ES2941966T3 - Una plataforma universal para preparar un receptor de antígeno quimérico inhibidor (ICAR) - Google Patents

Una plataforma universal para preparar un receptor de antígeno quimérico inhibidor (ICAR) Download PDF

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Will Gibson
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Abstract

La presente invención proporciona un método para identificar un objetivo para preparar un receptor de antígeno quimérico inhibidor (iCAR) o un receptor de antígeno quimérico protector (pCAR) capaz de prevenir o atenuar la activación no deseada de una célula inmunitaria efectora. También se proporciona una lista de dianas iCAR, así como vectores y células inmunitarias efectoras transducidas que comprenden la molécula de ácido nucleico y métodos para el tratamiento del cáncer que comprenden la administración de las células inmunitarias efectoras transducidas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Una plataforma universal para preparar un receptor de antígeno quimérico inhibidor (ICAR)
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere al campo de la inmunoterapia contra el cáncer mediante transferencia celular adoptiva, empleando receptores de antígenos quiméricos activadores (aCAR) que reconocen antígenos expresados en la superficie de las células tumorales, CAR inhibidores (iCAR) y CAR protectores (pCAR) dirigidos a variantes alélicas de la misma u otros antígenos de la superficie celular expresados por células normales pero no por el tumor debido a la pérdida de heterocigosidad (LOH).
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La identificación de antígenos seleccionables como dianas que se expresan exclusivamente en las células tumorales pero no en el tejido sano es, sin duda, el principal desafío de la inmunoterapia contra el cáncer en la actualidad. La evidencia clínica de que las células T son capaces de erradicar las células tumorales proviene de numerosos estudios que evalúan enfoques muy diversos para aprovechar las células T para tratar el cáncer (Rosenberg y Restifo, 2015). Estos enfoques emplean trasplante de médula ósea con infusión de linfocitos de donantes, transferencia adoptiva de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), tratamiento con células T redirigidas genéticamente a antígenos preseleccionados a través de los CAR (Gross y Eshhar, 2016a) o receptores de células T (TCR), el uso de inhibidores de puntos de control inmunitarios, o vacunación activa. De estos, el uso de células T genéticamente modificadas y de diferentes estrategias para la inmunización activa implican información preexistente sobre antígenos candidatos que es probable que ejerzan una respuesta clínica duradera pero efectos adversos mínimos. Sin embargo, como se indica en el título de una revisión reciente de S. Rosenberg, "Finding suitable targets is the major obstacle to cancer gene therapy" (Rosenberg, 2014).
El concepto de usar receptores de antígenos quiméricos (o CAR) para redirigir genéticamente las células T (u otras células asesinas del sistema inmunitario, tales como las células asesinas naturales (NK) y las células asesinas inducidas por citocinas) contra los antígenos de elección de una manera independiente del MHC fue introducido por primera vez por Gross y Eshhar a fines de la década de 1980 (Gross et al., 1989). Se producen sintéticamente a partir de genes quiméricos que codifican un fragmento variable de anticuerpo monocatenario extracelular (scFv) fusionado a través de una bisagra flexible y un motivo canónico transmembrana a componentes de señalización que comprenden motivos de activación inmunorreceptor basados en tirosina de cadenas CD3-Z o FcRy capaces de activación de células T. En la actualidad, las CAR se están examinando en docenas de ensayos clínicos, y hasta ahora han mostrado una eficacia excepcionalmente alta en las neoplasias malignas de células B (Dotti et al., 2014; Gill y June, 2015; Gross y Eshhar, 2016a). La seguridad de la terapia con células CAR-T está determinada, en gran medida, por su capacidad para discriminar entre el tumor y el tejido sano. Un riesgo importante y la causa directa de los efectos autoinmunes adversos que se han informado en estudios clínicos y preclínicos es la toxicidad fuera del tumor y en la diana, que resulta de la expresión extratumoral del antígeno diana (tratado en detalle en nuestra revisión reciente (Gross y Eshhar, 2016b) y (Klebanoff et al., 2016)). Con respecto a este riesgo, los antígenos de superficie celular compartidos y no mutados, que actualmente se prueban clínica o preclínicamente para la terapia CAR, se pueden dividir generalmente en varias categorías según su distribución tisular y modo de expresión:
- Antígenos estrictamente específicos de tumor. Quizás el único miembro de este grupo que ya se está examinando clínicamente es la variante III del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFRvIII), que con frecuencia se sobreexpresa en el glioblastoma y también se encuentra en el carcinoma de pulmón no microcítico y en cánceres de próstata, mama, cabeza y cuello, y ovario, pero no en tejido normal.
- Antígenos de superficie expresados en el tumor y en tejido sano no vital. Los antígenos de CAR potenciales en este grupo son moléculas relacionadas con la diferenciación, que se restringen principalmente al linaje de células B. Destacado entre estos (y un antígeno diana en numerosos ensayos clínicos) es CD19, un pan-marcador de células B adquirido muy temprano en la diferenciación de células B e implicado en la transducción de señales por el receptor de células B (BCR). Los antígenos prostáticos de membrana constituyen otra clase de antígenos en esta categoría.
- Antígenos que son expresados típicamente por células promotoras de tumores no malignos. Uno de tales antígenos es la proteína de activación de fibroblastos (FAP), una serina proteasa de la superficie celular que es expresada casi invariablemente por los fibroblastos asociados a tumores en diversos cánceres primarios y metastásicos. Otro antígeno es el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), que se expresa en gran medida durante la angiogénesis tumoral, y normalmente se expresa en células endoteliales vasculares y linfáticas en muchos órganos vitales.
- Antígenos asociados a tumores (TAA) compartidos con tejido sano vital.
La mayoría de los otros TAA que se evalúan actualmente en estudios preclínicos y clínicos son sobreexpresados por tumores, pero también están presentes, generalmente en un nivel más bajo, en tejido normal esencial.
El amplio espectro de estrategias diseñadas para abordar la autoinmunidad en la terapia con células CAR T se puede dividir en aquellas que buscan eliminar o suprimir las células T transferidas una vez que el daño ya es evidente (medidas reactivas) y aquellas que tienen como objetivo prevenir el daño potencial en primer lugar (medidas proactivas) (Gross y Eshhar, 2016a). Los enfoques reactivos a menudo usan genes suicidas tales como la timidina cinasa del virus del herpes simple (HSV-tk) e iC9, un polipéptido de fusión que comprende una caspasa 9 humana truncada y una proteína de unión a FK506 mutada. Otros enfoques utilizan anticuerpos para eliminar selectivamente las células manipuladas que causan estragos, o, como se demostró recientemente, un agente de molécula pequeña heterodimerizante que rige el acoplamiento del resto de reconocimiento de CAR al dominio de señalización intracelular (Wu et al., 2015). Si bien algunas medidas proactivas están diseñadas para limitar la persistencia o función in vivo de las células CAR T (por ejemplo, el uso de electroporación de ARNm para la administración de genes), otras abordan directamente el desafío crítico de aumentar la selectividad antigénica de los CAR terapéuticos para evitar el daño al tejido no tumoral. Dos de ellas suscitan especial interés, ya que pueden ampliar potencialmente la gama de antígenos tumorales a los que las células CAR T pueden dirigirse de forma segura:
- Reconocimiento de antígeno combinatorio (o 'dividido'). Si bien los verdaderos antígenos de superficie específicos de tumores son raros, las combinaciones de dos antígenos diferentes, no necesariamente clasificados como antígenos asociados a tumores, que se expresan conjuntamente en un tumor determinado, pueden definir una nueva firma específica de tumor. Restringir la actividad de las células CAR T a tales pares de antígenos proporciona un indicador de seguridad crítico y, en consecuencia, amplía el espectro de dianas específicas de tumores y puede tener un valor terapéutico sustancial. Los CAR de segunda y tercera generación se han diseñado para proporcionar a las células T terapéuticas señales de activación y coestimulación al acoplarse a un solo antígeno mediante la unión de dos o más porciones de señalización en el endodominio de CAR. Sin embargo, si la activación y la coestimulación se dividen en la misma célula T entre dos CAR, cada uno específico para un antígeno diferente, entonces la respuesta completa requeriría la cooperación de las dos señales complementarias que solo podrían lograrse en presencia de los dos antígenos. Este principio se ha demostrado en varios estudios preclínicos (Kloss et al., 2013; Lanitis et al., 2013; Wilkie et al., 2012; documento WO 2016/126608).
Si bien es indudable que es intrigante, este enfoque aún enfrenta la necesidad de una titulación meticulosa de la magnitud de las señales de activación y coestimulación para alcanzar el equilibrio óptimo que solo permitiría una reactividad eficaz de las células T en la diana y en el tumor. Todavía es cuestionable si dicho equilibrio se puede lograr de forma rutinaria en el entorno clínico.
Recientemente se publicó un enfoque completamente nuevo para limitar la respuesta de las células T solo a las células diana que expresan una combinación única de dos antígenos (Roybal et al., 2016a). Su elemento central funciona como un 'interruptor genético' que explota el modo de acción de varios receptores de la superficie celular, incluido Notch. Después de la unión de un receptor de este tipo a su ligando, sufre una doble escisión que da como resultado la liberación de su dominio intracelular que se transloca al núcleo celular, en el que funciona como un factor de transcripción. La implementación de este principio implica la introducción conjunta de dos genes en las células T efectoras. El primero se expresa de forma constitutiva, y codifica tal receptor escindible quimérico equipado con un resto de reconocimiento dirigido al primer antígeno. La interacción con este antígeno en la superficie de una célula diana activará la expresión del segundo gen que codifica un CAR convencional que se dirige al segundo antígeno. La célula diana morirá únicamente si también coexpresa este segundo antígeno.
CAR inhibidores. La reactividad fuera del tumor se produce cuando el antígeno diana de las células asesinas redirigidas por CAR se comparte con el tejido normal. Si este tejido normal expresa otro antígeno de superficie que no está presente en el tumor, entonces la coexpresión en las células modificadas genéticamente de un CAR adicional dirigido contra este antígeno no compartido, que alberga un resto de señalización inhibidor, puede evitar la activación de las células T por parte del tejido normal.
En lugar de un dominio activador (tal como FcRy o CD3-Z), un iCAR posee un dominio de señalización derivado de un receptor inhibidor que puede antagonizar la activación de las células T, tal como CTLA-4, PD-1 o un receptor inhibidor de NK. Si el tejido normal que comparte el antígeno del aCAR candidato con el tumor expresa otro antígeno de superficie que no comparte con el tumor, un iCAR expresado por la misma célula T que se dirige contra este antígeno no compartido puede proteger el tejido normal. (Fig. 1).
A diferencia de las células T, cada una de las cuales expresa un único TCR bicatenario codificado por segmentos de genes reorganizados somáticamente, las células NK no expresan receptores específicos de antígeno. En su lugar, las células NK expresan una serie de receptores inhibidores y activadores codificados por la línea germinal que reconocen respectivamente múltiples ligandos inhibidores y activadores en la superficie celular de células infectadas y sanas. Se ha descrito la capacidad protectora de un iCAR basado en receptores inhibidores de NK, tal como KIR3DL1 (documento US 9.745.368). KIR3DL1 y otros receptores inhibidores de NK funcionan desmantelando la sinapsis inmunológica de manera rápida y completa. Existen pruebas convincentes de que una sola célula NK puede salvar a una célula resistente que expresa tanto ligandos inhibidores como activadores, y sin embargo puede matar a una célula susceptible a la que se acopla simultáneamente, que expresa solo los ligandos activadores (Abeyweera et al., 2011; Eriksson et al., 1999; Treanor et al., 2006; Vyas et al., 2001). Esta habilidad exquisita se rige por la diferente organización espacial de las moléculas de transducción de señales formadas en cada una de las respectivas sinapsis inmunitarias que, en consecuencia, afecta la exocitosis de los gránulos citolíticos (ver (Huse et al., 2013) para revisión). Más recientemente, Fedorov et al.(Fedorov et al., 2013a; documento WO 2015/142314) emplearon con éxito para este fin los dominios intracelulares de PD-1 y CTLA-4. A diferencia de los receptores inhibidores de NK, los efectos reguladores de estos iCAR afectaron a toda la célula. Sin embargo, estos efectos fueron temporales, y permitieron la activación completa de las células T tras el encuentro posterior con células diana que expresaban únicamente el antígeno de aCAR.
La distribución tisular de los antígenos a los que se dirigen iCAR y aCAR dicta el modo de acción óptimo del iCAR requerido para conferir la máxima seguridad sin comprometer la eficacia clínica. Por ejemplo, si los sitios anatómicos del tumor y el o los tejidos normales a proteger no se intersecan, la inhibición transitoria (similar a CTLA-4 o PD-1) probablemente será suficiente. Sin embargo, si estos sitios se solapan, sólo la inhibición limitada a la sinapsis (p. ej., un modo de acción de NK) evitará la parálisis constante de las células terapéuticas, y permitirá su actividad tumoricida eficaz. El enfoque de usar los iCAR para reducir la reactividad fuera del tumor en la diana adolece de una grave falta de antígenos regulados a la baja en las células tumorales pero presentes en el tejido normal.
La secuenciación de próxima generación (NGS) permite la determinación de la secuencia de ADN de todos los genes que codifican proteínas (~1% del genoma completo) en una biopsia tumoral dada y la comparación del 'exoma' del cáncer con el de un tejido sano (generalmente de glóbulos blancos) del mismo paciente. La secuenciación del exoma se puede completar varios días después de la extracción de la biopsia, y a un coste relativamente bajo. Paralelamente, el análisis del transcriptoma (RNA-seq) puede proporcionar información complementaria sobre los genes que son expresados realmente por la misma muestra celular.
Cada vez es más claro que el panorama mutacional de cada tumor individual es único (Lawrence et al., 2013; Vogelstein et al., 2013). Como resultado de mutaciones no sinónimas, la célula tumoral puede presentar potencialmente un conjunto privado de neopéptidos al sistema inmunitario del paciente en uno o más de sus productos de HLA. De hecho, se están realizando enormes esfuerzos en los últimos años para identificar neoepítopos específicos de tumores que puedan ser reconocidos por el repertorio de células T CD8 o CD4 del propio paciente y sirvan como dianas para la inmunoterapia (para una revisión, véanse (Blankenstein et al., 2015; Van Buuren et al., 2014; Heemskerk et al., 2013; Overwijk et al., 2013; Schumacher y Schreiber, 2015)). Sin embargo, los hallazgos acumulativos sugieren que las inmunoterapias de células T basadas en neoantígenos tienen más probabilidades de ser eficaces en los cánceres que muestran una mayor carga mutacional, tales como melanoma y cánceres de pulmón, pero a menudo pueden no mostrar beneficios en la mayoría de los cánceres con menos mutaciones (Savage, 2014; Schumacher y Schreiber, 2015). Además, la considerable heterogeneidad intratumoral (Burrell et al., 2013) implica el co-direccionamiento simultáneo contra varios antígenos para evitar la aparición de variantes de pérdida de mutación, una tarea que se vuelve cada vez más exigente en vista de la escasez de neopéptidos inmunogénicos útiles.
En general, la necesidad urgente de identificar dianas adecuadas para la inmunoterapia contra el cáncer a través de la transferencia adoptiva de células asesinas redirigidas genéticamente aún no se ha satisfecho en gran medida.
BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN
En algunos aspectos, la presente invención proporciona un método para identificar una diana para preparar un receptor de antígeno quimérico inhibidor (iCAR) o un receptor de antígeno quimérico protector (pCAR) capaz de prevenir o atenuar la activación no deseada de una célula inmunitaria efectora, en el que la diana se identifica por un método que comprende:
(i) identificar un gen con al menos dos alelos expresados que codifica una proteína que comprende un epítopo polimórfico extracelular;
(ii) determinar que al menos uno de los alelos expresados exhibe un cambio de secuencia de aminoácidos en la secuencia del epítopo polimórfico extracelular con respecto a una secuencia de referencia del epítopo polimórfico extracelular;
(iii) determinar que el gen está ubicado en una región cromosómica que sufre pérdida de heterocigosidad (LOH) en un tipo de tumor; y
(iv) determinar que el gen se expresa en el tejido de origen del tipo de tumor en el que se encontró que la región cromosómica experimentaba LOH.
En algunas realizaciones, la posición de LOH se selecciona del grupo que consiste en una sustitución, eliminación e inserción. En algunas realizaciones, la posición de LOH es un SNP. En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular es un gen HLA.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular es un gen HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-G, HLA-E, HLA-F, HLA-K, HLA-L, HLA-DM, HLA-DO, HLA-DP, HLA_DQ, o HLA-DR En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular es un gen HLA-A. En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular es un gen HLA-B. En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular es un gen HLA-C. En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular es un gen HLA-G. En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular es un gen HLA-E. En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular es un gen HLA-F. En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular es un gen HLA-K. En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular es un gen HLA-L. En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular es un gen HLA-DM. En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular es un gen HLA-DO. En algunas realizaciones, el epítopo polimórfico extracelular es un gen HLA-DP. En algunas realizaciones, el epítopo polimórfico extracelular es un gen HLA_DQ. En algunas realizaciones, el epítopo polimórfico extracelular es un gen HLA-DR.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 1. En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se selecciona del grupo que consiste en ABCA4, ADAM30, AQP10, ASTN1, C1orf101, CACNA1S, CATSPER4, CD101, CD164L2, CD1A, CD1C, CD244, CD34, CD46, CELSR2, CHRNB2, CLCA2, CLDN19, CLSTN1, CR1, CR2, CRB1, CSF3R, CSMD2, ECE1, ELTD1, EMC1, EPHA10, EPHA2, EPHA8, ERMAP, FCAMR, FCER1A, FCGR1B, FCGR2A, FCGR2B, FCGR3A, FCRL1, FCRL3, FCRL4, FCRL5, FCRL6, GJB4, GPA33, GPR157, GPR37L1, GPR88, HCRTR1, IGSF3, IGSF9, IL22RA1, IL23R, ITGA10, KIAA1324, KIAA2013, LDLRAD2, LEPR, LGR6, LRIG2, LRP8, LRRC52, LRRC8B, LRRN2, LY9, MIA3, MR1, MUC1, MXRA8, NCSTN, NFASC, NOTCH2, NPR1, NTRK1, OPN3, OR10J1, OR10J4, OR10K1, OR10R2, OR10T2, OR10X1, OR11L1, OR14A16, OR14I1, OR14K1, OR2AK2, OR2C3, OR2G2, OR2G3, OR2L2, OR2M7, OR2T12, OR2T27, OR2T1, OR2T3, OR2T29, OR2T33, OR2T34, OR2T35, OR2T3, OR2T4, OR2T5, OR2T6, OR2T7, OR2T8, OR2W3, OR6F1, OR6K2, OR6K3, OR6K6, OR6N1, OR6P1, OR6Y1, PDPN, PEAR1, PIGR, PLXNA2, PTCH2, PTCHD2, PTGFRN, PTPRC, PTPRF, PTGFRN, PVRL4, RHBG, RXFP4, S1PR1, SCNN1D, SDC3, SELE, SELL, SELP, SEMA4A, SEMA6C, SLAMF7, SLAMF9, SLC2A7, SLC5A9, TACSTD2, TAS1 R2, TIE1, TLR5, TMEM81, TNFRSF14, TNFRSF1B, TRABD2B, USH2A, VCAM1, y ZP4.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 2. En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se selecciona del grupo que consiste en ABCG5, ALK, ASPRV1, ATRAID, CD207, CD8B, CHRNG, CLEC4F, CNTNAP5, CRIM1, CXCR1, DNER, DPP10, EDAR, EPCAM, GPR113, GPR148, GPR35, GPR39, GYPC, IL1RL1, ITGA4, ITGA6, ITGAV, LCT, LHCGR, LRP1B, LRP2, LY75, MARCO, MERTK, NRP2, OR6B2, PLA2R1, PLB1, PROKR1, PROM2, SCN7A, SDC1, SLC23A3, SLC5A6, TGOLN2, THSD7B, TM4SF20, TMEFF2, TMEM178A, TPO, y TRABD2A.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 3. En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se selecciona del grupo que consiste en ACKR2, ALCAM, ANO10, ATP13A4, BTLA, CACNA1 D, CACNA2D2, CACNA2D3, CASR, CCRL2, CD200, CD200R1, CD86, CD96, CDCP1, CDHR4, CELSR3, CHL1, CLDN11, CLDN18, CLSTN2, CSPG5, CX3CR1, CXCR6, CYP8B1, DCBLD2, DRD3, EPHA6, EPHB3, GABRR3, GP5, GPR128, GPR15, GPR27, GRM2, GRM7, HEG1, HTR3C, HTR3D, HTR3E, IGSF11, IL17RC, IL17RD, IL17RE, IL5RA, IMPG2, ITGA9, ITGB5, KCNMB3, LRIG1, LRRC15, LRRN1, MST1 R, NAALADL2, NRROS, OR5AC1, OR5H1, OR5H14, OR5H15, OR5H6, OR5K2, OR5K3, OR5K4, PIGX, PLXNB1, PLXND1, PRRT3, PTPRG, ROBO2, RYK, SEMA5B, SIDT1, SLC22A14, SLC33A1, SLC4A7, SLITRK3, STAB1, SUSD5, TFRC, TLR9, TMEM108, TMEM44, TMPRSS7, TNFSF10, UPK1B, VIPR1, y ZPLD1.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 4. En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se selecciona del grupo que consiste en ANTXR2, BTC, CNGA1, CORIN, EGF, EMCN, ENPEP, EPHA5, ERVMER34-1, EVC2, FAT1, FAT4, FGFRL1, FRAS1, GPR125, GRID2, GYPA, GYPB, KDR, KIAA0922, KLB, MFSD8, PARM1, PDGFRA, RNF150, TENM3, TLR10, TLR1, TLR6, TMEM156, TMPRSS11A, TMPRSS11B, TMPRSS11 E, TMPRSS11 F, UGT2A1, y UNC5C.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 5. En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se selecciona del grupo que consiste en ADAM19, ADRB2, BTNL3, BTNL8, BTNL9, C5orf15, CATSPER3, CD180, CDH12, CDHR2, COL23A1, CSF1R, F2RL2, FAM174A, FAT2, FGFR4, FLT4, GABRA6, GABRG2, GPR151, GPR98, GRM6, HAVCR1, HAVCR2, IL31RA, IL6ST, IL7R, IQGAP2, ITGA1, ITGA2, KCNMB1, LIFR, LNPEP, MEGF10, NIPAL4, NPR3, NRG2, OR2V1, OR2Y1, OSMR, PCDH12, PCDH1, PCDHA1, PCDHA2, PCDHA4, PCDHA8, PCDHA9, PCDHB10, PCDHB11, PCDHB13, PCDHB14, PCDHB15, PCDHB16, PCDHB2, PCDHB3, PCDHB4, PCDHB5, PCDHB6, PCDHGA1, PCDHGA4, PDGFRB, PRLR, SEMA5A, SEMA6A, SGCD, SLC1A3, SLC22A4, SLC22A5, SLC23A1, SLC36A3, SLC45A2, SLC6A18, SLC6A19, SLCO6A1, SV2C, TENM2, TIMD4, y UGT3A1.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 6. En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se selecciona del grupo que consiste en BAI3, BTN1A1, BTN2A1, BTN2A2, BTN3A1, BTN3A2, BTNL2, CD83, DCBLD1, DLL1, DPCR1, ENPP1, ENPP3, ENPP4, EPHA7, GABBR1, GABRR1, GCNT6, GFRAL, GJB7, GLP1 R, GPR110, GPR111, GPR116, GPR126, GPR63, GPRC6A, HFE, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DOA, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQA2, HLA-DQB1, HLA-DQB2, HLA-DRB1, HLA-DRB5, HLA-E, HLA-F, HLA-G, IL20RA, ITPR3, KIAA0319, LMBRD1, LRFN2, LRP11, MAS1L, MEP1A, MICA, MICB, MOG, MUC21, MUC22, NCR2, NOTCH4, OPRM1, OR10C1, OR12D2, OR12D3, OR14J1, OR2B2, OR2B6, OR2J1, OR2W1, OR5V1, PDE10A, PI16, PKHD1, PTCRA, PTK7, RAET1E, RAET1G, ROS1, SDIM1, SLC16A10, SLC22A1, SLC44A4, TAAR2, TREM1, TREML1, y TREML2.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 7. En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se selecciona del grupo que consiste en AQP1, C7orf50, CD36, CDHR3, CNTNAP2, DPP6, EGFR, EPHA1, EPHB6, ERVW-1, GHRHR, GJC3, GPNMB, GRM8, HUS1, HYAL4, KIAA1324L, LRRN3, MET, MUC12, MUC17, NPC1L1, NPSR1, OR2A12, OR2A14, OR2A25, OR2A42, OR2A7, OR2A2, OR2AE1, OR2F2, OR6V1, PILRA, PILRB, PKD1L1, PLXNA4, PODXL, PTPRN2, PTPRZ1, RAMP3, SLC29A4, SMO, TAS2R16, TAS2R40, TAS2R4, TFR2, THSD7A, TMEM213, TTYH3, ZAN, y ZP3.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 8. En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se selecciona del grupo que consiste en ADAM18, ADAM28, ADAM32, ADAM7, ADAM9, ADRA1A, CDH17, CHRNA2, CSMD1, CSMD3, DCSTAMP, FZD6, GPR124, NRG1, OR4F21, PKHD1L1, PRSS55, SCARA3, SCARA5, SDC2, SLC10A5, SLC39A14, SLC39A4, SLCO5A1, TNFRSF10A, y TNFRSF10B.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 9. En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se selecciona del grupo que consiste en ABCA1, AQP7, ASTN2, C9orf135, CA9, CD72, CNTNAP3B, CNTNAP3, CRB2, ENTPD8, GPR144, GRIN3A, IZUMO3, KIAA1161, MAMDC4, MEGF9, MUSK, NOTCH1, OR13C2, OR13C3, OR13C5, OR13C8, OR13C9, OR13D1, OR13F1, OR1B1, OR1J2, OR1K1, OR1L1, OR1L3, OR1L6, OR1L8, OR1N1, OR1N2, OR1Q1, OR2S2, PCSK5, PDCD1LG2, PLGRKT, PTPRD, ROR2, SEMA4D, SLC31A1, TEK, TLR4, TMEM2, y VLDLR.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 10. En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se selecciona del grupo que consiste en ABCC2, ADAM8, ADRB1, ANTXRL, ATRNL1, C10orf54, CDH23, CDHR1, CNNM2, COL13A1, COL17A1, ENTPD1, FZD8, FGFR2, GPR158, GRID1, IL15RA, IL2RA, ITGA8, ITGB1, MRC1, NRG3, NPFFR1, NRP1, OPN4, PCDH15, PKD2L1, PLXDC2, PRLHR, RET, RGR, SLC16A9, SLC29A3, SLC39A12, TACR2, TCTN3, TSPAN15, UNC5B, y VSTM4.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 11. En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se selecciona del grupo que consiste en AMICA1, ANO1, ANO3, APLP2, C11orf24, CCKBR, CD248, CD44, CD5, CD6, CD82, CDON, CLMP, CRTAM, DCHS1, DSCAML1, FAT3, FOLH1, GDPD4, GDPD5, GRIK4, HEPHL1, HTR3B, IFITM10, IL10RA, KIRREL3, LGR4, LRP4, LRP5, LRRC32, MCAM, MFRP, MMP26, MPEG1, MRGPRE, MRGPRF, MRGPRX2, MRGPRX3, MRGPRX4, MS4A4A, MS4A6A, MTNR1B, MUC15, NAALAD2, NAALADL1, NCAM1, NRXN2, OR10A2, OR10A5, OR10A6, OR10D3, OR10G4, OR10G7, OR10G8, OR10G9, OR10Q1, OR10S1, OR1S1, OR2AG1, OR2AG2, OR2D2, OR4A47, OR4A15, OR4A5, OR4C11, OR4C13, OR4C15, OR4C16, OR4C3, OR4C46, OR4C5, OR4D6, OR4A8P, OR4D9, OR4S2, OR4X1, OR51E1, OR51L1, OR52A1, OR52E1, OR52E2, OR52E4, OR52E6, OR52I1, OR52I2, OR52J3, OR52L1, OR52N1, OR52N2, OR52N4, OR52W1, OR56B1, OR56B4, OR5A1, OR5A2, OR5AK2, OR5AR1, OR5B17, OR5B3, OR5D14, OR5D16, OR5D18, OR5F1, OR5I1, OR5L2, OR5M11, OR5M3, OR5P2, OR5R1, OR5T2, OR5T3, OR5W2, OR6A2, OR6T1, OR6X1, OR8A1, OR8B12, OR8B2, OR8B3, OR8B4, OR8D1, OR8D2, OR8H1, OR8H2, OR8H3, OR8I2, OR8J1, OR8J2, OR8J3, OR8K1, OR8K3, OR8K5, OR8U1, OR9G1, OR9G4, OR9Q2, P2RX3, PTPRJ, ROBO3, SIGIRR, SLC22A10, SLC3A2, SLC5A12, SLCO2B1, SORL1, ST14, SYT8, TENM4, TMEM123, TMEM225, TMPRSS4, TMPRSS5, TRIM5, TRPM5, TSPAN18, y ZP1.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 12. En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se selecciona del grupo que consiste en ANO4, AVPR1A, BCL2L14, CACNA2D4, CD163, CD163L1, CD27, CD4, CLEC12A, CLEC1B, CLEC2A, CLEC4C, CLEC7A, CLECL1, CLSTN3, GPR133, GPRC5D, ITGA7, ITGB7, KLRB1, KLRC2, KLRC3, KLRC4, KLRF1, KLRF2, LRP1, LRP6, MANSC1, MANSC4, OLR1, OR10AD1, OR10P1, OR2AP1, OR6C1, OR6C2, OR6C3, OR6C4, OR6C6, OR6C74, OR6C76, OR8S1, OR9K2, ORAI1, P2RX4, P2RX7, PRR4, PTPRB, PTPRQ, PTPRR, SCNN1A, SELPLG, SLC2A14, SLC38A4, SLC5A8, SLC6A15, SLC8B1, SLCO1A2, SLCO1B1, SLCO1B7, SLCO1C1, SSPN, STAB2, TAS2R10, TAS2R13, TAS2R14, TAS2R20, TAS2R30, TAS2R31, TAS2R42, TAS2R43, TAS2R46, TAS2R7, TMEM119, TMEM132B, TMEM132C, TMEM132D, TMPRSS12, TNFRSF1A, TSPAN8, y VSIG10.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 13. En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se selecciona del grupo que consiste en ATP4B, ATP7B, FLT3, FREM2, HTR2A, KL, PCDH8, RXFP2, SGCG, SHISA2, SLC15A1, SLITRK6, y TNFRSF19.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 14. En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se selecciona del grupo que consiste en ADAM21, BDKRB2, C14orf37, CLEC14A, DLK1, FLRT2, GPR135, GPR137C, JAG2, LTB4R2, MMP14, OR11G2, OR11H12, OR11H6, OR4K1, OR4K15, OR4K5, OR4L1, OR4N2, OR4N5, SLC24A4, y SYNDIG1L.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 15. En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se selecciona del grupo que consiste en ANPEP, CD276, CHRNA7, CHRNB4, CSPG4, DUOX1, DUOX2, FAM174B, GLDN, IGDCC4, ITGA11, LCTL, LTK, LYSMD4, MEGF11, NOX5, NRG4, OCA2, OR4F4, OR4M2, OR4N4, PRTG, RHCG, SCAMP5, SEMA4B, SEMA6D, SLC24A1, SLC24A5, SLC28A1, SPG11, STRA6, TRPM1, y TYRO3.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 16. En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se selecciona del grupo que consiste en ATP2C2, CACNA1H, CD19, CDH11, CDH15, CDH16, CDH3, CDH5, CNGB1, CNTNAP4, GDPD3, GPR56, GPR97, IFT140, IL4R, ITFG3, ITGAL, ITGAM, ITGAX, KCNG4, MMP15, MSLNL, NOMO1, NOMO3, OR2C1, PIEZO1, PKD1, PKD1L2, QPRT, SCNN1B, SEZ6L2, SLC22A31, SLC5A11, SLC7A6, SPN, TMC5, TMC7, TMEM204, TMEM219, y TMEM8A.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 17. En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se selecciona del grupo que consiste en ABCC3, ACE, AOC3, ARL17B, ASGR2, C17orf80, CD300A, CD300C, CD300E, CD300LF, CD300LG, CHRNB1, CLEC10A, CNTNAP1, CPD, CXCL16, ERBB2, FAM171A2, GCGR, GLP2R, GP1BA, GPR142, GUCY2D, ITGA2B, ITGA3, ITGAE, ITGB3, KCNJ12, LRRC37A2, LRRC37A3, LRRC37A, LRRC37B, MRC2, NGFR, OR1A2, OR1D2, OR1G1, OR3A1, OR3A2, OR4D1, OR4D2, RNF43, SCARF1, SCN4A, SDK2, SECTM1, SEZ6, SHPK, SLC26A11, SLC5A10, SPACA3, TMEM102, TMEM132E, TNFSF12, TRPV3, TTYH2, y TUSC5.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 18. En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se selecciona del grupo que consiste en APCDD1, CDH19, CDH20, CDH7, COLEC12, DCC, DSC1, DSG1, DSG3, DYNAP, MEP1B, PTPRM, SIGLEC15, y TNFRSF11A.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 19. En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se selecciona del grupo que consiste en ABCA7, ACPT, BCAM, C19orf38, C19orf59, C5AR1, CATSPERD, CATSPERG, CD22, CD320, CD33, CD97, CEACAM19, CEACAM1, CEACAM21, CEACAM3, CEACAM4, CLEC4M, DLL3, EMR1, EMR2, EMR3, ERVV-1, ERVV-2, FAM187B, FCAR, FFAR3, FPR1, FXYD5, GFY, GP6, GPR42, GRIN3B, ICAM3, IGFLR1, IL12RB1, IL27RA, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIRREL2, KISS1R, LAIR1, LDLR, LILRA1, LILRA2, LILRA4, LILRA6, LILRB1, LILRB2, LILRB3, LILRB4, LILRB5, LINGO3, LPHN1, LRP3, MADCAM1, MAG, MEGF8, MUC16, NCR1, NOTCH3, NPHS1, OR10H1, OR10H2, OR10H3, OR10H4, OR1I1, OR2Z1, OR7A10, OR7C1, OR7D4, OR7E24, OR7G1, OR7G2, OR7G3, PLVAP, PTGIR, PTPRH, PTPRS, PVR, SCN1B, SHISA7, SIGLEC10, SIGLEC11, SIGLEC12, SIGLEC5, SIGLEC6, SIGLEC8, SIGLEC9, SLC44A2, SLC5A5, SLC7A9, SPINT2, TARM1, TGFBR3L, TMC4, TMEM91, TMEM161A, TMPRSS9, TNFSF14, TNFSF9, TRPM4, VN1R2, VSIG10L, VSTM2B, y ZNRF4.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 20. En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se selecciona del grupo que consiste en ABHD12, ADAM33, ADRA1D, APMAP, ATRN, CD40, CD93, CDH22, CDH26, CDH4, FLRT3, GCNT7, GGT7, JAG1, LRRN4, NPBWR2, OCSTAMP, PTPRA, PTPRT, SEL1L2, SIGLEC1, SIRPA, SIRPB1, SIRPG, SLC24A3, SLC2A10, SLC4A11, SSTR4, y THBD.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 21. En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se selecciona del grupo que consiste en CLDN8, DSCAM, ICOSLG, IFNAR1, IFNGR2, IGSF5, ITGB2, KCNJ15, NCAM2, SLC19A1, TMPRSS15, TMPRSS2, TMPRSS3, TRPM2, y UMODL1.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 22. En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se selecciona del grupo que consiste en CACNA1I, CELSR1, COMT, CSF2RB, GGT1, GGT5, IL2RB, KREMEN1, MCHR1, OR11H1, P2RX6, PKDREJ, PLXNB2, SCARF2, SEZ6L, SSTR3, SUSD2, TMPRSS6, y TNFRSF13C.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma X. En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se selecciona del grupo que consiste en ATP6AP2, ATP7A, CNGA2, EDA2R, FMR1NB, GLRA4, GPR112, GUCY2F, HEPH, P2RY10, P2RY4, PLXNA3, PLXNB3, TLR8, VSIG4, y XG.
En algunas realizaciones, el tumor se selecciona del grupo que consiste en un tumor de mama, un tumor de próstata, un tumor de ovario, un tumor de cuello uterino, un tumor de piel, un tumor pancreático, un tumor colorrectal, un tumor renal, un tumor hepático, un tumor cerebral, un linfoma, una leucemia, un tumor de pulmón, y un glioma.
En algunas realizaciones, el tumor se selecciona del grupo que consiste en un tumor de glándula suprarrenal, un tumor de riñón, un melanoma, DLBC, un tumor de mama, un sarcoma, un tumor de ovario, un tumor de pulmón, un tumor de vejiga, y un tumor de hígado. En algunas realizaciones, el tumor de la glándula suprarrenal es un carcinoma adrenocortical. En algunas realizaciones, el tumor renal es un carcinoma de células renales cromófobas. En algunas realizaciones, el melanoma es melanoma uveal.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Fig. 1 muestra el concepto de los iCAR (tomado de (Fedorov et al., 2013a).
Fig. 2 muestra el diseño molecular y el modo de acción de aCAR/pCAR. Se espera que la unión del pCAR a su antígeno en células normales, ya sea que expresen el antígeno de aCAR o no, dé como resultado un RIP rápido y la ruptura del polipéptido en 3 fragmentos separados.
Figs. 3A-C muestran el porcentaje de muestras tumorales que experimentan LOH en la región cromosómica que codifica el locus de HLA clase I. A. HLA-G, B. HLA-A, C. ZNRD1, en tipos de tumores de la base de datos TCGA. Cromófobo renal [KICH], carcinoma adrenocortical [ACC], adenocarcinoma pancreático [PAAD], sarcoma [SARC], carcinoma renal de células papilares [KIRP], carcinoma esofágico [ESCA], carcinoma de células escamosas de pulmón [LUSC], carcinoma renal de células claras renales [KIRC], carcinoma urotelial de vejiga [BLCA], cistoadenocarcinoma seroso de ovario [OV], timoma [THYM], carcinoma de células escamosas de cuello uterino y adenocarcinoma endocervical [CESC], carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello [HNSC], carcinoma invasivo de mama [BRCA], adenocarcinoma de estómago [STAD], linfoma difuso de células B grandes de neoplasia linfoide [DLBC], glioblastoma multiforme [GBM], adenocarcinoma de colon [COAD], adenocarcinoma de recto [READ], adenocarcinoma de pulmón [LUAD], tumores testiculares de células germinales [TGCT], mesotelioma [MESO], colangiocarcinoma [CHOL], carcinosarcoma uterino [UCS], melanoma cutáneo de piel [SKCM], carcinoma endometrial del cuerpo uterino [UCEC], glioma cerebral de bajo grado [LGG], adenocarcinoma de próstata [PRAD], carcinoma hepatocelular de hígado [LIHC], carcinoma de tiroides [THCA], feocromocitoma y paraganglioma [PCPG], leucemia mieloide aguda [LAML], melanoma uveal [UVM]
Fig. 4 muestra la expresión de HLA-A con respecto a todos los demás genes que codifican proteínas en el genoma. El valor de cada gen refleja el valor medio de RPKM de las medianas de tejido obtenidas de GTEX (gtexportal.org)
Fig.5 muestra un proceso de trabajo propuesto para el análisis de la pérdida de heterocigosidad de la proteína HLA en los cánceres del Ejemplo 5.
Fig. 6 muestra la frecuencia de LOH en el conjunto de datos pancan12 usando datos de números de copia procesados mediante ABSOLUTE. Las líneas representan intervalos de confianza binomiales del 95% para la frecuencia.
Fig. 7 muestra los tipos de LOH observados en HLA-A. De 588 episodios de LOH de HLA-A, ninguno involucró un punto de ruptura dentro del gen HLA-A.
Fig. 8 muestra la distribución de la longitud (en pares de bases) de las deleciones que abarcan HLA-A. Una gran fracción de estas deleciones son mayores que la longitud del cromosoma 6p.
Fig. 9 muestra la correlación entre la fracción de pacientes que tienen LOH de HLA-A en datos de números de copia relativos y de ABSOLUTE, con un umbral de -0,1.
Figuras 10A-10C muestran que la comparación de la tasa de LOH de HLA-A, HLA-B y HLA-C en 32 cánceres revela un patrón casi idéntico de LOH.
Fig. 11 muestra la captura de pantalla de IGV de los perfiles de números de copias de AML ordenados para la deleción del cromosoma 6p. El azul indica deleción, el rojo indica amplificación. No hay deleciones de HLA-A.
Fig. 12 muestra la proporción de tumores de melanoma uveal que sufren LOH para todos los SNP.
Fig. 13 proporciona las abreviaturas del estudio de TCGA (también disponibles en https://gdc.cancer.gov/resources-tcga-users/tcga-code-tables/tcga-study-abbreviations).
Fig. 14 representa la pérdida de una región cromosómica adyacente a la proteína supresora de tumores TP53, codificada en el cromosoma 17. Los genes codificados en el cromosoma 17 que se identificaron como dianas de iCAR pueden usarse para tratar al paciente RC001.
Fig. 15 proporciona un diagrama esquemático de los constructos de iCAR y aCAR.
Fig. 16 proporciona datos sobre la secreción de IL-2 medida por ELISA. iCAR inhibe específicamente la secreción de IL-2 tras la interacción con las células diana que expresan la diana de iCAR.
Fig. 17 muestra que iCAR inhibe específicamente la secreción de IL-2 tras la interacción con células diana que expresan la diana de iCAR según lo medido por CBA.
Fig. 18 muestra la activación específica de CD19 aCAR Jurkat-NFAT por células diana que expresan CD19.
Fig. 19 muestra inhibición específica de la activación de NFAT en CD19 aCAR/HLA-A2 iCAR Jurkat-NFAT
Fig. 20 muestra una inhibición específica de la activación de NFAT en diferentes relaciones E/T.
Fig. 21 proporciona las secuencias para los constructos de iCAR y aCAR de Fig. 15.
Fig. 22 proporciona las 1167 dianas potenciales de iCAR, pCAR y/o aCAR.
Fig. 23 proporciona los 3288 SNP de los 1167 genes enumerados en Fig. 22.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
I. INTRODUCCIÓN
Haciendo referencia al concepto revolucionario de los genes supresores de tumores (TSG) presentado en 1971 por A. G. Knudson (Knudson Jr., 1971), Devilee, Cleton-Jansen y Cornelisse afirmaron en el párrafo inicial de su ensayo titulado 'Ever since Knudson' (Devilee et al., 2001): “Muchas publicaciones han documentado la LOH en muchos cromosomas diferentes en una amplia variedad de tumores, lo que implica la existencia de múltiples TSG. La hipótesis de dos aciertos de Knudson predice que estos eventos de LOH son la segunda etapa en la inactivación de ambos alelos de un TSG”. En su revisión trascendental sobre las inestabilidades genéticas en los cánceres humanos (Lengauer et al., 1998), Lengauer, Kinzler y Vogelstein escribieron: “Los estudios cariotípicos han mostrado que la mayoría de los cánceres han perdido o ganado cromosomas, y los estudios moleculares indican que los datos cariotípicos en realidad subestiman el verdadero alcance de tales cambios. Las pérdidas de heterocigosidad, es decir, las pérdidas de un alelo materno o paterno en un tumor, están muy extendidas, y a menudo van acompañadas de una ganancia del alelo opuesto. Un tumor podría perder el cromosoma 8 materno, por ejemplo al duplicar el cromosoma 8 paterno, quedando la célula con un cariotipo normal del cromosoma 8 pero con un 'alelotipo' anormal del cromosoma 8. El cáncer 'promedio' de colon, mama, páncreas o próstata puede perder el 25% de sus alelos, y no es raro que un tumor haya perdido más de la mitad de sus alelos”. Desde entonces, estas observaciones se han reforzado y extendido a casi todos los cánceres humanos, incluyendo prácticamente todos los carcinomas, en numerosos informes (véase (McGranahan et al., 2012) para un repaso). Ahora se ha establecido sin ambigüedad que casi todos los tumores individuales exhiben pérdidas múltiples de cromosomas completos, brazos cromosómicos completos, o regiones subcromosómicas de tamaño variable. Se están desarrollando rápidamente nuevos algoritmos (p. ej., Sathirapongsasuti et al., 2011) para la determinación del perfil de LOH en cualquier muestra de células dada en función de los datos de la secuencia del exoma. Si bien el sesgo estadístico en la actualidad puede cuestionar la validez de algunas interpretaciones (Teo et al., 2012), es probable que dichos algoritmos mejoren y reemplacen a la mayoría de las otras metodologías para establecer perfiles de LOH que se habían empleado para este fin en la era anterior a NGS.
Los eventos tempranos de LOH pueden detectarse en células premalignas del mismo tejido, pero no en las células normales circundantes (Barrett et al., 1999). LOH es irreversible, y los eventos solo pueden acumularse, por lo que la heterogeneidad del tumor refleja la acumulación de pérdidas a lo largo de la progresión del tumor. Si bien pueden desarrollarse subclones tumorales que difieren en eventos posteriores de LOH, se espera que la regla sea la existencia de una firma mínima de LOH compartida por células premalignas, células madre tumorales putativas y todos los subclones tumorales en un paciente determinado. Las ramas que se derivan de este patrón de LOH 'troncal' todavía crearían un conjunto limitado de firmas parcialmente solapantes que, juntas, cubren todas las células tumorales en el mismo paciente
Un resultado inevitable de los eventos de LOH macroscópicos es la pérdida concomitante de todos los demás genes que residen en el material cromosómico eliminado, y estos naturalmente incluyen muchos genes que codifican proteínas transmembrana. En cuanto a su identidad, se ha compilado un catálogo de 3.702 proteínas de superficie celular humanas diferentes (el 'surfaceoma') (Da Cunha et al., 2009). La expresión de □42% de los genes del surfaceoma muestra una amplia distribución tisular, mientras que ^85 genes se expresan en todos los tejidos examinados, que es el sello distintivo de los genes constitutivos. Estos genes son candidatos, cuyas diferentes variantes polimórficas pueden servir como dianas para los iCAR y aCAR de la presente invención.
Más recientemente, Bausch-Fluck et al.(Bausch-Fluck et al., 2015) aplicaron su tecnología de captura de superficie celular quimioproteómica para identificar un conjunto combinado de 1492 glicoproteínas de superficie celular en 41 tipos de células humanas. Se espera que una gran fracción del surfaceoma sea expresada por cualquier tumor dado, exhibiendo cada uno un perfil distintivo. Se encontró que los genes que codifican proteínas de superficie celular están ligeramente enriquecidos en polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en sus regiones codificantes que todos los demás genes (Da Cunha et al., 2009). Las inserciones y eliminaciones polimórficas en el marco, que son más raras, contribuyen aún más al número de variantes, y probablemente ejercen efectos estructurales más sólidos en los productos polipeptídicos que los SNP que alteran la secuencia peptídica (no sinónimos). En total, un genoma típico contiene de 10.000 a 12.000 sitios con variantes no sinónimas, y de 190 a 210 inserciones/eliminaciones en el marco (Abecasis et al., 2010; Auton et al., 2015). Estas variantes no se distribuyen uniformemente por todo el genoma como genes altamente polimórficos tal como el locus HLA (http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/stats.html), o ciertos genes de receptores acoplados a proteína G (GPCR) (Lee et al., 2003; Rana et al., 2001) crean distintos 'puntos críticos' variantes. Otra capa de puntos críticos relacionados con LOH proviene de la pérdida frecuente de ciertos cromosomas o brazos cromosómicos en diferentes cáncer (p. ej., 3p y 17p en carcinoma de pulmón microcítico (Lindblad-Toh et al., 2000), 17p y 18q en cáncer colorrectal (Vogelstein et al., 1989), 17q y 19 en cáncer de mama (Li et al., 2014; Wang et al., 2004), 9p en melanoma (Stark y Hayward, 2007), 10q en glioblastoma (Ohgaki et al., 2004) y más)
Una fracción significativa de las variaciones alélicas en las proteínas de superficie afectaría la porción extracelular de los respectivos productos génicos, creando potencialmente epítopos restringidos al alelo distintos que, en principio, pueden ser reconocidos y distinguidos de otras variantes por mAbs altamente específicos. Está bien documentado que se pueden aislar mAbs que discriminan entre dos variantes de la misma proteína que difieren en un solo aminoácido (véase, por ejemplo, un ejemplo temprano de mAbs que reconocen productos de mutaciones puntuales del oncogén Ras con una especificidad exquisita) (Carney et al., 1986)). Curiosamente, se demostró que dos mAbs específicos para un solo intercambio de aminoácidos en un epítopo de proteína pueden usar regiones variables estructuralmente distintas de sus grupos de genes V de cadena pesada y ligera (Stark y Caton, 1991). Recientemente, Skora et al.(Skora et al., 2015) informaron el aislamiento de scFv específicos de péptidos que pueden distinguir entre neopéptidos unidos a HLA-I derivados de proteínas KRAS y EGFR mutadas y sus contrapartes de tipo salvaje, que difieren en ambos casos en un aminoácido
En conjunto, surge una firma antigénica única de células tumorales, que puede permitir su discriminación inequívoca de todas las demás células en todo el cuerpo del paciente individual. Comprende todas las proteínas transmembrana codificadas por variantes alélicas que están ausentes de la superficie de la célula tumoral debido a la LOH pero que están presentes en las células normales del tejido canceroso de origen u otros tejidos que expresan estos genes. Naturalmente, cada gen afectado por LOH se caracterizará por un patrón distinto de distribución tisular, excepto por los verdaderos genes constitutivos. No se espera que la mayoría de estos genes estén implicados directamente en la tumorigénesis o el mantenimiento del fenotipo transformado, y, en este sentido, su pérdida es de carácter 'pasajero'
La justificación presentada anteriormente sostiene que la LOH inevitablemente da forma a una representación molecular única para casi todos los tumores, que se caracteriza por la ausencia de numerosas estructuras de superficie polimórficas que están presentes en las células normales. Convertir esta firma postulada del tumor individual en un conjunto de epítopos antigénicos seleccionable como diana implica una estrategia inmunológica practicable para traducir el reconocimiento de una 'ausencia' particular en una señal de activación capaz de desencadenar la destrucción de células diana. Es importante destacar que la incorporación de un dispositivo de seguridad para garantizar que se evite estrictamente la reactividad fuera del tumor y en la diana será muy favorable en la implementación clínica futura de esta estrategia.
La presente invención aborda este reto mediante la coexpresión en cada célula asesina terapéutica de un único par de genes. Una pareja de este par codifica un CAR activador (aCAR), y la otra codifica un CAR protector (pCAR) o un CAR inhibidor (iCAR)
II. DEFINICIONES SELECTAS
La expresión “molécula de ácido nucleico”, como se usa aquí, se refiere a una molécula de ADN o ARN.
La expresión “que codifica” se refiere a la propiedad inherente de secuencias específicas de nucleótidos en un polinucleótido, tal como un gen, un ADNc o un ARNm, para servir como moldes para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procesos biológicos que tienen una secuencia definida de nucleótidos (p. ej., ARNr, ARNt y ARNm) o una secuencia definida de aminoácidos, y las propiedades biológicas resultantes de la misma. Por lo tanto, un gen codifica una proteína si la transcripción y traducción del ARNm correspondiente a ese gen produce la proteína en una célula u otro sistema biológico. Tanto la cadena codificante, cuya secuencia nucleotídica es idéntica a la secuencia del ARNm y generalmente se proporciona en los listados de secuencias, como la cadena no codificante, usada como molde para la transcripción de un gen o ADNc, puede decirse que codifica la proteína u otro producto de ese gen o ADNc.
A menos que se especifique lo contrario, una “secuencia nucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos” incluye todas las secuencias nucleotídicas que son versiones degeneradas entre sí y que codifican la misma secuencia de aminoácidos. Las secuencias nucleotídicas que codifican proteínas y ARN pueden incluir intrones.
El término “endógeno” se refiere a cualquier material de o producido dentro de un organismo, célula, tejido o sistema.
El término “exógeno” se refiere a cualquier material introducido o producido fuera de un organismo, célula, tejido o sistema.
El término “expresión”, como se usa aquí, se define como la transcripción y/o traducción de una secuencia nucleotídica particular impulsada por su promotor.
“Vector de expresión” se refiere a un vector que comprende un polinucleótido recombinante que comprende secuencias de control de la expresión unidas operativamente a una secuencia nucleotídica a expresar. Un vector de expresión comprende suficientes elementos que actúan en cis para la expresión; otros elementos para la expresión pueden ser suministrados por la célula hospedante o en un sistema de expresión in vitro. Los vectores de expresión incluyen todos los conocidos en la técnica, tales como cósmidos, plásmidos (por ejemplo, desnudos o contenidos en liposomas), y virus (por ejemplo, lentivirus, retrovirus, adenovirus, y virus adenoasociados) que incorporan el polinucleótido recombinante.
La expresión “variante genómica”, como se usa aquí, se refiere a un cambio de al menos un nucleótido a nivel genómico en una muestra secuenciada en comparación con la secuencia de referencia o de consenso en la misma posición genómica.
La expresión “alelo de referencia correspondiente”, como se usa aquí con referencia a una variante, significa la secuencia de referencia o de consenso o nucleótido en la misma posición genómica que la variante.
La expresión “dominio extracelular”, como se usa aquí con referencia a una proteína, significa una región de la proteína que está fuera de la membrana celular.
La expresión “pérdida de heterocigosidad” o “LOH”, como se usa aquí, significa la pérdida de materiales cromosómicos, tales como un cromosoma completo o una parte del mismo, en una copia de los dos cromosomas en una célula somática.
La expresión “región de secuencia”, como se usa aquí con referencia a una variante o un alelo de referencia, significa una secuencia que comienza en dirección 5’ y termina en dirección 3’ desde la posición de la variante, que puede traducirse en un “péptido epítopo” que puede ser reconocido por un anticuerpo.
El término “CAR”, tal como se usa aquí, se refiere a un polipéptido quimérico que comparte propiedades estructurales y funcionales con un receptor de la función inmunitaria celular o una molécula adaptadora, de p. ej., una célula T o una célula NK. Los CAR incluyen TCAR y NKR-CAR. Al unirse al antígeno afín, un CAR puede activar o inactivar la célula citotóxica en la que está dispuesto, o modular la actividad antitumoral de la célula o modular de otro modo la respuesta inmunitaria de las células.
