 UCAR-T的自激活导致。
5.2体外杀伤肿瘤细胞实验
制备出的UCAR-T，其杀瘤功能可以在体外进行初步鉴定。一般地，将UCAR-T和肿瘤靶细胞(稳定表达luciferase蛋白)以不同的效靶比混合后共培养24小时，通过检测共培养后细胞中的luciferase蛋白表达量来反应肿瘤细胞的存活情况，进而判断UCAR-T的杀瘤功能。
图22A-C是第一次制备的CD5-CD7 UCAR-T的杀瘤情况，图22A和22B是UCAR-T和KO-T细胞在制备期间的第7天的杀瘤检测结果，将UCAR-T和KO-T以3种效靶比和不同的肿瘤靶细胞共培养24小时后进行检测，从图可以看出KO-T不能杀伤肿瘤细胞而UCAR-T可以很好地杀伤肿瘤细胞；在低效靶比(0.2:1)下，CD5-CD7 UCAR-T杀伤双阳和单阳靶细胞的能力依次为CD5+/CD7+>CD5+/CD7->CD5-/CD7+，即双CAR-T的杀瘤能力强于单CAR-T；图22C是UCAR-T冻存复苏后24小时检测其杀瘤功能的结果，从图可以看出细胞冻存后再复苏不影响其杀瘤功能。
图22D-F是第二次制备的CD5-CD7 UCAR-T的杀瘤结果，图22D和22E分别是UCAR-T和KO-T细胞在制备期间的第10天的杀瘤检测结果，肿瘤细胞与UCAR-T共培养24小时后只有低效靶比下肿瘤细胞有残留，而与KO-T共培养24小时后几乎不会被杀死；图22F是UCAR-T冻存复苏后24小时的杀瘤结果，结果与冻存前一致。
实施例6通用CAR-T细胞表型鉴定
6.1通用CAR-T细胞的活化、分型、耗竭等指标检测
制备好的UCAR-T，在冻存前一般需要对其进行各项指标的检测，通过细胞的激活状态、分型、耗竭等指标来判断最终状态的UCAR-T是否有异常。
图23A-B展示了两次制备的CD5-CD7 UCAR-T在冻存前细胞的CD3/CD4/CD8细胞比例以及激活状态。图23A中的制剂细胞未进行TRAC/B2M的阴选，因此CD3指针的TCR复合物还有少量细胞表达，而图23B中的制剂细胞由于进行了TRAC/B2M的阴选，因此CD3染色呈完全阴性；一般来说，UCAR-T在制剂前(体外培养10-12天)，CD8阳性细胞的比例是CD4阳性细胞的2倍左右；CD5-CD7 UCAR-T中由于CAR阳性细胞存在自激活现象，所以CD25和CD69等激活maker仍会有部分表达。
图23C-D展示了两次制备的CD5-CD7 UCAR-T细胞在冻存前的细胞分型。CCR7是T细胞早期状态的maker，因此最终状态的UCAR-T细胞中CCR7阳性细胞的比例越高，理论上UCAR-T在回输到患者体内以后扩增会越好。图23C中的UCAR-T细胞是day10冻存，而图22D中的UCAR-T细胞是day12冻存，两次制备的工艺相同，从图可以看出day10冻存的细胞中CCR7阳性细胞的比例比day12冻存的高。
图24A-D展示了两次制备的CD5-CD7 UCAR-T在冻存前细胞的耗竭和早调状态，从图24A和图24B可以看出，LAG3和PD1两个耗竭maker的表达量均较低，表明最终状态的CD5-CD7 UCAR-T细胞中正在耗竭的细胞非常少；图24C和图24D中，PI和Annexin V双阳性表明细胞处于晚期凋亡状态，而PI阴性、Annexin V阳性表明细胞处于早期凋亡状态，从图可以看出最终状态的CD5-CD7 UCAR-T细胞中正在发生凋亡的细胞也很少。
综上所述，发明人制备出的CD5-CD7 UCAR-T细胞质量较好。
6.2通用CAR-T细胞的组分鉴定
除了上述的指标检测，发明人还对最终状态的UCAR-T进行了细胞组分鉴定，通过一系列的细胞maker检测，发明人发现最终状态的UCAR-T细胞中有部分CD56阳性的细胞(如图25A-B)，CD56通常认为是NK细胞的maker，但UCAR-T中的这部分细胞不表达NK的另一个maker CD16，且最终状态的UCAR-T细胞中无CD4和CD8双阴性的细胞，因此UCAR-T细胞中这部分CD56阳性的细胞被确定为NKT细胞，NKT细胞中也有部分CAR阳性的细胞，因此这部分CAR阳性的NKT细胞理论上也可以执行杀瘤功能。
不同批次的UCAR-T细胞中CD56阳性的细胞比例具有差异，范围在10％-20％左右，如图25中的A和B分别展示了两次制备的UCAR-T中的CD56阳性细胞的比例。
实施例7通用CAR-T细胞(EGFR开关)临床测试
图26展示了CD5-CD7 UCAR-T(EGFR开关)的一例临床测试结果，受试者是一名急性的T淋巴细胞白血病患者，男性，36岁，体重75kg。UCAR-T输注前给与的清淋处理是：30mg/m2的氟达拉滨和300mg/m2的环磷酰胺处理5天，然后30mg/m2的氟达拉滨和70mg/m2的马法兰再处理1天，让患者无处理休息3天后输注剂量(CAR阳性细胞)大于3.6e6/kg的CD5-CD7 UCAR-T细胞，之后每天取样检测患者外周血中CAR的拷贝数和淋巴细胞的变化情况。
如图26B所示，CD5-CD7 UCAR-T输注后患者外周血中的CAR拷贝数在2天之内有一定的减少，但2天之后开始增多，在第8天时达到峰值，之后在23天之内一直维持较高的水平；通过检测患者外周血中的淋巴细胞，发现总的UCAR-T细胞(图26C中的蓝色线)在淋巴细胞中的比例在输注后也一直在增加，第6天时达到了接近100％的比例，且CAR阳性细胞(图26C中的红色线)的扩增趋势也一致，而患者的T细胞(图26C中的黑色线)在UCAR-T输注后一直不断地减少，在第6天后已基本检测不到，以上的结果说明了发明人的CD5-CD7 UCAR-T在患者体内能很好地扩增且清除肿瘤细胞的效果非常好。
但从图26B和26C可以看出，从CD5-CD7 UCAR-T输注后的第8天起，患者外周血中的淋巴细胞已几乎全是CD5-CD7 UCAR-T，说明了患者的外周血中几乎没有自己的T和NK细胞，这就会导致患者没有正常的免疫功能，而EGFR开关对CD5-CD7 UCAR-T无效，因此此例患者后来接受了移植。
综上所述，发明人的EGFR开关版本的CD5-CD7 UCAR-T可以服务于因肿瘤负荷较高而无法做移植的T细胞淋巴瘤患者。为了拓展CD5-CD7 UCAR-T的应用范围，发明人对UCAR-T的开关做了替换改造，以期达到仅用CD5-CD7 UCAR-T就能完全治愈T细胞淋巴瘤患者的目的。
实施例8 HSV-TK分子开关的研究
8.1体外研究结果
8.1.1 CD5-CD7 UCAR-T(HSV-TK)细胞制备
鉴于EGFR开关对CD5-CD7 UCAR-T不起作用，我们尝试将EGFR替换为不依赖于患者自身免疫系统的小分子药物控制开关HSV-TK，如图27A所示，然后按激活电转(EGFR版本的工艺)和静息电转工艺分别制备了一批成品细胞(图27B-E)，图27B展示的是TRAC/B2M/CD5/CD7四基因的共敲除效率和CAR的转效，图27C展示的是细胞的分型，图27D展示的是细胞的组分。
通过比较可以发现两种工艺对TRAC/B2M/CD5/CD7四基因的共敲除效率是差不多的，只是对于静息电转工艺来说，TCR阳性的细胞比TCR阴性的细胞激活更充分，因此TCR阳性的细胞会有生长优势，若TCR细胞阴选不彻底，则残留的TCR阳性细胞比例会在后期慢慢变高(图27C)。
此外，静息电转工艺在day0时采用Pan-T阴选得到T细胞，将CD56阳性的细胞尽可能排除，因此在静息电转工艺得到的成品细胞中CD56阳性的细胞比例会低于采用CD3磁珠阳性的激活电转工艺得到的细胞(图27E)。至于细胞表型，CCR7阳性的细胞比例与细胞在体外的培养天数相关，培养天数越长，则CCR7阳性的细胞比例会越低(图27D)。
8.1.2 HSV-TK版本与EGFR版本UCAR-T之间的杀瘤效果比较
为了验证HSV-TK版本与EGFR版本UCAR-T之间的杀瘤功能是否有差异，发明人采用同一工艺在同一批次中制备出两种版本的UCAR-T，然后进行冻存和复苏，复苏24小时后与不同的肿瘤细胞以不同的效靶比共孵育24小时，通过检测肿瘤细胞的luciferase荧光值来反应UCAR-T的杀瘤能力。结果如图28所示，由同一工艺制备得到的HSV-TK和EGFR版本的CD5-CD7 UCAR-T对不同肿瘤细胞的杀伤能力是一样的，即使用不同的开关分子对CAR本身的杀瘤功能不产生影响。
8.1.3 HSV-TK联合更昔洛韦(GCV)药物对UCAR-T的清除效果测试
HSV-TK能高效地和GCV结合并对其进行一磷酸化，随后细胞内的激酶对其进行二磷酸化和三磷酸化，三磷酸化的GCV结构与细胞内的核苷极其类似，因此会竞争性地与DNA聚合酶结合或打破细胞内四种核苷的比例而抑制DNA的合成，DNA合成受阻后细胞会渐渐地凋亡。
发明人用不同浓度的GCV药物同时处理TK版本和EGFR版本的UCAR-T，每3天通过计数和FACS来检测CAR阳细胞的变化，结果如图28所示，GCV不影响EGFR版本的UCAR-T细胞生长(图29D-F)，只特异性地杀死含TK即CAR阳性的细胞(图29A-C)。GCV浓度越高，CAR阳性的细胞死的越快越多，但即使在较低浓度(0.3ug/ml)的GCV处理下，随着时间的延长，CAR阳性的细胞也会全部慢慢地死掉。
8.2动物实验结果
为了在体内验证HSV-TK版本CD5-CD7 UCAR-T和GCV的药效，发明人开展了动物实验。实验设计如图30A-B所示：一共有30只小鼠，每只小鼠在UCAR-T输入的前第7天接种5x105个CCRF肿瘤细胞，随后随机分为5组，每组6只，在肿瘤细胞接种后的第7天，给其中2组小鼠输入2x106个HSV-TK版本的UCAR-T细胞(每只小鼠)，另外2组输入2x106个EGFR版本的UCAR-T细胞，剩下的一组输入相应体积的PBS作为对照，在UCAR-T细胞输入后的第5天开始，给予HSV-TK版本和EGFR版本组中的一组小鼠输注50mg/kg的GCV，每天一次，共处理3天，然后在不同时间点通过小鼠成像观察小鼠体内肿瘤细胞的变化情况。
结果如图30B-C所示，未输入UCAR-T细胞组的小鼠在第4天(UCAR-T输入后)时体内已有较多的肿瘤细胞，而输入了UCAR-T细胞组的小鼠体内的肿瘤细胞则非常少，且输入EGFR版本和HSV-TK版本组的小鼠之间无明显差异，说明两种版本的CD5-CD7UCAR-T之间的杀瘤功能均较好且无区别；用GCV药物处理3天后，HSV-TK版本组的小鼠体内的肿瘤细胞相对于其它3组是最多的，说明GCV对此组小鼠体内的UCAR-T细胞发挥了作用，而其它3组小鼠体内的肿瘤细胞差别不大，说明GCV只特异性地杀死含HSV-TK的UCAR-T细胞。
由于在此次实验中，UCAR-T细胞输入的比较晚(正常情况下UCAR-T细胞在肿瘤细胞接种后的1-3天输入CAR-T细胞)，所以UCAR-T细胞输入时可能肿瘤细胞的数目已大于UCAR-T细胞的数目，导致UCAR-T未能杀死所有的肿瘤细胞，但从前8天的结果(图30B)以及整个实验周期中肿瘤细胞的负荷(图30C)来看，HSV-TK版本的CD5-CD7 UCAR-T和GCV的药效都是不错的。
相应地，本文至少提供了如下技术方案：
方案1：制备通用嵌合抗原受体T细胞(UCAR-T)的方法，包括：
1)利用CRISPR基因编辑系统制备如下基因被敲除的T细胞：
i)TRAC基因和/或TRBC基因；
ii)CD5基因；
iii)CD7基因；以及
2)以包括嵌合抗原受体(CAR)的编码序列的核酸分子转染所述T细胞，使其表达所述CAR。
方案2：如方案1所述的方法，其中在步骤1)中还包括敲除所述T细胞的B2M基因。
方案3：如方案1或2所述的方法，其中对所述TRAC基因的敲除所使用的sgRNA的靶序列选自SEQ ID NO：1-7所示序列及其任意组合。
方案4：如方案1-3任一项所述的方法，其中对所述B2M基因的敲除所使用的sgRNA的靶序列选自SEQ ID NO：8、9、11、12所示序列及其任意组合。
方案5：如方案1-4任一项所述的方法，其中对所述B2M基因的敲除使用两种sgRNA的组合，所述两种sgRNA的靶序列分别为SEQ ID NO：9和11所示序列。
方案6：如方案1-5任一项所述的方法，其中在步骤1)中将用于所述TRAC基因敲除和用于所述B2M基因敲除的sgRNA与Cas9蛋白混合后同时进行所述T细胞中所述TRAC基因和所述B2M基因的敲除，并且用于所述TRAC基因敲除的sgRNA的靶序列为SEQ ID NO：7所示序列。
方案7：如方案1-6任一项所述的方法，其中用于敲除所述CD5基因的sgRNA的靶序列选自SEQ ID NO：13、14、16、17、18、19所示序列及其任意组合。
方案8：如方案1-7任一项所述的方法，其中用于所述CD7基因敲除的sgRNA的靶序列为SEQ ID NO：20所示序列。
方案9：如方案1-8任一项所述的方法，其中对所述TRAC基因、所述CD5基因和所述CD7基因的敲除同时进行，用于敲除所述TRAC基因的sgRNA的靶序列为SEQ ID NO：7所示序列；用于敲除所述CD5基因的sgRNA的靶序列为SEQ ID NO：13所示序列；以及用于敲除所述CD7基因的sgRNA的靶序列为SEQ ID NO：20所示序列。
方案10：如方案1-9任一项所述的方法，其中对所述TRAC基因、所述B2M基因、所述CD5基因和所述CD7基因的敲除同时进行，用于敲除所述TRAC基因的sgRNA的靶序列为SEQID NO：7所示序列；用于敲除所述B2M基因的两种sgRNA的靶序列分别为SEQ ID NO：9和11所示系列；用于敲除所述CD5基因的sgRNA的靶序列为SEQ ID NO：13所示序列；以及用于敲除所述CD7基因的sgRNA的靶序列为SEQ ID NO：20所示序列。
方案11：如方案1-10任一项所述的方法，其中对所述TRAC基因、所述B2M基因、所述CD5基因和所述CD7基因的敲除同时进行，用于进行所述敲除的组分按比例在20μL体系中包括：