La expresión “unión específica”, como se usa aquí en el contexto de un dominio extracelular, tal como un scFv, que se une específicamente a una única variante alélica de un epítopo de superficie celular polimórfico, se refiere a la unión relativa del scFv a una variante alélica y su incapacidad para unirse a la correspondiente variante alélica diferente del mismo epítopo de superficie celular polimórfico. Dado que esto depende de la avidez (número de copias de CAR en la célula T, número de moléculas de antígeno en la superficie de las células diana (o células a proteger), y la afinidad de los CAR específicos usados, una definición funcional sería que el scFv específico proporcionaría una señal significativa en un ELISA contra la variante alélica única de un epítopo de superficie celular polimórfico para el que es específico, o que las células transfectadas con un CAR que muestran el scFv se marcarían claramente con la variante alélica única de un epítopo de superficie celular polimórfico en un ensayo FACS, mientras que los mismos ensayos que usan la correspondiente variante alélica diferente del mismo epítopo de superficie celular polimórfico no darían ninguna señal detectable.
El término “tratar”, como se usa aquí, se refiere a medios para obtener un efecto fisiológico deseado. El efecto puede ser terapéutico en términos de curación parcial o total de una enfermedad y/o síntomas atribuidos a la enfermedad. El término se refiere a inhibir la enfermedad, p. ej. deteniendo su desarrollo; o mejorar la enfermedad, p. ej. provocando la regresión de la enfermedad.
Como se usa aquí, los términos “sujeto” o “individuo” o “animal” o “paciente” o “mamífero” se refieren a cualquier sujeto, particularmente un sujeto mamífero, para quien se desea un diagnóstico, pronóstico, o terapia, por ejemplo un ser humano.
La frase “célula inmunitaria efectora segura” o “célula efectora segura” incluye aquellas células descritas por la invención que expresan al menos un iCAR o pCAR como se describe aquí. En algunas realizaciones, la “célula inmunitaria efectora segura” o la “célula efectora segura” es capaz de administrarse a un sujeto. En algunas realizaciones, la “célula inmunitaria efectora segura” o la “célula efectora segura” expresa además un aCAR como se describe aquí. En algunas realizaciones, la “célula inmunitaria efectora segura” o la “célula efectora segura” expresa además un iCAR o un pCAR como se describe aquí. En algunas realizaciones, la “célula inmunitaria efectora segura” o “célula efectora segura” expresa además un iCAR o un pCAR como se describe aquí, y un aCAR como se describe aquí.
Las composiciones farmacéuticas para uso según la presente invención se pueden formular de manera convencional usando uno o más vehículos o excipientes fisiológicamente aceptables. El o los vehículos deben ser “aceptables” en el sentido de ser compatibles con los demás ingredientes de la composición y no perjudiciales para el receptor de la misma.
Las frases “cantidad eficaz” o “cantidad terapéuticamente eficaz” se usan indistintamente aquí, y se refieren a una cantidad de un compuesto, formulación, material, o composición, como se describe aquí, eficaz para lograr un resultado biológico particular.
Los siguientes ejemplos de vehículos, modos de administración, formas de dosificación, etc., se enumeran como posibilidades conocidas entre las que se pueden seleccionar los vehículos, modos de administración, formas de dosificación, etc., para uso con la presente invención. Los expertos en la técnica comprenderán, sin embargo, que cualquier formulación dada y modo de administración seleccionados deben ensayarse primero para determinar si logran los resultados deseados.
Los métodos de administración incluyen, pero no se limitan a, las vías parenteral, p. ej., intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, mucosal (por ejemplo, oral, intranasal, bucal, vaginal, rectal, intraocular), intratecal, tópica e intradérmica. La administración puede ser sistémica o local. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica está adaptada para la administración oral.
El término “vehículo” se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehículo con el que se administra el principio activo. Los vehículos en la composición farmacéutica pueden comprender un aglutinante, tal como celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona (polividona o povidona), goma de tragacanto, gelatina, almidón, lactosa o lactosa monohidratada; un agente disgregante, tal como ácido algínico, almidón de maíz y similares; un lubricante o tensioactivo, tal como estearato de magnesio o laurilsulfato de sodio; y un deslizante, tal como dióxido de silicio coloidal.
La expresión “célula mononuclear de sangre periférica (PBMC)”, como se usa aquí, se refiere a cualquier célula sanguínea que tenga un núcleo redondo, tal como un linfocito, un monocito o un macrófago. Los métodos para aislar las PBMC de la sangre son fácilmente evidentes para los expertos en la técnica. Un ejemplo no limitativo es la extracción de estas células a partir de sangre entera mediante ficoll, un polisacárido hidrófilo que separa capas de sangre, formando los monocitos y linfocitos una capa leucocitaria bajo una capa de plasma, o por leucoféresis, la preparación de concentrados de leucocitos con la devolución de glóbulos rojos y plasma pobre en leucocitos al donante.
El término “cáncer”, como se usa aquí, se define como una enfermedad caracterizada por el crecimiento rápido e incontrolado de células aberrantes. Las células cancerosas pueden diseminarse localmente o a través del torrente sanguíneo y el sistema linfático a otras partes del cuerpo. Los ejemplos de diversos tipos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de piel, cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer de hígado, cáncer de cerebro, linfoma, leucemia, cáncer de pulmón, glioma, y similares.
III. SISTEMA CAR-T: iCAR, pCAR y aCAR
Debe enfatizarse que la presente invención proporciona una nueva vía que permite el direccionamiento específico de células tumorales al tiempo que se mantienen seguras las células normales. El concepto presentado aquí proporciona la identificación de nuevas dianas para iCAR (o pCAR o CAR protectores), estas dianas se definen como variantes alélicas únicas de epítopos de superficie celular polimórficos, que se pierden en las células tumorales debido a la LOH de la región cromosómica en la que residen, mientras que se siguen expresando en tejido normal. Debido a la variación polimórfica, es posible distinguir los dos alelos y seleccionar como diana sólo al alelo que falta en las células tumorales. Además, el antígeno diana puede no ser necesariamente un gen supresor de tumores, o un gen que se prevea que esté implicado en el cáncer, ya que se escoge por estar en una región perdida por la LOH, y por lo tanto simplemente podría vincularse a tales genes. Esto es conceptualmente diferente de los métodos empleados o sugeridos hasta la fecha en la terapia del cáncer, que se dirigen contra antígenos asociados a tumores o antígenos regulados a la baja en tumores, independientemente del polimorfismo. Los presentes métodos también permiten ampliar la selección de aCAR más allá de los antígenos asociados a tumores, confiriendo protección a las células normales a través de la coexpresión de iCAR y/o pCAR como se describe aquí.
La distinción es crucial porque la LOH, al ser un evento genómico, da como resultado la pérdida total de una variante específica del tumor con una probabilidad muy rara de recuperar el alelo perdido. Si el evento de LOH ocurre muy temprano en el desarrollo de los tumores, asegura una firma diana uniforme en todas las células tumorales derivadas del tejido premaligno inicial, incluidos los tumores metastásicos. Además, LOH ocurre en casi todos los tipos de cáncer, y por lo tanto, se puede confiar en este concepto como una herramienta universal para desarrollar marcadores relevantes para todos estos tipos de cáncer. Dado que los eventos de LOH son hasta cierto punto aleatorios, la presente invención proporciona además la selección de marcadores tumorales personalizados para cada paciente de cáncer individual, basándose en los eventos de LOH específicos que tuvieron lugar en ese paciente. Las herramientas en las que se confía para ejecutar este concepto, los aCAR y los iCAR, son bien conocidas, y se pueden preparar fácilmente usando métodos bien conocidos en la técnica, como se enseña, por ejemplo, en el documento WO 2015/142314 y en US 9.745.368, ambos incorporados por referencia como si se describiesen completamente aquí.
Según una estrategia, los dos CAR en cada par dado reconocen específicamente el producto de una variante alélica diferente del mismo gen diana para el cual el paciente es heterocigoto. El principio básico es el siguiente: el aCAR se dirige contra una variante alélica de una proteína de superficie celular seleccionada que se expresa en las células tumorales dadas y no se ve afectada por LOH, mientras que pCAR o iCAR se dirige contra el producto codificado por la variante alélica del mismo gen que se ha perdido de estas células tumorales debido a LOH. En otros tejidos normales de ese paciente individual que expresan dicho gen, ambos alelos están presentes y se sabe que son igualmente funcionales, es decir, la expresión es bialélica en todos los tejidos (a diferencia de otros genes que pueden presentar expresión monoalélica aleatoria (Chess, 2012; Savova et al., 2016). En un escenario, los dos CAR se dirigen contra dos epítopos relacionados que residen en la misma ubicación en el producto proteico, que difieren en uno o en solo unos pocos aminoácidos. En otro escenario, el aCAR se dirige contra un epítopo no polimórfico en la misma proteína, mientras que el pCAR o iCAR es específico del alelo. En este caso, la densidad del epítopo de aCAR en células normales sería generalmente dos veces mayor que la de aquella del de iCAR o pCAR. En algunas realizaciones, un solo vector de ácido nucleico codifica tanto aCAR como iCAR o pCAR.
Otra estrategia utiliza como dianas de pCAR o iCAR los productos proteicos de los genes constitutivos. Dado que, por definición, estos genes se expresan en todas las células del cuerpo, son dianas seguras para los pCAR o iCAR. Es decir, si pCAR o iCAR se dirigen contra un producto de membrana de un gen constitutivo para el cual el paciente dado es heterocigoto, todas las células del cuerpo, excepto las células tumorales que han perdido este alelo debido a LOH, estarán protegidas. Esta estrategia permite el desacoplamiento del producto del gen diana de aCAR de aquel del de pCAR o iCAR. De hecho, la diana de aCAR puede ser cualquier epítopo no polimórfico expresado por el tumor. Una variación de esta estrategia sería utilizar un aCAR conocido dirigido contra un antígeno asociado a un tumor no polimórfico, p. ej. un aCAR en uso clínico o bajo examen en ensayos clínicos, en combinación con un iCAR o pCAR dirigido contra un producto de membrana de un gen para el que el paciente dado es heterocigoto y que se expresa en al menos el tejido de origen del tumor y preferiblemente en tejidos normales vitales adicionales en los que se expresa el antígeno diana de aCAR.
Siguiendo la misma lógica que permite el desacoplamiento del antígeno diana de aCAR del de iCAR/pCAR, este último no debería ser necesariamente el producto de un gen constitutivo. En algunas realizaciones, iCAR y/o pCAR son el producto de cualquier gen cuyo patrón de expresión es suficientemente amplio para proteger tejidos normales vitales que expresan el antígeno diana de aCAR además del tumor. Como corolario, el antígeno de aCAR puede ser, como se argumenta para los genes constitutivos, cualquier epítopo no polimórfico expresado por el tumor, no restringido a los 'antígenos asociados a tumores' conocidos, una consideración que puede ampliar enormemente la lista de dianas candidatas de aCAR. En general, tanto para los genes constitutivos como para los no constitutivos, la identidad de dichos tejidos vitales normales y el nivel de expresión servirían como criterios importantes en la priorización de dichos dianas candidatas de aCAR.
Se debe tener cuidado para asegurar que la señal inhibidora transmitida por el iCAR sea estricta y permanentemente dominante sobre la señal del aCAR, y que no ocurra un reconocimiento cruzado entre el iCAR y el aCAR. La dominancia de iCAR garantiza que se prevendría la activación de la célula asesina al encontrarse con células normales que expresan ambos alelos. Sin embargo, este freno predeterminado no operaría al interactuar con las células tumorales: en ausencia de su antígeno diana, el iCAR no enviaría señales inhibidoras, desencadenando así la activación celular anticipada mediada por aCAR y la subsiguiente lisis de las células tumorales.
La tecnología iCAR puede basarse en puntos de control inmunitarios. En este sentido, la demostración (Fedorov et al., 2013b; documento WO 2015/142314) de que los elementos reguladores de PD-1 y CTLA-4 poseen una potente capacidad inhibidora de células T cuando se incorporan como componentes de señalización de iCAR es alentador, pero la generalidad de estas observaciones se cuestionó recientemente (Chicaybam y Bonamino, 2014, 2015). Además, aunque las rutas moleculares precisas desencadenadas por estas proteínas de punto de control no se comprenden por completo, su participación amortigua la activación de las células T a través de mecanismos tanto proximales como distales, lo que hace que las células T no respondan a los estímulos activantes concomitantes (Nirschl y Drake, 2013). Por lo tanto, aunque el estado de inactivación asegurado por los iCAR de PD-1 y CTLA-4 es de hecho temporal y reversible (Fedorov et al., 2013b), no permitiría la activación de células T en tejidos que expresan dianas tanto de iCAR como de aCAR. Por el contrario, el predominio de los receptores inhibidores de NK sobre los receptores de activación asegura que las células sanas se salven del ataque de las células NK a través de un mecanismo espacial, en lugar de temporal. (Long et al., 2013). Existe pruebas convincentes de que una sola célula NK puede salvar a una célula resistente que expresa tanto ligandos inhibidores como activadores y, sin embargo, matar a una célula susceptible a la que se acopla simultáneamente, que expresa solo los ligandos activadores. Esta exquisita capacidad se rige por la diferente organización espacial de las moléculas de transducción de señales formadas en cada una de las respectivas sinapsis inmunitarias que, en consecuencia, afecta la exocitosis de los gránulos citolíticos (p. ej., Abeyweera et al., 2011; Eriksson et al., 1999; Treanor et al., 2006; Vyas et al., 2001; documento US 9.745.368).
La estrategia basada en el control afirmado por los iCAR depende del dominio de la actividad de iCAR sobre la actividad de aCAR, como se explicó anteriormente. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona este tipo de iCAR, denominado aquí pCAR (por CAR protector, véase la Fig. 2), diseñado para operar en células CAR T de manera selectiva para la sinapsis y garantizar el dominio total sobre el aCAR coexpresado. En algunas realizaciones, el iCAR proporcionado por la presente invención es este tipo particular de iCAR al que se hace referencia aquí como CAR protector (pCAR).
En algunas realizaciones, el pCAR de la presente invención integra dos proezas tecnológicas. Primero, el pCAR permite desacoplar el resto activador del aCAR (FcRy/CD3-Z) de la unidad de reconocimiento y el elemento coestimulador (p. ej., CD28, 4-1BB, CD134 (OX40, GITR, IL2RP y motivo de unión STAT3 (YXXQ)) al colocarlos genéticamente en dos productos polipeptídicos diferentes. El reacoplamiento de estos elementos, que es obligatorio para la función de aCAR, solo tendrá lugar mediante la adición de un fármaco heterodimerizante que pueda unir los sitios de unión respectivos incorporados en cada uno de los polipéptidos por separado (Fig. 2B). La reconstrucción de un CAR completamente funcional mediante la unión de restos de reconocimiento y activación divididos de manera similar en virtud de un fármaco heterodimerizante ha sido dada a conocer recientemente por .(Wu et al. 2015). Para este fin, estos autores usaron el dominio de proteína de unión a FK506 (FKBP, 104 aminoácidos) y el mutante T2089L del dominio de unión a rapamicina-FKBP (FRB, 89 aminoácidos) que se heterodimeriza en presencia del análogo de rapamicina AP21967 (Esquema I a continuación). Este fármaco posee una actividad inmunosupresora 1000 veces menor en comparación con la rapamicina (Bayle et al., 2006; Graef et al., 1997; Liberles et al., 1997), y está disponible comercialmente (ARGENTTM, Regulated Heterodimerization Kit, ARIAD). En algunas realizaciones, el fármaco se administra por vía oral.
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En segundo lugar, injertar la unidad de reconocimiento de pCAR y el dominio de activación faltante, respectivamente, en las dos superficies del dominio transmembrana de un receptor controlado por RIP que contiene los dos sitios de escisión intramembrana (Figura 2A). La unión del pCAR a su antígeno desencadenará la escisión dual del polipéptido codificado, en primer lugar por un miembro de la familia de desintegrinas y metaloproteinasas extracelulares (ADAM), que elimina el ectodominio, y después por la y-secretasa intracelular, que libera el dominio intracelular del pCAR. Se predice que este primer evento de escisión interrumpirá la capacidad del aCAR truncado para obtener acceso a una configuración funcional, anclada a la membrana, de su elemento activador faltante, adquiriendo así un modo operativo (Figura 2C). Este principio se aprovechó recientemente en el desarrollo de nuevos interruptores genéticos diseñados para limitar la actividad de las células CAR T al reconocimiento simultáneo de dos antígenos diferentes en la célula tumoral, aplicando el receptor Notch (Morsut et al., 2016; Roybal et al., 2016b) o la molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM, Pizem, Y., tesis de Maestría en Ciencias bajo la supervisión del Inventor), dos receptores bien estudiados que funcionan a través de RIP. En estos estudios, la unión del CAR basado en RIP a un antígeno libera un dominio intracelular manipulado genéticamente que se traslada al núcleo celular, en el que activa la expresión del segundo CAR. A diferencia de la invención actual, que utiliza este proceso únicamente para desarmar cualquier actividad potencial de aCAR en presencia del antígeno protector. En algunas realizaciones, el primer evento de escisión interrumpe la capacidad del aCAR truncado para obtener acceso a una configuración funcional, anclada a la membrana, de su elemento activador faltante, adquiriendo así un modo operativo.
Se prevé que el modo de acción propuesto descrito anteriormente ejerza efectos locales de modo que solo los aCAR que residen en la misma sinapsis se vean afectados y ya no sean capaces de unirse productivamente a su antígeno y formar una sinapsis inmunológica. Como resultado, incluso cuando es probable que se produzcan múltiples interacciones del aCAR con un gran número de células no tumorales, sólo se espera que sean transitorias y no funcionales para que las células sean totalmente capaces de interacciones adicionales.
El dominio de los pCAR sobre sus contrapartes de los aCAR es inherente a este sistema, ya que la función de los aCAR depende completamente de la presencia de los pCAR. La escasez relativa de los pCAR en una célula T dada haría que los aCAR no fueran funcionales debido a la falta de un dominio de activación. En algunas realizaciones, una escasez de los pCAR en una célula T dada hace que los aCAR no sean funcionales debido a la falta de un dominio de activación.
Es fundamental que tanto el dominio de reconocimiento como el de activación estén localizados en la membrana plasmática (Wu et al., 2015). Por lo tanto, la segunda escisión, que separa el dominio activador de la membrana plasmática, haría que este dominio no fuera funcional, y evitaría la activación celular no deseada. En algunas realizaciones, el dominio de reconocimiento y el de activación están localizados en la membrana plasmática. En algunas realizaciones, la segunda escisión separa el dominio activador de la membrana plasmática, y hace que este dominio no funcione y previene la activación celular no deseada.
El aCAR y el pCAR están diseñados para funcionar a través de mecanismos mutuamente excluyentes. La capacidad del pCAR para someterse a la escisión no depende de la fuerza de la señalización inhibidora, por lo que no se completará el resultado de la señalización. Mientras los pCAR se escindan, los aCAR no pueden funcionar, independientemente de la relativa avidez de sus interacciones con sus respectivos antígenos, un escenario que asegura otro nivel crucial de seguridad.
En algunas realizaciones, el tejido de mamífero es tejido humano, y en otras realizaciones, el tejido normal de mamífero relacionado es tejido normal a partir del cual se desarrolló el tumor.
En algunas realizaciones, la célula inmunitaria efectora es una célula T, una célula asesina natural, o una célula asesina inducida por citocinas.
En algunas realizaciones, el al menos un elemento de transducción de señales capaz de inhibir una célula inmunitaria efectora es homólogo a un elemento de transducción de señales de una proteína de punto de control inmunitario, tal como una proteína de punto de control inmunitario seleccionada del grupo que consiste en PD1; CTLA4; BTLA; 2B4; CD160; CEACAM, tales como CEACAM1; KIRs, tales como KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, LIR1, LIR2, LIR3, LIR5, LIR8 y CD94-NKG2A; LAG3; TIM3;; supresor de Ig del dominio V de la activación de células T (VISTA); genes estimuladores de interferón (STING); proteínas que contienen el motivo inhibidor inmunorreceptor basado en tirosina (ITIM), inmunoglobulina de células T y dominio ITIM (TIGIT), y receptor de adenosina (p. ej., A2aR). En algunas realizaciones, la proteína de punto de control inmunitario es un regulador inmunitario negativo. En algunas realizaciones, el regulador inmunitario negativo se selecciona del grupo que consiste en 2B4, LAG-3 y BTLA-4.
En algunas realizaciones, la proteína de punto de control inmunitario es un receptor inhibidor de células asesinas naturales, p. ej. los KIR, tales como KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3; o un receptor similar a Ig de leucocitos, tales como LIR1, LIR2, LIR3, LIR5, LIR8;, y CD94-NKG2A, un receptor de lectina de tipo C que forma heterodímeros con CD94 y contiene 2 ITIM.
Los métodos para preparar y usar receptores de células asesinas en los iCAR se han descrito en el documento US 9.745.368, incorporado como referencia como si se describiera completamente aquí.
En algunas realizaciones, el dominio extracelular de cualquiera de las realizaciones anteriores se fusiona a través de una bisagra flexible y un motivo canónico transmembrana a dicho dominio intracelular.
i. IDENTIFICACIÓN DE LA DIANA: aCAR, iCAR y pCAR
La presente invención proporciona métodos para la identificación de dianas de aCAR, iCAR y/o pCAR basados en la identificación de genes candidatos que tienen epítopos polimórficos extracelulares. En algunas realizaciones, el aCAR puede dirigirse contra cualquier proteína extracelular expresada en el tejido tumoral. En algunas realizaciones, la diana de aCAR se expresa además en tejidos no tumorales, y la diana de iCAR también se expresa en tejidos no tumorales, pero no se expresa en tejidos tumorales.
En algunas realizaciones, el método de identificación de genes candidatos incluye primero determinar que el gen codifica una proteína transmembrana que comprende un epítopo polimórfico extracelular. En algunas realizaciones, el método de identificación de genes candidatos incluye además determinar que el gen tiene al menos dos alelos expresados. En algunas realizaciones, estos alelos exhiben al menos una variación alélica. En algunas realizaciones, la variación alélica incluye, por ejemplo, la presencia de uno o más SNP, inserciones, y/o deleciones. En algunas realizaciones, la variación alélica encontrada para el gen provoca un cambio de aminoácidos con respecto a la secuencia de referencia en una región extracelular de la proteína. En algunas realizaciones, el gen está ubicado en una región cromosómica que experimenta pérdida de heterocigosidad (LOH). En algunas realizaciones, el gen está ubicado en una región cromosómica que experimenta pérdida de heterocigosidad (LOH) en el cáncer. En algunas realizaciones, el gen se expresa en un tejido de origen de un tipo de tumor en el que se encontró que la región correspondiente experimentaba LOH. En algunas realizaciones, el gen se expresa al menos en uno o más tejidos en los que se expresa aCAR. En algunas realizaciones, la diana de iCAR o pCAR se expresa en células de órganos vitales en las que se expresa aCAR.
En algunas realizaciones, la diana para uso en iCAR y/o pCAR se selecciona en base a la identificación de un gen que tiene al menos un epítopo polimórfico extracelular, y en el que dicho gen tiene al menos dos alelos expresados. En algunas realizaciones, la diana para uso en iCAR y/o pCAR se selecciona en base a la identificación de un gen que se encuentra en una región cromosómica que experimenta pérdida de heterocigosidad. En algunas realizaciones, la diana para uso en iCAR y/o pCAR se selecciona en base a la identificación de un gen que se encuentra en una región cromosómica que experimenta pérdida de heterocigosidad en el cáncer. En algunas realizaciones, se calcula la puntuación para un SNP teórico, y se determina un límite umbral. Por ejemplo, si sólo el 32% de los SNP tuvieran un gen supresor de tumores en el cromosoma, entonces el rango percentil para tener uno sería 0,68. Además, por ejemplo, si el alelo tuviera una fracción alélica menor de 0,49 (en la que 0,5 es la más alta posible), entonces el rango percentil sería 0,99. Si la tasa de LOH fuera 0,10, y el 75% de los SNP tuvieran más LOH que eso, entonces el rango percentil sería 0,25. Si la relación entre la desviación estándar de los valores de expresión en los tejidos y la mediana del gen que alberga este SNP fue 1,3, y eso es mejor que 90% de otros genes, entonces el rango percentil es 0,9. La puntuación total para este SNP sería entonces 0,68*0,99*0,25*0,9=0,15. En algunas realizaciones, esta puntuación de candidato de LOH se puede emplear como un método para determinar si un gen candidato es una diana para iCAR o pCAR adecuada. En algunas realizaciones, la diana se puede seleccionar en base a esta puntuación de LOH. En algunas realizaciones, se determina que el gen candidato es adecuado como diana de iCAR o pCAR. Candidatos de LOH basados en una puntuación de candidato de LOH de más de 0,4.
En algunas realizaciones, la diana para uso en iCAR y/o pCAR se selecciona de un gen que tiene al menos un epítopo polimórfico extracelular. En algunas realizaciones, la diana es un gen ubicado en el cromosoma 1, cromosoma 2, cromosoma 3, cromosoma 4, cromosoma 5, cromosoma 6, cromosoma 7, cromosoma 8, cromosoma 9, cromosoma 10, cromosoma 11, cromosoma 12, cromosoma 13, cromosoma 14, cromosoma 15, cromosoma 16, cromosoma 17, cromosoma 18, cromosoma 19, cromosoma 20, cromosoma 21, cromosoma 22, o cromosoma X.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 1. En algunas realizaciones, la diana para uso en iCAR y/o pCAR se selecciona del grupo que consiste en ABCA4, ADAM30, AQP10, ASTN1, C1orf101, CACNA1S, CATSPER4, CD101, CD164L2, CD1A, CD1C, CD244, CD34, CD46, CELSR2, CHRNB2, CLCA2, CLDN19, CLSTN1, CR1, CR2, CRB1, CSF3R, CSMD2, ECE1, ELTD1, EMC1, EPHA10, EPHA2, EPHA8, ERMAP, FCAMR, FCER1A, FCGR1B, FCGR2A, FCGR2B, FCGR3A, FCRL1, FCRL3, FCRL4, FCRL5, FCRL6, GJB4, GPA33, GPR157, GPR37L1, GPR88, HCRTR1, IGSF3, IGSF9, IL22RA1, IL23R, ITGA10, KIAA1324, KIAA2013, LDLRAD2, LEPR, LGR6, LRIG2, LRP8, LRRC52, LRRC8B, LRRN2, LY9, MIA3, MR1, MUC1, MXRA8, NCSTN, NFASC, NOTCH2, NPR1, NTRK1, OPN3, OR10J1, OR10J4, OR10K1, OR10R2, OR10T2, OR10X1, OR11L1, OR14A16, OR14I1, OR14K1, OR2AK2, OR2C3, OR2G2, OR2G3, OR2L2, OR2M7, OR2T12, OR2T27, OR2T1, OR2T3, OR2T29, OR2T33, OR2T34, OR2T35, OR2T3, OR2T4, OR2T5, OR2T6, OR2T7, OR2T8, OR2W3, OR6F1, OR6K2, OR6K3, OR6K6, OR6N1, OR6P1, OR6Y1, PDPN, PEAR1, PIGR, PLXNA2, PTCH2, PTCHD2, PTGFRN, PTPRC, PTPRF, PTGFRN, PVRL4, RHBG, RXFP4, S1PR1, SCNN1D, SDC3, SELE, SELL, SELP, SEMA4A, SEMA6C, SLAMF7, SLAMF9, SLC2A7, SLC5A9, TACSTD2, TAS1R2, TIE1, TLR5, TMEM81, TNFRSF14, TNFRSF1B, TRABD2B, USH2A, VCAM1, y ZP4.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 2. En algunas realizaciones, la diana para uso en iCAR y/o pCAR se selecciona del grupo que consiste en ABCG5, ALK, ASPRV1, ATRAID, CD207, CD8B, CHRNG, CLEC4F, CNTNAP5, CRIM1, CXCR1, DNER, DPP10, EDAR, EPCAM, GPR113, GPR148, GPR35, GPR39, GYPC, IL1RL1, ITGA4, ITGA6, ITGAV, LCT, LHCGR, LRP1B, LRP2, LY75, MARCO, MERTK, NRP2, OR6B2, PLA2R1, PLB1, PROKR1, PROM2, SCN7A, SDC1, SLC23A3, SLC5A6, TGOLN2, THSD7B, TM4SF20, TMEFF2, TMEM178A, TPO, y TRABD2A.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 3. En algunas realizaciones, la diana para uso en iCAR y/o pCAR se selecciona del grupo que consiste en ACKR2, ALCAM, ANO10, ATP13A4, BTLA, CACNA1D, CACNA2D2, CACNA2D3, CASR, CCRL2, CD200, CD200R1, CD86, CD96, CDCP1, CDHR4, CELSR3, CHL1, CLDN11, CLDN18, CLSTN2, CSPG5, CX3CR1, CXCR6, CYP8B1, DCBLD2, DRD3, EPHA6, EPHB3, GABRR3, GP5, GPR128, GPR15, GPR27, GRM2, GRM7, HEG1, HTR3C, HTR3D, HTR3E, IGSF11, IL17RC, IL17RD, IL17RE, IL5RA, IMPG2, ITGA9, ITGB5, KCNMB3, LRIG1, LRRC15, LRRN1, MST1R, NAALADL2, NRROS, OR5AC1, OR5H1, OR5H14, OR5H15, OR5H6, OR5K2, OR5K3, OR5K4, PIGX, PLXNB1, PLXND1, PRRT3, PTPRG, ROBO2, RYK, SEMA5B, SIDT1, SLC22A14, SLC33A1, SLC4A7, SLITRK3, STAB1, SUSD5, TFRC, TLR9, TMEM108, TMEM44, TMPRSS7, TNFSF10, UPK1B, VIPR1, y ZPLD1.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 4. En algunas realizaciones, la diana para uso en iCAR y/o pCAR se selecciona del grupo que consiste en ANTXR2, BTC, CNGA1, CORIN, EGF, EMCN, ENPEP, EPHA5, ERVMER34-1, EVC2, FAT1, FAT4, FGFRL1, FRAS1, GPR125, GRID2, GYPA, GYPB, KDR, KIAA0922, KLB, MFSD8, PARM1, PDGFRA, RNF150, TENM3, TLR10, TLR1, TLR6, TMEM156, TMPRSS11A, TMPRSS11B, TMPRSS11 E, TMPRSS11 F, UGT2A1, y UNC5C.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 5. En algunas realizaciones, la diana para uso en iCAR y/o pCAR se selecciona del grupo que consiste en ADAM19, ADRB2, BTNL3, BTNL8, BTNL9, C5orf15, CATSPER3, CD180, CDH12, CDHR2, COL23A1, CSF1R, F2RL2, FAM174A, FAT2, FGFR4, FLT4, GABRA6, GABRG2, GPR151, GPR98, GRM6, HAVCR1, HAVCR2, IL31RA, IL6ST, IL7R, IQGAP2, ITGA1, ITGA2, KCNMB1, LIFR, LNPEP, MEGF10, NIPAL4, NPR3, NRG2, OR2V1, OR2Y1, OSMR, PCDH12, PCDH1, PCDHA1, PCDHA2, PCDHA4, PCDHA8, PCDHA9, PCDHB10, PCDHB11, PCDHB13, PCDHB14, PCDHB15, PCDHB16, PCDHB2, PCDHB3, PCDHB4, PCDHB5, PCDHB6, PCDHGA1, PCDHGA4, PDGFRB, PRLR, SEMA5A, SEMA6A, SGCD, SLC1A3, SLC22A4, SLC22A5, SLC23A1, SLC36A3, SLC45A2, SLC6A18, SLC6A19, SLCO6A1, SV2C, TENM2, TIMD4, y UGT3A1.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 6. En algunas realizaciones, la diana para uso en iCAR y/o pCAR se selecciona del grupo que consiste en BAI3, BTN1A1, BTN2A1, BTN2A2, BTN3A1, BTN3A2, BTNL2, CD83, DCBLD1, DLL1, DPCR1, ENPP1, ENPP3, ENPP4, EPHA7, GABBR1, GABRR1, GCNT6, GFRAL, GJB7, GLP1R, GPR110, GPR111, GPR116, GPR126, GPR63, GPRC6A, HFE, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DOA, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQA2, HLA-DQB1, HLA-DQB2, HLA-DRB1, HLA-DRB5, HLA-E, HLA-F, HLA-G, IL20RA, ITPR3, KIAA0319, LMBRD1, LRFN2, LRP11, MAS1L, MEP1A, MICA, MICB, MOG, MUC21, MUC22, NCR2, NOTCH4, OPRM1, OR10C1, OR12D2, OR12D3, OR14J1, OR2B2, OR2B6, OR2J1, OR2W1, OR5V1, PDE10A, PI16, PKHD1, PTCRA, PTK7, RAET1E, RAET1G, ROS1, SDIM1, SLC16A10, SLC22A1, SLC44A4, TAAR2, TREM1, TREML1, y TREML2. En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 6 y comprende una diana de HLA. En algunas realizaciones, la diana para uso en iCAR y/o pCAR es HLA-A, HLA-B, HlA-C, HLA-DOA, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQA2, HLA-DQB1, HLA-DQB2, HLA-DRB1, HLA-DRB5, HLA-E, HLA-F, HLA-G. En algunas realizaciones, la diana para uso en iCAR y/o pCAR es HLA-A2,
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 7. En algunas realizaciones, la diana para uso en iCAR y/o pCAR se selecciona del grupo que consiste en AQP1, C7orf50, CD36, CDHR3, CNTNAP2, DPP6, EGFR, EPHA1, EPHB6, ERVW-1, GHRHR, GJC3, GPNMB, GRM8, HUS1, HYAL4, KIAA1324L, LRRN3, MET, MUC12, MUC17, NPC1L1, NPSR1, OR2A12, OR2A14, OR2A25, OR2A42, OR2A7, OR2A2, OR2AE1, OR2F2, OR6V1, PILRA, PILRB, PKD1L1, PLXNA4, PODXL, PTPRN2, PTPRZ1, RAMP3, SLC29A4, SMO, TAS2R16, TAS2R40, TAS2R4, TFR2, THSD7A, TMEM213, TTYH3, ZAN, y ZP3.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 8. En algunas realizaciones, la diana para uso en iCAR y/o pCAR se selecciona del grupo que consiste en ADAM18, ADAM28, ADAM32, ADAM7, ADAM9, ADRA1A, CDH17, CHRNA2, CSMD1, CSMD3, DCSTAMP, FZD6, GPR124, NRG1, OR4F21, PKHD1L1, PRSS55, SCARA3, SCARA5, SDC2, SLC10A5, SLC39A14, SLC39A4, SLCO5A1, TNFRSF10A, y TNFRSF10B.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 9. En algunas realizaciones, la diana para uso en iCAR y/o pCAR se selecciona del grupo que consiste en ABCA1, AQP7, ASTN2, C9orf135, CA9, CD72, CNTNAP3B, CNTNAP3, CRB2, ENTPD8, GPR144, GRIN3A, IZUMO3, KIAA1161, MAMDC4, MEGF9, MUSK, NOTCH1, OR13C2, OR13C3, OR13C5, OR13C8, OR13C9, OR13D1, OR13F1, OR1B1, OR1J2, OR1K1, OR1L1, OR1L3, OR1L6, OR1L8, OR1N1, OR1N2, OR1Q1, OR2S2, PCSK5, PDCD1LG2, PLGRKT, PTPRD, ROR2, SEMA4D, SLC31A1, TEK, TLR4, TMEM2, y VLDLR.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 10. En algunas realizaciones, la diana para uso en iCAR y/o pCAR se selecciona del grupo que consiste en ABCC2, ADAM8, ADRB1, ANTXRL, ATRNL1, C10orf54, CDH23, CDHR1, CNNM2, COL13A1, COL17A1, ENTPD1, FZD8, FGFR2, GPR158, GRID1, IL15RA, IL2RA, ITGA8, ITGB1, MRC1, NRG3, NPFFR1, NRP1, OPN4, PCDH15, PKD2L1, PLXDC2, PRLHR, RET, RGR, SLC16A9, SLC29A3, SLC39A12, TACR2, TCTN3, TSPAN15, UNC5B, y VSTM4.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 11. En algunas realizaciones, la diana para uso en iCAR y/o pCAR se selecciona del grupo que consiste en AMICA1, ANO1, ANO3, APLP2, C11orf24, CCKBR, CD248, CD44, CD5, CD6, CD82, CDON, CLMP, CRTAM, DCHS1, DSCAML1, FAT3, FOLH1, GDPD4, GDPD5, GRIK4, HEPHL1, HTR3B, IFITM10, IL10RA, KIRREL3, LGR4, LRP4, LRP5, LRRC32, MCAM, MFRP, MMP26, MPEG1, MRGPRE, MRGPRF, MRGPRX2, MRGPRX3, MRGPRX4, MS4A4A, MS4A6A, MTNR1B, MUC15, NAALAD2, NAALADL1, NCAM1, NRXN2, OR10A2, OR10A5, OR10A6, OR10D3, OR10G4, OR10G7, OR10G8, OR10G9, OR10Q1, OR10S1, OR1S1, OR2AG1, OR2AG2, OR2D2, OR4A47, OR4A15, OR4A5, OR4C11, OR4C13, OR4C15, OR4C16, OR4C3, OR4C46, OR4C5, OR4D6, OR4A8P, OR4D9, OR4S2, OR4X1, OR51E1, OR51L1, OR52A1, OR52E1, OR52E2, OR52E4, OR52E6, OR52I1, OR52I2, OR52J3, OR52L1, OR52N1, OR52N2, OR52N4, OR52W1, OR56B1, OR56B4, OR5A1, OR5A2, OR5AK2, OR5AR1, OR5B17, OR5B3, OR5D14, OR5D16, OR5D18, OR5F1, OR5I1, OR5L2, OR5M11, OR5M3, OR5P2, OR5R1, OR5T2, OR5T3, OR5W2, OR6A2, OR6T1, OR6X1, OR8A1, OR8B12, OR8B2, OR8B3, OR8B4, OR8D1, OR8D2, OR8H1, OR8H2, OR8H3, OR8I2, OR8J1, OR8J2, OR8J3, OR8K1, OR8K3, OR8K5, OR8U1, OR9G1, OR9G4, OR9Q2, P2RX3, PTPRJ, ROBO3, SIGIRR, SLC22A10, SLC3A2, SLC5A12, SLCO2B1, SORL1, ST14, SYT8, TENM4, TMEM123, TMEM225, TMPRSS4, TMPRSS5, TRIM5, TRPM5, TSPAN18, y ZP1.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 12. En algunas realizaciones, la diana para uso en iCAR y/o pCAR se selecciona del grupo que consiste en ANO4, AVPR1A, BCL2L14, CACNA2D4, CD163, CD163L1, CD27, CD4, CLEC12A, CLEC1B, CLEC2A, CLEC4C, CLEC7A, CLECL1, CLSTN3, GPR133, GPRC5D, ITGA7, ITGB7, KLRB1, KLRC2, KLRC3, KLRC4, KLRF1, KLRF2, LRP1, LRP6, MANSC1, MANSC4, OLR1, OR10AD1, OR10P1, OR2AP1, OR6C1, OR6C2, OR6C3, OR6C4, OR6C6, OR6C74, OR6C76, OR8S1, OR9K2, ORAI1, P2RX4, P2RX7, PRR4, PTPRB, PTPRQ, PTPRR, SCNN1A, SELPLG, SLC2A14, SLC38A4, SLC5A8, SLC6A15, SLC8B1, SLCO1A2, SLCO1B1, SLCO1B7, SLCO1C1, SSPN, STAB2, TAS2R10, TAS2R13, TAS2R14, TAS2R20, TAS2R30, TAS2R31, TAS2R42, TAS2R43, TAS2R46, TAS2R7, TMEM119, TMEM132B, TMEM132C, TMEM132D, TMPRSS12, TNFRSF1A, TSPAN8, y VSIG10.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 13. En algunas realizaciones, la diana para uso en iCAR y/o pCAR se selecciona del grupo que consiste en ATP4B, ATP7B, FLT3, FREM2, HTR2A, KL, PCDH8, RXFP2, SGCG, SHISA2, SLC15A1, SLITRK6, y TNFRSF19.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 14. En algunas realizaciones, la diana para uso en iCAR y/o pCAR se selecciona del grupo que consiste en ADAM21, BDKRB2, C14orf37, CLEC14A, DLK1, FLRT2, GPR135, GPR137C, JAG2, LTB4R2, MMP14, OR11G2, OR11H12, OR11H6, OR4K1, OR4K15, OR4K5, OR4L1, OR4N2, OR4N5, SLC24A4, y SYNDIG1L.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 15. En algunas realizaciones, la diana para uso en iCAR y/o pCAR se selecciona del grupo que consiste en ANPEP, CD276, CHRNA7, CHRNB4, CSPG4, DUOX1, DUOX2, FAM174B, GLDN, IGDCC4, ITGA11, LCTL, LTK, LYSMD4, MEGF11, NOX5, NRG4, OCA2, OR4F4, OR4M2, OR4N4, PRTG, RHCG, SCAMP5, SEMA4B, SEMA6D, SLC24A1, SLC24A5, SLC28A1, SPG11, STRA6, TRPM1, y TYRO3.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 16. En algunas realizaciones, la diana para uso en iCAR y/o pCAR se selecciona del grupo que consiste en ATP2C2, CACNA1H, CD19, CDH11, CDH15, CDH16, CDH3, CDH5, CNGB1, CNTNAP4, GDPD3, GPR56, GPR97, IFT140, IL4R, ITFG3, ITGAL, ITGAM, ITGAX, KCNG4, MMP15, MSLNL, NOMO1, NOMO3, OR2C1, PIEZO1, PKD1, PKD1L2, QPRT, SCNN1B, SEZ6L2, SLC22A31, SLC5A11, SLC7A6, SPN, TMC5, TMC7, TMEM204, TMEM219, y TMEM8A.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 17. En algunas realizaciones, la diana para uso en iCAR y/o pCAR se selecciona del grupo que consiste en ABCC3, ACE, AOC3, ARL17B, ASGR2, C17orf80, CD300A, CD300C, CD300E, CD300LF, CD300LG, CHRNB1, CLEC10A, CNTNAP1, CPD, CXCL16, ERBB2, FAM171A2, GCGR, GLP2R, GP1BA, GPR142, GUCY2D, ITGA2B, ITGA3, ITGAE, ITGB3, KCNJ12, LRRC37A2, LRRC37A3, LRRC37A, LRRC37B, MRC2, NGFR, OR1A2, OR1D2, OR1G1, OR3A1, OR3A2, OR4D1, OR4D2, RNF43, SCARF1, SCN4A, SDK2, SECTM1, SEZ6, SHPK, SLC26A11, SLC5A10, SPACA3, TMEM102, TMEM132E, TNFSF12, TRPV3, TTYH2, y TUSC5.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 18. En algunas realizaciones, la diana para uso en iCAR y/o pCAR se selecciona del grupo que consiste en APCDD1, CDH19, CDH20, CDH7, COLEC12, DCC, DSC1, DSG1, DSG3, DYNAP, MEP1B, PTPRM, SIGLEC15, y TNFRSF11A.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 19. En algunas realizaciones, la diana para uso en iCAR y/o pCAR se selecciona del grupo que consiste en ABCA7, ACPT, BCAM, C19orf38, C19orf59, C5AR1, CATSPERD, CATSPERG, CD22, CD320, CD33, CD97, CEACAM19, CEACAM1, CEACAM21, CEACAM3, CEACAM4, CLEC4M, DLL3, EMR1, EMR2, EMR3, ERVV-1, ERVV-2, FAM187B, FCAR, FFAR3, FPR1, FXYD5, GFY, GP6, GPR42, GRIN3B, ICAM3, IGFLR1, IL12RB1, IL27RA, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIRREL2, KISS1R, LAIR1, LDLR, LILRA1, LILRA2, LILRA4, LILRA6, LILRB1, LILRB2, LILRB3, LILRB4, LILRB5, LINGO3, LPHN1, LRP3, MADCAM1, MAG, MEGF8, MUC16, NCR1, NOTCH3, NPHS1, OR10H1, OR10H2, OR10H3, OR10H4, OR1I1, OR2Z1, OR7A10, OR7C1, OR7D4, OR7E24, OR7G1, OR7G2, OR7G3, PLVAP, PTGIR, PTPRH, PTPRS, PVR, SCN1B, SHISA7, SIGLEC10, SIGLEC11, SIGLEC12, SIGLEC5, SIGLEC6, SIGLEC8, SIGLEC9, SLC44A2, SLC5A5, SLC7A9, SPINT2, TARM1, TGFBR3L, TMC4, TMEM91, TMEM161A, TMPRSS9, TNFSF14, TNFSF9, TRPM4, VN1R2, VSIG10L, VSTM2B, y ZNRF4.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 20. En algunas realizaciones, la diana para uso en iCAR y/o pCAR se selecciona del grupo que consiste en ABHD12, ADAM33, ADRA1D, APMAP, ATRN, CD40, CD93, CDH22, CDH26, CDH4, FLRT3, GCNT7, GGT7, JAG1, LRRN4, NPBWR2, OCSTAMP, PTPRA, PTPRT, SEL1L2, SIGLEC1, SIRPA, SIRPB1, SIRPG, SLC24A3, SLC2A10, SLC4A11, SSTR4, y THBD.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 21. En algunas realizaciones, la diana para uso en iCAR y/o pCAR se selecciona del grupo que consiste en CLDN8, DSCAM, ICOSLG, IFNAR1, IFNGR2, IGSF5, ITGB2, KCNJ15, NCAM2, SLC19A1, TMPRSS15, TMPRSS2, TMPRSS3, TRPM2, y UMODL1.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma 22. En algunas realizaciones, la diana para uso en iCAR y/o pCAR se selecciona del grupo que consiste en CACNA11, CELSR1, COMT, CSF2RB, GGT1, GGT5, IL2RB, KREMEN1, MCHR1, OR11H1, P2RX6, PKDREJ, PLXNB2, SCARF2, SEZ6L, SSTR3, SUSD2, TMPRSS6, y TNFRSF13C.
En algunas realizaciones, el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se encuentra en el cromosoma X. En algunas realizaciones, la diana para uso en iCAR y/o pCAR se selecciona del grupo que consiste en ATP6AP2, ATP7A, CNGA2, EDA2R, FMR1NB, GLRA4, GPR112, GUCY2F, HEPH, P2RY10, P2RY4, PLXNA3, PLXNB3, TLR8, VSIG4, y XG.
En algunas realizaciones, el aCAR usado para tratar el cáncer se dirige contra o se une específicamente a cualquier proteína de membrana que se exprese en el tejido tumoral, siempre que el iCAR se exprese en cada tejido normal en el que se exprese la proteína diana. En algunas realizaciones, el aCAR puede unirse específicamente o dirigirse a una proteína asociada a un tumor, un antígeno asociado a un tumor y/o antígenos en ensayos clínicos, una diana de CAR como se indica en la Tabla 1, así como cualquier proteína de superficie celular que se exprese en un tejido tumoral con la que se pueda corresponder o emparejar un iCAR con respecto a la unión a la diana, según los criterios enumerados en la solicitud. En algunas realizaciones, el aCAR puede ser cualquier proteína expresada con un dominio extracelular, siempre que el iCAR se exprese en los mismos tejidos que el aCAR o en cualquier tejido vital, pero se pierda en las células tumorales. En algunas realizaciones, el aCAR usado para tratar el cáncer, tal como cualquiera de los tipos de cáncer enumerados anteriormente, se dirige conta o se une específicamente a un epítopo de superficie celular no polimórfico seleccionado de los antígenos enumerados en Tabla 1, tal como CD19. En algunas realizaciones, la diana de aCAR, iCAR y/o pCAR es cualquier diana con un dominio extracelular. En algunas realizaciones, el aCAR usado para tratar el cáncer se dirige contra, o se une específicamente a, un epítopo de superficie celular no polimórfico seleccionado de, pero sin limitarse a, la siguiente lista de antígenos: CD19, CD20, CD22,CD10, CD7, CD49f, CD56, CD74, CAIX IgK, ROR1, ROR2, CD30, LewisY, CD33, CD34,CD38, CD123, CD28, CD44v6, CD44, CD41, CD133, CD138, NKG2D-L, CD139, BCMA, GD2,GD3 ,hTERT, FBP, EGP-2, EGP-40, FR-a, L1-CAM, ErbB2,3,4, EGFRvIII, VEGFR-2, IL-13Ra2, FAP, Mesothelin, c-MET, PSMA, CEA, kRas, MAGE-A1, MUC1MUC16, PDL1, PSCA, EpCAM, FSHR, AFP, AXL, CD80 CD89, CDH17,CLD18, GPC3, TEM8, TGFB1, NY-ESO-1 WT-1 y EGFR. En algunas realizaciones, la diana de aCAR, iCAR y/o pCAR es un antígeno enumerado en Tabla 1.
Tabla 1. Antígenos diana de CAR, incluyendo algunos evaluados en ensayos registrados en ClinicalTrials.gov
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Tabla 2: Otros antígenos diana de CAR
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ii. RESTO DE RECONOCIMIENTO: aCAR, iCAR y pCAR
La presente invención también proporciona restos de reconocimiento diseñados para proporcionar una unión específica a la diana. El resto de reconocimiento permite dirigir la unión específica y dirigida de aCAR, iCAR y/o pCAR. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento diseñado para proporcionar una unión específica a la diana proporciona una unión específica a un epítopo polimórfico extracelular. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento es parte de un dominio extracelular de aCAR, iCAR y/o pCAR. En algunas realizaciones, el dominio extracelular comprende un anticuerpo, derivado o fragmento del mismo, tal como un anticuerpo humanizado; un anticuerpo humano; un fragmento funcional de un anticuerpo; un anticuerpo de un solo dominio, tal como un nanocuerpo; un anticuerpo recombinante; y un fragmento variable monocatenario (scFv). En algunas realizaciones, el dominio extracelular comprende un mimético de anticuerpo, tal como una molécula de aficuerpo; una afilina; un afímero; una afitina; un alfacuerpo; un anticalino; un avímero; un DARPin; un finómero; un péptido de dominio de Kunitz; y un monocuerpo. En algunas realizaciones, el dominio extracelular comprende un aptámero.
En general, se puede usar cualquier tecnología relevante para diseñar un resto de reconocimiento que confiera a los aCAR y pCAR o iCAR una unión específica a sus dianas. Por ejemplo, los restos de reconocimiento que comprenden esta biblioteca iCAR-aCAR pueden derivar de un conjunto de restos de reconocimiento maestros idealmente seleccionado de una biblioteca de presentación combinatoria, de modo que:
- Colectivamente, los restos de reconocimiento seleccionados se dirigen contra los productos de la superficie celular de una serie de genes que residen en cada uno de los dos brazos de los 22 autosomas humanos. Cuanto más corta es la distancia entre genes vecinos, más completa es la cobertura, y por tanto, mayor es la universalidad de uso.
- Para cada uno de los genes seleccionados, se aísla un conjunto de restos de reconocimiento específicos de alelos, cada uno de los cuales permite una discriminación rigurosa entre las diferentes variantes alélicas que prevalecen en la población humana. Cuanto mayor sea el número de variantes seleccionadas como dianas, mayor será el número de pares de genes terapéuticos que se pueden ofrecer a los pacientes.
Un producto alélico dado puede convertirse en una diana potencial de pCAR o iCAR en un paciente, y una diana útil de aCAR en otro paciente que posea el mismo alelo, según el patrón particular de LOH en cada caso. Por lo tanto, a medida que se identifiquen los genes del resto de reconocimiento adecuados, cada uno se injertará tanto en un armazón de genes de pCAR como de iCAR y de aCAR. Por lo tanto, es deseable que todos los restos de reconocimiento dirigidos a variantes alélicas del mismo gen posean afinidades de unión de un intervalo similar. Dentro de un conjunto dado de restos de reconocimiento, todas las combinaciones posibles de pares pCAR-aCAR o iCAR-aCAR pueden ensamblarse previamente para asegurar la mayor cobertura de composiciones alélicas potenciales de ese gen en toda la población.
En algunas realizaciones, el paciente es heterocigoto para el alelo mayor y uno menor, cuyos productos difieren en una sola posición a lo largo del polipéptido codificado como resultado de un SNP no sinónimo o, con menor frecuencia, una indel. En algunas otras realizaciones, un paciente es heterocigoto para dos alelos menores que difieren del principal en dos posiciones separadas. Dependiendo del evento de LOH particular que involucre dicho gen en pacientes individuales, un epítopo variante dado puede servir como una diana de iCAR en un paciente y una diana de aCAR en otro. En algunas realizaciones, el epítopo variante que puede servir como diana de iCAR no es la variante del alelo principal. En algunas realizaciones, el epítopo variante que puede servir como diana de iCAR es un alelo menor.
La identificación de un mAb específico de variantes (a saber, un mAb específico para el epítopo codificado por el alelo menor 'a') es bien conocida en la técnica, y es similar, en principio, a la identificación de un mAb contra cualquier determinante antigénico convencional, y por lo general se puede lograr mejor a través de un cribado de alto rendimiento de una biblioteca de scFv de anticuerpos recombinantes, utilizando, por ejemplo, tecnologías de visualización en fagos (Barbas et al., 2004), ribosomas (Hanes et al., 1997) o levaduras (Chao et al., 2006). El antígeno empleado para el cribado de la biblioteca puede ser un péptido sintético que abarque la posición de variación entre los dos alelos (normalmente 15-20 aminoácidos de longitud o más), un polipéptido recombinante de longitud completa que puede estar comercialmente disponible o puede ser sintetizado a medida por una de las muchas compañías que operan en este campo, o incluso células completas que expresan dicha variante alélica a un alto nivel en virtud de la transfección génica (por ejemplo, electroporación de ARNm que codifica el ADNc de longitud completa clonado como molde para la transcripción de ARNm in vitro en el vector pGEM4Z/A64 (Boczkowski et al., 2000)), siguiendo una etapa de sustracción realizada en las mismas células que no expresan este alelo. Estos métodos son bien conocidos, y se describen, por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cuarta edición) Green y Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Antibodies: A Laboratory Manual (Segunda edición), Publicado por Edward A. Greenfield, 2012 CSH laboratory press; Using Antibodies, A laboratory manual by Ed Harlow y David Lane, 1999 CSH laboratory press.
Por definición, el epítopo correspondiente (en la misma posición) que está codificado por el alelo principal ('A'), crea un determinante antigénico único que difiere del creado por 'a' en la identidad de un solo aminoácido (SNP) o longitud (indel; por ejemplo, inserción o deleción). Este determinante, en principio, puede ser reconocido por un conjunto diferente de mAbs identificados por la misma, u otra, tecnología de detección de presentación de anticuerpos. La capacidad de distintos miembros en cada uno de los dos conjuntos de mAbs identificados para distinguir entre los dos epítopos o variantes, por ejemplo un anticuerpo del primer conjunto se une al producto del alelo 'a' pero no al de 'A', y un Ab del segundo conjunto se une recíprocamente a 'A' pero no a 'a', se puede determinar usando ensayos de unión convencionales tales como ELISA o citometría de flujo (Skora et al., 2015) u otra técnica para la tinción celular. Alternativamente, una vez que se identifica que un Ab que se une a 'a' no se une a 'A', y se determina su secuencia de proteína, se puede usar potencialmente un método computacional para predecir la secuencia de un scFv de anticuerpo 'complementario' que se une a 'A' pero no a 'a'. Para un método computacional de este tipo, véase, por ejemplo, (Sela-Culang et al., 2015a,b).
En algunas realizaciones, por ejemplo con respecto a los genes del locus de HLA-clase I, HLA-A, HLA-B y HLA-C como los genes diana, existen disponibles numerosos anticuerpos monoclonales específicos de alelos, por ejemplo, pero sin limitarse a, los anticuerpos listados en el Ejemplo 3.
En algunas realizaciones, la diana para uso en la generación de un resto de reconocimiento comprende al menos un epítopo polimórfico extracelular. En algunas realizaciones, la diana es el producto de un gen que está ubicado en el cromosoma 1, cromosoma 2, cromosoma 3, cromosoma 4, cromosoma 5, cromosoma 6, cromosoma 7, cromosoma 8, cromosoma 9, cromosoma 10, cromosoma 11, cromosoma 12, cromosoma 13, cromosoma 14, cromosoma 15, cromosoma 16, cromosoma 17, cromosoma 18, cromosoma 19, cromosoma 20, cromosoma 21, cromosoma 22, o cromosoma X.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 1. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en ABCA4, ADAM30, AQP10, ASTN1, C1orf101, CACNA1S, CATSPER4, CD101, CD164L2, CD1A, CD1C, CD244, CD34, CD46, CELSR2, CHRNB2, CLCA2, CLDN19, CLSTN1, CR1, CR2, CRB1, CSF3R, CSMD2, ECE1, ELTD1, EMC1, EPHA10, EPHA2, EPHA8, ERMAP, FCAMR, FCER1A, FCGR1B, FCGR2A, FCGR2B, FCGR3A, FCRL1, FCRL3, FCRL4, FCRL5, FCRL6, GJB4, GPA33, GPR157, GPR37L1, GPR88, HCRTR1, IGSF3, IGSF9, IL22RA1, IL23R, ITGA10, KIAA1324, KIAA2013, LDLRAD2, LEPR, LGR6, LRIG2, LRP8, LRRC52, LRRC8B, LRRN2, LY9, MIA3, MR1, MUC1, MXRA8, NCSTN, NFASC, NOTCH2, NPR1, NTRK1, OPN3, OR10J1, OR10J4, OR10K1, OR10R2, OR10T2, OR10X1, OR11L1, OR14A16, OR14I1, OR14K1, OR2AK2, OR2C3, OR2G2, OR2G3, OR2L2, OR2M7, OR2T12, OR2T27, OR2T1, OR2T3, OR2T29, OR2T33, OR2T34, OR2T35, OR2T3, OR2T4, OR2T5, OR2T6, OR2T7, OR2T8, OR2W3, OR6F1, OR6K2, OR6K3, OR6K6, OR6N1, OR6P1, OR6Y1, PDPN, PEAR1, PIGR, PLXNA2, PTCH2, PTCHD2, PTGFRN, PTPRC, PTPRF, PTGFRN, PVRL4, RHBG, RXFP4, S1PR1, SCNN1D, SDC3, SELE, SELL, SELP, SEMA4A, SEMA6C, SLAMF7, SLAMF9, SLC2A7, SLC5A9, TACSTD2, TAS1R2, TIE1, TLR5, TMEM81, TNFRSF14, TNFRSF1B, TRABD2B, USH2A, VCAM1, y ZP4.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 1. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en ABCA4, ADAM30, AQP10, ASTN1, C1orf101, CACNA1S, CATSPER4, CD101, CD164L2, CD1A, CD1C, CD244, CD34, CD46, CELSR2, CHRNB2, CLCA2, CLDN19, CLSTN1, CR1, CR2, CRB1, CSF3R, CSMD2, ECE1, ELTD1, EMC1, EPHA10, EPHA2, EPHA8, ERMAP, FCAMR, FCER1A, FCGR1B, FCGR2A, FCGR2B, FCGR3A, FCRL1, FCRL3, FCRL4, FCRL5, FCRL6, GJB4, GPA33, GPR157, GPR37L1, GPR88, HCRTR1, IGSF3, IGSF9, IL22RA1, IL23R, ITGA10, KIAA1324, KIAA2013, LDLRAD2, LEPR, LGR6, LRIG2, LRP8, LRRC52, LRRC8B, LRRN2, LY9, MIA3, MR1, MUC1, MXRA8, NCSTN, NFASC, NOTCH2, NPR1, NTRK1, OPN3, OR10J1, OR10J4, OR10K1, OR10R2, OR10T2, OR10X1, OR11L1, OR14A16, OR14I1, OR14K1, OR2AK2, OR2C3, OR2G2, OR2G3, OR2L2, OR2M7, OR2T12, OR2T27, OR2T1, OR2T3, OR2T29, OR2T33, OR2T34, OR2T35, OR2T3, OR2T4, OR2T5, OR2T6, OR2T7, OR2T8, OR2W3, OR6F1, OR6K2, OR6K3, OR6K6, OR6N1, OR6P1, OR6Y1, PDPN, PEAR1, PIGR, PLXNA2, PTCH2, PTCHD2, PTGFRN, PTPRC, PTPRF, PTGFRN, PVRL4, RHBG, RXFP4, S1PR1, SCNN1D, SDC3, SELE, SELL, SELP, SEMA4A, SEMA6C, SLAMF7, SLAMF9, SLC2A7, SLC5A9, TACSTD2, TAS1R2, TIE1, TLR5, TMEM81, TNFRSF14, TNFRSF1B, TRABD2B, USH2A, VCAM1, y ZP4.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 2. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en ABCG5, ALK, ASPRV1, ATRAID, CD207, CD8B, CHRNG, CLEC4F, CNTNAP5, CRIM1, CXCR1, DNER, DPP10, EDAR, EPCAM, GPR113, GPR148, GPR35, GPR39, GYPC, IL1RL1, ITGA4, ITGA6, ITGAV, LCT, LHCGR, LRP1B, LRP2, LY75, MARCO, MERTK, NRP2, OR6B2, PLA2R1, PLB1, PROKR1, PROM2, SCN7A, SDC1, SLC23A3, SLC5A6, TGOLN2, THSD7B, TM4SF20, TMEFF2, TMEM178A, TPO, y TRABD2A.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 2. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en ABCG5, ALK, ASPRV1, ATRAID, CD207, CD8B, CHRNG, CLEC4F, CNTNAP5, CRIM1, CXCR1, DNER, DPP10, EDAR, EPCAM, GPR113, GPR148, GPR35, GPR39, GYPC, IL1RL1, ITGA4, ITGA6, ITGAV, LCT, LHCGR, LRP1B, LRP2, LY75, MARCO, MERTK, NRP2, OR6B2, PLA2R1, PLB1, PROKR1, PROM2, SCN7A, SDC1, SLC23A3, SLC5A6, TGOLN2, THSD7B, TM4SF20, TMEFF2, TMEM178A, TPO, y TRABD2A.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 3. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en ACKR2, ALCAM, ANO10, ATP13A4, BTLA, CACNA1D, CACNA2D2, CACNA2D3, CASR, CCRL2, CD200, CD200R1, CD86, CD96, CDCP1, CDHR4, CELSR3, CHL1, CLDN11, CLDN18, CLSTN2, CSPG5, CX3CR1, CXCR6, CYP8B1, DCBLD2, DRD3, EPHA6, EPHB3, GABRR3, GP5, GPR128, GPR15, GPR27, GRM2, GRM7, HEG1, HTR3C, HTR3D, HTR3E, IGSF11, IL17RC, IL17RD, IL17RE, IL5RA, IMPG2, ITGA9, ITGB5, KCNMB3, LRIG1, LRRC15, LRRN1, MST1R, NAALADL2, NRROS, OR5AC1, OR5H1, OR5H14, OR5H15, OR5H6, OR5K2, OR5K3, OR5K4, PIGX, PLXNB1, PLXND1, PRRT3, PTPRG, ROBO2, RYK, SEMA5B, SIDT1, SLC22A14, SLC33A1, SLC4A7, SLITRK3, STAB1, SUSD5, TFRC, TLR9, TMEM108, TMEM44, TMPRSS7, TNFSF10, UPK1B, VIPR1, y ZPLD1.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 3. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en ACKR2, ALCAM, ANO10, ATP13A4, BTLA, CACNA1D, CACNA2D2, CACNA2D3, CASR, CCRL2, CD200, CD200R1, CD86, CD96, CDCP1, CDHR4, CELSR3, CHL1, CLDN11, CLDN18, CLSTN2, CSPG5, CX3CR1, CXCR6, CYP8B1, DCBLD2, DRD3, EPHA6, EPHB3, GABRR3, GP5, GPR128, GPR15, GPR27, GRM2, GRM7, HEG1, HTR3C, HTR3D, HTR3E, IGSF11, IL17RC, IL17RD, IL17RE, IL5RA, IMPG2, ITGA9, ITGB5, KCNMB3, LRIG1, LRRC15, LRRN1, MST1R, NAALADL2, NRROS, OR5AC1, OR5H1, OR5H14, OR5H15, OR5H6, OR5K2, OR5K3, OR5K4, PIGX, PLXNB1, PLXND1, PRRT3, PTPRG, ROBO2, RYK, SEMA5B, SIDT1, SLC22A14, SLC33A1, SLC4A7, SLITRK3, STAB1, SUSD5, TFRC, TLR9, TMEM108, TMEM44, TMPRSS7, TNFSF10, UPK1B, VIPR1, y ZPLD1.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 4. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en ANTXR2, BTC, CNGA1, CORIN, EGF, EMCN, ENPEP, EPHA5, ERVMER34-1, EVC2, FAT1, FAT4, FGFRL1, FRAS1, GPR125, GRID2, GYPA, GYPB, KDR, KIAA0922, KLB, MFSD8, PARM1, PDGFRA, RNF150, TENM3, TLR10, TLR1, TLR6, TMEM156, TMPRSS11A, TMPRSS11B, TMPRSS11 E, TMPRSS11 F, UGT2A1, y UNC5C.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 4. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en ANTXR2, BTC, CNGA1, CORIN, EGF, EMCN, ENPEP, EPHA5, ERVMER34-1, EVC2, FAT1, FAT4, FGFRL1, FRAS1, GPR125, GRID2, GYPA, GYPB, KDR, KIAA0922, KLB, MFSD8, PARM1, PDGFRA, RNF150, TENM3, TLR10, TLR1, TLR6, TMEM156, TMPRSS11A, TMPRSS11B, TMPRSS11 E, TMPRSS11 F, UGT2A1, y UNC5C.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 5. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en ADAM19, ADRB2, BTNL3, BTNL8, BTNL9, C5orf15, CATSPER3, CD180, CDH12, CDHR2, COL23A1, CSF1R, F2RL2, FAM174A, FAT2, FGFR4, FLT4, GABRA6, GABRG2, GPR151, GPR98, GRM6, HAVCR1, HAVCR2, IL31RA, IL6ST, IL7R, IQGAP2, ITGA1, ITGA2, KCNMB1, LIFR, LNPEP, MEGF10, NIPAL4, NPR3, NRG2, OR2V1, OR2Y1, OSMR, PCDH12, PCDH1, PCDHA1, PCDHA2, PCDHA4, PCDHA8, PCDHA9, PCDHB10, PCDHB11, PCDHB13, PCDHB14, PCDHB15, PCDHB16, PCDHB2, PCDHB3, PCDHB4, PCDHB5, PCDHB6, PCDHGA1, PCDHGA4, PDGFRB, PRLR, SEMA5A, SEMA6A, SGCD, SLC1A3, SLC22A4, SLC22A5, SLC23A1, SLC36A3, SLC45A2, SLC6A18, SLC6A19, SLCO6A1, SV2C, TENM2, TIMD4, y UGT3A1.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 5. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en ADAM19, ADRB2, BTNL3, BTNL8, BTNL9, C5orf15, CATSPER3, CD180, CDH12, CDHR2, COL23A1, CSF1R, F2RL2, FAM174A, FAT2, FGFR4, FLT4, GABRA6, GABRG2, GPR151, GPR98, GRM6, HAVCR1, HAVCR2, IL31RA, IL6ST, IL7R, IQGAP2, ITGA1, ITGA2, KCNMB1, LIFR, LNPEP, MEGF10, NIPAL4, NPR3, NRG2, OR2V1, OR2Y1, OSMR, PCDH12, PCDH1, PCDHA1, PCDHA2, PCDHA4, PCDHA8, PCDHA9, PCDHB10, PCDHB11, PCDHB13, PCDHB14, PCDHB15, PCDHB16, PCDHB2, PCDHB3, PCDHB4, PCDHB5, PCDHB6, PCDHGA1, PCDHGA4, PDGFRB, PRLR, SEMA5A, SEMA6A, SGCD, SLC1A3, SLC22A4, SLC22A5, SLC23A1, SLC36A3, SLC45A2, SLC6A18, SLC6A19, SLCO6A1, SV2C, TENM2, TIMD4, y UGT3A1.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 6. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en BAI3, BTN1A1, BTN2A1, BTN2A2, BTN3A1, BTN3A2, BTNL2, CD83, DCBLD1, DLL1, DPCR1, ENPP1, ENPP3, ENPP4, EPHA7, GABBR1, GABRR1, GCNT6, GFRAL, GJB7, GLP1R, GPR110, GPR111, GPR116, GPR126, GPR63, GPRC6A, HFE, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DOA, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQA2, HLA-DQB1, HLA-DQB2, HLA-DRB1, HLA-DRB5, HLA-E, HLA-F, HLA-G, IL20RA, ITPR3, KIAA0319, LMBRD1, LRFN2, LRP11, MAS1L, MEP1A, MICA, MICB, MOG, MUC21, MUC22, NCR2, NOTCH4, OPRM1, OR10C1, OR12D2, OR12D3, OR14J1, OR2B2, OR2B6, OR2J1, OR2W1, OR5V1, PDE10A, PI16, PKHD1, PTCRA, PTK7, RAET1 E, RAET1G, ROS1, SDIM1, SLC16A10, SLC22A1, SLC44A4, TAAR2, TREM1, TREML1, y TREML2.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 6. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en BAI3, BTN1A1, BTN2A1, BTN2A2, BTN3A1, BTN3A2, BTNL2, CD83, DCBLD1, DLL1, DPCR1, ENPP1, ENPP3, ENPP4, EPHA7, GABBR1, GABRR1, GCNT6, GFRAL, GJB7, GLP1R, GPR110, GPR111, GPR116, GPR126, GPR63, GPRC6A, HFE, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DOA, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQA2, HLA-DQB1, HLA-DQB2, HLA-DRB1, HLA-DRB5, HLA-E, HLA-F, HLA-G, IL20RA, ITPR3, KIAA0319, LMBRD1, LRFN2, LRP11, MAS1L, MEP1A, MICA, MICB, MOG, MUC21, MUC22, NCR2, NOTCH4, OPRM1, OR10C1, OR12D2, OR12D3, OR14J1, OR2B2, OR2B6, OR2J1, OR2W1, OR5V1, PDE10A, PI16, PKHD1, PTCRA, PTK7, RAET1 E, RAET1G, ROS1, SDIM1, SLC16A10, SLC22A1, SLC44A4, TAAR2, TREM1, TREML1, y TREML2.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 7. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en AQP1, C7orf50, CD36, CDHR3, CNTNAP2, DPP6, EGFR, EPHA1, EPHB6, ERVW-1, GHRHR, GJC3, GPNMB, GRM8, HUS1, HYAL4, KIAA1324L, LRRN3, MET, MUC12, MUC17, NPC1L1, NPSR1, OR2A12, OR2A14, OR2A25, OR2A42, OR2A7, OR2A2, OR2AE1, OR2F2, OR6V1, PILRA, PILRB, PKD1L1, PLXNA4, PODXL, PTPRN2, PTPRZ1, RAMP3, SLC29A4, SMO, TAS2R16, TAS2R40, TAS2R4, TFR2, THSD7A, TMEM213, TTYH3, ZAN, y ZP3.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 7. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en AQP1, C7orf50, CD36, CDHR3, CNTNAP2, DPP6, EGFR, EPHA1, EPHB6, ERVW-1, GHRHR, GJC3, GPNMB, GRM8, HUS1, HYAL4, KIAA1324L, LRRN3, MET, MUC12, MUC17, NPC1L1, NPSR1, OR2A12, OR2A14, OR2A25, OR2A42, OR2A7, OR2A2, OR2AE1, OR2F2, OR6V1, PILRA, PILRB, PKD1L1, PLXNA4, PODXL, PTPRN2, PTPRZ1, RAMP3, SLC29A4, SMO, TAS2R16, TAS2R40, TAS2R4, TFR2, THSD7A, TMEM213, TTYH3, ZAN, y ZP3.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 8. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en ADAM18, ADAM28, ADAM32, ADAM7, ADAM9, ADRA1A, CDH17, CHRNA2, CSMD1, CSMD3, DCSTAMP, FZD6, GPR124, NRG1, OR4F21, PKHD1L1, PRSS55, SCARA3, SCARA5, SDC2, SLC10A5, SLC39A14, SLC39A4, SLCO5A1, TNFRSF10A, y TNFRSF10B.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 8. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en ADAM18, ADAM28, ADAM32, ADAM7, ADAM9, ADRA1A, CDH17, CHRNA2, CSMD1, CSMD3, DCSTAMP, FZD6, GPR124, NRG1, OR4F21, PKHD1L1, PRSS55, SCARA3, SCARA5, SDC2, SLC10A5, SLC39A14, SLC39A4, SLCO5A1, TNFRSF10A, y TNFRSF10B.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 9. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en ABCA1, AQP7, ASTN2, C9orf135, CA9, CD72, CNTNAP3B, CNTNAP3, CRB2, ENTPD8, GPR144, GRIN3A, IZUMO3, KIAA1161, MAMDC4, MEGF9, MUSK, NOTCH1, OR13C2, OR13C3, OR13C5, OR13C8, OR13C9, OR13D1, OR13F1, OR1B1, OR1J2, OR1K1, OR1L1, OR1L3, OR1L6, OR1L8, OR1N1, OR1N2, OR1Q1, OR2S2, PCSK5, PDCD1LG2, PLGRKT, PTPRD, ROR2, SEMA4D, SLC31A1, TEK, TLR4, TMEM2, y VLDLR.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 9. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en ABCA1, AQP7, ASTN2, C9orf135, CA9, CD72, CNTNAP3B, CNTNAP3, CRB2, ENTPD8, GPR144, GRIN3A, IZUMO3, KIAA1161, MAMDC4, MEGF9, MUSK, NOTCH1, OR13C2, OR13C3, OR13C5, OR13C8, OR13C9, OR13D1, OR13F1, OR1B1, OR1J2, OR1K1, OR1L1, OR1L3, OR1L6, OR1L8, OR1N1, OR1N2, OR1Q1, OR2S2, PCSK5, PDCD1LG2, PLGRKT, PTPRD, ROR2, SEMA4D, SLC31A1, TEK, TLR4, TMEM2, y VLDLR.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 10. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en ABCC2, ADAM8, ADRB1, ANTXRL, ATRNL1, C10orf54, CDH23, CDHR1, CNNM2, COL13A1, COL17A1, ENTPD1, FZD8, FGFR2, GPR158, GRID1, IL15RA, IL2RA, ITGA8, ITGB1, MRC1, NRG3, NPFFR1, NRP1, OPN4, PCDH15, PKD2L1, PLXDC2, PRLHR, RET, RGR, SLC16A9, SLC29A3, SLC39A12, TACR2, TCTN3, TSPAN15, UNC5B, y VSTM4.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 10. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en ABCC2, ADAM8, ADRB1, ANTXRL, ATRNL1, C10orf54, CDH23, CDHR1, CNNM2, COL13A1, COL17A1, ENTPD1, FZD8, FGFR2, GPR158, GRID1, IL15RA, IL2RA, ITGA8, ITGB1, MRC1, NRG3, NPFFR1, NRP1, OPN4, PCDH15, PKD2L1, PLXDC2, PRLHR, RET, RGR, SLC16A9, SLC29A3, SLC39A12, TACR2, TCTN3, TSPAN15, UNC5B, y VSTM4.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 11. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en AMICA1, ANO1, ANO3, APLP2, C11orf24, CCKBR, CD248, CD44, CD5, CD6, CD82, CDON, CLMP, CRTAM, DCHS1, DSCAML1, FAT3, FOLH1, GDPD4, GDPD5, GRIK4, HEPHL1, HTR3B, IFITM10, IL10RA, KIRREL3, LGR4, LRP4, LRP5, LRRC32, MCAM, MFRP, MMP26, MPEG1, MRGPRE, MRGPRF, MRGPRX2, MRGPRX3, MRGPRX4, MS4A4A, MS4A6A, MTNR1B, MUC15, NAALAD2, NAALADL1, NCAM1, NRXN2, OR10A2, OR10A5, OR10A6, OR10D3, OR10G4, OR10G7, OR10G8, OR10G9, OR10Q1, OR10S1, OR1S1, OR2AG1, OR2AG2, OR2D2, OR4A47, OR4A15, OR4A5, OR4C11, OR4C13, OR4C15, OR4C16, OR4C3, OR4C46, OR4C5, OR4D6, OR4A8P, OR4D9, OR4S2, OR4X1, OR51E1, OR51L1, OR52A1, OR52E1, OR52E2, OR52E4, OR52E6, OR52I1, OR52I2, OR52J3, OR52L1, OR52N1, OR52N2, OR52N4, OR52W1, OR56B1, OR56B4, OR5A1, OR5A2, OR5AK2, OR5AR1, OR5B17, OR5B3, OR5D14, OR5D16, OR5D18, OR5F1, OR5I1, OR5L2, OR5M11, OR5M3, OR5P2, OR5R1, OR5T2, OR5T3, OR5W2, OR6A2, OR6T1, OR6X1, OR8A1, OR8B12, OR8B2, OR8B3, OR8B4, OR8D1, OR8D2, OR8H1, OR8H2, OR8H3, OR8I2, OR8J1, OR8J2, OR8J3, OR8K1, OR8K3, OR8K5, OR8U1, OR9G1, OR9G4, OR9Q2, P2RX3, PTPRJ, ROBO3, SIGIRR, SLC22A10, SLC3A2, SLC5A12, SLCO2B1, SORL1, ST14, SYT8, TENM4, TMEM123, TMEM225, TMPRSS4, TMPRSS5, TRIM5, TRPM5, TSPAN18, y ZP1.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 11. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en AMICA1, ANO1, ANO3, APLP2, C11 orf24, CCKBR, CD248, CD44, CD5, CD6, CD82, CDON, CLMP, CRTAM, DCHS1, DSCAML1, FAT3, FOLH1, GDPD4, GDPD5, GRIK4, HEPHL1, HTR3B, IFITM10, IL10RA, KIRREL3, LGR4, LRP4, LRP5, LRRC32, MCAM, MFRP, MMP26, MPEG1, MRGPRE, MRGPRF, MRGPRX2, MRGPRX3, MRGPRX4, MS4A4A, MS4A6A, MTNR1B, MUC15, NAALAD2, NAALADL1, NCAM1, NRXN2, OR10A2, OR10A5, OR10A6, OR10D3, OR10G4, OR10G7, OR10G8, OR10G9, OR10Q1, OR10S1, OR1S1, OR2AG1, OR2AG2, OR2D2, OR4A47, OR4A15, OR4A5, OR4C11, OR4C13, OR4C15, OR4C16, OR4C3, OR4C46, OR4C5, OR4D6, OR4A8P, OR4D9, OR4S2, OR4X1, OR51E1, OR51L1, OR52A1, OR52E1, OR52E2, OR52E4, OR52E6, OR52I1, OR52I2, OR52J3, OR52L1, OR52N1, OR52N2, OR52N4, OR52W1, OR56B1, OR56B4, OR5A1, OR5A2, OR5AK2, OR5AR1, OR5B17, OR5B3, OR5D14, OR5D16, OR5D18, OR5F1, OR5I1, OR5L2, OR5M11, OR5M3, OR5P2, OR5R1, OR5T2, OR5T3, OR5W2, OR6A2, OR6T1, OR6X1, OR8A1, OR8B12, OR8B2, OR8B3, OR8B4, OR8D1, OR8D2, OR8H1, OR8H2, OR8H3, OR8I2, OR8J1, OR8J2, OR8J3, OR8K1, OR8K3, OR8K5, OR8U1, OR9G1, OR9G4, OR9Q2, P2RX3, PTPRJ, ROBO3, SIGIRR, SLC22A10, SLC3A2, SLC5A12, SLCO2B1, SORL1, ST14, SYT8, TENM4, TMEM123, TMEM225, TMPRSS4, TMPRSS5, TRIM5, TRPM5, TSPAN18, y ZP1.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 12. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en ANO4, AVPR1A, BCL2L14, CACNA2D4, CD163, CD163L1, CD27, CD4, CLEC12A, CLEC1B, CLEC2A, CLEC4C, CLEC7A, CLECL1, CLSTN3, GPR133, GPRC5D, ITGA7, ITGB7, KLRB1, KLRC2, KLRC3, KLRC4, KLRF1, KLRF2, LRP1, LRP6, MANSC1, MANSC4, OLR1, OR10AD1, OR10P1, OR2AP1, OR6C1, OR6C2, OR6C3, OR6C4, OR6C6, OR6C74, OR6C76, OR8S1, OR9K2, ORAI1, P2RX4, P2RX7, PRR4, PTPRB, PTPRQ, PTPRR, SCNN1A, SELPLG, SLC2A14, SLC38A4, SLC5A8, SLC6A15, SLC8B1, SLCO1A2, SLCO1B1, SLCO1B7, SLCO1C1, SSPN, STAB2, TAS2R10, TAS2R13, TAS2R14, TAS2R20, TAS2R30, TAS2R31, TAS2R42, TAS2R43, TAS2R46, TAS2R7, TMEM119, TMEM132B, TMEM132C, TMEM132D, TMPRSS12, TNFRSF1A, TSPAN8, y VSIG10.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 12. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en ANO4, AVPR1A, BCL2L14, CACNA2D4, CD163, CD163L1, CD27, CD4, CLEC12A, CLEC1B, CLEC2A, CLEC4C, CLEC7A, CLECL1, CLSTN3, GPR133, GPRC5D, ITGA7, ITGB7, KLRB1, KLRC2, KLRC3, KLRC4, KLRF1, KLRF2, LRP1, LRP6, MANSC1, MANSC4, OLR1, OR10AD1, OR10P1, OR2AP1, OR6C1, OR6C2, OR6C3, OR6C4, OR6C6, OR6C74, OR6C76, OR8S1, OR9K2, ORAI1, P2RX4, P2RX7, PRR4, PTPRB, PTPRQ, PTPRR, SCNN1A, SELPLG, SLC2A14, SLC38A4, SLC5A8, SLC6A15, SLC8B1, SLCO1A2, SLCO1B1, SLCO1B7, SLCO1C1, SSPN, STAB2, TAS2R10, TAS2R13, TAS2R14, TAS2R20, TAS2R30, TAS2R31, TAS2R42, TAS2R43, TAS2R46, TAS2R7, TMEM119, TMEM132B, TMEM132C, TMEM132D, TMPRSS12, TNFRSF1A, TSPAN8, y VSIG10.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 13. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en ATP4B, ATP7B, FLT3, FREM2, HTR2A, KL, PCDH8, RXFP2, SGCG, SHISA2, SLC15A1, SLITRK6, y TNFRSF19.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 13. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en ATP4B, ATP7B, FLT3, FREM2, HTR2A, KL, PCDH8, RXFP2, SGCG, SHISA2, SLC15A1, SLITRK6, y TNFRSF19.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 14. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en ADAM21, BDKRB2, C14orf37, CLEC14A, DLK1, FLRT2, GPR135, GPR137C, JAG2, LTB4R2, MMP14, OR11G2, OR11H12, OR11H6, OR4K1, OR4K15, OR4K5, OR4L1, OR4N2, OR4N5, SLC24A4, y SYNDIG1L.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 14. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en ADAM21, BDKRB2, C14orf37, CLEC14A, DLK1, FLRT2, GPR135, GPR137C, JAG2, LTB4R2, MMP14, OR11G2, OR11H12, OR11H6, OR4K1, OR4K15, OR4K5, OR4L1, OR4N2, OR4N5, SLC24A4, y SYNDIG1L.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 15. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en ANPEP, CD276, CHRNA7, CHRNB4, CSPG4, DUOX1, DUOX2, FAM174B, GLDN, IGDCC4, ITGA11, LCTL, LTK, LYSMD4, MEGF11, NOX5, NRG4, OCA2, OR4F4, OR4M2, OR4N4, PRTG, RHCG, SCAMP5, SEMA4B, SEMA6D, SLC24A1, SLC24A5, SLC28A1, SPG11, STRA6, TRPM1, y TYRO3.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 15. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en ANPEP, CD276, CHRNA7, CHRNB4, CSPG4, DUOX1, DUOX2, FAM174B, GLDN, IGDCC4, ITGA11, LCTL, LTK, LYSMD4, MEGF11, NOX5, NRG4, OCA2, OR4F4, OR4M2, OR4N4, PRTG, RHCG, SCAMP5, SEMA4B, SEMA6D, SLC24A1, SLC24A5, SLC28A1, SPG11, STRA6, TRPM1, y TYRO3.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 16. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en ATP2C2, CACNA1H, CD19, CDH11, CDH15, CDH16, CDH3, CDH5, CNGB1, CNTNAP4, GDPD3, GPR56, GPR97, IFT140, IL4R, ITFG3, ITGAL, ITGAM, ITGAX, KCNG4, MMP15, MSLNL, NOMO1, NOMO3, OR2C1, PIEZO1, PKD1, PKD1L2, QPRT, SCNN1B, SEZ6L2, SLC22A31, SLC5A11, SLC7A6, SPN, TMC5, TMC7, TMEM204, TMEM219, y TMEM8A.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 16. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en ATP2C2, CACNA1H, CD19, CDH11, CDH15, CDH16, CDH3, CDH5, CNGB1, CNTNAP4, GDPD3, GPR56, GPR97, IFT140, IL4R, ITFG3, ITGAL, ITGAM, ITGAX, KCNG4, MMP15, MSLNL, NOMO1, NOMO3, OR2C1, PIEZO1, PKD1, PKD1L2, QPRT, SCNN1B, SEZ6L2, SLC22A31, SLC5A11, SLC7A6, SPN, TMC5, TMC7, TMEM204, TMEM219, y TMEM8A.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 17. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en ABCC3, ACE, AOC3, ARL17B, ASGR2, C17orf80, CD300A, CD300C, CD300E, CD300LF, CD300LG, CHRNB1, CLEC10A, CNTNAP1, CPD, CXCL16, ERBB2, FAM171A2, GCGR, GLP2R, GP1BA, GPR142, GUCY2D, ITGA2B, ITGA3, ITGAE, ITGB3, KCNJ12, LRRC37A2, LRRC37A3, LRRC37A, LRRC37B, MRC2, NGFR, OR1A2, OR1D2, OR1G1, OR3A1, OR3A2, OR4D1, OR4D2, RNF43, SCARF1, SCN4A, SDK2, SECTM1, SEZ6, SHPK, SLC26A11, SLC5A10, SPACA3, TMEM102, TMEM132E, TNFSF12, TRPV3, TTYH2, y TUSC5.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 17. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en ABCC3, ACE, AOC3, ARL17B, ASGR2, C17orf80, CD300A, CD300C, CD300E, CD300LF, CD300LG, CHRNB1, CLEC10A, CNTNAP1, CPD, CXCL16, ERBB2, FAM171A2, GCGR, GLP2R, GP1BA, GPR142, GUCY2D, ITGA2B, ITGA3, ITGAE, ITGB3, KCNJ12, LRRC37A2, LRRC37A3, LRRC37A, LRRC37B, MRC2, NGFR, OR1A2, OR1D2, OR1G1, OR3A1, OR3A2, OR4D1, OR4D2, RNF43, SCARF1, SCN4A, SDK2, SECTM1, SEZ6, SHPK, SLC26A11, SLC5A10, SPACA3, TMEM102, TMEM132E, TNFSF12, TRPV3, TTYH2, y TUSC5.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 18. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en APCDD1, CDH19, CDH20, CDH7, COLEC12, DCC, DSC1, DSG1, DSG3, DYNAP, MEP1B, PTPRM, SIGLEC15, y TNFRSF11A.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 18. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en APCDD1, CDH19, CDH20, CDH7, COLEC12, DCC, DSC1, DSG1, DSG3, DYNAP, MEP1B, PTPRM, SIGLEC15, y TNFRSF11A.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 19. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en ABCA7, ACPT, BCAM, C19orf38, C19orf59, C5AR1, CATSPERD, CATSPERG, CD22, CD320, CD33, CD97, CEACAM19, CEACAM1, CEACAM21, CEACAM3, CEACAM4, CLEC4M, DLL3, EMR1, EMR2, EMR3, ERVV-1, ERVV-2, FAM187B, FCAR, FFAR3, FPR1, FXYD5, GFY, GP6, GPR42, GRIN3B, ICAM3, IGFLR1, IL12RB1, IL27RA, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIRREL2, KISS1R, LAIR1, LDLR, LILRA1, LILRA2, LILRA4, LILRA6, LILRB1, LILRB2, LILRB3, LILRB4, LILRB5, LINGO3, LPHN1, LRP3, MADCAM1, MAG, MEGF8, MUC16, NCR1, NOTCH3, NPHS1, OR10H1, OR10H2, OR10H3, OR10H4, OR1I1, OR2Z1, OR7A10, OR7C1, OR7D4, OR7E24, OR7G1, OR7G2, OR7G3, PLVAP, PTGIR, PTPRH, PTPRS, PVR, SCN1B, SHISA7, SIGLEC10, SIGLEC11, SIGLEC12, SIGLEC5, SIGLEC6, SIGLEC8, SIGLEC9, SLC44A2, SLC5A5, SLC7A9, SPINT2, TARM1, TGFBR3L, TMC4, TMEM91, TMEM161A, TMPRSS9, TNFSF14, TNFSF9, TRPM4, VN1R2, VSIG10L, VSTM2B, y ZNRF4.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 19. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en ABCA7, ACPT, BCAM, C19orf38, C19orf59, C5AR1, CATSPERD, CATSPERG, CD22, CD320, CD33, CD97, CEACAM19, CEACAM1, CEACAM21, CEACAM3, CEACAM4, CLEC4M, DLL3, EMR1, EMR2, EMR3, ERVV-1, ERVV-2, FAM187B, FCAR, FFAR3, FPR1, FXYD5, GFY, GP6, GPR42, GRIN3B, ICAM3, IGFLR1, IL12RB1, IL27RA, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIRREL2, KISS1R, LAIR1, LDLR, LILRA1, LILRA2, LILRA4, LILRA6, LILRB1, LILRB2, LILRB3, LILRB4, LILRB5, LINGO3, LPHN1, LRP3, MADCAM1, MAG, MEGF8, MUC16, NCR1, NOTCH3, NPHS1, OR10H1, OR10H2, OR10H3, OR10H4, OR1I1, OR2Z1, OR7A10, OR7C1, OR7D4, OR7E24, OR7G1, OR7G2, OR7G3, PLVAP, PTGIR, PTPRH, PTPRS, PVR, SCN1B, SHISA7, SIGLEC10, SIGLEC11, SIGLEC12, SIGLEC5, SIGLEC6, SIGLEC8, SIGLEC9, SLC44A2, SLC5A5, SLC7A9, SPINT2, TARM1, TGFBR3L, TMC4, TMEM91, TMEM161A, TMPRSS9, TNFSF14, TNFSF9, TRPM4, VN1R2, VSIG10L, VSTM2B, y ZNRF4.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 20. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en ABHD12, ADAM33, ADRA1D, APMAP, ATRN, CD40, CD93, CDH22, CDH26, CDH4, FLRT3, GCNT7, GGT7, JAG1, LRRN4, NPBWR2, OCSTAMP, PTPRA, PTPRT, SEL1L2, SIGLEC1, SIRPA, SIRPB1, SIRPG, SLC24A3, SLC2A10, SLC4A11, SSTR4, y THBD.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 20. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en ABHD12, ADAM33, ADRA1D, APMAP, ATRN, CD40, CD93, CDH22, CDH26, CDH4, FLRT3, GCNT7, GGT7, JAG1, LRRN4, NPBWR2, OCSTAMP, PTPRA, PTPRT, SEL1L2, SIGLEC1, SIRPA, SIRPB1, SIRPG, SLC24A3, SLC2A10, SLC4A11, SSTR4, y THBD.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 21. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en CLDN8, DSCAM, ICOSLG, IFNAR1, IFNGR2, IGSF5, ITGB2, KCNJ15, NCAM2, SLC19A1, TMPRSS15, TMPRSS2, TMPRSS3, TRPM2, y UMODL1.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 21. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en CLDN8, DSCAM, ICOSLG, IFNAR1, IFNGR2, IGSF5, ITGB2, KCNJ15, NCAM2, SLC19A1, TMPRSS15, TMPRSS2, TMPRSS3, TRPM2, y UMODL1.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 22. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR proporciona especificidad para al menos al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en CACNA11, CELSR1, COMT, CSF2RB, GGT1, GGT5, IL2RB, KREMEN1, MCHR1, OR11H1, P2RX6, PKDREJ, PLXNB2, SCARF2, SEZ6L, SSTR3, SUSD2, TMPRSS6, y TNFRSF13C.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma 22. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en CACNA1I, CELSR1, COMT, CSF2RB, GGT1, GGT5, IL2RB, KREMEN1, MCHR1, OR11H1, P2RX6, PKDREJ, PLXNB2, SCARF2, SEZ6L, SSTR3, SUSD2, TMPRSS6, y TNFRSF13C.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma X. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en ATP6AP2, ATP7A, CNGA2, EDA2R, FMR1NB, GLRA4, GPR112, GUCY2F, HEPH, P2RY10, P2RY4, PLXNA3, PLXNB3, TLR8, VSIG4, y XG.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del cromosoma X. En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el iCAR o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en ATP6AP2, ATP7A, CNGA2, EDA2R, FMR1NB, GLRA4, GPR112, GUCY2F, HEPH, P2RY10, P2RY4, PLXNA3, PLXNB3, TLR8, VSIG4, y XG.
Las secuencias que codifican las regiones variables de estos anticuerpos pueden clonarse fácilmente a partir del hibridoma relevante, y pueden usarse para construir genes que codifican scFv contra cualquier diana deseada, incluyendo, por ejemplo, los scFv contra variantes de epítopos alélicos de HLA Clase-I específicos, y que serían adecuados para incorporación en un constructo de CAR usando herramientas ampliamente disponibles como se describe, por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cuarta edición) Green y Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Antibodies: A Laboratory Manual (Segunda edición), Publicado por Edward A. Greenfield, 2012 CSH laboratory press; Using Antibodies, A laboratory manual by Ed Harlow y David Lane, 1999 CSH laboratory press.
La presente invención proporciona una base de datos que comprende secuencias de ADN de variantes polimórficas perdidas en células tumorales debido a LOH, y que codifican productos de la superficie celular, en las que la variación en la secuencia de ADN da como resultado una variación en la secuencia de aminoácidos en un dominio extracelular de la proteína codificada. La información se recuperó de varias bases de datos abiertas al público en general, tal como TCGA, disponible en el portal público de datos TCGA del Instituto Nacional de Salud (https://gdc.cancer.gov/) que proporciona, entre otros, datos que se pueden usar para inferir el número relativo de copias del gen en una variedad de tipos de tumores, y el portal cbio para datos TCGA en http://www.cbioportal.org (Cerami et al., 2012, Gao et al., 2013); la base de datos del Exome Aggregation Consortium (ExAC) (exac.broadinstitute.org, Lek et al., 2016), que proporciona, entre otros, frecuencias alélicas de variantes de SNP en varias poblaciones; la base de datos v6p de Genotype-Tissue Expression (GTEX) (acceso dbGaP phs000424.v6.p1) (https://gtexportal.org/home, Consorcio GT. Human genomics, 2015) que incluye datos de expresión tisular para genes; y bases de datos que brindan información estructural de proteínas, tal como Human Protein Atlas (Uhlen et al., 2015); el Cell Surface Protein Atlas (Bausch-Fluck et al., 2015), una base de datos basada en espectrometría de masas de proteínas de superficie celular N-glucosiladas, y la base de datos UniProt (www.uniprot.org/downloads).
La presente invención proporciona además un método para la identificación en todo el genoma de genes que codifican proteínas de superficie celular expresadas que experimentan LOH. Los genes identificados deben cumplir los siguientes criterios: 1) El gen codifica una proteína transmembrana -por lo tanto, que tiene una porción expresada en la superficie celular para permitir la unión de iCAR o pCAR; 2) El gen tiene al menos dos alelos expresados (en al menos una población étnica comprobada); 3) La variación alélica encontrada para ese gen provoca un cambio de aminoácido con respecto a la secuencia de referencia en una región extracelular de la proteína; 4) El gen está ubicado en una región cromosómica que sufre LOH en cáncer; 5) El gen se expresa en un tejido de origen de un tipo de tumor en el que se encontró que la región correspondiente sufría LOH.
En principio, los genes descritos anteriormente, adecuados para codificar dianas para la unión de iCAR o pCAR, pueden identificarse mediante cualquier método conocido en la técnica, y no solo mediante extracción de bases de datos. Por ejemplo, el concepto de LOH no es nuevo, y la información de LOH para genes, cromosomas o regiones genómicas/cromosómicas específicos en tumores específicos ya se ha publicado en la bibliografía, y por lo tanto los genes candidatos se pueden obtener de las publicaciones disponibles. Alternativamente, dicha información se puede encontrar mediante hibridaciones del genoma completo con marcadores cromosómicos tales como sondas de microsatélites (Medintz et al., 2000, Genoma Res.
Agosto 2000; 10(8): 1211-1218) o por cualquier otro método adecuado (Ramos y Amorim, 2015, J. Bras. Patol. Med. Lab. 51 (3):198-196).
Del mismo modo, la información sobre las variantes alélicas está disponible públicamente en diversas bases de datos, y también se puede obtener fácilmente para un caso personalizado mediante la secuenciación genómica de una región sospechosa. Además, la información sobre la estructura de la proteína y el patrón de expresión está disponible públicamente, y es fácilmente accesible como se describe anteriormente.
En consecuencia, dado que la información sobre los diversos criterios para muchos genes y SNP está disponible públicamente, y las técnicas para recuperarla son generalmente conocidas, la principal novedad de la aplicación es utilizar LOH como criterio para escoger una diana para el reconocimiento de iCAR o pCAR, y la concepto de tratamiento personalizado basado en un alelo específico perdido en un paciente específico.
Como ejemplo no limitativo, se encontró según la presente invención los genes HLA, incluyendo los genes HLA-I y HLA-II no clásicos (por ejemplo, HLA-A, HLA-B HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-DM, HLA-DO, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR HLA-K y o HLA-L) LOH en frecuencias variables, es un evento relativamente frecuente en muchos tipos de tumores (véanse las Figs.
10A-C), lo que haría que estos genes fueran buenos candidatos para ser usados como dianas para el reconocimiento de iCAR/pCAR para los fines de la presente invención.
El reconocimiento de la diana de aCAR en células normales en cualquier tejido esencial sano en ausencia de la diana de pCAR o iCAR sería perjudicial, y está estrictamente prohibido. En este sentido, el concepto de pares pCAR-aCAR o iCAR-aCAR, como se propone aquí, constituye un interruptor de activación a prueba de fallos, como: i) células que no expresan el gen seleccionado (en caso de que el aCAR y el pCAR o iCAR se dirijan contra diferentes productos del mismo gen) no serán atacadas debido a la ausencia del antígeno diana de aCAR; ii) células normales que expresan este mismo gen coexpresarán ambos alelos y no serán atacadas debido a la dominancia de pCAR o iCAR; iii) en caso de que pCAR o iCAR se dirijan contra el producto de un gen constitutivo polimórfico, todas las células del cuerpo estarán protegidas; y iv) sólo se atacarán las células tumorales que expresan la diana de aCAR pero no la de pCAR o la iCAR. En algunas realizaciones, el reconocimiento de la diana de aCAR en células normales en cualquier tejido esencial sano en ausencia de la diana de pCAR o iCAR sería perjudicial. En algunas realizaciones, las células que no expresan el gen seleccionado (en caso de que el aCAR y el pCAR o iCAR se dirijan contra diferentes productos del mismo gen) no serán atacadas debido a la ausencia del antígeno diana de aCAR. En algunas realizaciones, las células normales que expresan este mismo gen coexpresarán ambos alelos, y no serán atacadas debido a la dominancia de pCAR o iCAR. En algunas realizaciones, cuando pCAR o iCAR se dirigen contra el producto de un gen constitutivo polimórfico, todas las células del cuerpo estarán protegidas. En algunas realizaciones, solo se atacarán las células tumorales que expresan la diana de aCAR pero no la de pCAR o el iCAR. En algunas realizaciones, se protegerán las células que expresan las dianas del par aCAR/iCAR o ambas dianas del par aCAR/pCAR.
Como se destacó anteriormente, según la invención, debe haber un dominio permanente de la señal inhibidora sobre la señal activadora. Por lo tanto, es necesario garantizar que ningún gen aCAR se exprese en una célula asesina dada, en ningún momento, en ausencia de su pareja iCAR. Esto puede implementarse a través del ensamblaje en tándem de estos pares de genes iCAR-aCAR como productos de una sola cadena o a través de una modalidad bicistrónica adecuada basada, por ejemplo, en un sitio de entrada al ribosoma interno o en uno de varios péptidos virales 2A autoescindibles. Como sugiere la gran cantidad de datos dados a conocer sobre la expresión bi-cistrónica, el gen iCAR siempre se ubicará en dirección 5’ de su pareja aCAR, para garantizar una estequiometría favorable. Otra opción sería manipular las células asesinas para que expresen tanto aCAR como iCAR o pCAR transfectando o transduciendo la célula asesina con dos constructos independientes, codificando cada constructo un aCAR o un iCAR/pCAR. Por supuesto, esto no es un problema cuando se usa un par génico pCAR-aCAR. En algunas realizaciones, la señal inhibidora es dominante sobre la señal activadora. En algunas realizaciones, aCAR e iCAR o pCAR se expresan simultáneamente en la misma célula.
Otra opción atractiva para asegurar la dominancia de iCAR es separar el resto de reconocimiento de aCAR de su porción activadora/coestimuladora, de manera que ambas entidades solo puedan ensamblarse en un receptor funcional en presencia de una molécula pequeña heterodimerizante. La capacidad de controlar estrictamente el estado operativo de dichos receptores divididos mediante una sincronización, dosificación y ubicación precisas se demostró recientemente en el contexto de los CAR antitumorales (Wu et al., 2015).
Además, es probable que el dominio esperado también sea intrínseco a la composición particular de los elementos de señalización de iCAR incorporados en la porción intracelular en el diseño de iCAR seleccionado que debería 'competir' con la fuerza de señalización de la plataforma de aCAR escogida. Esta capacidad también estará influida por las afinidades relativas de los dos restos de reconocimiento por sus respectivos epítopos diana (que se trató anteriormente) y la avidez general de sus interacciones. Con respecto a esto último, la estrategia propuesta asegura tanto una estequiometría iCAR/aCAR favorable como una distribución equilibrada de sus respectivos epítopos objetivo en células normales. Nuevamente, esto no es un problema cuando se usa un par génico pCAR-aCAR.
Para garantizar aún más la seguridad, se pueden emplear otros medios convencionales implementados actualmente en el campo de la inmunoterapia de CAR y TCR, tal como el uso de genes suicidas o el uso de electroporación de ARNm para la expresión transitoria.
Si bien la LOH deja a menudo a las células con un solo alelo de un gen determinado, con frecuencia se acompaña de la duplicación del cromosoma restante, o parte del cromosoma, lo que da como resultado una LOH de 'número de copias neutral' (Lo et al., 2008; O'Keefe et al., 2010; Sathirapongsasuti et al., 2011). En estas circunstancias, la aparición de variantes de pérdida de epítopos requiere dos eventos independientes, y por lo tanto es menos probable. La expresión de varios pares pCAR-aCAR o iCAR-aCAR en diferentes fracciones de las células modificadas genéticamente evitará la aparición de escapes mutacionales, incluso en los casos de LOH de 'pérdida del número de copias', en los que solo se ha retenido una única copia del alelo diana. Sin embargo, dado que los genes de una sola copia pueden volverse esenciales, su pérdida funcional sería mucho menos probable.
En vista de lo anterior, en un aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un receptor de antígeno quimérico inhibidor (iCAR) capaz de prevenir o atenuar la activación no deseada de una célula inmunitaria efectora, en la que el iCAR comprende un dominio extracelular que se une específicamente a una única variante alélica de un epítopo de superficie celular polimórfico ausente en las células tumorales de los mamíferos debido a la pérdida de heterocigosidad (LOH) pero presente al menos en todas las células del tejido normal relacionado de los mamíferos, o en los órganos vitales en los que se expresa el aCAR; y un dominio intracelular que comprende al menos un elemento de transducción de señales que inhibe una célula inmunitaria efectora.
En algunas realizaciones, el epítopo de superficie celular polimórfico es parte de un antígeno codificado por un gen supresor de tumores o un gen ligado genéticamente a un gen supresor de tumores, ya que es probable que dichos genes se pierdan debido a la LOH en los tumores. Además, el epítopo de superficie celular polimórfico puede ser parte de un antígeno codificado por un gen que normalmente reside en un cromosoma o brazo cromosómico que a menudo sufre LOH en células cancerosas, tal como, pero sin limitarse a, los brazos cromosómicos 3p, 6p, 9p, 10q, 17p, 17q, o 18q, o el cromosoma 19. Estos epítopos pueden identificarse fácilmente en las bases de datos relevantes como se describe aquí.
En algunas realizaciones, el epítopo de superficie celular polimórfico es un producto de gen constitutivo, tales como las AP2S1, CD81, GPAA1, LGa Ls 9, MGAT2, MGAT4B, VAMP3 sin clasificar; las proteínas de adhesión celular CTNNA1 NM_001903, CTNNB1, CTNNBIP1 NM_020248, CTNNBL1 NM_030877, delta catenina CTNND1 NM_001085458; los canales y transportadores ABCB10 NM_012089, ABCB7 NM_004299, ABCD3 NM_002857, ABCE1 NM_002939, ABCF1 NM_001090, ABCF2 NM_005692, ABCF3 NM_018358, CALM1[1][7] Calmodulina que capta iones calcio, MFSD11 NM_024311, similar a MSFD10, también conocida como TETRAN o proteína [1] similar al transportador de tetraciclina, MFSD12 NM_174983, MFSD3 NM_138431, MFSD5 NM_032889, SLC15A4 NM_145648, SLC20A1 NM_005415, portador de oxoglutarato/malato mitocondrial SLC25A11[1], SLC25A26 NM_173471, SLC25A28 NM_031212, SLC25A3 NM_002635, SLC25A32 NM_030780, SLC25A38 NM_017875, SLC25A39 NM_016016, SLC25A44 NM_014655, SLC25A46 NM_138773, SLC25A5 NM_001152, SLC27A4 NM_005094, SLC30A1 NM_021194, SLC30A5 NM_022902, SLC30A9 NM_006345, SLC35A2 NM_005660, SLC35A4 NM_080670, SLC35B1 NM_005827, SLC35B2 NM_178148, SLC35C2 NM_015945, SLC35E1 NM_024881, SLC35E3 NM_018656, SLC35F5 NM_025181, SLC38A2 NM_018976, SLC39A1 NM_014437, SLC39A3 NM_144564, SLC39A7 NM_006979, SLC41A3 NM_017836, SLC46A3 NM_181785, SLC48A1 NM_017842, los receptores ACVR1 NM_001105 similar a ACVRL1 de la familia de receptores de TGF Beta del síndrome de Rendu-Osler-Weber, ACVR1B NM_004302, receptor de IgE de baja afinidad CD23[1] FCER2 (lectina); y el grupo de HLA/inmunoglobulina/reconocimiento celular BAT1, también conocido como DDX39B, que está implicado en el ayuste del ARN, superfamilia de inmunoglobulinas Basigin BSG, metaloproteinasa extracelular, factor inhibidor de la migración de macrófagos MIF, y/o TAPBP [Wikipedia]. En algunas realizaciones, el gen constitutivo es un HLA tipo I, un receptor acoplado a proteína G (GPCR), un canal iónico, o una tirosina cinasa receptora, preferiblemente un HLA-A, HLA-B, HLA-C. En algunas realizaciones, el gen constitutivo es HLA-A. En algunas realizaciones, el gen constitutivo es HLA-B. En algunas realizaciones, el gen constitutivo es HLA-C.
Cualquier tecnología relevante puede usarse para manipular un resto de reconocimiento que confiera a los aCAR y pCAR o iCAR unión específica a sus dianas. En algunas realizaciones, el dominio extracelular comprende (i) un anticuerpo, derivado o fragmento del mismo, tal como un anticuerpo humanizado; un anticuerpo humano; un fragmento funcional de un anticuerpo; un anticuerpo de dominio único, tal como un nanocuerpo; un anticuerpo recombinante; y un fragmento variable monocatenario (scFv); (ii) un mimético de anticuerpo, tal como una molécula de aficuerpo; una afilina; un afímero; una afitina; un alfacuerpo; una anticalina; un avímero; un DARPin; un finómero; un péptido de dominio de Kunitz; y un monocuerpo; o (iii) un aptámero. Preferiblemente, el dominio extracelular comprende un scFv.
En algunas realizaciones, el aCAR comprende un dominio extracelular que se une específicamente a un epítopo de superficie celular no polimórfico de un antígeno o una única variante alélica de un epítopo de superficie celular polimórfico. En algunas realizaciones, el dominio extracelular de aCAR se une a un epítopo que es un epítopo de antígeno asociado a tumor. En algunas realizaciones, el dominio extracelular de aCAR que se une a un epítopo que es un antígeno asociado a tumor es compartido al menos por células de tejido tumoral y normal relacionado, y un dominio intracelular que comprende al menos un elemento de transducción de señales que activa y/o coestimula una célula inmunitaria efectora. En algunas realizaciones, el aCAR usado para tratar el cáncer se dirige contra o se une específicamente a cualquier proteína de membrana que se exprese en el tejido tumoral, siempre que la diana de iCAR se exprese en cada tejido normal en el que se exprese la proteína de aCAR dirigida. En algunas realizaciones, el aCAR se dirige contra o se une específicamente a un epítopo de superficie celular no polimórfico seleccionado de, pero sin limitarse a, la siguiente lista de antígenos: CD19, CD20, Cd 22, CD10, CD7, CD49f, CD56, CD74, CAIX IgK, ROR1, ROR2, CD30, LewisY, CD33, CD34,CD38, CD123, CD28, CD44v6, CD44, CD41, CD133, CD138, NKG2D-L, CD139, BCMA, GD2,GD3, hTERT, FBP, EGP-2, EGP-40, FR-a, L1-CAM, ErbB2,3,4, EGFRvIII, VEGFR-2, IL-13Ra2, FAP, Mesothelin, c-MET, PSMA, CEA, kRas, MAGE-A1, MUC1MUC16, PDL1, PSCA, EpCAM, FSHR, AFP, AXL, CD80 CD89, CDH17,CLD18, GPC3, TEM8, TGFB1, NY-ESO-1, WT-1 y EGFR En algunas realizaciones, el aCAR se une a CD19. En algunas realizaciones, el aCAR se dirige contra o se une específicamente a un epítopo de superficie celular no polimórfico de CD19.