不少于30pmol的Cas9和不少于45pmol的靶向SEQ ID NO：7所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；
不少于20pmol的Cas9和不少于30pmol的靶向SEQ ID NO：9所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；
不少于20pmol的Cas9和不少于30pmol的靶向SEQ ID NO：11所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；
不少于40pmol的Cas9和不少于120pmol的靶向SEQ ID NO：13所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；以及
不少于40pmol的Cas9和不少于120pmol的靶向SEQ ID NO：20所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物。
方案12：如方案1-11任一项所述的方法，其中对所述TRAC基因、所述B2M基因、所述CD5基因和所述CD7基因的敲除同时进行，用于进行所述敲除的组分按比例在20μL体系中包括：
30pmol的Cas9和45pmol的靶向SEQ ID NO：7所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；
20pmol的Cas9和30pmol的靶向SEQ ID NO：9所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；
20pmol的Cas9和30pmol的靶向SEQ ID NO：11所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；
80pmol的Cas9和150pmol的靶向SEQ ID NO：13所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；以及
40pmol的Cas9和120pmol的靶向SEQ ID NO：20所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物。
方案13：如方案1-12任一项所述的方法，其中在步骤1)中还包括敲除所述T细胞的CIITA基因。
方案14：如方案1-13任一项所述的方法，其中用于所述CIITA基因敲除的sgRNA的靶序列为SEQ ID NO：25所示序列。
方案15：如方案1-14任一项所述的方法，其中对所述TRAC基因、所述B2M基因、所述CD5基因、所述CD7基因和所述CIITA基因的敲除同时进行，用于进行所述敲除的组分按比例在20μL体系中包括：
不少于30pmol的Cas9和不少于45pmol的靶向SEQ ID NO：7所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；
不少于20pmol的Cas9和不少于30pmol的靶向SEQ ID NO：9所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；
不少于20pmol的Cas9和不少于30pmol的靶向SEQ ID NO：11所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；
不少于80pmol的Cas9和不少于150pmol的靶向SEQ ID NO：13所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；
不少于40pmol的Cas9和不少于120pmol的靶向SEQ ID NO：20所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；以及
不少于40pmol的Cas9和不少于60pmol的靶向SEQ ID NO：25所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物。
方案16：如方案1-15任一项所述的方法，其中对所述TRAC基因、所述B2M基因、所述CD5基因、所述CD7基因和所述CIITA基因的敲除同时进行，用于进行所述敲除的组分按比例在20μL体系中包括：
30pmol的Cas9和45pmol的靶向SEQ ID NO：7所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；
25pmol的Cas9和40pmol的靶向SEQ ID NO：9所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；
25pmol的Cas9和40pmol的靶向SEQ ID NO：11所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；
80pmol的Cas9和150pmol的靶向SEQ ID NO：13所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；
40pmol的Cas9和120pmol的靶向SEQ ID NO：20所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；以及
50pmol的Cas9和80pmol的靶向SEQ ID NO：25所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物。
方案17：制备通用嵌合抗原受体T细胞(UCAR-T)的方法，包括：
1)利用使用胞嘧啶碱基编辑器制备如下基因被敲除的T细胞：
i)TRAC基因和/或TRBC基因；
ii)CD5基因；
iii)CD7基因；以及
2)以包括嵌合抗原受体(CAR)的编码序列的核酸分子转染所述T细胞，使其表达嵌合抗原受体(CAR)。
方案18：如方案17所述的方法，其中在步骤1)中还包括敲除所述T细胞的B2M基因。
方案19：如方案17或18所述的方法，其中在步骤1)中还包括敲除所述T细胞的CIITA基因。
方案20：如方案17-19任一项所述的方法，其中对所述TRAC基因的敲除所使用的sgRNA的靶序列为SEQ ID NO：26所示序列。
方案21：如方案17-20任一项所述的方法，其中对所述TRBC基因的敲除所使用的sgRNA的靶序列选自SEQ ID NO：27-31任一项所示序列及其任意组合。
方案22：如方案17-21任一项所述的方法，其中对所述B2M基因的敲除所使用的sgRNA的靶序列选自SEQ ID NO：33和34所示序列及其组合。