En algunas realizaciones, el iCAR se dirige contra o se une específicamente a una única variante alélica de un antígeno que no incluye los receptores de efrina (p. ej., EPHA 7) y claudinas. En algunas realizaciones, el iCAR se dirige contra o se une específicamente a un epítopo codificado por una única variante alélica de un gen HLA (gen HLA-A, gen HLA-B o gen HLA-C).
iii. DOMINIOS INTRACELULARES: aCAR, iCAR y pCAR
La presente invención también proporciona dominios intracelulares como parte del aCAR, iCAR y/o pCAR. En algunas realizaciones, el dominio intracelular comprende al menos un elemento de transducción de señales. En algunas realizaciones, el dominio intracelular comprende al menos un elemento de transducción de señales que inhibe una célula inmunitaria efectora.
En general, se puede usar cualquier tecnología relevante para manipular un elemento de transducción de señales que confiera a los aCAR y pCAR o iCAR la capacidad de inducir una función celular, incluida, por ejemplo, la capacidad de inhibir una célula inmunitaria efectora o de activar o coestimular una célula inmunitaria efectora.
En algunas realizaciones, el al menos un elemento de transducción de señales es capaz de inhibir una célula inmunitaria efectora. En algunas realizaciones, el al menos un elemento de transducción de señales capaz de inhibir una célula inmunitaria efectora es homólogo a un elemento de transducción de señales de una proteína de punto de control inmunitario. En algunas realizaciones, la proteína de punto de control inmunitario se selecciona del grupo que consiste en PD1, CTLA4, BTLA, 2B4, CD160, CEACAM (que incluye, por ejemplo, CEACAM1), las KIR (que incluye, por ejemplo, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, LIR1, LIR2, L iR3, LIR5, LIR8 y CD94), NKG2A; La G3; TIM3; supresor de Ig del dominio V de la activación de células T (VISTA); genes estimuladores de interferón (STING); proteínas que contienen motivo inhibidor inmunorreceptor basado en tirosina (ITIM), inmunoglobulina de células T y dominio ITIM (TIGIT), y receptor de adenosina (p. ej., A2aR). En algunas realizaciones, la proteína de punto de control inmunitario es un regulador inmunitario negativo. En algunas realizaciones, el regulador inmunitario negativo se selecciona del grupo que consiste en 2B4, LAG-3 y BTLA-4.
En algunas realizaciones, el elemento de transducción de señales es capaz de activar o coestimular una célula inmunitaria efectora. En algunas realizaciones, el elemento de transducción de señales es un dominio de activación. En algunas realizaciones, el elemento de transducción de señales es un dominio coestimulador. En algunas realizaciones, el elemento de transducción de señales que activa o coestimula una célula inmunitaria efectora es homólogo a un motivo de activación inmunorreceptor basado en tirosina (ITAM), un receptor activador similar a inmunoglobulina de células asesinas, o una molécula adaptadora, y/o un elemento de transducción de señales coestimulador. En algunas realizaciones, el elemento de transducción de señales que activa o coestimula una célula inmunitaria efectora es homólogo a un motivo de activación inmunorreceptor basado en tirosina (ITAM). En algunas realizaciones, el ITAM es de una proteína que incluye, pero no se limita a, cadenas CD3Z o FcRy. En algunas realizaciones, el elemento de transducción de señales que activa o coestimula una célula inmunitaria efectora es homólogo a un receptor activador de tipo inmunoglobulina (KIR) de células asesinas. En algunas realizaciones, el KIR incluye, por ejemplo, pero no se limita a KIR2DS y KIR3DS. En algunas realizaciones, el elemento de transducción de señales que activa o coestimula una célula inmunitaria efectora es homólogo a una molécula adaptadora. En algunas realizaciones, la molécula adaptadora incluye, por ejemplo, pero no se limita a DAP12. En algunas realizaciones, el elemento de transducción de señales que activa o coestimula una célula inmunitaria efectora es homólogo a un elemento de transducción de señales coestimulador. En algunas realizaciones, el elemento de transducción de señales coestimulador es de una proteína que incluye, pero no se limita a, CD27, CD28, ICOS, CD137 (4-1BB), CD134 (OX40), y/o GITR. En algunas realizaciones, los aCAR comprenden un elemento de transducción de señales.
En algunas realizaciones, el dominio extracelular se fusiona a través de una bisagra flexible y un motivo canónico transmembrana a dicho dominio intracelular.
En algunas realizaciones, el uso de un pCAR permite el desacoplamiento para desacoplar el resto activador del aCAR (FcRy/CD3-Z) de la unidad de reconocimiento y el elemento coestimulador (p. ej., CD28, 4-IBB). En algunas realizaciones, estos elementos se colocan genéticamente en dos productos polipeptídicos diferentes. En algunas realizaciones, el reacoplamiento de estos elementos, que es obligatorio para la función de aCAR, solo tendrá lugar mediante la adición de un fármaco heterodimerizante que puede unir los sitios de unión respectivos incorporados en cada uno de los polipéptidos por separado.
En lugar de un dominio de activación (tal como FcRy o CD3-Z), un iCAR posee un dominio de señalización derivado de un receptor inhibidor que puede antagonizar la activación de las células T. En algunas realizaciones, el iCAR posee un dominio de señalización derivado de un receptor inhibidor que puede antagonizar la activación de las células T. En algunas realizaciones, el dominio de señalización de iCAR se deriva de un receptor inhibidor, que incluye, por ejemplo, pero no se limita a, un receptor inhibidor de CTLA-4, PD-1 o NK.
iv. CONSTRUCCIÓN DE VECTORES CAR-T (aCAR; iCAR; pCAR)
En algunas realizaciones, el aCAR está codificado por un primer vector de ácido nucleico, y el iCAR o pCAR está codificado por un segundo vector de ácido nucleico. En algunas realizaciones, el aCAR está codificado por un primer vector de ácido nucleico, y el iCAR o pCAR está codificado por un segundo vector de ácido nucleico. En algunas realizaciones, el aCAR está codificado por un primer vector de ácido nucleico, y el iCAR o pCAR está codificado por un segundo vector de ácido nucleico. En algunas realizaciones, la secuencia nucleotídica que codifica iCAR o pCAR está en un segundo vector.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención como se define en una cualquiera de las realizaciones anteriores, y al menos un elemento de control, tal como un promotor, ligado operativamente a la molécula de ácido nucleico.
En algunas realizaciones, el vector es un vector lentiviral (LV). En algunas realizaciones, el vector LV es un vector LV comercialmente disponible. En algunas realizaciones, el vector LV incluye, pero no se limita a, pLVX-Puro, pLVX-IRES-Puro/Neo/Hygro, pLVx-EF1a-IRES (TAKARA), y/o pcLV-EF1a (Sirion). En algunas realizaciones, el vector LV es pLVX-Puro. En algunas realizaciones, el vector LV es pLVX-IRES-Puro/Neo/Hygro. En algunas realizaciones, el vector LV es pLVx-EF1 a-IRES (TAKARA). En algunas realizaciones, el vector LV es pcLV-EF1 a (Sirion).
En algunas realizaciones, el vector comprende un promotor EF1. En algunas realizaciones, el vector comprende un promotor de CMV. En algunas realizaciones, el vector comprende un promotor de PGK. En algunas realizaciones, el vector comprende una bisagra de CD8. En algunas realizaciones, el vector comprende un dominio coestimulador de CD28 TM y 41BB.
En algunas realizaciones, el vector comprende además una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un aCAR que comprende un dominio extracelular que se une específicamente a un epítopo de superficie celular no polimórfico de un antígeno o una única variante alélica de un epítopo de superficie celular polimórfico, en el que dicho epítopo es un antígeno asociado a un tumor o es compartido al menos por células de tejido tumoral y normal relacionados, y un dominio intracelular que comprende al menos un elemento de transducción de señales que activa y/o coestimula una célula inmunitaria efectora.
En algunas realizaciones, el dominio extracelular de aCAR codificado por el ácido nucleico comprendido en el vector se une específicamente a un epítopo de superficie celular no polimórfico de un antígeno, y el dominio extracelular de iCAR se une específicamente a una única variante alélica de un epítopo de superficie celular polimórfico de un antígeno diferente al que se une el dominio extracelular de dicho aCAR.
En algunas realizaciones, el dominio extracelular del iCAR codificado por el ácido nucleico comprendido en el vector se dirige contra o se une específicamente a una única variante alélica de los genes HLA, incluyendo, por ejemplo, el gen HLA-A, el gen HLA-B o el gen HLA-C; o contra una única variante alélica de un gen enumerado en la Tabla 8.
En algunas realizaciones, el dominio extracelular del aCAR codificado por el ácido nucleico comprendido en el vector se dirige contra o se une específicamente a un epítopo de superficie celular no polimórfico seleccionado de los antígenos enumerados en Tabla 1, tal como CD19. En algunas realizaciones, la diana de aCAR es cualquier diana con un dominio extracelular.
En algunas realizaciones, el dominio extracelular del iCAR codificado por el ácido nucleico comprendido en el vector se dirige contra o se une específicamente a una única variante alélica de los genes HLA, incluyendo, por ejemplo, el gen HLA-A, el gen HLA-B o el gen HLA-C, o contra una sola variante alélica de un gen enumerado en la Tabla 8; y el dominio extracelular del aCAR codificado por el ácido nucleico comprendido en el vector se dirige contra o se une específicamente a un epítopo de superficie celular no polimórfico seleccionado de los antígenos enumerados en la Tabla 1, tal como CD19. En algunas realizaciones, la diana de aCAR es cualquier diana con un dominio extracelular.
En algunas realizaciones, el al menos un elemento de transducción de señales del aCAR que activa o coestimula una célula inmunitaria efectora es homólogo a un motivo de activación inmunorreceptor basado en tirosina (ITAM) de, por ejemplo, cadenas CD3Z o FcRy; un dominio transmembrana de un receptor activador de tipo inmunoglobulina (KIR) de células asesinas que comprende un resto de aminoácido cargado positivamente, o una cadena lateral cargada positivamente, o un dominio transmembrana KIR activador de, por ejemplo, KIR2DS y KIR3DS, o una molécula adaptadora tal como DAP12; o un elemento de transducción de señales coestimulador de, por ejemplo, CD27, CD28, ICOS, CD137 (4-1BB) o CD134 (OX40).
En algunas realizaciones, iCAR o pCAR se expresa mediante un primer vector, y aCAR se expresa mediante un segundo vector. En algunas realizaciones, el iCAR o pCAR y el aCAR son expresados ambos por el mismo vector.
En algunas realizaciones, la secuencia nucleotídica del vector comprende un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) entre la secuencia nucleotídica que codifica el aCAR y la secuencia nucleotídica que codifica el iCAR. En general, la secuencia nucleotídica que codifica el aCAR y la secuencia nucleotídica que codifica el iCAR pueden estar en cualquier orden secuencial, pero en realizaciones particulares, la secuencia nucleotídica que codifica el aCAR está en dirección 3’ de la secuencia nucleotídica que codifica el iCAR.
En algunas realizaciones, las secuencias nucleotídica que codifican el aCAR y el iCAR se codifican en un solo vector. En algunas realizaciones, el vector comprende un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) entre la secuencia nucleotídica que codifica el aCAR y la secuencia nucleotídica que codifica el iCAR. En algunas realizaciones, la secuencia nucleotídica que codifica el aCAR está en dirección 3’ de la secuencia nucleotídica que codifica el iCAR. En algunas realizaciones, la secuencia nucleotídica comprende un péptido viral 2A autoescindible ubicado entre la secuencia nucleotídica que codifica el aCAR y la secuencia nucleotídica que codifica el iCAR. En algunas realizaciones, la secuencia nucleotídica del vector comprende un péptido viral 2A autoescindible entre la secuencia nucleotídica que codifica el aCAR y la secuencia nucleotídica que codifica el iCAR. En algunas realizaciones, el péptido viral 2A autoescindible incluye, pero no se limita a, T2A del virus Thosea asigna (TaV), F2A del virus de la fiebre aftosa (FMDV), E2A del virus de la rinitis equina A (ERAV), y/o P2A del teschovirus porcino-1 (PTV1). En algunas realizaciones, el péptido viral 2A autoescindible es T2A del virus Thosea asigna (TaV). En algunas realizaciones, el péptido viral 2A autoescindible es F2A del virus de la fiebre aftosa (FMDV). En algunas realizaciones, el péptido viral 2A autoescindible es E2A del virus de la rinitis equina A (ERAV). En algunas realizaciones, el péptido viral 2A autoescindible es P2A de teschovirus porcino-1 (PTV1).
En algunas realizaciones, el vector comprende una secuencia nucleotídica que codifica el aCAR constitutivo unido mediante un enlazador flexible a dicho iCAR.
Las células inmunitarias pueden transfectarse con la molécula de ácido nucleico apropiada descrita aquí, por ejemplo mediante transfección de ARN o mediante la incorporación en un plásmido apto para la replicación y/o transcripción en una célula eucariota o un vector viral. En algunas realizaciones, el vector se selecciona de un vector retroviral o lentiviral.
También se pueden usar combinaciones de vector retroviral y una línea de empaquetamiento apropiada, en las que las proteínas de la cápside serán funcionales para infectar células humanas. Se conocen varias líneas celulares productoras de virus anfotrópicos, incluyendo pA12 (Miller, et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:431-437); PA317 (Miller, et al. (1986) Mol. Cell. Bioi. 6:2895-2902); y CRIP (Danos, et ai. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:6460-6464). Alternativamente, pueden usarse partículas no anfotrópicas, tales como partículas pseudotipadas con envoltura VSVG, RD 114 o GAL V. Las células se pueden transducir además mediante cocultivo directo con células productoras, por ejemplo mediante el método de Breg, y otros (1992) Blood 80: 1418-1422, o cultivando con sobrenadante viral solo o lotes de vectores concentrados, por ejemplo mediante el método de Xu, et ai. (1994) Exp. Hemat. 22:223-230; y Hughes, et ai. (1992) J Clin. Invest. 89: 1817.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para preparar un receptor de antígeno quimérico inhibidor (iCAR) capaz de prevenir o atenuar la activación no deseada de una célula inmunitaria efectora, según la presente invención como se define anteriormente, comprendiendo el método: (i) recuperar una lista de variantes genómicas humanas de genes que codifican proteínas de al menos una base de datos de variantes conocidas; (ii) filtrar la lista de variantes recuperadas en (i): (a) seleccionando variantes que dan como resultado una variación en la secuencia de aminoácidos en la proteína codificada por el gen respectivo en comparación con su alelo de referencia correspondiente, (b) seleccionando variantes de genes en las que la variación de la secuencia de aminoácidos está en un dominio extracelular de la proteína codificada, (c) seleccionando variantes de genes que experimentan pérdida de heterocigosis (LOH) al menos en un tumor, y (d) seleccionando variantes de genes que se expresan al menos en un tejido de origen del al menos un tumor en el que sufren LOH según (c), obteniendo así una lista de variantes que tienen una variación de secuencia de aminoácidos en un dominio extracelular en la proteína codificada por el respectivo gen perdido en el al menos un tumor debido a LOH y expresado al menos en un tejido de origen del al menos un tumor; (iii) definir una región de secuencia que comprende al menos una única variante de la lista obtenida en (ii), subclonar y expresar la región de secuencia que comprende al menos una única variante y una región de secuencia que comprende el alelo de referencia correspondiente, obteniendo así los respectivos péptidos epitópicos; (iv) seleccionar un dominio de unión a iCAR, que se une específicamente al péptido epitópico codificado por la región de la secuencia clonada, o al péptido epitópico codificado por el alelo de referencia correspondiente, obtenido en (iii); y (vii) preparar los iCAR como se define aquí anteriormente, comprendiendo cada uno un dominio de unión a iCAR como se define en (iv).
En algunas realizaciones, las variantes candidatas de genes que se seleccionan experimentan LOH en al menos 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% en un determinado tipo de tumor.
En algunas realizaciones, la frecuencia del alelo menor para cada variante seleccionada es igual o superior al 1, 2, 3, 4 o 5% en al menos una población.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una combinación de dos o más moléculas de ácido nucleico, comprendiendo cada una de ellas una secuencia nucleotídica que codifica un miembro diferente de un sistema activador de células inmunitarias efectoras controladas, siendo dichas moléculas de ácido nucleico parte de o formando una única molécula continua de ácido nucleico, o comprendiendo dos o más moléculas de ácido nucleico separadas, en la que el sistema activador inmunitario efector controlado dirige las células inmunitarias efectoras para destruir las células tumorales que han perdido uno o más cromosomas o fracciones de los mismos debido a la pérdida de heterocigosidad (LOH) y células sobrantes de tejido normal relacionado, y en la que (a) el primer miembro comprende un polipéptido de receptor de antígeno quimérico activador (aCAR) que comprende un primer dominio extracelular que se une específicamente a un epítopo de superficie celular no polimórfico de un antígeno, o a una única variante alélica de un epítopo de superficie celular polimórfico diferente, y dicho epítopo de superficie celular polimórfico o no polimórfico es un antígeno asociado a un tumor o es compartido por células de tejido anormal y normal relacionados de mamífero; y (b) el segundo miembro comprende un polipéptido regulador que comprende un segundo dominio extracelular que se une específicamente a una única variante alélica de un epítopo de superficie celular polimórfico no expresado por un tejido anormal de mamífero debido a LOH pero presente en todas las células de tejido normal relacionado de mamífero.
En algunas realizaciones, el primer miembro se selecciona de: (a) un aCAR constitutivo que comprende además un dominio intracelular que comprende al menos un elemento de transducción de señales que activa y/o coestimula una célula inmunitaria efectora; y (b) un aCAR condicional que comprende además un dominio intracelular que comprende un primer miembro de un sitio de unión para una molécula pequeña heterodimerizante y opcionalmente al menos un elemento de transducción de señales coestimulador, pero que carece de un elemento de transducción de señales activador; y el segundo miembro es: (c) un receptor de antígeno quimérico inhibidor (iCAR) que comprende además un dominio intracelular que comprende al menos un elemento de transducción de señales que inhibe una célula inmunitaria efectora; o (d) un receptor de antígeno quimérico protector (pCAR) que comprende además una región reguladora extracelular que comprende un sustrato para una sheddasa; un motivo canónico transmembrana que comprende un sustrato para una proteasa de escisión intramembrana; y un dominio intracelular, comprendiendo dicho dominio intracelular al menos un elemento de transducción de señales que activa y/o coestimula una célula inmunitaria efectora y un segundo miembro de un sitio de unión para una molécula pequeña heterodimerizante.
En algunas realizaciones (i) el dominio extracelular del iCAR o pCAR se une específicamente a una única variante alélica de un epítopo de superficie celular polimórfico de un antígeno, que es un antígeno diferente al que se une el dominio extracelular del aCAR; (ii) el dominio extracelular de dicho pCAR o iCAR se une específicamente a una única variante alélica de un epítopo de superficie celular polimórfico diferente del mismo antígeno al que se une el dominio extracelular de dicho aCAR; o (iii) el dominio extracelular de dicho pCAR o iCAR se une específicamente a una variante alélica única diferente del mismo epítopo de superficie celular polimórfico al que se une el dominio extracelular de dicho aCAR.
En algunas realizaciones de pCAR, el sustrato para una sheddasa es un sustrato para una desintegrina y metaloproteinasa (ADAM) o una beta-secretasa 1 (BACE1). En algunas realizaciones, el sustrato forma parte del dominio extracelular, y comprende repeticiones Lin 12/Notch y un sitio de escisión de la proteasa ADAM.
En general, se acepta que no existe un motivo de secuencia consistente que prediga la escisión de ADAM, pero Caescu et al.
(Caescu et al., 2009) describen, en la Tabla 3, un gran número de secuencias de sustrato de ADAM10 y/o ADAM17, que se incorporan aquí como referencia como si se describiesen completamente aquí, y que pueden servir como sustrato para ADAM en el pCAR de la presente invención. En algunas realizaciones, las secuencias de sustrato de ADAM son las de la proteína precursora de amiloide, BTC, CD23, colágeno, DII-1, glicoproteína de Ébola, E-cadherina, EGF, epirregulina, ligando Fas, receptor de la hormona del crecimiento, HB-EGF, receptor de interleucina-1 tipo II, receptor de IL-6, L-selectina, N-cadherina, Notch, receptor p55 del TNF, receptor p75 del TNF, Pmel17, proteína priónica, proteína tirosina fosfatasa Z receptora, TGF-a, TNF o TR (Caescu et al., 2009).
Puede ser ventajoso usar una secuencia de escisión de ADAM10 en el pCAR de la presente invención debido a que ADAM 10 está presente de manera constitutiva en niveles comparablemente altos, por ejemplo, en linfocitos. A diferencia de ADAM10, el pariente cercano TACE/ADAM17 se detecta solo en niveles bajos en células no estimuladas. La expresión superficial de ADAM17 en blastos de células T se induce rápidamente mediante estimulación (Ebsen et al., 2013).
Hemming et al. (Hemming et al., 2009) dan a conocer que no se ha identificado ningún motivo de secuencia consistente que prediga la escisión de BACE1 en sustratos frente a no sustratos, pero describen, en la Tabla 1, una gran cantidad de sustratos de BACE1 que tienen secuencias de escisión de BAC1, que se incorporan aquí como referencia como si se describiesen completamente aquí, y que pueden servir como sustrato para BACE1 en el pCAR de la presente invención.
En algunas realizaciones de pCAR, el sustrato para una proteasa de escisión intramembrana es un sustrato para una SP2, una y-secretasa, una peptidasa de péptido señal (spp), una proteasa tipo spp, o una proteasa romboidal.
Rawson et al. (Rawson, 2013) describen que los sustratos de SP2 tienen al menos una hélice que atraviesa la membrana de tipo 2, e incluyen un motivo desestabilizador de hélice, tal como un motivo Asp-Pro en un sustrato de SP2. Este documento describe en la Tabla 1 una serie de sustratos de SP2 que tienen secuencias de escisión de SP2, que se incorporan aquí como referencia como si se describiesen completamente aquí, y que pueden servir como sustrato para SP2 en el pCAR de la presente invención.
Haapasalo y Kovacs (Haapasalo y Kovacs, 2011) enseñan que el precursor de la proteína amiloide-P (ApPP) es un sustrato para la y-secretasa dependiente de presenilina (PS) (PS/y-secretasa), y que se ha encontrado que al menos 90 proteínas adicionales sufren una proteólisis similar por este complejo enzimático. Los sustratos de y-secretasa tienen algunas características comunes: la mayoría de las proteínas de sustrato son proteínas transmembrana de tipo I; la escisión tipo y mediada por PS/y-secretasa (que corresponde a la escisión & en ApPP, que libera AICD) tiene lugar en o cerca del límite de los dominios transmembrana y citoplasmático. El sitio de escisión de tipo & flanquea un tramo de secuencia de aminoácidos hidrófobos rica en restos de lisina y/o arginina. Parece que la escisión de PS/ysecretasa no depende de una secuencia diana de aminoácidos específica en el sitio de escisión o adyacente al mismo, sino quizás del estado conformacional del dominio transmembrana. Haapasalo y Kovacs describen en la Tabla 1 una lista de sustratos de y-secretasa, cuyas secuencias de escisión se incorporan aquí como referencia como si se describiesen completamente aquí, y que pueden servir como sustrato para y-secretasas en el pCAR de la presente invención.
Voss et al. (Voss et al., 2013) enseñan que hasta ahora no se ha descrito ningún sitio de escisión de consenso basado en elementos de secuencia primaria dentro del sustrato para las GxGD aspartil proteasas (spps). Los dominios transmembrana de las proteínas de membrana adoptan preferentemente una confirmación de hélice a en la que sus enlaces peptídicos son difícilmente accesibles para las proteasas. Por lo tanto, para hacer que los dominios transmembrana sean susceptibles a la proteólisis intramembrana, se postuló que su contenido de hélice a debe reducirse mediante aminoácidos desestabilizadores de hélice. Según esta hipótesis, se ha mostrado que diversos péptidos señal contienen aminoácidos desestabilizadores de hélice dentro de su región h que influyen de manera crítica en su procesamiento proteolítico por SPP. Además, los restos polares dentro de la región h de los péptidos señal pueden influir en la escisión por SPP, ya que, por ejemplo, los restos de serina y cisteína dentro del péptido señal de diversas cepas de VHC son críticos para la escisión por SPP. Aún no se comprende completamente si estos restos polares también afectan simplemente el contenido helicoidal de los péptidos señal, o si se requiere el grupo hidroxilo o sulfhidrilo en particular para desencadenar la escisión por SPP. De manera similar, la escisión del dominio transmembrana Bri2 por SPPL2b aumenta significativamente cuando se reduce el contenido de hélice a del dominio transmembrana Bri2. Curiosamente, sólo un resto de aminoácido de cuatro restos con una supuesta potencia desestabilizadora de hélice redujo significativamente el contenido de hélice a del dominio transmembrana Bri2 en un entorno basado en fosfolípidos. Esto sugiere que la desestabilización de un dominio transmembrana helicoidal a no es causada simplemente por ciertos restos de aminoácidos, sino que el contexto y la posición de estos aminoácidos determinan su potencial desestabilizador de hélice y, por lo tanto, la accesibilidad de los dominios transmembrana a la proteólisis intramembrana por SPP/SPPL. Voss et al. describen adicionalmente en la Tabla 1 una lista de sustratos de spp y similares a spp, cuyas secuencias de escisión se incorporan aquí como referencia como si se describiesen completamente aquí, y que pueden servir como sustrato para spp en el pCAR de la presente invención.
Bergbold et al. (Bergbold y Lemberg, 2013) enseñan que para las proteasas romboides se han sugerido dos modelos diferentes para el reconocimiento de sustrato. En el primer modelo, la flexibilidad conformacional del esqueleto peptídico del sustrato, combinado con la inmersión de la membrana en la vecindad del sitio activo romboidal, es suficiente para proporcionar especificidad. Para el sustrato Spitz de Drosophila bien caracterizado, se ha mostrado que un motivo de glicinalanina sirve como una ruptura de hélice que permite la pérdida del plegamiento del dominio transmembrana en el sitio activo romboidal. El segundo modelo sugiere que las proteasas romboides reconocen principalmente una secuencia específica que rodea el sitio de escisión, y que los restos desestabilizadores de la hélice transmembrana son una característica secundaria requerida sólo para algunos sustratos. La secuencia específica aún no se ha identificado. Bergbold et al. describen en la Tabla 3 una lista de sustratos para proteasas romboides, cuyas secuencias de escisión se incorporan aquí como referencia como si se describiesen completamente aquí, y que pueden servir como sustrato para proteasas romboides en el pCAR de la presente invención.
En vista de lo anterior, dado que en la mayoría de los casos aún no se ha establecido un motivo de consenso para las proteasas que escinden intramembrana, y dado que los ensayos para identificar sustratos para proteasas que escinden intramembrana son bien conocidos en la técnica como se describe en la bibliografía citada anteriormente aquí, el pCAR puede comprender una secuencia de aminoácidos identificada como tal, y puede comprender además restos desestabilizadores de la hélice transmembrana.
En algunas realizaciones, el sustrato forma parte del motivo canónico transmembrana, y es homólogo/derivado de un dominio transmembrana de Notch, ErbB4, E-cadherina, N-cadherina, efrina-B2, proteína precursora de amiloide, o CD44.
En algunas realizaciones, comprende una secuencia nucleotídica que codifica un dominio extracelular y un dominio intracelular de dicho aCAR condicional como proteínas separadas, en el que cada dominio se fusiona independientemente con un motivo canónico transmembrana y comprende un miembro diferente de un sitio de unión para una molécula pequeña heterodimerizante.
En algunas realizaciones, cada uno de los miembros primero y segundo del sitio de unión para una molécula pequeña heterodimerizante deriva de una proteína seleccionada de: (i) proteína de unión a tacrolimus (FK506) (FKBP) y FKBP; (ii) FKBP y subunidad catalítica A de calcineurina (CnA); (iii) FKBP y ciclofilina; (iv) FKBP y proteína asociada a FKBP-rapamicina (FRB); (v) girasa B (GyrB) y GyrB; (vi) dihidrofolato reductasa (DHFR) y DHFR; (vii) dominio de homodimerización de DmrB (DmrB) y DmrB; (viii) una proteína PYL (también conocida como receptor de ácido abscísico y como RCAR) y ABI; y (ix) proteína GAI de Arabidopsis thaliana (también conocida como insensible al ácido giberélico y proteína DELLA GAI; GAI) y proteína GID1 de Arabidopsis thaliana (también conocida como receptor de giberelina GID1; GID1).
v. CONSTRUCCIÓN DE CÉLULAS EFECTORAS
En todavía otro aspecto, la presente invención proporciona un método para preparar una célula inmunitaria efectora segura, que comprende: (i) transfectar una célula inmunitaria efectora, manipulada mediante TCR, dirigida a un antígeno asociado a un tumor, con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un iCAR o pCAR como se define aquí anteriormente, o transducir las células con un vector, o (ii) transfectar una célula inmunitaria efectora sin tratamiento previo con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un iCAR o pCAR como se define aquí anteriormente y una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un aCAR como se define aquí anteriormente; o transducir una célula inmunitaria efectora con un vector como se define aquí anteriormente.
En algunas realizaciones, la célula inmunitaria para uso en ingeniería incluye, pero no se limita a, una célula T, una célula asesina natural, o una célula asesina inducida por citocinas. En algunas realizaciones, la célula inmunitaria para uso en ingeniería incluye, pero no se limita a, una célula T Jurkat, una célula T Jurkat-NFAT, y/o una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC).
En aún otro aspecto, la presente invención proporciona una célula inmunitaria efectora segura obtenida mediante el método de la presente invención como se describe anteriormente. La célula inmunitaria efectora segura puede ser una célula T redirigida que expresa un receptor de células T exógeno (TCR) y un iCAR o pCAR, en el que el TCR exógeno se dirige contra un epítopo de superficie celular no polimórfico de un antígeno o una única variante alélica de un epítopo de superficie celular polimórfico, en el que dicho epítopo es un antígeno asociado a un tumor o es compartido al menos por células de tejido tumoral y normal relacionados, y el iCAR o pCAR es como se define anteriormente; o la célula inmunitaria efectora segura es una célula inmunitaria efectora redirigida, tal como una célula asesina natural o una célula T, que expresa un iCAR o pCAR y un aCAR como se definió anteriormente.
En algunas realizaciones, la célula inmunitaria efectora segura expresa en su superficie un aCAR que comprende un dominio extracelular que se une específicamente a un epítopo de superficie celular no polimórfico de un antígeno, y un iCAR o pCAR que comprende un dominio extracelular que se une específicamente a una única variante alélicas de un epítopo de superficie celular polimórfico de un antígeno diferente al que se une el dominio extracelular de dicho aCAR. En algunas realizaciones, el dominio extracelular del iCAR o pCAR se une específicamente a una única variante alélica de un epítopo de superficie celular polimórfico diferente del mismo antígeno al que se une el dominio extracelular de dicho aCAR; o el dominio extracelular del iCAR o pCAR se une específicamente a una única variante alélica diferente del mismo epítopo de superficie celular polimórfico al que se une el dominio extracelular de dicho aCAR.
En algunas realizaciones, el dominio extracelular del aCAR expresado en la superficie celular se une específicamente a un epítopo de superficie celular no polimórfico seleccionado de los antígenos enumerados en la Tabla 1, tal como CD19. En algunas realizaciones, la diana es cualquier diana con un dominio extracelular.
En algunas realizaciones, el dominio extracelular del iCAR o pCAR expresado en la superficie celular se dirigecontra o se une específicamente a una única variante alélica de un gen HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-G, HLA-E, HLA-F, HLA-K, HLA-L, HLA-DM, HLA-DO, HLA-DP, HLA DQ, o HLA-DR, o contra una única variante alélica de un gen enumerado en la Tabla 8.
En algunas realizaciones, el dominio extracelular del iCAR y/o pCAR expresado en la superficie celular se dirige contra o se une específicamente a una única variante alélica de un gen HLA-A, gen HLA-B o gen HLA-C, o contra una única variante alélica de un gen enumerado en la Tabla 8; y el dominio extracelular del aCAR expresado en la superficie celular se dirige contra o se une específicamente a un epítopo de superficie celular no polimórfico seleccionado de los antígenos enumerados en la Tabla 1, tales como, por ejemplo, pero sin limitarse a, CD19. En algunas realizaciones, la diana de aCAR es cualquier diana con un dominio extracelular.
En algunas realizaciones, el aCAR y el iCAR están presentes en la superficie celular como proteínas separadas.
En algunas realizaciones, el nivel de expresión en la superficie celular de la secuencia nucleotídica que codifica el iCAR es mayor o igual al nivel de expresión de la secuencia nucleotídica que codifica el aCAR.
En algunas realizaciones, el dominio extracelular del iCAR y/o pCAR expresado en la superficie celular se dirige contra o se une específicamente a una única variante alélica de al menos un epítopo polimórfico extracelular.
En algunas realizaciones, el dominio extracelular del iCAR y/o pCAR expresado en la superficie celular se dirige contra o se une específicamente a una única variante alélica de un gen seleccionado de grupo que consiste en ABCA4, ADAM30, AQP10, ASTN1, Clorf101, CACNA1S, CATSPER4, CD101, CD164L2, CD1A, CD1C, CD244, CD34, CD46, CELSR2, CHRNB2, CLCA2, CLDN19, CLSTN1, CR1, CR2, CRB1, CSF3R, CSMD2, ECE1, ELTD1, EMC1, EPHA10, EPHA2, EPHA8, ERMAP, FCAMR, FCER1A, FCGR1B, FCGR2A, FCGR2B, FCGR3A, FCRL1, FCRL3, FCRL4, FCRL5, FCRL6, GJB4, GPA33, GPR157, GPR37L1, GPR88, HCRTR1, IGSF3, IGSF9, IL22RA1, IL23R, ITGA10, KIAA1324, KIAA2013, LDLRAD2, LEPR, LGR6, LRIG2, LRP8, LRRC52, LRRC8B, LRRN2, LY9, MIA3, MR1, MUC1, MXRA8, NCSTN, NFASC, NOTCH2, NPR1, NTRK1, OPN3, OR10J1, OR10J4, OR10K1, OR10R2, OR10T2, OR10X1, OR11L1, OR14A16, OR14I1, OR14K1, OR2AK2, OR2C3, OR2G2, OR2G3, OR2L2, OR2M7, OR2T12, OR2T27, OR2T1, OR2T3, OR2T29, OR2T33, OR2T34, OR2T35, OR2T3, OR2T4, OR2T5, OR2T6, OR2T7, OR2T8, OR2W3, OR6F1, OR6K2, OR6K3, OR6K6, OR6N1, OR6P1, OR6Y1, PDPN, PEAR1, PIGR, PLXNA2, PTCH2, PTCHD2, PTGFRN, PTPRC, PTPRF, PTGFRN, PVRL4, RHBG, RXFP4, S1PR1, SCNN1D, SDC3, SELE, SELL, SELP, SEMA4A, SEMA6C, SLAMF7, SLAMF9, SLC2A7, SLC5A9, TACSTD2, TAS1R2, TIE1, TLR5, TMEM81, TNFRSF14, TNFRSF1B, TRABD2B, USH2A, VCAM1, y ZP4.
En algunas realizaciones, el dominio extracelular del iCAR y/o pCAR expresado en la superficie celular se dirige contra o se une específicamente a una única variante alélica de un gen seleccionado de grupo que consiste en ABCG5, ALK, ASPRV1, ATRAID, CD207, CD8B, CHRNG, CLEC4F, CNTNAP5, CRIM1, CXCR1, DNER, DPP10, EDAR, EPCAM, GPR113, GPR148, GPR35, GPR39, GYPC, IL1RL1, ITGA4, ITGA6, ITGAV, LCT, LHCGR, LRP1B, LRP2, LY75, MARCO, MERTK, NRP2, OR6B2, PLA2R1, PLB1, PROKR1, PROM2, SCN7A, SDC1, SLC23A3, SLC5A6, TGOLN2, THSD7B, TM4SF20, TMEFF2, TMEM178A, TPO, y TRABD2A.
En algunas realizaciones, el dominio extracelular del iCAR y/o pCAR expresado en la superficie celular se dirige contra o se une específicamente a una única variante alélica de un gen seleccionado de grupo que consiste en ACKR2, ALCAM, ANO10, ATP13A4, BTLA, CACNA1D, CACNA2D2, CACNA2D3, CASR, CCRL2, CD200, CD200R1, CD86, CD96, CDCP1, CDHR4, CELSR3, CHL1, CLDN11, CLDN18, CLSTN2, CSPG5, CX3CR1, CXCR6, CYP8B1, DCBLD2, DRD3, EPHA6, EPHB3, GABRR3, GP5, GPR128, GPR15, GPR27, GRM2, GRM7, HEG1, HTR3C, HTR3D, HTR3E, IGSF11, IL17RC, IL17RD, IL17RE, IL5RA, IMPG2, ITGA9, ITGB5, KCNMB3, LRIG1, LRRC15, LRRN1, MST1R, NAALADL2, NRROS, OR5AC1, OR5H1, OR5H14, OR5H15, OR5H6, OR5K2, OR5K3, OR5K4, PIGX, PLXNB1, PLXND1, PRRT3, PTPRG, ROBO2, RYK, SEMA5B, SIDT1, SLC22A14, SLC33A1, SLC4A7, SLITRK3, STAB1, SUSD5, TFRC, TLR9, TMEM108, TMEM44, TMPRSS7, TNFSF10, UPK1B, VIPR1, y ZPLD1.
En algunas realizaciones, el dominio extracelular del iCAR y/o pCAR expresado en la superficie celular se dirige contra o se une específicamente a una única variante alélica de un gen seleccionado de grupo que consiste en ANTXR2, BTC, CNGA1, CORIN, EGF, EMCN, ENPEP, EPHA5, ERVMER34-1, EVC2, FAT1, FAT4, FGFRL1, FRAS1, GPR125, GRID2, GYPA, GYPB, KDR, KIAA0922, KLB, MFSD8, PARM1, PDGFRA, RNF150, TENM3, TLR10, TLR1, TLR6, TMEM156, TMPRSS11A, TMPRSS11B, TMPRSS11 E, TMPRSS11 F, UGT2A1, y UNC5C.
En algunas realizaciones, el dominio extracelular del iCAR y/o pCAR expresado en la superficie celular se dirige contra o se une específicamente a una única variante alélica de un gen seleccionado de grupo que consiste en ADAM19, ADRB2, BTNL3, BTNL8, BTNL9, C5orf15, CATSPER3, CD180, CDH12, CDHR2, COL23A1, CSF1R, F2RL2, FAM174A, FAT2, FGFR4, FLT4, GABRA6, GABRG2, GPR151, GPR98, GRM6, HAVCR1, HAVCR2, IL31RA, IL6ST, IL7R, IQGAP2, ITGA1, ITGA2, KCNMB1, LIFR, LNPEP, MEGF10, NIPAL4, NPR3, NRG2, OR2V1, OR2Y1, OSMR, PCDH12, PCDH1, PCDHA1, PCDHA2, PCDHA4, PCDHA8, PCDHA9, PCDHB10, PCDHB11, PCDHB13, PCDHB14, PCDHB15, PCDHB16, PCDHB2, PCDHB3, PCDHB4, PCDHB5, PCDHB6, PCDHGA1, PCDHGA4, PDGFRB, PRLR, SEMA5A, SEMA6A, SGCD, SLC1A3, SLC22A4, SLC22A5, SLC23A1, SLC36A3, SLC45A2, SLC6A18, SLC6A19, SLCO6A1, SV2C, TENM2, TIMD4, y UGT3A1.
En algunas realizaciones, el dominio extracelular del iCAR y/o pCAR expresado en la superficie celular se dirige contra o se une específicamente a una única variante alélica de un gen seleccionado de grupo que consiste en BAI3, BTN1A1, BTN2A1, BTN2A2, BTN3A1, BTN3A2, BTNL2, CD83, DCBLD1, DLL1, DPCR1, ENPP1, ENPP3, ENPP4, EPHA7, GABBR1, GABRR1, GCNT6, GFRAL, GJB7, GLP1R, GPR110, GPR111, GPR116, GPR126, GPR63, GPRC6A, HFE, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DOA, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQA2, HLA-DQB1, HLA-DQB2, HLA-DRB1, HLA-DRB5, HLA-E, HLA-F, HLA-G, IL20RA, ITPR3, KIAA0319, LMBRD1, LRFN2, LRP11, MAS1L, MEP1A, MICA, MICB, MOG, MUC21, MUC22, NCR2, NOTCH4, OPRM1, OR10C1, OR12D2, OR12D3, OR14J1, OR2B2, OR2B6, OR2J1, OR2W1, OR5V1, PDE10A, PI16, PKHD1, PTCRA, PTK7, RAET1E, RAET1G, ROS1, SDIM1, SLC16A10, SLC22A1, SLC44A4, TAAR2, TREM1, TREML1, y TREML2.
En algunas realizaciones, el dominio extracelular del iCAR y/o pCAR expresado en la superficie celular se dirige contra o se une específicamente a una única variante alélica de un gen seleccionado de grupo que consiste en AQP1, C7orf50, CD36, CDHR3, CNTNAP2, DPP6, EGFR, EPHA1, EPHB6, ERVW-1, GHRHR, GJC3, GPNMB, GRM8, HUS1, HYAL4, KIAA1324L, LRRN3, MET, MUC12, MUC17, NPC1L1, NPSR1, OR2A12, OR2A14, OR2A25, OR2A42, OR2A7, OR2A2, OR2AE1, OR2F2, OR6V1, PILRA, PILRB, PKD1L1, PLXNA4, PODXL, PTPRN2, PTPRZ1, RAMP3, SLC29A4, SMO, TAS2R16, TAS2R40, TAS2R4, TFR2, THSD7A, TMEM213, TTYH3, ZAN, y ZP3.
En algunas realizaciones, el dominio extracelular del iCAR y/o pCAR expresado en la superficie celular se dirige contra o se une específicamente a una única variante alélica de un gen seleccionado de grupo que consiste en ADAM18, ADAM28, ADAM32, ADAM7, ADAM9, ADRA1A, CDH17, CHRNA2, CSMD1, CSMD3, DCSTAMP, FZD6, GPR124, NRG1, OR4F21, PKHD1L1, PRSS55, SCARA3, SCARA5, SDC2, SLC10A5, SLC39A14, SLC39A4, SLCO5A1, TNFRSF10A, y TNFRSF10B.
En algunas realizaciones, el dominio extracelular del iCAR y/o pCAR expresado en la superficie celular se dirige contra o se une específicamente a una única variante alélica de un gen seleccionado de grupo que consiste en ABCA1, AQP7, ASTN2, C9orf135, CA9, CD72, CNTNAP3B, CNTNAP3, CRB2, ENTPD8, GPR144, GRIN3A, IZUMO3, KIAA1161, MAMDC4, MEGF9, MUSK, NOTCH1, OR13C2, OR13C3, OR13C5, OR13C8, OR13C9, OR13D1, OR13F1, OR1B1, OR1J2, OR1K1, OR1L1, OR1L3, OR1L6, OR1L8, OR1N1, OR1N2, OR1Q1, OR2S2, PCSK5, PDCD1LG2, PLGRKT, PTPRD, ROR2, SEMA4D, SLC31A1, TEK, TLR4, TMEM2, y VLDLR.
En algunas realizaciones, el dominio extracelular del iCAR y/o pCAR expresado en la superficie celular se dirige contra o se une específicamente a una única variante alélica de un gen seleccionado de grupo que consiste en ABCC2, ADAM8, ADRB1, ANTXRL, ATRNL1, C10orf54, CDH23, CDHR1, CNNM2, COL13A1, COL17A1, ENTPD1, FZD8, FGFR2, GPR158, GRID1, IL15RA, IL2RA, ITGA8, ITGB1, MRC1, NRG3, NPFFR1, NRP1, OPN4, PCDH15, PKD2L1, PLXDC2, PRLHR, RET, RGR, SLC16A9, SLC29A3, SLC39A12, TACR2, TCTN3, TSPAN15, UNC5B, y VSTM4.
En algunas realizaciones, el dominio extracelular del iCAR y/o pCAR expresado en la superficie celular se dirige contra o se une específicamente a una única variante alélica de un gen seleccionado de grupo que consiste en AMICA1, ANO1, ANO3, APLP2, C11orf24, CCKBR, CD248, CD44, CD5, CD6, CD82, CDON, CLMP, CRTAM, DCHS1, DSCAML1, FAT3, FOLH1, GDPD4, GDPD5, GRIK4, HEPHL1, HTR3B, IFITM10, IL10RA, KIRREL3, LGR4, LRP4, LRP5, LRRC32, MCAM, MFRP, MMP26, MPEG1, MRGPRE, MRGPRF, MRGPRX2, MRGPRX3, MRGPRX4, MS4A4A, MS4A6A, MTNR1B, MUC15, NAALAD2, NAALADL1, NCAM1, NRXN2, OR10A2, OR10A5, OR10A6, OR10D3, OR10G4, OR10G7, OR10G8, OR10G9, OR10Q1, OR10S1, OR1S1, OR2AG1, OR2AG2, OR2D2, OR4A47, OR4A15, OR4A5, OR4C11, OR4C13, OR4C15, OR4C16, OR4C3, OR4C46, OR4C5, OR4D6, OR4A8P, OR4D9, OR4S2, OR4X1, OR51E1, OR51L1, OR52A1, OR52E1, OR52E2, OR52E4, OR52E6, OR52I1, OR52I2, OR52J3, OR52L1, OR52N1, OR52N2, OR52N4, OR52W1, OR56B1, OR56B4, OR5A1, OR5A2, OR5AK2, OR5AR1, OR5B17, OR5B3, OR5D14, OR5D16, OR5D18, OR5F1, OR5I1, OR5L2, OR5M11, OR5M3, OR5P2, OR5R1, OR5T2, OR5T3, OR5W2, OR6A2, OR6T1, OR6X1, OR8A1, OR8B12, OR8B2, OR8B3, OR8B4, OR8D1, OR8D2, OR8H1, OR8H2, OR8H3, OR8I2, OR8J1, OR8J2, OR8J3, OR8K1, OR8K3, OR8K5, OR8U1, OR9G1, OR9G4, OR9Q2, P2RX3, PTPRJ, ROBO3, SIGIRR, SLC22A10, SLC3A2, SLC5A12, SLCO2B1, SORL1, ST14, SYT8, TENM4, TMEM123, TMEM225, TMPRSS4, TMPRSS5, TRIM5, TRPM5, TSPAN18, y ZP1.
En algunas realizaciones, el dominio extracelular del iCAR y/o pCAR expresado en la superficie celular se dirige contra o se une específicamente a una única variante alélica de un gen seleccionado de grupo que consiste en ANO4, AVPR1A, BCL2L14, CACNA2D4, CD163, CD163L1, CD27, CD4, CLEC12A, CLEC1B, CLEC2A, CLEC4C, CLEC7A, CLECL1, CLSTN3, GPR133, GPRC5D, ITGA7, ITGB7, KLRB1, KLRC2, KLRC3, KLRC4, KLRF1, KLRF2, LRP1, LRP6, MANSC1, MANSC4, OLR1, OR10AD1, OR10P1, OR2AP1, OR6C1, OR6C2, OR6C3, OR6C4, OR6C6, OR6C74, OR6C76, OR8S1, OR9K2, ORAI1, P2RX4, P2RX7, PRR4, PTPRB, PTPRQ, PTPRR, SCNN1A, SELPLG, SLC2A14, SLC38A4, SLC5A8, SLC6A15, SLC8B1, SLCO1A2, SLCO1B1, SLCO1B7, SLCO1C1, SSPN, STAB2, TAS2R10, TAS2R13, TAS2R14, TAS2R20, TAS2R30, TAS2R31, TAS2R42, TAS2R43, TAS2R46, TAS2R7, TMEM119, TMEM132B, TMEM132C, TMEM132D, TMPRSS12, TNFRSF1A, TSPAN8, y VSIG10.
En algunas realizaciones, el dominio extracelular del iCAR y/o pCAR expresado en la superficie celular se dirige contra o se une específicamente a una única variante alélica de un gen seleccionado de grupo que consiste en ATP4B, ATP7B, FLT3, FREM2, HTR2A, KL, PCDH8, RXFP2, SGCG, SHISA2, SLC15A1, SLITRK6, y TNFRSF19.
En algunas realizaciones, el resto de reconocimiento para uso en el aCAR, iCAR y/o pCAR proporciona especificidad para al menos un epítopo polimórfico extracelular en un producto génico de un gen seleccionado del grupo que consiste en ADAM21, BDKRB2, C14orf37, CLEC14A, DLK1, FLRT2, GPR135, GPR137C, JAG2, LTB4R2, MMP14, OR11G2, OR11H12, OR11H6, OR4K1, OR4K15, OR4K5, OR4L1, OR4N2, OR4N5, SLC24A4, y SYNDIG1L.
En algunas realizaciones, el dominio extracelular del iCAR y/o pCAR expresado en la superficie celular se dirige contra o se une específicamente a una única variante alélica de un gen seleccionado de grupo que consiste en ANPEP, CD276, CHRNA7, CHRNB4, CSPG4, DUOX1, DUOX2, FAM174B, GLDN, IGDCC4, ITGA11, LCTL, LTK, LYSMD4, MEGF11, NOX5, NRG4, OCA2, OR4F4, OR4M2, OR4N4, PRTG, RHCG, SCAMP5, SEMA4B, SEMA6D, SLC24A1, SLC24A5, SLC28A1, SPG11, STRA6, TRPM1, y TYRO3.
En algunas realizaciones, el dominio extracelular del iCAR y/o pCAR expresado en la superficie celular se dirige contra o se une específicamente a una única variante alélica de un gen seleccionado de grupo que consiste en ATP2C2, CACNA1H, CD19, CDH11, CDH15, CDH16, CDH3, CDH5, CNGB1, CNTNAP4, GDPD3, GPR56, GPR97, IFT140, IL4R, ITFG3, ITGAL, ITGAM, ITGAX, KCNG4, MMP15, MSLNL, NOMO1, NOMO3, OR2C1, PIEZO1, PKD1, PKD1L2, QPRT, SCNN1B, SEZ6L2, SLC22A31, SLC5A11, SLC7A6, SPN, TMC5, TMC7, TMEM204, TMEM219, y TMEM8A.
En algunas realizaciones, el dominio extracelular del iCAR y/o pCAR expresado en la superficie celular se dirige contra o se une específicamente a una única variante alélica de un gen seleccionado de grupo que consiste en ABCC3, ACE, AOC3, ARL17B, ASGR2, C17orf80, CD300A, CD300C, CD300E, CD300LF, CD300LG, CHRNB1, CLEC10A, CNTNAP1, CPD, CXCL16, ERBB2, FAM171A2, GCGR, GLP2R, GP1BA, GPR142, GUCY2D, ITGA2B, ITGA3, ITGAE, ITGB3, KCNJ12, LRRC37A2, LRRC37A3, LRRC37A, LRRC37B, MRC2, NGFR, OR1A2, OR1D2, OR1G1, OR3A1, OR3A2, OR4D1, OR4D2, RNF43, SCARF1, SCN4A, SDK2, SECTM1, SEZ6, SHPK, SLC26A11, SLC5A10, SPACA3, TMEM102, TMEM132E, TNFSF12, TRPV3, TTYH2, y TUSC5.
En algunas realizaciones, el dominio extracelular del iCAR y/o pCAR expresado en la superficie celular se dirige contra o se une específicamente a una única variante alélica de un gen seleccionado de grupo que consiste en APCDD1, CDH19, CDH20, CDH7, COLEC12, DCC, DSC1, DSG1, DSG3, DYNAP, MEP1B, PTPRM, SIGLEC15, y TNFRSF11A.
En algunas realizaciones, el dominio extracelular del iCAR y/o pCAR expresado en la superficie celular se dirige contra o se une específicamente a una única variante alélica de un gen seleccionado de grupo que consiste en ABCA7, ACPT, BCAM, C19orf38, C19orf59, C5AR1, CATSPERD, CATSPERG, CD22, CD320, CD33, CD97, CEACAM19, CEACAM1, CEACAM21, CEACAM3, CEACAM4, CLEC4M, DLL3, EMR1, EMR2, EMR3, ERVV-1, ERVV-2, FAM187B, FCAR, FFAR3, FPR1, FXYD5, GFY, GP6, GPR42, GRIN3B, ICAM3, IGFLR1, IL12RB1, IL27RA, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIRREL2, KISS1R, LAIR1, LDLR, LILRA1, LILRA2, LILRA4, LILRA6, LILRB1, LILRB2, LILRB3, LILRB4, LILRB5, LINGO3, LPHN1, LRP3, MADCAM1, MAG, MEGF8, MUC16, NCR1, NOTCH3, NPHS1, OR10H1, OR10H2, OR10H3, OR10H4, OR1I1, OR2Z1, OR7A10, OR7C1, OR7D4, OR7E24, OR7G1, OR7G2, OR7G3, PLVAP, PTGIR, PTPRH, PTPRS, PVR, SCN1B, SHISA7, SIGLEC10, SIGLEC11, SIGLEC12, SIGLEC5, SIGLEC6, SIGLEC8, SIGLEC9, SLC44A2, SLC5A5, SLC7A9, SPINT2, TARM1, TGFBR3L, TMC4, TMEM91, TMEM161A, TMPRSS9, TNFSF14, TNFSF9, TRPM4, VN1R2, VSIG10L, VSTM2B, y ZNRF4.
En algunas realizaciones, el dominio extracelular del iCAR y/o pCAR expresado en la superficie celular se dirige contra o se une específicamente a una única variante alélica de un gen seleccionado de grupo que consiste en ABHD12, ADAM33, ADRA1D, APMAP, ATRN, CD40, CD93, CDH22, CDH26, CDH4, FLRT3, GCNT7, GGT7, JAG1, LRRN4, NPBWR2, OCSTAMP, PTPRA, PTPRT, SEL1L2, SIGLEC1, SIRPA, SIRPB1, SIRPG, SLC24A3, SLC2A10, SLC4A11, SSTR4, y THBD.
En algunas realizaciones, el dominio extracelular del iCAR y/o pCAR expresado en la superficie celular se dirige contra o se une específicamente a una única variante alélica de un gen seleccionado de grupo que consiste en CLDN8, DSCAM, ICOSLG, IFNAR1, IFNGR2, IGSF5, ITGB2, KCNJ15, NCAM2, SLC19A1, TMPRSS15, TMPRSS2, TMPRSS3, TRPM2, y UMODL1.
En algunas realizaciones, el dominio extracelular del iCAR y/o pCAR expresado en la superficie celular se dirige contra o se une específicamente a una única variante alélica de un gen seleccionado de grupo que consiste en CACNAH, CELSR1, COMT, CSF2RB, GGT1, GGT5, IL2RB, KREMEN1, MCHR1, OR11H1, P2RX6, PKDREJ, PLXNB2, SCARF2, SEZ6L, SSTR3, SUSD2, TMPRSS6, y TNFRSF13C.
En algunas realizaciones, el dominio extracelular del iCAR y/o pCAR expresado en la superficie celular se dirige contra o se une específicamente a una única variante alélica de un gen seleccionado de grupo que consiste en ATP6AP2, ATP7A, CNGA2, EDA2R, FMR1NB, GLRA4, GPR112, GUCY2F, HEPH, P2RY10, P2RY4, PLXNA3, PLXNB3, TLR8, VSIG4, y XG.
En algunas realizaciones, el dominio extracelular del iCAR y/o pCAR expresado en la superficie celular se dirige contra o se une específicamente a una única variante alélica de HLA-A2. En algunas realizaciones, el dominio extracelular del iCAR y/o pCAR expresado en la superficie celular se dirige contra o se une específicamente a una única variante alélica de CD20. En algunas realizaciones, el iCAR se dirigirá contra HLA-A2. En algunas realizaciones, el iCAR se dirigirá contra CD20. En algunas realizaciones, el aCAR se dirigirá contra CD19. En algunas realizaciones, el conjunto iCAR/aCAR será HLA-A2 y CD19 respectivamente. En algunas realizaciones, el conjunto iCAR/aCAR incluirá CD20 y CD19 respectivamente.
vi. PREPARACIÓN DE CÉLULAS DIANA
En algunas realizaciones, las células diana se preparan y analizan en un sistema in vitro. En algunas realizaciones, se establecerá un sistema recombinante in vitro para probar la funcionalidad de los constructos de iCAR y/o pCAR en la inhibición de la actividad de aCAR contra las células fuera de la diana. En algunas realizaciones, se producirán células diana que expresan el epítopo de aCAR, el epítopo de iCAR, o ambos. En algunas realizaciones, se producirán células diana que expresan el epítopo de aCAR, el epítopo de pCAR, o ambos. En algunas realizaciones, las células recombinantes que expresan el epítopo de aCAR representarán las células 'en el tumor' en la diana, mientras que las células que expresan los epítopos de aCAR e iCAR representarían las células sanas 'fuera del tumor' en la diana.
En algunas realizaciones, el conjunto iCAR/aCAR será HLA-A2 y CD19 respectivamente, las células recombinantes que expresan HLA-A2, CD19, o ambas, se producirán transfectando la línea celular (p.ej., Hela, Hela-Luciferasa o Raji) con el vector de expresión que codifica estos genes. Para la detección de la expresión recombinante de CD19 y HLA-A2, ambos genes se fusionarán con una etiqueta de proteína (p.ej., HA o Flag o Myc, etc.). En algunas realizaciones, el conjunto de la diana de iCAR/aCAR será CD20/CD19, y las células recombinantes expresarán CD19, CD20, o ambos.
En algunas realizaciones, el vector de expresión que comprende el conjunto de la diana de iCAR/aCAR se transfecta en una célula. En algunas realizaciones, el vector de expresión se transfecta en una célula para producir los efectos diana y fuera del tumor.
En algunas realizaciones, el vector de expresión codifica un gen seleccionado del grupo que consiste en ABCA4, ADAM30, AQP10, ASTN1, C1orf101, CACNA1S, CATSPER4, CD101, CD164L2, CD1A, CD1C, CD244, CD34, CD46, CELSR2, CHRNB2, CLCA2, CLDN19, CLSTN1, CR1, CR2, CRB1, CSF3R, CSMD2, ECE1, ELTD1, EMC1, EPHA10, EPHA2, EPHA8, ERMAP, FCAMR, FCER1A, FCGR1B, FCGR2A, FCGR2B, FCGR3A, FCRL1, FCRL3, FCRL4, FCRL5, FCRL6, GJB4, GPA33, GPR157, GPR37L1, GPR88, HCRTR1, IGSF3, IGSF9, IL22RA1, IL23R, ITGA10, KIAA1324, KIAA2013, LDLRAD2, LEPR, LGR6, LRIG2, LRP8, LRRC52, LRRC8B, LRRN2, LY9, MIA3, MR1, MUC1, MXRA8, NCSTN, NFASC, NOTCH2, NPR1, NTRK1, OPN3, OR10J1, OR10J4, OR10K1, OR10R2, OR10T2, OR10X1, OR11L1, OR14A16, OR14I1, OR14K1, OR2AK2, OR2C3, OR2G2, OR2G3, OR2L2, OR2M7, OR2T12, OR2T27, OR2T1, OR2T3, OR2T29, OR2T33, OR2T34, OR2T35, OR2T3, OR2T4, OR2T5, OR2T6, OR2T7, OR2T8, OR2W3, OR6F1, OR6K2, OR6K3, OR6K6, OR6N1, OR6P1, OR6Y1, PDPN, PEAR1, PIGR, PLXNA2, PTCH2, PTCHD2, PTGFRN, PTPRC, PTPRF, PTGFRN, PVRL4, RHBG, RXFP4, S1PR1, SCNN1D, SDC3, SELE, SELL, SELP, SEMA4A, SEMA6C, SLAMF7, SLAMF9, SLC2A7, SLC5A9, TACSTD2, TAS1R2, TIE1, TLR5, TMEM81, TNFRSF14, TNFRSF1B, TRABD2B, USH2A, VCAM1, y ZP4.
En algunas realizaciones, el vector de expresión codifica un gen seleccionado del grupo que consiste en ABCG5, ALK, ASPRV1, ATRAID, CD207, CD8B, CHRNG, CLEC4F, CNTNAP5, CRIM1, CXCR1, DNER, DPP10, EDAR, EPCAM, GPR113, GPR148, GPR35, GPR39, GYPC, IL1RL1, ITGA4, ITGA6, ITGAV, LCT, LHCGR, LRP1B, LRP2, LY75, MARCO, MERTK, NRP2, OR6B2, PLA2R1, PLB1, PROKR1, PROM2, SCN7A, SDC1, SLC23A3, SLC5A6, TGOLN2, THSD7B, TM4SF20, TMEFF2, TMEM178A, TPO, y TRABD2AD2A.
En algunas realizaciones, el vector de expresión codifica un gen seleccionado del grupo que consiste en ACKR2, ALCAM, ANO10, ATP13A4, BTLA, CACNA1D, CACNA2D2, CACNA2D3, CASR, CCRL2, CD200, CD200R1, CD86, CD96, CDCP1, CDHR4, CELSR3, CHL1, CLDN 11, CEDN18, CLSTN2, CSPG5, CX3CR1, CXCR6, CYP8B1, DCBLD2, DRD3, EPHA6, EPHB3, GABRR3, GP5, GPR128, GPR15, GPR27, GRM2, GRM7, HEG1, HTR3C, HTR3D, HTR3E, IGSF11, IL17RC, IL17RD, IL17RE, IL5RA, IMPG2, ITGA9, ITGB5, KCNMB3, LRIG1, LRRC15, LRRN1, MST1R, NAALADL2, NRROS, OR5AC1, OR5H1, OR5H14, OR5H15, OR5H6, OR5K2, OR5K3, OR5K4, PIGX, PLXNB1, PLXND1, PRRT3, PTPRG, ROBO2, RYK, SEMA5B, SIDT1, SLC22A14, SLC33A1, SLC4A7, SLITRK3, STAB1, SUSD5, TFRC, TLR9, TMEM108, TMEM44, TMPRSS7, TNFSF10, UPK1B, VIPR1, y ZPLD1.
En algunas realizaciones, el vector de expresión codifica un gen seleccionado del grupo que consiste en ANTXR2, BTC, CNGA1, CORIN, EGF, EMCN, ENPEP, EPHA5, ERVMER34-1, EVC2, FAT1, FAT4, FGFRL1, FRAS1, GPR125, GRID2, GYPA, GYPB, KDR, KIAA0922, KLB, MFSD8, PARM1, PDGFRA, RNF150, TENM3, TLR10, TLR1, TLR6, TMEM156, TMPRSS11A, TMPRSS11B, TMPRSS11 E, TMPRSS11 F, UGT2A1, y UNC5C.
En algunas realizaciones, el vector de expresión codifica un gen seleccionado del grupo que consiste en ADAM19, ADRB2, BTNL3, BTNL8, BTNL9, C5orf15, CATSPER3, CD180, CDH12, CDHR2, COL23A1, CSF1R, F2RL2, FAM174A, FAT2, FGFR4, FLT4, GABRA6, GABRG2, GPR151, GPR98, GRM6, HAVCR1, HAVCR2, IL31RA, IL6ST, IL7R, IQGAP2, ITGA1, ITGA2, KCNMB1, LIFR, LNPEP, MEGF10, NIPAL4, NPR3, NRG2, OR2V1, OR2Y1, OSMR, PCDH12, PCDH1, PCDHA1, PCDHA2, PCDHA4, PCDHA8, PCDHA9, PCDHB10, PCDHB11, PCDHB13, PCDHB14, PCDHB15, PCDHB16, PCDHB2, PCDHB3, PCDHB4, PCDHB5, PCDHB6, PCDHGA1, PCDHGA4, PDGFRB, PRLR, SEMA5A, SEMA6A, SGCD, SLC1A3, SLC22A4, SLC22A5, SLC23A1, SLC36A3, SLC45A2, SLC6A18, SLC6A19, SLCO6A1, SV2C, TENM2, TIMD4, y UGT3A1.
En algunas realizaciones, el vector de expresión codifica un gen seleccionado del grupo que consiste en BAI3, BTN1A1, BTN2A1, BTN2A2, BTN3A1, BTN3A2, BTNL2, CD83, DCBLD1, DLL1, DPCR1, ENPP1, ENPP3, ENPP4, EPHA7, GABBR1, GABRR1, GCNT6, GFRAL, GJB7, GLP1R, GPR110, GPR111, GPR116, GPR126, GPR63, GPRC6A, HFE, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DOA, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQA2, HLA-DQB1, HLA-DQB2, HLA-DRB1, HLA-DRB5, HLA-E, HLA-F, HLA-G, IL20RA, ITPR3, KIAA0319, LMBRD1, LRFN2, LRP11, MAS1L, MEP1A, MICA, MICB, MOG, MUC21, MUC22, NCR2, NOTCH4, OPRM1, OR10C1, OR12D2, OR12D3, OR14J1, OR2B2, OR2B6, OR2J1, OR2W1, OR5V1, PDE10A, PI16, PKHD1, PTCRA, PTK7, RAET1E, RAET1G, ROS1, SDIM1, SLC16A10, SLC22A1, SLC44A4, TAAR2, TREM1, TREML1, y TREML2.
En algunas realizaciones, el vector de expresión codifica un gen seleccionado del grupo que consiste en AQP1, C7orf50, CD36, CDHR3, CNTNAP2, DPP6, EGFR, EPHA1, EPHB6, ERVW-1, GHRHR, GJC3, GPNMB, GRM8, HUS1, HYAL4, KIAA1324L, LRRN3, MET, MUC12, MUC17, NPC1L1, NPSR1, OR2A12, OR2A14, OR2A25, OR2A42, OR2A7, OR2A2, OR2AE1, OR2F2, OR6V1, PILRA, PILRB, PKD1L1, PLXNA4, PODXL, PTPRN2, PTPRZ1, RAMP3, SLC29A4, SMO, TAS2R16, TAS2R40, TAS2R4, TFR2, THSD7A, TMEM213, TTYH3, ZAN, y ZP3.
En algunas realizaciones, el vector de expresión codifica un gen seleccionado del grupo que consiste en ADAM18, ADAM28, ADAM32, ADAM7, ADAM9, ADRA1A, CDH17, CHRNA2, CSMD1, CSMD3, DCSTAMP, FZD6, GPR124, NRG1, OR4F21, PKHD1L1, PRSS55, SCARA3, SCARA5, SDC2, SLC10A5, SLC39A14, SLC39A4, SLCO5A1, TNFRSF10A, y TNFRSF10B.
En algunas realizaciones, el vector de expresión codifica un gen seleccionado del grupo que consiste en ABCA1, AQP7, ASTN2, C9orf135, CA9, CD72, CNTNAP3B, CNTNAP3, CRB2, ENTPD8, GPR144, GRIN3A, IZUMO3, KIAA1161, MAMDC4, MEGF9, MUSK, NOTCH1, OR13C2, OR13C3, OR13C5, OR13C8, OR13C9, OR13D1, OR13F1, OR1B1, OR1J2, OR1K1, OR1L1, OR1L3, OR1L6, OR1L8, OR1N1, OR1N2, OR1Q1, OR2S2, PCSK5, PDCD1LG2, PLGRKT, PTPRD, ROR2, SEMA4D, SLC31A1, TEK, TLR4, TMEM2, y VLDLR.
En algunas realizaciones, el vector de expresión codifica un gen seleccionado del grupo que consiste en ABCC2, ADAM8, ADRB1, ANTXRL, ATRNL1, C10orf54, CDH23, CDHR1, CNNM2, COL13A1, COL17A1, ENTPD1, FZD8, FGFR2, GPR158, GRID1, IL15RA, IL2RA, ITGA8, ITGB1, MRC1, NRG3, NPFFR1, NRP1, OPN4, PCDH15, PKD2L1, PLXDC2, PRLHR, RET, RGR, SLC16A9, SLC29A3, SLC39A12, TACR2, TCTN3, TSPAN15, UNC5B, y VSTM4.
En algunas realizaciones, el vector de expresión codifica un gen seleccionado del grupo que consiste en AMICA1, ANO1, ANO3, APLP2, C11orf24, CCKBR, CD248, CD44, CD5, CD6, CD82, CDON, CLMP, CRTAM, DCHS1, DSCAML1, FAT3, FOLH1, GDPD4, GDPD5, GRIK4, HEPHL1, HTR3B, IFITM10, IL10RA, KIRREL3, LGR4, LRP4, LRP5, LRRC32, MCAM, MFRP, MMP26, MPEG1, MRGPRE, MRGPRF, MRGPRX2, MRGPRX3, MRGPRX4, MS4A4A, MS4A6A, MTNR1B, MUC15, NAALAD2, NAALADL1, NCAM1, NRXN2, OR10A2, OR10A5, OR10A6, OR10D3, OR10G4, OR10G7, OR10G8, OR10G9, OR10Q1, OR10S1, OR1S1, OR2AG1, OR2AG2, OR2D2, OR4A47, OR4A15, OR4A5, OR4C11, OR4C13, OR4C15, OR4C16, OR4C3, OR4C46, OR4C5, OR4D6, OR4A8P, OR4D9, OR4S2, OR4X1, OR51E1, OR51L1, OR52A1, OR52E1, OR52E2, OR52E4, OR52E6, OR52I1, OR52I2, OR52J3, OR52L1, OR52N1, OR52N2, OR52N4, OR52W1, OR56B1, OR56B4, OR5A1, OR5A2, OR5AK2, 0R5AR1, OR5B17, OR5B3, OR5D14, OR5D16, OR5D18, OR5F1, OR5I1, OR5L2, OR5M11, OR5M3, OR5P2, OR5RI, OR5T2, OR5T3, OR5W2, OR6A2, OR6T1, OR6X1, OR8A1, OR8B12, OR8B2, OR8B3, OR8B4, OR8D1, OR8D2, OR8H1, OR8H2, OR8H3, OR8I2, OR8J1, OR8J2, OR8J3, OR8K1, OR8K3, OR8K5, OR8U1, OR9G1, OR9G4, OR9Q2, P2RX3, PTPRJ, ROBO3, SIGIRR, SLC22A10, SLC3A2, SLC5A12, SLCO2B1, SORL1, ST14, SYT8, TENM4, TMEM123, TMEM225, TMPRSS4, TMPRSS5, TRIM5, TRPM5, TSPAN18, y ZP1.
En algunas realizaciones, el vector de expresión codifica un gen seleccionado del grupo que consiste en ANO4, AVPR1A, BCL2L14, CACNA2D4, CD163, CD163L1, CD27, CD4, CLEC12A, CLEC1B, CLEC2A, CLEC4C, CLEC7A, CLECL1, CLSTN3, GPR133, GPRC5D, ITGA7, ITGB7, KLRB1, KLRC2, KLRC3, KLRC4, KLRF1, KLRF2, LRP1, LRP6, MANSC1, MANSC4, OLR1, OR10AD1, OR10P1, OR2AP1, OR6C1, OR6C2, OR6C3, OR6C4, OR6C6, OR6C74, OR6C76, OR8S1, OR9K2, ORAI1, P2RX4, P2RX7, PRR4, PTPRB, PTPRQ, PTPRR, SCNN1A, SELPLG, SLC2A14, SLC38A4, SLC5A8, SLC6A15, SLC8B1, SLCO1A2, SLCO1B1, SLCO1B7, SLCO1C1, SSPN, STAB2, TAS2R10, TAS2R13, TAS2R14, TAS2R20, TAS2R30, TAS2R31, TAS2R42, TAS2R43, TAS2R46, TAS2R7, TMEM119, TMEM132B, TMEM132C, TMEM132D, TMPRSS12, TNFRSF1A, TSPAN8, y VSIG10.
En algunas realizaciones, el vector de expresión codifica un gen seleccionado del grupo que consiste en ATP4B, ATP7B, FLT3, FREM2, HTR2A, KL, PCDH8, RXFP2, SGCG, SHISA2, SLC15A1, SLITRK6, y TNFRSF19.
En algunas realizaciones, el vector de expresión codifica un gen seleccionado del grupo que consiste en ADAM21, BDKRB2, C14orf37, CLEC14A, DLK1, FLRT2, GPR135, GPR137C, JAG2, LTB4R2, MMP14, OR11G2, OR11H12, OR11H6, OR4K1, OR4K15, OR4K5, OR4L1, OR4N2, OR4N5, SLC24A4, y SYNDIG1L.
En algunas realizaciones, el vector de expresión codifica un gen seleccionado del grupo que consiste en ANPEP, CD276, CHRNA7, CHRNB4, CSPG4, DUOX1, DUOX2, FAM174B, GLDN, IGDCC4, ITGA11, LCTL, LTK, LYSMD4, MEGF11, NOX5, NRG4, OCA2, OR4F4, OR4M2, OR4N4, PRTG, RHCG, SCAMP5, SEMA4B, SEMA6D, SLC24A1, SLC24A5, SLC28A1, SPG11, STRA6, TRPM1, y TYRO3.
En algunas realizaciones, el vector de expresión codifica un gen seleccionado del grupo que consiste en ATP2C2, CACNA1H, CD19, CDH11, CDH15, CDH16, CDH3, CDH5, CNGB1, CNTNAP4, GDPD3, GPR56, GPR97, IFT140, IL4R, ITFG3, ITGAL, ITGAM, ITGAX, KCNG4, MMP15, MSLNL, NOMO1, NOMO3, OR2C1, PIEZO1, PKD1, PKD1L2, QPRT, SCNN1B, SEZ6L2, SLC22A31, SLC5A11, SLC7A6, SPN, TMC5, TMC7, TMEM204, TMEM219, y TMEM8A.
En algunas realizaciones, el vector de expresión codifica un gen seleccionado del grupo que consiste en ABCC3, ACE, AOC3, ARL17B, ASGR2, C17orf80, CD300A, CD300C, CD300E, CD300LF, CD300LG, CHRNB1, CLEC10A, CNTNAP1, CPD, CXCL16, ERBB2, FAM171A2, GCGR, GLP2R, GP1BA, GPR142, GUCY2D, ITGA2B, ITGA3, ITGAE, ITGB3, KCNJ12, LRRC37A2, LRRC37A3, LRRC37A, LRRC37B, MRC2, NGFR, OR1A2, OR1D2, OR1G1, OR3A1, OR3A2, OR4D1, OR4D2, RNF43, SCARF1, SCN4A, SDK2, SECTM1, SEZ6, SHPK, SLC26A11, SLC5A10, SPACA3, TMEM102, TMEM132E, TNFSF12, TRPV3, TTYH2, y TUSC5.
En algunas realizaciones, el vector de expresión codifica un gen seleccionado del grupo que consiste en APCDD1, CDH19, CDH20, CDH7, COLEC12, DCC, DSC1, DSG1, DSG3, DYNAP, MEP1B, PTPRM, SIGLEC15, y TNFRSF11A.
En algunas realizaciones, el vector de expresión codifica un gen seleccionado del grupo que consiste en ABCA7, ACPT, BCAM, C19orf38, C19orf59, C5AR1, CATSPERD, CATSPERG, CD22, CD320, CD33, CD97, CEACAM19, CEACAM1, CEACAM21, CEACAM3, CEACAM4, CLEC4M, DLL3, EMR1, EMR2, EMR3, ERVV-1, ERVV-2, FAM187B, FCAR, FFAR3, FPR1, FXYD5, GFY, GP6, GPR42, GRIN3B, ICAM3, IGFLR1, IL12RB1, IL27RA, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIRREL2, KISS1R, LAIR1, LDLR, LILRA1, LILRA2, LILRA4, LILRA6, LILRB1, LILRB2, LILRB3, LILRB4, LILRB5, LINGO3, LPHN1, LRP3, MADCAM1, MAG, MEGF8, MUC16, NCR1, NOTCH3, NPHS1, OR10H1, OR10H2, OR10H3, OR10H4, OR1I1, OR2Z1, OR7A10, OR7C1, OR7D4, OR7E24, OR7G1, OR7G2, OR7G3, PLVAP, PTGIR, PTPRH, PTPRS, PVR, SCN1B, SHISA7, SIGLEC10, SIGLEC11, SIGLEC12, SIGLEC5, SIGLEC6, SIGLEC8, SIGLEC9, SLC44A2, SLC5A5, SLC7A9, SPINT2, TARM1, TGFBR3L, TMC4, TMEM91, TMEM161A, TMPRSS9, TNFSF14, TNFSF9, TRPM4, VN1R2, VSIG10L, VSTM2B, y ZNRF4.
En algunas realizaciones, el vector de expresión codifica un gen seleccionado del grupo que consiste en ABHD12, ADAM33, ADRA1D, APMAP, ATRN, CD40, CD93, CDH22, CDH26, CDH4, FLRT3, GCNT7, GGT7, JAG1, LRRN4, NPBWR2, OCSTAMP, PTPRA, PTPRT, SEL1L2, SIGLEC1, SIRPA, SIRPB1, SIRPG, SLC24A3, SLC2A10, SLC4A11, SSTR4, y THBD.
En algunas realizaciones, el vector de expresión codifica un gen seleccionado del grupo que consiste en CLDN8, DSCAM, ICOSLG, IFNAR1, IFNGR2, IGSF5, ITGB2, KCNJ15, NCAM2, SLC19A1, TMPRSS15, TMPRSS2, TMPRSS3, TRPM2, y UMODL1.
En algunas realizaciones, el vector de expresión codifica un gen seleccionado del grupo que consiste en CACNA11, CELSR1, COMT, CSF2RB, GGT1, GGT5, IL2RB, KREMEN1, MCHR1, OR11H1, P2RX6, PKDREJ, PLXNB2, SCARF2, SEZ6L, SSTR3, SUSD2, TMPRSS6, y TNFRSF13C.
En algunas realizaciones, el vector de expresión codifica un gen seleccionado del grupo que consiste en ATP6AP2, ATP7A, CNGA2, EDA2R, FMR1NB, GLRA4, GPR112, GUCY2F, HEPH, P2RY10, P2RY4, PLXNA3, PLXNB3, TLR8, VSIG4, y XG.
En algunas realizaciones, las células inmunitarias efectoras seguras usadas para tratar el cáncer como se define anteriormente expresan en su superficie un aCAR que comprende un dominio extracelular que se une específicamente a un antígeno asociado a un tumor o un epítopo de superficie celular de un antígeno, y un iCAR que comprende un dominio extracelular que se une específicamente a una única variante alélica de un epítopo de superficie celular polimórfico de un antígeno expresado al menos en un tejido de origen del tumor, tal como cualquiera de los enumerados anteriormente, que es un antígeno diferente de aquel al que se une el dominio extracelular de dicho aCAR. En algunas realizaciones, el iCAR se expresa en el mismo tejido en el que se expresa el aCAR. En algunas realizaciones, el aCAR e iCAR son alelos diferentes del mismo gen. En algunas realizaciones, el aCAR e iCAR son proteínas diferentes, y por lo tanto son alelos diferentes.
A. ENSAYOS IN VITRO
En algunas realizaciones, el iCAR y/o pCAR se evaluarán para determinar la actividad en los efectos, incluyendo la eficacia y la capacidad de inhibición, usando una variedad de ensayos. En algunas realizaciones, el efecto inhibidor del iCAR y/o pCAR se evaluará in vitro y/o in vivo. En algunas realizaciones, el efecto inhibidor del iCAR y/o pCAR se evaluará in vitro. En algunas realizaciones, el efecto inhibidor del iCAR y/o pCAR se evaluará in vivo. En algunas realizaciones, los ensayos in vitro miden la secreción de citocinas y/o los efectos de citotoxicidad. En algunas realizaciones, los ensayos in vivo evaluarán la inhibición y la protección de iCAR y/o pCAR contra xenoinjertos fuera del tumor en la diana. En algunas realizaciones, los ensayos in vivo evaluarán la inhibición y protección del iCAR y/o pCAR contra el tejido fuera del tumor en la diana y/u órganos virales.
i. Ensayo de citotoxicidad de luciferasa
En algunas realizaciones, el iCAR y/o el pCAR se evalúan usando un ensayo de citotoxicidad de luciferasa. En general, para un ensayo citotóxico de luciferasa, las células diana recombinantes (que pueden denominarse “T”) se manipulan para expresar la luciferasa de luciérnaga. En algunas realizaciones, las células Hela-Luc comerciales pueden transfectarse con ADN que codifica las proteínas diana. El ensayo in vitro de luciferasa se puede realizar según el ensayo Bright-Glo Luciferase (disponible comercialmente de Promega o BPS Biosciences u otros proveedores comerciales). Las células T efectoras (E) transducidas (que han sido transducidas tanto con iCAR o pCAR como con aCAR o aCAR o CAR simulado) se pueden incubar durante 24 a 48 horas con células diana recombinantes que expresan HLA-A2, CD19, o tanto CD19 como HLA-A2, o CD20, o tanto CD20 como CD19, para probarlas en diferentes relaciones de efector a diana. En algunas realizaciones, el par iCAR/aCAR o pCAR/aCAR comprende cualquiera de aCAR, pCAR y/o iCAR con los componentes descritos anteriormente. En algunas realizaciones, el par iCAR/aCAR comprende un iCAR dirigido contra HLA-A2, y un aCAR dirigido contra CD19. En algunas realizaciones, el par iCAR/aCAR comprende un iCAR dirigido contra CD20, y un aCAR dirigido contra CD19. La muerte celular se cuantificará indirectamente mediante la estimación del número de células vivas con el sistema Bright-Glo Luciferase.
En algunas realizaciones, la citotoxicidad 'fuera del tumor' se puede optimizar clasificando las poblaciones de células T transducidas según el nivel de expresión de iCAR/aCAR, o seleccionando la subpoblación de células diana recombinantes según su expresión diana, incluyendo, por ejemplo, la expresión del producto génico que codifica al menos un epítopo polimórfico extracelular. En algunas realizaciones, la diana de aCAR, iCAR y/o pCAR es cualquier diana con un dominio extracelular. En algunas realizaciones, la clasificación se basa en el nivel de expresión de CD19 o HLA-A2.
En algunas realizaciones, el iCAR y/o pCAR se examina para determinar si las células T transducidas con iCAR pueden discriminar entre las células 'en el tumor' (p. ej., células tumorales) y las células 'fuera del tumor' (p. ej., células no tumorales) in vitro. En general, esto se prueba examinando el efecto letal de las células T transducidas incubadas con una mezcla de células 'en el tumor' y 'fuera del tumor' en una relación de 1:1. En algunas realizaciones, la relación es 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, o 1:8. Las células recombinantes en el tumor se pueden distinguir de las células recombinantes 'fuera del tumor' por la expresión de luciferasa en realizaciones en las que solo se manipulará una población celular para expresar el gen de la luciferasa a la vez). La destrucción se puede cuantificar después de 24 a 48 horas de coincubación usando el ensayo Bright-Glo Luciferase (Promega).
En algunas realizaciones, las células T transducidas con iCAR/aCAR y/o pCAR/aCAR exhiben alrededor de 10%, alrededor de 20%, alrededor de 30%, alrededor de 40%, alrededor de 50%, alrededor de 60%, alrededor de 70%, alrededor de 80%, alrededor de 90%, y/o alrededor de 95% menos de destrucción de células fuera del tumor en comparación con las células T transducidas con aCAR pero no transducidas con iCAR y/o pCAR. En algunas realizaciones, las células T transducidas con iCAR/aCAR y/o pCAR/aCAR muestran alrededor de 1, alrededor de 2, alrededor de 3, alrededor de 4, alrededor de 5, o alrededor de 10 veces menos muerte de células fuera del tumor en comparación con las células T transducidas con aCAR pero no transducidas con iCAR y/o pCAR
ii. Caspasa 3
En algunas realizaciones, se emplean ensayos de detección de caspasa 3 para examinar iCAR y/o pCAR para determinar el nivel de apoptosis de las células 'en el tumor' (p. ej., células tumorales) y células 'fuera del tumor' (p. ej., células no tumorales) in vitro. En algunas realizaciones, se examina la detección de caspasa_3 de la apoptosis inducida por linfocitos citotóxicos (CTL) por un anticuerpo contra la caspasa 3 escindida activada.
Generalmente, una de las rutas por las que los CTL destruyen las células diana es induciendo la apoptosis a través del ligando Fas. La proteína CASP3 es un miembro de la familia de cisteína-ácido aspártico proteasas (caspasa). Por lo general, la activación secuencial de las caspasas desempeña un papel importante en la fase de ejecución de la apoptosis celular, y como tal, la escisión de la procaspasa 3 en caspasa 3 da como resultado un cambio conformacional y la expresión de la actividad catalítica. La forma activada escindida de la caspasa 3 puede reconocerse específicamente por un anticuerpo monoclonal.
En algunas realizaciones, las células T transducidas se pueden incubar con células recombinantes 'en el tumor' (p. ej., que imitan un tumor) y 'fuera del tumor' (p. ej., que no imitan un tumor). En algunas realizaciones, las células recombinantes 'en el tumor' (p. ej., tumorales) y 'fuera del tumor' (p. ej., no tumorales) se han marcado previamente con CFSE ((éster N-hidroxisuccinimidílico de 5(6)-carboxifluoresceína)) u otro tinte marcador celular (p. ej., CellTrace Violet). En algunas realizaciones, la coincubación de células diana con células efectoras se produce durante alrededor de 1 hora a alrededor de 6 horas, alrededor de 2 horas a alrededor de 5 horas, o alrededor de 2 a alrededor de 4 horas. En algunas realizaciones, la apoptosis de las células diana se cuantifica mediante citometría de flujo. Las células pueden permeabilizarse y fijarse con un kit de tinción interior (Miltenyi o BD bioscience), y teñirse con un anticuerpo para caspasa 3 activada (BD bioscience).
En algunas realizaciones, las células T transducidas con iCAR/aCAR y/o pCAR/aCAR inducen alrededor de 10%, alrededor de 20%, alrededor de 30%, alrededor de 40%, alrededor de 50%, alrededor de 60%, alrededor de 70%, alrededor de 80%, alrededor de 90%, y/o alrededor de 95% menos de apoptosis de células fuera del tumor en comparación con las células T transducidas con aCAR pero no transducidas con iCAR y/o pCAR. En algunas realizaciones, las células T transducidas con aCAR/iCAR y/o aCAR/pCAR inducen alrededor de 1, alrededor de 2, alrededor de 3, alrededor de 4, alrededor de 5, o alrededor de 10 veces menos apoptosis de células fuera del tumor en comparación con células T transducidas con aCAR pero no transducidas con iCAR y/o pCAR
iii. Microscopía de lapso de tiempo
Micros CTL de lapso de tiempo
Puede emplearse microscopía de lapso de tiempo de las células T transducidas con iCAR y/o pCAR para discernir la unión a la diana. En algunas realizaciones, las células diana se marcarán con un gen informador (por ejemplo, pero sin limitarse a, una proteína fluorescente tal como mCherry). En algunas realizaciones, las células T transducidas se incuban con células 'en el tumor' o 'fuera del tumor' durante hasta 5 días. En algunas realizaciones, se puede usar microscopía de lapso de tiempo para visualizar la muerte. En algunas realizaciones, se llevará a cabo un análisis de citometría de flujo usando tinción del número de células viables y perlas CountBright (Invitrogen) para determinar el número de células diana en el punto final.
En algunas realizaciones, para determinar si las células T transducidas con aCAR/iCAR o aCAR/pCAR pueden discernir dianas in vitro, cada célula diana recombinante ('en el tumor' o 'fuera del tumor') se marca con una proteína informadora diferente (por ejemplo, GFP y mCherry). En algunas realizaciones, cualquier par de proteínas informadoras funcionaría, siempre que el par informador contenga dos informadores que sean fácilmente distinguibles. En algunas realizaciones, las células T transducidas (células efectoras) se coincubarán con las células recombinantes (células diana) en una relación de 1:1 de E/T. En algunas realizaciones, la relación de efectores a diana (E/T) incluye, pero no se limita a, 16:1, 12:1, 10:1, 8:1, 6:1, 4:1, 2:1, o 1:1. En algunas realizaciones, el destino de la célula se examina entonces mediante formación de imágenes microscópicas.
iv. Liberación de citocinas
La liberación de citocinas se puede examinar para determinar la activación de las células T. En algunas realizaciones, las células T transducidas con iCAR/aCAR y/o pCAR/aCAR se incuban con las células diana recombinantes, y se cuantifica la producción de citocinas para una o más citocinas, por ejemplo midiendo la secreción de citocinas en el sobrenadante del cultivo celular según el kit ELISA MAXTM Deluxe Set de BioLegend, o mediante análisis de citometría de flujo del porcentaje de células T que producen citocinas. Para el análisis de citometría de flujo, generalmente se emplea una parada de Golgi para evitar la secreción de las citocinas. En algunas realizaciones, después de una incubación de 6 horas y de 18 a 24 horas de las células T transducidas con células diana, las células T se permeabilizarán y fijarán mediante un kit de tinción interior (Miltenyi), y se teñirán con anticuerpos para los marcadores de células T (CD3 y CD8) y para una o más citocinas. En algunas realizaciones, las citocinas incluyen, pero no se limitan, a IL-2, INFy y/o TNFa.
v. Tinción de CD107a
También se puede examinar la tinción de CD107a para determinar la actividad citolítica de las células T transducidas. En general, la desgranulación de las células T se puede identificar por la expresión superficial de CD 107a, una proteína de membrana asociada a los lisosomas (LAMP-1), y se ha mostrado que la expresión superficial de LAMP-1 se correlaciona con la citotoxicidad de las células T CD8. Además, esta molécula se encuentra en el lado luminal de los lisosomas. Normalmente, tras la activación, CD107a se transfiere a la superficie de la membrana celular de linfocitos activados. Además, CD107a se expresa en la superficie celular de forma transitoria, y se reinternaliza rápidamente a través de la ruta endocítica. Por lo tanto, aunque no está ligado a la teoría, la detección de CD107a se maximiza mediante la tinción de anticuerpos durante la estimulación celular y mediante la adición de monensina (por ejemplo, para evitar la acidificación y la subsiguiente degradación de los complejos de anticuerpos CD107a endocitados).
En algunas realizaciones, las células T transducidas con aCAR/iCAR y/o aCAR/pCAR se incuban con las células diana durante alrededor de 6 horas a alrededor de 24 horas, y se examina la expresión de CD107a en las células T CD8. En algunas realizaciones, las células diana expresan sólo una proteína diana reconocida por aCAR (como en las células tumorales) o células diana que expresan ambas proteínas diana reconocidas por aCAR e iCAR (como en las células normales). En algunas realizaciones, las células T transducidas coniCAR y/o pCAR se incuban con las células diana durante alrededor de 6 horas a alrededor de 24 horas en presencia de monensina, y la expresión de CD107a en las células T CD8 se sigue mediante citometría de flujo usando anticuerpos conjugados contra los marcadores de superficie de células T (por ejemplo, CD3 y CD8) y un anticuerpo conjugado para CD107a.
vi. Cuantificación por ELISA de citocinas segregadas
En algunas realizaciones, después del cocultivo de células T transducidas (Jurkat, o células T primarias), que expresan iCAR o aCAR, o tanto aCAR como iCAR, con células diana modificadas, que expresan iCAR o aCAR, o ambos antígenos aCAR e iCAR en su superficie celular, se recogerá el medio acondicionado, y se medirá la concentración de citocinas mediante ELISA de citocinas. En algunas realizaciones, la citocina se selecciona del grupo que consiste en IL-2, INFy y/o TNFa. En algunas realizaciones, la citocina se selecciona del grupo que consiste en IL-2. En algunas realizaciones, la citocina se selecciona del grupo que consiste en INFy. En algunas realizaciones, la citocina se selecciona del grupo que consiste en TNFa. En algunas realizaciones, con células transducidas con CAR dual (aCAR/iCAR) se demuestra una disminución de alrededor de 20%, alrededor de 25%, alrededor de 30%, alrededor de 35%, alrededor de 40%, alrededor de 45%, alrededor de 50%, alrededor de 55%, alrededor de 60%, alrededor de 65%, alrededor de 70%, alrededor de 75%, alrededor de 80%, alrededor de 85%, alrededor de 90%, alrededor de 95%, o alrededor de 99%.
vii. Secreción de citocinas medida mediante ensayo de matriz de perlas citométricas (CBA)
La matriz de perlas citométricas (CBA) se usa para medir una variedad de proteínas solubles e intracelulares, incluyendo citocinas, quimiocinas y factores de crecimiento. En algunas realizaciones, las células T (células T primarias o células Jurkat), transducidas con constructos de aCAR o tanto de aCAR como iCAR (células efectoras), se estimulan con células diana modificadas que expresan en su superficie celular antígenos diana tanto de iCAR y aCAR como de aCAR o iCAR. En algunas realizaciones, la relación de efectora a diana oscila entre 20:1 hasta 1:1. En algunas realizaciones, la relación efectora a diana oscila de 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1,9:1, 8:1,7:1,6:1,5:1,4:1,3:1,2:1, o 1:1. En algunas realizaciones, tras varias horas de coincubación, las células efectoras producen y segregan citocinas que indican su estado efector. En algunas realizaciones, el sobrenadante de la reacción se recoge, y se mide y se cuantifica la IL-2 segregada mediante un ensayo multiplex de CBA.
En algunas realizaciones, se demuestra una disminución de alrededor de 20%, alrededor de 25%, alrededor de 30%, alrededor de 35%, alrededor de 40%, alrededor de 45%, alrededor de 50%, alrededor de 55%, alrededor de 60%, alrededor de 65%, alrededor de 70%, alrededor de 75%, alrededor de 80%, alrededor de 85%, alrededor de 90%, alrededor de 95%, o alrededor de 99% cuando células transducidas con CAR dual (aCAR/iCAR) se coincubaron con células diana que expresan ambos antígenos diana, en comparación a la secreción de IL-2 que resultó de la incubación conjunta de las mismas células efectoras con células diana que expresaban sólo una diana. En algunas realizaciones, se demostró una disminución de alrededor de 20%, alrededor de 25%, alrededor de 30%, alrededor de 35%, alrededor de 40%, alrededor de 45%, alrededor de 50%, alrededor de 55%, alrededor de 60%, alrededor de 65%, alrededor de 70%, alrededor de 75%, alrededor de 80%, alrededor de 85%, alrededor de 90%, alrededor de 95%, o alrededor de 99% en la secreción de IL-2 cuando células transducidas con CAR dual (aCAR/iCAR) se coincubaron con células diana que expresan ambos antígenos diana, en comparación con la secreción de IL-2 que resultó de la incubación conjunta de las mismas células efectoras con células diana que expresaban sólo una diana. En algunas realizaciones, una disminución del 86%. En algunas realizaciones, el aCAR es un aCAR de CD19. En algunas realizaciones, el iCAR es un iCAR de HLA-A2. En algunas realizaciones, el iCAR es un iCAR de CD20. En algunas realizaciones, el par aCAR/iCAR es aCAR de CD19 y un iCAR de HLA-A2. En algunas realizaciones, el par aCAR/iCAR es un aCAR de CD19 y un iCAR de CD20.
viii. Ensayo de desgranulación de células T medido mediante tinción con CD107a
En algunas realizaciones, la desgranulación de células T puede identificarse mediante la expresión superficial de CD107a, una proteína de membrana asociada a lisosomas (LAMP-1). En algunas realizaciones, se ha demostrado que la expresión superficial de LAMP-1 se correlaciona con la citotoxicidad de las células T CD8. En algunas realizaciones, la granulación (CD107a) es un marcador del potencial letal.
B. ENSAYOS IN VIVO
En algunas realizaciones, la eficacia de los pares iCAR/aCAR y/o iCAR/pCAR se prueba in vivo. En algunas realizaciones, se inoculan por vía intravenosa ratones NOD/SCID/yc- o similares con células tumorales. En algunas realizaciones, las células tumorales son células NALM 6 CD19 positivas (ATCC, línea celular B-ALL humana) que están manipuladas para expresar luciferasa de luciérnaga. En algunas realizaciones, para el establecimiento y/o la diferenciación entre células 'en la diana' y células 'fuera del tumor', NALM 6 puede manipularse para expresar el epítopo de iCAR y/o pCAR, representando así las células sanas. En algunas realizaciones, el epítopo de iCAR y/o pCAR comprende al menos un epítopo polimórfico extracelular. En algunas realizaciones, el epítopo de iCAR y/o pCAR es de HLA-A2 o CD20. Otras células que podrían emplearse en estos ensayos incluyen, pero no se limitan a, Raji o cualquier otra línea celular recombinante. En algunas realizaciones, dichos ensayos pueden estar en un modelo PDX (xenoinjerto derivado del paciente).
Para el ensayo, los ratones se dividirán en grupos de estudio; a un grupo se le inyectarán células NALM 6 mientras que al otro se le inyectarán NALM-6 que expresa el epítopo de iCAR. Varios días después, los ratones recibirán una infusión intravenosa de células T transducidas con aCAR, aCAR/iCAR y un grupo de control de células T no transducidas o sin células T. Los ratones se sacrificarán, y se cuantificará la carga tumoral según el flujo total.
Según una realización del ensayo, para probar si las células T que expresan el constructo de iCAR y/o pCAR podrían discriminar in vivo entre las células diana y las células fuera de diana dentro del mismo organismo, a los ratones se les inyecta una mezcla 1:1 de células NALM-6 'en el tumor'/'fuera del tumor, seguido de una inyección de células T transducidas que expresan el aCAR solo o tanto aCAR como iCAR. Con esta realización, tras el sacrificio de los ratones, se analizará la presencia de células 'en el tumor' y 'fuera del tumor' en el bazo y la médula ósea mediante citometría de flujo para los dos marcadores, CD19 y el epítopo de iCAR.
i. Ensayo de CTL in vivo en modelos de ratón con xenoinjerto humano
En algunas realizaciones, para probar si las células T que expresan constructos tanto de aCAR como de iCAR discriminan entre las células diana y las células 'fuera de la diana' dentro del mismo organismo y destruyen eficazmente las células diana mientras evitan las células 'fuera de la diana' se evaluará mediante un ensayo de c Tl in vivo.
En algunas realizaciones, las células T transducidas con ¡CAR o aCAR, o tanto con ¡CAR como con aCAR, se inyectarán i.v. a ratones NOD/SCID/yc- sin tratamiento previo o similares, y hasta varias horas más tarde, se inyectarán células diana que expresan iCAR, aCAR, o ambos. En algunas realizaciones, estas dianas se marcarán con CFSE/CPDE o colorante trazador celular similar en diferentes concentraciones (alta, media y baja), que permitirán una mayor discriminación entre ellas. En algunas realizaciones, se calculará el porcentaje de muerte específica, como se describe en el Ejemplo 5.
ii. Cinética de crecimiento tumoral en modelos de ratón con xenoinjerto humano
En algunas realizaciones, las células tumorales expresan la diana de iCAR, la diana de aCAR, o ambas. En algunas realizaciones, una línea celular tumoral de aCAR podría ser la NALM 6 positiva para CD 19 (ATCC, línea celular BALL humana). En algunas realizaciones, las células tumorales que expresan tanto el aCAR como el iCAR (es decir, células 'fuera del tumor') son NALM 6 manipuladas para expresar el epítopo de iCAR (por ejemplo, HLA-A2), representando de ese modo las células sanas. En algunas realizaciones, NALM 6 y NAlM 6-HLA-A2 también pueden manipularse para expresar un gen informador (p. ej., luciferasa de luciérnaga), para una fácil detección.
En algunas realizaciones, la monitorización se realizará midiendo el volumen del tumor por medios mecánicos (calibrador), y también mediante el uso de sistemas de formación de imágenes in vivo (IVIS). En algunas realizaciones, la carga tumoral puede cuantificarse, y las poblaciones de células T infiltrantes pueden analizarse mediante FACS.
iii. Toxicidad y cinética de crecimiento tumoral en modelos de ratones transgénicos
En algunas realizaciones, también se usarán ratones transgénicos que expresan las dianas de aCAR e iCAR humanas, para determinar la eficacia de las células T transducidas. En algunas realizaciones, el sistema nos permitirá controlar los problemas de eficacia y toxicidad.
C. USOS IN VIVO: TRATAMIENTO, BIOMARCADORES
En aún otro aspecto, la presente invención proporciona un método para seleccionar un biomarcador personalizado para un sujeto que tiene un tumor caracterizado por LOH, comprendiendo el método (i) obtener una biopsia del tumor del sujeto; (ii) obtener una muestra de tejido normal del sujeto, por ejemplo PBMC; y (iii) identificar una única variante alélica de un epítopo de superficie celular polimórfico que no es expresado por las células del tumor debido a LOH, pero que es expresado por las células del tejido normal, identificando así un biomarcador personalizado para el sujeto.
En algunas realizaciones, el biomarcador se usa para personalizar un tratamiento del sujeto, por lo que el método comprende además las etapas de tratar el cáncer en un paciente que tiene un tumor caracterizado por LOH, que comprende administrar al paciente una célula inmunitaria efectora como se definió anteriormente, en el que el iCAR se dirige a la única variante alélica identificada en (iii). En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para seleccionar un biomarcador personalizado para un sujeto que tiene un tumor caracterizado por LOH, comprendiendo el método (i) obtener una biopsia del tumor del sujeto; (ii) obtener una muestra de tejido normal del sujeto, por ejemplo PBMC; (iii) identificar una única variante alélica de un epítopo de superficie celular polimórfico que no se expresa en las células del tumor debido a LOH, pero que se expresa en las células del tejido normal, en base a la puntuación de candidato a LOH, en el que una variante alélica se identifica como un biomarcador personalizado para el sujeto.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar el cáncer en un paciente que tiene un tumor caracterizado por LOH, que comprende administrar al paciente una célula inmunitaria efectora como se definió anteriormente, en el que el iCAR se dirige contra una única variante alélica que codifica un epítopo de superficie celular polimórfico ausente de las células del tumor debido a la pérdida de heterocigosidad (LOH) pero presente al menos en todas las células del tejido normal relacionado de mamífero del paciente.
En un aspecto similar, la presente invención proporciona un método para reducir la carga tumoral en un sujeto que tiene un tumor caracterizado por LOH, que comprende administrar al paciente una célula inmunitaria efectora como se definió anteriormente, en el que el iCAR se dirige contra una única variante alélica que codifica un epítopo de superficie celular polimórfico ausente de las células del tumor debido a la pérdida de heterocigosis (LOH) pero presente al menos en todas las células del tejido normal relacionado de mamífero del paciente o al menos en los tejidos vitales en los que se expresa el aCAR.
En otro aspecto similar, la presente invención proporciona un método para aumentar la supervivencia de un sujeto que tiene un tumor caracterizado por LOH, que comprende administrar al paciente una célula inmunitaria efectora como se definió anteriormente, en el que el iCAR se dirige a una única variante alélica que codifica un epítopo de superficie celular polimórfico ausente de las células del tumor debido a la pérdida de heterocigosidad (LOH) pero presente al menos en todas las células del tejido normal relacionado de mamífero del paciente.
En todavía un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una célula inmunitaria efectora segura como se definió anteriormente, para uso en el tratamiento, la reducción de la carga tumoral, o el aumento de la supervivencia de un paciente que tiene un tumor caracterizado por LOH, en el que el iCAR se dirige contra una única variante alélica que codifica un epítopo de superficie celular polimórfico ausente de las células del tumor debido a la pérdida de heterocigosidad (LOH) pero presente al menos en todas las células del tejido normal relacionado de mamífero del paciente.
En aún un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para tratar el cáncer en un paciente que tiene un tumor caracterizado por LOH, que comprende: (i) identificar o recibir información que identifique una única variante alélica de un epítopo de superficie celular polimórfico que no es expresado por células del tumor debido a LOH, pero que es expresado por las células del tejido normal, (ii) identificar o recibir información que identifique un epítopo de superficie celular no polimórfico de un antígeno o una única variante alélica de un epítopo de superficie celular polimórfico, en el que dicho epítopo es un antígeno asociado a un tumor o es compartido por células al menos de tejido tumoral y normal relacionados en dicho paciente con cáncer; (iii) seleccionar o recibir al menos una molécula de ácido nucleico que define un iCAR como se define aquí anteriormente y al menos una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un aCAR como se define aquí anteriormente, o al menos un vector como se define aquí anteriormente, en el que el iCAR comprende un dominio extracelular que se une específicamente a un epítopo de superficie celular de (i), y el aCAR comprende un dominio extracelular que se une específicamente a un epítopo de superficie celular de (ii); (iv) preparar o recibir al menos una población de células inmunitarias efectoras redirigidas seguras transfectando células inmunitarias efectoras con las moléculas de ácido nucleico de (iii) o transduciendo células inmunitarias efectoras con los vectores de (iii); y (v) administrar a dicho paciente con cáncer al menos una población de células efectoras inmunitarias redirigidas seguras de (iv).
En un aspecto similar, la presente invención proporciona al menos una población de células efectoras inmunitarias redirigidas seguras para tratar el cáncer en un paciente que tiene un tumor caracterizado por LOH, en la que las células inmunitarias redirigidas seguras se obtienen (i) identificando o recibiendo información que identifica un única variante alélica de un epítopo de superficie celular polimórfico que no es expresado por las células del tumor debido a LOH, pero que es expresado por las células del tejido normal, (ii) identificar o recibir información que identifique un epítopo de superficie celular no polimórfico de un antígeno o una única variante alélica de un epítopo de superficie celular polimórfico, en el que dicho epítopo es un antígeno asociado a un tumor o es compartido por células al menos de tejido tumoral y normal relacionados en dicho paciente con cáncer; (iii) seleccionar o recibir al menos una molécula de ácido nucleico que define un iCAR como se define aquí anteriormente y al menos una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un aCAR como se define aquí anteriormente, o al menos un vector como se define aquí anteriormente, en el que el iCAR comprende un dominio extracelular que se une específicamente a un epítopo de superficie celular de (i), y el aCAR comprende un dominio extracelular que se une específicamente a un epítopo de superficie celular de (ii); (iv) preparar o recibir al menos una población de células inmunitarias efectoras redirigidas seguras transfectando células inmunitarias efectoras con las moléculas de ácido nucleico de (iii) o transduciendo células inmunitarias efectoras con los vectores de (iii).
En algunas realizaciones que se refieren a una cualquiera de las realizaciones anteriores dirigidas al tratamiento del cáncer, o a células efectoras inmunitarias seguras para uso en el tratamiento del cáncer, (i) el dominio extracelular del iCAR se une específicamente a una única variante alélica de un epítopo de superficie celular polimórfico de un antígeno, que es un antígeno diferente al que se une el dominio extracelular del aCAR; (ii) el dominio extracelular de dicho iCAR se une específicamente a una única variante alélica de un epítopo de superficie celular polimórfico diferente del mismo antígeno al que se une el dominio extracelular de dicho aCAR; o (iii) el dominio extracelular de dicho iCAR se une específicamente a una única variante alélica diferente del mismo epítopo de superficie celular polimórfico al que se une el dominio extracelular de dicho aCAR.
En algunas realizaciones, el tratamiento da como resultado una reactividad fuera del tumor en la diana reducida, en comparación con un tratamiento que comprende administrar al paciente con cáncer al menos una población de células efectoras inmunitarias que expresan un aCAR de (iii) pero que carecen de un iCAR de (iii).
En algunas realizaciones, las células inmunitarias efectoras seguras usadas para tratar el cáncer como se define anteriormente expresan en su superficie un aCAR que comprende un dominio extracelular que se une específicamente a un antígeno asociado a un tumor o un epítopo de superficie celular no polimórfico de un antígeno, y un iCAR que comprende un dominio extracelular que se une específicamente a una única variante alélica de un epítopo de superficie celular polimórfico de un antígeno expresado al menos en un tejido de origen del tumor o de una proteína constitutiva, que es un antígeno diferente de aquel al que se une el dominio extracelular de dicho aCAR.
En algunas realizaciones, las células inmunitarias efectoras seguras usadas para tratar el cáncer como se define anteriormente expresan en su superficie un aCAR que comprende un dominio extracelular que se une específicamente a un antígeno asociado a un tumor o un epítopo de superficie celular no polimórfico de un antígeno, y un iCAR que comprende un dominio extracelular que se une específicamente a una única variante alélica de un epítopo de superficie celular polimórfico de un antígeno expresado al menos en un tejido de origen del tumor o de una proteína constitutiva, tales como los genes HLA (incluyendo, por ejemplo, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-G, HLA-E, h La -F, HLA-K, HLA-L, HLA-DM, HLA-DO, HLA-DP, HLA-DQ, o HLA-DR), que es un antígeno diferente de aquel al que se une el dominio extracelular de dicho aCAR.
En algunas realizaciones, las células inmunitarias efectoras seguras usadas para tratar el cáncer como se define anteriormente expresan en su superficie un aCAR que comprende un dominio extracelular que se une específicamente a un antígeno asociado a un tumor o un epítopo de superficie celular no polimórfico de un antígeno, y un iCAR que comprende un dominio extracelular que se une específicamente a una única variante alélica de un epítopo de superficie celular polimórfico de un antígeno expresado al menos en un tejido de origen del tumor, tal como un HLA-A, que es un antígeno diferente de aquel al que se une el dominio extracelular de dicho aCAR.
En algunas realizaciones, se administra más de una población de células efectoras inmunitarias, y las diferentes poblaciones expresan diferentes pares de los aCAR e iCAR que tienen unión específica a epítopos de superficie celular de diferentes productos génicos.