方案23：如方案17-22任一项所述的方法，其中对所述B2M基因的敲除使用两种sgRNA，其中所述两种sgRNA的靶序列分别为SEQ ID NO：8和9所示序列。
方案24：如方案17-23任一项所述的方法，其中用于敲除所述CD5基因的sgRNA的靶序列选自SEQ ID NO：37、39、41-46任一项所示序列及其任意组合。
方案25：如方案17-24任一项所述的方法，其中用于所述CD7基因敲除的sgRNA的靶序列为SEQ ID NO：47所示序列。
方案26：如方案17-25任一项所述的方法，其中用于所述CIITA基因敲除的sgRNA的靶序列选自SEQ ID NO：50、51、54、57任一项所示序列及其任意组合。
方案27：如方案17-26任一项所述的方法，其中所述胞嘧啶碱基编辑器为nCBE3或nCBE4蛋白。
方案28：如方案17-27任一项所述的方法，其中在以CD2/CD3/CD28抗原激活所述T细胞之前对所述TRAC基因、所述B2M基因、所述CD5基因、所述CD7基因和/或所述CIITA基因进行敲除。
方案29：如方案1-28任一项所述的方法，其中所述CAR的胞外抗原结合结构域包括第一抗原结合部分和第二抗原结合部分，所述第一抗原结合部分能够特异性结合CD7，所述第二抗原结合部分能够特异性结合CD5。
方案30：如方案1-29任一项所述的方法，其中所述第一抗原结合部分包括来自抗CD7单域抗体的重链可变区，所述重链可变区的HCDR1包括SEQ ID NO：59所示氨基酸序列、HCDR2包括SEQ ID NO：60所示氨基酸序列以及HCDR3包括SEQ ID NO：61所示氨基酸序列。
方案31：如方案1-30任一项所述的方法，所述第二抗原结合部分包括来自抗CD5单域抗体的重链可变区，所述重链可变区的HCDR1包括SEQ ID NO：63所示氨基酸序列、HCDR2包括SEQ ID NO：64所示氨基酸序列以及HCDR3包括SEQ ID NO：65所示氨基酸序列。
方案32：如方案1-31任一项所述的方法，其中所述第一抗原结合部分包括SEQ IDNO：62所示氨基酸序列。
方案33：在如方案1-32任一项所述的方法，其中所述第二抗原结合部分包括SEQID NO：66所示氨基酸序列。
方案34：如方案1-33任一项所述的方法，其中所述CAR的胞外抗原结合结构域包括SEQ ID NO：74所示氨基酸序列。
方案35：如方案1-34任一项所述的方法，其中所述CAR从氨基端到羧基端依次包括所述第一抗原结合部分、连接片段、所述第二抗原结合部分、铰链区、跨膜区、胞内共刺激结构域和胞内信号传导结构域。
方案36：如方案1-35任一项所述的方法，其中所述连接片段包括SEQ ID NO：67所示氨基酸序列；所述铰链区包括SEQ ID NO：68所示氨基酸序列；所述跨膜区包括SEQ IDNO：69所示氨基酸序列；所述胞内共刺激结构域包括SEQ ID NO：70所示氨基酸序列；所述胞内信号传导结构域包括SEQ ID NO：71所示氨基酸序列。
方案37：如方案1-36任一项所述的方法，其中所述核酸分子中还包括tEGFR或单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)的编码序列。
方案38：如方案1-37任一项所述的方法，其中所述核酸分子中的所述tEGFR或HSV-TK的编码序列的通过自剪切肽的编码序列连接在所述CAR的编码序列的下游。
方案39：如方案1-38任一项所述的方法，其中所述自剪切肽为T2A，其氨基酸序列优选为SEQ ID NO：72所示。
方案40：如方案1-39任一项所述的方法，其中还包括在步骤2)后筛选出不表达TCR和MHC-I类分子的T细胞。
方案41：如方案1-40任一项所述的方法，其中所述T细胞含有NKT细胞，例如10-20％数量比例的NKT细胞。
方案42：通过方案1-41任一项所述的方法制备的UCAR-T细胞。
方案43：药物组合物，其包括方案42所述的UCAR-T细胞和药学上可接受的载体。
方案44：方案42所述的UCAR-T细胞在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
方案45：如方案44所述的用途，其中所述癌症在其细胞表面表达CD5和/或CD7。
方案46：如方案44或45所述的用途，其中所述癌症为T细胞恶性肿瘤，如急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)和T细胞淋巴瘤。
方案47：在受试者中治疗癌症的方法，包括以治疗有效量的方案42所述的UCAR-T细胞或方案43所述的药物组合物向所述受试者给药。
方案48：如方案47所述的方法，其中所述癌症在其细胞表面表达CD5和/或CD7。
方案49：如方案48所述的方法，其中所述癌症为T细胞恶性肿瘤，如急性T淋巴细胞白血病和T细胞淋巴瘤。
方案50：如方案47或48所述的方法，其中还包括治疗后以更昔洛韦(GCV)向所述受试者给药。
方案51：药物试剂盒，包括：1)方案42所述的UCAR-T细胞或药物组合物；以及2)GCV。
本文提供的UCAR-T的优势包括但不限于：
1.采用双靶点，可避免单靶CAR-T因抗原逃逸造成的off-tumor问题，大大增加了适应症人群；
2.将CAR同时作为攻击分子，大大减弱了宿主免疫细胞对UCAR-T的清除；
3.采用健康供着的T细胞制备，一次可制备多人份，一方面患者不用等待CAR-T的制备，另一方面还大大降低了每人份的制备成本，进而可降低患者的治疗费用；
4.能够实现反复给药。
本文和附图中提到的核酸分子和蛋白分子的序列如下：
A-01 sgRNA靶序列TGTGCTAGACATGAGGTCTA(SEQ ID NO：1)
A-02 sgRNA靶序列TGGATTTAGAGTCTCTCAGC(SEQ ID NO：2)
A-03 sgRNA靶序列AGCTGGTACACGGCAGGGTC(SEQ ID NO：3)
A-04 sgRNA靶序列ATTTGTTTGAGAATCAAAAT(SEQ ID NO：4)
A-05 sgRNA靶序列ACAAAACTGTGCTAGACATG(SEQ ID NO：5)
A-06 sgRNA靶序列CTCTCAGCTGGTACACGGCA(SEQ ID NO：6)
A-XL sgRNA靶序列AGAGTCTCTCAGCTGGTACA(SEQ ID NO：7)
B-10 sgRNA靶序列GGCCGAGATGTCTCGCTCCG(SEQ ID NO：8)
B-13 sgRNA靶序列GAGTAGCGCGAGCACAGCTA(SEQ ID NO：9)
B-01 sgRNA靶序列AAGTCAACTTCAATGTCGGA(SEQ ID NO：10)
B-03 sgRNA靶序列CAGTAAGTCAACTTCAATGT(SEQ ID NO：11)
B-XL sgRNA靶序列CGTGAGTAAACCTGAATCTT(SEQ ID NO：12)
C-03 sgRNA靶序列GCTGTAGAACTCCACCACGC(SEQ ID NO：13)
C-01 sgRNA靶序列AAGCGTCAAAAGTCTGCCAG(SEQ ID NO：14)
C-05 sgRNA靶序列CTGGTGACCCAACATCCCGG(SEQ ID NO：15)
C-06 sgRNA靶序列AGACTTTTGACGCTTGACTG(SEQ ID NO：16)
C-07 sgRNA靶序列CAGCATCTGTGAAGGCACCG(SEQ ID NO：17)
C-08 sgRNA靶序列TTTCCTGAAGCAATGCTCCA(SEQ ID NO：18)
C-10 sgRNA靶序列GGCGTGGTGGAGTTCTACAG(SEQ ID NO：19)
E-01 sgRNA靶序列GGAGCAGGTGATGTTGACGG(SEQ ID NO：20)
F-01 sgRNA靶序列CCTACACAATGCGTTGCCTGG(SEQ ID NO：21)
F-02 sgRNA靶序列GCCCCTAGAAGGTGGCTACC(SEQ ID NO：22)
F-03 sgRNA靶序列GATATTGGCATAAGCCTCCC(SEQ ID NO：23)
F-04 sgRNA靶序列GAGATTCAGGCAGCTCAACG(SEQ ID NO：24)
F-05 sgRNA靶序列CCATTGCTTGAACCGTCCGG(SEQ ID NO：25)
BE-A01 sgRNA靶序列TTTCAAAACCTGTCAGTGAT(SEQ ID NO：26)
BE-A02 sgRNA靶序列CCCACCAGCTCAGCTCCACG(SEQ ID NO：27)
BE-A03 sgRNA靶序列CCACACCCAAAAGGCCACAC(SEQ ID NO：28)
BE-A04 sgRNA靶序列GCTGTCAAGTCCAGTTCTAC(SEQ ID NO：29)
BE-A05 sgRNA靶序列AGTCCAGTTCTACGGGCTCT(SEQ ID NO：30)
BE-A06 sgRNA靶序列CACCCAGATCGTCAGCGCCG(SEQ ID NO：31)
BE-B01 sgRNA靶序列ACAGCCCAAGATAGTTAAGT(SEQ ID NO：32)
BE-B02 sgRNA靶序列TTACCCCACTTAACTATCTT(SEQ ID NO：33)
BE-B03 sgRNA靶序列CTTACCCCACTTAACTATCT(SEQ ID NO：34)
NB-37 sgRNA靶序列GCCCGAATGCTGTCAGCTTC(SEQ ID NO：35)
NB-38 sgRNA靶序列TTCCTGAAGCTGACAGCATT(SEQ ID NO：36)
BE-C02 sgRNA靶序列CCTCCCACTGCTTGGAGCTC(SEQ ID NO：37)
BE-C04 sgRNA靶序列CGGCCAGCACTGTGCCGGCG(SEQ ID NO：38)
BE-C07 sgRNA靶序列ATCTTCCATTGGATTGGCAA(SEQ ID NO：39)
BE-C08 sgRNA靶序列CAAGGTGCAGAGCCGTCTGG(SEQ ID NO：40)
BE-C10 sgRNA靶序列AGGTGCAGAGCCGTCTGGTG(SEQ ID NO：41)
BE-C13 sgRNA靶序列CTCCCACCGCAGCGAGCTCC(SEQ ID NO：42)
BE-C14 sgRNA靶序列TCCTATCGAGTGCTGGACGC(SEQ ID NO：43)
BE-C15 sgRNA靶序列TGTCCCAGTGCCACGAACTT(SEQ ID NO：44)
BE-C17 sgRNA靶序列CTCCCAAAGTTCGTGGCACT(SEQ ID NO：45)
BE-C18 sgRNA靶序列GCCAGGATCCAAACCCCGC(SEQ ID NO：46)
BE-E01 sgRNA靶序列CACCTGCCAGGCCATCACGG(SEQ ID NO：47)
BE-F01 sgRNA靶序列CAGCTCACAGTGTGCCACCA(SEQ ID NO：48)
BE-F02 sgRNA靶序列TATGACCAGATGGACCTGGC(SEQ ID NO：49)
BE-F03 sgRNA靶序列ACTGGACCAGTATGTCTTCC(SEQ ID NO：50)
BE-F04 sgRNA靶序列TGTCTTCCAGGACTCCCAGC(SEQ ID NO：51)
BE-F05 sgRNA靶序列TTCAACCAGGAGCCAGCCTC(SEQ ID NO：52)
BE-F06 sgRNA靶序列CTCTGGCAAATCTCTGAGGC(SEQ ID NO：53)
BE-F07 sgRNA靶序列ACCTCCCGAGCAAACATGAC(SEQ ID NO：54)
BE-F08 sgRNA靶序列CCCACCCAATGCCCGGCAGC(SEQ ID NO：55)
BE-F09 sgRNA靶序列AGGCCATTTTGGAAGCTTGT(SEQ ID NO：56)
BE-F10 sgRNA靶序列CGCCCAGGTCCTCACGTCTG(SEQ ID NO：57)
BE-F11 sgRNA靶序列GAGCCAGCCACAGGGCCCCC(SEQ ID NO：58)
CD7 sdAb HCDR1氨基酸序列GFTFTWAW(SEQ ID NO：59)
CD7 sdAb HCDR2氨基酸序列INPSGGSP(SEQ ID NO：60)
CD7 sdAb HCDR2氨基酸序列ARKDKDD(SEQ ID NO：61)
CD7 sdAb VHH蛋白序列(CD7-FHVH10)：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTWAWMGWVRQAPGKGLEWVSSINPSGGSPYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARKDKDDWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：62)
CD5 sdAb HCDR1氨基酸序列GGTFSNYA(SEQ ID NO：63)
CD5 sdAb HCDR2氨基酸序列ISAYNGDT(SEQ ID NO：64)
CD5 sdAb HCDR3氨基酸序列ARYESMSGQDI(SEQ ID NO：65)
CD5 sdAb VHH蛋白序列(CD5-FHVH61)：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYAISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGDTKYAQRLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRNLRSDDTAVYYCARYESMSGQDIWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：66)