En algunas realizaciones, las células inmunitarias efectoras seguras usadas en el método para tratar el cáncer se seleccionan de células T, células asesinas naturales, o células asesinas inducidas por citocinas. En algunas realizaciones, la célula inmunitaria efectora segura es una célula efectora autóloga o universal (alogénica). En algunas realizaciones, el iCAR usado en cualquiera de los métodos para tratar el cáncer definidos anteriormente se dirige contra todos los tejidos del paciente en los que está presente el antígeno diana del aCAR, en el que el antígeno diana del aCAR es un epítopo de superficie celular no polimórfico de un antígeno, o una única variante alélica de un epítopo de superficie celular polimórfico, y dicho epítopo es un antígeno asociado a un tumor o es compartido al menos por células de tejido tumoral y normal relacionados.
En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona de leucemia mieloide aguda [LAML], carcinoma adrenocortical [ACC], carcinoma urotelial de vejiga [BLCA], glioma cerebral de bajo grado [LGG], carcinoma invasivo de mama [BRCA], carcinoma cervical de células escamosas y adenocarcinoma endocervical [CESC], colangiocarcinoma [CHOL], adenocarcinoma de colon [COAD], carcinoma de esófago [ESCA], glioblastoma multiforme [GBM], carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello [HNSC], riñón cromófobo [KICH], carcinoma renal de células claras [KIRC], carcinoma de células papilares renales de riñón [KIRP], carcinoma hepatocelular de hígado [LIHC], adenocarcinoma de pulmón [LUAD], carcinoma de células escamosas de pulmón [LUSC], linfoma difuso de células B grandes de neoplasia linfoide [DLBC], mesotelioma [MESO], cistoadenocarcinoma seroso de ovario [OV], adenocarcinoma pancreático [PAAD], feocromocitoma y paraganglioma [PCPG], adenocarcinoma de próstata [PRAD], adenocarcinoma de recto [READ], sarcoma [SARC], melanoma cutáneo de la piel [SKCM], adenocarcinoma de estómago [STAD], tumores de células germinales testiculares [TGCT], timoma [THYM], carcinoma de tiroides [THCA], carcinosarcoma uterino [UCS], carcinoma endometrial del cuerpo uterino [UCEC], melanoma uveal [UVM].
En algunas realizaciones, el iCAR y/o pCAR para uso en el tratamiento del cáncer es cualquier iCAR y/o pCAR descrito aquí. En algunas realizaciones, el iCAR y/o pCAR usado para tratar el cáncer, tal como cualquiera de los tipos de cáncer enumerados anteriormente, se dirige contra o se une específicamente a una única variante alélica de un gen HLA (incluyendo, por ejemplo, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-G, HLA-E, HLA-F, HLA-K, HLA-L, HLA-DM, HLA-DO, HLA-DP, HLA-DQ o HLA-DR, gen HLA-B o gen HLA-C, o contra una única variante alélica de un gen enumerado en la Tabla 8 En algunas realizaciones, el iCAR usado para tratar el cáncer, tal como cualquiera de los tipos de cáncer enumerados anteriormente, se dirige contra o se une específicamente a una única variante alélica de un gen HLA-A, un gen HLA-B o un gen HLA-C, o contra una única variante alélica de un gen enumerado en la Tabla 8; y el aCAR usado para tratar el cáncer, tal como cualquiera de los tipos de cáncer enumerados anteriormente, se dirige contra o se une específicamente a un epítopo de superficie celular no polimórfico seleccionado de los antígenos enumerados en la Tabla 1, tal como CD19.
Para la administración oral, la preparación farmacéutica puede estar en forma líquida, por ejemplo, disoluciones, jarabes o suspensiones, o puede presentarse como un producto farmacéutico para reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes del uso. Tales preparaciones líquidas se pueden preparar por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (p. ej., jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (p. ej., lecitina o goma arábiga); vehículos no acuosos (p. ej., aceite de almendras, ésteres aceitosos o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (p. ej., phidroxibenzoatos de metilo o de propilo, o ácido sórbico). Las composiciones farmacéuticas pueden tomar la forma de, por ejemplo, comprimidos o cápsulas, preparados por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); cargas (p. ej., lactosa, celulosa microcristalina o hidrogenofosfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); disgregantes (p. ej., almidón de patata o glicolato de almidón de sodio); o agentes humectantes (p. ej., laurilsulfato de sodio). Los comprimidos se pueden revestir mediante métodos bien conocidos en la técnica.
Las preparaciones para administración oral pueden formularse adecuadamente para dar una liberación controlada del compuesto activo.
Para la administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas, formulados de manera convencional.
Las composiciones se pueden formular para administración parenteral mediante inyección, por ejemplo por inyección en bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosificación unitaria, por ejemplo en ampollas o en envases multidosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden adoptar formas tales como suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, de estabilización y/o de dispersión. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para la reconstitución con un vehículo adecuado, por ejemplo agua libre de pirógenos estéril, antes del uso.
Las composiciones también se pueden formular en composiciones rectales, tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo que contienen bases de supositorios convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.
Para la administración por inhalación, las composiciones para uso según la presente invención se administran convenientemente en forma de una presentación de rociado en aerosol desde paquetes presurizados o un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida. Se pueden formular cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina, para uso en un inhalador o insuflador, que contengan una mezcla de polvo del compuesto y una base de polvo adecuada, tal como lactosa o almidón.
Para fines de claridad, y de ninguna manera limitando el alcance de las enseñanzas, a menos que se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades, porcentajes o proporciones, y otros valores numéricos enumerados aquí, deben interpretarse como precedidos en todos los casos por la expresión “alrededor de”. En consecuencia, los parámetros numéricos citados en la presente memoria descriptiva son aproximaciones que pueden variar dependiendo del resultado deseado. Por ejemplo, cada parámetro numérico puede interpretarse a la luz del número de dígitos significativos notificados y aplicando técnicas de redondeo ordinarias.
La expresión “alrededor de”, como se usa aquí, significa que también se incluyen valores del 10% o menos por encima o por debajo de los valores indicados.
TABLAS LARGAS
La solicitud de patente contiene una sección de tablas largas. Las copias de las tablas se envían al mismo tiempo en CD-ROM.
EJEMPLOS
Con respecto a los ejemplos, se emplea la siguiente terminología.
Cuando se emplea el término cromosoma, generalmente se refiere al cromosoma en el que se encuentra el SNP. Para el análisis de SNP, la posición se refiere a la posición genómica del SNP (ensamblaje GRCh37.p13). El snp_id, cuando se usa, se refiere al dbSNP rs ID, si existe.
El término “ref” se refiere al alelo nucleotídico de referencia. El término “alt” se refiere al alelo nucleotídico alternativo. El término “calidad” se refiere a la puntuación de calidad del Exome Aggregation Consortium (ExAC). El término “filter_status” se refiere a la información de filtrado de ExAC.
El término “allele_frequency” se refiere a la frecuencia alélica global de ExAC. El término “max_allele_frequency” se refiere a la frecuencia alélica global del alelo alternativo más común (generalmente, esto solo es relevante cuando el SNP tiene más de dos alelos alternativos en el mismo sitio, y esto a menudo puede significar errores de secuenciación de todos modos).
El término “het_allele_count” se refiere al número de participantes en ExAC que eran heterocigotos. El término “AFR_AF” se refiere a la frecuencia de alelos menores de los genomas africanos. El término “AMR_AF” se refiere a la frecuencia de alelos menores en los genomas latinos. El término “EAS_AF” se refiere a la frecuencia de alelos menores en los genomas de Asia oriental. El término “FIN_AF” se refiere a la frecuencia de alelos menores en los genomas finlandeses. El término “NFE_AF” se refiere a la frecuencia de alelos menores en genomas europeos no finlandeses. El término “OTH_AF” se refiere a la frecuencia de alelos menores en Otros genomas. El término “SAS_AF” se refiere a la frecuencia de alelos menores en los genomas del sur de Asia.
El término “max_AF” se refiere a la frecuencia de alelos menores máxima entre las poblaciones clasificadas en ExAC (0,5 es la frecuencia alélica máxima permitida).
El término “gen” se refiere al símbolo HUGO del gen en el que cae el SNP.
El término “hgncJD” se refiere al ID numérico del gen en el que se encuentra el SNP del Comité de Nomenclatura de Genes de HUGO.
El término “consequence” se refiere al impacto del SNP en el producto proteico traducido. Puede ser uno de varios, incluidos: missense_variant, frameshift variant, inframe_deletion, stop_gained.
El término “protein_consequence” informa la sustitución de aminoácidos y su ubicación en el transcrito de proteína de referencia (por ejemplo, p.Arg482Gln).
El término “aa _affected” se refiere a la ubicación numérica del aminoácido afectado en el transcrito de proteína de consenso.
El término “allele_1” se refiere al aminoácido codificado por el alelo de referencia.
El término “allele_2” se refiere al aminoácido codificado por el alelo alternativo.
El término “sift_score” se refiere a la puntuación y la interpretación del efecto funcional predicho de la sustitución de aminoácidos por el algoritmo SIFT. Usa la versión sift5.2.2. Las puntuaciones oscilan de 0-1. Una puntuación baja significa que es más probable que se tolere una sustitución de aminoácidos.
El término “polyphen_score” se refiere a la puntuación y la interpretación del efecto funcional predicho de la sustitución de aminoácidos por el algoritmo Polyphen. Usa PolyPhen (v2.2.2). Las puntuaciones oscilan de 0-1. Una puntuación baja significa que es más probable que la sustitución de un aminoácido sea perjudicial.
El término “polyphen_numeric” se refiere a la única puntuación numérica extraída del algoritmo Polyphen.
El término “protein_domains_affected” se refiere a los dominios proteicos predichos basados en los siguientes algoritmos: Gene3D, hmmpanther, Prosite.
El término “BLOSUM_score” hace referencia a la puntuación de la sustitución de aminoácidos basada en la matriz BLOSUM62 de https://www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/ToolBox/C_DOC/lxr/source/data/BLOSUM62. Una puntuación negativa indica una sustitución de aminoácidos que ha ocurrido con menos frecuencia a lo largo del tiempo en la evolución (es más probable que afecte la función de la proteína).
El término “allele_1_one_letter” se refiere al código de aminoácidos de una letra del alelo de aminoácidos de referencia. El término “allele_2_one_letter” se refiere al código de aminoácidos de una letra del alelo de aminoácidos alternativo. El término “mono_allelic_expression” se refiere a si el gen en el que cae el SNP experimenta o no una expresión monoalélica en humanos. Para esta anotación, se usó la base de datos establecida por Savova et al.7 Un 1 en esta columna indica que el gen muestra una expresión monoalélica. Un 0 en esta columna indica que el gen no mostró expresión monoalélica en la base de datos de Savova et al. Una NA en esta columna significa que el gen no se anotó en el documento de Savova et al.
El término “extracellular” se refiere a si el SNP cae o no en un dominio extracelular de la proteína afectada. Un 1 en esta columna indica que el SNP está en un dominio extracelular, y un 0 indica que no lo está. Para la anotación de dominios de proteínas, se usó Uniprot.
El término “Pdb_id” se refiere a la ID del banco de datos de proteínas de la proteína afectada, si existe. En el caso de que existan muchas entradas en el banco de datos de proteínas para una proteína, sólo se incluye la primera ID. El término “aa_context_21aa_allele_1” se refiere a una ventana de 21 aminoácidos que rodea al aminoácido del SNP en la secuencia de proteína de consenso. La secuencia consiste en los 10 aminoácidos de la parte anterior de la secuencia de la proteína de consenso. Se hizo una comprobación para asegurar que el aminoácido de referencia coincidiera con la secuencia de la proteína de consenso en la posición afectada. Si estos dos aminoácidos no fueran los mismos, entonces la entrada dice “discrepancia con uniprot fasta basada en la isoforma de consenso”.
El término “aa_context_21aa_allele_2: La misma ventana de aminoácidos que la anterior, pero insertando el alelo 2 del aminoácido en el medio.
El término “gtexmean: Expresión génica promedio en los tejidos (en RPKM). Consiste en el valor medio de los valores medianos de RPKM en los tejidos de GTEX. Por ejemplo, si los valores de un gen determinado fueran Pulmón (mediana) = 3, Mama (mediana) = 2, Páncreas (mediana) = 5, entonces el valor dado a conocer en esta entrada sería 3,33.
El término “gtex_min: La expresión génica más baja para un tejido en todos los tejidos. Este valor deriva de la lista de valores medianos de la expresión génica en todos los tejidos. Por ejemplo, si los valores de un gen determinado fueran Pulmón (mediana) = 3, Mama (mediana) = 2, Páncreas (mediana) = 5, entonces el valor dado a conocer en esta entrada sería 2.
El término “gtex_max: La expresión génica más alta para un tejido en todos los tejidos. Este valor deriva de la lista de valores medianos de la expresión génica en todos los tejidos. Por ejemplo, si los valores de un gen determinado fueran Pulmón (mediana) = 3, Mama (mediana) = 2, Páncreas (mediana) = 5, entonces el valor dado a conocer en esta entrada sería 5.
El término “gtex_std_dev: La desviación estándar de los valores de expresión génica en los tejidos para un gen dado. Por ejemplo, si los valores de un gen determinado fueran Pulmón (mediana) = 3, Mama (mediana) = 2, Páncreas (mediana) = 5, entonces el valor dado a conocer en esta entrada sería 1,5.
El término “cell_surface_protein_atlas: Un marcador binario para determinar si la proteína se anotó o no como una proteína de membrana en el atlas de proteínas de la superficie celular (wlab.ethz.ch/cspa/). Un 1 indica que el gen se anotó como una proteína de membrana en esta base de datos.
El término “human_protein_atlas_membrane_proteins: Un marcador binario para determinar si la proteína se anotó o no como una proteína de membrana en el atlas de proteínas humanas (https://www.proteinatlas.org/). Un 1 indica que el gen se anotó como una proteína de membrana en esta base de datos.
El término “subcell_map_proteome_membrane_proteins: Un marcador binario para determinar si la proteína se anotó o no como una proteína de membrana en el mapa subcelular del proteoma (http://science.sciencemag.org/content/early/2017/05/10/science.aal3321/). Un 1 indica que el gen se anotó como una proteína de membrana en esta base de datos.
El término “n_membrane_databases_w_gene: El número total de bases de datos con el gen anotado como un gen que se expresa en la membrana celular. Máximo = 3, mínimo = 0.
El término “membrane_protein_call” : Una interpretación textual del número de bases de datos de membrana que incluyeron el gen. Si el gen se incluyó en una base de datos, entonces la llamada es una proteína de membrana de “confianza baja”. Si el gen se incluyó en dos bases de datos, entonces la llamada es una proteína de membrana de “confianza media”. Si el gen se incluyó en tres bases de datos, entonces la llamada es una proteína de membrana de “confianza alta”.
El término “ratio_gtex_std_dev_to_mean” : La proporción de la desviación estándar de la expresión génica en los tejidos sobre la expresión génica media en los tejidos. Por ejemplo, si los valores para un gen determinado fueran Pulmón (mediana) = 3, Mama (mediana) = 2, Páncreas (mediana) = 5, entonces el valor dado a conocer en esta entrada sería 1,5/3,33 = 0,45. Esto pretende ser una medida de la uniformidad de expresión entre tejidos. Un valor bajo indica que el gen se expresa de manera uniforme. Un valor alto sugiere que el gen tiende a expresarse en algunos tejidos y no en otros.
El término “universally_expressed: Un marcador binario de si un gen parece expresarse universalmente. Se dice que un gen se expresa universalmente si gtex_mean es > 10, gtex_min. El término “> 1, y ratio_gtex_std_dev_to_mean < 1. Un 1 en esta columna indica que el gen en cuestión cumplía estos criterios.
El término “enfermedad”: el código de barras TCGA para la enfermedad analizada para los datos de LOH en esta fila de la hoja de cálculo.
El término “mean_expression_in-tissue”: La expresión génica media en el tejido analizado. Varias categorizaciones de tejido pueden cartografiarse en un solo tipo de tumor TCGA. El cartografiado de tejidos en GTEX a tipos de tumor TCGA se proporciona en el archivo “tcga_disease_tissue_lookup.txt”. A continuación se da muestra representativa:
Figure imgf000053_0001
El término “mean_expression in_other_tissues”: La expresión génica media en todos los demás tejidos excepto en el tejido analizado. Por ejemplo, si el gen que se analiza es PSMA (un gen específico de la próstata), este valor sería muy bajo cuando el tipo de tumor analizado fuera PRAD (adenocarcinoma de próstata).
El término “cohens_d: La medida d de Cohen de la separación de la expresión en el tejido analizado frente a todos los demás tejidos. Esto pretende ser una medida de cuánto este gen se expresa de forma única en el tejido analizado. Una d alta de Cohen sugeriría que este gen se expresa de manera única en el tejido analizado, y por lo tanto podría ser una buena diana de aCAR.
El término “proportion_w_LOH_relative: La proporción de tumores en el tipo de tumor analizado que muestra signos de LOH. El umbral para llamar a un segmento genómico que sugiere LOH fue -0,1 (en unidades de número relativo de copias). El número relativo de copias de un segmento fue el logaritmo de la señal del número de copias en el tumor dividida entre la señal del número de copias en el normal emparejado. Estos datos se obtuvieron del portal cbio, y la técnica se validó en la parte 1.
El término “CI_95_low_relative: El límite inferior del intervalo de confianza del 95% en la proporción de tumores que sufren LOH en este locus. Para este cálculo, se usó la función prop.test en R. Esta función calcula un intervalo de confianza binomial con la corrección de continuidad de Yates.
El término “CI_95_high_relative: El límite superior del intervalo de confianza del 95% en la proporción de tumores que sufren LOH en este locus. Para este cálculo, se usó la función prop.test en R. Esta función calcula un intervalo de confianza binomial con la corrección de continuidad de Yates.
El término “mutsig_hits_on_chr: Los genes en el mismo cromosoma que el SNP que pasan significancia estadística (valor de q < 0,25) por ser impulsores del cáncer. Se usó el algoritmo Mutsig 2.0. El formato es “Símbolo del gen, q=valor de q; Símbolo genético 2, ...”
El término “tsg_on_chr_mutated_in_disease: Una variable indicadora binaria de si uno de los genes que pasan estadísticamente significancia de mutsig es un gen supresor de tumores. La lista de genes supresores de tumores usada para esta anotación fue la lista de la tabla publicada por Vogelstein et al.9. Un 1 en esta columna indica que el gen está anotado como un gen supresor de tumores.
El término “hallmark_tsg_on_chr_mutated_in_disease”: Una variable indicadora binaria de si alguno de los genes identificados como significativamente mutados en el tipo de tumor analizado y en el mismo cromosoma que el SNP son genes supresores de tumores “distintivos”. Los genes supresores de tumores “distintivos” son una pequeña lista de genes supresores de tumores muy bien validados que tienen más probabilidades de mutar en las primeras etapas del desarrollo del tumor. Estos genes fueron: TP53, PTEN, APC, MLL3, MLL2, VHL, CDKN2A, y RB1. Un 1 en esta columna indica que uno de estos TSG característicos existen en el mismo cromosoma que el SNP en cuestión, y están significativamente mutados en el tipo de tumor analizado.
El término “gistic_deletion_n_peaks” : El número de picos GISTIC en el cromosoma en el que cae el SNP. Un número más alto sugiere (vagamente) que hay más fuerzas selectivas que impulsan la pérdida de material genético en este cromosoma.
El término “gistic_deletion_best_q_value” : El valor de q más bajo en GISTIC para la pérdida genómica en el cromosoma en el que cae el SNP. Un valor de q muy bajo sugiere que existe una presión selectiva significativa para perder material genómico en algún lugar del cromosoma.
El término “proportion_of_patients_eligible”: La proporción estimada de pacientes que tendrían i) heterocigosidad de la línea germinal del SNP y ii) LOH del SNP en el tumor. La estimación de la proporción de pacientes con heterocigosidad de la línea germinal del SNP asume el equilibrio de Hardy-Weinberg, que usa la ecuación proporción de heterocigotos = 2pq. En la que p es la fracción alélica global del SNP, y q = 1-p.
El término “proportion_of_patients_eligible_max_ethnicity _targeted: La proporción estimada de pacientes que tendrían i) heterocigosidad de la línea germinal del SNP y ii) LOH del SNP en el tumor. La estimación de la proporción de pacientes con heterocigosidad de la línea germinal del SNP asume el equilibrio de Hardy-Weinberg, que usa la ecuación proporción de heterocigotos = 2pq. En la que p es la fracción alélica máxima restringida por población del SNP, y q = 1 -p. Por ejemplo, en algunos casos la población usada puede ser africana, y en algunos casos puede ser del sur de Asia.
El término “cumulative_score: Una puntuación que cuantifica el grado en que un SNP es un buen candidato para una diana de iCAR. Las puntuaciones varían de 0 a 1 teórico. Para obtener más información sobre el cálculo de esta puntuación, véase la sección titulada “Puntuación acumulativa para clasificar los SNP candidatos”.
EJEMPLO 1. EVALUACIÓN DE LA TASA DE LOH DE LOS GENES HLA A TRAVÉS DE LOS CÁNCERES
Introducción:
Se propone una estrategia terapéutica para abordar las vulnerabilidades contraídas por la pérdida genómica en las células cancerosas. La estrategia propuesta usa una combinación de células T con CAR activadores (aCAR) y células T con CAR inhibidores (iCAR) para dirigirse de manera más segura a los tumores que han perdido segmentos genómicos que codifican proteínas de membrana celular heterocigotas para los alelos maternos y paternos, es decir, con cambios en la codificación de proteínas polimórficas).
Los iCAR pueden disminuir la toxicidad fuera del tumor de la terapia de CAR-T sin disminuir la eficacia antitumoral si la diana del iCAR se expresa sólo en tejidos no tumorales. Uno de esos escenarios en los que las dianas de iCAR se expresan sólo en células no tumorales ocurre cuando el antígeno de iCAR es codificado por una parte del genoma que se ha eliminado en las células tumorales. Una familia de genes que es altamente polimórfica y que se sabe que se expresa en todas las células es HLA.
Las proteínas HLA se expresan casi universalmente en células de mamíferos para permitir la presentación de antígenos no propios a las células del sistema inmunitario. Los genes HLA también tienden a expresarse cuantitativamente en gran medida, lo que los hace más susceptibles a la dianización terapéutica. La expresión de ARN de los genes HLA es superior al 99,3 por ciento de otros genes que codifican proteínas en el genoma (Figura 4). La expresión tisular media de los genes HLA y sus ubicaciones genómicas se incluyen en la Tabla 3, así como en la tabla amplia que se proporciona en el CD-ROM.
La meta de esta sección es identificar los tipos de cáncer en los que el gen HLA sufre deleciones frecuentes. Los análisis secundarios incluyen intentos de identificar los impulsores de la pérdida genómica en el locus de HLA.
Ejecutamos un plan detallado para identificar cánceres con presiones selectivas que provocaron la pérdida frecuente de copias de genes HLA (Figura 5).
Frecuencia de pérdida de HLA en los tipos de tumores usando datos ABSOLUTE:
Usamos perfiles de números de copias del TCGA, que habían sido procesados por el algoritmo ABSOLUTE, para evaluar las estimaciones reales de la tasa de pérdida alélica de HLA-A. Los datos de números de copias segmentados de ABSOLUTE disponibles públicamente se descargaron de (https://www.svnapse.org/#!Synapse:syn1710464.2)1. El algoritmo ABSOLUTE genera el nivel de números de copias de cada segmento alélico dentro de un solo genoma de cáncer. En el caso de pérdida de una sola copia del cromosoma 6 (que alberga el locus de HLA), los números de copias alélicas serían: 1 para el segmento retenido y 0 para el segmento que se perdió. En el caso de una pérdida de heterocigosidad neutra para las copias, entonces el segmento retenido tendría el número de copias 2 y el segmento perdido tendría el número de copias 0. Los datos del número de copias disponibles públicamente procesados por ABSOLUTE estaban disponibles para 12 tipos de tumores (Tabla 4). El carcinoma de células escamosas de pulmón (LUSC) tuvo la mayor frecuencia de LOH de HLA-A en comparación con los otros tipos de tumores (Figura 6). Los cánceres de útero/endometrio (UCEC) tuvieron la frecuencia más baja de LOH de HLA-A de todos los tumores evaluables (las muestras de AML no se incluyeron debido a que no se disponía de datos ABSOLUTE). De 588 deleciones del gen HLA-A, ninguna tuvo un punto de ruptura intragénico (Figura 7). La mayoría de las deleciones de los genes HLA-A abarcaban grandes porciones del cromosoma (Figura 8). Si bien los datos del número de copias ABSOLUTE no estaban disponibles para las muestras de AML, la inspección manual de los datos del número de copias relativo en estas muestras no reveló deleciones (Figura 11).
Validación de los datos del número de copias relativo en comparación con los datos del número de copias ABSOLUTE:
Intentamos obtener la frecuencia de LOH de tantos tipos de tumores como estuvieran disponibles públicamente. Sin embargo, estos datos no habían sido procesados por ABSOLUTE, y los datos sin procesar para procesar por ABSOLUTE no están disponibles públicamente. En su lugar, usamos datos relativos del número de copias en 32 tipos de tumores de TCGA (Figura 13). Estos datos se descargaron de cbioportal (cbioportal.org/data_sets.jsp). Los datos relativos del número de copias se obtuvieron de matrices Affymetrix SNP 6.0 de muestras de tumores.
Para determinar si se podían obtener estimaciones precisas de LOH a partir de los datos relativos del número de copias, calculamos la tasa de LOH con datos relativos para los tumores que ya tenían datos de LOH de ABSOLUTE. Estos datos consistían en un archivo de número de copias segmentado. A cada segmento se le asigna una relación de copias relativa. La relación de copias se define como el logaritmo de la relación de densidad de señal en el tumor en comparación con la normal emparejada (en matrices Affymetrix). La normalización con un control emparejado (generalmente de sangre periférica) ayuda a eliminar cualesquiera variantes del número de copias de la línea germinal para que no se interprete erróneamente como somática. Se afirma que un segmento ha sufrido una pérdida genómica si el número relativo de copias de ese segmento genómico está por debajo de un umbral determinado. Por ejemplo, si el número relativo de copias del segmento 321 es -0,4 y el umbral para la pérdida de copias es -0,3, entonces se afirma que el segmento 321 ha sufrido una pérdida de copias, y dado que carecemos de información alélica directa, se afirma también que ha sufrido LOH.
Primero intentamos determinar el límite óptimo del número de copias para etiquetar segmentos de números de copias relativos como si hubieran sufrido LOH. La concordancia de las estimaciones del número de copias ABSOLUTE y relativo de LOH fue la más alta con un límite de -0,1 para el número de copias relativo (Tabla 5 y Figura 9). Este umbral también es el umbral usado por el grupo de números de copias de TCGA para definir la pérdida de copias en el portal Tumorscape de TCGA (http://portals.broadinstitute.org/tcga/home). La correlación entre la fracción de individuos con LOH de HLA-A en los datos relativos frente a los datos de ABSOLUTE fue 0,55. Esta correlación razonablemente alta nos permitió avanzar con el análisis de todos los tipos de tumores con datos relativos del número de copias disponibles.
Fracción de pacientes con HLA-LOH en 32 tipos de tumores usando datos relativos del número de copias
La porción de pacientes que tenían LOH de HLA-A se calculó para los 32 tumores disponibles de TCGA (Figura 10A; COAD y READ se analizaron juntos). El tumor con mayor índice de LOH de HLA-A fue el cáncer cromófobo de riñón. El tumor con menor tasa de LOH de HLA-A fue el melanoma uveal (Tabla 6). Para asegurarnos de que la tasa de LOH que habíamos derivado en estos análisis fuera robusta a una pequeña perturbación de la posición genómica, analizamos la tasa de LOH de los genes en dirección 5’ y en dirección 3’ de HLA-A para ver si su tasa de LOH de HLA-A era similar a HLA-A. Como se esperaba, la tasa de LOH de los genes en dirección 5’ y en dirección 3’, HLA-G y ZNRD1, respectivamente, fue exactamente la misma que para HLA-A. (Figura 3 A-C). Estos datos demuestran que las llamadas de LOH de HLA-A son resistentes a pequeñas desviaciones en la posición genómica. A continuación, buscamos determinar si los otros genes HLA (A, B, C) tenían tasas similares de LOH en comparación con HLA-A. Todos estos genes se encuentran dentro de una región de 1,3 Mb en el cromosoma 6p. En distancia genómica, esta es una región pequeña. Repetimos el análisis HLA-A en HLA-B y HLA-C. El patrón de LOH fue casi idéntico entre los tres genes HLA en los 32 tumores analizados (Figura 10A-C).
Adición de la presión de selección a las tasas de LOH de HLA-A
La heterogeneidad genómica intratumoral es una característica recientemente apreciada de casi todos los cánceres humanos analizados hasta la fecha2- 3. Las terapias dirigidas a alteraciones genéticas sólo presentes en una fracción de las células tumorales pueden afectar sólo a las células tumorales que portan dichas alteraciones. Una estrategia de iCAR que se dirija a antígenos que no están presentes en las células tumorales puede proteger algunas células tumorales del ataque de aCAR si el antígeno no se elimina clonalmente. Por lo tanto, buscamos identificar tumores en los que los genes HLA probablemente sufran LOH clonal. Es probable que la LOH, que se pronto en la evolución, sea impulsada por fuerzas selectivas en el inicio y/o mantenimiento del tumor. Por lo tanto, buscamos supresores de tumores en el cromosoma 6 (que alberga el locus de HLA) de tres maneras. Primero, buscamos genes que estuvieran significativamente mutados en el cromosoma 6 en cada uno de los tipos de tumores evaluados4. La hoja de cálculo da a conocer los genes con una mutación significativa en el cromosoma 6 en la columna “chr6_mutsig_sig_genes”.
En segundo lugar, buscamos regiones de genes significativamente eliminados, lo que significa supresores de tumores probablemente eliminados. Usamos los resultados de la ejecución de GISTIC2.0 en estos datos. La hoja de cálculo da a conocer el número de picos de deleción GISTIC en el cromosoma 6 (q<0,25) y el valor de q más bajo de estos picos de deleción. En general, cuantos más picos de deleción GISTIC y menor sea el valor de q, más fuerte será la presión de selección. Sin embargo, también es posible tener el escenario en el que predomina un pico GISTIC muy fuerte y el número de picos sería pequeño, pero la importancia del controlador es segura. En general, el valor de q más bajo debería ser el correlato más fuerte de la presencia del controlador del supresor de tumores en un cromosoma dado.
En tercer lugar, solapamos el conjunto de genes que estaban significativamente mutados en cada tumor con una lista de genes supresores de tumores conocidos, para determinar si alguno de los genes mutados probablemente provocaría la pérdida del cromosoma 65. Pudimos identificar dos tipos de tumores con posibles controladores mutacionales. En el carcinoma adrenocortical, el gen DAXX estaba significativamente mutado (q=0,0571), y en el linfoma difuso de células B grandes, el gen TNFAIP3 estaba significativamente mutado (q=0,00278). DAXX codifica una histona chaperona, cuyas mutaciones están asociadas con telómeros más largos en el carcinoma adrenocortical6. TNFAIP3 codifica un regulador negativo de la señalización de NF-kappaB. Se ha demostrado que las mutaciones de este gen que ocurren en DLBCL aumentan la señalización de NF-kappaB7.
Tabla 3. Loci genómicos analizados para LOH. Las coordenadas genómicas están en el ensamblaje del genoma humano hg 19.
Gen Proteína Cromosoma Posición de partida Posición final Expresión de ARN (RPKM) HLA-A HLA-A 6 29941260 29945884 226,6
HLA-B HLA-B 6 31353872 31357188 422,4
HLA-C HLA-C 6 31268749 31272130 193,4
Tabla 4. Tipos de tumores con datos ABSOLUTE
Nombre de la enfermedad Abreviatura de Número de Número de muestras
TCGA muestras terminadas ABSOLUTE Carcinoma urotelial de vejiga BLCA 138 90
Carcinoma invasivo de mama BRCA 880 750
Adenocarcinoma de colon COAD 422 349
Glioblastoma multiforme GBM 580 485
Carcinoma de células escamosas de HNSC 310 270
cabeza y cuello
Carcinoma renal de células claras del KIRC 497 373
riñón
Leucemia mieloide aguda LAML 200 0
Adenocarcinoma de pulmón LUAD 357 292
Carcinoma de células escamosas de LUSC 344 261
pulmón
Cistoadenocarcinoma seroso de ovario OV 567 457
Adenocarcinoma de recto READ 164 147
Carcinoma de endometrio del cuerpo UCEC 498 378
uterino
Tabla 5. Correlación (Pearson) de la tasa de LOH por datos relativos de número de copias frente a datos de número de copias ABSOLUTE. Picos de correlación para un valor umbral de -0,1.
Umbral de deleción Correlación (r2)
0 0,01
-0,05 0,49
-0,1 0,55
-0,15 0,53
-0,2 0,46
-0,25 0,44
-0,3 0,21
-0,35 0,10
-0,4 0,07
-0,45 0,09
-0,5 0,08
Tabla 6. Números y tasas de LOH para los 32 cánceres en el conjunto de datos TCGA.
Abreviatura de TCGA Muestras totales (n) Número con LOH (n) Fracción con LOH
KICH 66 57 0,863636364
ACC 90 46 0,511111111
PAAD 184 51 0,277173913
KIRP 288 73 0,253472222
LUSC 501 124 0,24750499
SARC 257 63 0,245136187
ESCA 184 45 0,244565217
KIRC 528 98 0,185606061
BLCA 408 73 0,178921569
OV 579 96 0,165803109 Abreviatura de TCGA Muestras totales (n) Número con LOH (n) Fracción con LOH
THYM 123 20 0,162601626
HNSC 522 81 0,155172414
CESC 295 45 0,152542373
STAD 441 66 0,149659864
BRCA 1080 159 0,147222222
DLBC 48 7 0,145833333
LUAD 516 65 0,125968992
COADREAD 616 77 0,125
GBM 577 72 0,124783362
TGCT 150 18 0,12
CHOL 36 4 0,111111111
MESO 87 9 0,103448276
UCS 56 5 0,089285714
UCEC 539 31 0,057513915
LGG 513 24 0,046783626
PRAD 492 19 0,038617886
SKCM 104 4 0,038461538
LIHC 370 14 0,037837838
PCPG 162 3 0,018518519
THCA 499 9 0,018036072
UVM 80 0 0
LAML 0 0 NA
Con base en lo anterior, concluimos que la LOH de la región HLA es un evento común en muchos tumores, sin embargo, y el porcentaje de LOH varía entre tipos de tumores. Por lo tanto, los genes HLA son buenos candidatos para las dianas de iCAR.
Referencias para el Ejemplo 1:
1. Zack TI, Schumacher SE, Carter SL, Cherniack AD, Saksena G, Tabak B, Lawrence MS, Zhsng CZ, Wala J, Mermel CH, Sougnez C, Gabriel SB, Hernandez B, Shen H, Laird PW, Getz G, Meyerson M, Beroukhim R. Pan-cancer patterns of somatic copy number alteration. Nature genetics. 2013 ;45:1134-1140
2. Gibson WJ, Hoivik EA, Halle MK, Taylor-Weiner A, Cherniack AD, Berg A, Holst F, Zack TI, Werner HM, Staby KM, Rosenberg M, Stefansson IM, Kusonmano K, Chevalier A, Mauland KK, Trovik J, Krakstad C, Giannakis M, Hodis E, Woie K, Bjorge L, Vintermyr OK, Wala JA, Lawrence MS, Getz G, Carter SL, Beroukhim R, Salvesen HB. The genomic landscape and evolution of endometrial carcinoma progression and abdominopelvic metastasis. Nature genetics. 2016;48:848-855
3. Gerlinger M, Rowan AJ, Horswell S, Math M, Larkin J, Endesfelder D, Gronroos E, Martinez P, Matthews N, Stewart A, Tarpey P, Varela I, Phillimore B, Begum S, McDonald NQ, Butler A, Jones D, Raine K, Latimer C, Santos c R, Nohadani M, Eklund AC, Spencer-Dene B, Clark G, Pickering L, Stamp G, Gore M, Szallasi Z, Downward J, Futreal PA, Swanton C. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. The New England journal of medicine. 2012;366:883-892
4. Lawrence MS, Stojanov P, Mermel CH, Robinson JT, Garraway LA, Golub TR, Meyerson M, Gabriel SB, Lander ES, Getz G. Discovery and saturation analysis of cancer genes across 21 tumour types. Nature.
2014;505:495-501
5. Vogelstein B, Papadopoulos N, Velculescu VE, Zhou S, Diaz LA, Jr., Kinzler KW. Cancer genome landscapes.
Science. 2013;339:1546-1558
6. Zheng S, Cherniack AD, Dewal N, Moffitt RA, Danilova L, Murray BA, Lerario AM, Else T, Knijnenburg TA, Ciriello G, Kim S, Assie G, Morozova O, Akbani R, Shih J, Hoadley KA, Choueiri Tk , Waldmann J, Mete O, Robertson AG, Wu HT, Raphael BJ, Shao L, Meyerson M, Demeure Mj , Beuschlein F, Gill AJ, Sidhu SB, Almeida MQ, Fragoso M, Cope LM, Kebebew E, Habra MA, Whitsett TG, Bussey KJ, Rainey WE, Asa SL, Bertherat J, Fassnacht M, Wheeler DA, Cancer Genome Atlas Research N, Hammer GD, Giordano TJ, Verhaak RGW. Comprehensive pan-genomic characterization of adrenocortical carcinoma. Cancer cell.
2016;29:723-736
7. Compagno M, Lim WK, Grunn A, Nandula SV, Brahmachary M, Shen Q, Bertoni F, Ponzoni M, Scandurra M, Califano A, Bhagat G, Chadburn A, Dalla-Favera R, Pasqualucci L. Mutations of multiple genes cause deregulation of nf-kappab in diffuse large b-cell lymphoma. Nature. 2009;459:717-721
EJEMPLO 2 IDENTIFICACIÓN EN TODO EL GENOMA DE ALELOS DE LA LÍNEA GERMINAL QUE CODIFICAN PROTEÍNAS DE SUPERFICIE CELULAR EXPRESADAS QUE SUFREN PÉRDIDA DE HETEROCIGOSIDAD
Introducción:
Las células CAR-T inhibidoras pueden disminuir la toxicidad fuera del tumor de la terapia de CAR-T sin disminuir la eficacia antitumoral si la diana de iCAR se expresa sólo en tejidos no tumorales. Uno de esos escenarios en los que las dianas de iCAR se expresarán sólo en células no tumorales es aquel en el que el antígeno de iCAR es codificado por una parte del genoma que se ha eliminado en las células tumorales. La meta de esta sección del flujo de trabajo es identificar dichos alelos.
Identificación de alelos:
Utilizamos la base de datos del Exome Aggregation Consortium (ExAC) como entrada para el análisis (exac.broadinstitute.org). La base de datos ExAC es una compilación de exomas de diversos estudios de secuenciación a nivel de población con un total de 60.706 exomas1. ExAC contiene información sobre cada variante, incluyendo el número de recuentos del alelo de referencia en comparación con el alelo alternativo (frecuencia alélica). La información de frecuencia alélica se extiende a subpoblaciones dentro de la base de datos como se detalla en la Tabla 7.
Tabla 7. Subpoblaciones dentro de la base de datos ExAC. Nota: No todas las posiciones en el genoma tienen suficiente cobertura en el exoma como para que todos los individuos de esta tabla estén representados. Fuente: http://exac.broadinstitute.org/faq.
Figure imgf000059_0001
Se aplicaron los siguientes filtros a las variantes de la base de datos ExAC: i) la variante debe afectar la composición de aminoácidos de la proteína codificada ii) la variante debe tener una frecuencia de alelos menores superior a 0,05 (5%) en al menos una de los poblaciones en la Tabla 6. El análisis corrigió los escenarios en los que el alelo menor tenía una fracción de alelo mayor que 0,5 (50%). Si se observaron más de tres alelos en un sitio, se usó la sustitución más prevalente (estos sitios son a menudo sitios de error de secuencia, y deben interpretarse con precaución).
Se consideró que un SNP tenía un impacto en la composición de la proteína si alguno de los SNP producía cualesquiera de las siguientes clases de variantes: 'missense_variant', 'inframe_deletion', 'start_lost','stop_gained', 'inframe insertion', 'stop_retained_variant', 'frameshift_variant', 'stop_lost', 'coding_sequence_variant', 'protein_altering_variant'. El análisis comenzó con 9.362.319 variantes, y 29.904 variantes pasaron estos dos filtros. Estas variantes cayeron en 10.302 genes. Todos los alelos que coincidían con estos dos filtros se incluyeron en el análisis.
Identificación de genes expresados:
Usamos la base de datos v6p (dbGaP Accession phs000424.v6.p1) de Genotype-Tissue Expression (GTEX) para la identificación de genes que se expresan en diversos tipos de tejido (https://gtexportal.org/home/)2. La base de datos GTEX consiste en la secuenciación de ARN de 8.555 muestras humanas de diversos tipos de tejido sano. Se obtuvieron varias anotaciones de esta base de datos. Primero, determinamos la expresión promedio de cada gen en todos los tejidos. La expresión media de cada gen se calculó tomando los datos de expresión mediana por tejido y calculando la media de estos valores en todos los tejidos. Estos datos se obtuvieron del archivo GTEx_Analysis_v6p_RNA-seq_RNA-SeQCv1.1.8_gene_median_rpkm.gct disponible en https://gtexportal.org/home/datasets.
También se incluyó la expresión media de cada gen correspondiente a cada tipo de tumor. Para obtener estos datos, creamos una cartografía de los tipos de tumores en los tejidos normales correspondientes. Por ejemplo, los datos TCGA de cáncer de páncreas se anotarían con tejido de páncreas de GTEX. En algunos casos, el cartografiado fue más aproximado. Por ejemplo, los datos de expresión de glioblastomas se cartografiaron a partir de todos los tejidos anotados como cerebro en GTEX. Se adjunta una tabla con estos cartografiados (titulada tcga_disease_tissue_lookup.txt) Se calcularon varias medidas para evaluar la homogeneidad o sobreexpresión de cada gen en cada tejido/tipo de tumor. Para cada tipo de tumor, se calculó una puntuación D de Cohen para establecer una posible sobreexpresión del gen. Es probable que los genes sobreexpresados en tejidos particulares sean buenas dianas de aCAR. Por el contrario, medimos la desviación estándar de la expresión génica en los tejidos, y la comparamos con la expresión media en todos los tejidos. Cuando esta proporción era baja, el gen se expresa uniformemente en todos los tejidos. Es probable que los genes con una expresión uniforme en todos los tejidos sean mejores dianas de iCAR.
Un gen se denominó “expresado universalmente” si cumplía los siguientes criterios: (i) la expresión media en los tejidos fue mayor que 10 RPKM. (ii) Los tejidos con la menor expresión tenían un RPKM mayor que 1. (iii) La relación de la desviación estándar en la mediana de RPKM entre tejidos en comparación con la media de RPKM era menor que 1. Sólo se anotaron 1.092 genes como expresados universalmente.
Los candidatos se seleccionaron únicamente en base a la anotación UniProt. Para las proteínas transmembrana, suele haber una predicción clara para los segmentos de la proteína que son extracelulares.
La Tabla 8 presenta una lista de 1167 buenos genes candidatos identificados por el método anterior que tienen epítopos polimórficos extracelulares clasificados según la ubicación cromosómica.
Anotación de alelos
Impacto del alelo en la función de la proteína:
Para que un iCAR reconozca efectivamente sólo células cancerosas que han perdido un alelo de una proteína de membrana, la estructura de la proteína debe ser lo suficientemente diferente según el alelo codificado. Se tomaron varias medidas para cuantificar el efecto de cada SNP en la proteína resultante. En primer lugar, la clase de variante de SNP dada a conocer (por ejemplo, pérdida de sentido, sin sentido) se dio a conocer en la columna 'consequence'. El efecto sobre la traducción de la proteína de consenso se incluyó en la columna 'protein_consequence' (por ejemplo, p.Arg482Gln). El algoritmo SIFT intenta predecir si una variante de proteína tendrá un efecto en la estructura de la proteína, y por lo tanto en la función6. La puntuación puede oscilar de 0 (perjudicial) a 1 (benigno). Se incluyeron puntuaciones SIFT (versión sift5.2.2) para cada SNP para el que había una puntuación disponible. Las puntuaciones no están disponibles para las mutaciones de cambio de marco, por ejemplo. También se usó PolyPhen (v2.2.2) para hacer predicciones sobre la posibilidad de que una variante pueda afectar la estructura y función de la proteína. El algoritmo Polyphen da a conocer puntuaciones de manera opuesta a SIFT, correspondiendo una puntuación de 0 a benigno, y correspondiendo una puntuación de 1 a perjudicial.
Una medida clásica de la probabilidad de inducir un cambio estructural por sustitución de aminoácidos es usar la matriz de sustitución BLOSUM62. Descargamos la matriz BLOSUM62 de https://www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/ToolBox/C_DOC/lxr/source/data/BLOSUM62. Cada SNP se anotó con la puntuación BLOSUM62 correspondiente a su sustitución.
Clasificación del alelo que cae en la porción extracelular de la proteína:
Para que un iCAR reconozca un alelo, el alelo debe caer en la porción extracelular de la proteína. Para cada SNP, extrajimos la posición del aminoácido afectado en la traducción de consenso, y la comparamos con los dominios anotados como extracelulares de la base de datos Uniprot. La base de datos Uniprot se descargó de www.uniprot.org/downloads. Son posibles muchos falsos negativos debido a la falta de caracterización de los dominios de todas las proteínas. Un total de 3288 SNP en 1167 genes se anotaron como extracelulares (Tabla 8).
Anotaciones del contexto peptídico de SNP:
El contexto peptídico de los alelos analizados probablemente importará cuando se intente generar anticuerpos que reconozcan estas secuencias. Incluimos como referencia los 10 aminoácidos que preceden y flanquean el aminoácido codificado por el SNP (secuencia de 21 aminoácidos en total). Se usó la base de datos uniprot para la secuencia de aminoácidos de consenso. Anotamos cualquier conflicto en el que la secuencia de la base de datos uniprot no coincida con el aminoácido codificado por cualquiera de los SNP en la posición predicha, para no incluir secuencias falsas.
Estas secuencias de 21 aminoácidos podrían ser útiles como entrada para programas de predicción de epítopos de células B, tal como Bepipred.
Anotaciones específicas del cáncer:
Proporción de tumores que sufren LOH
Encontrar pacientes cuyos tumores podrían beneficiarse de la terapia propuesta requeriría que una diana de iCAR fuese un SNP que experimenta pérdida de heterocigosidad (LOH) en una gran fracción de tumores. Los archivos de números de copias de segmentos se descargaron del portal de genómica del cáncer de cbio http://www.cbioportal.org/ 8. Como ejemplo, en la Figura 12 se muestra la proporción de tumores de melanoma uveal sometidos a LOH para todos los SNP.
Alteraciones potenciales del conductor en los cromosomas que albergan SNP candidatos
Un posible mecanismo de resistencia a la terapia dirigida genómicamente es si una de las alteraciones genómicas previstas sólo está presente en una fracción de las células cancerosas. Un mecanismo para intentar identificar las dianas que probablemente estén presentes en las etapas más tempranas del desarrollo del tumor es identificar los eventos impulsores para cada tumor. El mecanismo más frecuente de inactivación del gen supresor de tumores es la mutación y posterior LOH del cromosoma no mutado. Intentamos encontrar genes impulsores, particularmente genes supresores de tumores (TSG) que probablemente sufran este proceso en cada tipo de tumor. Usamos los resultados de la ejecución de MUTSIG 2.0 en todos los tumores en este análisis para identificar genes significativamente mutados en cada tipo de tumor. Anotamos si uno de los genes que mutaron significativamente se incluyó o no en una lista de genes supresores de tumores “distintivos” que incluyen TP53, PTEN, APC, MLL3, MLL2, VHL, CDKN2A, RB1. Finalmente, la lista de genes impulsores, TSG, y TSG “distintivos” se anotaron en un SNP si caían en el mismo cromosoma que el SNP.
Si bien las mutaciones en los genes impulsores que posteriormente experimentan LOH es un mecanismo que puede marcar eventos que probablemente ocurran temprano en la evolución del tumor, la deleción focal de segmentos genómicos que contienen un gen supresor de tumores es otro. Usamos el algoritmo GISTIC para identificar regiones de ADN que sufren deleción genómica a una tasa superior a la media. El algoritmo GISTIC identifica “picos” de significancia estadística a lo largo de los brazos cromosómicos que sugieren una presión selectiva negativa en estas regiones. Para cada SNP, registramos el número de picos de deleción en el cromosoma en el que cayó el SNP. También registramos el valor de q más bajo de cualquiera de estos picos. Un valor de q más bajo sugiere una presión selectiva más fuerte.
Puntuación acumulativa para clasificar los SNP candidatos:
En un esfuerzo por proporcionar una “puntuación” continua para los SNP candidatos, combinamos varias métricas diferentes que deberían asociarse con mejores SNP candidatos. La puntuación consiste en el producto del rango percentil de cada uno de los siguientes:
1. proporción de tumores con LOH en ese SNP (cuanto más alto, mejor) 2. prevalencia del alelo (cuanto más alto, mejor) 3. relación de la desviación estándar de los valores de expresión entre tejidos a la mediana (cuanto más bajo, mejor, más consistente) 4. si hay o no un gen supresor de tumores en el cromosoma (es mejor tener uno que no tener uno)
Para ilustrar, calcularemos la puntuación de un SNP teórico. Si solo el 32% de los SNP tuvieran un gen supresor de tumores en el cromosoma, entonces el rango percentil para tener uno sería 0,68. Si el alelo tuviera una fracción de alelo menor de 0,49 (en la que 0,5 es la más alta posible), entonces el rango percentil sería 0,99. Si la tasa de LOH fuera 0,10, y el 75% de los SNP tuvieran más LOH que eso, entonces el rango percentil sería 0,25. Si la relación entre la desviación estándar de los valores de expresión en los tejidos y la mediana del gen que alberga este SNP fue 1,3, y eso es mejor que 90% de otros genes, entonces el rango percentil es 0,9. La puntuación total para este SNP sería entonces 0,68*0,99*0,25*0,9=0,15.
Cualquier SNP con una puntuación mayor que 0,4 se consideró “top-hit”.