连接片段(linker)氨基酸序列：
GGGGGGGGGGGCTCTGGGGGGGGTGGCTCAGGTGGCGGTGGCTCT(SEQ ID NO：67)
CD8α铰链区蛋白序列：
FVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO：68)
CD8α跨膜区蛋白序列：
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN(SEQ ID NO：69)
4-1BB胞内结构域蛋白序列：
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO：70)
CD3z胞内信号结构域蛋白序列：
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQA(SEQ ID NO：71)
剪切肽T2A蛋白序列：
EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO：72)
EGFRt蛋白序列：
RKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM(SEQ ID NO：73)
通过linker串联的CD5-CD7 sdAb氨基酸序列
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTWAWMGWVRQAPGKGLEWVSSINPSGGSPYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARKDKDDWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYAISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGDTKYAQRLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRNLRSDDTAVYYCARYESMSGQDIWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：74)
参考文献：
1 Nagao,T.et al.Immunohistochemical analysis of salivary glandtumors:application for surgical pathology practice.Acta Histochem Cytochem45,269-282,doi:10.1267/ahc.12019(2012).
2 Poirot,L.et al.Multiplex Genome-Edited T-cell ManufacturingPlatform for"Off-the-Shelf"Adoptive T-cell Immunotherapies.Cancer Res 75,3853-3864,doi:10.1158/0008-5472.CAN-14-3321(2015).
3 Ren,J.et al.A versatile system for rapid multiplex genome-editedCAR T cell generation.Oncotarget 8,17002-17011,doi:10.18632/oncotarget.15218(2017).
4 Ren,J.et al.Multiplex Genome Editing to Generate Universal CAR TCells Resistant to PD1 Inhibition.Clin Cancer Res 23,2255-2266,doi:10.1158/1078-0432.CCR-16-1300(2017).
5 Scherer,L.D.,Brenner,M.K.&Mamonkin,M.Chimeric Antigen Receptors forT-Cell Malignancies.Front Oncol 9,126,doi:10.3389/fonc.2019.00126(2019).
6 Casali,P.,Burastero,S.E.,Nakamura,M.,Inghirami,G.&Notkins,A.L.Humanlymphocytes making rheumatoid factor and antibody to ssDNA belong to Leu-1+B-cell subset.Science 236,77-81,doi:10.1126/science.3105056(1987).
7 Freitas,C.M.T.,Johnson,D.K.&Weber,K.S.T Cell Calcium SignalingRegulation by the Co-Receptor CD5.Int J Mol Sci 19,doi:10.3390/ijms19051295(2018).
8 Sahillioglu,A.C.&Schumacher,T.N.Safety switches for adoptive celltherapy.Curr Opin Immunol 74,190-198,doi:10.1016/j.coi.2021.07.002(2022).
9 Xu,Y.et al.Preclinical development of T-cell receptor-engineered T-cell therapy targeting the 5T4 tumor antigen on renal cell carcinoma.CancerImmunol Immunother 68,1979-1993,doi:10.1007/s00262-019-02419-4(2019).
10 Gomes-Silva,D.et al.CD7-edited T cells expressing a CD7-specificCAR for the therapy of T-cell malignancies.Blood 130,285-296,doi:10.1182/blood-2017-01-761320(2017).
11 Georgiadis,C.et al.Base-edited CAR T cells for combinationaltherapy against T cell malignancies.Leukemia 35,3466-3481,doi:10.1038/s41375-021-01282-6(2021).

Claims (10)

1.制备通用嵌合抗原受体T细胞(UCAR-T)的方法，包括：
1)利用CRISPR基因编辑系统制备如下基因被敲除的T细胞：
i)TRAC基因和/或TRBC基因；
ii)CD5基因；
iii)CD7基因；以及
2)以包括嵌合抗原受体(CAR)的编码序列的核酸分子转染所述T细胞，使其表达所述CAR。
2.如权利要求1所述的方法，其中在步骤1)中还包括敲除所述T细胞的B2M基因和/或CIITA基因。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中：
对所述TRAC基因的敲除所使用的sgRNA的靶序列选自SEQ ID NO：1-7所示序列及其任意组合；
对所述B2M基因的敲除所使用的sgRNA的靶序列选自SEQ ID NO：8、9、11、12所示序列及其任意组合；优选地，对所述B2M基因的敲除使用两种sgRNA的组合，所述两种sgRNA的靶序列分别为SEQ ID NO：9和11所示序列；
用于敲除所述CD5基因的sgRNA的靶序列选自SEQ ID NO：13、14、16、17、18、19所示序列及其任意组合；
用于所述CD7基因敲除的sgRNA的靶序列为SEQ ID NO：20所示序列；和/或
用于所述CIITA基因敲除的sgRNA的靶序列为SEQ ID NO：25所示序列；
优选地，在步骤1)中将用于所述TRAC基因敲除和用于所述B2M基因敲除的sgRNA与Cas9蛋白混合后同时进行所述T细胞中所述TRAC基因和所述B2M基因的敲除，并且用于所述TRAC基因敲除的sgRNA的靶序列为SEQ ID NO：7所示序列；
优选地，对所述TRAC基因、所述CD5基因和所述CD7基因的敲除同时进行，用于敲除所述TRAC基因的sgRNA的靶序列为SEQ ID NO：7所示序列；用于敲除所述CD5基因的sgRNA的靶序列为SEQ ID NO：13所示序列；以及用于敲除所述CD7基因的sgRNA的靶序列为SEQ ID NO：20所示序列；
优选地，对所述TRAC基因、所述B2M基因、所述CD5基因和所述CD7基因的敲除同时进行，用于敲除所述TRAC基因的sgRNA的靶序列为SEQ ID NO：7所示序列；用于敲除所述B2M基因的两种sgRNA的靶序列分别为SEQ ID NO：9和11所示系列；用于敲除所述CD5基因的sgRNA的靶序列为SEQ ID NO：13所示序列；以及用于敲除所述CD7基因的sgRNA的靶序列为SEQ IDNO：20所示序列；
更优选地，对所述TRAC基因、所述B2M基因、所述CD5基因和所述CD7基因的敲除同时进行，用于进行所述敲除的组分按比例在20μL体系中包括：不少于30pmol的Cas9和不少于45pmol的靶向SEQ ID NO：7所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；不少于20pmol的Cas9和不少于30pmol的靶向SEQ ID NO：9所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；不少于20pmol的Cas9和不少于30pmol的靶向SEQ ID NO：11所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；不少于40pmol的Cas9和不少于120pmol的靶向SEQ ID NO：13所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；以及不少于40pmol的Cas9和不少于120pmol的靶向SEQ ID NO：20所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；
更优选地，对所述TRAC基因、所述B2M基因、所述CD5基因和所述CD7基因的敲除同时进行，用于进行所述敲除的组分按比例在20μL体系中包括：30pmol的Cas9和45pmol的靶向SEQID NO：7所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；20pmol的Cas9和30pmol的靶向SEQ ID NO：9所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；20pmol的Cas9和30pmol的靶向SEQ ID NO：11所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；80pmol的Cas9和150pmol的靶向SEQ ID NO：13所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；以及40pmol的Cas9和120pmol的靶向SEQ ID NO：20所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；
更优选地，对所述TRAC基因、所述B2M基因、所述CD5基因、所述CD7基因和所述CIITA基因的敲除同时进行，用于进行所述敲除的组分按比例在20μL体系中包括：不少于30pmol的Cas9和不少于45pmol的靶向SEQ ID NO：7所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；不少于20pmol的Cas9和不少于30pmol的靶向SEQ ID NO：9所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；不少于20pmol的Cas9和不少于30pmol的靶向SEQ ID NO：11所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；不少于80pmol的Cas9和不少于150pmol的靶向SEQ ID NO：13所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；不少于40pmol的Cas9和不少于120pmol的靶向SEQ ID NO：20所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；以及不少于40pmol的Cas9和不少于60pmol的靶向SEQ ID NO：25所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；
更优选地，对所述TRAC基因、所述B2M基因、所述CD5基因、所述CD7基因和所述CIITA基因的敲除同时进行，用于进行所述敲除的组分按比例在20μL体系中包括：30pmol的Cas9和45pmol的靶向SEQ ID NO：7所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；25pmol的Cas9和40pmol的靶向SEQ ID NO：9所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；25pmol的Cas9和40pmol的靶向SEQ ID NO：11所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；80pmol的Cas9和150pmol的靶向SEQID NO：13所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；40pmol的Cas9和120pmol的靶向SEQ IDNO：20所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物；以及50pmol的Cas9和80pmol的靶向SEQ IDNO：25所示序列的sgRNA所形成的RNP复合物。
4.制备通用嵌合抗原受体T细胞(UCAR-T)的方法，包括：
1)利用使用胞嘧啶碱基编辑器制备如下基因被敲除的T细胞：
i)TRAC基因和/或TRBC基因；
ii)CD5基因；
iii)CD7基因；以及
2)以包括嵌合抗原受体(CAR)的编码序列的核酸分子转染所述T细胞，使其表达嵌合抗原受体(CAR)。
5.如权利要求4所述的方法，其中在步骤1)中还包括敲除所述T细胞的B2M基因和/或CIITA基因。
6.如权利要求4或5所述的方法，其中：
对所述TRAC基因的敲除所使用的sgRNA的靶序列为SEQ ID NO：26所示序列；
对所述TRBC基因的敲除所使用的sgRNA的靶序列选自SEQ ID NO：27-31任一项所示序列及其任意组合；
对所述B2M基因的敲除所使用的sgRNA的靶序列选自SEQ ID NO：33和34所示序列及其组合；优选地，对所述B2M基因的敲除使用两种sgRNA，其中所述两种sgRNA的靶序列分别为SEQ ID NO：8和9所示序列；
用于敲除所述CD5基因的sgRNA的靶序列选自SEQ ID NO：37、39、41-46任一项所示序列及其任意组合；
用于所述CD7基因敲除的sgRNA的靶序列为SEQ ID NO：47所示序列；和/或
用于所述CIITA基因敲除的sgRNA的靶序列选自SEQ ID NO：50、51、54、57任一项所示序列及其任意组合；
优选地，所述胞嘧啶碱基编辑器为nCBE3或nCBE4蛋白；
优选地，在以CD2/CD3/CD28抗原激活所述T细胞之前对所述TRAC基因、所述B2M基因、所述CD5基因、所述CD7基因和/或所述CIITA基因进行敲除。
7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述CAR的胞外抗原结合结构域包括第一抗原结合部分和第二抗原结合部分，所述第一抗原结合部分能够特异性结合CD7，所述第二抗原结合部分能够特异性结合CD5；
优选地，所述第一抗原结合部分包括来自抗CD7单域抗体的重链可变区，所述重链可变区的HCDR1包括SEQ ID NO：59所示氨基酸序列、HCDR2包括SEQ ID NO：60所示氨基酸序列以及HCDR3包括SEQ ID NO：61所示氨基酸序列；所述第二抗原结合部分包括来自抗CD5单域抗体的重链可变区，所述重链可变区的HCDR1包括SEQ ID NO：63所示氨基酸序列、HCDR2包括SEQ ID NO：64所示氨基酸序列以及HCDR3包括SEQ ID NO：65所示氨基酸序列；