Tabla 8. Dianas de iCAR ejemplares
Cro. n° Gen
1 ABCA4
1 ADAM30
1 ASTN1
1 C1orf101
Gen
CACNA1S
CATSPER4
CD101
CD164L2
CD1A
CD1C
CD244
CD34
CELSR2
CHRNB2
CLCA2
CLSTN1
CR1
CR2
CRB1
CSF3R
CSMD2
ECE1
ELTD1
EMC1
EPHA10
EPHA2
ERMAP
FCAMR
FCER1A
FCGR1B
FCGR2A
FCGR2B
FCGR3A
FCRL1
FCRL3
FCRL4
FCRL5
FCRL6
GJB4
GPA33
GPR157
GPR37L1
GPR88
HCRTR1
IGSF3
IGSF9
IL22RA1
Figure imgf000062_0001
ITGA10
KIAA1324 Gen
KIAA2013
LDLRAD2
LEPR
LRIG2
LRP8
LRRC52
LRRC8B
LRRN2
LY9
MR1
MUC1
MXRA8
NCSTN
NFASC
NOTCH2
NPR1
NTRK1
OPN3
OR10J1
OR10J4
OR10K1
OR10R2
OR10T2
OR10X1
OR11L1
OR14A16
OR1411
OR14K1
OR2AK2
OR2C3
OR2G2
OR2G3
OR2L2
OR2M7
OR2T1
OR2T12
OR2T27
OR2T29
OR2T3
OR2T33
OR2T34
OR2T35
OR2T4
Figure imgf000063_0001
OR2T5
OR2T6 Gen
OR2T7
OR2T8
OR2W3
OR6F1
OR6K2
OR6K3
OR6K6
OR6N1
OR6P1
OR6Y1
PEAR1
PIGR
PLXNA2
PTCH2
PTCHD2
PTGFRN
PTPRC
PTPRF
PVRL4
RXFP4
S1PR1
SCNN1D
SDC3
SELE
SELL
SELP
SEMA4A
SEMA6C
SLAMF7
SLAMF9
SLC2A7
SLC5A9
TACSTD2
TAS1R2
TIE1
TLR5
TMEM81
TNFRSF14
TNFRSF1B
TRABD2B
USH2A
VCAM1
ZP4
Figure imgf000064_0001
ABCG5
ALK Gen
ASPRV1
ATRAID
CD207
CHRNG
CLEC4F
CNTNAP5
CRIM1
CXCR1
DNER
DPP10
EDAR
EPCAM
GPR113
GPR148
GPR35
GPR39
IL1RL1
ITGA4
ITGA6
ITGAV
LCT
LHCGR
LRP1B
LRP2
LY75
MARCO
MERTK
NRP2
OR6B2
PLA2R1
PLB1
PROKR1
PROM2
SCN7A
SDC1
TGOLN2
THSD7B
TMEFF2
TMEM178A
TPO
TRABD2A
ACKR2
ALCAM
Figure imgf000065_0001
ANO10
ATP13A4 Gen
CACNA1D
CACNA2D2
CACNA2D3
CASR
CCRL2
CD200
CD200R1
CD86
CD96
CDCP1
CDHR4
CELSR3
CHL1
CLDN11
CLDN18
CLSTN2
CSPG5
CX3CR1
CXCR6
DCBLD2
DRD3
EPHB3
GABRR3
GP5
GPR128
GPR15
GPR27
GRM2
GRM7
HEG1
HTR3C
HTR3D
HTR3E
IGSF11
IL17RC
IL17RD
IL17RE
IL5RA
IMPG2
ITGA9
ITGB5
KCNMB3
LRIG1
Figure imgf000066_0001
LRRC15
LRRN1 Gen
MST1R
NAALADL2
NRROS
OR5AC1
OR5H1
OR5H14
OR5H15
OR5H6
OR5K2
OR5K3
OR5K4
PLXNB1
PLXND1
PRRT3
PTPRG
ROBO2
RYK
SEMA5B
SIDT1
SLC22A14
SLC33A1
SLC4A7
SLITRK3
STAB1
SUSD5
TFRC
TLR9
TMEM44
TMPRSS7
TNFSF10
UPK1B
VIPR1
ZPLD1
ANTXR2
BTC
CNGA1
CORIN
EGF
EMCN
ENPEP
EPHA5
ERVMER34-1
EVC2
Figure imgf000067_0001
FAT1
FAT4 Gen
FGFRL1
FRAS1
GPR125
GRID2
GYPA
GYPB
KDR
KIAA0922
KLB
MFSD8
PARM1
PDGFRA
RNF150
TENM3
TLR1
TLR10
TLR6
TMEM156
TMPRSS11A
TMPRSS11B
TMPRSS11 E
TMPRSS11 F
UNC5C
ADAM19
ADRB2
BTNL3
BTNL8
BTNL9
C5orf15
CATSPER3
CD180
CDH12
CDHR2
COL23A1
CSF1R
F2RL2
FAM174A
FAT2
FGFR4
FLT4
GABRA6
GABRG2
GPR151
Figure imgf000068_0001
GPR98
GRM6 Gen
HAVCR1
HAVCR2
IL31RA
IL6ST
IL7R
ITGA1
ITGA2
KCNMB1
LIFR
LNPEP
MEGF10
NIPAL4
OR2V1
OR2Y1
OSMR
PCDH1
PCDH12
PCDHA1
PCDHA2
PCDHA4
PCDHA8
PCDHA9
PCDHB10
PCDHB11
PCDHB13
PCDHB14
PCDHB15
PCDHB16
PCDHB2
PCDHB3
PCDHB4
PCDHB5
PCDHB6
PCDHGA1
PCDHGA4
PDGFRB
PRLR
SEMA5A
SEMA6A
SGCD
SLC1A3
SLC22A4
SLC22A5
Figure imgf000069_0001
SLC36A3
SLC6A18 Gen
SLC6A19
SLCO6A1
SV2C
TENM2
TIMD4
UGT3A1
BAI3
BTN1A1
BTN2A1
BTN2A2
BTN3A2
BTNL2
CD83
DCBLD1
DLL1
DPCR1
ENPP1
ENPP3
ENPP4
EPHA7
GABBR1
GABRR1
GCNT6
GFRAL
GJB7
GLP1R
GPR110
GPR111
GPR116
GPR126
GPR63
GPRC6A
HFE
HLA-A
HLA-B
HLA-C
HLA-DPA1
HLA-DPB1
HLA-DQA1
HLA-DQA2
HLA-DQB1
HLA-DQB2
HLA-DRB1
Figure imgf000070_0001
HLA-DRB5
HLA-E Gen
HLA-F
HLA-G
IL20RA
ITPR3
KIAA0319
LMBRD1
LRFN2
LRP11
MAS1L
MEP1A
MICA
MICB
MUC21
MUC22
NCR2
NOTCH4
OPRM1
OR10C1
OR12D2
OR12D3
OR14J1
OR2B2
OR2B6
OR2J1
OR2W1
OR5V1
PKHD1
PTCRA
RAET1E
RAET1G
ROS1
SDIM1
SLC22A1
SLC44A4
TAAR2
TREM1
TREML1
TREML2
AQP1
CD36
CDHR3
CNTNAP2
DPP6
Figure imgf000071_0001
EGFR
EPHA1 Gen
EPHB6
ERVW-1
GHRHR
GJC3
GPNMB
GRM8
HYAL4
KIAA1324L
LRRN3
MET
MUC12
MUC17
NPC1L1
NPSR1
OR2A12
OR2A14
OR2A2
OR2A25
OR2A42
OR2A7
OR2AE1
OR2F2
OR6V1
PILRA
PKD1L1
PLXNA4
PODXL
PTPRN2
PTPRZ1
RAMP3
SLC29A4
SMO
TAS2R16
TAS2R4
TAS2R40
TFR2
THSD7A
TMEM213
TTYH3
ZAN
ZP3
ADAM18
ADAM28
Figure imgf000072_0001
ADAM32
ADAM7 Gen
ADAM9
CDH17
CHRNA2
CSMD1
CSMD3
DCSTAMP
FZD6
GPR124
NRG1
OR4F21
PKHD1L1
PRSS55
SCARA3
SCARA5
SDC2
SLC10A5
SLC39A14
SLC39A4
SLCO5A1
TNFRSF10A
TNFRSF10B
ABCA1
AQP7
C9orf135
CA9
CD72
CNTNAP3
CNTNAP3B
ENTPD8
GPR144
GRIN3A
IZUMO3
KIAA1161
MAMDC4
MEGF9
MUSK
NOTCH1
OR13C2
OR13C3
OR13C5
OR13C8
OR13C9
OR13D1
Figure imgf000073_0001
OR13F1
OR1B1 Cro. n2 Gen
9 OR1J2
9 OR1K1
9 OR1L1
9 OR1L3
9 OR1L6
9 OR1L8
9 OR1N1
9 OR1N2
9 OR1Q1
9 OR2S2
9 PCSK5
9 PLGRKT
9 PTPRD
9 ROR2
9 SEMA4D
9 SLC31A1
9 TEK
9 TLR4
9 TMEM2
9 VLDLR
10 ABCC2
10 ADAM8
10 ADRB1
10 ANTXRL
10 ATRNL1
10 C10orf54
10 CDH23
10 CDHR1
10 CNNM2
10 COL13A1
10 COL17A1
10 ENTPD1
10 FGFR2
10 FZD8
10 GPR158
10 GRID1
10 IL15RA
10 IL2RA
10 ITGA8
10 ITGB1
10 MRC1
10 NPFFR1
10 NRP1
10 OPN4
10 PCDH15 Cro. n2 Gen
10 PKD2L1
10 PLXDC2
10 PRLHR
10 RGR
10 SLC29A3
10 SLC39A12
10 TACR2
10 TCTN3
10 TSPAN15
10 UNC5B
10 VSTM4
11 AMICA1
11 ANO3
11 APLP2
11 C11orf24
11 CCKBR
11 CD248
11 CD44
11 CD5
11 CD6
11 CDON
11 CLMP
11 CRTAM
11 DCHS1
11 DSCAML1
11 FAT3
11 FOLH1
11 GDPD4
11 GDPD5
11 GRIK4
11 HEPHL1
11 HTR3B
11 IFITM10
11 IL10RA
11 KIRREL3
11 LGR4
11 LRP4
11 LRP5
11 LRRC32
11 MCAM
11 MFRP
11 MPEG1
11 MRGPRE
11 MRGPRF
11 MRGPRG Cro. n2 Gen
11 MRGPRX2
11 MRGPRX3
11 MRGPRX4
11 MS4A4A
11 MTNR1B
11 MUC15
11 NAALAD2
11 NAALADL1
11 NCAM1
11 NRXN2
11 OR10A2
11 OR10A5
11 OR10A6
11 OR10D3
11 OR10G4
11 OR10G7
11 OR10G8
11 OR10G9
11 0R10Q1
11 OR10S1
11 OR1S1
11 OR2AG1
11 OR2AG2
11 OR2D2
11 OR4A15
11 OR4A47
11 OR4A5
11 OR4A8P
11 OR4C11
11 OR4C13
11 OR4C15
11 OR4C16
11 OR4C3
11 OR4C46
11 OR4C5
11 OR4D6
11 OR4D9
11 OR4S2
11 OR4X1
11 OR51E1
11 OR51L1
11 OR52A1
11 OR52E1
11 OR52E2
11 OR52E4 Cro. n2 Gen
11 OR52E6
11 OR52I1
11 OR52I2
11 OR52J3
11 OR52L1
11 OR52N1
11 OR52N2
11 OR52N4
11 OR52W1
11 OR56B1
11 OR56B4
11 OR5A1
11 OR5A2
11 OR5AK2
11 OR5AR1
11 OR5B17
11 OR5B3
11 OR5D14
11 OR5D16
11 OR5D18
11 OR5F1
11 OR5I1
11 OR5L2
11 OR5M11
11 OR5M3
11 OR5P2
11 OR5R1
11 OR5T2
11 OR5T3
11 OR5W2
11 OR6A2
11 OR6T1
11 OR6X1
11 OR8A1
11 OR8B12
11 OR8B2
11 OR8B3
11 OR8B4
11 OR8D1
11 OR8D2
11 OR8H1
11 OR8H2
11 OR8H3
11 OR8I2
11 OR8J1 Cro. n2 Gen
11 OR8J2
11 OR8J3
11 OR8K1
11 OR8K3
11 OR8K5
11 OR8U1
11 OR9G1
11 OR9G4
11 OR9Q2
11 P2RX3
11 PTPRJ
11 ROBO3
11 SIGIRR
11 SLC22A10
11 SLC3A2
11 SLC5A12
11 SLCO2B1
11 SORL1
11 ST14
11 SYT8
11 TENM4
11 TMEM123
11 TMPRSS4
11 TMPRSS5
11 TRPM5
11 TSPAN18
11 ZP1
12 ANO4
12 AVPR1A
12 CACNA2D4
12 CD163
12 CD163L1
12 CD27
12 CD4
12 CLEC12A
12 CLEC2A
12 CLEC4C
12 CLEC7A
12 CLECL1
12 CLSTN3
12 GPR133
12 GPRC5D
12 ITGA7
12 ITGB7
12 KLRB1 Cro. n2 Gen
12 KLRC2
12 KLRC3
12 KLRC4
12 KLRF1
12 KLRF2
12 LRP1
12 LRP6
12 MANSC1
12 MANSC4
12 OLR1
12 OR10AD1
12 OR10P1
12 OR2AP1
12 OR6C1
12 OR6C2
12 OR6C3
12 OR6C4
12 OR6C6
12 OR6C74
12 OR6C76
12 OR8S1
12 OR9K2
12 ORAI1
12 P2RX4
12 P2RX7
12 PTPRB
12 PTPRQ
12 SCNN1A
12 SELPLG
12 SLC38A4
12 SLC5A8
12 SLC6A15
12 SLC8B1
12 SLCO1B1
12 SLCO1B7
12 SSPN
12 STAB2
12 TAS2R10
12 TAS2R13
12 TAS2R20
12 TAS2R30
12 TAS2R31
12 TAS2R42
12 TAS2R43
12 TAS2R46 Cro. n2 Gen
12 TAS2R7
12 TMEM119
12 TMEM132B
12 TMEM132C
12 TMEM132D
12 TMPRSS12
12 TNFRSF1A
12 TSPAN8
12 VSIG10
13 ATP4B
13 ATP7B
13 FLT3
13 FREM2
13 KL
13 PCDH8
13 SGCG
13 SHISA2
13 SLC15A1
13 SLITRK6
13 TNFRSF19
14 ADAM21
14 BDKRB2
14 C14orf37
14 CLEC14A
14 DLK1
14 FLRT2
14 GPR135
14 GPR137C
14 JAG2
14 LTB4R2
14 MMP14
14 OR11G2
14 OR11H12
14 OR11H6
14 OR4K1
14 OR4K15
14 OR4K5
14 OR4L1
14 OR4N2
14 OR4N5
14 OR4Q2
14 SLC24A4
14 SYNDIG1L
15 ANPEP
15 CD276 Cro. n2 Gen
15 CHRNA7
15 CHRNB4
15 CSPG4
15 DUOX1
15 DUOX2
15 FAM174B
15 GLDN
15 IGDCC4
15 ITGA11
15 LCTL
15 LTK
15 LYSMD4
15 MEGF11
15 NRG4
15 OCA2
15 OR4F4
15 OR4M2
15 OR4N4
15 PRTG
15 RHCG
15 SCAMP5
15 SEMA4B
15 SEMA6D
15 SLC24A1
15 SLC28A1
15 TRPM1
15 TYRO3
16 ATP2C2
16 CACNA1H
16 CD19
16 CDH11
16 CDH16
16 CDH3
16 CDH5
16 CNGB1
16 CNTNAP4
16 GDPD3
16 GPR56
16 GPR97
16 IL4R
16 ITFG3
16 ITGAL
16 ITGAM
16 ITGAX
16 KCNG4 Cro. n2 Gen
16 MMP15
16 MSLNL
16 NOMO1
16 NOMO3
16 OR2C1
16 PKD1
16 PKD1L2
16 SCNN1B
16 SEZ6L2
16 SLC22A31
16 SLC5A11
16 SLC7A6
16 SPN
16 TMC5
16 TMC7
16 TMEM204
16 TMEM219
16 TMEM8A
17 ABCC3
17 ACE
17 AOC3
17 ASGR2
17 C17orf80
17 CD300A
17 CD300C
17 CD300E
17 CD300LG
17 CHRNB1
17 CLEC10A
17 CNTNAP1
17 CPD
17 CXCL16
17 FAM171A2
17 GCGR
17 GLP2R
17 GP1BA
17 GPR142
17 GUCY2D
17 ITGA2B
17 ITGA3
17 ITGAE
17 ITGB3
17 KCNJ12
17 LRRC37A
17 LRRC37A2 Cro. n2 Gen
17 LRRC37A3
17 LRRC37B
17 MRC2
17 NGFR
17 OR1A2
17 OR1D2
17 OR1G1
17 OR3A1
17 OR3A2
17 OR4D1
17 OR4D2
17 RNF43
17 SCN4A
17 SDK2
17 SECTM1
17 SEZ6
17 SLC26A11
17 SPACA3
17 TMEM102
17 TMEM132E
17 TNFSF12
17 TRPV3
17 TTYH2
17 TUSC5
18 APCDD1
18 CDH19
18 CDH20
18 CDH7
18 COLEC12
18 DCC
18 DSC1
18 DSG1
18 DSG3
18 DYNAP
18 MEP1B
18 PTPRM
18 SIGLEC15
18 TNFRSF11A
19 ABCA7
19 ACPT
19 BCAM
19 C19orf38
19 C19orf59
19 C5AR1
19 CATSPERD Cro. n2 Gen
19 CATSPERG
19 CD320
19 CD33
19 CD97
19 CEACAM1
19 CEACAM19
19 CEACAM21
19 CEACAM3
19 CEACAM4
19 CLEC4M
19 DLL3
19 EMR1
19 EMR2
19 EMR3
19 ERVV-1
19 ERVV-2
19 FAM187B
19 FCAR
19 FFAR3
19 FPR1
19 GFY
19 GP6
19 GPR42
19 GRIN3B
19 ICAM3
19 IGFLR1
19 IL12RB1
19 IL27RA
19 KIR2DL1
19 KIR2DL3
19 KIR2DL4
19 KIR3DL1
19 KIR3DL2
19 KIR3DL3
19 KIRREL2
19 KISS1R
19 LAIR1
19 LDLR
19 LILRA1
19 LILRA2
19 LILRA4
19 LILRA6
19 LILRB1
19 LILRB2
19 LILRB3 Cro. n2 Gen
19 LILRB4
19 LILRB5
19 LINGO3
19 LPHN1
19 LRP3
19 MADCAM1
19 MAG
19 MEGF8
19 MUC16
19 NCR1
19 NOTCH3
19 NPHS1
19 OR10H1
19 OR10H2
19 OR10H3
19 OR10H4
19 OR1I1
19 OR2Z1
19 OR7A10
19 OR7C1
19 OR7D4
19 OR7E24
19 OR7G1
19 OR7G2
19 OR7G3
19 PLVAP
19 PTGIR
19 PTPRH
19 PTPRS
19 PVR
19 SCN1B
19 SHISA7
19 SIGLEC10
19 SIGLEC11
19 SIGLEC12
19 SIGLEC5
19 SIGLEC6
19 SIGLEC8
19 SIGLEC9
19 SLC44A2
19 SLC5A5
19 SLC7A9
19 TARM1
19 TGFBR3L
19 TMC4 Cro. n2 Gen
19 TMEM91
19 TMPRSS9
19 TNFSF14
19 TNFSF9
19 TRPM4
19 VN1R2
19 VSIG10L
19 VSTM2B
20 ABHD12
20 ADAM33
20 ADRA1D
20 APMAP
20 ATRN
20 CD40
20 CD93
20 CDH22
20 CDH26
20 CDH4
20 FLRT3
20 GCNT7
20 GGT7
20 JAG1
20 LRRN4
20 NPBWR2
20 OCSTAMP
20 PTPRA
20 PTPRT
20 SEL1L2
20 SIGLEC1
20 SIRPA
20 SIRPB1
20 SIRPG
20 SLC24A3
20 SLC2A10
20 SSTR4
20 THBD
21 CLDN8
21 DSCAM
21 ICOSLG
21 IFNAR1
21 IFNGR2
21 IGSF5
21 ITGB2
21 KCNJ15
21 NCAM2 Cro. n2 Gen
21 TMPRSS15
21 TMPRSS2
21 TMPRSS3
21 TRPM2
21 UMODL1
22 CACNA11
22 CELSR1
22 COMT
22 CSF2RB
22 GGT1
22 GGT5
22 IL2RB
22 KREMEN1
22 MCHR1
22 OR11H1
22 P2RX6
22 PKDREJ
22 PLXNB2
22 SCARF2
22 SEZ6L
22 SSTR3
22 SUSD2
22 TMPRSS6
22 TNFRSF13C
X ATP6AP2
X ATP7A
X EDA2R
X FMR1NB
X GLRA4
X GPR112
X GUCY2F
X HEPH X P2RY10
X P2RY4
X PLXNA3
X PLXNB3
X VSIG4
X XG
Referencias para el Ejemplo 2:
I. Lek M, Karczewski KJ, Minikel EV, Samocha KE, Banks E, Fennell T, O'Donnell-Luria AH, Ware JS, Hill AJ, Cummings BB, Tukiainen T, Birnbaum DP, Kosmicki JA, Duncan LE, Estrada K, Zhao F, Zou J, Pierce-Hoffman E, Berghout J, Cooper DN, Deflaux N, DePristo M, Do R, Flannick J, Fromer M, Gauthier L, Goldstein J, Gupta N, Howrigan D, Kiezun A, Kurki MI, Moonshine AL, Natarajan P, Orozco L, Peloso GM, Poplin R, Rivas MA, Ruano-Rubio V, Rose SA, Ruderfer DM, Shakir K, Stenson PD, Stevens C, Thomas BP, Tiao G, Tusie-Luna MT, Weisburd B, Won h H, Yu D, Altshuler DM, Ardissino D, Boehnke M, Danesh J, Donnelly S, Elosua R, Florez JC, Gabriel SB, Getz G, Glatt SJ, Hultman CM, Kathiresan S, Laakso M, McCarroll S, McCarthy MI, McGovern D, McPherson R, Neale BM, Palotie A, Purcell SM, Saleheen D, Scharf JM, Sklar P, Sullivan PF, Tuomilehto J, Tsuang MT, Watkins HC, Wilson JG, Daly MJ, MacArthur DG, Exome Aggregation C. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 2016;536:285-291
2. Consortium GT. Human genomics. The genotype-tissue expression (gtex) pilot analysis: Multitissue gene regulation in humans. Science. 2015;348:648-660
3.
6. Ng PC, Henikoff S. Sift: Predicting amino acid changes that affect protein function. Nucleic acids research.
2003;31:3812-3814
7.
8. Cerami E, Gao J, Dogrusoz U, Gross BE, Sumer SO, Aksoy BA, Jacobsen A, Byrne CJ, Heuer ML, Larsson E, Antipin Y, Reva B, Goldberg AP, Sander C, Schultz N. The cbio cancer genomics portal: An open platform for exploring multidimensional cancer genomics data. Cancer discovery. 2012;2:401-404
EJEMPLO 3 ANÁLISIS DE SECUENCIACIÓN DE ADN PARA VERIFICACIÓN DE LOH DE HLA EN MUESTRAS DE KICH
Preparación y secuenciación de bibliotecas
Objetivo- Sobre la base del análisis in-silico, se escogió el cáncer KICH como el primer tipo de tumor para la verificación húmeda de la predicción de LOH de HLA. El objetivo era identificar el genotipo de HLA para cada paciente basado en ADN derivado de tejido normal, y después analizar el alotipo de HLA en el tejido canceroso en un intento de identificar la pérdida de uno de los alelos de HLA.
Para eso, se determinó el alotipo de HLA para el ADN derivado de 6 muestras de KICH emparejadas congeladas (normales y cancerosas) RC-001-RC003, TNEABA11, TNEABNWE, 2rDFRAUB, 2RDFRNQG, IOWT5AVJ, IOWT5N74. Además, también se analizaron dos muestras emparejadas de ADN OG-001-OG-002 (normal y cancerosa). Se preparó una biblioteca de ADN, y se realizó un análisis de secuencia para identificar el tipo de HLA de la muestra. El ADN se extrajo de 6 muestras de KICH emparejadas congeladas (normales y tumorales), y se preparó una biblioteca como se describe a continuación.
Las bibliotecas de secuenciación de HLA TruSight se prepararon con TruSight® HLA v2 Sequencing Panel (Illumina, San Diego, California, U.S.A.) en Genotypic Technology Pvt. Ltd., Bangalore, India.
En resumen, los amplicones de HLA se generaron usando los cebadores proporcionados en el kit de secuenciación TruSight HLA. Los amplicones se confirmaron en gel de agarosa, seguido de la limpieza de los amplicones usando perlas de purificación de muestras proporcionada en el kit. Los amplicones se normalizaron y se fragmentaron mediante la reacción de tagmentación. Después de la tagmentación, diferentes amplicones de cada muestra individual se agruparon, y se procedió a la PCR de enriquecimiento. El código de barras de las muestras se realizó durante la PCR de enriquecimiento utilizando Nextera XT Index Kit v2 (Illumina). El producto final de la PCR se purificó usando perlas de purificación de muestras, seguido de una verificación de control de calidad de las bibliotecas. Las bibliotecas se cuantificaron con un fluorómetro Qubit (Thermo Fisher Scientific, MA, U.S.A.), y su distribución de tamaños de fragmentos se analizó en Agilent Bioanalyzer.
Secuencias del adaptador de Illumina:
5' - AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC [i5] TCGTCGGCAGCGTC
5' - CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [i7] GTCTCGTGGGCTCGG
[i5, i7] - Secuencia de índice dual única para identificar datos de secuenciación específicos de la muestra La siguiente tabla muestra el genotipo de HLA de las muestras anteriores.
Como se ve a continuación, podemos inferir el alelo perdido a partir del análisis; por ejemplo, el paciente n.° RC001 presenta pérdida del alelo HLA-A3 0 en las muestras tumorales, y se vuelve hemicigótico a HLA-32; el paciente #RC003 perdió HLA-1 en la muestra del tumor, y se vuelve hemicigótico a HLA-30. El alelo perdido identificado determinará el iCAR relevante para cada paciente. Los casos en los que las muestras de tumor se contaminaron con células normales podrían mostrar una clara pérdida del alelo de HLA en este método.
Tabla 9: Genotipo de HLA de las muestras de KICH emparejadas
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Figure imgf000090_0001
Secuenciación del exoma
Además de la secuenciación de HLA, también realizamos la secuenciación del exoma para confirmar la LOH de HLA e identificar eventos de LOH adicionales en todo el genoma.
La calidad de las lecturas sin procesar finales emparejadas de Illumina (150X2, HiSeq) se verificó mediante FastQC. Las lecturas sin procesar de Illumina se procesaron con el software Trim Galore para el recorte del adaptador y el recorte de base de baja calidad usando parámetros de longitud de lectura mínima de 50 pb y calidad de base mínima de 30. Las lecturas procesadas se alinearon con el genoma humano de referencia (hg 19) usando Bowtie2. Después, los archivos .bam alineados para cada una de las muestras se procesaron para obtener los archivos .bam eliminados del duplicado de PCR final, y se verificó la calidad de la alineación usando Qualimap.
Las variantes se identificaron usando SAMtools y BCFtools. En este caso, se realiza un genotipado conjunto para identificar variantes en cada par de muestras (cada par normal y tumoral). Por lo tanto, para cada par se genera un .vcf fusionado. Las posibles variantes se identifican a partir de cada uno de estos archivos .vcf fusionados usando un umbral de profundidad de lectura >20 y una calidad de asignación >30. De cada par de los archivos .vcf combinados filtrados, se generaron archivos .vcf, muestra a muestra. Las variantes filtradas se anotaron adicionalmente para los genes, el cambio de proteínas y el impacto de las variaciones usando Variant Studio.
La siguiente tabla describe el grado de pérdida de cromosomas para las muestras anteriores. RC001, RC002 y RC003 exhiben una gran pérdida de cromosomas, incluyendo el cromosoma 6, que codifica los genes HLA; por lo tanto, para estas muestras, HLA se puede usar como diana de iCAR, además de muchas otras dianas codificadas en los cromosomas 1, 2, 3, 4 (para RC002), 5, 6, 8 (para RC003), 9 (RC001, RC002), 10 (RC001, RC003), 11 (RC003), 13 (RC001, RC003), 14 (RC002), 17 (RC001, RC003), 19 (RC001), 21 (RC001, RC003), 22(RC001, RC002).
Tabla 10 Pérdida de cromosomas
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Para RC001, la Fig. 14 representa la pérdida de una región cromosómica adyacente a la proteína supresora de tumores TP53, codificada en el cromosoma 17. Los genes codificados en el cromosoma 17 que se identificaron como dianas de iCAR pueden usarse para tratar al paciente RC001.
Abreviaturas: ADP, difosfato de adenosina; ALL, leucemia linfoblástica aguda; AML, leucemia mielógena aguda; APRIL, un ligando inductor de proliferación; BAFF, factor de activación de células B de la familia de TNF; BCMA, antígeno de maduración de células B; BCR, receptor de células B; BM, médula ósea; CAIX, anhidrasa carbónica IX; CAR, receptor de antígeno quimérico; CEA, antígeno carcinoembrionario; LLC, leucemia linfocítica crónica; CNS, sistema nervioso central; CSPG4, proteoglicano 4 de sulfato de condroitina; DC, célula dendrítica; ECM, matriz extracelular; EGFR, receptor del factor de crecimiento epidérmico; EGFRvIII, variante III del EGFR; EphA2, carcinoma hepatocelular A2 productor de eritropoyetina; FAP, proteína de activación de fibroblastos; FR-a, receptor alfa de folato; GBM, glioblastoma multiforme; GPI, glicofosfatidilinositol; H&N, cabeza y cuello; HL, linfoma de Hodgkin; Ig, inmunoglobulina; L1 -CAM, molécula de adhesión celular L1; MM, mieloma múltiple; NB, neuroblastoma; NF-KB, factor nuclear-KB; NHL, linfoma no Hodgkin; NK, asesina natural; NKG2D-L, ligando de NKG2D; PBMC, célula mononuclear de sangre periférica; PC, célula plasmática; PLL, leucemia prolinfocítica; PSCA, antígeno de células madre prostáticas; PSMA, antígeno prostático específico de membrana; RCC, carcinomas de células renales; ROR1, receptor huérfano 1 de tipo tirosina cinasa receptora; TCL, leucemia/linfoma de células T ; Th2, T auxiliar 2; TNBC, cáncer de mama triple negativo; TNFR, receptor del factor de necrosis tumoral; VEGFR-2, factor 2 de crecimiento endotelial vascular.
Referencias:
Abecasis, G.R., Altshuler, D., Auton, A., Brooks, L.D., Durbin, R.M., Gibbs, R.A., Hurles, M.E., y McVean, G.A. (2010). A map of human genome variation from population-scale sequencing. Nature 467, 1061-1073.
Abeyweera, T.P., Merino, E., y Huse, M. (2011). Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells. J. Cell Biol. 192, 675-690.
Auton, A., Abecasis, G.R., Altshuler, D.M., Durbin, R.M., Bentley, D.R., Chakravarti, A., Clark, A.G., Donnelly, P., Eichler, E.E., Flicek, P., et al. (2015). A global reference for human genetic variation. Nature 526, 68-74.
Barbas, Carlos F., Dennis R. Burton, Jamie K. Scott, G. J. S. 2004. Phage display: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Bausch-Fluck, D., Hofmann, A., Bock, T., Frei, A.P., Cerciello, F., Jacobs, A., Moest, H., Omasits, U., Gundry, R.L., Yoon, C., et al. (2015). A mass spectrometric-derived cell surface protein atlas. PLoS One 10.
Bayle, J.H., Grimley, J.S., Stankunas, K., Gestwicki, J.E., Wandless, T.J., y Crabtree, G.R. (2006). Rapamycin analogs with differential binding specificity permit orthogonal control of protein activity. Chem. Biol. 13, 99-107.
Bergbold, N., y Lemberg, M.K. (2013). Emerging role of rhomboid family proteins in mammalian biology and disease. Biochim. Biophys. Acta 1828, 2840-2848.
Blankenstein, T., Leisegang, M., Uckert, W., y Schreiber, H. (2015). Targeting cancer-specific mutations by T cell receptor gene therapy. Curr. Opin. Immunol. 33, 112-119. Boczkowski, D., S. K. Nair, J. H. Nam, H. K. Lyerly, y E. Gilboa. 2000. Induction of tumor immunity and cytotoxic T lymphocyte responses using dendritic cells transfected with messenger RNA amplified from tumor cells. Cancer Res 60: 1028-34.
Barrett, M.T., Sanchez, C.A., Prevo, Burrell, R.A., McGranahan, N., Bartek, J., y Swanton, C. (2013). The causes and consequences of genetic heterogeneity in cancer evolution. Nature 501,338-345.
Van Buuren, M.M., Calis, J.J.A., y Schumacher, T.N.M. (2014). High sensitivity of cancer exome-based CD8 T cell neoantigen identification. Oncoimmunology 3.
Caescu, C.I., Jeschke, G.R., y Turk, B.E. (2009). Active-site determinants of substrate recognition by the metalloproteinases TACE and ADAM10. Biochem. J. 424, 79-88. Carney, W.P., Petit, D., Hamer, P., Der, C.J., Finkel, T., Cooper, G.M., Lefebvre, M., Mobtaker, H., Delellis, R., y Tischler, A.S. (1986). Monoclonal antibody specific for an activated RAS protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83, 7485-7489.
Cerami E, et al. The cbio cancer genomics portal: An open platform for exploring multidimensional cancer genomics data. Cancer discovery. 2012;2:401-404.
Chao, G., W. L. Lau, B. J. Hackel, S. L. Sazinsky, S. M. Lippow, y K. D. Wittrup. 2006. Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display. Nat. Protoc. 1.
Chess, A. (2012). Mechanisms and consequences of widespread random monoallelic expression. Nat. Rev. Genet. 13, 421-428.
Chicaybam, L., y Bonamino, M.H. (2014). Abstract 2797: Construction and validation of an activating and inhibitory chimeric antigen receptor (CAR) system. Cancer Res. 74, 2797-2797.
Chicaybam, L., and Bonamino, M.H. (2015). Abstract 3156: Construction and validation of an activating and inhibitory chimeric antigen receptor (CAR) system. Cancer Res. 75, 3156-3156.
Consortium GT. Human genomics. The genotype-tissue expression (gtex) pilot analysis: Multitissue gene regulation in humans. Science. 2015;348:648-660.
Da Cunha, J.P.C., Galante, P.A.F., De Souza, J.E., De Souza, R.F., Carvalho, P.M., Ohara, D.T., Moura, R.P., Oba-Shinja, S.M., Marie, S.K.N., Silva Jr., W.A., et al. (2009). Bioinformatics construction of the human cell surfaceome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16752-16757.
Devilee, P., Cleton-Jansen, A.-M., y Cornelisse, C.J. (2001). Ever since Knudson. Trends Genet. 17, 569-573.
Dotti, G., Gottschalk, S., Savoldo, B., y Brenner, M.K. (2014). Design and development of therapies using chimeric antigen receptor-expressing T cells. Immunol. Rev. 257, 107-126.
Ebsen, H., Schroder, A., Kabelitz, D., y Janssen, O. (2013). Differential surface expression of ADAM10 and ADAM17 on human T lymphocytes and tumor cells. PLoS One 8, e76853.
Eriksson, M., Leitz, G., Fallman, E., Axner, O., Ryan, J.C., Nakamura, M.C., y Sentman, C.L. (1999). Inhibitory receptors alter natural killer cell interactions with target cells yet allow simultaneous killing of susceptible targets. J. Exp. Med. 190, 1005-1012.
Fedorov, V.D., Themeli, M., y Sadelain, M. (2013a). PD-1- and CTLA-4-based inhibitory chimeric antigen receptors (iCARs) divert off-target immunotherapy responses. Sci. Transl. Med. 5, 215ra172.
Fedorov, V.D., Themeli, M., y Sadelain, M. (2013b). PD-1- and CTLA-4-based inhibitory chimeric antigen receptors (iCARs) divert off-target immunotherapy responses. In Science Translational Medicine, (Affiliation: Center for Cell Engineering, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (MSKCC), New York, NY 10065, United States; Affiliation: Tri-Institutional MSTP Program (MSKCC, Rockefeller University, Weill-Cornell Medical College), New York, NY 10065, Un),.
Feenstra, M., Veltkamp, M., van Kuik, J., Wiertsema, S., Slootweg, P., van den Tweel, J., de Weger, R., y Tilanus, M. (1999). HLA class I expression and chromosomal deletions at 6p and 15q in head and neck squamous cell carcinomas. Tissue Antigens 54, 235-245.
Gao J. et al, Integrative analysis of complex cancer genomics and clinical profiles using the cBio Portal. Sci Signal.
20132;6(269)
Gill, S., y June, C.H. (2015). Going viral: chimeric antigen receptor T-cell therapy for hematological malignancies. Immunol. Rev. 263, 68-89.
Gordon, W.R., Zimmerman, B., He, L., Miles, L.J., Huang, J., Tiyanont, K., McArthur, D.G., Aster, J.C., Perrimon, N., Loparo, J.J., et al. (2015). Mechanical Allostery: Evidence for a Force Requirement in the Proteolytic Activation of Notch. Dev. Cell 33, 729-736.
Graef, I.A., Holsinger, L.J., Diver, S., Schreiber, S.L., y Crabtree, G.R. (1997). Proximity and orientation underlie signaling by the non-receptor tyrosine kinase ZAP70. EMBO J. 16, 5618-5628.
Gross, G., y Eshhar, Z. (2016a). Therapeutic Potential of T-Cell Chimeric Antigen Receptors in Cancer Treatment: Counteracting Off-Tumor Toxicities for Safe CAR T-Cell Therapy. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2016. 56:59-83. Gross, G., y Eshhar, Z. (2016b). Therapeutic Potential of T Cell Chimeric Antigen Receptors (CARs) in Cancer Treatment: Counteracting Off-Tumor Toxicities for Safe CAR T Cell Therapy. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 56, 59­ 83.
Gross, G., Waks, T., y Eshhar, Z. (1989). Expression of immunoglobulin-T-cell receptor chimeric molecules as functional receptors with antibody-type specificity. Proc Natl Acad Sci USA 86, 10024-10028.
Haapasalo, A., y Kovacs, D.M. (2011). The many substrates of presenilin/y-secretase. J. Alzheimers. Dis. 25, 3-28. Hanes, J., y A. Plückthun. 1997. In vitro selection and evolution of functional proteins by using ribosome display. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94.
Heemskerk, B., Kvistborg, P., y Schumacher, T.N.M. (2013). The cancer antigenome. EMBO J. 32, 194-203.
Hemming, M.L., Elias, J.E., Gygi, S.P., y Selkoe, D.J. (2009). Identification of beta-secretase (BACE1) substrates using quantitative proteomics. PLoS One 4, e8477.
Huse, M., Catherine Milanoski, S., y Abeyweera, T.P. (2013). Building tolerance by dismantling synapses: inhibitory receptor signaling in natural killer cells. Immunol. Rev. 251, 143-153.
Jiménez, P., Canton, J., Collado, A., Cabrera, T., Serrano, A., Real, L.M., Garcia, A., Ruiz-Cabello, F., y Garrido, F. (1999). Chromosome loss is the most frequent mechanism contributing to HLA haplotype loss in human tumors. Int. J. Cancer 83, 91-97.
Klebanoff, C.A., Rosenberg, S.A., y Restifo, N.P. (2016). Prospects for gene-engineered T cell immunotherapy for solid cancers. Nat. Med. 22, 26-36.
Kloss, C.C., Condomines, M., Cartellieri, M., Bachmann, M., y Sadelain, M. (2013). Combinatorial antigen recognition with balanced signaling promotes selective tumor eradication by engineered T cells. Nat. Biotechnol. 31,71-75. Knudson Jr., A.G. (1971). Mutation and cancer: statistical study of retinoblastoma. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 68, 820-823.
Lanitis, E., Poussin, M., Klattenhoff, A.W., Song, D., Sandaltzopoulos, R., June, C.H., y Powell Jr, D.J. (2013). Chimeric antigen receptor T cells with dissociated signaling domains exhibit focused anti-tumor activity with reduced potential for toxicity. Cancer Immunol. Res. 1, 10.1158/2326-6066.CIR - 13-0008.
Lawrence, M.S., Stojanov, P., Polak, P., Kryukov, G. V, Cibulskis, K., Sivachenko, A., Carter, S.L., Stewart, C., Mermel, C.H., Roberts, S.A., et al. (2013). Mutational heterogeneity in cancer and the search for new cancer-associated genes. Nature 499, 214-218.
Lee, A., Rana, B.K., Schiffer, H.H., Schork, N.J., Brann, M.R., Insel, P.A., y Weiner, D.M. (2003). Distribution analysis of nonsynonymous polymorphisms within the G-protein-coupled receptor gene family. Genomics 81,245-248.
Lek M, et al., Exome Aggregation C. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature.
2016;536:285-291.
Lengauer, C., Kinzler, K.W., y Vogelstein, B. (1998). Genetic instabilities in human cancers. Nature 396, 643-649. Li, H., Yang, B., Xing, K., Yuan, N., Wang, B., Chen, Z., He, W., y Zhou, J. (2014). A preliminary study of the relationship between breast cancer metastasis and loss of heterozygosity by using exome sequencing. Sci. Rep. 4.
Liberles, S.D., Diver, S.T., Austin, D.J., y Schreiber, S.L. (1997). Inducible gene expression and protein translocation using nontoxic ligands identified by a mammalian three-hybrid screen. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 7825-7830.
Lindblad-Toh, K., Tanenbaum, D.M., Daly, M.J., Winchester, E., Lui, W.-O., Villapakkam, A., Stanton, S.E., Larsson, C., Hudson, T.J., Johnson, B.E., et al. (2000). Loss-of-heterozygosity analysis of small-cell lung carcinomas using single-nucleotide polymorphism arrays. Nat. Biotechnol. 18, 1001-1005.
Lo, K.C., Bailey, D., Burkhardt, T., Gardina, P., Turpaz, Y., y Cowell, J.K. (2008). Comprehensive analysis of loss of heterozygosity events in glioblastoma using the 100K SNP mapping arrays and comparison with copy number abnormalities defined by BAC array comparative genomic hybridization. Genes Chromosom. Cancer 47, 221-237. Long, E.O., Sik Kim, H., Liu, D., Peterson, M.E., y Rajagopalan, S. (2013). Controlling natural killer cell responses: Integration of signals for activation and inhibition. Annu. Rev. Immunol. 31,227-258.
Maleno, I., López-Nevot, M.A., Cabrera, T., Salinero, J., y Garrido, F. (2002). Multiple mechanisms generate HLA class I altered phenotypes in laryngeal carcinomas: high frequency of HLA haplotype loss associated with loss of heterozygosity in chromosome region 6p21. Cancer Immunol. Immunother. 51,389-396.
Maleno, I., Cabrera, C.M., Cabrera, T., Paco, L., López-Nevot, M.A., Collado, A., Ferrón, A., y Garrido, F. (2004). Distribution of HLA class I altered phenotypes in colorectal carcinomas: high frequency of HLA haplotype loss associated with loss of heterozygosity in chromosome region 6p21. Immunogenetics 56, 244-253.
Maleno, I., Romero, J.M., Cabrera, T., Paco, L., Aptsiauri, N., Cozar, J.M., Tallada, M., López-Nevot, M.A., y Garrido, F. (2006). LOH at 6p21.3 region and HLA class I altered phenotypes in bladder carcinomas. Immunogenetics 58, 503­ 510.
Maleno, I., Aptsiauri, N., Cabrera, T., Gallego, A., Paschen, A., López-Nevot, M.A., y Garrido, F. (2011). Frequent loss of heterozygosity in the p2-microglobulin region of chromosome 15 in primary human tumors. Immunogenetics 63, 65­ 71.
McGranahan, N., Burrell, R.A., Endesfelder, D., Novelli, M.R., y Swanton, C. (2012). Cancer chromosomal instability: Therapeutic and diagnostic challenges. EMBO Rep. 13, 528-538.
Morsut, L., Roybal, K.T., Xiong, X., Gordley, R.M., Coyle, S.M., Thomson, M., y Lim, W.A. (2016). Engineering Customized Cell Sensing and Response Behaviors Using Synthetic Notch Receptors. Cell 164, 780-791.
Ng PC, Henikoff S. Sift: Predicting amino acid changes that affect protein function. Nucleic acids research.
2003;31:3812-3814.
Nirschl, C.J., y Drake, C.G. (2013). Molecular pathways: Coexpression of immune checkpoint molecules: Signaling pathways and implications for cancer immunotherapy. Clin. Cancer Res. 19, 4917-4924.
O'Keefe, C., McDevitt, M.A., y Maciejewski, J.P. (2010). Copy neutral loss of heterozygosity: A novel chromosomal lesion in myeloid malignancies. Blood 115, 2731-2739.
Ohgaki, H., Dessen, P., Jourde, B., Horstmann, S., Nishikawa, T., Di Patre, P.-L., Burkhard, C., Schüler, D., Probst-Hensch, N.M., Maiorka, P.C., et al. (2004). Genetic pathways to glioblastoma: a population-based study. Cancer Res.
64, 6892-6899.
Overwijk, W.W., Wang, E., Marincola, F.M., Rammensee, H.G., y Restifo, N.P. (2013). Mining the mutanome: developing highly personalized Immunotherapies based on mutational analysis of tumors. J. Immunother. Cancer 1, 11.
Rana, B.K., Shiina, T., y Insel, P.A. (2001). Genetic variations and polymorphisms of G protein-coupled receptors: functional and therapeutic implications. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 41,593-624.
Rawson, R.B. (2013). The site-2 protease. Biochim. Biophys. Acta 1828, 2801-2807. Rosenberg, S.A. (2014). Finding suitable targets is the major obstacle to cancer gene therapy. Cancer Gene Ther. 21,45-47.
Rosenberg, S.A., y Restifo, N.P. (2015). Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer. Science 348, 62-68.
Roybal, K.T., Rupp, L.J., Morsut, L., Walker, W.J., McNally, K.A., Park, J.S., y Lim, W.A. (2016a). Precision Tumor Recognition by T Cells With Combinatorial Antigen-Sensing Circuits. Cell.
Roybal, K.T., Rupp, L.J., Morsut, L., Walker, W.J., McNally, K.A., Park, J.S., and Lim, W.A. (2016b). Precision Tumor Recognition by T Cells With Combinatorial Antigen-Sensing Circuits. Cell 164, 770-779.
Sathirapongsasuti, J.F., Lee, H., Horst, B.A.J., Brunner, G., Cochran, A.J., Binder, S., Quackenbush, J., y Nelson, S.F. (2011). Exome sequencing-based copy-number variation and loss of heterozygosity detection: ExomeCNV. Bioinformatics 27, 2648-2654.
Savage, P.A. (2014). Tumor antigenicity revealed. Trends Immunol. 35, 47-48.
Savova, V., Chun, S., Sohail, M., McCole, R.B., Witwicki, R., Gai, L., Lenz, T.L., Wu, C.-T., Sunyaev, S.R., y Gimelbrant, A.A. (2016). Genes with monoallelic expression contribute disproportionately to genetic diversity in humans. Nat. Genet.
48, 231-237.
Schumacher, T.N., y Schreiber, R.D. (2015). Neoantigens in cancer immunotherapy. Science (80-. ). 348, 69-74. Sela-Culang, I., Y. Ofran, y B. Peters. 2015a. Antibody specific epitope prediction - Emergence of a new paradigm. Curr. Opin. Virol. 11.
Sela-Culang, I., S. Ashkenazi, B. Peters, y Y. Ofran. 2015b. PEASE: Predicting B-cell epitopes utilizing antibody sequence. Bioinformatics 31.
Skora, A.D., Douglass, J., Hwang, M.S., Tam, A.J., Blosser, R.L., Gabelli, S.B., Cao, J., Diaz, L.A., Papadopoulos, N., Kinzler, K.W., et al. (2015). Generation of MANAbodies specific to HLA-restricted epitopes encoded by somatically mutated genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 9967-9972.
Stark, M., y Hayward, N. (2007). Genome-wide loss of heterozygosity and copy number analysis in melanoma using high-density single-nucleotide polymorphism arrays. Cancer Res. 67, 2632-2642.
Stark, S.E., y Caton, A.J. (1991). Antibodies that are specific for a single amino acid interchange in a protein epitope use structurally distinct variable regions. J. Exp. Med. 174, 613- 624.
Teo, S.M., Pawitan, Y., Ku, C.S., Chia, K.S., y Salim, A. (2012). Statistical challenges associated with detecting copy number variations with next-generation sequencing. Bioinformatics 28, 2711-2718.
Thul PJ, et al. A subcellular map of the human proteome. Science. 2017 ;356.
Treanor, B., Lanigan, P.M.P., Kumar, S., Dunsby, C., Munro, I., Auksorius, E., Culley, F.J., Purbhoo, M.A., Phillips, D., Neil, M.A.A., et al. (2006). Microclusters of inhibitory killer immunoglobulin-like receptor signaling at natural killer cell immunological synapses. J. Cell Biol. 174, 153-161.
Uhlen M, et al. Tissue-based map of the human proteome. Science. 2015;347:1260419. Vogelstein, B., Fearon, E.R., Kern, S.E., Hamilton, S.R., Preisinger, A.C., Nakamura, Y., y White, R. (1989). Allelotype of colorectal carcinomas. Science (80-. ). 244, 207-211. Vogelstein, B., Papadopoulos, N., Velculescu, V.E., Zhou, S., Diaz Jr., L.A., y Kinzler, K.W. (2013). Cancer genome landscapes. Science (80-. ). 340, 1546-1558.
Voss, M., Schroder, B., y Fluhrer, R. (2013). Mechanism, specificity, and physiology of signal peptide peptidase (SPP) and SPP-like proteases. Biochim. Biophys. Acta 1828, 2828-2839.
Vyas, Y.M., Mehta, K.M., Morgan, M., Maniar, H., Butros, L., Jung, S., Burkhardt, J.K., y Dupont, B. (2001). Spatial organization of signal transduction molecules in the NK cell immune synapses during MHC class I-regulated noncytolytic and cytolytic interactions. J. Immunol. 167, 4358-4367.
Wang, Z.C., Lin, M., Wei, L.-J., Li, C., Miron, A., Lodeiro, G., Harris, L., Ramaswamy, S., Tanenbaum, D.M., Meyerson, M., et al. (2004). Loss of heterozygosity and its correlation with expression profiles in subclasses of invasive breast cancers. Cáncer Res. 64, 64-71. Wilkie, S., Van Schalkwyk, Hobbs, S., Davies, D.M., Van, D.S., Pereira, A.C.P., Burbridge, S.E., Box, C., Eccles, S.A., y Maher, J. (2012). Dual targeting of ErbB2 and MUC in breast cancer using chimeric antigen receptors engineered to provide complementary signaling. J. Clin. Immunol. 32, 1059-1070.
Wu, C.-Y., Roybal, K.T., Puchner, E.M., Onuffer, J., y Lim, W.A. (2015). Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science (80-. ). 350, aab4077.
Yeung, J.T., Hamilton, R.L., Ohnishi, K., Ikeura, M., Potter, D.M., Nikiforova, M.N., Ferrone, S., Jakacki, R.I., Pollack, I.F., y Okada, H. (2013). LOH in the HLA class I region at 6p21 is associated with shorter survival in newly diagnosed adult glioblastoma. Clin. Cancer Res. 19, 1816-1826.
EJEMPLO 4 VERIFICACIÓN DE LOH A NIVEL DE PROTEÍNAS
La LOH puede detectarse a nivel de proteína mediante tinción diferencial de muestras de células normales frente a células tumorales usando anticuerpos específicos del alelo. Por ejemplo, la verificación de la LOH de HLA en muestras de cáncer se puede realizar usando anticuerpos antiHLA comerciales específicos para el alotipo de HLA del paciente. La Tabla 11 a continuación detalla un ejemplo de anticuerpos disponibles específicos del alelo, que se pueden usar. Las muestras se someterán a tinción inmunohistoquímica (IHC) como se describe en el protocolo de IHC a continuación.
Tabla 11: Anticuerpos anti-HLA específicos del alelo
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Protocolo de IHC
Muestras de tejidos congelados -Los tejidos congelados a menudo se fijan en una disolución basada en formalina, y se embeben en OCT (compuesto de temperatura de corte óptima), que permite la criosección de la muestra. Los tejidos en OCT se mantienen congelados a -80oC. Los bloques congelados se retiran a -80oC antes del corte, se equilibran en la cámara crióstata, y se cortan en secciones delgadas (a menudo de 5 a 15 gm de grosor). Las secciones se montan en un portaobjetos histológico. Los portaobjetos se pueden almacenar entre -20°C y -80°C. Antes de la
tinción IHC, los portaobjetos se descongelan a temperatura ambiente (RT) durante 10-20 min.
Tejidos embebidos en parafina -Los tejidos se embeben en una disolución fijadora de formaldehído. Antes de añadir la cera de parafina, los tejidos se deshidratan por inmersión gradual en concentraciones crecientes de etanol (70%, 90%, 100%) y xileno durante tiempos y duraciones específicos a RT. Después, los tejidos se embeben en cera de parafina.
Los tejidos embebidos en parafina se cortan en un micrótomo en secciones de 5-15 gm de grosor, se flotan en un baño de agua a 56 oC, y se montan en un portaobjetos histológico. Los portaobjetos se pueden mantener a RT. Antes de la tinción IHC, las secciones embebidas en parafina requieren una etapa de rehidratación. REHIDRATACIÓN: las secciones se rehidratan por inmersión en xileno (2 X 10 min), seguido de concentraciones decrecientes de etanol - 100% X2, cada una durante 10 min 95% etanol - 5 min 70% etanol - 5 min 50% etanol - 5 min Aclarado en dH2O.
Detección de inmunofluorescencia:
Protocolo:
1. Rehidrate los portaobjetos en amortiguador de lavado (PBSX1) durante 10 minutos. Drene el amortiguador de lavado.
2. Realice la recuperación de antígenos - si es necesario (recuperación de antígenos inducida por calor o recuperación enzimática).
3. Para los antígenos intracelulares, realice la permeabilización - incube los portaobjetos en tritón X-100 al 0,1% en PBSX1 durante 10 minutos a RT.
4. BLOQUEO - Bloquee el tejido en amortiguador de bloqueo durante 30 min. a RT. El amortiguador de bloqueo depende del método de detección, generalmente 5% de suero animal en PBSX1 o 1% de BSA en PBSX1 5. ANTICUERPO PRIMARIO - Anticuerpo primario diluido en amortiguador de incubación (por ejemplo, 1% de BSA, suero de burro al 1% en PBS, también se pueden usar otros amortiguadores de incubación), según las instrucciones del fabricante del anticuerpo. Incube el tejido a 4oC durante la noche en anticuerpo primario diluido. El anticuerpo primario puede ser un anticuerpo monoclonal anti-HLA-A, anti-HLA-B o anti-HLA-C específico del alelo, como se detalla anteriormente.
o Si se usa un anticuerpo primario conjugado, protéjalo de la luz, y continúe hasta la etapa 8. o Como control negativo, incube el tejido con amortiguador de incubación solamente, sin anticuerpo primario.
o También, realice un control de isotipo emparejado del anticuerpo monoclonal usado en el experimento.
6. 6. LAVADO - Lave los portaobjetos en amortiguador de lavado - 3 X 5-15 min.
7. 7. ANTICUERPO SECUNDARIO - diluya el anticuerpo secundario en el amortiguador de incubación según las instrucciones del fabricante del anticuerpo. Incube el tejido durante 30-60 min a RT en anticuerpo secundario diluido. Protéjalo de la luz.
8. 8. LAVADO - Lave los portaobjetos en amortiguador de lavado - 3 X 5-15 min.
9. 9. Tinción DAPI - diluya el amortiguador de incubación DAPI (~300 nM - 3 gM). Añada 300 pl de disolución DAPI a cada sección. Incube a RT durante 5-10 min.
10. 10. LAVADO - lave el portaobjetos una vez con X1 PBS.
11. 11. Monte con un medio de montaje antiatenuación.
12. 12. Mantenga los portaobjetos protegidos de la luz.
13. 13. Visualice los portaobjetos usando un microscopio de fluorescencia.
Detección cromogénica:
Protocolo:
1. 1. Rehidrate los portaobjetos en amortiguador de lavado (PBSX1) durante 10 minutos. Drene el amortiguador de lavado.
2. 2. Realice la recuperación del antígeno - si es necesario - véase más arriba.
3. 3. Para los reactivos de HRP, bloquee la actividad de la peroxidasa endógena con peróxido de hidrógeno al 3,0% en metanol durante al menos 15 min.
4. 4. Lave las secciones sumergiéndolas en dH2O durante 5 min.
5. 5. Para los antígenos intracelulares, realice la permeabilización - incube los portaobjetos en tritón X-100 al 0,1% en PBSX1 durante 10 minutos a RT.
6. 6. BLOQUEO - Bloquee el tejido en amortiguador de bloqueo durante 30 min. a RT. El amortiguador de bloqueo depende del método de detección, generalmente suero animal al 5 % en PBSX1 o BSA al 1 % en PBSX1.
7. 7. ANTICUERPO PRIMARIO - Anticuerpo primario diluido en amortiguador de incubación (por ejemplo, 1% de BSA, suero de burro al 1% en PBS, también se pueden usar otros amortiguadores de incubación), según las instrucciones del fabricante del anticuerpo. Incube el tejido a 4°C durante la noche en anticuerpo primario diluido
8. 8. LAVADO - Lave los portaobjetos en amortiguador de lavado - 3 X 5-15 min.
9. 9. ANTICUERPO SECUNDARIO - Incube el tejido durante 30-60 min a RT en anticuerpo secundario conjugado con HRP.
10. 10. LAVADO - lave los portaobjetos en amortiguador de lavado 3 X 5-15 min.
11. 11. Añada el reactivo ABC-HRP según las pautas del fabricante. Incube a RT durante 60 min.
12. 12. Prepare la disolución DAB (u otro cromógeno) según las pautas del fabricante, y aplíquela a las secciones de tejido. La reacción cromogénica hace que los sitios del epítopo se vuelvan marrones (normalmente de unos pocos segundos a 10 minutos). Continúe con la siguiente etapa cuando la intensidad de la señal sea adecuada para obtener imágenes
13. 13. LAVADO - Lave los portaobjetos en amortiguador de lavado - 3 X 5-15 min.
14. 14. Lave los portaobjetos en dH2O - 2 X 5-15min.
15. 15. Tinción de núcleos: añada disolución de hematoxilina. Incube a RT durante 5 min.
16. 16. Deshidrate secciones de tejido - 95% etanol - 2 X 2min. 100% etanol - 2 X 2min. Xileno - 2 X 2min. 17. 17. Monte con un medio de montaje antiatenuación
18. 18. Visualice los portaobjetos usando una iluminación de campo brillante
EJEMPLO 5. DISEÑO Y CONSTRUCCIÓN DE CAR-T
El propósito del estudio es crear un receptor sintético que inhibirá el efecto 'fuera del tumor' en la diana de la terapia de CAR-T. En ese grado, se estableció una biblioteca de constructos de CAR compuestos por CAR activadores e inhibidores.
El primer conjunto de constructos incluía un CAR inhibidor dirigido contra la secuencia de HLA tipo I (HLA-A2) y un CAR activador dirigido contra el antígeno tumoral (CD19). El siguiente conjunto de constructos que se usará como prueba de concepto incluye secuencias de CAR activador dirigidas contra CD19 y secuencias de CAR inhibidor dirigidas contra CD20. Se construirán constructos adicionales dirigidos contra antígenos diana identificados por futuros análisis bioinformáticos. Los candidatos diana se priorizarán según los criterios expuestos (los criterios ejemplares incluyen, pero no se limitan a, patrón de expresión de diana, nivel de expresión de diana, antigenicidad, y más). Se construyó un iCAR de CD19 aCAR, CD20, y un iCAR de HLA-A2, como se describe en las Figuras 15 y 21.
Los constructos de iCAR se diseñaron y sintetizaron usando síntesis de ADN comercial. Los dominios transmembrana e intracelular hasta el primer dominio extracelular anotado de PD-1 (aminoácido 145-288) se fusionaron en dirección 3’ con scFv de HLA-A2 (la secuencia de ADN que codifica HLA-A2 se recuperó del hibridoma BB7.2, (ATCC cat #: HB-82), que produce anti HLA-A2).
Se diseñarán constructos similares con CTLA4 (aminoácidos 161-223) o con otras secuencias derivadas de inmunorreguladores negativos adicionales (por ejemplo, 2B4, LAG-3 y BTLA-4), y sus secuencias de señalización se fusionarán en dirección 3’ con scFv de HLA-A2.
Para la detección y clasificación de iCAR, se integró un gen informador (por ejemplo, eGFP) en dirección 3’ a la secuencia de iCAR a través de secuencias IRES, seguido de un gen de resistencia a antibióticos (es decir, higromicina) separado por la secuencia P2A, como se ilustra en la Figura 15.
Para el constructo de aCAR, el scFV de CD19 se fusionó con el constructo de CAR de segunda generación compuesto por la secuencia bisagra de CD8 seguida de CD28 transmembrana y coestimulación 1 de 41BB y CD3Z. También se diseñarán y construirán constructos de aCAR adicionales compuestos por otro elemento de señalización o estructural (por ejemplo, bisagra de CD28, dominio de señalización de CD28, o dominios de señalización tanto de CD28 como de 41BB). Para la detección y clasificación de aCAR, se integró un gen informador RFP en dirección 3’ de la secuencia de aCAR a través de secuencias IRES, seguido de un gen de resistencia a antibióticos (resistencia a puromicina) separado por la secuencia P2A (Figura 15).
Las secuencias de aCAR e iCAR se clonaron en un vector de transferencia de lentivirus, y entonces se usaron para la producción de partículas virales usando células de empaquetamiento HEK-293T.
EJEMPLO 6. PRODUCCIÓN DE CÉLULAS EFECTORAS
Para estudiar el efecto de los constructos de iCAR sobre la modulación de la activación de CD19 CAR, se construyeron células efectoras Jurkat recombinantes como se detalla en la Tabla 12 a continuación. Jurkat (ATCC TIB 152), una línea de células T CD4+, y Jurkat-NFAT (una línea celular Jurkat adquirida de BPS Biosciences, manipulada para expresar una proteína luciferasa de luciérnaga, bajo el control de elementos de respuesta NFAT), se transdujeron usando placas unidas al vector lentiviral revestidas con retronectina (Takara) o en presencia de polibreno. Las células transducidas se sometieron además a selección de antibióticos para producir las líneas celulares descritas en la Tabla 12. Después de la selección, las células se sometieron a análisis de citometría de flujo para verificar la expresión de la proteína informadora codificada en cada constructo.
Tabla 12 - líneas celulares efectoras recombinantes
Línea celular efectora Celda Constructo 1 (aCAR- Constructo 2 (iCAR-recombinante parental RFP) GFP)
CD 19 aCAR Jurkat Jurkat CD 19 aCAR -CD 19aCAR/HLA-A2 iCAR Jurkat Jurkat CD19 aCAR HLA-A2 iCAR
HLA-A2 iCAR Jurkat - HLA-A2 iCAR
Jurkat
CD 19aCAR/CD20 Jurkat CD19 aCAR CD20 iCAR
iCAR Jurkat
CD20 iCAR Jurkat Jurkat - CD20 iCAR
CD19 aCAR Jurkat-NFAT Jurkat-NFAT CD19 aCAR -CD 19aCAR/HLA-A2 iCAR Jurkat- Jurkat-NFAT CD19 aCAR HLA-A2 iCAR
NFAT HLA-A2 iCAR Jurkat-NFAT - HLA-A2 iCAR
Jurkat-NFAT
CD 19aCAR/CD20 Jurkat-NFAT CD19 aCAR CD20 iCAR
iCAR Jurkat-NFAT
CD20 iCAR Jurkat-NFAT Jurkat-NFAT - CD20 iCAR
Además, las células T activadas, derivadas de sangre periférica obtenida de donantes sanos, se transducirán con partículas virales que codifican aCAR, iCAR, o ambos, a diferentes multiplicidades de infección (MOI). La selección de FACS basada en la expresión del gen informador se usará para la clasificación y selección de la población celular que exprese diferentes niveles de aCAR, iCAR, o ambos.
EJEMPLO 7. PREPARACIÓN DE CÉLULAS DIANA
Se estableció un sistema recombinante in vitro para probar la funcionalidad de los constructos de iCAR en la inhibición de la actividad de aCAR contra células fuera de la diana. Para este fin, se produjeron células diana que expresaban el epítopo de aCAR, el epítopo de iCAR, o ambos. Las células recombinantes que expresan el epítopo de aCAR representan las células 'en la diana' 'en el tumor', mientras que las células que expresan los epítopos de aCAR e iCAR representan las células sanas 'en la diana' 'fuera del tumor'.
Como nuestro primer conjunto iCAR/aCAR se basa en HLA-A2 y CD19 respectivamente, se produjeron células recombinantes que expresan HLA-A2 o CD19 o ambos, transfectando la línea celular (por ejemplo, Hela, ATCC CRM-CCL-2, Hela-Luciferase- GenTarget SCO32-Bsd o Raji- ATCC CCL-86) con vectores de expresión que codifican estos genes.
Para la detección de la expresión de HLA A-2 recombinante, se insertó la etiqueta Myc. Para el segundo conjunto iCAR/aCAR compuesto por CD20 iCAR/CD19 aCAR, se construyeron células recombinantes que expresan CD20 o CD19 o ambos (las células diana se detallan en la Tabla 15).
Tabla 13 - Líneas celulares diana
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Ensayos-
El efecto inhibidor de iCAR se probará tanto in vitro como in vivo.
En los ensayos in vitro, nos centraremos en medir la secreción de citocinas y los efectos de la citotoxicidad, al tiempo que, in vivo, evaluaremos la inhibición y la protección de iCAR para xenoinjertos 'en el tumor'. Limitaremos que las células T que carecen de iCAR contaminen los resultados clasificando las células T para que sean iCAR/aCAR doble positivas usando genes informadores. Como control negativo para la actividad de bloqueo de iCAR, podemos usar células T transducidas con CAR que carece del dominio de scFv (es decir, transducción simulada).
EJEMPLO 8. ENSAYOS IN VITRO
Ensayo de linfocitos T citotóxicos (CTL) de luciferasa
El ensayo se realizará usando células diana recombinantes Hela-Luc descritas anteriormente, manipuladas para expresar luciferasa de luciérnaga, y uno o dos antígenos diana de CAR. El ensayo de luciferasa in vitro se realizará según el protocolo del fabricante del ensayo de luciferasa Bright-Glo (Promega), y la bioluminiscencia como lectura.
Las células T (transducidas con iCAR y pCAR, o iCAR y aCAR, o aCAR o CAR simulado) se incubarán durante 24 a 48 h con las células diana recombinantes que expresan HLA-A2 o CD19, o tanto HLA-A2 como CD19 o CD20, o tanto CD20 como CD 19, en diferentes relaciones de efector a diana. La muerte celular se cuantificará con el sistema Bright-Glo Luciferase.
La citotoxicidad 'fuera del tumor' se optimiza clasificando la población de células T transducidas según el nivel de expresión de iCAR/aCAR, o seleccionando la subpoblación de células diana recombinantes según su nivel de expresión de CD19, HLA-A2 o CD20. Para probar si las células T transducidas con iCAR pueden discriminar entre las células 'en el tumor' y 'fuera del tumor' in vitro, probaremos el efecto letal de las células T transducidas incubadas con una mezcla de células 'en el tumor' y 'fuera del tumor' en una relación de 1:1 y más. Las células recombinantes 'en el tumor' se distinguirán de las células recombinantes 'fuera del tumor' por la expresión de luciferasa (sólo se manipulará una población celular para que exprese el gen de luciferasa en un momento dado). La muerte se cuantificará después de 24 a 48 h de coincubación.
Ensayo de actividad de caspasa 3 - detección de apoptosis inducida por CTL mediante un anti-caspasa 3 activada (CASP3).
Una de las rutas por las que las células T citotóxicas exterminan las células diana es induciendo la apoptosis a través del ligando Fas. La activación secuencial de caspasas juega un papel importante en la fase de ejecución de la apoptosis celular. La escisión de pro-caspasa 3 a caspasa 3 da como resultado un cambio conformacional y expresión de actividad catalítica. La forma activada escindida de la caspasa 3 puede reconocerse específicamente mediante un anticuerpo monoclonal.
Las células T transducidas se cocultivarán durante 2-4 horas con células recombinantes 'en el tumor' o 'fuera del tumor', previamente marcadas con CFSE u otro colorante marcador celular (por ejemplo, CellTrace Violet). Después de la permeabilización y fijación celular mediante un kit de tinción interno (por ejemplo, Miltenyi o BD bioscience), CASP3 activada se detectará mediante tinción con anticuerpos específicos (BD bioscience), y las células diana apoptóticas se detectarán y cuantificarán mediante citometría de flujo.
Microscopía de lapso de tiempo CTL
Las células T transducidas se incubarán con células 'en el tumor' o 'fuera del tumor' durante un máximo de 5 días. Se usará microscopía de lapso de tiempo para visualizar la muerte. Como alternativa, se llevará a cabo un análisis de citometría de flujo usando la tinción del número de células viables y perlas CountBright (Invitrogen), para determinar el número de células diana en el punto final.
Para demostrar la eficacia de las células T transducidas con aCAR/iCAR en el discernimiento de dianas in vitro, cada célula diana recombinante ('en el tumor' o 'fuera del tumor') se marca con una proteína informadora diferente (por ejemplo, GFP y mCherry). Las células T transducidas (células efectoras) se coincubarán con una mezcla de células recombinantes que expresan uno o dos antígenos diana (células diana) en diferentes relaciones E/T. El destino de cada línea celular se seguirá por imágenes de microscopía.
Liberación de citocinas
Tras la activación de las células T, las células segregan citocinas que pueden cuantificarse y usarse para evaluar la activación e inhibición de las células T. Las citocinas pueden detectarse intracelularmente mediante citometría de flujo o por medida de las proteínas segregadas en el medio mediante ELISA o Cytometric Bead Array (CBA).
Cuantificación por ELISA de citocinas segregadas
Después del cocultivo de células T transducidas (Jurkat, o células T primarias), que expresan iCAR o aCAR, o tanto aCA como iCAR, con células diana modificadas, que expresan iCAR o aCAR o ambos antígenos aCAR e iCAR, en su superficie celular, se recogerá el medio acondicionado, y la concentración de citocinas se medirá mediante ELISA de citocinas (IL-2, INFy o TNFa) según las instrucciones de fabricación (por ejemplo, BioLegened o similar), y mediante Cytometric Bead Array (Miltenyi o similar).
Inhibición específica de iCAR medida por ELISA de IL-2
Las células efectoras Jurkat CD19 aCAR y Jurkat CD19 aCAR/HLA-A2 iCAR se cocultivaron con células diana Raji, Raji-HLA-A2, y Thp1, y los sobrenadantes correspondientes se recogieron para la medida de IL-2 mediante ELISA, como se ilustra en la Figura 16A. La incubación de Jurkat CD19-aCAR/HLA-A2-iCAR con células diana Raji ('tumor') que expresan CD19 mostró secreción de IL-2; sin embargo, la incubación de estas células efectoras con células diana Raji-HLA-A2 que expresan CD19 y HLA-A2 ('fuera del tumor') dio como resultado inhibición de más del 80% de la secreción de IL-2. Por el contrario, la secreción de IL-2 no se vio afectada cuando las células CD19 aCAR Jurkat se incubaron con células diana Raji o Raji-HLA-A2 (Figura 16B). Este resultado, junto con el ensayo de activación de NFAT que se describe a continuación, apunta hacia la potencia del constructo de iCAR para proteger específicamente a las células normales que expresan un antígeno que no se expresa en las células tumorales.
Cuantificación de la liberación de citocinas por citometría de flujo
Células T transducidas (Jurkat, o células T primarias) que expresan iCAR o aCAR, o tanto aCAR como iCAR, cocultivadas durante 6-24 h con células diana recombinantes, que expresan iCAR o aCAR, o ambos antígenos diana de aCAR e iCAR en su superficie celular, se someterán a bloqueadores del transporte de Golgi (por ejemplo, Brefeldina A, monensina) para permitir la acumulación intracelular de citocinas. A continuación, las células T se permearán y se fijarán con un kit de tinción interior (por ejemplo, Miltenyi) y se tiñerán con anti CD3 y CD8 y para IL-2 y o INFy y o TNFa.
Secreción de citocinas medida mediante ensayo de matriz de perlas citométricas (CBA)
La matriz de perlas citométricas (CBA) se usa para medir una variedad de proteínas solubles e intracelulares, incluyendo citocinas, quimiocinas y factores de crecimiento.
Las células T (células T primarias o células Jurkat) transducidas con constructos de aCAR, o tanto de aCAR como de iCAR (células efectoras), se estimularon con células diana modificadas que expresan antígenos diana tanto de iCAR como de aCAR, o de aCAR o de iCAR en su superficie celular (Figura 17A). Después de varias horas de coincubación, las células efectoras producen y segregan citocinas que indican su estado efector. Se recogió el sobrenadante de la reacción, y la IL-2 segregada se midió y se cuantificó mediante un ensayo multiplex de CBA.
Como se muestra en la Figura 17B, se demostró una inhibición específica de la secreción de IL-2 para células T Jurkat transducidas con aCAR/iCAR cocultivadas con células diana que expresan ambos antígenos diana. Se demostró una disminución del 86% en la secreción de IL-2 cuando las células transducidas con CAR dual (aCAR/iCAR) se coincubaron con células diana que expresaban ambos antígenos diana, en comparación con la secreción de IL-2 resultante de la coincubación de las mismas células efectoras con células diana que expresan sólo una diana.
Ensayo de activación de NFAT
Para la determinación de la activación de células T medida por la activación de NFAT, se transdujeron células Jurkat-NFAT con diferentes combinaciones de aCAR e iCAR, como se detalla en la Tabla 12. Líneas celulares efectoras Jurkat-NFAT, que expresan CD19 aCAR, HLA-A2 iCAR, o ambos, se cocultivaron con células diana que expresaban CD19 (células Raji-'en la diana'), tanto c D19 como HLA-A2 (Raji-HLA-A2 'fuera del tumor'), o HLA-A2 (Thp1 'fuera del tumor'), como se describe en la Tabla 13. Como control positivo, las células efectoras se estimularon en presencia de PMA e ionomicina, que desencadenan la liberación de calcio necesaria para la señalización de NFAT. Tras 16 h de incubación a 37°C, la luciferasa se cuantificó usando el kit de BPS Biosciences “One step luciferase assay system”, según las instrucciones del fabricante. Como era de esperar, la línea celular Jurkat NFAT que expresa el constructo CD19-CAR se activó específicamente en presencia de la línea celular Raji que expresa CD19, mientras que no se mostró activación cuando estas células se cultivaron conjuntamente con la línea celular Thp1 que no expresa CD19 (Figura 18).
El efecto inhibidor de HLA-A2 iCAR sobre la activación de NFAT inducida por CD19 aCAR se puede ver en la Figura 21. La línea celular Jurkat-NFAT que expresa tanto CD19 aCAR como HLA-A2 iCAR se inhibió específicamente cuando se incubó junto con Raji-HLA-A2, que expresan CD19 y HLA-A2, en comparación con la activación inducida por células Raji que expresan CD19 solamente. Por el contrario, la línea celular Jurkat-NFAT que expresa sólo CD19-CAR fue activada de manera similar por las líneas celulares Raji y Raji-A2. En estas condiciones, la inhibición de la activación de NFAT se calculó como ~30% (Figura 19).
Se probó el efecto de diferentes relaciones E/T. El ensayo se repitió varias veces con relaciones E/T de 10:1,5:1, 1:1. Los resultados dados en la Figura 20 indican que se puede obtener un efecto inhibidor aumentado con una relación E/T más alta. Los resultados se presentan como una relación del valor medio de luminiscencia del cocultivo de cada línea celular efectora con células diana 'fuera del tumor' al valor medio del cocultivo con células presentadoras 'en la diana'. Como se muestra, la línea celular Jurkat-NFAT que expresa tanto CD19 aCAR como HLA-A2 iCAR se inhibió específicamente cuando se incubó conjuntamente con Raji-HLA-A2, que expresa proteínas CD19 y HLA-A2; sin embargo, no se detectó inhibición cuando esta línea celular se cocultivó con la línea celular Raji, que expresa CD19 solamente. Por el contrario, la línea celular Jurkat-NFAT que expresa CD19 aCAR se activó igualmente, independientemente de la línea celular diana que expresa CD19 con la que se cocultivó (Raji o Raji-HLA-A2).
Ensayo de desgranulación de células T medido mediante tinción con CD107a
La desgranulación de las células T se puede identificar por la expresión superficial de CD107a, una proteína de membrana asociada a los lisosomas (LAMP-1). Se ha mostrado que la expresión superficial de LAMP-1 se correlaciona con la citotoxicidad de las células T CD8. Esta molécula se encuentra en el lado luminal de los lisosomas. Tras la activación, CD107a se transfiere a la superficie de la membrana celular de linfocitos activados. CD107a se expresa en la superficie celular de forma transitoria, y se reinternaliza rápidamente a través de la ruta endocítica. Por lo tanto, la detección de CD107a se maximiza mediante la tinción con anticuerpos durante la estimulación celular, y mediante la adición de monensina (para evitar la acidificación y la subsiguiente degradación de complejos de anticuerpos CD107a sometidos a endocitosis).
Las células T transducidas se incubarán con las células diana durante 6 a 24 h en presencia de monensina, y se seguirá la expresión de CD107a en las células T CD8 por citometría de flujo usando anticuerpos conjugados contra los marcadores de la superficie de células T (CD3, CD8) y un anticuerpo conjugado para CD107a.
Granulación (CD107a) como marcador del potencial letal. La función más crítica de las células T citolíticas es la capacidad de exterminar células diana. Los linfocitos T CD8+ citotóxicos median la destrucción de las células diana a través de dos rutas principales: la activación de la apoptosis mediada por perforina-granzima, y la inducción de la apoptosis mediada por el fas-ligando fas. La inducción de estas rutas depende de la liberación de gránulos citolíticos de las células T CD8+ respondedoras. La desgranulación es un requisito previo para exterminio mediado por perforinagranzima, y es necesaria para la función lítica inmediata mediada por células T CD8+ específicas de antígeno respondedoras. La citotoxicidad no requiere la síntesis de proteínas de novo por la célula T CD8+ efectora; en cambio, los gránulos líticos preformados ubicados dentro del citoplasma se liberan de manera polarizada hacia la célula diana. Los gránulos líticos son lisosomas secretores unidos a la membrana que contienen un núcleo denso compuesto por diversas proteínas, incluyendo perforina y granzimas. El núcleo del gránulo está rodeado por una bicapa lipídica que contiene numerosas glicoproteínas de membrana asociadas a los lisosomas (LAMP), que incluyen CD107a (LAMP-1), CD107b (LAMP-2), y CD63 (LAMP-3). Durante el proceso de desgranulación, la membrana del gránulo lítico se fusiona con la membrana plasmática de la célula T CD8+ activada, y los contenidos del gránulo se liberan en la sinapsis inmunológica entre la célula T CD8+ y la célula diana. Como resultado de este proceso, la membrana granular, que incluye en ella las glicoproteínas CD107a, CD107b y CD63, se incorpora a la membrana plasmática de la célula T CD8+ respondedora. La expresión de alto nivel de CD107a y b en la superficie celular de las células T activadas requiere desgranulación, debido a que los inhibidores de la desgranulación, tal como la colchicina, reducen drásticamente la expresión de CD107a y b en la superficie celular. Es importante destacar que estas proteínas rara vez se encuentran en la superficie de los linfocitos T en reposo. Por lo tanto, marcar las células respondedoras con anticuerpos contra CD107a y b, y medir su expresión por citometría de flujo, puede identificar directamente las células T CD8+ desgranuladas (Betts y Koup, 2004).
Configuraciones experimentales:
Las PBMC transducidas con constructos iCAR+aCAR / aCAR (células efectoras) se estimulan con PMA+ionomicina (control positivo) o células diana modificadas que expresan antígenos de iCAR+aCAR/ aCAR/ iCAR en su superficie celular. Durante varias horas de co-incubación, las células efectoras se desgranulan, CD107a puede detectarse en la superficie celular. Esta expresión es transitoria, y la CD107a se reinternaliza rápidamente a través de la ruta endocítica. Por lo tanto, la detección de CD107a se maximiza mediante la tinción con anticuerpos durante la estimulación celular, y mediante la adición de monensina (para evitar la acidificación y la subsiguiente degradación de complejos de anticuerpos CD107a sometidos a endocitosis). Se requiere BFA para la expresión óptima de citocinas.
EJEMPLO 9 MODELOS IN VIVO
Ensayo de CTL in vivo en modelos de ratón con xenoinjerto humano
Para probar si las células T que expresan los constructos de aCAR e iCAR podrían discriminar entre las células diana y las células 'fuera de la diana' dentro del mismo organismo, y exterminar eficazmente las células diana mientras se respetan las células 'fuera de la diana', se evaluará mediante un ensayo de CTL in vivo.
Las células T transducidas con iCAR o aCAR, o tanto iCAR como aCAR, se inyectarán i.v. a ratones NOD/SCID/ycsin tratamiento previo o similares. Varias horas más tarde, se inyectarán células diana que expresen iCAR, aCAR, o ambos. Estas dianas se marcarán con CFSE / CPDE o un tinte de traza celular similar en diferentes concentraciones (alta, media y baja), que permitirá una mayor discriminación entre ellas. 18 h después de la inyección de las dianas, los ratones se sacrificarán, los bazos se recolectarán, y se evaluará la eliminación de la diana específica mediante FACS. El porcentaje de muertes específicas se calculará según la siguiente fórmula:
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Cinética de crecimiento tumoral en modelos de ratón con xenoinjerto humano
Se inocularán ratones NOD/SCID/yc- o similares con células tumorales. La inoculación puede ser i.p / i.v. o s.c. Las células tumorales expresarán la diana de iCAR, la diana de aCAR, o ambas. Un ejemplo de una posible línea celular tumoral de aCAR podría ser NALM 6 CD19 positiva (ATCC, línea celular BALL humana). Ejemplo de células tumorales que expresan tanto aCAR como iCAR (es decir, células 'fuera del tumor'), es la NALM 6, manipulada para expresar el epítopo de iCAR (por ejemplo, HLA-A2), representando así las células sanas. NALM 6 y NALM 6-HLA-A2 también se pueden manipular para expresar un gen informador (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga), para una fácil detección. Los ratones se dividirán en varios grupos de estudio, inoculados con todas las combinaciones posibles de células diana. Como ejemplo, a un grupo se le inyectarán células NALM 6 mientras que al otro se le inyectará NALM-6 que expresa el epítopo de iCAR. Varios días después, mientras el tumor ya se ha establecido, los ratones recibirán una infusión intravenosa de células T transducidas con aCAR, aCAR/iCAR, o iCAR. Además, también se incluirán grupos de control de células T no transducidas, sin células T, o de células T transducidas sin un dominio de señalización. Los ratones se monitorizarán hasta que el tumor alcance el punto final experimental, es decir, el volumen tumoral máximo permitido. La monitorización se realizará midiendo el volumen tumoral por medios mecánicos (calibrador), y también mediante el uso de sistemas de formación de imágenes in vivo (IVIS). El día del punto final, los ratones se sacrificarán, se cuantificará la carga tumoral, y las poblaciones de células T infiltrantes se analizarán mediante FACS. Para probar si las células T que expresan el constructo de iCAR podrían discriminar entre las células diana y las células 'fuera de la diana' dentro del mismo organismo, inyectaremos a los ratones varias mezclas posibles en varias proporciones de células NALM-6 'en el tumor'/'fuera del tumor', seguido de la inyección de células T transducidas que expresan aCAR solo o tanto aCAR como iCAR. Tras el sacrificio de los ratones, se analizará la presencia de células 'en el tumor' y 'fuera del tumor' en el bazo y la médula ósea mediante citometría de flujo para los dos marcadores, CD19 y el epítopo de iCAR.
Toxicidad y cinética de crecimiento tumoral en modelos de ratones transgénicos
También se usarán ratones transgénicos que expresan las dianas de aCAR e iCAR humanos para determinar la eficacia de las células T transducidas. En estos entornos, los ratones tienen un sistema inmunitario completamente funcional, y se puede evaluar la toxicidad potencial de las células T transducidas con iCAR/aCAR. El constructo de CAR contendrá scFv, que coincide con los antígenos humanos, mientras que los dominios de señalización se modificarán para activar o inhibir las células T murinas. Un ejemplo para tal modelo son los ratones HHD-HLA-A2, que expresan sólo la molécula HLA-A2 humana mientras que todas las demás proteínas son únicamente murinas. El scFv del CD19 aCAR se dirigirá en este caso contra el homólogo de CD19 murino. Se usarán células diana humanas que carecen de moléculas HLA (por ejemplo, células LCL 721.221 o C1 R-neoATCC® CRL-2369™ o similar). Las dianas se modificarán para expresar el CD19 murino. Este sistema permitirá monitorizar los problemas de eficacia y toxicidad.
Producción de mAbs
Se seleccionan varios pares de variantes alélicas conservadas y perdidas identificadas en diferentes tumores, y sus productos polipeptídicos servirán para la generación de mAb específicos variantes usando técnicas de producción de mAb. El poder discriminatorio de los mAb candidatos se evaluará mediante experimentos de tinción doble y citometría de flujo, o inmunohistoquímica, según lo determinado por la unión a líneas celulares recombinantes que expresan los alelos seleccionados.
Todos los encabezados y las designaciones de las secciones se usan sólo con fines de claridad y referencia, y no se deben considerar limitativos de ninguna manera. Por ejemplo, los expertos en la técnica apreciarán la utilidad de combinar diversos aspectos de diferentes encabezados y secciones según sea apropiado de acuerdo con el alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Las realizaciones específicas y los ejemplos descritos aquí se ofrecen sólo a modo de ejemplo, y la aplicación debe estar limitada sólo por los términos de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un método para identificar una diana para preparar un receptor de antígeno quimérico inhibidor (iCAR) o un receptor de antígeno quimérico protector (pCAR) capaz de prevenir o atenuar la activación no deseada de una célula inmunitaria efectora, en el que la diana se identifica mediante un método que comprende:
(i) identificar un gen con al menos dos alelos expresados que codifica una proteína que comprende un epítopo polimórfico extracelular;
(ii) determinar que al menos uno de los alelos expresados exhibe un cambio de secuencia de aminoácidos en la secuencia del epítopo polimórfico extracelular con respecto a una secuencia de referencia del epítopo polimórfico extracelular;
(iii) determinar que el gen está ubicado en una región cromosómica que experimenta pérdida de heterocigosidad (LOH) en un tipo de tumor, en el que la posición de la LOH se selecciona del grupo que consiste en una sustitución, deleción, e inserción; y
(iv) determinar que el gen se expresa en el tejido de origen del tipo de tumor en el que se encontró que la región cromosómica sufrió LOH,
por lo que la diana identificada es un epítopo polimórfico extracelular, ausente del tumor debido a la pérdida de heterocigosidad (LOH) pero presente en el tejido de origen del tipo de tumor.
2. El método de la reivindicación 1, en el que la posición de LOH es un SNP.
3. El método de la reivindicación 1, en el que el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular es un gen HLA.
4. El método de la reivindicación 3, en el que el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular es un gen HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-G, HLA-E, HLA-F, HLA-K, HLA-L, HLA-DM, HLA-DO, HLA-DP, HLA_DQ, o HLA-DR.
5. El método de la reivindicación 1, en el que el gen que comprende el epítopo polimórfico extracelular se selecciona del grupo que consiste en:
a) ABCA4, ADAM30, AQP10, ASTN1, C1orf101, CACNA1S, CATSPER4, CD101, CD164L2, CD1A, CD1C, CD244, CD34, CD46, CELSR2, CHRNB2, CLCA2, CLDN19, CLSTN1, CR1, CR2, CRB1, CSF3R, CSMD2, ECE1, ELTD1, EMC1, EPHA10, EPHA2, EPHA8, ERMAP, FCAMR, FCER1A, FCGR1B, FCGR2A, FCGR2B, FCGR3A, FCRL1, FCRL3, FCRL4, FCRL5, FCRL6, GJB4, GPA33, GPR157, GPR37L1, GPR88, HCRTR1, IGSF3, IGSF9, IL22RA1, IL23R, ITGA10, KIAA1324, KIAA2013, LDLRAD2, LEPR, LGR6, LRIG2, LRP8, LRRC52, LRRC8B, LRRN2, LY9, MIA3, MR1, MUC1, MXRA8, NCSTN, NFASC, NOTCH2, NPR1, NTRK1, OPN3, OR10J1, OR10J4, OR10K1, OR10R2, OR10T2, OR10X1, OR11L1, OR14A16, OR14I1, OR14K1, OR2AK2, OR2C3, OR2G2, OR2G3, OR2L2, OR2M7, OR2T12, OR2T27, OR2T1, OR2T3, OR2T29, OR2T33, OR2T34, OR2T35, OR2T3, OR2T4, OR2T5, OR2T6, OR2T7, OR2T8, OR2W3, OR6F1, OR6K2, OR6K3, OR6K6, OR6N1, OR6P1, OR6Y1, PDPN, PEAR1, PIGR, PLXNA2, PTCH2, PTCHD2, PTGFRN, PTPRC, PTPRF, PVRL4, RHBG, RXFP4, S1 PR1, SCNN1 D, SDC3, SELE, SELL, SELP, SEMA4A, SEMA6C, SLAMF7, SLAMF9, SLC2A7, SLC5A9, TACSTD2, TAS1 R2, TIE1, TLR5, TMEM81, TNFRSF14, TNFRSF1B, TRABD2B, USH2A, VCAM1, y ZP4;
b) ABCG5, ALK, ASPRV1, ATRAID, CD207, CD8B, CHRNG, CLEC4F, CNTNAP5, CRIM1, CXCR1, DNER, DPP10, EDAR, EPCAM, GPR113, GPR148, GPR35, GPR39, GYPC, IL1RL1, ITGA4, ITGA6, ITGAV, LCT, LHCGR, LRP1B, LRP2, LY75, MARCO, MERTK, NRP2, OR6B2, PLA2R1, PLB1, PROKR1, PROM2, SCN7A, SDC1, SLC23A3, SLC5A6, TGOLN2, THSD7B, TM4SF20, TMEFF2, TMEM178A, TPO, y TRABD2A;
c) ACKR2, ALCAM, ANO10, ATP13A4, BTLA, CACNA1D, CACNA2D2, CACNA2D3, CASR, CCRL2, CD200, CD200R1, CD86, CD96, CDCP1, CDHR4, CELSR3, CHL1, CLDN11, CLDN18, CLSTN2, CSPG5, CX3CR1, CXCR6, CYP8B1, DCBLD2, DRD3, EPHA6, EPHB3, GABRR3, GP5, GPR128, GPR15, GPR27, GRM2, GRM7, HEG1, HTR3C, HTR3D, HTR3E, IGSF11, IL17RC, IL17RD, IL17RE, IL5RA, IMPG2, ITGA9, ITGB5, KCNMB3, LRIG1, LRRC15, LRRN1, MST1 R, NAALADL2, NRROS, OR5AC1, OR5H1, OR5H14, OR5H15, OR5H6, OR5K2, OR5K3, OR5K4, PIGX, PLXNB1, PLXND1, PRRT3, PTPRG, ROBO2, RYK, SEMA5B, SIDT1, SLC22A14, SLC33A1, SLC4A7, SLITRK3, STAB1, SUSD5, TFRC, TLR9, TMEM108, TMEM44, TMPRSS7, TNFSF10, UPK1B, VIPR1, y ZPLD1;
d) ANTXR2, BTC, CNGA1, CORIN, EGF, EMCN, ENPEP, EPHA5, ERVMER34-1, EVC2, FAT1, FAT4, FGFRL1, FRAS1, GPR125, GRID2, GYPA, GYPB, KDR, KIAA0922, KLB, MFSD8, PARM1, PDGFRA, RNF150, TENM3, TLR10, TLR1, TLR6, TMEM156, TMPRSS11A, TMPRSS11B, TMPRSS11 E, TMPRSS11 F, UGT2A1, y UNC5C.;
e) ADAM19, ADRB2, BTNL3, BTNL8, BTNL9, C5orf15, CATSPER3, CD180, CDH12, CDHR2, COL23A1, CSF1R, F2RL2, FAM174A, FAT2, FGFR4, FLT4, GABRA6, GABRG2, GPR151, GPR98, GRM6, HAVCR1, HAVCR2, IL31RA, IL6ST, IL7R, IQGAP2, ITGA1, ITGA2, KCNMB1, LIFR, LNPEP, MEGF10, NIPAL4, NPR3, NRG2, OR2V1, OR2Y1, OSMR, PCDH12, PCDH1, PCDHA1, PCDHA2, PCDHA4, PCDHA8, PCDHA9, PCDHB10, PCDHB11, PCDHB13, PCDHB14, PCDHB15, PCDHB16, PCDHB2, PCDHB3, PCDHB4, PCDHB5, PCDHB6, PCDHGA1, PCDHGA4, PDGFRB, PRLR, SEMA5A, SEMA6A, SGCD, SLC1A3, SLC22A4, SLC22A5, SLC23A1, SLC36A3, SLC45A2, SLC6A18, SLC6A19, SLCO6A1, SV2C, TENM2, TIMD4, y UGT3A1;
f) BAI3, BTN1A1, BTN2A1, BTN2A2, BTN3A1, BTN3A2, BTNL2, CD83, DCBLD1, DLL1, DPCR1, ENPP1, ENPP3, ENPP4, EPHA7, GABBR1, GABRR1, GCNT6, GFRAL, GJB7, GLP1 R, GPR110, GPR111, GPR116, GPR126, GPR63, GPRC6A, HFE, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DOA, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQA2, HLA-DQB1, HLA DQB2, HLA-DRB1, HLA-DRB5, HLA-E, HLA-F, HLA-G, IL20RA, ITPR3, KIAA0319, LMBRD1, LRFN2, LRP11, MAS1L, MEP1A, MICA, MICB, MOG, MUC21, MUC22, NCR2, NOTCH4, OPRM1, OR10C1, OR12D2, OR12D3, OR14J1, OR2B2, OR2B6, OR2J1, OR2W1, OR5V1, PDE10A, PI16, PKHD1, PTCRA, PTK7, RAET1 E, RAET1G, ROS1, SDIM1, SLC16A10, SLC22A1, SLC44A4, TAAR2, TREM1, TREML1, y TREML2;
g) AQP1, C7orf50, CD36, CDHR3, CNTNAP2, DPP6, EGFR, EPHA1, EPHB6, ERVW-1, GHRHR, GJC3, GPNMB, GRM8, HUS1, HYAL4, KIAA1324L, LRRN3, MET, MUC12, MUC17, NPC1L1, NPSR1, OR2A12, OR2A14, OR2A25, OR2A42, OR2A7, OR2A2, OR2AE1, OR2F2, OR6V1, PILRA, PILRB, PKD1L1, PLXNA4, PODXL, PTPRN2, PTPRZ1, RAMP3, SLC29A4, SMO, TAS2R16, TAS2R40, TAS2R4, TFR2, THSD7A, TMEM213, TTYH3, ZAN, y ZP3.;
h) ADAM18, ADAM28, ADAM32, ADAM7, ADAM9, ADRA1A, CDH17, CHRNA2, CSMD1, CSMD3, DCSTAMP, FZD6, GPR124, NRG1, OR4F21, PKHD1L1, PRSS55, SCARA3, SCARA5, SDC2, SLC10A5, SLC39A14, SLC39A4, SLCO5A1, TNFRSF10A, y TNFRSF10B;
i) ABCA1, AQP7, ASTN2, C9orf135, CA9, CD72, CNTNAP3B, CNTNAP3, CRB2, ENTPD8, GPR144, GRIN3A, IZUMO3, KIAA1161, MAMDC4, MEGF9, MUSK, NOTCH1, OR13C2, OR13C3, OR13C5, OR13C8, OR13C9, OR13D1, OR13F1, OR1B1, OR1J2, OR1K1, OR1L1, OR1L3, OR1L6, OR1L8, OR1N1, OR1N2, OR1Q1, OR2S2, PCSK5, PDCD1LG2, PLGRKT, PTPRD, ROR2, SEMA4D, SLC31A1, TEK, TLR4, TMEM2, y VLDLR;
j) ABCC2, ADAM8, ADRB1, ANTXRL, ATRNL1, C10orf54, CDH23, CDHR1, CNNM2, COL13A1, COL17A1, ENTPD1, FZD8, FGFR2, GPR158, GRID1, IL15RA, IL2RA, ITGA8, ITGB1, MRC1, NRG3, NPFFR1, NRP1, OPN4, PCDH15, PKD2L1, PLXDC2, PRLHR, RET, RGR, SLC16A9, SLC29A3, SLC39A12, TACR2, TCTN3, TSPAN15, UNC5B, y VSTM4;
k) AMICA1, ANO1, ANO3, APLP2, C11orf24, CCKBR, CD248, CD44, CD5, CD6, CD82, CDON, CLMP, CRTAM, DCHS1, DSCAML1, FAT3, FOLH1, GDPD4, GDPD5, GRIK4, HEPHL1, HTR3B, IFITM10, IL10RA, KIRREL3, LGR4, LRP4, LRP5, LRRC32, MCAM, MFRP, MMP26, MPEG1, MRGPRE, MRGPRF, MRGPRX2, MRGPRX3, MRGPRX4, MS4A4A, MS4A6A, MTNR1B, MUC15, NAALAD2, NAALADL1, NCAM1, NRXN2, OR10A2, OR10A5, OR10A6, OR10D3, OR10G4, OR10G7, OR10G8, OR10G9, OR10Q1, OR10S1, OR1S1, OR2AG1, OR2AG2, OR2D2, OR4A47, OR4A15, OR4A5, OR4C11, OR4C13, OR4C15, OR4C16, OR4C3, OR4C46, OR4C5, OR4D6, OR4A8P, OR4D9, OR4S2, OR4X1, OR51E1, OR51L1, OR52A1, OR52E1, OR52E2, OR52E4, OR52E6, OR52I1, OR52I2, OR52J3, OR52L1, OR52N1, OR52N2, OR52N4, OR52W1, OR56B1, OR56B4, OR5A1, OR5A2, OR5AK2, OR5AR1, OR5B17, OR5B3, OR5D14, OR5D16, OR5D18, OR5F1, OR5I1, OR5L2, OR5M11, OR5M3, OR5P2, OR5R1, OR5T2, OR5T3, OR5W2, OR6A2, OR6T1, OR6X1, OR8A1, OR8B12, OR8B2, OR8B3, OR8B4, OR8D1, OR8D2, OR8H1, OR8H2, OR8H3, OR8I2, OR8J1, OR8J2, OR8J3, OR8K1, OR8K3, OR8K5, OR8U1, OR9G1, OR9G4, OR9Q2, P2RX3, PTPRJ, ROBO3, SIGIRR, SLC22A10, SLC3A2, SLC5A12, SLCO2B1, SORL1, ST14, SYT8, TENM4, TMEM123, TMEM225, TMPRSS4, TMPRSS5, TRIM5, TRPM5, TSPAN18, y ZP1;
l) ANO4, AVPR1A, BCL2L14, CACNA2D4, CD163, CD163L1, CD27, CD4, CLEC12A, CLEC1B, CLEC2A, CLEC4C, CLEC7A, CLECL1, CLSTN3, GPR133, GPRC5D, ITGA7, ITGB7, KLRB1, KLRC2, KLRC3, KLRC4, KLRF1, KLRF2, LRP1, LRP6, MANSC1, MANSC4, OLR1, OR10AD1, OR10P1, OR2AP1, OR6C1, OR6C2, OR6C3, OR6C4, OR6C6, OR6C74, OR6C76, OR8S1, OR9K2, ORAI1, P2RX4, P2RX7, PRR4, PTPRB, PTPRQ, PTPRR, SCNN1A, SELPLG, SLC2A14, SLC38A4, SLC5A8, SLC6A15, SLC8B1, SLCO1A2, SLCO1B1, SLCO1B7, SLCO1C1, SSPN, STAB2, TAS2R10, TAS2R13, TAS2R14, TAS2R20, TAS2R30, TAS2R31, TAS2R42, TAS2R43, TAS2R46, TAS2R7, TMEM119, TMEM132B, TMEM132C, TMEM132D, TMPRSS12, TNFRSF1A, TSPAN8, y VSIG10;
m) ATP4B, ATP7B, FLT3, FREM2, HTR2A, KL, PCDH8, RXFP2, SGCG, SHISA2, SLC15A1, SLITRK6, y TNFRSF19; n) ADAM21, BDKRB2, C14orf37, CLEC14A, DLK1, FLRT2, GPR135, GPR137C, JAG2, LTB4R2, MMP14, OR11G2, OR11H12, OR11H6, OR4K1, OR4K15, OR4K5, OR4L1, OR4N2, OR4N5, SLC24A4, y SYNDIG1L.;
o) ANPEP, CD276, CHRNA7, CHRNB4, CSPG4, DUOX1, DUOX2, FAM174B, GLDN, IGDCC4, ITGA11, LCTL, LTK, LYSMD4, MEGF11, NOX5, NRG4, OCA2, OR4F4, OR4M2, OR4N4, PRTG, RHCG, SCAMP5, SEMA4B, SEMA6D, SLC24A1, SLC24A5, SLC28A1, SPG11, STRA6, TRPM1, y TYRO3;
p) ATP2C2, CACNA1H, CD19, CDH11, CDH15, CDH16, CDH3, CDH5, CNGB1, CNTNAP4, GDPD3, GPR56, GPR97, IFT140, IL4R, ITFG3, ITGAL, ITGAM, ITGAX, KCNG4, MMP15, MSLNL, NOMO1, NOMO3, OR2C1, PIEZO1, PKD1, PKD1L2, QPRT, SCNN1B, SEZ6L2, SLC22A31, SLC5A11, SLC7A6, SPN, TMC5, TMC7, TMEM204, TMEM219, y TMEM8A.;
q) ABCC3, ACE, AOC3, ARL17B, ASGR2, C17orf80, CD300A, CD300C, CD300E, CD300LF, CD300LG, CHRNB1, CLEC10A, CNTNAP1, CPD, CXCL16, ERBB2, FAM171A2, GCGR, GLP2R, GP1BA, GPR142, GUCY2D, ITGA2B, ITGA3, ITGAE, ITGB3, KCNJ12, LRRC37A2, LRRC37A3, LRRC37A, LRRC37B, MRC2, NGFR, OR1A2, OR1D2, OR1G1, OR3A1, OR3A2, OR4D1, OR4D2, RNF43, SCARF1, SCN4A, SDK2, SECTM1, SEZ6, SHPK, SLC26A11, SLC5A10, SPACA3, TMEM102, TMEM132E, TNFSF12, TRPV3, TTYH2, y TUSC5.
r) APCDD1, CDH19, CDH20, CDH7, COLEC12, DCC, DSC1, DSG1, DSG3, DYNAP, MEP1B, PTPRM, SIGLEC15, y TNFRSF11A
s) ABCA7, ACPT, BCAM, C19orf38, C19orf59, C5AR1, CATSPERD, CATSPERG, CD22, CD320, CD33, CD97, CEACAM19, CEACAM1, CEACAM21, CEACAM3, CEACAM4, CLEC4M, DLL3, EMR1, EMR2, EMR3, ERVV-1, ERVV-2, FAM187B, FCAR, FFAR3, FPR1, FXYD5, GFY, GP6, GPR42, GRIN3B, ICAM3, IGFLR1, IL12RB1, IL27RA, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIRREL2, KISS1R, LAIR1, LDLR, LILRA1, LILRA2, LILRA4, LILRA6, LILRB1, LILRB2, LILRB3, LILRB4, LILRB5, LINGO3, LPHN1, LRP3, MADCAM1, MAG, MEGF8, MUC16, NCR1, NOTCH3, NPHS1, OR10H1, OR10H2, OR10H3, OR10H4, OR1I1, OR2Z1, OR7A10, OR7C1, OR7D4, OR7E24, OR7G1, OR7G2, OR7G3, PLVAP, PTGIR, PTPRH, PTPRS, PVR, SCN1B, SHISA7, SIGLEC10, SIGLEC11, SIGLEC12, SIGLEC5, SIGLEC6, SIGLEC8, SIGLEC9, SLC44A2, SLC5A5, SLC7A9, SPINT2, TARM1, TGFBR3L, TMC4, TMEM91, TMEM161A, TMPRSS9, TNFSF14, TNFSF9, TRPM4, VN1R2, VSIG10L, VSTM2B, y ZNRF4; t) ABHD12, ADAM33, ADRA1 D, APMAP, ATRN, CD40, CD93, CDH22, CDH26, CDH4, FLRT3, GCNT7, GGT7, JAG1, LRRN4, NPBWR2, OCSTAMP, PTPRA, PTPRT, SEL1L2, SIGLEC1, SIRPA, SIRPB1, SIRPG, SLC24A3, SLC2A10, SLC4A11, SSTR4, y THBD;
u) CLDN8, DSCAM, ICOSLG, IFNAR1, IFNGR2, IGSF5, ITGB2, KCNJ15, NCAM2, SLC19A1, TMPRSS15, TMPRSS2, TMPRSS3, TRPM2, y UMODL1;
v) CACNA11, CELSR1, COMT, CSF2RB, GGT1, GGT5, IL2RB, KREMEN1, MCHR1, OR11H1, P2RX6, PKDREJ, PLXNB2, SCARF2, SEZ6L, SSTR3, SUSD2, TMPRSS6, y TNFRSF13C;
w) ATP6AP2, ATP7A, CNGA2, EDA2R, FMR1NB, GLRA4, GPR112, GUCY2F, HEPH, P2RY10, P2RY4, PLXNA3, PLXNB3, TLR8, VSIG4, y XG.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el tumor se selecciona del grupo que consiste en un tumor de mama, un tumor de próstata, un tumor de ovario, un tumor de cuello uterino, un tumor de piel, un tumor pancreático, un tumor colorrectal, un tumor renal, un tumor hepático, un tumor cerebral, un linfoma, una leucemia, un tumor pulmonar, y un glioma
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el tumor se selecciona del grupo que consiste en un tumor de glándula suprarrenal, un tumor de riñón, un melanoma, DLBC, un tumor de mama, un sarcoma, un tumor de ovario, un tumor de pulmón, un tumor de vejiga, y un tumor de hígado.
8. El método de la reivindicación 7, en el que el tumor de la glándula suprarrenal es un carcinoma adrenocortical.
9. El método de la reivindicación 7, en el que el tumor de riñón es un carcinoma de células renales cromófobas.
10. El método de la reivindicación 7, en el que el melanoma es un melanoma uveal.
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Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111465693A (zh) 2017-09-28 2020-07-28 依姆派特生物有限公司 用于制备抑制性嵌合抗原受体(iCAR)的通用平台
KR20210088559A (ko) * 2018-09-28 2021-07-14 임팩트-바이오 리미티드. 암 요법에 사용하기 위한 활성화 항원 수용체 (aCAR)/저해성 키메라 항원 수용체 (iCAR) 쌍의 식별 방법
GB201820157D0 (en) * 2018-12-11 2019-01-23 Imperial Innovations Ltd Method of treatment
SG11202111130SA (en) * 2019-04-30 2021-11-29 Senti Biosciences Inc Chimeric receptors and methods of use thereof
CN114585645A (zh) * 2019-08-09 2022-06-03 A2生物治疗公司 对杂合性丧失作出响应的细胞表面受体
CA3148611A1 (en) 2019-08-12 2021-02-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Macrophage stimulating 1 receptor (mst1r) variants and uses thereof
US20220389075A1 (en) 2019-11-12 2022-12-08 A2 Biotherapeutics, Inc. Engineered t cell receptors and uses thereof
JP2023506184A (ja) * 2019-12-11 2023-02-15 エイ２・バイオセラピューティクス・インコーポレイテッド Ｌｉｌｒｂ１ベースのキメラ抗原受容体
JP2023515471A (ja) * 2020-02-20 2023-04-13 センティ バイオサイエンシズ インコーポレイテッド 抑制性キメラ受容体構造物
EP4107175A4 (en) * 2020-02-20 2024-03-20 Senti Biosciences Inc ARCHITECTURES OF INHIBITORY CHIMERIC RECEPTORS
CN115151268A (zh) * 2020-02-24 2022-10-04 加利福尼亚大学董事会 使用脑特异性抗原归巢，阻断和向大脑提供基于细胞的治疗
WO2021252635A1 (en) * 2020-06-11 2021-12-16 A2 Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for treating cancers
CN114058589B (zh) * 2020-07-30 2023-05-12 华东师范大学 具有嵌合抗原受体修饰的免疫细胞、制备方法和药物
AU2021329375A1 (en) * 2020-08-20 2023-04-20 A2 Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for treating ceacam positive cancers
MX2023002104A (es) * 2020-08-20 2023-07-10 A2 Biotherapeutics Inc Composiciones y métodos para tratar cánceres positivos para egfr.
JP2023538114A (ja) * 2020-08-20 2023-09-06 エー２ バイオセラピューティクス， インコーポレイテッド メソテリン陽性がんを治療するための組成物及び方法
CN112194726B (zh) * 2020-09-02 2023-06-23 沣潮医药科技（上海）有限公司 用于病理性蛋白聚集物清除的嵌合抗原受体及其应用
CN112194728B (zh) * 2020-09-22 2023-07-11 沣潮医药科技（上海）有限公司 用于内毒素清除的嵌合抗原受体及其应用
US20230390393A1 (en) * 2020-11-04 2023-12-07 Miltenyi Biotec B.V. & Co Kg Chimeric antigen receptor comprising an antigen binding domain specific for msln having a specificity for tumor cells
IL302874A (en) 2020-11-18 2023-07-01 Pionyr Immunotherapeutics Inc Anti-Marco antibodies and their uses
CN114832105B (zh) * 2021-02-01 2023-08-04 复旦大学附属中山医院 一种C7orf50基因或蛋白的抑制剂的用途
KR20230147109A (ko) 2021-02-16 2023-10-20 에이투 바이오쎄라퓨틱스, 인크. Her2 양성 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법
WO2022187182A1 (en) * 2021-03-02 2022-09-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Targeting t regulatory cells to islet cells to stall or reverse type 1 diabetes
CN113122543B (zh) * 2021-04-01 2024-05-17 厦门大学 唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素-15蛋白的核酸适配体及其应用
WO2023076912A2 (en) * 2021-10-26 2023-05-04 ImmPACT Bio USA Inc. Cd4+ and/or cd8+ cell populations comprising icars for use in treatment therapies
CN114517185B (zh) * 2022-01-17 2023-04-28 华东师范大学 嵌合抗原受体nk细胞及其制备方法和应用
WO2023150768A2 (en) * 2022-02-07 2023-08-10 Oregon Health & Science University Biomarkers for acute myeloid leukemia and uses thereof
WO2023172954A2 (en) * 2022-03-08 2023-09-14 A2 Biotherapeutics, Inc. Engineered receptors specific to hla-e and methods of use
CN116773790B (zh) * 2023-08-18 2023-11-28 南京普恩瑞生物科技有限公司 一种肿瘤组织her2梯度检测产品的制备方法和应用
CN117567651B (zh) * 2024-01-15 2024-03-26 中国人民解放军东部战区总医院 协同表达血管内皮黏附分子vcam1的嵌合抗原受体及其应用

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2546365B1 (en) * 2008-09-03 2016-11-09 The Johns Hopkins University Genetic alterations in isocitrate dehydrogenase and other genes in malignant glioma
EP3623380A1 (en) 2013-03-15 2020-03-18 Michael C. Milone Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
EP4098275A1 (en) 2013-03-15 2022-12-07 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Compositions and methods for immunotherapy
EP3858378A1 (en) 2013-11-21 2021-08-04 Autolus Limited Cell
JP6663350B2 (ja) * 2014-01-16 2020-03-11 クロヴィス・オンコロジー，インコーポレーテッド ヘテロ接合性の喪失を示す乳癌または卵巣癌の患者を治療するためのｐａｒｐ阻害剤の使用
CA2967222C (en) 2014-11-12 2023-10-31 Rinat Neuroscience Corp. Inhibitory chimeric antigen receptors
CA2969384A1 (en) 2014-12-17 2016-06-23 Cellectis Inhibitory chimeric antigen receptor (icar or n-car) expressing non-t cell transduction domain
US11161907B2 (en) 2015-02-02 2021-11-02 Novartis Ag Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
MX2017010721A (es) 2015-02-24 2018-08-28 Univ California Interruptores transcripcionales activados mediante unión y métodos para su uso.
GB201515321D0 (en) * 2015-08-28 2015-10-14 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides, combination of peptides and scaffolds for use in immunotherapeutic treatment of various cancers
EP3263595A1 (en) 2016-06-30 2018-01-03 Medizinische Hochschule Hannover Fusion protein for use in the treatment of hvg disease
US20190248869A1 (en) * 2016-09-28 2019-08-15 Gavish-Galilee Bio Applications Ltd. A universal platform for car therapy targeting a novel antigenic signature of cancer
WO2018204546A2 (en) 2017-05-02 2018-11-08 Prothena Biosciences Limited Antibodies recognizing tau
GB201707779D0 (en) * 2017-05-15 2017-06-28 Autolus Ltd Cell
CN111465693A (zh) 2017-09-28 2020-07-28 依姆派特生物有限公司 用于制备抑制性嵌合抗原受体(iCAR)的通用平台
KR20210088559A (ko) 2018-09-28 2021-07-14 임팩트-바이오 리미티드. 암 요법에 사용하기 위한 활성화 항원 수용체 (aCAR)/저해성 키메라 항원 수용체 (iCAR) 쌍의 식별 방법
AU2019369498A1 (en) 2018-10-31 2021-05-20 Delinia, Inc. Multivalent regulatory T cell modulators

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