更优选地，所述第一抗原结合部分包括SEQ ID NO：62所示氨基酸序列；
更优选地，所述第二抗原结合部分包括SEQ ID NO：66所示氨基酸序列；
更优选地，所述CAR的胞外抗原结合结构域包括SEQ ID NO：74所示氨基酸序列。
8.如权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述核酸分子中还包括tEGFR或单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)的编码序列；优选地，所述核酸分子中的所述tEGFR或HSV-TK的编码序列的通过自剪切肽的编码序列连接在所述CAR的编码序列的下游。
9.如权利要求1-8任一项所述的方法，其中还包括在步骤2)后筛选出不表达TCR和MHC-I类分子的T细胞。
10.通过权利要求1-9任一项所述的方法制备的UCAR-T细胞。
CN202210910113.XA 2022-07-29 2022-07-29 靶向cd5和cd7的通用car-t及其应用 Pending CN117467707A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210910113.XA CN117467707A (zh) 2022-07-29 2022-07-29 靶向cd5和cd7的通用car-t及其应用
PCT/CN2023/109928 WO2024022513A1 (zh) 2022-07-29 2023-07-28 靶向cd5和cd7的通用car-t及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210910113.XA CN117467707A (zh) 2022-07-29 2022-07-29 靶向cd5和cd7的通用car-t及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117467707A true CN117467707A (zh) 2024-01-30

Family

ID=89622625

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210910113.XA Pending CN117467707A (zh) 2022-07-29 2022-07-29 靶向cd5和cd7的通用car-t及其应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN117467707A (zh)
WO (1) WO2024022513A1 (zh)

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107723275B (zh) * 2017-10-20 2020-09-04 重庆精准生物技术有限公司 通用型car-t细胞及其制备方法和应用
CN109706121A (zh) * 2019-01-25 2019-05-03 苏州茂行生物科技有限公司 一种基于碱基编辑的通用型car-t细胞及其制备方法和应用
CN112852741A (zh) * 2019-11-28 2021-05-28 华东师范大学 一种嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和细胞药物
CN112940137A (zh) * 2021-02-08 2021-06-11 广州安捷生物医学技术有限公司 一种pd-1基因敲除的靶向muc1的car-t细胞及其制备方法和应用
CN113699185A (zh) * 2021-07-28 2021-11-26 广东万海细胞生物科技有限公司 一种通用型car-t细胞的制备方法
CN114317607A (zh) * 2021-12-31 2022-04-12 西安桑尼赛尔生物医药有限公司 融合一代靶向cd7 car和二代靶向bcma的双靶点通用car-t细胞及制备方法
CN114517185B (zh) * 2022-01-17 2023-04-28 华东师范大学 嵌合抗原受体nk细胞及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2024022513A1 (zh) 2024-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10709775B2 (en) Cells for immunotherapy engineered for targeting CD38 antigen and for CD38 gene inactivation
CN116425882A (zh) 嵌合蛋白
US11505608B2 (en) Chimeric antigen receptors against multiple HLA-G isoforms
WO2019052577A1 (zh) 一种基因编辑t细胞及其用途
US20230183313A1 (en) Isolated chimeric antigen receptor, modified t cell comprising same and use thereof
US9468655B2 (en) Compositions and methods including recombinant B lymphocyte cell line including at least one endogenous gene expressing at least one endogenous membrane immunoglobulin reactive to a first antigen and including at least one exogenously incorporated nucleic acid expressing at least one exogenous secreted immunoglobulin reactive to a second antigen
JP2021532742A (ja) Ｎｅｆを含むｔ細胞及びその生成方法
CN113122503B (zh) 一种靶向t细胞淋巴瘤细胞的通用型car-t及其制备方法和应用
US9845351B2 (en) Compositions and methods including recombinant B lymphocyte cell line including an exogenously incorporated nucleic acid expressing an exogenous membrane immunoglobulin reactive to a first antigen and including an endogenous gene expressing an endogenous secreted immunoglobulin reactive to a second antigen
CN112679618B (zh) 一种靶向trbc1的人源化嵌合抗原受体、t细胞及用途
Chen et al. Rational tuning of CAR tonic signaling yields superior T-cell therapy for cancer
WO2024022513A1 (zh) 靶向cd5和cd7的通用car-t及其应用
EP4086341A1 (en) Method for purifying ucart cell and use thereof
CN113122504A (zh) 一种纯化ucart细胞的方法与应用
EP4086340A1 (en) Universal car-t targeting t-cell lymphoma cell and preparation method therefor and use thereof
RU2816370C2 (ru) Устойчивые к ритуксимабу химерные антигенные рецепторы и пути их применения
Halim Targeting of B-cell Malignancy Using Novel Parallel Chimeric Antigen Receptor (pCAR) Engineered T-cells
AU2022230441A1 (en) Fasl expression and fasr gene knockout to protect therapeutic cells from allogeneic rejection and activation-induced cell death
Waibl Polania et al. Antigen presentation by tumor-associated macrophages mediates progenitor to terminal exhaustion transition in GBM and other solid tumors
WO2022266203A1 (en) Selective targeting of host cd70+ alloreactive cells to prolong allogeneic car t cell persistence
WO2023107898A1 (en) Dual targeting of pediatric malignancies through car t-cells secreting bispecific innate immune cell engagers (bices)

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication